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OS ANTICORPOS E SEUS FRAGMENTOS NA IMUNOTERAPIA CONTRA O
CÂNCER
Luiz Euribel Prestes Carneiro, PhD Médico, Universidade do Oeste Paulista –
UNOESTE, Presidente Prudente, SP, [email protected]
André Fellipe Freitas Rodrigues, MSc. Farmacêutico, Faculdade de Colíder,
FACIDER, Colíder, MT, [email protected]
Sueli Schadeck Zago, MSc. Farmacêutica, Universidade do Oeste Paulista –
UNOESTE, Presidente Prudente, SP, [email protected]
Gisele Alborghetti Nai, PhD Médica, Universidade do Oeste Paulista –
UNOESTE, Presidente Prudente, SP [email protected]
RESUMO
Imunoterapia compreende o maior grupo de moléculas em desenvolvimento em
todo o mundo atualmente. Eles têm sido investigados para o tratamento de
diversas condições patológicas como o câncer, doenças infecciosas e
inflamatórias. Anticorpos são versáteis e de alta especificidade de
reconhecimento de moléculas. Os anticorpos monoclonais (mAb) podem
exercer os seus efeitos biológicos por eles mesmos, visando especificidade
contra moleculares importantes sobre células tumorais ou no microambiente.
Eles também podem ser usados para a entrega de agentes radioligados
(radioimunoterapia, RAIT), ou conjugado com moléculas pró-drogas (antibodydirected enzyme prodrug therapy, ADEPT). Na última década, a biologia
molecular e da engenharia genética têm sido usados para criar classes
pequenas e menos imunogênicos de anticorpos. Combinações adequadas de
anticorpos com radionuclídeos e fármacos anticâncer e as construções como
os anticorpos totalmente humanos ou biespecífico representam um importante
passo no tratamento de tumores.
Palavras chaves: imunoterapia, anticorpos monoclonais, radioimunoterapia,
ADEPT, câncer.
ANTIBODIES AND THEIR FRAGMENTS IN CANCER IMMUNOTERAPHY
ABSTRACT
Immunotherapy comprises the largest group of molecules in development
worldwide at present. They have been investigated for the treatment of a wide
range of pathological conditions including cancer, infectious and inflammatory
diseases. Antibodies are versatile and highly specific targeting-recognition
1
molecules. Monoclonal antibodies (mAb) can exert their biological effects by
themselves, targeting/aiming specificity against key moleculars on tumor cells
or in the microenvironment. They can also be used for the delivery of radiobeled
agents (radioimmunotherapy, RAIT), or conjugated with pro-drug molecules
(antibody-directed enzyme prodrug therapy, ADEPT). In the last decade,
molecular biology and genetic engineering have been used to create small and
less immunogenic classes of antibodies. Appropriate combinations of antibodies
with radionuclides and anti-cancer drugs, and constructs such as fully human or
bispecific antibodies represent an important step forward for the treatment of
tumors.
Key-words: immunotherapy, monoclonal antibodies, radioimmunotherapy,
antibody-directed enzyme prodrug therapy, cancer.
INTRODUÇÃO
Muitos pacientes morrem com estados avançados ou metastáticos de
câncer. Uma vez que a cirurgia combinada à radiação localizada continua
sendo a melhor opção para tratar tumores localizados, a quimioterapia
sistêmica e mais recentemente, a imunoterapia tem se constituído em
importante arma no tratamento especialmente de pacientes terminais e com
metástases. A quimioterapia sistêmica é acompanhada por uma toxicidade
dose-limitante para vários tecidos, especialmente aqueles com rápida
proliferação celular como mucosa intestinal, oral, medula óssea e folículos
pilosos do cabelo (GOLDENBERG, 2007). Além de um número reduzido de
fármacos disponíveis para uso clínico, há uma concentração insuficiente da
droga no sítio tumoral, falta de seletividade sistêmica entre células tumorais e
normais, multirresistência a droga pelas células tumorais quando em uso
prolongado devido ao aumento na expressão de glutationa S-transferase e
hiper-regulação da bomba de efluxo P-glicoproteína que remove o fármaco do
interior da célula (XU e MCLEOD, 2001; ROOSEBOM, et al. 2004; SHAROM,
2008; ANDRADY et al. 2011).
Os imunoterápicos representam atualmente o maior número de
moléculas em desenvolvimento para a composição de novos fármacos. Essas
moléculas versáteis são investigadas para o tratamento de um grande número
de condições patológicas como câncer, doenças inflamatórias e infecciosas.
2
A imunoterapia contra os tumores consiste de diferentes estratégias
como a produção de anticorpos dirigidos contra antígenos tumorais, vacinação
com extratos obtidos do tumor e métodos não específicos como vacinação com
BCG ou com extratos bacterianos e administração de toxinas (ORTIN, 2005;
BHARDWA et al. 2007; ANDRADY, et al. 2011). Dentre essas moléculas
destacam-se os anticorpos, que podem ser usados para exercer diferentes
atividades biológicas ou como veículos, quando conjugados a diferentes
substâncias como radioisótopos, fármacos, toxinas ou peptídeos. A capacidade
do anticorpo carregando um agente terapêutico se ligar especificamente ao
antígeno de uma determinada célula ou tecido tumoral tem sido uma grande
ferramenta da indústria farmacêutica para aumentar a ação do fármaco e
minimizar seus efeitos colaterais (MCCARRON et al. 2005).
Em 1908, Paul Ehrlich postulou a existência contínua de “germes
aberrantes” (tumores) e que o seu crescimento e desenvolvimento poderia
inevitavelmente levar a morte, porém os mesmos podem ser reconhecidos e
atacados pelo sistema imune (anticorpos) gerando o conceito de “magic bullet”
(bala mágica) (ORTIN, 2005; WINAU et al. 2004; GENSINI et al. 2007).
Durante os anos 50 e 60, Burnett e Thomas formularam a teoria da
imunovigilância na qual a geração de células cancerosas é um fenômeno
normal em humanos e que as mesmas são identificadas e eliminadas pelo
sistema imune antes de se desenvolverem em câncer (ORTIN, 2005).
1. IMUNOTERAPIA BASEADA EM ANTICORPOS
Os anticorpos representam a mais promissora classe de novos fármacos
em desenvolvimento contra o câncer na atualidade, com cerca de 20 tipos
disponíveis no mercado e mais de 150 sendo utilizados em ensaios clínicos
(MCCARRON et al. 2005; SHARKEY e GOLDENBERG, 2006; STROME et al,
2007). Nos anos 70, a imortalização de linfócitos B murinos pela tecnologia dos
hibridomas proposta por Kohler & Milstein, permitiu a produção de grandes
quantidades de anticorpos específicos contra uma determinada molécula,
denominados anticorpos monoclonais (mAb), um pré-requisito para a aplicação
terapêutica anti-tumoral (MCCARRON et al. 2005; ANDRADY et al. 2011).
3
Os anticorpos são proteínas com duas regiões distintas capazes de fixar
antígenos, células e complemento. A região variável ou dotada de
complementaridade ao antígeno (complementarity determining regions– CDR
ou Fab), e a região Fc que é constante e responsável pela ligação a proteínas
séricas como o complemento ou a células através dos receptores para FcγR.
Os anticorpos por si só normalmente não conseguem destruir uma célula mas
ao se ligarem a ela podem ativar diferentes mecanismos imunológicos capazes
de bloquear o crescimento ou mesmo promoverem a sua morte (MCCARRON
et al. 2005).
Os anticorpos livres ou não conjugados podem ser utilizados como
moléculas
efetoras
e
exercer
citotoxicidade
principalmente
por
dois
mecanismos. A ligação específica da região Fab ao antígeno presente na
superfície da célula tumoral produz uma modificação conformacional na região
Fc do anticorpo, capaz de fixar e ativar o complemento gerando o Complexo de
Ataque a Membrana (CAM) que ao produzir poros sobre a superfície celular
provoca sua morte, referido como citotoxicidade dependente de complemento
(CDC), no segundo mecanismo, conhecido como citotoxicidade celular
dependente de anticorpo (ADCC), o anticorpo se liga ao antígeno tumoral
fazendo a ponte entre a célula tumoral e células imunocompetentes,
recrutadas, como os Linfócitos T citotóxicos (LT/CD8 +) que produzem a sua
morte (ORTIN 2005; MCCARRON et al. 2005; STROME et al. 2007).
Os anticorpos ao se ligarem aos seus alvos específicos podem ser
também usados como moduladores agonistas ou antagonistas de vias de
sinalização celular estabilizando, diminuindo ou mesmo inibindo a proliferação
celular ou induzindo a sua morte ou apoptose. Quando é possível a ligação
cruzada de mAbs anti-tumorais na superfície da célula com outras moléculas
como haptenos, a apoptose é intensificada. Os mAbs anti-tumorais são ainda
capazes de bloquear moléculas associadas à adesão celular impedindo a
formação de metástases (SHARKEY e GOLDENBERG 2006; STROME et al.
2007).
Os anticorpos possuem uma vida média prolongada no soro. Para
imunoterapia esta é uma propriedade vantajosa por que a molécula se mantém
por um longo período circulante nos fluidos corporais, podendo interagir de
maneira mais efetiva com o seu alvo. No entanto, o maior limite para o uso da
4
imunoterapia com mAbs está relacionada a imunogenicidade que proteínas dos
roedores causam em humanos levando ao reconhecimento dos mAbs pelo
sistema imune gerando a produção de anticorpos humanos anti-murinos
(human anti-murine antibodies - HAMA). A geração de HAMA reduz
sensivelmente a meia vida dos mAbs que são removidos da circulação
limitando o seu uso em diferentes ciclos do tratamento ou por períodos
prolongados (MIRICK et al. 2004). Outra limitação é a pequena penetração de
moléculas grandes como os anticorpos, Imunoglobulina (Ig) G (180 kDa) em
tumores sólidos (STROME et al. 2007; MIRICK et al. 2004; ANDRADY et al.
2011).
Os avanços em biotecnologia e na biologia molecular possibilitaram a
construção de anticorpos IgG com menor antigenicidade removendo uma
porção significativa do componente murino: mAbs quiméricos (chAb), com uma
região constante humana (75% de sua porção) e uma região variável murina
(25% de sua porção) anticorpos humanizados (hzAb) que possuem as cadeias
CDR de origem murina (5%), conservando 95% da molécula com sequências
humanas, e mais recentemente mAbs completamente humanos (“fully human” fhAb), resultantes da expressão gênica do repertório de anticorpos humanos
pela tecnologia de DNA recombinante (rDNA) (GOLDENBERG 2007;
SHARKEY e GOLDENBERG, 2006). Uma estratégia para alcançar tumores
sólidos e diminuir ainda mais a imunogenicidade, foi a construção de
fragmentos cada vez menores de anticorpos, com diminuição do peso
molecular mas que mantivessem a capacidade de fixar antígenos e pudessem
ser conjugados à outras moléculas. Dessa maneira, diferentes estudos
experimentais
e
clínicos
estão
utilizando
fragmentos
de
anticorpos
monoméricos, diméricos ou biespecíficos (bsmAb), triméricos ou mesmo
tetraméricos onde cada fragmento Fab é capaz de se ligar a uma molécula
diferente como antígeno tumoral, radioisótopos, fármacos ou toxinas (ECCLES
2001; AGUILLÓN et al. 2003; HUST et al. 2012). Recentemente foi
demonstrado que algumas espécies animais como os camelídeos, possuem
anticorpos funcionais onde as cadeias leves estão ausentes mas a presença de
um domínio simples de cadeias pesadas, através da região N terminal é
plenamente capaz de fixar antígenos (VHHs ou nano-anticorpos). São os
menores fragmentos de anticorpos já construídos (15 kDa) e em tumores
5
sólidos humanos implantados em animais; essas pequenas moléculas
penetram no tumor de maneira muito eficiente, são removidos mais
rapidamente do sangue e reduzem a imunogenicidade quando comparados a
um anticorpo completo (HARMSEN e DE HAARD 2007; CORTEZ-RETAMOZO
et al. 2004; KAUMAYA e FOY 2012; HUST et al. 2012). Os VHHs produzidos
em larga escala em Escherichia coli por rDNA, tem formato farmacológico
altamente flexível, possuem uma pequena meia vida, sendo eliminados por
depuração renal e são capazes de ultrapassar a barreira sanguínea cerebral
podendo ser utilizados para tumores neurológicos. São capazes de reconhecer
epítopos estranhos ou escondidos e ligar-se em cavidades ou sítios ativos de
proteínas alvo. Essas pequenas moléculas podem representar um novo e
promissor grupo de anticorpos no tratamento dos tumores (REVETS et al.
2005; ROOVERS et al. 2007; HUST et al. 2012).
A terapia anti-tumoral por mAb pode ser classificada pela administração
de anticorpos livres ou conjugados.
2. ANTICORPOS LIVRES
Inicialmente, a terapia com anticorpos livres trouxe poucos benefícios
em oncologia. A descoberta, no início dos anos 80, de que anticorpos contra o
antígeno carcinoembriônico (CEA) conseguiram ligar-se seletivamente e
romper tecidos de pacientes com câncer colorretal expressando CEA,
demonstrou a importância destes anticorpos (SHARKEY e GOLDENBERG
2006; HAMMARSTRÖM 1999; HUST et al. 2012).
O primeiro anticorpo monoclonal aprovado pelo FDA (Food and Drug
Administration) para o tratamento de um tumor foi o Rituximab (Rituxan ), um
mAb quimérico anti-CD20 IgG 1, com a região Fc humana e a região de ligação
ao antígeno (Fab) murina, específico para o antígeno de superfície CD20,
presente em neoplasias linfoides de células B como a leucemia linfoide crônica
e linfomas não-Hodgkin (NHL) de células B, resistentes a quimioterapia
convencional (ORTIN 2005; ECCLES 2001; KLIMM et al. 2005; ANDRADY et
al. 2011; KAUMAYA e FOY 2012), seguido por outros mAbs como o hzAb
trastuzumab (Herceptin), contra HER2 (receptor 2 do fator de crescimento
epidérmico humano), utilizado para tratar pacientes com câncer de mama
6
expressando o antígeno HER2/neu, chAb cetuximab (Erbitux  anti-EGFR)
específico contra o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e o
hzAb bevacizumab (Avastin anti-VEGF), o agente antiangiogênico em maior
estágio de desenvolvimento da atualidade, que contem uma fração IgG 1
humano (93%) e uma região complementar determinante, bloqueadora do
VEGF (7%), que bloqueia todas as isoformas de VEGF (fator de crescimento
vásculo-endotelial) aos receptores, inibindo a angiogênese (STROME et al.
2007).
Combinado a quimioterapia, bevacizumab está sendo usado em ensaios
clínicos de fase III no tratamento avançado de tumor colorretal, câncer de
mama e câncer de pulmão não pequenas células (BHARDWA et al. 2007;
SHARKEY e GOLDENBERG 2006, ECCLES 2001; RIETZEl et al. 2004,
GRIDELLI et al. 2007; KAUMAYA e FOY 2012). O bloqueio de VEGF diminui a
perfusão do tumor, o volume de vascularização, a densidade microvascular, a
pressão do fluido intersticial e o número de células endoteliais e progenitoras
circulantes. Em 2006, o FDA aprovou outro mAb, IgG 2, fhAb panitumumab
(Vectibix), que se liga ao EGFR para o tratamento de pacientes com câncer
colorretal que superexpressam EGFR, carcinoma colorretal metastático ou em
regime de tratamento com os quimioterápicos fluoropirimidina, oxaliplatin e
irinotecan. A ligação do panitumumab ao EGFR inibe a fosforilação e ativação
de quinases associadas ao EGFR resultando na inibição do crescimento celular
e da produção de fatores de crescimento como o fator de crescimento
endotelial e de interleucina-8 (RUTHANN et al. 2007; AURISICCHIO et al.
2012).
Além destes, existe um número crescente de mAbs aprovados pelo FDA
sendo utilizados como agentes terapêuticos especialmente em doenças
autoimunes
e
inflamatórias.
A
administração
de
anticorpos
anti-TNF
(adalimumab, etarnecept inflix), podem induzir uma melhora significativa no
tratamento de pacientes com artrite reumatoide, sacroileítes, psoríase e
espondilite anquilosante, especialmente naqueles pacientes refratários ao
tratamento com imunomoduladores como azatioprina, corticoides, metotrexato
e 6-mercaptopurina (AGUILLÓN et al. 2003).
7
O Omalizumab, um hzAb capaz de se ligar seletivamente a IgE tem sido
utilizado em pacientes com quadros de asma e rinite alérgica severos,
resistentes ao tratamento convencional (MORJARIA et al. 2007; HENDELES e
SORKNESS, 2007).
3. ANTICORPOS CONJUGADOS/ RADIOIMUNOTERAPIA
A ideia de se usar anticorpos antitumorais para transportar substâncias
tóxicas seletivamente até as células tumorais já foi desenvolvida no inicio do
século por Ehrlich (GENSINI et al. 2007). No final dos anos 50, Mathé et al.
ligaram o quimioterápico metotrexato a fração globulínica de um antissoro de
hamster
contra
células
leucêmicas
de
camundongo
(SHARKEY
e
GOLDENBERG 2006; MATHÉ et al. 1958; AURISICCHIO et al. 2012). Nos
anos 70, Rowland et al. conjugaram um anticorpo a um quimioterápico como
uma forma de aumentar a eficiência da droga ao sitio tumoral (ROWLAND et al.
1975).
A radioimunoterapia (RAIT) vem sendo utilizada no estudo de tumores
há mais de duas décadas. Consiste na administração sistêmica de um
elemento radiativo (radioisótopo) especialmente radionuclídeos que possuem
emissão de partículas alfa ou beta, conjugado a um mAb dirigido seletivamente
contra antígenos tumorais (QU et al. 2008). Em 1981, Resche et al. (RESCHE
et al. 2003) utilizou
131
Iodo (131I)-conjugado a IgG de cabra contra CEA em
hamsters portando carcinoma colônico humano.
A RAIT tem uma série de vantagens sobre a radioterapia convencional
permitindo a aplicação de uma dose alta de radionuclídeos que são
seletivamente incorporados, depositando doses letais nas células do tumor
enquanto nenhuma ou pequena incorporação de radiação acontece nas células
normais (ACAR et al. 2007). A radiação pode agir sinergicamente com a
imunoterapia aumentando a resposta imune, diminuindo a imunossupressão
e/ou alterando o fenótipo das células tumorais (SHARP et al. 2007).
Enquanto um grande sucesso foi obtido no tratamento de tumores
hematológicos, como certos tipos de linfomas não-Hodgkin (NHL) de células B
usando mAbs ligados a radionuclídeos contra antígenos CD20, com respostas
duradouras em cerca de 70-80% dos casos obtidos em estudos clínicos, teve
8
pouca eficácia, cerca de 10%, no tratamento de tumores sólidos (REYLLI
2006). As razões do insucesso são variadas e complexas, mas uma das mais
importantes é a diminuída propriedade farmacocinética do anticorpo IgG no seu
estado natural. Os mAbs intactos são macromoléculas com meia vida
prolongada na circulação, cerca de 2 a 3 dias para formas murinas e 4 dias
para anticorpos quiméricos ou humanizados (REYLLI 2006).
Se por um lado essa longa permanência do anticorpo radiomarcado
pode aumentar a acumulação de radioatividade no tumor pelos diversos
mecanismos pelos quais o anticorpo pode extravasar e interagir com as células
tumorais, por outro lado, isso é a maior causa de citotoxicidade inespecífica as
células hematopoiéticas, uma vez que a citotoxicidade da medula óssea está
diretamente relacionada ao tempo da radioatividade no sangue, especialmente
se os mAbs estiverem ligados com radionuclídeos com emissão Beta como o
Iodo-131 (131I) ou yttrium-90 (90Y), conhecido como efeito de fogo cruzado
(“cross fire effect”)33,34. Além disso, em doses máximas toleradas, a RAIT não é
capaz de emitir radiação suficientemente alta que tenha um efeito significativo
no crescimento de tumores sólidos, especialmente quando aplicado como
monoterapia (MOOSMAYER et al. 2006). A construção de fragmentos de
anticorpos com menor peso molecular pela engenharia genética melhorou a
farmacogenética e a penetração no tumor, mas sua aplicação clínica tem sido
limitada pela baixa captação e pequeno tempo de residência no tumor
(MOOSMAYER et al. 2006). A RAIT encontra outras barreiras no tratamento de
tumores sólidos, como pequena circulação sanguínea em tumores grandes,
baixa permeabilidade do endotélio vascular, elevada pressão do fluído
intersticial do estroma tumoral e expressão heterogênea dos antígenos
tumorais (AGGARWAL et al. 2007).
Os anticorpos conjugados a elementos radiativos foram os primeiros
imunoconjugados a serem utilizados na terapia antitumoral. Em 2002, o FDA
aprovou
o
90
Y-(Ibritumomab
tiuxetan[Zevalin])
e
o
131
I-(Tositumomab
[Bexxar]) atualmente os únicos radioconjugados aprovados para o tratamento
de câncer, ambos registrados para terapia em indivíduos portadores de linfoma
não-Hodgkin e refratários a quimioterapia, utilizando para a conjugação um
anticorpo anti-CD20. A eficiência terapêutica do tratamento com RAIT é
superior ao tratamento com anticorpos não conjugados e comparado aos
9
índices obtidos com drogas citotóxicas ou a de anticorpos não conjugados
associados a quimioterapia, para pacientes com NHL em estado avançado. Em
geral, a toxicidade hematológica é mais severa em pacientes submetidos à
quimioterapia do que à RAIT (QU et al. 2008).
Um grande número de novos mAbs conjugados a radionuclídeos estão
sendo testados em ensaios clínicos de fase I e fase II dirigidos contra
antígenos tumorais de diferentes tecidos e órgãos como Linfomas de Células T,
tumores sólidos como câncer colorretal, câncer de ovário, próstata, pâncreas,
pulmão, hepatocelular, renal, de mama, glioma do sistema nervoso central ou
câncer leptomeningeal, meduloblastoma, câncer de cabeça e pescoço e
carcinoma medular de tireoide (SHARKEY et al. 2007; AURISICCHIO et al.
2012).
A RAIT também vem sendo utilizada em combinação com outras
terapias que visam melhorar a distribuição e captação da radiação, como a
administração de Interferon (IFN)-alfa e IFN-gama que aumentam a expressão
de antígenos no sítio tumoral ou potencializam a sua ação como a
administração conjunta de RAIT e quimioterápicos (PALLELA et al. 2008;
OOSTERWIJK et al. 2003).
Os quimioterápicos podem agir como agentes sensibilizadores à
radiação, e podem ter um potencial aditivo ou sinérgico. Nesses casos,
pequenas quantidades das drogas com baixos efeitos de citotoxicidade são
administradas antes, no momento ou após o uso de RAIT (SHARKEY 2007).
Uma vez que a radioatividade pode ser facilmente detectada e medida por
cintilografia ela também foi rapidamente utilizada como uma forma de
diagnóstico por imagem (SHARKEY e GOLDENBERG 2006). Atualmente, com
o advento da tomografia por emissão de pósitrons (PET), mABs pósitronsconjugados fornecem imagens superiores e estão sendo largamente utilizados.
4.
A
SELEÇÃO
DE
UM
ALVO
PRÉVIO
É
O
FUTURO
DA
RADIOIMUNOTERAPIA
A RAIT e o radioimunodiagnóstico começaram com o principio de que
uma molécula alvo (ex. mAb) carregando um radioisótopo tinha o potencial de
selecionar uma imagem ou liberar uma dose terapêutica de radiação no sítio
10
tumoral. O próximo passo foi à constatação de que a injeção prévia de um mAb
dirigido contra uma molécula alvo no sítio tumoral de maneira separada da
injeção de uma segunda molécula de baixo peso molecular, ligada a um
radioisótopo, capaz de se ligar com alta afinidade ao Mab previamente injetado
(estratégia pré-alvo ou “pretargeting strategy”), com meia vida bem curta e
rapidamente excretada pelo rim, reduzia sensivelmente a toxicidade à medula
óssea (SHARKEY e GOLDENBERG, 2006). Devido sua rápida difusão e
eliminação renal, essas pequenas moléculas precisam ser bastante seletivas
ao tumor e sua ligação específica deve ocorrer com alta afinidade, que pode
ser alcançado, por exemplo, com a utilização da ligação avidina/biotina ou pela
ligação hapteno/anticorpo (SHARKEY e GOLDENBERG, 2006; BERNDORFF
et al. 2006; AURISICCHIO et al. 2012). Também aqui, uma ferramenta
promissora é a construção de anticorpos biespecíficos (bsmAbs), onde um
fragmento Fab se liga seletivamente ao antígeno tumoral e o outro fragmento
se liga especificamente em haptenos ou biotina ligados a radionuclídeos como
131
I ou
90
Y. O bsmAb não radioativo é administrado inicialmente e deixado se
acumular no tumor, subsequentemente, o hapteno radioativo de rápida
eliminação é injetado. É necessário otimizar o intervalo de aplicação do bsMab
e o peptídeo irradiado para impedir que anticorpos livres na circulação
sanguínea se liguem aos peptídeos irradiados retardando sua eliminação e
aumentando a toxicidade (REYLLI, 2006; BERNDORFF et al. 2006). Dessa
maneira são superados os dois maiores obstáculos pelo uso da RAIT em
estudos clínicos, a toxicidade a medula óssea e a imunogenicidade. MAbs,
bsmAbs ou outros métodos de terapia utilizando pré-alvos estão sendo
utilizados em modelos animais e em estudos clínicos em indivíduos com câncer
cerebral (Grana, et al. 2002), melanoma (DADACHOVA e CASADEVALL 2006;
URBANO et al. 2007), carcinoma do cólon (GILLIGAN et al. 2000; RESCHE et
al. 2003), carcinoma medular da tireoide (KRAEBER-BODÉRÉ et al. 2006) e
câncer de mama metastático (SENEKOWITSCH-SCHMIDTKE et al. 2001;
SHEN et al. 2005).
5. mAbs CONJUGADOS A ENZIMAS E ATIVAÇÃO DE PRÓ-FÁRMACOS
(ANTIBODY DIRECTED ENZYME PRODRUG THERAPY - ADEPT)
11
Uma tentativa de melhorar a seletividade e aumentar a morte das células
tumorais pelos quimioterápicos é o uso de fármacos de baixa toxicidade (prófármacos) que podem seletivamente ser clivados no sítio tumoral por uma
enzima, resultando em um grande aumento de sua concentração e na
diminuição da toxicidade a outros tecidos quando comparada a quimioterapia
convencional. Para tal, diferentes mecanismos estão sendo propostos: 1utilizando aspectos fisiológicos do próprio tumor como a expressão aumentada
de enzimas seletivas ao tumor, capaz de clivar o pró-fármaco; 2- mecanismos
baseadas na ativação de pró-fármacos por enzimas exógenas levadas ao sítio
tumoral por mAbs (ADEPT); e 3- a geração dessas enzimas no próprio sítio
tumoral transportadas por vírus (“Vírus Directed Enzyme Prodrug Therapy” VDEPT) e pela ativação de genes a partir de rDNA (“Gene Directed Prodrug
Therepy” - GDEPT) (DENNY, 2004; DI STEFANO et al. 2007; HUST et al.
2012).
Várias enzimas, como a beta-glucoronidase, carboxipepetidase2 (CPG2)
e beta-lactamase possuem esta propriedade sendo normalmente expressas no
lisossomo das células ou obtidas a partir de bactérias como Escherichia coli e
Pseudomonas sp. (DENNY, 2004; DI STEFANO et al. 2007).
A ADEPT utiliza inicialmente um mAb conjugado a uma enzima que seja
capaz de converter uma droga inativa em droga ativa dirigido contra os
antígenos tumorais (fase I). Uma vez que o conjugado livre que não se ligou ao
tumor é retirado da circulação sanguínea, pela ação de um anticorpo
anticonjugado, um pró-droga não ativa biologicamente é inoculada sendo
convertida a uma forma ativa pela enzima ligada ao anticorpo (fase II). A
conversão continua da pró-droga em sua forma ativa resulta em um aumento
significativo de sua concentração e citotoxicidade do fármaco sobre as células
tumorais (BAGSHAWE et al. 1994; XU et al. 2004; HUST et al. 2012).
Os melhores fármacos a serem utilizados devem ser moléculas de baixo
peso molecular capazes de se difundir pelas células do tumor e adjacentes
(“Bystander effect”) e com meia vida bastante curta (XU et al. 2004).
A grande vantagem do sistema ADEPT em relação ao uso do próprio
quimioterápico acoplado ao mAb está no aumento, de cerca de 1.000 para
10.000 vezes, do número de pró-fármacos ativados no sítio tumoral
(BAGSHAWE et al. 1999). Semelhante a RAIT com a utilização de pré-alvos,
12
as maiores limitações do sistema ADEPT são a imunogenicidade provocada
por anticorpos murinos somado agora a presença de uma enzima
potencialmente imunogênica e a remoção lenta do conjugado anticorpo-enzima
da circulação. Em diferentes estudos clínicos usando mAbs murinos,
quiméricos ou humanizados e enzimas de origem bacteriana ou humana, os
pacientes formaram anticorpos anticonjugado que limitaram seu uso contínuo
(FRANCIS et al. 2002; HARDING et al. 2005; HUST et al. 2012). Sharma et al.
(SHARMA et al. 1992) relataram que todos os pacientes formaram anticorpos
IgM e IgG contra fragmentos de um mAb murino anti-CEA, conjugado a enzima
bacteriana, carboxipeptidase G2 (CPG2). Para superar parte das limitações
expostas acima algumas estratégias estão sendo desenvolvidas como a
construção de mutantes de enzimas humanas e de enzimas bacterianas
capazes de induzir baixa resposta imune. Harding et al (HARDING et al. 2006)
relataram a construção de uma enzima beta-lactamase mutante bacteriana,
que mostrou baixa imunogenicidade frente a células mononucleares de
indivíduos saudáveis. Por ser capaz de converter várias pró-drogas, como
doxorubicina, vimblastina, Taxol , paclitaxel e melphalan, é uma candidata em
potencial para a utilização em ADEPT.
A construção de proteínas de fusão entre fragmentos de anticorpos e
enzimas por rDNA aumentou a remoção do mAb-enzima e diminuiu a resposta
imune. Roberge et al (ROBERGE et al. 2006) relataram a construção de uma
proteína de fusão entre a enzima beta-lactamase e um fragmento de cadeia
única derivado do hz mAb CC49 com alta especificidade pelo antígeno TAG72, super-expresso na superfície de diferentes tumores sólidos como câncer
colorretal e câncer de pulmão não pequenas células e utilizado em estudos
clínicos de fase I e II (FORERO et al. 2007; HUST et al. 2012). Além de
ultrapassar essas barreiras, a aplicação clínica do ADEPT necessita de alguns
requisitos para o seu sucesso, como a expressão do antígeno tumoral na
superfície ou na matriz celular; alta afinidade e especificidade do mAb; a
enzima conjugada ao mAb deve exercer sua atividade catalítica em pH próximo
ao fluido extracelular do tumor; uma vez que o conjugado mAb/enzima podem
ser imunogênicos eles devem ser removidos antes da aplicação do prófármaco; a enzima escolhida à ser conjugada ao mAb não deve ter um
homólogo humano para evitar a ativação do pró-fármaco fora do sítio tumoral; o
13
intervalo entre a aplicação do conjugado e do fármaco inativo deve ser bem
estabelecido para evitar a ativação do pró-fármaco no plasma e subsequente
toxicidade sistêmica (XU et al. 2004).
Diferentes estudos clínicos têm sido conduzidos para avaliar aspectos
como a capacidade de conversão de pró-drogas alquilantes como a mostarda
nitrogenada capaz de alterar a estrutura e função do DNA bloqueando a divisão
celular pela enzima CPG2 (NAPIER et al. 2000) e o desenvolvimento de novos
fármacos com meia vida extremamente curta capazes de serem rapidamente
removidos da circulação evitando o uso de anticonjugado (MAYER et al. 2006).
Recentemente, Mayer et al (MAYER et al. 2006) descreveram os resultados de
um estudo de fase I utilizando MFECP1, uma proteína de fusão da cadeia
simples do anticorpo anti-CEA e CPG2, seguido da injeção do pró-droga bisiodo fenol mostarda. Vinte e oito pacientes foram avaliados e MFECP1 se
mostrou seguro e bem tolerado, foi removido rapidamente pelo fígado e
apresentou
menor
imunogenicidade
que
tratamentos
anteriores,
com
significativo aumento da sobrevida.
Cabe destacar que em países em desenvolvimento, uma limitação
importante para o uso dessas terapias emergentes é o seu custo elevado.
Segundo Goldenberg & Sharkey (SHARKEY e GOLDENBERG, 2006), o custo
médio mensal para o tratamento de câncer colorretal com bevacizumab é de
U$4,800 e U$12,000 para cetuximab. Barret et al (LOMBERGET et al. 2006)
relataram o elevado custo de Herceptin , indicado no tratamento de mulheres
com câncer de mama, quando comparado a outros tipos de tratamento.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A imunoterapia, especialmente contra os tumores, teve um grande
avanço nos anos 80 e 90 em modelos animais, mas se mostrou pouco eficiente
quando aplicada em humanos. Na última década, no entanto, especialmente
graças ao uso da biotecnologia, um grande número de imunobiológicos
antitumorais estão sendo pesquisados e/ou produzidos. Usados como
monoterapia ou associados à quimioterapia ou radioterapia, representam a
última fronteira no tratamento dessas afecções.
14
Embora o custo ainda represente um fator limitante para seu uso em
escala mundial, a semelhança do que aconteceu com outros medicamentos, na
medida em que sua eficiência e aplicação forem demonstradas, certamente
haverá um aumento na produção e maior acesso a esses tratamentos, mesmo
nos países em desenvolvimento.
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