INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular

INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
NATHÁLIA SILVA OLIVEIRA
ESTUDO DA RESPOSTA IMUNE EM LESÕES INTRAEPITELIAIS ANAIS EM
PACIENTES INFECTADOS E NÃO INFECTADOS PELO HIV E HPV.
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Biologia Celular e Molecular.
Orientador: Prof. Dra. Alcina Frederica Nicol
RIO DE JANEIRO
2015
ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
AUTOR: NATHÁLIA SILVA OLIVEIRA
ESTUDO DA RESPOSTA IMUNE EM LESÕES INTRAEPITELIAIS ANAIS EM
PACIENTES INFECTADOS E NÃO INFECTADOS PELO HIV E HPV.
ORIENTADOR: PROF. DRA. ALCINA FREDERICA NICOL
Aprovada em: 25 de março de 2015
EXAMINADORES:
Prof. Dr. José Augusto Nery - Presidente
Prof. Dr. Dennis Ferreira Carvalho
Prof. Dr. Ruth Khalili Friedman
Prof. Dr. Cecília Vianna Andrade
Prof. Dr. Luiza Pereira Oliveira
Rio de Janeiro, 25 de Março de 2015.
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
ESTUDO DA RESPOSTA IMUNE EM LESÕES INTRAEPITELIAIS ANAIS EM
PACIENTES INFECTADOS E NÃO INFECTADOS PELO HIV E HPV.
RESUMO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Nathália Silva Oliveira
O Papiloma Vírus Humano (HPV) é o principal agente etiológico do câncer do trato anogenital. Uma maior prevalência e incidência de desenvolvimento do carcinoma e doenças
associadas ao HPV têm sido observadas em indivíduos infectados pelo HIV. A história
natural da infecção pelo HPV ainda não está totalmente elucidada, assim como a
resposta imune que ocorre na co-infeção pelo HIV/HPV,principalmente na mucosa anal.
Objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta imune “in situ” em amostras de biópsias
de indivíduos infectados pelo HIV em acompanhamento no Instituto Nacional de
Infectologia/FIOCRUZ, RJ. Um total de 114 biópsias foi analisado através de Tissue
Micro-Array, sendo 15 de indivíduos Não infectados pelo HIV, todos sem lesão, e 99 de
indivíduos Infectados pelo HIV: 21 sem lesão, 39 com NIA1, e 39 com NIA2/3. Foi
realizado PCR e sequenciamento para identificação do DNA de HPV e imunohistoquímica
para análise dos marcadores imunes CD4, CD8, Foxp3, T-bet e IL-10 e SLPI. A análise
estatística foi feita no software SPSS 15.0 aplicando os testes: Kruskall-Wallis, Teste Quiquadrado e Teste Exato de Fisher. Pacientes Infectados pelo HIV com NIA 2/3
apresentaram nadir CD4+ <50 cél/mm³ comparados aos pacientes normais (p = 0,01).
Quanto aos marcadores imunes, indivíduos Infectados pelo HIV apresentaram uma maior
expressão de Foxp3 e IL-10 de acordo com a gravidade da lesão (p= 0,002). Coeficiente
de correlação positiva foi encontrada entre FoxP3 e IL-10 (r=0,34; p=0,27). Observamos
que 93,4% (101/107) das amostras apresentaram DNA de HPV, sendo os tipos de HPV
mais prevalentes: o HPV 16 (26,9%), seguido dos HPV 6 (15,7%), HPV 59 (13%) e HPV
18 (10,2%). Interessantemente amostras de indivíduos que apresentavam DNA de HPV
de alto risco oncogênico foram negativas para SLPI bem como houve uma menor
expressão em amostras com NIA 2/3 comparadas ao grupo sem lesão em indivíduos
Infectados pelo HIV, mostrando uma correlação inversa com o tipo de HPV e grau de
lesão. Sugerimos que os indivíduos infectados pelo HIV apresentem grandes chances de
desenvolverem o câncer anal, devido à alta prevalência do HPV 16 e alta expressão de
IL-10 (Th2) e Foxp3 (células T reguladoras), os quais poderiam estar inativados.Também
foi observado pela diminuição de células T-bet (resposta Th1), nestas lesões de alto grau.
A maioria dos indivíduos infectados pelo HIV, já foram expostos aos 4 tipos de HPV da
atual vacina quadrivalente. Sugerimos que a vacinação contra o HPV deve ser
considerada como medida profilática para reduzir o risco de desenvolvimento de lesões
intraepiteliais anais nos indivíduos Infectados pelo HIV. Nosso estudo parece ser o
primeiro a descrever a associação de SLPI como biomarcador de câncer em amostras de
lesões anais, e a descrever o fator de transcrição T-bet em lesões anais.
iv
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
ESTUDO DA RESPOSTA IMUNE EM LESÕES INTRAEPITELIAIS ANAIS EM
PACIENTES INFECTADOS E NÃO INFECTADOS PELO HIV E HPV.
ABSTRACT
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Nathália Silva Oliveira
Human Papillomavirus (HPV) is the main etiologic agent for lower genital tract cancers. A
higher incidence and prevalence of these cancers has been reported in HIV infected
individuals. The natural history of HPV infection is still unclear and the immune response
with HIV/HPV co-infection, particularly in the anal mucosa, is poorly understood. The aim
of this study was to evaluate the immune response "in situ" in ano-rectal biopsies from
HIV-infected patients followed up at the National Institute of Infectious Diseases /
FIOCRUZ, RJ. A total of 114 biopsies were analyzed by Tissue Micro-Array: 15 were from
HIV negative individuals without any lesions and 99 from HIV-positive individuals: 21
without lesions, 39 with AIN 1 and 39 with AIN 2/3. PCR and sequencing was run to
identify HPV DNA. CD4, CD8, Foxp3, T-bet, IL-10 and SLPI were analyzed by
immunohistochemistry. Statistical analysis was carried out using SPSS 15.0. The
Kruskal-Wallis, chi-square and Fisher's exact tests were applied. HIV-positive patients with
AIN 2/3 showed a nadir count of CD4 + <50 cells/mm³ compared to normal subjects (p =
0.01). HIV positive individuals showed a higher expression of FoxP3 and IL-10 according
to the severity of the lesion (p = 0.002). A positive coefficient correlation was found
between FoxP3 and IL-10 (0.34; p = 0.27). The analysis showed that 93.4% (101/107) of
the samples had HPV DNA, and the most common types were: HPV 16 (26.9%), followed
by HPV 6 (15.7%), HPV 59 (13%) and HPV 18 (10.2%). Interestingly, samples from
individuals with high-risk oncogenic HPV DNA were negative for SLPI and there was less
expression in AIN 2/3 compared to the no-lesion group of HIV + individuals, showing an
inverse association with HPV type and degree of AIN. The HIV-positive individuals may
develop anal cancer due to the high prevalence of HPV 16 and high expression of IL-10
(Th2), despite the high expression of Foxp3 (regulatory cells), which could be inactivated,
also, a decrease of T-bet cells (Th1 response) was observed on these high-grade lesions.
Moreover, most of the HIV-infected individuals have already been exposed to the 4 HPV
types that are covered by the current quadrivalent vaccine, which suggests that the HPV
vaccination should be considered as a prophylactic measure to reduce the risk of anal
intraepithelial lesions in HIV-positive individuals. SLPI was inversely associated with the
degree of squamous cell dysplasia suggesting that a decreased SLPI expression in HPV
infection may play a role in susceptibility to HIV infection. As far as the authors know this
study is the first to describe an SLPI association as a cancer biomarker in anal lesions,
and to verify the the transcriptor factor T-bet in anal lesions.
v
LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS.
AIDS
Síndrome
da
imunodeficiência
adquirida
(acquired
immunodeficiency
syndrome)
ASC
Células escamosas atípicas (atypical squamous cells)
ASC-H
Células escamosas atípicas que não pode excluir lesões de alto grau
ASC-US
Células escamosas atípicas de significado indeterminado
CDC
Centro de controle de doenças (Centers for Disease Control)
CDK
Quinase dependente de ciclina (ciclin-dependentkinase)
dNTP
Desoxirribonucleotídeo Trifosfato (Deoxyribonucleoside Triphosphates)
DST
Doença Sexualmente Transmissível
E2F
Fator de transcrição
FDA
Administração de Alimentos e Drogas (Food and Drug Administration)
HAART
Terapia Anti-retroviral Altamente Ativa (Highly Active Antiretroviral Therapy)
HSH
Homens que fazem sexo com homens
HSIL
Lesão
intraepitelial escamosa
de
alto
risco
(high-grade
squamous
intraepithelial lesions)
HSPGs
Proteoglicanos de Heparam Sulfato (Heparan Sulfate Proteoglycans)
HPV
Papilomavírus humano (Human papillomavirus)
HSV
Vírus Herpes Simples (herpes simplex vírus)
IC
Intervalo de Confiança
ICTV
Comitê Internacional para Taxonomia das Viroses (International Committe
on Taxonomy of Viruses)
INCA
Instituto Nacional do Câncer
INI
Instituto Nacional de Infectologia
Kb
Kilobase
LCR
Região controladora longa (long control region)
LSIL
Lesão intraepitelial escamosa de baixo risco (low-grade squamous
intraepithelial lesions)
M
Molar (concentração)
MgCl2
Cloreto de magnésio
mM
Milimolar
NIC
Neoplasia intraepitelial cervical
NIA
Neoplasia intraepitelial anal (AIN – Anal intraepithelial neoplasia)
vi
Nm
Nanômetro
p53
Proteína de 53kD
pRb
Proteína do Retinoblastoma
Pb
Pares de Base
PCR
Reação em cadeia da polimerase (Polimerase Chain Reaction)
pM
Picomolar
pmol/µL
Picomols por microlitro
pRb
Proteína do Retinoblastoma
SLPI
Proteína inibidora da protease secretória dos leucócitos (Secretory
Leukocyte Protease Inhibitor)
SUS
Sistema Único de Saúde
Taq
Thermusaquaticus
TMA
Micro-arranjo de tecido (Tissue Micro-Array)
UV
Ultravioleta
VAERS
Sistema de reportagem de efeitos adversos de vacinas (Vaccine Adverse
Event Reporting System)
VEGF
Fator de crescimento vascular endotelial
VLP
Partículas semelhantes a vírus (Virus-like particle)
WHO
Organização Mundial de Saúde (World Health Organization)
µg/mL
Micrograma por mililitro
µL
Microlitro
vii
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora, Dra. Alcina Nicol, pelo auxílio e colaboração para a realização
deste trabalho, e principalmente por todas as oportunidades concedidas, confiança
depositada, exemplos e conselhos que contribuíram para minha formação profissional e
pessoal.
A toda a equipe do Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas, que me
ajudaram e acompanharam nesses dois anos. Com especial carinho à Luisa Pereira, por
toda orientação intelectual e incrível gentileza.
Aos técnicos do Serviço de Anatomia Patológica do IINI (IPEC), Marcos e Dulce,
cuja ajuda foi primordial para o início do projeto. Agradeço também ao suporte do
Fontmed e da Dra Andrea Pires, na confecção do TMA. À patologista Dra Cecilia Vianna,
do IFF, que tanto me ajudou com os problemas da imunohistoquímica e por toda a
paciência.
Agradeço também ao amigo Sérgio Amaro, e ao Dr Miguel, do laboratório de
Genética do INCA, cuja ajuda foi primordial para a realização do sequenciamento.
Agradeço imensamente a epidemiologista Ruth Khalili e a estatística Cynthia
Cunha, por todas as reuniões e debates proveitosos que tanto acrescentaram ao projeto e
à minha construção acadêmica.
Muito obrigada a Pós-graduação em Biologia Molecular pela formação acadêmica
de excelência, e a todos os amigos feitos durante as disciplinas, que propiciaram
momentos alegres e de descanso.
A minha família. Meus pais, Susan Oliveira e Geraldo Oliveira, que sempre
tornaram possível prosseguir com meus objetivos. Minha irmã Thaís Oliveira, minha
melhor amiga, que entre brigas e reconciliações sempre ouviu minhas queixas e me
apoiou. Ao meu noivo, Lohran Luiz, que tanto me apoiou e incentivou, secou todas as
minhas lágrimas, contornou todas as angustias, e principalmente por me fazer sorrir nos
momentos mais difíceis.
E agradeço principalmente a Deus, que colocou em meu caminho todas as
pessoas envolvidas nesse trabalho, me guiou, fortaleceu e confortou nos piores
momentos, sempre me mostrando a solução para continuar a caminhada.
viii
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO......................................................................................................................................................1
1.1. EPIDEMIOLOGIA DO HPV..............................................................................................................................................1
1.2. CO-INFECÇÃO HIV E HPV..............................................................................................................................................2
1.3. NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ANAL.......................................................................................................................5
1.4. DIAGNÓSTICO DA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ANAL................................................................................6
1.5. IMUNOHISTOQUÍMICA E BIOMARCADORES.......................................................................................................8
1.6. ASPECTOS BIOLÓGICOS DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO...............................................................................9
1.7. CLASSIFICAÇÃO E TIPOS DE HPV...........................................................................................................................11
1.8. INFECÇÃO E PATOGÊNESE DO HPV......................................................................................................................13
1.9. RESPOSTA IMUNE AO HPV E À CO-INFECÇÃO HPV/HIV.............................................................................16
1.10. VACINAÇÃO PROFILÁTICA CONTRA HPV...........................................................................................................19
2.
OBJETIVOS.........................................................................................................................................................22
2.1. OBJETIVO GERAL...........................................................................................................................................................22
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................................................................................22
3.
MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................................................23
3.1. POPULAÇÃO FONTE: AS COORTES DE MULHERES COM HIV/AIDS E DE HOMENS INFECTADOS
E NÃO INFECTADOS PELO HIV...................................................................................................................................23
3.1.1. PROCEDIMENTOS NA COORTE DE MULHERES COM HIV/AIDS..........................................................23
3.1.2. PROCEDIMENTOS NA COORTE DE HOMENS NÃO INFECTADOS EINFECTADOS PELO
HIV.................................................................................................................................................................................................24
3.1.3. EXAME ANAL E ANUSCOPIA DE ALTA RESOLUÇÃO (AAR)....................................................................24
3.1.4. AMOSTRAS DE BIÓPSIAS AVALIADAS PARA O PRESENTE ESTUDO...............................................25
3.2. BIOMARCADORES DE INTERESSE.........................................................................................................................26
3.3. PREPARO DO TISSUE MICROARRAY (TMA)......................................................................................................27
3.4. IMUNOHISTOQUÍMICA...............................................................................................................................................27
3.5. EXTRAÇÃO E DETECÇÃO DE DNA DE HPV.........................................................................................................29
3.6. GENOTIPAGEM DO HPV NO TECIDO ANAL........................................................................................................32
3.7. GENOTIPAGEM DO HPV NA SECREÇÃO ANAL..................................................................................................33
3.8. VARIÁVEIS SELECIONADAS......................................................................................................................................33
ix
3.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA...............................................................................................................................................34
4.
RESULTADOS....................................................................................................................................................36
4.1. CARACTERÍSTICAS DO GRUPO DE ESTUDO......................................................................................................36
4.2. ANÁLISE DE EXPRESSÃO IN SITU DOS MARCADORES IMUNES CD4+, CD8+, FOXP3+, T-BET+
E IL-10......................................................................................................................................................................................40
4.3. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO BIOMARCADOR SLPI
4.4. CORRELAÇÃO ENTRE OS MARCADORES IN SITU E NÍVEIS DE CD4+ PERIFÉRICOS..................47
4.5. TIPOS DE HPV ENCONTRADOS EM BIÓPSIA E SECREÇÃO ANAL......................................................48
5.
DISCUSSÃO........................................................................................................................................................57
CONCLUSÕES.....................................................................................................................................................67
REFERÊNCIAS...................................................................................................................................................68
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1-1. Estimativa de adultos e crianças vivendo com HIV por região .................................. 3
Figura 1-2 Anatomia do canal anal .................................................................................................................. 5
Figura 1-3 Anuscopia de alta resolução. À esquerda coloração com ácido acético 5%. À
direita coloração com azul de toluidina .......................................................................................................... 7
Figura 1-4 Reação de imunohistoquímica .................................................................................................... 8
Figura 1-5 Ilustração do Papilomavirus humano. Esquerda: Micrografia eletrônica do
Papilomavirus (Stannard 1995). Direita: Organização do genoma do HPV 16 ........................10
Figura 1-6 Analises filogenéticas de 170 tipos de HPV. Árvore filogenética construída
através do método de likelihood separando os HPV por gêneros e tipos ..................................12
Figura 1-7 Processo de infecção pelo HPV. Demonstração do ciclo de infecção pelo HPV
através da entrada do vírus em micro-ruptura no epitélio, ou através da junção escamocolunar .........................................................................................................................................................................14
Figura 1-8 Regulação da entrada do ciclo celular e proliferação no epitélio infectado por
HPV de baixo e alto risco....................................................................................................................................16
Figura 4-4-1 Imunohistoquímica para células CD4+ em amostras fixadas em formol e
incluídas em parafina. ..........................................................................................................................................40
Figura 4-2. Marcação de imunohistoquímica para CD8+, FoxP3 e T-bet ...................................41
Figura 4-3. Marcação imunohistoquímica para IL-10. Todas as células positivas para IL-10
estão coradas em cor castanha.......................................................................................................................43
Figura 4-4. Marcação de SLPI em biopsias anais. .................................................................................45
Figura 4-5. Expressão de SLPI in situ de acordo com o diagnóstico histopatológico ...........46
Figura 4-6. Correlações observadas .............................................................................................................47
xi
LISTA DE QUADROS
Quadro 1-1. Regiões codificantes do genoma do HPV........................................................................11
Quadro 3-1. Marcadores imunohistoquímicos e estratégia de quantificação. ..........................29
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 3-1. Sequência dos iniciadores (76). .............................................................................................31
Tabela 4-1. Características selecionadas segundo status sorológico para o HIV e
diagnóstico histopatológico (2010-2013). ...................................................................................................38
Tabela 4-2. Expressão dos marcadores imunes de acordo com o diagnóstico
histopatológico e sorologia HIV (2010-2013). ...........................................................................................44
Tabela 4-3. Expressão de SLPI segundo oncogenicidade do HPV (2010-2013). ..................46
Tabela 4-4. Tipos de HPV encontrados nas biópsias de acordo com diagnóstico
histopatológico (2010-2013). .............................................................................................................................50
Tabela 4-5. Genótipos de HPV encontrados na secreção anal segundo diagnóstico
histopatológico (2010-2013). .............................................................................................................................52
Tabela 4-6. Sensibilidade, especificidade e grau de concordância entre os genótipos de
HPV encontrados em biópsia e secreção anal (2010-2013). ............................................................54
Tabela 4-7. Oncogenicidade dos HPV encontrados em biópsias de acordo com o
diagnóstico histopatológico (2010-2013). ...................................................................................................56
xiii
1. INTRODUÇÃO
O HPV é considerado uma Doença Sexualmente Transmissível (DST) e
infecta células epiteliais com a capacidade de causar lesões na pele e mucosa em
forma de projeções, podendo ser condilomatosas. Devido a essa apresentação
clínica suas lesões clínicas são conhecidas popularmente como “crista de galo” (1).
A definição do termo papilomavírus foi originada do latim papila, diminutivo de
papula, que significa projeção ou saliência em forma de mamilo, com a junção da
desinência - oma, usada pelos antigos médicos gregos para nomear as tumorações
ou os entumescimentos. Suas espécies foram identificadas de acordo com o grupo
de animais infectados pelo vírus, originando uma nomenclatura binominal em inglês,
logo a espécie capaz de infectar o homem é denominada Papilomavirus humano (do
inglês – Human papillomavirus)(2).
Celsus (1991), citado por Camara e colaboradores (2008), descreve que em
muitos textos da antiguidade, as verrugas genitais já eram consideradas como de
origem venérea, sendo por muito tempo associadas ao homossexualismo
masculino(3).
Em 1891, em Londres, Joseph F. Payne publicou o artigo: On the
contagiousness of commom warts, onde mostrou a natureza infecciosa das
verrugas, descrevendo o desenvolvimento dessas estruturas em seu próprio
polegar, por auto-inoculação de material raspado da superfície de uma lesão
verrucosa de uma criança. Com a utilização da microscopia eletrônica e o cultivo de
células, por volta de 1940, Maurice Strauss e outros pesquisadores da Escola de
Medicina da Universidade de Yale, New Haven, Connecticut, observaram partículas
que se assemelhavam aos vírus em amostras de verrugas da pele, também
chamadas de papilomas(3).
1.1.
EPIDEMIOLOGIA DO HPV
A infecção pelo Papilomavírus humano (HPV) é uma das principais doenças
sexualmente transmissíveis (DSTs) da atualidade, capaz de levar ao câncer.
Analisando estudos multicêntricos, estima-se que aproximadamente 50% de toda
população sexualmente ativa será infectada pelo vírus em algum momento de suas
vidas, e a prevalência situa-se entre 6% e 72% na dependência da população
1
estudada e do método diagnóstico utilizado, e que 5% de todos os carcinomas no
mundo tem o HPV como agente etiológico, tornando esse vírus um importante
campo de estudo para o entendimento e prevenção dos carcinomas relacionados
com o HPV(4).
Segundo a organização Mundial da Saúde, o HPV é responsável por 530,000
casos de câncer cervical por ano, com 275,000 mortes (4). Além do câncer cervical,
o HPV também está associado ao desenvolvimento carcinogênico em outros sítios,
como ânus, vagina, vulva, pênis e orofaringe. Sendo as zonas de transformação de
epitélio escamo-colunar os principais sítios de desenvolvimento de lesões
neoplásicas (5).
Pesquisas estimam que no mínimo 50% dos indivíduos sexualmente ativos
entrarão em contato com o vírus em algum momento de suas vidas, e para as
mulheres esse contato ocorrerá até os 50 anos de idade em 80% da população
feminina(1). De acordo com a organização Mundial da Saúde (OMS), existem
aproximadamente 9 a 10 milhões pessoas infectadas no Brasil, estima-se que 700
mil novos casos surjam a cada ano, sendo desta maneira a infecção pelo HPV
considerada uma epidemia(6).
Dentre os tipos de HPV considerados de alto risco oncogênico, os tipos 16 e
18 apresentam maior associação com o câncer anogenital e do trato aerodigestivo,
onde 21-40% da população geral apresenta HPV de alto risco, de acordo com
estudo realizado no Brasil. Quanto aos HPV de baixo risco, que geralmente estão
associados com o aparecimento dos condilomas, destacam-se os tipos 6 e 11 entre
os mais encontrados na população infectada no Brasil (1,7).
A presença de HPV em lesões anais está aumentando, conforme dados da
literatura. Dentre os indivíduos infectados pelo HIV e diagnosticados com NIA de alto
grau, o HPV é detectado entre 11% e 52% nos homens, e entre 6% e 20% nos
indivíduos não infectados pelo HIV. Esse número é menor quando observado a
presença do HPV em mulheres não infectadas pelo HIV, sendo a taxa de 1 a 2,8%
dos casos(8,9).
1.2.
O
CO-INFECÇÃO HIV e HPV
vírus
da
imunodeficiência
humana
–
HIV
(do
inglês
Human
Immunodeficiency Virus) é um retrovírus com 100 nm de diâmetro, composto por
envelope lipoproteico e um núcleo que abriga duas moléculas de RNA idênticas de
2
9,2 Kb e suas enzimas virais: transcriptase reversa, integrase e protease. O HIV esta
presente em todos os fluídos corporais, sendo usualmente transmitido pelo sangue e
secreções genitais, principalmente através de relação sexual. Esse vírus infecta
primariamente linfócitos T CD4+, onde se integra ao genoma hospedeiro, se replica
e rompe a célula pela liberação dos novos vírus(10). O HIV-1 infecta também células
apresentadores de antígenos (APCs), macrófagos, entre outras células imunes,
causando depleção e eventual imunodeficiência, de maneira que por um processo
complexo de patogênese, é o agente etiológico da síndrome da imunodeficiência
adquirida – AIDS (do inglês – Acquired immunodeficiency syndrome)(11).
O HIV-1 é uma doença sexualmente transmissível (DST) disseminada
mundialmente, de maneira a ser considerada uma epidemia. Segundo a organização
mundial da saúde, em dado publicado em julho de 2013, é estimado que 35,0
milhões de pessoas no mundo estão infectadas pelo HIV (Figura 1.1)(12).E no
Brasil, segundo o Ministério da Saúde, 734 mil pessoas estão infectadas por esse
vírus. Segundo o boletim epidemiológico, os grupos populacionais em situação de
maior vulnerabilidade são usuários de drogas, HSH e mulheres profissionais do sexo
(13).
Figura 1-1. Estimativa de adultos e crianças vivendo com HIV por região. Adaptado de WHO,
2013.
Devido à capacidade do HIV-1 causar imunossupressão, a possibilidade de
infecções oportunistas aumenta consideravelmente. Dentre uma das principais DST
3
associadas ao HIV-1, além do vírus Herpes simplex tipo 2, está o Papilomavirus
humano (HPV) (14). Na co-infecção pelo HIV/HPV ocorre alteração na expressão de
proteínas do ciclo celular e regulatórias, como a p27, proteína do retinoblastoma
(pRb) e fator de crescimento vascular endotelial(VEGF), favorecendo a persistência
da infecção do HPV e o desenvolvimento do câncer invasivo (15). De maneira que a
infecção pelo HIV-1 tornou-se um importante fator de risco para a infecção e
persistência do HPV (16).
Além disso, em recente meta-análise, foi observado que a infecção
múltipla,por mais de um tipo de HPV de alto risco oncogênico aumenta o risco de
aquisição do HIV-1, quando comparado à homens e mulheres não infectados pelo
HPV (14).Em outro estudo a prevalência de infecção por qualquer tipo de HPV foi de
36,3% de 5578 mulheres infectadas pelo HIV, e 12% de múltiplas infecções, sendo
os HPV mais encontrados os tipos 16, 18, 31, 33, 52 e 58.
Do mesmo modo, ao analisar mulheres infectadas pelo HIV em diferentes
regiões do mundo foram encontradas as seguintes prevalências da infecção pelo
HPV: na América do sul e central 57%; na África 57 %; nos Estados Unidos 31% ena
Ásia 31% (17).
No Brasil, um estudo realizado com amostras anais de 863 mulheres
infectadas pelo HIV encontrou 31% de positividade para pelo menos um tipo de HPV
de alto risco. Os 3 tipos de alto risco oncogênico mais prevalentes foram: HPV 16
(20%), 56 (12%) e 68 (11%), enquanto que os HPV de baixo risco oncogênico foram
os HPV 44 (16%), 53 (12%) e 6 (10%) (18).
O câncer anal na população geral é considerado raro, sua incidência entre
homens e mulheres aumenta cerca de 2% ao ano. Mulheres infectadas pelo HIV têm
7 vezes mais chances de desenvolverem câncer anal quando comparadas com a
população em geral. A incidência de câncer anal em indivíduos infectados pelo HIV
é maior que indivíduos não infectados, principalmente em homens que fazem sexo
com homens (HSH). Estudo esse observou que a principal via de contaminação pelo
HIV foi através de sexo desprotegido com parceiro infectado e que a alta incidência
de câncer ano-genitais pode ter influência da infecção persistente pelo HPV(19).
Ao contrário de outras doenças associadas à AIDS, a incidência de
neoplasias anais não diminuiu com o advento da terapia anti-retroviral altamente
ativa – HAART (do inglês - Highly Active Antiretroviral Therapy), também
mencionada como Terapia Anti-retroviral Combinada - cART.Essa observação foi
atribuída ao fato que homens em tratamento cART apresentavam AIDS mais
4
avançada, o que é um fator de risco, em relação aos homens que não estavam em
tratamento. Baixas contagens de CD4+ periféricos e o aumento do tempo de vida
dos indivíduos infectados pelo HIV também foram atribuídas a esse quadro(20).
1.3.
NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ANAL
A Neoplasia Intraepitelial Anal (NIA) é a lesão precursora do carcinoma de
células escamosas do ânus. Apesar desse tipo de carcinoma ser considerado raro,
sua
incidência
em
homens
e
mulheres
está
aumentando
mundialmente,
principalmente em indivíduos infectados pelo HIV. Dentre os principais fatores de
risco para seu desenvolvimento, destacam-se a infecção pelo HPV e HIV, prática de
intercurso anal e imunossupressão (21).
O canal anal situa-se entre a pele perianal e o epitélio colunar (Figura 1.2). A
linha dentada, ou linha pectínea, é um ponto de referência macroscópico que divide
o canal anal no local de transição entre a mucosa escamosa e não escamosa.
Dessa maneira, os tumores que acometem o canal anal podem ser queratinizados
ou não queratinizados, dependendo de sua localização em relação à linha pectínea.
(21,22).
Figura 1-2 Anatomia do canal anal. (Adaptado de Ryan, 2000)
A histologia da neoplasia intraepitelial anal é bastante semelhante à vista nas
neoplasias cervicais. Assim como para a cérvice o grau de displasia também é
5
classificado de maneira semelhante. A NIA 1 caracteriza-se por displasia leve, com
aproximadamente 20-25% da espessura do epitélio contendo células displásicas,
considerada lesão intraepitelial de baixo grau – LSIL (do inglês Low-grade
Squamous Intraepithelial Lesion). E NIA 2 por displasia moderada e NIA 3 para
displasia acentuada, com mais de 50% do epitélio abrigando células displásicas, de
maneira que os graus 2 e 3 são comumente diagnosticados como lesão intraepitelial
de alto grau – HSIL (do inglês High-grade Squamous Intraepithelial Lesion) (21,22).
Essas
lesões
ocorrem
no
canal
anal
como
citado
anteriormente,
principalmente na região de transformação do epitélio estratificado para o epitélio
glandular. A lesão intraepitelial escamosa de baixo grau (LSIL) pode regredir ou
evoluir para uma lesão de alto grau dependendo da resposta do hospedeiro e do tipo
viral, enquanto que as lesões de alto grau estão fortemente associadas com a
progressão para o câncer. Semelhante ao que é visto na epidemiologia do câncer
cervical, 90% dos casos de câncer anal apresentam associação com a infecção
persistente pelos HPV de alto risco 16 e 18 (16,23,24).
1.4.
DIAGNÓSTICO DA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ANAL
O epitélio anal é muito similar ao epitélio cérvico-uterino, por esta razão a triagem
citológica é semelhante ao Papanicolau, e em conjunto com a anuscopia de alta
resolução, são os métodos mais empregados para a detecção das lesões anais,
com sensibilidade entre 80 a 90%, variando de acordo com o quadrante da área
indicada pela anuscopia, e mais sensível quando há contagens de CD4+ menor que
400 cél/mm³, em pacientes infectados pelo HIV(25).
A anuscopia de alta resolução é um método de diagnóstico clínico para detecção
de áreas potencialmente neoplásicas no canal anal. Esse exame é realizado com o
auxílio de um aparelho chamado anuscópio, que aumenta o poder de visão do
médico, permitindo a visualização de lesões clínicas, caracterizadas pelos
condilomas anais. Esse método também é utilizado para detecção de lesões no
pênis, vagina e colo de útero. Para a visualização das lesões subclínicas,
geralmente de caráter maligno, que não são visíveis a olho nu, com aumento de 1416 vezes feitos pelo colposcópio, faz-se aplicação prévia do ácido acético a 5%
abaixo da linha pectínea e a 2% acima da linha pectínea e depois o azul de toluidina.
São consideradas positivas as áreas coradas em azul escuro pelo azul de toluidina,
e coloração aceto-branca pelo ácido acético (Figura 1.3) (26).
6
Este fenômeno acontece devido ao ácido acético provocar e coagulação
temporária de proteínas e vaso constricção, corando as áreas ricas em proteínas em
coloração branco-opaca. O azul de toluidina é um corante vital e impregna as
regiões alteradas com células ricas em DNA, que estão em processo de divisão
celular (26). A vídeo-anuscopia de alta resolução é realizada utilizando-se um vídeocolposcópio digital e é muito similar a colposcopia. Pode-se usar ácido acético a 3%
para auxiliar a visualização do epitélio anormal, pois as alterações são muito
similares às causadas na cérvice. Outros sinais de neoplasia intraepitelial anal (NIA)
são áreas de vascularização anormal com características tipo pontilhado, mosaico e
vasos atípicos(27,28).
Figura 1-3 Anuscopia de alta resolução. À esquerda coloração com ácido acético 5%. À direita
coloração com azul de toluidina. (Adaptado de Magi e colaboradores, 2006).
Durante o procedimento podem ser realizadas biópsias direcionadas de
acordo com os achados na anuscopia, fixadas com formol a 10% e submetidas a
técnicas de histopatologia para coloração com Hematoxilina-Eosina e diagnóstico da
lesão pelo médico. Na lâmina vista através do microscópio, é observado estroma de
tecido conjuntivo papilar viloso, coberto por um epitélio que pode apresentar
hiperceratose. Um dos sinais de infecção pelo HPV é o aparecimento de coilócitos,
caracterizados por vacuolização perinuclear, que aparecem principalmente nas
displasias de baixo grau e lesões condilomatosas. No início da evolução da lesão, a
membrana basal permanece intacta e sem evidências de invasão do estroma
adjacente, porém dependendo da evolução da infecção e da resposta do hospedeiro
podem aparecer lesões compatíveis com neoplasias intraepiteliais e câncer invasivo
(29).
1.5.
IMUNOHISTOQUÍMICA E BIOMARCADORES
7
A
imunohistoquímica
permite
detectar
“in
situ”
proteínas
do
HPV,
evidenciando sua infecção, além de proteínas consideradas biomarcadores de
progressão de tumor que são amplamente utilizadas no diagnóstico de neoplasias.
Essa técnica é baseada na especificidade antígeno-anticorpo. Para que essa
interação seja evidenciada é necessária a utilização de um anticorpo secundário,
caracterizando uma reação imunoquímica. Este segundo anticorpo interage
especificamente com o anticorpo primário, e é conjugado com enzimas ou
substâncias fluorescentes que permitem a sua visualização (Figura 1.4). Os
métodos mais comumente empregados utilizam reação com a formação do
complexo peroxidase-antiperoxidase ou avidina-biotina-peroxidase(15).
Figura 1-4 Reação de imunohistoquímica. (Fonte: http://www.anticorpos.com.br/exames/imunohistoquimica.aspx)
Através dessa técnica, é possível detectar o revestimento proteico das
partículas virais do HPV em cortes histológicos obtidos a partir de biopsias. Para
isso é utilizado anticorpos policlonais e monoclonais específicos para antígenos do
capsídeo viral. A imunohistoquímica apresenta alta especificidade, porém, a
sensibilidade deste método diminui quando ocorre a integração do genoma viral à
célula hospedeira, como nos casos de lesões intraepiteliais de alto grau e dos
carcinomas epidermóides invasores (15,30).
Além da detecção das proteínas virais, a análise de proteínas consideradas
biomarcadores de proliferação celular são amplamente utilizadas na rotina de
diagnóstico patológico. Esses biomarcadores, foram inicialmente estudados em sua
relação com o câncer cervical associado ao HPV. As proteínas mais utilizadas
8
atualmente são: p16, p53 e Ki-67, que apresentam perfil bastante característico de
acordo com o grau de lesão (31).
As técnicas de imunohistoquímica têm permitido a identificação de novas
moléculas marcadoras, que estão relacionados ao comportamento biológico das
neoplasias e associadas à presença do HPV. Recentemente estudos demonstram
que a expressão da proteína inibidora da protease secretória dos leucócitos – SLPI
(do inglês Secretory Leukocyte Protease Inhibitor) está inversamente correlacionada
com a progressão de lesões neoplásicas no carcinoma escamoso de cabeça e
pescoço e com a presença de HPV. Estudos conduzidos nessa área suportam a
ideia de que SLPI bloqueia a entrada de HIV e HPV na célula através de sua ligação
a um receptor comum, o heterotetrâmero Anexina A2-S100A10. Esses dados
colocam a SLPI como possível biomarcador para lesões neoplásicas causadas pelo
HPV (32).
A proteína SLPI é uma anti-leucoprotease de 11,7-Kda, não glicosilada, que
inibe moléculas secretadas por neutrófilos como a elastase, catepisina G,
quimiotripisina e tripsina (32). SLPI é produzida por células epiteliais do pulmão,
mama, endométrio, ovário, glândulas salivares e várias células imunes como
neutrófilos, macrófagos e linfócitos B. Essa proteína possui potente papel inibidor
sobre a elastase de neutrófilos, demonstrando ser um importante fator de proteção
contra a proteólise em pele e mucosa (32,33).
A elastase, capaz de clivar uma variedade de proteínas estruturais, também
ativa metalo-proteinases que degradam a matriz, culminando em aumento de matriz
extracelular clivada.
Além disso, SLPI inibe diretamente metalo-proteinases
secretadas por macrófagos, possivelmente pela inibição de Nf-KB. Dessa maneira, a
ausência de SLPI está associada com o aumento da atividade de elastase, atraso na
reposição de matriz extracelular e cicatrização aberrante do epitélio (34,35).
Devido as suas características, como ser produzida por células epiteliais e
sua propriedade antimicrobiana, antiproteolitica e anti-inflamatória, SLPI tornou-se
alvo de estudos voltados para o processo de carcinogênese em vários tipos de
tumores (35). No entanto, seu papel ainda não está bem esclarecido e há
controvérsias sobre seu papel em diferentes tipos de tumores, onde dependendo do
tipo de câncer é observado aumento ou diminuição de sua expressão (36). Em
tumores de fígado e ovário, SLPI foi observada com potencial papel protetor contra
metástase. Porém no câncer de ovário SLPI foi associado com o processo de
metástase e proliferação de células tumorais. Diante disso, o papel de SLPI no
9
desenvolvimento de tumores está longe de ser esclarecido, tornando importante o
seu papel em diversos tipos de câncer (37,38).
1.6.
ASPECTOS BIOLÓGICOS DO PAPILOMAVIRUS HUMANO
O Papilomavirus humano possui diâmetro entre 52 a 55nm, com simetria
icosaédrica, não envelopados. Cada partícula viral é constituída por única fita de
DNA circular dupla hélice, genoma com aproximadamente 7900 pares de bases e
peso molecular de 5,2 x 106 daltons (Figura 1.5). Seu capsídeo, que envolve o DNA
viral, é formado por 72 pentâmeros chamados capsômeros, e é formado por duas
proteínas estruturais: L1 (proteína principal), de 55 kDa, e L2 (proteína secundária),
de 70 kDa(39).
Figura 1-5 Ilustração do Papilomavirus humano.Esquerda: Micrografia eletrônica do Papilomavirus
(Stannard, 1995). Direita: Organização do genoma do HPV 16. Adaptado de Doorbar, 2012.
O genoma do Papilomavírus humano possui três domínios (Figura 1.5): a
região que compreende os genes de expressão precoce, denominados “E” (do
inglês early), onde se localiza os genes E1, E2, E4, E5, E6 e E7, compreendendo
um fragmento de cerca de 4Kb; uma região de 3Kb englobando os genes L1 e L2,
genes de expressão
tardia, denominados “L” (do
inglês
late); E a Região
regulatória (LCR), também citada como upstream regulatory region (URR), que se
encontra entre a extremidade 5’ da região precoce e a extremidade 3’ da região
tardia, de aproximadamente 1Kb, não contendo capacidade codificadora porém
apresenta elementos reguladores como citado anteriormente (39,40).
Resumidamente, as funções de cada região do genoma estão descritas no
Quadro 1.1:
10
Quadro 1-1. Regiões codificantes do genoma do HPV (39).
Região
E1/E2
E4
E5
E6
E7
L1/L2
Função
Codificam as proteínas responsáveis pelo controle dos genes E6 e E7;
Codifica uma proteína de função ainda desconhecida, porém segundo alguns autores pode
controlar a liberação do vírus pelas células;
Codifica uma proteína hidrofóbica responsável pelo aumento do tempo de vida da célula
hospedeira;
As proteínas codificadas por esse gene inibem negativamente os reguladores do ciclo celular
e inibem também p53, que é um fator de transcrição que induz apoptose;
Codifica a proteína viral que se liga a uma proteína supressora de tumor, o pRb, permitindo
que a célula siga com o ciclo celular sem manifestar sinais mitogênicos;
Codificam as proteínas estruturais do capsídeo viral;
1.7.
CLASSIFICAÇÃO E TIPOS DE HPV
De acordo com o Comitê Internacional para Taxonomia das Viroses (ICTV - do
inglês – International Committe on Taxonomy of Viruses), esses vírus pertencem à
família Papilomaviridae, e são classificados em 12 gêneros (Figura 1.6), sendo
cinco capazes de infectar humanos: Alfa, beta, gama, mu e nu, enquanto que os
demais infectam outros animais. Os tipos pertencentes ao gênero Alfa papilomavirus
são capazes de causar lesões cutâneas e mucosas em primatas. Aproximadamente
60 tipos pertencentes a este gênero são predominantemente detectados no trato
ano-genital e oral em cerca de 70% da população, está diretamente relacionado com
o desenvolvimento de lesões neoplásicas, de tal maneira a ser os que apresentam
maior relevância clínica (41,42).
11
Figura 1-6 Analises filogenéticas de 170 tipos de HPV. Árvore filogenética construída através do
método de likelihood separando os HPV por gêneros e tipos (Villiers, 2013).
Em torno de 170 tipos já tiveram seu genoma completo sequenciado. Os vírus
capazes de infectar mucosas podem ainda serem classificados quanto ao seu
potencial oncogênico, sendo agrupados em alto risco os tipos de HPV 16, 18, 31, 33,
35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, e 82, em baixo risco os tipos 6, 11, 40, 42, 43,
44, 54, 17, 61, 70, 72, 81 e 89. Os tipos 26, 53 e 66, 67 e 69 são designados como
provavelmente de alto risco, e os tipos 34, 57 e 83 são considerados de risco
indeterminado (39,43,44).
Os subtipos de alto risco estão altamente associados ao desenvolvimento de
lesões neoplásicas. Em recente estudo publicado em 2014 por Pirog e
colaboradores, onde foram avaliadas 760 amostras de câncer cervical colhidos em
diversos países, foram observados 71,8% de positividade para HPV de alto risco, e
em 7% das amostras foi encontrado mais de um tipo de HPV. De maneira que os
tipos mais prevalentes foram o HPV 16 (50,9%), seguido do HPV 18 (31,6%) e HPV
45 (11,6%) (45).
Os HPV de baixo de risco normalmente estão associados com lesões clínicas, de
caráter benigno, denominadas de condiloma acuminado, ao passo que os tipos mais
12
prevalentes na população são os HPV6 e 11. Essas lesões podem persistir por
meses ou anos e em indivíduos imunocompetentes normalmente essas lesões são
eliminadas pelo próprio organismo. Porém, essas lesões tem o quadro complicado
em indivíduos imunodeprimidos, onde a eliminação da lesão é dificultada pela falha
na resposta imune, e em casos raros podem evoluir para lesões malignas (46).
1.8.
INFECÇÃO E PATOGÊNESE DO HPV
O desenvolvimento de câncer no trato ano-genital está fortemente associado
com a persistência na infecção de tipos de HPV de alto risco e com a desregulação
da expressão gênica do hospedeiro, que leva a massiva proliferação celular,
deficiência no reparo do DNA, e acúmulo de dano genético na célula infectada (46).
O ciclo de vida do HPV está diretamente ligado ao processo de diferenciação
de queratinócitos. Acredita-se que para que o HPV consiga infectar células
hospedeiras em epitélios estratificados, se faça necessária à presença de microrupturas no epitélio, comumente causadas pelo ato sexual, que permitem o alcance
do HPV à camada basal, permitindo a entrada de virions infecciosos nas células em
estado de proliferação. A infecção normalmente acontece na junção epitélio escamocolunar (JEC), também conhecida como zona de transformação (ZT), onde o vírus
consegue alcançar diretamente as células mucosas em estado proliferativo (47,48).
Alguns estudos apoiam a suposição de que o vírion é internalizado na célula
em um processo lento, e ocorre através de endocitose mediada por vesículas de
clatrina. Para a entrada na célula acredita-se que seja necessário a ligação da
proteína L1 do capsídeo a receptores HSPGs, proteoglicanos de heparam sulfato
(do inglês, heparan sulfate proteoglycans), encontrados na membrana de células da
camada basal. Em seguida ocorre mudança conformacional das proteínas do
capsídeo viral permitindo exposição da porção N-terminal da proteína L2 à clivagem
porperforinas (48,49).
Por ser um vírus não envelopado a liberação do DNA viral pelo capsídeo no
interior da célula ocorre de maneira menos complexa, facilitando o transporte do
material genético ao núcleo da célula hospedeira. Como citado acima, as partículas
virais são endocitadas nos endossomos tardios e/ou lisossomos, as partículas virais
são desmontadas e o DNA do HPV é transportado para núcleo com auxílio da
proteína L2 (46–48).
13
As células infectadas se tornam reservatórios. Nessa etapa o vírus utiliza a
maquinaria proteica da célula hospedeira para manter a manutenção do genoma
viral em baixo número de cópias na forma epissomal. O padrão de expressão viral
nessa fase ainda não está bem esclarecido, contudo há concordância que as
proteínas E1 e E2 são expressas a fim de manter o DNA viral na forma epissomal e
garantir a segregação do genoma as células hospedeiras descendentes de forma
que pelo processo de estratificação do epitélio, essas células atingem camadas
superiores (46,48).
No epitélio normal, quando as células atingem a camada intermediária, essas
células entram em processo terminal de diferenciação que leva a parada do ciclo
celular, onde acontecem alterações na produção de lipídeos e em filamentos de
queratina, o que permite a formação da barreira natural do epitélio. Em lesões
intraepiteliais de baixo grau, as células infectadas na camada basal são estimuladas
à produção das proteínas virais E6 e E7, que estimulam a célula à divisão celular
devido a interação com proteínas atuantes nos mecanismos de controle do ciclo
celular, como p53 e pRb. De maneira que o aumento da expressão de E6 e E7 está
relacionado com o desenvolvimento da neoplasia (46,50).
Quando as células infectadas atingem a camada intermediária do epitélio,
proteínas necessárias à amplificação do genoma viral têm sua expressão
aumentada. Essas células apresentam expressão da proteína E4, e entram na fase
S ou G2 do ciclo celular. Ao alcançar a camada superior do epitélio, as células com
alta expressão de E4, passam a expressar as proteínas do capsídeo viral L1 e L2,
permitindo o empacotamento do genoma viral. O processo de infecção está
resumido na Figura 1.7(46,48).
Figura 1-7 Processo de infecção pelo HPV. Demonstração do ciclo de infecção pelo HPV através
da entrada do vírus em micro-ruptura no epitélio, ou através da junção escamo-colunar. As células
com núcleos vermelhos indicam expressão das oncoproteínas virais E6 e E7; Células coradas em
14
verde representam expressão de E4; Células laranjas representam expressão das proteínas de
capsídeo L1 e L2 (Adaptado de Doorbar, 2012).
A participação das proteínas E6 e E7 no desenvolvimento de neoplasia entre
os tipos de baixo e alto risco oncogênico ainda não está totalmente esclarecida.
Porém sabe-se que as proteínas oriundas de ambos os tipos têm particularidades,
que hipotetizam a causa dos HPV de alto risco levarem ao câncer, enquanto que os
tipos de HPV de baixo risco apresentam fraca relação com o desenvolvimento de
neoplasias. Fato esse que impossibilita generalizar o papel dessas proteínas na
infecção pelo HPV (46).
É importante ressaltar que os HPV de baixo e alto risco oncogênicos
apresentam diferenças quanto a posição e regulação de seus promotores, assim
como no padrão de splicing de RNA mensageiro. Essas diferenças afetam o padrão
de expressão de E6 e E7. Dessa maneira, correntes de estudo defendem que essas
diferenças no padrão de expressão podem determinar a diferença no fenótipo de
lesão visualizado na infecção pelos HPV de alto e baixo risco (48).
Nas lesões causadas pelos HPV de baixo risco oncogênico (Figura 1.8, A), a
proliferação na camada basal é regulada pela presença de fatores de crescimento,
assim como no epitélio normal não infectado. O papel de E6 e E7 nessas lesões é
manter ciclo celular, inibindo proteínas regulatórias, a fim de facilitar a amplificação
viral. E7 de baixo risco tem a capacidade de se ligar a uma proteína membro da
família de retinoblastomas, o p130, deslocando E2F4 e transativando genes
(codificadores das proteínas MDM2, PCNA, Ki-67 e ciclinaE) responsáveis pela
entrada na fase S do ciclo celular. Dessa maneira, não é necessária a fosforilação
de E2F4 pela ciclina D/cdk para que a célula entre em estado proliferativo, como é
visto no epitélio normal. Diante disso, p16, que é responsável por um feedback
negativo controlando a expressão dela mesma e de ciclina D/cdk e prevenindo a
divisão celular exacerbada, deixa de desempenhar seu papel, uma vez que os
genes responsáveis pela proliferação continuam sendo transativados independente
de ciclina D/cdk (46).
Na infecção pelos HPV de alto risco oncogênico (Figura 1.8, B), também há o
deslocamento de E2F4 através da interação de E7 com p130, levando a indução da
fase S do ciclo celular. Em decorrência disso, altos níveis de p14arf comprometem a
função normal de MDM2 em degradar p53, o que leva ao seu aumento. A proteína
p53 é responsável por mediar a parada do ciclo celular, porém sua função é inibida
15
pela proteína E6 de alto risco, que associada com a ubiquitina ligase E6AP leva a
degradação de p53 através de ubiquitinação, permitindo dessa maneira a
proliferação celular exacerbada e possível progressão para lesão neoplásica (46).
Figura 1-8 Regulação da entrada do ciclo celular e proliferação no epitélio infectado por HPV
de baixo e alto risco. (A) Epitélio infectado por HPV de baixo risco. (B) Epitélio infectado por HPV de
alto risco. Em ambas as representações os núcleos vermelhos representam células em proliferação.
As células coradas em verde demonstram expressão de E4. Os núcleos amarelos representam
expressão de L1. (Adaptado de Doobar, 2012).
No caso de E6 e E7 oriundas de tipos de alto risco, possuem um importante
papel na proliferação celular nas camadas basal e parabasal. Como citado acima a
proteína E6 de alto risco tem a capacidade de se ligar a p53 e promover sua
degradação, além de ativar a telomerase, inibir a apoptose e a resposta promovida
por interferon.
E7 de alto risco é capaz de se ligar e degradar pRb e p107 assim como gerar
instabilidade ao genoma do hospedeiro e suprimir a função de STAT-1. Enquanto
que E6 e E7 de baixo risco não executam essas atividades, o que torna o epitélio
infectado pelo HPV de alto risco mais suscetível ao desenvolvimento de neoplasias
(46,48).
1.9.
RESPOSTA IMUNE AO HPV E À CO -INFECÇÃO HPV/HIV
Em indivíduos infectados pelo HIV é observado aumento da incidência,
prevalência e persistência da infecção pelo HPV, que é atribuído ao aumento da
suscetibilidade à infecção e diminuição da habilidade de eliminar o HPV devido à
deficiência de resposta imune mediada por célula, todas essas características
associadas à imunossupressão causada pelo HIV (51).
16
A resposta imune inata contra o HPV é mediada principalmente por macrófagos e
células NK (do inglês – Natural Killers). Porém o longo período observado entre a
infecção inicial, e a indução de proliferação neoplásica promovida pelo HPV aponta
a capacidade desse vírus de evadir o sistema imune. De fato, o ciclo de infecção é
caracterizado por baixa replicação do genoma e produção de proteínas virais,
ausência de inflamação e ciclo replicativo não lítico, o que limita os sinais que ativam
a resposta imune do hospedeiro. A resposta imune contra o HPV geralmente é
pouco eficiente pois no início da infecção o vírus permanece confinado nas células
basais do epitélio, protegido das células imunes circulantes, em estado de baixa
replicação de proteínas virais (52).
A resposta gerada por interferon (IFN), citocinas chave na resposta antiviral, é
suprimida pelas proteínas virais E6 e E7 de HPV de alto risco oncogênico, que
inibem receptores de IFN impedindo resposta por essa via. Os macrófagos, que têm
importante papel antiviral, através da secreção de TGF-α, também são neutralizados
pela resposta de E6 e E7 de alto risco oncogênico, que inibem a translocação dos
macrófagos, impedindo a morte da célula infectada (53). Recentes estudos também
mostraram regulação negativa de receptores de CD1d na superfície de células
infectadas por HPV 6 ou 16, mediada por E5, mostrando outro mecanismo de
evasão do sistema imune (54).As células de Langerhans estão diminuídas na
infecção pelos HPV de alto risco oncogênico. Ao passo que é visto aumento de
células T regulatórias (CD4+/CD25+/FoxP3+), também chamadas de T-reg,
responsáveis por mediar tolerância da resposta imune, através da regulação da
resposta de linfócitos Th1 (ricos em CD45-RA e T-bet) e Th2 (ricos em CD45-RA e
GATA-3). As T-regs com a produção de IL-10 e TGF-β1. IL-10 produzida por T-regs
é capaz de prejudicar a apresentação de antígenos pelas células dendriticas (DC),
prevenindo dessa maneira a resposta imune mediada por células T contra as células
malignas. Ao mesmo tempo, IL-10 dificulta a apresentação de antígenos por DCs
através da redução da expressão do antígeno leucocitário humano – HLA (do inglês
– Human Leukocyte Antigen) classe II, redução de moléculas co-estimulatórias e
citocinas produzidas por linfócitos Th1. IL-10 também inibe a resposta inflamatória e
favorece o desenvolvimento de tumores (55).
Dessa maneira, a resposta imune efetiva é gerada somente nos estágios tardios
da infecção, quando queratinócitos supra-basais apresentam DNA de HPV
amplificado o suficiente para ser detectado pelo sistema imune (56). A maioria dos
estudos que abordam a resposta imune frente ao HPV/HIV estão voltados para o
17
câncer cervical, e já mostraram que na infecção somente pelo HPV há ativação da
resposta imune mediada por linfócitos de perfil Th1, ao passo que na co-infecção
ocorre mudança de perfil para Th2 (57). Na lesão percursora de baixo grau é
observado moderada expressão das citocinas de perfil Th1 IL-2, IL-12 e IFN-gama, e
baixa expressão das citocinas de perfil Th2 IL-4, IL-6, IL-10 e TGF-β1. Nas lesões
malignas e em indivíduos infectados pelo HIV ocorre inversão do padrão de
citocinas, de maneira que citocinas Th1 passam a ter baixa expressão, e as
citocinas Th2 predominam. Uma vez que a resposta imune antiviral e antitumoral é
ativada por citocinas Th1 e inibida por citocinas Th2, sugere-se que a mudança
observada possa ser uma possível explicação para o risco elevado de progressão
da lesão para o câncer em indivíduos co-infectados (58).
A infecção pelo HPV pode alterar a expressão de proteínas do ciclo celular e
regulatórias, como a p27, Rb e VEGF, favorecendo a persistência viral do HPV e o
desenvolvimento do câncer invasivo (15). Foi demonstrado que a mucosa gastrointestinal e vaginal apresenta um papel fundamental no início da infecção pelo HIV1, servindo como sítio de entrada para o vírus. Na co-infecção pelo HIV/HPV
observa-se que com a evolução da infecção do HIV, a resposta imune diminui,
ocorrendo
então
replicação
viral
e
expressão
do
HPV,
culminando
no
desenvolvimento de lesões de baixo grau. Com o tempo estas lesões poderão
progredir para HSIL, um provável precursor de câncer invasivo. Há a hipótese que a
resposta de linfócitos citotóxicos (CD8+) contra células infectadas pelo HPV esteja
prejudicada nos indivíduos infectados pelo HIV, fator esse que contribui para a
progressão da lesão (59,60).
A progressão de lesões de alto grau para o câncer invasivo pode levar
diversos anos, embora nos indivíduos jovens infectados pelo HIV, isso possa
acontecer mais rapidamente. Estudos prospectivos são ainda necessários para um
melhor esclarecimento dos mecanismos mediados pela resposta imune celular na
co-infecção pelo HIV/HPV, assim como de fatores que possam contribuir para maior
gravidade e progressão da doença. Até o momento, alguns estudos relatam como
principais fatores de risco para co-infecção pelo HIV/HPV a relação sexual
desprotegida e elevado número de parceiros sexuais (16,61).
18
1.10. VACINAÇÃO PROFILÁTICA CONTRA HPV
A vacinação é o método de maior sucesso e eficácia no controle de doenças
infecciosas em termos de custo e efetividade. Duas
vacinas
profiláticas
foram
aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos: a vacina
bivalente CervarixTM (HPV2, Glaxo SmithKline) para prevenção dos HPV tipo 16 e
18; e a quadrivalente Gardasil (HPV4, Merck Sharp & Dohme) para HPV tipos 6, 11,
16 e 18. Estas vacinas usam vetores que expressam o gene L1 do vírus, que foram
usados com sucesso para gerar VLPs que induzem títulos elevados de anticorpos
específicos. Ambas protegem mulheres contra infecções e, indiretamente contra o
câncer cervical, causados pelos HPV 16 e 18 que causam aproximadamente 70%
dos casos de câncer cervical no mundo (62).
No Brasil, atualmente estas duas vacinas contra HPV estão comercialmente
disponíveis.A primeira vacina, quadrivalente, foi aprovada em 2006 pela agência
nacional de vigilância sanitária (ANVISA) e é especifica para os HPVs: 6, 11, 16 e
18, tendo o nome comercial de Gardasil ® (Sanofi Pasteur MSD). Na sua posologia
são necessárias três doses intramusculares (IM): 0 dia, 60 dias e 180 dias. No
Brasil, está liberada para uso em homens e mulheres de 9 a 26 anos de idade.
Desde marco de 2014, o Sistema Único de Saúde (SUS) tem distribuído
gratuitamente para meninas de 11 a 13 anos de idade (63).
A segunda vacina foi aprovada pela ANVISA desde 2008 para uso em
mulheres de 10 a 25 anos de idade. Esta vacina, dita bivalente, é especifica para os
HPV 16 e HPV 18 – tipos virais associados ao carcinoma e tem o nome comercial de
Cervarix ® (GlaxoSmithKline S.A.). Também deve ser aplicada em três doses IM: 0
dia, 30 dias e 180 dias (63).
O mecanismo de proteção induzido pela vacina parece ser mediado,
principalmente, pelas altas concentrações de anticorpos neutralizantes (dez vezes
ou mais elevados do que as concentrações após a infecção natural). A vacinação
profilática com VLP de L1 tem se apresentado como muito eficaz na prevenção da
infecção primária, da infecção latente e das patologias associadas. Entretanto, as
concentrações séricas de anticorpos necessárias para conferir proteção contra esta
infecção são desconhecidas, de modo que o período de proteção dado pelas
vacinas continua a ser indeterminado (62).
Diversos estudos têm demonstrado que ambas as vacinas quadrivalente e
bivalente contra o HPV, são seguras, apresentam longa durabilidade para proteção
19
contra infecções primarias para os HPVs específicos das respectivas vacinas e um
moderado grau de proteção cruzada contra alguns tipos que não são específicos
das vacinas (64).
Contudo, no presente momento, existem diversas controvérsias entre as
agências e profissionais de saúde, pesquisadores e clínicos. É importante enfatizar
que as vacinas contra HPV não são um tratamento para as doenças associadas ou
já existentes na hora da vacinação, nem irão proteger contra os tipos de HPV não
específicos das vacinas. As vacinas contra HPV também não são recomendadas
para meninas < 9 anos de idade ou durante a gravidez, até o momento a Cervarix
(bivalente) ainda não está recomendado para uso em meninos.Apesar dos esforços
pelas agencias de saúde pública nos Estados Unidos e Brasil, a cobertura da
vacinação permanece com taxas muito baixas(65).
No EUA, somente 33,4% de meninas e 6,8% de meninos adolescentes com
idade entre 13-16, tinham sido vacinados com as 3 doses da vacina de HPV em
2012 (64). No Brasil, somente a primeira dose alcançou 99% das adolescentes,
contudo somente 55% foram vacinadas na segunda dose (63).
Em outros países como no Japão, em Junho de 2012 o Ministro da saúde,
suspendeu parcialmente o programa de vacinação contra o HPV, demonstrando
claramente que os programas de vacinação podem ser seriamente comprometidos
por preocupações com relação à segurança da vacina (65).
O CDC (do inglês - Centers for Disease Control) juntamente com o FDA
operam um programa conhecido como VAERS (do inglês - Vaccine Adverse Event
Reporting System). O VAERS recebeu um total de 21,194 relatos de efeitos
adversos que ocorreram em meninas logo apos a vacinação contra o HPV (durante
Junho 2006 a Marco 2013), sendo que 92,1% foram classificadas como não sendo
graves (www.cdc.gov/vaccinesafety/Vaccines/HPV).
Vacinação em homens
Diversos estudos têm analisado a eficácia da vacinação profilática contra a
infecção pelo HPV nos homens, e enfatizam esta vacinação como estratégia de
prevenção de HPV em Homens que fazem sexo com homens (HSH) (63,64).
A vacinação contra o HPV em homens poderá proteger também mulheres
desta infecção. Alguns países como EUA, Canada, Áustria e Austrália já tem
recomendado a vacinação para homens (66).
20
Homens que fazem sexo com homens apresentam altas taxas de infecção
pelo HPV na região anal e outras doenças associadas ao HPV, além disso,
HSH/Infectados pelo HIV apresentam risco aumentado de desenvolverem o câncer
anal comparados com homens na população geral (67).
Considerações atuais sobre as vacinas contra o HPV:
As vacinas contra HPV, como outras vacinas podem não proteger todos que
são vacinados, desta forma o programa de rastreio regular (através da citologia
oncótica do Papanicolau) deve permanecer mesmo se mulheres receberam ou não
as vacinas contra HPV (63).
Atualmente uma vacina tipo “segunda geração” está em desenvolvimento
pela Merck, Sharp e Dohme, contendo 5 genótipos de HPV adicionais a atual vacina
quadrivalente. A vacina nonavalente V503 parece ser segura e eficaz na prevenção
da infecção persistente e lesões pré-cancerosas associadas a tipos de HPV
16/18/31/33/45/52/58, bem como verrugas genitais relacionadas com os tipos de
HPV 6 e 11 (68).
A vacina contra HPV ainda não é recomendada durante a gravidez. Embora
as vacinas possam reduzir a incidência de diversas doenças infecciosas e os
benefícios superarem os riscos, alguns efeitos adversos graves foram reportados,
requerendo um rigoroso monitoramento da vacinação após cada aplicação (booster)
vacinal, bem como uma avaliação crítica de indivíduos com doenças autoimunes
(Nicol AF, 2015.Não publicado).
21
Principais perguntas da pesquisa
Pacientes co-infectados pelo HIV/HPV apresentam uma maior prevalência de
lesões anais intraepiteliais. Quais fatores imunes poderiam estar envolvidos na
resposta imune “in situ”. Quais os tipos de HPV mais prevalentes nas lesões de alto
grau? Haveria uma associação pelo HPV de alto risco oncogênico com a severidade
da lesão e a disfunção de algum fator imune?
Hipótese: A infeção pelo HIV poderia alterar a expressão da resposta imune
inflamatória, favorecendo a persistência pelo HPV e consequente desenvolvimento
de lesões anais intraepiteliais.
2. OBJETIVOS
2.1.
OBJETIVO GERAL
Avaliar a resposta imune “in situ” em amostras de biópsias anais negativas
para lesões intraepiteliais obtidas de indivíduos não infectados e infectados pelo HIV,
assim como em biópsias anais dos indivíduos infectados pelo HIV segundo o
resultado histopatológico: sem lesões, com lesão de baixo grau (NIA 1) e com lesão
alto grau (NIA 2/3), em acompanhamento no Instituto Nacional de Infectologia (INI)
da Fundação Oswaldo Cruz no Rio de Janeiro.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Os objetivos específicos visaram comparar os participantes infectados e não
infectados pelo HIV sem lesões intraepiteliais escamosas, assim como os pacientes
infectados pelo HIV, agrupados pelo resultado histopatológico, segundo:
1. As características sócio-demográficas, comportamentais e clínico-laboratoriais.
2. O perfil de células CD4+, CD8+ e FoxP3+in situ nas amostras de biópsias
anais,
3. O perfil de células T-bet+in situ como parâmetro de resposta Th1 nas
amostras de biopsias anais,
4. O perfil de células IL-10+in situ como parâmetro de resposta Th2 nas
amostras de biópsias anais,
5. A proteína SLPI in situ como possível biomarcador de progressão de tumor
nas amostras de biopsias anais,
6. Identificar os tipos virais de HPV presentes nas amostras de biópsias anais.
22
7. Avaliar a associação entre as células T CD4+ periféricas e o uso de terapia
anti-retroviral combinada com a expressão dos marcadores imunes, nos
pacientes infectados pelo HIV segundo os diferentes graus de lesão.
8. Avaliar a correlação entre os genótipos do HPV de baixo e alto risco
oncogênico na secreção anal e nas biopsias anais, segundo a situação
sorológica para o HIV e o resultado histopatológico.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1.
População fonte: as Coortes de Mulheres com HIV/AIDS e de Homens
infectados e não infectados pelo HIV do Instituto Nacional de
Infectologia da Fundação Oswaldo Cruz
O presente estudo foi conduzido com mulheres infectadas pelo HIV
integrantes da coorte de mulheres, estabelecida em 1996 (69), e com homens
infectados pelo HIV e não infectados integrantes da coorte de homens estabelecida
em 2010, ambas pelo Laboratório de Pesquisa em DST/AIDS (LapClin DST/AIDS)
do Instituto Nacional de Infectologia (INI, antigo Instituto de Pesquisa Clínica
Evandro Chagas-IPEC), com o principal objetivo de estudar a infecção pelo HPV e
as lesões intraepiteliais escamosas nestas populações. O estudo envolvendo os
homens e o estudo envolvendo as mulheres foram aprovados pelo comitê de ética e
pesquisa do INI/Fiocruz (protocolo 0044.0.009000.09 da coorte de homens, e
protocolo 020/2001 – da coorte de mulheres).
3.1.1. Procedimentos na Coorte de Mulheres com HIV/AIDS
A avaliação da infecção anal pelo HPV e das lesões dele decorrentes na
coorte de mulheres HIV-positivo teve início em Janeiro de 2011. Durante a visita
ginecológica de rotina da coorte, mediante leitura e explicação do termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE), o estudo da infecção e das lesões anais
foi oferecido a cada mulher. Após assinatura do TCLE, uma amostra de swab anal
foi coletada pela ginecologista e colocada em meio para citologia em base líquida
(Preserv Cyto solution, Hologic, USA), refrigerada e transportada ao Laboratório de
virologia do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo, onde uma
23
alíquota foi removida para extração do DNA utilizando-se o kit QIAamp DNA Mini Kit
(Qiagen, Chattlesworh, CA).
Na detecção e genotipagem do HPV anal foi utilizado o teste de triagem para
HPV PapilloCheck (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany), um teste de
microensaio de PCR-DNA que permite detectar e identificar 24 genótipos do HPV,
incluindo 15 genótipos de alto risco oncogênico (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56, 58, 59, 68, 73, e 82), dois genótipos do HPV provavelmente de alto risco (53 e
66), e 7 genótipos de baixo risco (6, 11, 40, 42, 43, 44, e 70).
A citologia anal foi realizada pelo Laboratório Salomão Zoppi Diagnósticos,
em São Paulo, e os resultados foram classificados segundo o sistema Bethesda de
2001 em: células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US),
células glandulares atípicas (AG-US), lesão intraepitelial escamosa de baixo grau
(LGAIN), células escamosas atípicas não podendo afastar lesão intraepitelial anal de
alto grau (ASC-H), lesão intraepitelial anal escamosa de alto grau (HGAIN), e câncer
invasivo(70,71). Na presença de qualquer uma destas alterações citológicas e/ou na
presença de lesão hipercrômica na margem anal indicativa de Doença de Bowen, a
mulher foi referenciada para o proctologista para a realização de uma anuscopia de
alta resolução (AAR) e biópsias caso indicado. Os procedimentos referentes a
anuscopia de alta resolução e biópsias estão descritos abaixo.
Dados demográficos, comportamentais e clínicos foram coletados pelas
ginecologistas por meio de questionários semi-estruturados durante a visita na qual
as amostras anais foram também obtidas.
3.1.2. Procedimentos na Coorte de Homens infectados e não infectados pelo
HIV do INI/Fiocruz
A coorte de homens foi estabelecida em Agosto de 2010 e consiste em um
estudo prospectivo, para o qual homens HIV-positivo com idade igual ou maior do
que 18 anos, com relato de intercurso sexual ao menos uma vez e sem história de
câncer anal foram convidados a participar enquanto aguardavam na sala de espera
e mediante convite por telefone. Os homens HIV-negativo foram recrutados a partir
de estudos para testagem de estratégias em prevenção do HIV e outros estudos em
andamento no LapClin DST/AIDS, assim como por indicação de participantes HIVpositivo incluídos na coorte de homens. Homens em uso de imunomoduladores, tal
como prednisona na dose superior a 10 mg/dia, interleucina e interferon não
24
preenchiam os critérios de inclusão para o estudo. Todos os participantes incluídos
concordaram e assinaram previamente o TCLE do estudo, no qual uma visita anual
vem sendo realizada com coleta de dados sociodemográficos, da história
proctológica (incluindo história de lesões intraepiteliais anais, condiloma e de
doenças sexualmente transmissíveis e tratamentos realizados), queixas anogenitais
e proctológicas, e comportamentos de risco mediante entrevista no sistema ACASI
(Audio Computer-Assisted Self-Interview) (72).
Amostras de swab anal para detecção e genotipagem do HPV e citologia anal
foram coletadas em todas as visitas anuais do estudo e seguiram os mesmos
procedimentos descritos para a coorte de mulheres. A anuscopia de alta resolução
(descrita abaixo) foi realizada em todas as visitas anuais do estudo, independente do
resultado da citologia anal, e também foi realizada para o acompanhamento
semestral do tratamento das lesões existentes por um período de até um ano.
Amostras de sangue foram obtidas em todas as visitas para testagem para
sífilis, hepatite B e C e carga viral para o HIV, mensurada através do branched chain Chironassay (Chiron, Emeryville, California, USA) com limite inferior de
sensibilidade de 50 copias/ml.
3.1.3. Exame anal e Anuscopia de alta resolução (AAR)
O exame anal e a anuscopia de alta resolução foram realizados por um
proctologista experiente. O exame anal consistiu na inspeção ocular da margem e
do canal anal utilizando o anuscópio convencional. O teste de acetobranqueamento
foi realizado para aumentar a visibilidade de lesões intraepiteliais do HPV. Ácido
acético foi aplicado em toda a área da margem e do canal anal. Lesão intraepitelial
foi suspeita na presença de área acetobranca ou no caso de ou de lesões exofíticas
elevadas facilmente distinguível da mucosa normal. Biópsias foram realizadas para
confirmar o diagnóstico de lesões relacionadas ao HPV, sendo indicada mais de
uma biópsia nos casos de áreas acetobrancas em diferentes quadrantes. Exames
histopatológicos foram realizados no Laboratório de histopatologia do INI, que possui
teste de proficiência pelo College of American Pathologists (CAP) External Quality
Assurance (EQA), resultados histopatológicos foram categorizados como ausência
de lesão intraepitelial anal, atipia, condiloma, NIA1, NIA2, NIA3 e câncer invasivo.
25
Um fragmento de biópsia para armazenamento em container com nitrogênio
líquido também foi obtido exatamente do mesmo local no qual foi retirada a amostra
para o exame histopatológico.
3.1.4. Amostras de biópsias avaliadas para o presente estudo
Foram avaliadas 155 biopsias obtidas de 122 participantes no período de 30
de junho de 2010 a 28 de janeiro de 2013, sendo 91 biopsias obtidas de homens e
64 biopsias obtidas de mulheres. A avaliação dos marcadores imunes foi realizada
nas biopsias com quantidade representativa do material, nas biópsias cujo tecido
apresentava epitélio escamoso e estroma e nas biópsias do mesmo paciente,
realizadas na mesma data, desde que com resultados histopatológicos diferentes.
Desta forma, 27 biopsias não foram consideradas por não apresentarem quantidade
representativa de material e/ou não apresentavam epitélio escamoso e estroma; 14
biópsias de 14 participantes não foram consideradas, uma vez que estes
participantes apresentavam biopsias na mesma data com resultado idêntico.
Cento e quatorze biópsias obtidas de 102 participantes foram consideradas
para a análise: 91 participantes contribuíram com uma biópsia, 10 com duas
biópsias, e um indivíduo contribuiu com três biópsias. Dentre as 114 biópsias
avaliadas, 102 constituíam a primeira biópsia anal realizada pelo paciente desde a
sua inclusão na coorte, e 12 correspondiam a biópsias anais subsequentes.
Considerando as 114 biópsias, 15 foram provenientes de 15 participantes HIVnegativos e 99 biópsias foram obtidas de 87 participantes infectados pelo HIV.
Quanto ao diagnóstico histopatológico, 36 biópsias anais mostraram ausência de
lesão intraepitelial escamosa (15 de participantes não infectados pelo HIV e 21 de
participantes infectados), 39 biópsias, todas de participantes infectados pelo HIV,
resultaram em neoplasia intraepitelial anal de baixo grau (NIA1) e 39 biópsias, todas
de participantes infectados pelo HIV, foram classificadas como neoplasia
intraepitelial anal de alto grau (NIA2/3).
3.2.Biomarcadores de interesse
Os seguintes biomarcadores nas biópsias anais foram avaliados para
possíveis correlações de interesse neste estudo:
26
- Células CD4+, CD8+ e FoxP3+ in situ: porcentagem in situ de linfócito T auxiliar,
linfócito T citotóxico e linfócito T regulador;
- Células T-bet+ como parâmetro de resposta Th1: porcentagem in situ de células
Th1;
- Células IL-10+ como parâmetro de resposta Th2: porcentagem in situ de células
Th2;
- Células SLPI+ como possível biomarcador de progressão de tumor: porcentagem
in situ da proteína inibidora da protease secretória dos leucócitos.
3.3. PREPARO DO TISSUE MICROARRAY (TMA)
Esta etapa do estudo foi conduzida em colaboração com a Dr. Andrea Pires
no Laboratório Fonte Med, conforme o protocolo descrito por Pires e colaboradores
em 2008. Brevemente, foram construídos dois blocos de TMA; as biópsias incluídas
foram cortadas em micrótomo para confecção de lâminas histológicas e coradas em
Hematoxilina-Eosina (H&E). A seleção da área específica que foi utilizada na
montagem do TMA foi realizada por patologista experiente (A.P), buscando
preservar o tecido epitelial, seja nos casos em que este mostrava presença ou não
de alteração sugestiva de lesão intraepitelial, segundo os subgrupos do estudo. Em
seguida, as áreas selecionadas de cada biópsia foram puncionadas utilizando
agulhas hipodérmicas (Beckton-Dickinson PreciseGlide®) calibre 16 (1,1 mm²),
fixadas e ordenadas em molduras com fita adesiva dupla face, após a organização
de todos os fragmentos provenientes das biópsias, a moldura foi preenchida com
parafina líquida (73). Foram então produzidos dois blocos, o primeiro contendo 54
fragmentos de biópsias de mulheres, e o segundo com 61 fragmentos de biópsias de
homens.
3.4. IMUNOHISTOQUÍMICA
Para realização da imunohistoquímica, utilizamos o protocolo descrito por
Nicol e colaboradores (15). Brevemente, os blocos de TMA foram submetidos à
cortes histológicos de 5 de espessura em lâminas silanizadas. As amostras foram
submetidas ao processo de desparafinização com xilol e álcool 70%, 90% e 100%,
seguido de inibição da peroxidase endógena com H2O2 e metanol na proporção de
1:1 por 15 minutos. A recuperação antigênica foi feita em tampão citrato, pH 6,0 a 95
27
ºC durante 45 min. A inibição de proteínas inespecífica foi feita de acordo com o
protocolo do Kit MACH 4TM Universal AP Polymer Kit (Biocare Medical). Os
anticorpos primários foram incubados em câmara úmida overnight. Foram utilizados
os anticorpos secundários do Kit MACH 4TM Universal AP Polymer Kit (Biocare
Medical) e a revelação foi feita com 3,3-Diaminobenzidine (DAB). Para a montagem
das lâminas, as amostras foram coradas com hematoxilina e contra-coradas com
hidróxido de amônio a 2%, desidratadas em álcool e xilol, e seladas com Etellan®
(Merck) e lamínula.
Os anticorpos utilizados foram: anti-CD4+ (R&D system, Minnesota, E.U.A.);
anti-CD8+ monoclonal (Dako, Glostrup -Denmark); anti-FoxP3 monoclonal (Abcam,
Cambridge - Inglaterra); anti-T-bet monoclonal (Abcam – Cambridge - Inglaterra);
anti-IL-10 policlonal (Abcam – Cambridge - Inglaterra) (Quadro 1.1). A marcação da
proteína SLPI foi realizada em colaboração com o grupo do Dr. Martin Kast, na
Universityof Southern California,Los Angeles – E.U.A. A imunohistoquímica para
marcação de SLPI foi realizada segundo protocolo descrito por Cordes e
colaboradores, 2011(74). Todas as amostras foram quantificadas para a obtenção
da porcentagem de células positivas, evidenciadas pela cor castanha, para cada
anticorpo. Para isso, foi contado o número de células positivas por campo, e o
número total de células no mesmo campo (células positivas e negativas), admitindose o mínimo de dois campos por biópsia. Então, o cálculo da porcentagem foi
realizado da seguinte forma:
Número de células positivas/campo x 100= % de células positivas
Número total de células/campo
A marcação para SLPI foi avaliada da seguinte forma: negativa (0%), fraca (119%), moderada (20-49%) ou forte (≥50%), baseado na porcentagem de células
positivas em cada amostra.
28
Quadro 3-1. Marcadores imunohistoquímicos e estratégia de quantificação.
Anticorpo
Diluição
Observação
Área
analisada
Quantificação
CD8+
1:200
Interação com MHC classe I
Estroma
% cél. Positivas
CD4+
1:100
Interação com MHC classe II
Estroma
% cél. Positivas
SLPI
1:100
IL-10
1:400
FoxP3
1:50
T-bet
1:150
Neutraliza elastase,triptase e
catepsina G
Inibe a produçãode citocinas
Th2
Marcador de células T
regulatórias (Tregs)
Fator de trancrição para Th1
Epitélio
semiquantitativa
Referência
Nicol et al 2005(75)
Nicol et al 2005(75)
Cordes et al, 2011 (74)
Estroma
% cél. Positivas
Nicol et al 2005(75)
Estroma
% cél. Positivas
Qinghuaet al, 2012.(57)
Estroma
% cél. Positivas
Qinghuaet al, 2012.(57)
Para análise de todos os marcadores in situ todas as comparações foram
realizadas da seguinte maneira: para os indivíduos infectados pelo HIV, os grupos
de comparação foram formados de acordo com o diagnóstico histopatológico (sem
lesão, NIA de baixo grau e NIA de alto grau). E o grupo não infectado pelo HIV com
diagnóstico sem lesão, foi comparado ao grupo infectado pelo HIV sem lesão
histopatológica.
3.5. EXTRAÇÃO E DETECÇÃO DE DNA DO HPV
As biópsias armazenadas em nitrogênio líquido foram incluídas em
TissueTek® O.C.TM, e submetidas a cortes histológicos em criostato, em torno de 5
cortes com 5 µm de espessura, para obtenção do material genético. A extração de
DNA das amostras foi realizada utilizando o kit de isolamento, Tissue & Cells
Genomic Prep Mini Spin (GE Healthcare), de acordo com protocolo do fabricante.
Em seguida, o DNA purificado foi quantificado através de espectrofotometria, no
aparelho Nanodrop (ND 1000, Thermo Fisher Scientific, Wilmington, EUA),
pertencente à Rede de Plataformas Tecnológicas da Fiocruz - PDTIS. As amostras
que apresentaram concentração de DNA abaixo de 3 ng/l, foram submetidas à
amplificação termoestável de todo o material genético Phi29 DNA polimerase,
29
utilizando o kit Ilustra Genomyphi V2 DNA Amplification Kits (GE Healthcare) de
acordo com protocolo do fabricante.
Para detecção de DNA de HPV, o material genômico foi submetido à reação
em cadeia da polimerase (PCR) para amplificação de regiões conservadas do gene
L1, utilizando os pares de oligonucleotídeos flanqueadores dessa região. Os
oligonucleotídeos utilizados para todas as PCRs foram adquiridos da Invitrogen (São
Paulo, Brasil), de acordo com as sequências apresentadas na Tabela 3.1.
Foi utilizado o par de iniciadores PGMY 09 e 11 para amplificação de cerca de
450 pares de base na primeira reação de PCR(76). Para essa reação foi utilizado
tampão 1x Colorless Go Taq Flexi Buffer, 0,3 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP,
dTTP), 2,5 mM MgCl2, 1,25 U de Taq Polimerase (todos os reagentes provenientes
da Promega, Madison, EUA), 1M de cada iniciador e cerca de 15ng/l de DNA
purificado para volume final de 25 l da reação. A reação de PCR foi realizada no
termociclador GeneAmp PCR System 9700 – Applied Biosystems utilizando o
seguinte ciclo de temperatura: etapa inicial de 95 ºC por 5 minutos, seguido de 40
ciclos de 95 ºC por 40 segundos (desnaturação), 55 ºC por 40 segundos
(hibridização) e 72 ºC por 40 segundos (extensão). Ao final dos ciclos, houve etapa
final de 72 ºC por 5 minutos, e então as amostras foram armazenadas a temperatura
de -20 ºC.
As amostras com resultado negativo para HPV na primeira reação, foram
então submetidas à reação de nested PCR, utilizando os iniciadores GP5+ e GP6+,
para amplificação de fragmentos com cerca de160 pares de base (76). Para reação
da PCR foram usados os mesmos reagentes e concentrações utilizados para
amplificação pelos iniciadores PGMY, diferenciando apenas os iniciadores GP5+ e
GP6+ na concentração de 2,5 M. A reação de PCR também foi realizada no
termociclador GeneAmp PCR System 9700 – Applied Biosystems. O ciclo utilizado
foi o seguinte: etapa inicial de 95 ºC por 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 ºC por
40 segundos (desnaturação), 40 ºC por 40 segundos (hibridização) e 72 ºC por 40
segundos (extensão). Seguido de etapa final de 72 ºC por 5 minutos. As amostras
foram armazenadas a temperatura de -20 ºC.
Todas as amostras foram testadas para amplificação de cerca de 110 pares
de base do gene constitucional da β-globina utilizando os iniciadores PC03 e
PC04(77) (Tabela 3.1), presente no genoma de todas as células nucleadas
humanas, a fim de ser usado como controle positivo para presença de DNA na
amostra pesquisada. Para amplificação desse fragmento foi utilizado protocolo
30
semelhante à amplificação do HPV, excetuando-se os iniciadores PC03 e PC04
utilizados na concentração de 0,08 M, e o MgCl2 à 3 mM de concentração. As
condições da PCR foram as seguintes: etapa inicial de 95 ºC por 5 minutos, seguido
de 40 ciclos de 95 ºC por 1 minuto (desnaturação), 55 ºC por 1 minuto (hibridização)
e 72 ºC por 1 minuto. E etapa final de 70 ºC por 5 minutos. As amostras foram
armazenadas a temperatura de -20 ºC.
As amostras com resultado negativo para β-globina foram excluídas das
análises referentes à pesquisa de DNA de HPV. Em todas as amplificações foi
utilizado um controle positivo, o qual continha 100 ηg de DNA controle de HPV
isolado da linhagem HeLa, e um controle negativo de água ultrapura, sem adição de
DNA, segundo Ferreira et al, 2011(78).
Tabela 3-1. Sequência dos iniciadores(76).
Iniciador
Sequência 5'-3'
Alvo
PC03
ACACAACTGTGTTCACTAGC
β-globina human
PC04
CAACTTCATCCACGTTCACC
GP5+
TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
GP6+
GAAAAA TAAACTGTAAATCATATTC
PGMY11 – A
GCA CAG GGA CAT AAC AAT GG
PGMY11 – B
GCG CAG GGC CAC AAT AAT GG
PGMY11 – C
GCA CAG GGA CAT AAT AAT GG
PGMY11 – D
GCC CAG GGC CAC AAC AAT GG
PGMY11 – E
GCT CAG GGT TTA AAC AAT GG
PGMY09 – F
CGT CCC AAA GGA AAC TGA TC
PGMY09 – G
CGA CCT AAA GGA AAC TGA TC
PGMY09 – H
CGT CCA AAA GGA AAC TGA TC
PGMY09 – I
G CCA AGG GGA AAC TGA TC
PGMY09 – J
CGT CCC AAA GGA TAC TGA TC
PGMY09 – K
CGT CCA AGG GGA TAC TGA TC
PGMY09 – L
CGA CCT AAA GGG AAT TGA TC
PGMY09 – M
CGA CCT AGT GGA AAT TGA TC
PGMY09 – N
CGA CCA AGG GGA TAT TGA TC
PGMY09 – P
G CCC AAC GGA AAC TGA TC
PGMY09 – Q
CGA CCC AAG GGA AAC TGG TC
PGMY09 – R
CGT CCT AAA GGA AAC TGG TC
HMB01
GCG ACC CAA TGC AAA TTG GT
31
L1 – HPV
L1 – HPV
Para visualização dos resultados, 5 L dos produtos amplificados foram
misturados a 2 L de azul de bromofenol (Promega, Madison, EUA) e submetidos à
eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com GelRedTM (Uniscience). Os
tamanhos dos fragmentos foram estimados utilizando o marcador de 100pb DNA
Ladder (Amersham Biosciences). O gel de agarose foi visualizado em um
transiluminador de ultravioleta e fotografado utilizando o software Quantity One
(BioRad Laboratories).
3.6. GENOTIPAGEM DO HPV NO TECIDO ANAL
As amostras positivas para HPV foram submetidas à nova amplificação do
DNA de HPV, utilizando os protocolos com os conjuntos e iniciadores PGMY09/11
ou GP5+/GP6+, porém a reação foi realizada com volume final de 50 l. As
amostras que apresentaram única banda, de tamanho esperado, no gel de agarose
2% prosseguiram para purificação dos produtos amplificados utilizando o Kit
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey Nagel) conforme especificações do
fabricante. As amostras que apresentaram múltiplas bandas no gel de agarose,
evidenciando amplificação inespecífica, foram submetidas à nova eletroforese em
gel de agarose 2% para separação do fragmento de interesse no gel com auxilio de
bisturi estéril, e então purificação do produto pelo Kit NucleoSpin® Gel and PCR
Clean-up (MachereyNagel) conforme especificações do fabricante. Todos os
produtos purificados foram quantificados no aparelho Nanodrop (ND 1000, Thermo
Fisher Scientific, Wilmington, EUA), disponibilizado pela Rede de Plataformas
Tecnológicas da Fiocruz - PDTIS.
Os produtos obtidos através da amplificação por PCR e purificação foram
utilizados para genotipagem do HPV através do método de sequenciamento de
término da cadeia utilizando dideoxinucleotídeos, desenvolvido por Frederik Sanger.
As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando 2,5 µL da mistura de Big
dye e tampão de sequenciamento 5x (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction V 3.1 – Applied Biosystems), 3,2 pmol de cada iniciador
(PGMY09/11 ou GP05/06), 2 µL de produto purificado em concentração de 3 ng, e
água deionizada 10 µL. A mistura pronta foi distribuída em placa de 96 poços e
levado ao termociclador nas seguintes condições: 40 ciclos de 94 ºC por 10
segundos, 50 ºC por 5 segundos e 60 ºC por 4 minutos. Após a reação de
sequenciamento foi realizada precipitação das amostras para retirada de dNTPs
32
livres que podem interferir na leitura da sequência de DNA no analisador de
DNA. Brevemente, utilizou-se 30 ul de isopropanol 75% seguido de centrifugação
por 45 minutos, e 50 l etanol 75% seguido de centrifugação por 15 minutos. Então
a placa foi aquecida a 60 ºC por 10 minutos.
Para desnaturação da reação de sequenciamento foi utilizado 10 ul de
formamida Hi-Di (Applied Biosystems P/N:4311320), em cada poço da placa
contendo o material precipitado, aquecimento a 95 ºC por 3 minutos, seguido de
resfriamento em gelo. Após o preparo descrito acima, as amostras foram analisadas
pelo sequenciador automático de 48 capilares ABI Prism 3730 Genetic Analyzer
(Applied Biosystems), no Laboratório de Genética – INCA (Instituto Nacional do
Câncer).
Os cromatogramas das sequências obtidos no sequenciamento foram
posteriormente analisados no software MEGA 6ªedição e construção da sequência
consenso. As sequências geradas foram submetidas software BLASTn (disponível
em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) para a determinação dos tipos de
HPV presentes nas amostras.
As amostras em que o cromatograma apresentou sugestividade de múltipla
infecção foram submetidas à identificação dos tipos virais utilizando o Kit High + Low
Papilloma Strip (Operon - Zaragoza, Spain), de acordo com protocolo do fabricante.
Esse teste permite a detecção qualitativa, em amostra de DNA, de 37 subtipos de
HPV sendo, 19 tipos de alto risco (16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58,
59, 66, 68, 69, 73 e 820 e 18 tipos de baixo risco (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 62,
67, 70, 71, 72, 74, 81, 83, 84 e 91).
3.7. GENOTIPAGEM DO HPV NA SECREÇÃO ANAL
Uma sub-análise foi feita com o resultado de genotipagem a partir da
secreção anal de 65 indivíduos pertencentes ao estudo. Esses dados foram obtidos
do banco de dados informatizado do INI.
A identificação dos HPV na secreção anal foi realizada no Instituto Ludwig de
Pesquisa Sobre o Câncer, utilizando o kit PapilloCheck® (Greiner Bio-One,
Frickenhausen, Alemanha). A secreção foi coletada com auxílio de swab e
submetida à extração do DNA, onde 5 l foi submetido a PCR segundo protocolo do
fabricante. A detecção dos tipos virais foi realizada através de um sistema baseado
em microarranjo de DNA, capaz de detectar 24 genótipos, incluindo 15 HPV de alto
33
risco oncogênico (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, e 82), 2 tipos
prováveis de alto risco (53 e 66), e 7 tipos de baixo risco oncogênico (6, 11, 40, 42,
43, 44, e 70).
3.8.VARIÁVEIS SELECIONADAS
A partir dos bancos de dados das coortes de homens e de mulheres do
Laboratório de Pesquisa em DST/AIDS do INI foram obtidas as variáveis
sóciodemográficas, comportamentais e clínico-laboratoriais dos participantes do
estudo segundo plausibilidade teórica com os desfechos estudados. Cabe ressaltar
que nem todas as variáveis foram coletadas de forma semelhante para homens e
mulheres, uma vez que pertencem a coortes diferentes, cada qual com questionários
próprios. Estas variáveis provenientes de diferentes bases de dados foram inseridas
em uma única base de dados para atender as análises especificas deste estudo. As
variáveis selecionadas foram:
Variáveis sóciodemográficas: Sexo, idade no momento da obtenção da biópsia.
Variáveis comportamentais: tabagismo (exposição atual),uso de drogas ilícitas,
história de sexo anal; número de parceiros sexuais nos últimos 6 meses para as
mulheres(considerado parceiro sexual mediante relato de sexo anal e/ou vaginal), e
nos últimos 12 meses para homens (considerado parceiro sexual mediante relato de
sexo anal), número de parceiros sexuais homens nos últimos 12 meses para os
homens.
Variáveis referentes ao HPV: história de lesão anal, história de lesão cervical,
história de tratamento para lesões relacionadas ao HPV, genotipagem do HPV;
Variáveis referentes ao HIV: infecção pelo HIV (confirmada segundo o fluxograma
para diagnóstico do HIV do Ministério da Saúde); tempo desde o diagnóstico da
infecção pelo HIV (data da biopsia anal menos a data da primeira sorologia positiva
para o HIV); CD4+ nadir, definido como o valor mais baixo do linfócito TCD4+ até a
obtenção da biópsia; nível de linfócito TCD4+ próximo à data da biópsia anal, carga
viral do HIV-1 (detectável quando >49 cópias/UI); uso de terapia antiretroviral
combinada (cART) definida como exposição até o momento da biópsia anal, a dois
ou mais inibidores da transcriptase reversa análogo dos nucleosídeos e a um
inibidor da transcriptase reversa não análogo dos nucleosídeos ou a pelo menos um
inibidor da protease; e tempo de tratamento com HAART.
34
3.9.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Análises descritivas segundo o status sorológico para o HIV e segundo o
diagnóstico histopatológico foram realizadas considerando-se as biópsias anais
como unidade da observação. Para as variáveis categóricas foram obtidas
proporções e, para as variáveis contínuas foram calculadas as médias com desviopadrão, e a mediana com os percentis 25 e 75. Na comparação das variáveis
categóricas foram utilizados o Teste Qui-quadrado e o Teste Exato de Fisher. Para
as variáveis contínuas foi utilizado o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Para
avaliar o grau de concordância dos tipos de HPV entre biópsia e secreção anal foi
utilizado o Coeficiente de Kappa, o qual foi interpretado da seguinte maneira: <0 =
sem concordância; 0 – 0,39 = concordância fraca; 0,40 – 0,59 = concordância
moderada; 0,60 – 0,79 = concordância considerável; 0,80 – 1,0 = concordância
perfeita (79).
Para verificar a existência de correlação entre os marcadores imunes e as
variáveis
sóciodemográficas,
comportamentais
e
clínico-laboratoriais,
foram
utilizados o Coeficiente de Correlação de Pearson e o Coeficiente de Correlação de
Spearman. Para avaliação da magnitude da correlação foram considerados os
seguintes parâmetros: < 0,10 = muito fraco; 0,10 a 0,30 = fraco; 0,30 a 0,50 =
moderado; ≥ 0.50 = forte (80). Além disso, foram estimadas a sensibilidade e
especificidade da genotipagem do HPV na biópsia e na secreção anal. O nível de
significância adotado foi de 5%. O software SPSS 15.0 foi utilizado para gerar todas
as análises.
35
4. RESULTADOS
4.1.
CARACTERÍSTICAS DO GRUPO DE ESTUDO
No presente estudo foram incluídas 114 biópsias, 54 oriundas de mulheres e
60 de homens. Ao todo, 13,1% (15/114) das amostras pertencentes a indivíduos
Não infectados pelo HIV, e 86,8% (99/114) infectados pelo HIV (Tabela 4.1).
Os grupos de estudo para comparação foram formados visando a
comparação entre infectados pelo HIV e não infectados sem lesões intraepiteliais
escamosas, assim como os pacientes HIV-positivo agrupados pelo resultado
histopatológico. De maneira que foram incluídas 15 amostras de indivíduos não
infectados pelo HIV, com biópsia sem lesão. E entre os pacientes infectados pelo
HIV, foram incluídas 21 amostras sem lesão, 39 com neoplasia de baixo grau (NIA
1) e 39 amostras com neoplasia de alto grau (NIA 2/3) (Tabela 4.1).
Considerando todos os indivíduos incluídos, a idade variou entre 33,5 e 48,1
anos de idade. A média de idade entre os indivíduos infectados pelo HIV foi de 42 (±
0,9) anos, e 33,6 (± 2,5) anos para os indivíduos não infectados pelo HIV. No grupo
infectado pelo HIV, a média de idade dos indivíduos com amostras normais foi 38,5
(± 1,8), 41,5 (± 1,4) no grupo com neoplasia de baixo grau, e 44,4 (± 1,6) no grupo
com neoplasia de alto grau. Dessa maneira, no grupo infectado pelo HIV foi
observado aumento da idade conforme a agressividade da lesão, com significativa
diferença estatística (p=0,002). Para idade observada nas amostras sem lesão de
Não infectados pelo HIV e infectados pelo HIV não foi observada diferença
estatística significativa (p-valor >0,05).
Quando analisado as variáveis comportamentais observamos que 30,5%
(29/95) relataram tabagismo no momento do questionário e 18% (20/111) o uso de
alguma droga ilícita durante a vida. Quanto a média de parceiros sexuais para
mulheres, 75% (39/52) relataram um parceiro sexual nos últimos 6 meses, e para os
homens a média foi de 14,1 nos últimos 12 meses. A média de parceiros sexuais
masculinos relatados pelos homens foi de 13,5 nos últimos 12 meses.
Quanto as variáveis referentes ao HPV, 66% (35/53) das mulheres possuíam
histórico de lesão cervical. Quanto às lesões anais, 22,5% (25/111) dos indivíduos
apresentaram histórico de lesão anal (Tabela 4.1).
De acordo com as variáveis referentes ao HIV, à média de tempo desde o
diagnóstico do HIV na população estudada foi de 106,5 (DP 79,2) meses. A carga
viral no sangue dos indivíduos, para este estudo, foi avaliada como detectável ou
36
indetectável, de maneira que 42,9% (48/98) apresentaram carga viral detectável.
Além disso, 81,8% (81/99) estavam em tratamento de cART no momento da coleta.
Não foi observada diferença estatística para nenhuma dessas variáveis de acordo
com os grupos de comparação estabelecidos (Tabela 4.1).
Dentre o grupo infectado pelo HIV, 28,3% (28/99) apresentou contagem de
linfócitos CD4+ nadir <50 cél/mm³; 34,3% (34/99) entre 50-199cél/mm³; 25,3%
(25/99) entre 200-349 cél/mm³, e 12,1% (12/99) > 350 cél/mm³.
Quando analisado de acordo com o diagnóstico histopatológico, observamos
que entre os casos de NIA de alto grau, 43,6% (17/39) apresentaram nadir CD4+
<50 cél/mm³. Enquanto que para os casos sem lesão, apenas 2,5% (2/21)
apresentaram esse nível de CD4+ nadir. E nenhum caso com NIA de alto grau foi
relacionado com contagem >350 cél/mm³. A diferença observada entre os grupos de
diagnóstico foram estatisticamente significativos (p-valor = 0,01) (Tabela 4.1).
Quanto aos níveis de linfócitos CD4+ no sangue periférico analisado próximo
a data da biópsia, apenas 2% (2/99) apresentou contagem < 50 cél/mm³; 9% (9/99)
entre 50-199 cél/mm³; 17,2% (17/99) entre 200-349 cél/mm³; e 72,7% (72/99) > 350
cél/mm³. Para esta variável também observamos diferença estatística entre os
grupos de diagnóstico (p-valor = 0,058) (Tabela 4.1).
37
Tabela 4-1. Características selecionadas segundo status sorológico para o HIV e diagnóstico
histopatológico (2010-2013).
Status sorológico para o HIV
Diagnóstico Histopatológico – N (%)
Variáveis
Não
infectados
Infectados
Total
Sem lesão
Sem lesão
NIA Baixo Grau
NIA Alto Grau
(N = 15)
(N = 21)
(N = 39)
(N = 39)
33,6 (9,5)
38,5 (8,1)
41,5 (8,5)
44,4 (9,8)
40,9 (9,6)
15 (100,0)
6 (28,6)
19 (48,7)
20 (51,3)
60 (52,6)
-
8 (38,1)
10 (27,8)
11 (28,9)
29 (30,5)
3 (20,0)
2 (10,0)
7 (18,9)
8 (21,1)
20 (18,2)
0
-
5 (35,7)
2 (10)
5 (27,8)
12 (23,1)
1
-
9 (64,3)
17 (85)
13 (72,2)
39 (75,0)
2
-
-
1 (5)
-
1 (1,9)
30,3 (19,5)
9,4 (5,5)
10,6 (4,6)
6,2 (2,0)
14,1 (5,4)
30,3 (75,4)
9,4 (12,2)
10,6 (19,1)
6,2 (8,9)
14,1 (40,8)
10 (76,9)
8 (40,0)
15 (40,5)
14 (35,9)
47 (43,1)
História de lesão
cervical
-
10 (66,7)
13 (65)
12 (66,7)
35 (66,0)
História de lesões
anais de HPV
2 (14,3)
3 (15,0)
11 (28,9)
9 (23,7)
25 (22,7)
História de
tratamento prévio
de HPV
2 (14,3)
3 (14,3)
11 (28,9)
7 (18,4)
23 (20,7)
Variáveis
comportamentais
Idade (Anos)
Média (SD)
Sexo (masculino)
Tabagismo
Uso de droga ilícita
Nº de parceiros
sexuais - últimos 6
meses
(para mulheres)
Nº de parceiros
sexuais - últimos 12
meses
(para homens)
Média (EP)
Nº de parceiros
sexuais masculinos
- 12 meses
(para homens)
Média (DP)
Variáveis
relacionadas ao
HPV
Histórico de sexo
anal
38
Variáveis
relacionadas ao
HIV
Nadir CD4*
Média (DP)
-
205,6 (125,2)
213,3 (184,1)
122,2 (117,7)
175,8 (153,7)
< 50
-
2 (9,5)
9 (23,1)
17 (43,6)
28 (28,3)
50-199
-
11 (52,4)
11 (28,2)
12 (30,8)
34 (34,3)
200-349
-
6 (28,6)
11 (28,2)
8 (20,5)
25 (25,3)
350 - ≥ 500
-
2 (9,6)
8 (20,5)
-
12 (12,1)
-
636,4 (377,6)
536,8 (288,9)
443,5 (277,9)
521,2 (311,0)
< 50
-
-
1 (2,6)
1 (2,6)
2 (2,0)
50-199
-
1 (4,8)
3 (7,7)
5 (12,8)
9 (9,1)
200-349
-
4 (19,0)
4 (10,3)
9 (23,1)
17 (17,2)
350 - ≥ 500
-
16 (76,1)
31 (79,5)
24 (61,5)
71 (72,7)
Média (DP)
Carga viral HIV
indetectável
(6 meses)
-
87,3 (84,8)
104,6 (73,4)
118,7 (81,5)
106,5 (79,2)
-
11 (52,4)
25 (64,1)
20 (52,6)
56 (57,1)
cART(meses)
-
17 (81)
29 (74,4)
35 (89,7)
81 (81,8)
CD4+ Atual*
Média (DP)
-
Tempo desde
diagnóstico HIV
(meses)
Nota: 1- Informação ignorada (missing): Idade – 0%, Sexo = 0,0%, Tabagismo = 16,7%, Uso de droga ilícita =
3,5%, Histórico de sexo anal = 4,4%, História de lesão cervical = 53,5%, História de lesões anais de HPV =
3,5%, História de tratamento prévio de HPV = 2,6%, Nº de parceiros sexuais nos últimos 6 meses (para
mulheres) = 3,7%, Nº de parceiros sexuais nos últimos 12 meses (para homens) = 5,0%, Nº de parceiros sexuais
masculinos nos últimos 12 meses (para homens)= 5,0%, CD4 nadir = 0,0%, CD4 atual = 0,0%, carga viral HIV (6
meses) = 1,0 %, Exposição ao cART = 0,0%. Tempo desde diagnóstico HIV = 0,0%,2- * p-valor < 0,05 no Teste
Exato de Fisher nas variáveis CD4+ nadir e CD4+ atual.3- DP: Desvio Padrão; IQR= percentual 25 – percentual
75.
39
4.2.
ANÁLISE DE EXPRESSÃO IN SITU DOS MARCADORES IMUNES
CD4+, CD8+, FoxP3+, T-bet+ e IL-10+
Após a realização da imunohistoquímica, número diferente de casos para
cada marcador foram perdidos devido à abrasividade gerada pela técnica, de
maneira que alguns cortes histológicos não permaneceram aderidos à lâmina após
as sucessivas lavagens, ou dobraram, impedindo a análise. Dessa maneira, para
cada marcador foi considerado um número total de casos válidos a serem incluídos.
Para marcação de CD4+, CD8+, FoxP3+, T-bet+ e IL-10+ foram avaliadas 49, 56,
63, 48 e 61 amostras respectivamente, conforme descrito na Tabela 4.2, a
frequência obtida de cada marcador analisado.
CD4+:A expressão das células CD4+ pela imunohistoquímica apresentou
perfil de marcação multifocal no estroma, e algumas células positivas no epitélio,
com moderado aumento de marcação para células CD4+ nas amostras normais,
quando comparadas às amostras de baixo e alto grau (Figura 4.1).
Porém, apesar do leve aumento celular observado não houve diferença
estatística entre nenhum dos grupos avaliados (Tabela 4.2).
Figura 4-4-1 Imunohistoquímica para células CD4+ em amostras fixadas em formol e incluídas
em parafina. (A) Sem lesão. (B) Baixo grau. (C) Alto grau.
CD8+: O perfil de positividade para células CD8+ se apresentou multifocal no
estroma, com relevante número de células positivas no epitélio. Foram incluídas
para análise 56 amostras. Não foi observado um padrão diferenciado de marcação
entre os grupos analisados (Figura 4.2 – A). E também não houve diferença
estatisticamente significante nos níveis de expressão quando comparado os
diferentes graus de lesão (Tabela 4.2).
FoxP3+: Na marcação para FoxP3+ também foi observado padrão de
positividade multifocal, com poucas células marcadas no epitélio, e com aumento de
células positivas nas amostras com NIA de alto grau, quando comparadas às
40
amostras normais e de NIA de baixo grau (Figura 4.2 – B). No grupo infectado pelo
HIV observamos aumento da expressão de FoxP3 de acordo com o aumento do
grau de lesão. Amostras com laudo histopatológico sem lesão, NIA baixo grau e alto
grau apresentaram média de expressão de 4,6%, 4,1% e 11,8% respectivamente.
Esse aumento foi estatisticamente significante, com p= 0,002. Não houve diferença
estatística na marcação quando comparadas as amostras sem lesão dos grupos
infectado e não infectado pelo HIV. (Tabela 4.2).
T-bet+: Na análise da expressão de T-bet, observamos perfil de marcação
focal, apenas no estroma, e com leve aumento de células positivas no grupo sem
lesão em relação aos demais grupos (Figura 4.2 – C e D). Para esse marcador,
observamos diferença entre o grupo com NIA baixo grau infectado pelo HIV, com
média de 3,3% de marcação, e o grupo sem lesão Não infectado pelo HIV, com
média de marcação de 0,5% (p=0.032) (Tabela 4.2).
Figura 4-2. Marcação de imunohistoquímica para CD8+, FoxP3 e T-bet. (A) Mucosa escamosa,
apresentando moderado infiltrado inflamatório linfocitário no estroma, com poucos linfócitos marcados
para FoxP3+ no estroma (seta) e no epitélio (20x). (B) Mucosa escamosa exibindo leve infiltrado
linfocitário com linfócitos CD8+ no estroma e no epitélio (40x). (C) Mucosa escamosa (NIA III)
exibindo moderado infiltrado linfocitário com raras células marcadas para T-bet (seta). (40x). (D)
Fragmento e estroma de biopsia anal exibindo moderado infiltrado linfocitário com raras células
marcadas para T-bet (seta) (40x).
41
IL-10+: A marcação de IL-10 apresentou perfil multifocal, predominante no
estroma, com pouquíssimas células marcadas no epitélio (Figura 4.3). Foi
observado maior expressão de IL-10 nas lesões de NIA de alto grau, com média de
13,3% de positividade, nos indivíduos infectados pelo HIV. Ao passo que as
amostras com diagnóstico sem lesão e NIA baixo grau (ambos infectados pelo HIV)
tiveram menor expressão da citocina, com média de 7,3% e 10,1% de marcação. No
grupo infectado pelo HIV,o aumento de IL-10+ em relação aos outros grupos foi
significativo ao nível de 5% (p-valor =0,003). Não houve diferença estatística na
marcação da citocina quando comparado às amostras sem lesão de infectados e
não infectados pelo HIV (Tabela 4.2).
42
Figura 4-3. Marcação imunohistoquímica para IL-10. Todas as células positivas para IL-10 estão
coradas em cor castanha. (A) tecido sem lesão, 20x. (B) NIA de baixo grau, 20x. (C) NIA de alto grau,
20x.
43
Tabela 4-2. Expressão dos marcadores imunes de acordo com o diagnóstico histopatológico e
sorologia HIV (2010-2013).
Marcador
CD4+ %
HIV
Diagnóstico
Média (DP)
Não infectados
Sem lesão
11,3 (1,5)
8
Infectados
Sem lesão
10,4 (1,7)
10
Baixo Grau
Alto Grau
8,5 (1,0)
8,0 (2,1)
9,3 (0,8)
20
11
49
Não infectados
Sem lesão
23,3 (3,6)
5
Infectados
Sem lesão
25,6 (4,6)
10
Baixo Grau
Alto Grau
30,4 (2,6)
29,4 (3,0)
28,6 (1,7)
24
17
56
Não infectados
Sem lesão
2,6 (0,9)
10
Infectados
Sem lesão
4,6 (0,9)
12
Baixo Grau
Alto Grau
4,1 (1,0)
11,8 (2,1)
6,8 (1,0)
18
23
63
Não infectados
Sem lesão
0,5 (0,5)
3
Infectados
Sem lesão
2,3 (0,5)
14
Baixo Grau
Alto Grau
3,3 (0,8)
4,4 (1,6)
3,2 (0,6)
15
16
48
Não infectado
Sem lesão
3,3 (1,6)
2
Infectados
Sem lesão
7,3 (0,8)
17
Total
CD8+ %
Total
FoxP3+ %
Total
T-bet+ %
Total
IL10+ %
N
p-valor
0,22
0,47
0,002
0,73
0,003
Baixo Grau
Alto Grau
10,1 (0,9)
21
13,3 (1,5)
21
Total
10,2 (0,7)
61
Nota: Foi aplicado o teste de Kruskal Wallis para comparação no grupo infectado pelo HIV de acordo
com diagnóstico histopatológico. E para comparação entre os grupos infectados pelo HIV e HV
negativo apenas com diagnóstico sem lesão (sem lesão). DP = Desvio Padrão.
4.3 – ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO BIOMARCADOR SLPI
Assim como na avaliação dos marcadores imunes, após a realização da
imunohistoquímica muitos casos foram perdidos devido a questões pertinentes a
técnica, dessa maneira, para avaliação da expressão de SLPI como possível
biomarcador foram considerados 45 casos ao total.
A marcação imunohistoquímica para SLPI foi avaliada da seguinte forma:
negativa (0%), fraca (1-19%), moderada (20-49%) ou forte (≥50%), baseado na
44
porcentagem de células positivas em cada amostra. Todos os casos controles
apresentaram positividade para SLPI, com forte marcação, principalmente nas
células escamosas mais diferenciadas, com marcação leve nas células da camada
basal. As lesões de alto grau se apresentaram menos marcadas para SLPI em
comparação as lesões de baixo grau (Figura 4.4).
Figura 4-4. Marcação de SLPI em biopsias anais. (A) Forte expressão do SLPI em controle (Não
infectados pelo HIV, sem lesão). (B) expressão moderada em lesão de baixo grau (NIA1). (C)
expressão fraca e alto grau (NIA 2/3). 40x.
A expressão de SLPI foi avaliada de acordo com o diagnóstico
histopatológico. Dessa maneira, observamos que no grupo infectado pelo HIV,
houve predominância dos casos de NIA de alto grau, 88,9% (8/9) nos casos com
escore negativo (escore 0). E menor distribuição das amostras de alto grau, 25%
(3/12), com escore 3. Inversamente, a expressão da proteína está aumentada nos
casos de NIA de baixo grau e sem lesão. Os quais 75% (9/12) dos casos com forte
marcação (escore 3) foram de NIA de baixo grau e sem lesão, e apenas 11,1% (1/9)
escore zero.
No grupo infectado pelo HIV observou-se que quanto menor a expressão de
SLPI, maior foi o aumento da gravidade da lesão, com diferença estatisticamente
significativa entre os diferentes níveis de expressão de SLPI (p<0,05), quando foram
comparados aos grupos descritos acima. Não houve diferença estatística quando
comparada a expressão nos casos com diagnóstico sem lesão nos grupos infectado
e não infectado pelo HIV (Figura 4.5).
45
Diágnóstico histopatológico segundo escore SLPI
100,0
88,9
90,0
80,0
80,0
75,0
70,0
64,3
Normal/Baixo Grau
60,0
Alto Grau
% 50,0
40,0
35,7
30,0
25,0
20,0
20,0
11,1
10,0
,0
0 (N = 9)
1 (N = 14)
2 (N = 10)
Escore SLPI
3 (N = 12)
Figura 4-5. Expressão de SLPI in situ de acordo com o diagnóstico histopatológico. Escore 0 =
marcação negativa (0%); escore 1 = marcação fraca (1-19%); escore 2 = marcação moderada (2049%); escore 3 = marcação forte (≥50%). (p<0,05).
Não houve diferença associação estatisticamente significativa na expressão
dos marcadores imunes e do biomarcador SLPI quando observado o uso de
HAART.
Avaliamos o escore obtido da expressão da proteína SLPI segundo a
oncogenicidade do HPV detectado na biópsia. Observamos que as amostras
positivas para DNA de HPV de alto risco 77,8% (7/9) foram negativas para SLPI
(escore 0), 78,6% (11/14), 33,3% (3/9) e 63,6% (7/11) nos escores 1, 2 e 3
respectivamente. Para os casos com presença de DNA de HPV de baixo risco,
11,1% (1/9), 21,4% (3/9), 44,4% (4/9) e 27,3% (3/9) apresentaram escore de SLPI
negativo (zero), 1, 2 e 3 respectivamente. E dois casos com infecção múltipla por
HPV de baixo e alto risco apresentaram escore 2 e 3 de SLPI (Tabela 4.3)
Tabela 4-3. Expressão de SLPI segundo oncogenicidade do HPV (2010-2013).
Oncogenicidade HPV
Escore SLPI - N (%)
0
1
2
3
Total
Negativo
1 (11,1)
-
1 (11,1)
-
2 (4,7)
Baixo Risco
1 (11,1)
3 (21,4)
4 (44,4)
3 (27,3)
11 (25,6)
Alto Risco
7 (77,8)
11 (78,6)
3 (33,3)
7 (63,6)
28 (65,1)
-
-
1 (11,1)
1 (9,1)
2 (4,7)
9 (100,0)
11 (100,0)
43 (100,0)
Baixo/Alto Risco
Total
9 (100,0) 14 (100,0)
Missing: 4,4%
46
4.4. CORRELAÇÃO ENTRE OS MARCADORES IN SITU ENÍVEIS DE CD4+
PERIFÉRICOS
Para análise de correlação entre os marcadores e níveis de CD4+ periféricos,
foram empregadas a Correlações de Pearson e de Spearman nos dados obtidos por
imunohistoquímica.
Através da correlação de Pearson observamos moderado coeficiente de
correlação positiva (r= 0,34; p= 0,029) entre os níveis de expressão de CD4+ in situ
e CD4+ periférico atual. E entre os níveis de CD4+ periférico próximo à data da
coleta e CD4+ periférico nadir (r= 0,31; p= 0,001). Também observamos forte
coeficiente de correlação negativa (r= -0,51; p=0,004) entre os níveis de CD4+ in situ
e IL-10 (Figura 4.6 – A, B e C).
Através da correlação de Spearman observamos moderado coeficiente de
correlação positiva entre FoxP3+ e IL-10 (0,34; p=0,027). Os mesmos testes foram
aplicados para os outros marcadores, porém não houve relevância estatisticamente
significativa (Figura 4.6 - D).
Os Coeficientes de correlação de Pearson e Spearman foram empregados
para avaliar os outros marcadores, porém não foram encontrados coeficientes de
correlação com significância estatística.
Figura 4-6. Correlações observadas. Em A, B e C coeficiente de correlação de Pearson; Em A e C
correlação positiva; Em C correlação negativa. Em D coeficiente de correlação de Spearman;
correlação positiva.
47
Observamos fraco coeficiente de correlação positiva entre a expressão de Tbet+ e Foxp3+, porém com significância limítrofe (r= 0,34; p-valor = 0,055).
A comparação entre os níveis dos marcadores imunes segundo a expressão
de SLPI não foi estatisticamente significativa (p-valor >0,05). Também não
encontramos associação entre os níveis de expressão dos marcadores in situ
(marcadores imunes e SLPI) com o uso de cART.
4.5. TIPOS DE HPV ENCONTRADOS EM BIÓPSIA E SECREÇÃO ANAL
Do total de 114 biópsias incluídas, 7 foram excluídas das análises devido a
resultado para β-globina negativo, de maneira que analisamos somente 107
amostras. Através da técnica de PCR e sequenciamento encontramos 93,4%
(101/107) de casos positivos para DNA de HPV. As amostras negativas para HPV
foram confirmadas com o nested PCR utilizando o par de primer GP5+/6+, e
apresentaram resultado para β-globina positivo.
Entre as amostras positivas foram identificados 23 tipos de HPV, sendo 8
tipos de baixo risco (6, 11, 40, 42, 43, 54, 61, 89), 11 tipos de alto risco oncogênico
(16, 18, 31, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59) e 4 tipos considerados prováveis de alto
risco (53, 66, 67 e 69). Para as comparações realizadas de acordo com o
diagnóstico histopatológico, os genótipos de alto risco e os considerados prováveis
de alto risco foram agrupados, de maneira que foi utilizado como variável de
comparação os seguintes perfis de oncogenicidade: baixo risco, alto risco e
alto/baixo risco, sendo o último pertinente às infecções múltiplas (Tabela 4.4).
O tipo que apresentou maior prevalência foi o HPV 16, sendo 27,1% (29/107)
dos casos, seguido do HPV 6, com 15,9% (17/107), o HPV 59 com 13,1% (14/107),
e o HPV 18 com 9,3% (11/107). Observamos diferença estatística (p=0,02) no
resultado de HPV 6 entre os grupos sem lesão, NIA baixo grau e NIA alto grau,
infectado pelo HIV. Quando analisamos a oncogenicidade dos genótipos de HPV
quanto ao diagnóstico, no grupo infectado pelo HIV, observamos que 81,1% (30/37)
dos casos de NIA alto grau, estavam infectados por HPV de alto risco. E 26,3%
(10/38) dos casos com NIA baixo grau, apresentavam HPV de baixo risco. A
diferença observada nesse grupo foi estatisticamente significante (p=0,03) (Tabela
4.4).
48
Além disso, encontramos 9,72% (9/107) de casos com múltipla infecção,
todos em indivíduos infectados pelo HIV. Destes, 6 casos apresentaram HPV de
genótipos de alto e baixo risco oncogênico, e 3 amostras com múltipla infecção
apenas por genótipos de alto risco oncogênico (Tabela 4.4).
Analisamos os tipos de HPV detectados na secreção anal, utilizando o kit
PapilloCheck® (GreinerBio-One, Frickenhausen, Alemanha). Sendo que apenas
57,8% (65/114) das amostras apresentavam resultado disponível no banco de dados
do INI.
Utilizando essa abordagem, foram detectados 24 tipos de HPV. Sendo que
22,7% (15/65) foram tipos de alto risco oncogênico (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 56, 58, 59, 68, 73, 82), 10,6% (7/65) dos tipos de baixo risco oncogênico (6,11,
40, 42, 43, 44/55, 70), e 3% (2/65) dos casos considerados como provável alto risco
(53 e 65). Assim como no resultado encontrado nas biópsias, o HPV 16 foi o de
maior
prevalência,
encontrado
em
30,3%
(20/65)
das
amostras.
Porém,
diferentemente do resultado em biópsia, HPV 16 foi seguido do HPV 52 com 22,7%
(15/65) dos casos, HPV 44/55 com 21,2% (14/65) e HPV 56 com 19,7 % (13/65) dos
casos (Tabela 4.5).
Adicionalmente, observamos dentre as amostras com HPV 51, que a maioria
eram oriundas de indivíduos infectados pelo HIV e com diagnóstico histopatológico
sem lesão (p=0,009). Quando avaliado a oncogenicidade dos genótipos de HPV
encontrados na secreção anal, não foi observada diferença estatisticamente
significativa entre os grupos de comparação discriminados.
Através do método utilizado na identificação dos tipos virais a partir da swab
(secreção) anal encontramos maior número de casos com infecções múltiplas,
quando comparado ao resultado gerado a partir das biópsias. Do total de amostras
analisadas, 40 apresentaram mais de um tipo de HPV (Tabela 4.5).
49
Tabela 4-4. Tipos de HPV encontrados nas biópsias de acordo com diagnóstico histopatológico
(2010-2013).
Status sorológico para o HIV
Diagnóstico Histopatológico - N (%)
Variáveis
Não
infectados
Sem lesão
Total
Infectados pelo HIV
Sem lesão NIA Baixo Grau
NIA Alto Grau
(N = 15)
(N = 21)
(N = 39)
(N = 39)
HPV 16
3 (27,3)
3 (14,3)
10 (26,3)
13 (35,1)
29 (27,1)
HPV 18
-
4 (19,0)
4 (10,5)
2 (5,4)
10 (9,3)
HPV 31
-
-
3 (7,9)
-
3 (2,8)
HPV 33
-
-
1 (2,6)
2 (5,4)
3 (2,8)
HPV 35
-
-
2 (5,3)
3 (8,1)
5 (4,7)
HPV 39
-
-
2 (5,3)
1 (2,7)
3 (2,8)
HPV 51
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
HPV 52
-
2 (9,5)
2 (5,3)
-
4 (3,7)
HPV 56
-
1 (4,8)
-
-
1 (0,9)
HPV 58
-
1 (4,8)
1 (2,6)
4 (10,8)
6 (5,6)
HPV 59
2 (18,2)
2 (9,5)
6 (15,8)
4 (10,8)
14 (13,1)
HPV 53
-
-
1 (2,6)
2 (5,4)
3 (2,8)
HPV 66
-
1 (4,8)
1 (2,6)
1 (2,7)
3 (2,8)
HPV 67
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
HPV 69
1 (9,1)
1 (4,8)
1 (2,6)
-
3 (2,8)
HPV 6*
1 (9,1)
5 (23,8)
7 (18,4)
4 (10,8)
17 (15,9)
HPV 11
1 (9,1)
1 (4,8)
6 (15,8)
-
8 (7,5)
HPV 40
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
HPV 42
-
-
2 (5,3)
-
2 (1,9)
HPV 43
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
HPV 54
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
HPV 61
-
1 (4,8)
2 (5,3)
1 (2,7)
4 (3,7)
HPV 89
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
HPV 6, 16, 52
-
1 (4,8)
-
-
1 (0,9)
HPV 18, 52
HPV 11, 16, 18, 31, 35,
39, 52, 6, 43, 61
HPV 11, 16
-
1 (4,8)
-
-
1 (0,9)
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
HPV 6, 11, 40, 16
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
HPV 18, 33, 39
-
-
-
1 (2,7)
1 (0,9)
Alto Grau
Provável Alto Grau
Baixo Grau
Múltipla-infecção
50
HPV 11, 54, 31, 59
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
HPV 11, 61, 59
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
HPV 69, 16
-
-
1 (2,6)
-
1 (0,9)
3 (27,3)
2 (9,5)
-
2 (5,4)
7 (6,5)
Baixo Risco
2 (18,2)
6 (28,6)
10 (26,3)
5 (13,5)
23 (21,5)
Alto Risco
6 (54,5)
12 (57,1)
23 (60,5)
30 (81,1)
71 (66,4)
HPV Negativo
Oncogenicidade HPV
Alto/Baixo Risco
1 (4,8)
5 (13,2)
Informação ignorada (missing): HPV genótipos = 6,1%, Oncogenicidade HPV= 6,1%
51
6 (5,6)
Tabela 4-5. Genótipos de HPV encontrados na secreção anal segundo diagnóstico histopatológico
(2010-2013).
Status sorológico para o HIV
Diagnóstico Histopatológico - N(%)
Variáveis
Não
infectados
Total
Infectados pelo HIV
Sem lesão Sem lesão NIA Baixo Grau
NIA Alto Grau
(N = 15)
(N = 21)
(N = 39)
(N = 39)
HPV alto risco
6 (40,0)
5 (83,3)
19 (86,4)
21 (95,5)
51 (78,5)
HPV não alto risco
3 (20,0)
3 (50,0)
12 (54,5)
11 (50,0)
29 (44,6)
HPV 16
-
2 (33,3)
6 (27,3)
11 (50,0)
19 (29,2)
HPV 18
-
1 (16,7)
3 (13,6)
3 (13,6)
7 (10,8)
HPV 31
1 (6,7)
1 (16,7)
2 (9,1)
3 (13,6)
7 (10,8)
HPV 33
-
-
2 (9,1)
3 (13,6)
5 (7,7)
HPV 35
1 (6,7)
-
1 (4,5)
2 (9,1)
4 (6,2)
HPV 39
1 (6,7)
-
2 (9,1)
3 (13,6)
6 (9,2)
HPV 45
-
-
5 (22,7)
3 (13,6)
8 (12,3)
HPV 51*
1 (6,7)
3 (50,0)
1 (4,5)
1 (4,5)
6 (9,2)
HPV 52
-
3 (50,0)
7 (31,8)
5 (22,7)
15 (23,1)
HPV 56
1 (6,7)
2 (33,3)
6 (27,3)
3 (13,6)
12 (18,5)
HPV 58
-
-
4 (18,2)
6 (27,3)
10 (15,4)
HPV 59
-
1 (16,7)
4 (18,2)
3 (13,6)
8 (12,3)
HPV 68
-
-
6 (27,3)
3 (13,6)
9 (13,8)
HPV 73
-
-
3 (13,6)
-
3 (4,6)
HPV 82
-
1 (16,7)
1 (4,5)
3 (13,6)
5 (7,7)
HPV 53
1 (6,7)
3 (50,0)
2 (9,1)
5 (22,7)
11 (16,9)
HPV 66
-
1 (16,7)
5 (22,7)
2 (9,1)
8 (12,3)
HPV 6
-
1 (16,7)
3 (13,6)
6 (27,3)
10 (15,4)
HPV 11
-
-
5 (22,7)
2 (9,1)
7 (10,8)
HPV 40
2 (13,3)
-
1 (4,5)
-
3 (4,6)
HPV 42
-
1 (16,7)
4 (18,2)
5 (22,7)
10 (15,4)
HPV 43
-
-
1 (4,5)
2 (9,1)
3 (4,6)
1 (6,7)
2 (33,3)
4 (18,2)
7 (31,8)
14 (21,5)
-
1 (16,7)
3 (13,6)
2 (9,1)
6 (9,2)
HPV 16, 52
-
4 (66,7)
11 (50,0)
13 (59,1)
28 (43,1)
HPV 39, 66
1 (6,7)
1 (16,7)
7 (31,8)
4 (18,2)
13 (20,0)
Alto risco
Provável alto risco
Baixo Risco
HPV 44, 55
HPV 70
Múltiplas infecções
52
HPV 16, 56
1 (6,7)
3 (50,0)
10 (45,5)
13 (59,1)
27 (41,5)
HPV 16, 56
1 (6,7)
3 (50,0)
10 (45,5)
13 (59,1)
27 (41,5)
HPV 11, 45
-
-
9 (40,9)
5 (22,7)
14 (21,5)
HPV 31, 39
2 (13,3)
1 (16,7)
3 (13,6)
5 (22,7)
11 (16,9)
HPV 16, 45
-
2 (33,3)
9 (40,9)
12 (54,5)
23 (35,4)
HPV 68, 70
-
1 (16,7)
6 (27,3)
5 (22,7)
12 (18,5)
HPV 56, 58
1 (6,7)
2 (33,3)
9 (40,9)
7 (31,8)
19 (29,2)
HPV 56, 66
1 (6,7)
2 (33,3)
8 (36,4)
4 (18,2)
15 (23,1)
HPV 16,53, 58
1 (6,7)
4 (66,7)
9 (40,9)
16 (72,7)
30 (46,2)
HPV 18, 52, 59
-
3 (50,0)
8 (36,4)
6 (27,3)
17 (26,2)
HPV 16, 33, 68
-
2 (33,3)
12 (54,5)
13 (59,1)
27 (41,5)
HPV 16, 44, 55, 52
1 (6,7)
4 (66,7)
12 (54,5)
15 (68,2)
32 (49,2)
HPV 16, 43, 44, 55, 58
1 (6,7)
3 (50,0)
10 (45,5)
15 (68,2)
29 (44,6)
HPV 56, 58, 66, 68
1 (6,7)
2 (33,3)
12 (54,5)
11 (50,0)
26 (40,0)
HPV 44, 55, 51, 52, 59
2 (13,3)
5 (83,3)
10 (45,5)
9 (40,9)
26 (40,0)
HPV 11, 33, 56, 82
1 (6,7)
3 (50,0)
9 (40,9)
10 (45,5)
23 (35,4)
HPV 51, 53, 56, 66
3 (20,0)
4 (66,7)
10 (45,5)
8 (36,4)
25 (38,5)
HPV 16, 44, 55, 52, 53, 58
2 (13,3)
5 (83,3)
14 (63,6)
16 (72,7)
37 (56,9)
HPV 16, 18, 42, 45, 59
-
4 (66,7)
11 (50,0)
15 (68,2)
30 (46,2)
HPV 11, 31, 33, 43, 66
1 (6,7)
2 (33,3)
9 (40,9)
10 (45,5)
22 (33,8)
HPV 16, 18, 52, 58, 59
-
4 (66,7)
12 (54,5)
16 (72,7)
32 (49,2)
HPV 39, 42, 44, 55, 45, 51
3 (20,0
4 (66,7)
9 (40,9)
12 (54,5)
28 (43,1)
HPV 6, 16, 31, 42, 45
HPV 33, 39, 42, 44, 55, 45,
58
HPV 16, 18, 44, 55, 51, 53,
68
HPV 42, 44, 55, 53, 56, 58,
66
HPV 6, 42, 45, 52, 58, 66
1 (6,7)
3 (50,0)
12 (54,5)
17 (77,3)
33 (50,8)
2 (13,3)
3 (50,0)
12 (54,5)
16 (72,7)
33 (50,8)
3 (20,0)
5 (83,3)
12 (54,5)
15 (68,2)
35 (53,8)
3 (20,0)
4 (66,7)
12 (54,5)
15 (68,2)
34 (52,3)
-
4 (66,7)
16 (72,7)
14 (63,6)
34 (52,3)
HPV 11, 31, 39, 52, 59, 68
2 (13,3)
4 (66,7)
16 (72,7)
12 (54,5)
34 (52,3)
HPV 6, 16, 53, 56, 58, 68
HPV 16, 31, 44, 55, 51, 53,
56
HPV 11, 40, 53, 56, 68, 70,
73
HPV 6, 18, 42, 52, 53, 70, 82
HPV 16, 42, 44, 55, 56, 66,
68, 70, 73
HPV 6, 11, 35, 44, 55, 52, 53,
59, 68
HPV 6, 11, 16, 33, 43, 44, 55,
52, 59, 70
HPV 6, 16, 18, 35, 44, 55, 52,
58, 59, 68, 73
2 (13,3)
4 (66,7)
14 (63,6)
17 (77,3)
37 (56,9)
5 (33,3)
5 (83,3)
13 (59,1)
17 (77,3)
40 (61,5)
4 (26,7)
3 (50,0)
12 (54,5)
9 (40,9)
28 (43,1)
1 (6,7)
5 (83,3)
14 (63,6)
14 (63,6)
34 (52,3)
2 (13,3)
5 (83,3)
15 (68,2)
17 (77,3)
39 (60)
3 (20,0)
5 (83,3)
17 (77,3)
15 (68,2)
40 (61,5)
1 (6,7)
4 (66,7)
18 (81,8)
16 (72,7)
39 (60,0)
1 (6,7)
4 (66,7)
16 (72,7)
17 (77,3)
38 (58,5)
* Teste exato de Fisher, p<0,005. Informação ignorada (missing): HPV alto risco = 43,0%, HPV não
alto risco = 43,0%, genótipos HPV = 43,0%
53
Ao analisarmos os diferentes tipos de HPV encontrados na biópsia
e secreção anal, observamos que o HPV 16, de alto risco oncogênico,
foi o de maior prevalência nos dois casos. Comparando os dois resultados, 18 tipos
de HPV foram encontrados em ambos materiais de partida. Porém quando
observadas as 60 amostras em comum, com resultado de HPV, observamos fraca
concordância entre os dois métodos, com exceção para o diagnóstico de HPV 11,
que apresentou concordância moderada (k = 0,57; p = 0,000) (Tabela 4.6).
Foi observada menor sensibilidade que especificidade para a maioria dos
genótipos detectados por ambos os métodos e especialmente, uma elevada
especificidade para os genótipos 31, 43 e 53 (Tabela 4.6).
Tabela 4-6. Sensibilidade, especificidade e grau de concordância entre os genótipos de HPV
encontrados em biópsia e secreção anal (2010-2013).
Sensibilidade
Specificidade
Coeficiente
Kappa
N
P-valor
HPV 6
20,0
92,0
0,14
60
0,248
HPV 11
57,1
96,2
0,57
60
0,000
HPV 16
55,6
73,8
0,28
60
0,029
HPV 18
16,7
96,3
0,17
60
0,167
HPV 31
28,6
100,0
0,41
60
0,000
HPV 33
-
-
-
-
-
HPV 35
25,0
98,2
0,30
60
0,012
HPV 39
0,0
98,2
-0,03
60
0,761
HPV 40
-
-
-
-
-
98,0
100,0
97,8
100,0
98,0
84,9
96,2
-0,03
0,49
0,07
0,14
0,41
0,32
0,12
60
60
60
60
60
60
60
0,652
0,000
0,364
0,033
0,001
0,009
0,296
Genótipos HPV
HPV 42
0,0
HPV 43
33,3
HPV 51
HPV 52
7,1
HPV 53
9,1
HPV 56
HPV 58
33,3
HPV 59
57,1
HPV 66
12,5
Nota: p-valor para o coeficiente de Kappa.
Avaliamos o resultado da genotipagem dos HPV encontrados nas biópsias
(n= 107) e na secreção anal (n= 65) quanto ao diagnóstico histopatológico. Para as
biópsias, todo o grupo infectado pelo HIV apresentou alto percentual de HPV de alto
risco oncogênico, sendo 57,1% (12/21) no grupo sem lesão, 60,5% (23/38) no grupo
com NIA de baixo grau e 81,1% (30/37) no grupo com NIA de alto grau. Quando
analisados os HPV de baixo risco oncogênico, observamos distribuição de 25%
(8/23) e 26,3% (10/23) das amostras no grupo sem lesão e NIA baixo grau,
54
respectivamente. Houve diferença estatística entre os grupos de estudo quando
avaliado a oncogenicidade do HPV (p<0.036) (Tabela 4.7).
Da mesma forma, nas amostras de secreção anal foi observada uma maior
ocorrência de HPV de alto risco oncogênico com diagnóstico histopatológico NIA de
alto grau, quando comparadas as biópsias sem lesão com diagnóstico de NIA de
baixo grau dentre as amostras infectadas pelo HIV. Porém não foi observada
diferença estatisticamente significativa (p-valor >0,05). Quando se consideram
somente as amostras com diagnóstico histopatológico sem lesão,também não se
observa diferença estatisticamente significativa da frequência de HPV de alto risco
oncogênico entre as amostras dos grupos infectado e não infectado pelo HIV (pvalor >0,05) (Tabela 4.7).
55
Tabela 4-7. Oncogenicidade dos HPV encontrados em biópsias de acordo com o diagnóstico histopatológico (2010-2013).
Status sorológico para o HIV
Diagnóstico histopatológico
Variáveis
Não infectados
Sem lesão
N
%
HPV biópsia
Infectados
Sem lesão
Baixo grau
Alto grau
Total
Total
Sem lesão Baixo grau
Alto grau
Total
N
%
N
%
N
%
N
%
N
%
N
%
N
%
N
%
Negativo
3
27,3
2
9,5
0
0
2
5,4
4
4,2
5
15,6
0
0
2
5,4
7
6,5
Baixo Risco
2
18,2
6
28,6
10
26,3
5
13,5
21
21,9
8
25,0
10
26,3
5
13,5
23
21,5
Alto Risco
6
54,5
12
57,1
23
60,5
30
81,1
65
67,7
18
56,3
23
60,5
30
81,1
71
66,4
Baixo e Alto Risco
0
,0
1
4,8
5
13,2
0
0
6
6,3
1
3,1
5
13,2
0
0
6
5,6
Total
11
100
21
100
38
100
37
100
96
100
32
100
38
100
37
100
107
100
56
5. DISCUSSÃO
Sabemos que o HPV está principalmente relacionado com o câncer cervical, porém
sua associação com o desenvolvimento de neoplasias intraepiteliais anais está se
tornando mais frequente. O que pode ser explicado pelo aumento do tempo de vida dos
indivíduos infectados pelo HIV devido ao impacto do tratamento com cART. Mais de 90%
dos casos de carcinomas anais em indivíduos infectados pelo HIV estão associados com
a infecção persistente por pelo menos um subtipo de HPV, sendo comum a infecção
múltipla (51,81).
No entanto, o mecanismo imune pelo qual a infecção pelo HPV e HIV predispõe
pacientes ao desenvolvimento de carcinoma anal ainda não está bem esclarecido.
Inicialmente, o objetivo do estudo era estudar o perfil in situ dos marcadores
escolhidos na população masculina atendida pela coorte do INI. Contudo, não obtivemos
quantidade de indivíduos suficientes para as análises propostas, se fazendo necessária a
inclusão de mulheres no estudo. Além dos fatores imunes associados ao desenvolvimento
da neoplasia intraepitelial anal, decidimos avaliar também fatores epidemiológicos
relacionados com o desenvolvimento de lesões epiteliais malignas e infecção pelo HPV,
com o objetivo de correlacionar os dados clínicos, epidemiológicos e moleculares.
Alguns estudos relatam a idade como importante fator no desenvolvimento de
lesões associadas ao HPV(82). Foi observado no presente estudo que a média de idade
da população estudada mostrou leve aumento de acordo a gravidade da lesão. A média
de idade entre os indivíduos infectados pelo HIV foi de 42 anos e 33,6 para os indivíduos
não infectados pelo HIV, de maneira que esse grupo contribuiu apenas com amostras de
tecido diagnosticado como sem lesão pelo histopatológico.
Verificamos também que no grupo infectado pelo HIV ocorreu um aumento da
idade de acordo com a gravidade da lesão, a média de idade dos indivíduos com
amostras normais, NIA 1 e NIA 2/3 foram 38,5; 41,5 e 44,4 anos respectivamente, com
diferença estatística significante.
Nosso resultado corrobora com dados publicados na literatura (83). Em um estudo
realizado no Brasil com mulheres infectadas pelo HPV, publicado recentemente, AmaroFilho e colaboradores observaram que em casos de câncer cervical, mulheres com coinfecção pelo HIV e HPV apresentam média de idade mais avançada, com média de 51,1
anos (83). Outro estudo realizado com mulheres infectadas pelo HIV em uma coorte
57
também brasileira analisou amostras de NIA e associação com HPV. Nesse estudo as
mulheres com diagnóstico de NIA apresentaram média de 42 anos de idade (18).
Em um estudo recente realizado com a mesma coorte de pacientes do INI, Nicol e
colaboradores observaram que mulheres HIV positivas com <30 anos de idade
apresentavam uma maior soroprevalência do HPV 6,11,16 e 18, e havia uma tendência
de soroprevalência para HPV tipos 6, 16 em mulheres HIV negativas com > de 30 anos
(84).
Alguns outros fatores de risco conhecidos para o desenvolvimento de lesões HPV
indiuzidas já foram pré-estabelecidas como: o início de atividade sexual precoce, múltiplos
parceiros sexuais, história de DST, gravidez precoce e tabagismo (82). Ao analisarmos o
número de parceiros sexuais dos indivíduos incluídos no estudo, observamos que a
média de parceiros sexuais para mulheres foi de um nos últimos 6 meses, e para os
homens a média foi de 14,1 nos últimos 12 meses. A média de parceiros sexuais
masculinos relatados pelos homens foi de 13,6 nos últimos 12 meses.
Mesmo que o tempo analisado tenha sido diferente entre homens e mulheres, o
maior número de parceiros sexuais entre os homens quando comparado às mulheres é
notável. Principalmente no número de parceiros sexuais masculinos relatados pelos
homens. Dado esse que corrobora com a literatura, na qual estudos mostram que homens
que fazem sexo com homens (HSH) têm até 37 vezes mais chances de evolução para o
câncer anal, sendo considerados grupo de risco (85).
Dentre os pacientes que relataram tabagismo, 11/29 apresentaram diagnóstico
histopatológico de NIA de alto grau, e todos eram infectados pelo HIV. Quanto ao relato
de sexo anal receptivo, a maioria dos pacientes estava infectada pelo HIV e apresentaram
diagnóstico de NIA de baixo e alto grau. Essa característica condiz com estudos de NIA,
onde para homens e mulheres, são considerados fatores de risco para o desenvolvimento
de NIA e câncer anal, histórico de sexo anal receptivo, aumento do número de parceiros
sexuais e tabagismo. E para as mulheres, adicionalmente o câncer cervical (51).
Em nosso estudo, dentre os pacientes com CD4+ nadir <50 cél/mm³, 17/18 foram
diagnosticados com NIA de alto grau. Em uma coorte no Brasil de mulheres infectadas
pelo HIV onde foi avaliada associação entre HPV e citologia anal anormal, cerca de
14,8% (128/863) apresentaram CD4 nadir abaixo de 50 cél/mm³, e 78,7% (679/863)
apresentaram CD4+ periférico acima de 350 cél/mm³ (18).
58
Outro estudo onde foi realizada análise multivariada, observou-se que baixas
contagens de CD4+ (≤200 cél/mm³) não se mostram como forte preditor de infecção por
HPV de alto risco oncogênico (61).
Dentre os pacientes infectados pelo HIV, 81,8% estavam em uso de cART no
momento da coleta e 42,9% apresentaram carga viral detectável. No presente estudo não
observamos correlação entre os níveis de CD4+ periféricos e o uso de HAART. Em
estudo prévio do nosso grupo, com amostras cervicais, também não foi observado este
tipo de correlação (15).
A co-infecção pelo HIV/HPV leva a alterações biológicas importantes que
acarretam o desenvolvimento da progressão de NIA para o câncer anal. A maioria dos
estudos que abordam a resposta imune frente ao HPV/HIV estão voltados para o câncer
cervical, e já mostraram que na infecção somente pelo HPV há ativação da resposta
imune mediada por linfócitos de perfil Th1, ao passo que na co-infecção ocorre mudança
de perfil para Th2 (57).
Estudos prévios mostraram diferença significativa entre o número de células
imunocompetentes e o grau da neoplasia, contudo estes estudos foram em cérvice
uterina, indicando que a resposta imune no estroma é fundamental para a regressão da
lesão ou sua progressão para o câncer cervical (86,87).
Em nosso estudo não encontramos diferença estatística no perfil de marcação de
células CD4+ e CD8+ entre os indivíduos infectados pelo HIV, quanto ao diagnóstico
histopatológico. Em estudo publicado em 2007, também não foi visto diferença estatística
entre a expressão de células CD4+ e CD8+ in situ de biópsia com NIA de alto grau
quando comparado às biópsias sem lesão, utilizadas como controle (85).
Porém, esse resultado é controverso a outros estudos, que mostraram que ocorreu
a redução do número de células CD4+ no estroma de amostras de neoplasia intraepitelial
cervical (NIC) de mulheres HIV positiva (88). Em estudo publicado pelo nosso grupo,
também foi observado redução de células CD4+ e CD8+ em amostras com NIC de
mulheres infectadas pelo HIV (75).
Possivelmente, não observamos a redução dessas células no presente devido ao
baixo número de espécimes analisados para esses marcadores. Fato esse decorrente em
parte de problemas com a técnica de imunohistoquímica.
Outros estudos que avaliaram a presença de células T CD4+ observaram um
aumento significativo destas células em lesões de baixo grau, e que pacientes com
deficiência de linfócitos T CD4+ estavam associados com uma maior prevalência de
59
infecção pelo HPV e lesões pré-invasivas, evidenciando que a presença destas células
são essenciais para a replicação viral do HPV e no controle do câncer invasivo (16).
Ao analisarmos a expressão de T-bet+, um fator de transcrição ligado a
diferenciação de células Th1, também não observamos diferença entre os grupos
analisados, uma vez que foi vista fraca marcação imunohistoquímica nas amostras
avaliadas. Nosso resultado é controverso ao encontrado em amostras de câncer cervical,
onde observaram aumento desse tipo celular quando comparado aos casos sem lesão
(57). No entanto, em nosso estudo não foi utilizado amostras de câncer. Diante da
criteriosa busca bibliográfica durante este estudo, acreditamos que essa é a primeira vez
que esse fator de transcrição é avaliado em amostras de NIA de pacientes infectados e
não infectados pelo HIV.
Analisamos outro fator de transcrição, o FoxP3+ para o estudo de células T
regulatórias na NIA. Observamos significativo aumento das células T-regs no estroma de
amostras com NIA alto grau quando comparado as amostras sem lesão de pacientes
infectados pelo HIV.
Esse achado corrobora com dados da literatura, onde é visto superexpressão de
FoxP3+ em amostras de câncer cervical, NIA e câncer anal (57,89). Estudos prévios
sugerem que o elevado número de células FoxP3+ positivas na mucosa anal possa inibir
resposta imunes antitumorais, através de uma via dependente de TGF (90,91). Além
disso, altos níveis de células T-regs no tecido anal em pacientes com infecção crônica
pelo HPV pode atrasar a eliminação do vírus pelo sistema imune (92).
Um importante estudo mostrou um desequilíbrio da imunidade local devido a
depleção de células imune locais e uma superexpressão de Foxp3+. Bem como que IL-8
e IL-23 estavam associados com o desenvolvimento da malignidade anal em pacientes
co-infectados pelo HPV/HIV (89).
O aumento de células FoxP3+ positivas observado também tem relação com a
imunopatogênese do HIV. Estudos sugerem que o aumento de T-regs em mucosa seja
característico da infecção pelo HIV, principalmente em indivíduos sem tratamento, o que
indica que essas células tenham papel significativo na patogênese da doença (93). Além
disso, FoxP3 pode funcionar como repressor de transcrição durante a ativação de células
T, inibindo NFAT e NF-kB, e reprimindo a secreção de IL-2, IL-4, e IFN-gama (94).
Esse perfil de resposta pode estar ligado com a infecção crônica pelo HPV. Uma
vez que, a resposta mediada por IFN-gama é um importante mecanismo imunológico para
ao controle de infecções virais (53). Para análise de resposta Th2, verificamos a
60
marcação para citocina IL-10. Observamos que houve diferença estatística entre o grupo
infectado pelo HIV, quanto ao diagnóstico histopatológico, com aumento da marcação in
situ nas amostras de NIA de baixo e alto grau quando comparadas com o grupo sem
lesão.
A IL-10 é uma citocina capaz de inibir a resposta inflamatória do hospedeiro, de
maneira a favorecer o desenvolvimento de células tumorais. Dessa maneira, o aumento
da secreção de citocinas anti-inflamatórias como IL-10, atenua a resposta antitumoral
(55). Essa atividade corrobora com o dado encontrado em nosso estudo e na literatura,
onde é observado aumento dessa citocina em amostras de câncer cervical e de NIA em
pacientes infectados pelo HIV (95).
Além disso, o aumento de IL-10 também pode estar relacionado com a capacidade
de evasão do sistema imune característica do HPV. Uma vez que essa citocina prejudica
a resposta de células T antígeno específicas. O que está de acordo com estudos que
indicam que a predominância de citocinas Th2 em lesões causadas pelo HPV está
associada com o desenvolvimento de lesões neoplásicas (57).
Observamos também, correlação positiva entre a expressão de IL-10+ e Foxp3+
nos indivíduos infectados pelo HIV, mostrando que na NIA de alto grau de pacientes
infectados pelo HIV há um microambiente imunossuprimido. Em concordância com nosso
estudo, outro estudo observou aumento do mRNA dessas duas moléculas em lesões
neoplásicas causadas pelo HPV. E que células T-reg apresentavam a habilidade de inibir
o contato das células T, através da secreção de citocinas como IL-10 (96).
O coeficiente de correlação positiva observada entre IL-10+ e FoxP3+ era
esperado devido a função biológica exercida por ambos. Células T-regs secretam a
citocina IL-10, de maneira a manter a inibição da resposta inflamatória. Perfil esse
observado em pacientes infectados pelo HPV e também pelo HIV (93,95).
Observamos também coeficiente de correlação negativa entre a expressão de IL10 e CD4+in situ. IL-10 também é produzida por células T para controle da atividade
inflamatória, de maneira a agir nessas células indiretamente, reduzindo o número desse
tipo celular. Ou seja, as próprias células T secretam essa citocina para se autor
regularem. Fato esse que pode explicar a correlação negativa observada (58).
Analisando as taxas de CD4+ periférico, no grupo infectado pelo HIV; 28,3%
apresentaram CD4+ nadir abaixo de 50 cél/mm³. Quanto aos níveis de CD4+ periférico
41,4% apresentavam mais de 500 cél/mm³ e 30,3% acima de 350 cél/mm³. Em um estudo
onde foi realizada análise multivariada, observou-se que baixas contagens de CD4+ (≤200
61
cél/mm³) não se mostram como forte preditor de infecção por HPV de alto risco
oncogênico (61).
Ao compararmos o resultado dos marcadores in situ com os níveis de CD4+ no
sangue, observamos correlação positiva entre os níveis de CD4+ periférico atual (próximo
à data da biópsia) com a expressão de CD4+ in situ e com o CD4+ nadir desses
indivíduos. Mostrando que, no presente estudo, os níveis desse tipo celular na mucosa
infectada pelo HPV apresentaram associação com os níveis no sangue periférico.
Analisamos o perfil de expressão da proteína SLPI, em biópsias com diagnóstico
de NIA de indivíduos infectados pelo HIV e não infectados como possível biomarcador.
Segundo evidências científicas atuais, essa parece ser a primeira vez que é documentada
a análise da expressão dessa proteína na NIA.
Estudos demostraram que a expressão de SLPI está inversamente correlacionada
com a progressão de lesões neoplásicas em carcinoma escamoso de cabeça e pescoço e
com a presença de HPV, sugerindo que essa proteína possa ter influência na
suscetibilidade à infecção pelo HPV (32). Em nossas análises, observamos correlação
inversa entre a expressão de SLPI e o aumento da displasia de células epiteliais anais
entre indivíduos infectados pelo HIV, e na formação e progressão da NIA.
Em estudos com SLPI e infecção oral pelo HIV, foi observado que alta expressão
dessa proteína pode prevenir a infecção pelo HIV por bloquear a ligação do vírus na
célula hospedeira (97). Além disso, em recente estudo, foi demonstrado que a proteína
SLPI quando incubada com células epiteliais, reduz a entrada de HPV nessas células
através de resposta dose-dependente.No mesmo trabalho, SLPI mostrou capacidade de
se ligar ao heterotetramêro de anexina A2. Dado esse muito importante, uma vez que
essa estrutura está associada à infecção e inserção do HPV nas células epiteliais (98).
Para a confirmação molecular da presença de DNA de HPV nas biopsias, foi
realizada a técnica de PCR, indicando que 93,51% (101/107) das amostras apresentavam
DNA de HPV. Esse número já era esperado, uma vez que todas as amostras coletadas
apresentaram diagnóstico histopatológico sugestivo de infecção pelo HPV. Este dado esta
de acordo com estudos já publicados. Em recente meta-análise publicada em 2013,
dentre os estudos realizados com lesões anais, foi encontrada prevalência de 92,6% de
HPV em mulheres e 80-90% em homens (29).
A identificação de DNA do HPV foi realizada por dois métodos distintos: através da
biópsia e pela análise da secreção anal (swab anal, coletado no mesmo dia da biópsia
anal). Contudo, não encontramos boa concordância entre os tipos de HPV encontrados
62
na secreção e biopsia anal (coeficiente kappa< 0,4). Somente os genótipos de HPV de
baixo risco oncogênico, 11 e 43 e o de alto risco oncogênico HPV 31 apresentaram
moderada concordância pelos dois métodos de detecção. O baixo nível de concordância
pode ter sido devido ao pequeno número disponível no resultado de secreção anal. Um
estudo comparativo reportou uma concordância de 44% para o tipo de HPV em biópsia e
amostras provenientes de lavagem vaginal de mulheres com lesões cervicais. O que
indica que o HPV detectado na secreção, não necessariamente é o mesmo tipo que está
causando a lesão intraepitelial (99).
Dentre os genótipos de HPV detectados na secreção anal dos indivíduos
infectados pelo HIV, o tipo 51, de alto risco oncogênico, apresentou diferença estatística
entre os grupos estudados, onde foi mais frequente nas amostras sem lesão (100).
Estudos mostram que a infecção por genótipos de alto risco oncogênico é frequente em
amostras anais de indivíduos infectados pelo HIV, e normalmente o HPV 51 aparece
moderadamente associado a lesões anais. Porém, o número de amostras em que foi
detectada a presença desse genótipo foi baixo, e não podemos excluir que a relação vista
com as amostras sem lesão de indivíduos infectados pelo HIV pode ter sido gerado ao
acaso. De maneira, que esse é um dado interessante a ser estudo em uma população
com número maior de indivíduos.
A histologia é o padrão ouro para diagnóstico do grau de lesão, desta forma a
distribuição dos genótipos de HPV foi descrita de acordo com o grau de lesão histológica.
Identificamos nas biopsias anais 23 genótipos diferentes, 11 genótipos de alto risco
oncogênico (16, 18, 31, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59), 4 genótipos considerados
prováveis de alto risco (53, 66, 67 e 69) e 8 genótipos de baixo risco oncogênico (6, 11,
40, 42, 43, 54, 61, 89). O tipo mais prevalente na população estudada foi o HPV 16,
identificado em 26,9% (29/107) das amostras, seguido do HPV 6, com 15,7% (17/107), o
HPV 59 com 13% (14/107), e o HPV 18 com 10,2% (11/107). E observamos que foi
estatisticamente significativo o alto número de casos infectados por genótipos de alto
risco no grupo de NIA alto grau infectado pelo HIV.
O HPV 16, um genótipo de alto risco oncogênico, está fortemente associado ao
desenvolvimento de lesões malignas associadas ao HPV, e ao câncer anal e cervical. Na
maioria dos estudos realizados com amostras diagnosticadas com NIA em indivíduos
infectados pelo HIV, o tipo mais frequente foi o HPV 16 (101). Nesse tipo de HPV, além
de outros tipos de alto risco, as proteínas virais E6 e E7 desempenham um papel
importante no processo de carcinogênese, de maneira que quando produzidas em
63
quantidades elevadas inibem a regulação do ciclo celular e interferem na homeostase do
epitélio, de maneira a levar ao desenvolvimento de lesões epiteliais neoplásicas, como a
NIA (46).
Dados da literatura confirmam que o HPV 16 é o mais prevalente no câncer
cervical e anal em todas as regiões do mundo e o tipo 18 está em segundo lugar.
Contudo, a frequência dos tipos de HPV encontrados varia conforme a região geográfica
da população estudada (102).
No presente estudo observamos resultado diferente quanto o HPV 18, onde o
segundo tipo mais prevalente foi o HPV 6, considerado de baixo risco oncogênico, e o
HPV 18 foi o quarto tipo mais encontrado. Observamos também que houve diferença
estatística significativa no grupo infectado pelo HIV, quando comparados os grupos por
diagnósticos, de maneira que o HPV 6 se mostrou mais frequente nos casos de NIA de
baixo grau. A maior parte dos casos com presença de DNA de HPV de baixo risco
oncogênico está presente em amostras normais ou de baixo grau, sendo 25% (8/23) e
26,3% (10/23) das amostras no grupo sem lesão e NIA baixo grau, respectivamente.
O HPV 6 está fortemente associado com o desenvolvimento de lesões benignas
de baixo grau, o condiloma acuminado, e lesões subclínicas. Dessa maneira, nosso
resultado corrobora com dados da literatura, onde o HPV 6 foi amplamente detectado em
lesões de baixo grau (39).
E explica-se também o HPV 18 não ter a frequência observada em outros estudos,
uma vez que a maioria das amostras incluídas no estudo foi diagnosticada como sem
lesão e lesão intraepitelial de baixo grau. Além disso, não avaliamos amostras com
diagnóstico de câncer.
Estudos indicam que o condiloma anal é usualmente considerado lesão benigna,
desde que não estejam associados ao HPV de alto risco oncogênico (82). No presente
estudo encontramos alta prevalência de HPV de alto risco oncogênico (60,5%) em
condiloma anal (que são lesões benignas de baixo grau) nos indivíduos infectados pelo
HIV. Fato interessante foi que as amostras sem lesão tanto de pacientes não infectados
pelo HIV, 54,5% (6/15), quanto de infectados pelo HIV, 57,1 (17/21), apresentaram HPV
de alto risco. Estas lesões podem regredir espontaneamente, permanecer estáveis ou
progredir em tamanho e número.
Além disso, encontramos 9,72% (9/107) de amostras com múltipla infecção
provenientes de indivíduos infectados pelo HIV. Destes, seis amostras apresentaram HPV
64
de genótipos de alto e baixo risco oncogênico, e três amostras com múltipla infecção
apenas por genótipos de alto risco oncogênico. A infecção múltipla por HPV também é
comum no ânus, porém a prevalência de genótipos e infecções múltiplas varia de forma
significativa, de acordo com características da população, variabilidade na interpretação
patológica, e métodos moleculares utilizados (103). Outro estudo também demonstrou
que a alta prevalência de infecção múltipla por HPV no canal anal de HSH ocorreu,
caracterizando este grupo como de risco para o desenvolvimento do câncer anal (100).
Um recente estudo de meta-análise indicou que as taxas de progressão de NIA de
alto grau para câncer são de aproximadamente um em 600 por ano em HSH que são HIV
soropositivos, e um em 4000 por ano em indivíduos HIV soronegativos (104).
Curiosamente, não observamos diferença estatística entre as amostras de biópsias
anais sem lesão obtidas de indivíduos não infectados pelo HIV e de pacientes infectados
pelo HIV. No entanto, nas análises dos marcadores imunes o grupo sem lesão,não
infectado pelo HIV, teve poucas amostras válidas analisadas, devido a dificuldades
geradas pelas técnicas utilizadas. De maneira que do ponto de vista laboratorial esse
grupo não pode ser avaliado eficientemente. Para elucidação desse resultado é
necessário um estudo com maior número de indivíduos com essas características.
Já foi descrito que a infecção pelo HIV aumenta o risco de infecção pelo HPV, e
acredita-se que leve também a persistência da infecção. Em um meta-análise publicada
em 2012, observaram uma forte evidência entre aumento de risco de infecção pelo HIV
com genótipos de HPV prevalentes nos estudos analisados (14).
Porém, ainda não está claro se a infecção pelo HPV, de fato, aumenta o risco de
infecção pelo HIV-1, embora estudos apontem que a resposta imune inflamatória pelo
HPV poderia recrutar células susceptíveis ao HIV (61,105). Ainda são escassos estudos
no Brasil que exploram a resposta imune nesses grupos de indivíduos incluídos no
presente estudo, sendo esta uma importante área de pesquisa para a elucidação da
patogênese e resposta imune no desenvolvimento de lesões neoplásicas.
Dessa maneira, para elucidação dos resultados, as perspectivas são avaliar a
progressão da lesão intraepitelial anal em uma população com maior número de
indivíduos infectados e não infectados. Com a inclusão de amostras de câncer anal para
que esses marcadores sejam analisados também no carcinoma in situ e invasivo. Além
disso, a avaliação de outras citocinas e marcadores imunes são necessários para o
entendimento da resposta imune observada nessa patologia. Assim como o uso de outras
técnicas, como a detecção de RNA mensageiro para avaliar a expressão dessas
65
proteínas e imunofluorecência para marcação dupla das células, a fim de uma melhor
caracterização dos tipos celulares envolvidos na resposta imune local.
66
6.CONCLUSÕES
 O avanço da idade foi associado com o diagnostico de NIA de alto grau em indivíduos
infectados pelo HIV, sugerindo que indivíduos acima de 40 anos devam ser considerados
pacientes de risco para o desenvolvimento do câncer anal e incluídos em
acompanhamento clínico criterioso como medida de prevenção contra o desenvolvimento
de câncer.
 Evidenciamos forte associação entre a expressão da proteína SLPI e amostras sem
lesão, ou com NIA de baixo grau. De maneira que inversamente, a diminuição da
expressão de SLPI foi associada com a NIA de alto grau, em indivíduos infectados pelo
HIV, apontando essa proteína como potencial biomarcador a ser investigado.
 Observamos alta prevalência dos HPV16, HPV6, HPV59 e HPV18 nas biópsias
analisadas dos indivíduos infectados pelo HIV.De acordo com os genótipos de HPV
identificados, sugerimos que a vacinação contra o HPV deve ser considerada como
possível medida profilática para reduzir o risco de desenvolvimento de lesões
intraepiteliais anais nos indivíduos infectados pelo HIV.
 Assim como em estudos com amostras cervicais, o presente estudo também mostrou
mudança do perfil imune para Th2 na progressão da neoplasia anal de indivíduos
infectados pelo HIV. De maneira que a resposta anti-inflamatória observada se instala no
estroma dessas amostras antes do desenvolvimento do câncer anal. Dessa forma, a
análise da resposta imune local e seus mecanismos de ativação são um importante
campo de estudo para o entendimento do desenvolvimento do câncer e tratamento.
 Nossos resultados sugerem que a Neoplasia Intraepitelial Anal desenvolvida em
indivíduos infectados pelo HIV apresenta aumento do número de linfócitos T regulatórios
e de secreção da citocina IL-10, caracterizando um microambiente imunossuprimido no
local de desenvolvimento da lesão.
67
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