Genética Molecular - Página Virologia Animal
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Genética Molecular Fundamentos Aplicações científicas Biotecnologia Genética Molecular DNA RNA Proteínas Universo Celular Ciclo celular Ciclo Celular: Mitose Célula animal Núcleo Celular: Cromossomas Cromossoma: gene DNA Ácido Desoxirribonucléico “Informação genética codificada” DNA Estrutura e composição DNA: dupla Hélice Molécula de DNA: Uma Molécula de DNA: Dupla Hélice – Duas cadeias ou fitas de nucleotídeos. – Polímero de nucleotídeos Nucleotídeos Açúcar + Fosfato + Base nitrogenada Freitas, T.R.P. 2009 Açúcar: Pentose Pentose: cinco átomos de carbono Desoxirribose – DNA Ribose – RNA DNA: Quatro bases nitrogenadas Purinas Pirimidinas DNA: Pareamento de Bases DNA: Disposição dos Nucleotídeos DNA: arranjo antiparalelo Dupla Hélice: visão geral RNA Ácido Ribonucléico “Informação genética transcrita” Estrutura e composição RNA: composição Similar ao DNA: Polímero de nucleotídeos RNA: Ribose Bases Nitrogenadas: Adenina, Uracila, Guanina, Citosina RNA: Estrutura Fita única Altamente reativo Menos estável RNA: tipos e funções RNA mensageiro - mRNA: carrega a informação (código genético) para síntese protéica – Tradução RNA transportador ou transferência - tRNA: transporta o aminoácido até o maquinaria de tradução. RNA ribossômico - rRNA: compõe a estrutura física do ribossoma, local onde se processará a tradução. Mecanismos Moleculares na célula Replicação do DNA Transcrição: RNA Tradução do RNA: proteínas Mecanismos moleculares Replicação do DNA Nova molécula de DNA Transcrição do DNA Produz moléculas de RNA Tradução do RNA Produção de Proteínas Replicação do DNA Replicação: Uma molécula de DNA dupla fita (parental) pode se duplicar originando duas moléculas de DNA (filhas). Dinâmica: a duplicação do DNA envolve a ação simultânea e integrada de: – Enzimas DNA polimerase, Primases, Helicases, etc – Vários fatores protéicos – Nucleotídeos e RNA Replicação do DNA Replicação: Semiconservativa Transcrição do DNA Transcreve a mensagem genética do DNA Síntese de RNA Transcrição do DNA: Síntese de RNA Procariotos – RNA polimerase separa os pares de base do DNA, desenrolando o DNA, dando início a síntese de RNA, formando uma bolha de transcrição no DNA. Proteína transcrição: Fator Sigma. Eucariotos – 3 classes de RNAs polimerases no núcleo: Polimerase I: sintetiza o precursor de rRNA (subunidade maior). Polimerase II: sintetiza precursores dos mRNAs. Polimerase III: sintetiza os RNAs pequenos, os tRNAs e o rRNA ribossômico (subunidade menor) Várias proteínas: Fatores de transcrição (TF) Transcrição: Uma cópia do gene (DNA) é transcrita em RNA Transcrição do mRNA mRNA RNAm contém uma seqüência linear de bases que são complementares ao DNA que serviu de molde. Tradução Síntese de Proteínas Tradução: Síntese de proteínas RNA mensageiro RNA transportador Ribossomas Vários fatores protéicos Enzimas Tradução Transcrição/Tradução Dogma Central Genomas Tecnologia do DNA recombinante Caracterização genômica e Diagnóstico viral Quimeras Vacinas: “nova geração” Vírus Parasitas intracelulares obrigatórios Genoma: DNA ou RNA Simples ou complexos Mecanismos de replicação Utilizam a maquinaria celular Interferem no metabolismo celular Vírus: genoma DNA DNA fita dupla: Herpesvírus (Aujeszky) DNA fita dupla: Poxvírus (vaccinia) DNA fita simples circular: Circovírus Vírus genoma RNA RNA fita simples (+): Vírus da Peste Suína Clássica RNA fita (-): Influenza aviária RNA fita dupla: Bluetongue RNA fita (-): vírus da doença de Newcastle Métodos Moleculares Conhecimentos precursores Eletroforese em gel Técnica de separação de moléculas Migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho: – Poros do gel – Menor massa - migração maior Eletroforese SDS - PAGE Agarose- ácido nucléico Fragmentos de DNA Enzimas de Restrição (1953): fenômeno de restrição/modificação Bacteriófago Nucleases bacterianas específicas – Clivagem de DNA estranho Restrição Degradação do DNA estranho Modificação Proteção do próprio DNA Enzimas de restrição – clivagem do DNA: Tesouras moleculares Plasmídeos Aplicação direta Enzimas de restrição – Padrões de corte Mapas de restrição Tecnologia do DNA Recombinante – Clonagem Vetores Inserção e deleção de genes Mapa de restrição: Herpesvirus suíno 1 (doença de Aujeszky) Técnicas de Hibridização de ácidos nucléicos Pareamento dos nucleotídeos em fitas complementares de DNA ou RNA Hibridizações Hibridização “in situ” – Sondas ou Probes Blotting – Southern blotting – Northern blotting Hibridização: conceito Hibridização “in situ” - ISH Pareamento: – DNA-DNA; DNA-RNA; RNA-RNA Detecção de DNA ou mRNA: – Localizar com precisão um gene específico ou seus transcritos em um tipo de população celular ou áreas. – Detectar a presença do DNA ou RNA infecciosos em processos patológicos. – Oncogênese Hibridização “in situ” Sonda fluorescente Teste de paternidade Clonagem genética Fundamentos e aplicações Clonagem Origem do termo - Genética Bacteriana uma colônia de bactérias como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente idênticos à bactéria inicial. Clonagem molecular: isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. Clonagem: precursores Seleção do vetor: – Plasmídeos, Levedura, Vírus Seleção do local para inserção de gene estranho: mapa de restrição 1o. estágio inserto vetor 2o. estágio Clonagem: “shot gun” Técnica aplicada sobre o DNA purificado de Herpes – clonagem em E.coli Clonagem: várias aplicações Vacinas recombinantes “nova geração” Vacinas de nova geração Inativadas – Vacinas de subunidades – Proteínas sintéticas Vacinas Vivas deletadas Vivas Recombinantes – vetor Vacinas DNA Precursores para as vacinas Primeiramente: identificação de proteínas imunogênicas do agente infeccioso – resposta imune similar ao vírus íntegro. Em segundo lugar: identificação das proteínas que não são necessárias: – não imunogênicas, não atuem na replicação e nem estejam relacionadas com a virulência. – Deleção Vetores de expressão Genes que codificam as proteínas de interesse: – selecionados, clonados e expressos usando vetores. Principais vetores: – E. coli, Leveduras, Baculovirus Vacinas recombinantes Vacinas de subunidades: – Gene da Proteína E (envelope) – Febre aftosa – Peste suína clássica Vacinas Vivas deletadas: – Doença de Aujeszky Vivas Recombinantes: – Febre aftosa – Peste suína clássica Peste suína clássica O gene da gp 55 foi clonado e expresso em baculovirus. Ensaio em suínos – Produção de anticorpos neutralizantes – Aprimoramento Vacina DNA Transgenes Transgênicos Inserção de um gene estranho no patrimônio genético de outro organismo Organismos geneticamente modificados – OGM Tabaco com luciferina Transgenia Aplicação da tecnologia do DNA recombinante Seleção do gene, cortes com enzimas, clonagem ou amplificação, purificação, avaliação do produto Inserção no organismo alvo Transferência do DNA Em plantas Resistência a pragas: Bacillus thuringiensis - BT Seleção do gene da proteína tóxica para a praga gene CRY (crystal protein gene) Gene CRY cry gene Agrobacterium tumefaciens Bacillus thuringiensis Clonagem do cry gene Milho transgênico - Bt Clonagem e amplificação do gene cry1C, no controle da Lagarta-do-cartucho Embrapa Sete Lagoas, 2005. Enriquecimento das plantas Plantas modificadas para produzir menos ácidos graxos saturados. Utilização: produção de margarinas menos prejudiciais à saúde. Arroz dourado, maior teor de betacaroteno, precursor da vitamina A. Pensa-se também em desenvolver um arroz com teor aumentado de ferro, para controlar a anemia. Batata com gene da bactéria Escherichia coli, funciona como uma vacina contra a diarréia causada por essa mesma bactéria e imuniza contra a cólera. Comerciais Cenoura Betasweet : Mais doce do que as comuns, contém doses extras de betacaroteno. Batata: Não fica escura depois de descascada. Seleção e inversão da seqüência do gene do escurecimento (Austrália) Melão : mais resistente a vírus (Upjohn, EUA) Ervilha: conservação (DNA Plant Tecnology, EUA) Mais exemplos Milho - Cry gene Soja Broto de Trigo Algodão
