Genética Molecular
Fundamentos
Aplicações científicas
Biotecnologia
Genética Molecular
DNA
RNA
Proteínas
Universo Celular
Ciclo celular
Ciclo Celular: Mitose
Célula animal
Núcleo Celular: Cromossomas
Cromossoma: gene
DNA
Ácido Desoxirribonucléico
“Informação genética codificada”
DNA
Estrutura e composição
DNA: dupla Hélice
Molécula de DNA:
Uma Molécula de DNA: Dupla Hélice
– Duas cadeias ou fitas de nucleotídeos.
– Polímero de nucleotídeos
Nucleotídeos
Açúcar + Fosfato + Base nitrogenada
Freitas, T.R.P. 2009
Açúcar: Pentose
Pentose: cinco átomos de carbono
Desoxirribose – DNA
Ribose – RNA
DNA: Quatro bases
nitrogenadas
Purinas
Pirimidinas
DNA: Pareamento de
Bases
DNA: Disposição dos
Nucleotídeos
DNA: arranjo antiparalelo
Dupla Hélice: visão geral
RNA
Ácido Ribonucléico
“Informação genética transcrita”
Estrutura e composição
RNA: composição
Similar ao DNA: Polímero de nucleotídeos
RNA: Ribose
Bases Nitrogenadas:
Adenina, Uracila, Guanina, Citosina
RNA: Estrutura
Fita única
Altamente reativo
Menos estável
RNA: tipos e funções
RNA mensageiro - mRNA: carrega a
informação (código genético) para síntese
protéica – Tradução
RNA transportador ou transferência - tRNA:
transporta o aminoácido até o maquinaria
de tradução.
RNA ribossômico - rRNA: compõe a
estrutura física do ribossoma, local onde se
processará a tradução.
Mecanismos Moleculares
na célula
Replicação do DNA
Transcrição: RNA
Tradução do RNA: proteínas
Mecanismos moleculares
Replicação do DNA
Nova molécula de DNA
Transcrição do DNA
Produz moléculas de RNA
Tradução do RNA
Produção de Proteínas
Replicação do DNA
Replicação: Uma molécula de DNA dupla
fita (parental) pode se duplicar originando
duas moléculas de DNA (filhas).
Dinâmica: a duplicação do DNA envolve a
ação simultânea e integrada de:
– Enzimas
DNA polimerase, Primases, Helicases, etc
– Vários fatores protéicos
– Nucleotídeos e RNA
Replicação do DNA
Replicação: Semiconservativa
Transcrição do DNA
Transcreve a mensagem genética do DNA
Síntese de RNA
Transcrição do DNA: Síntese
de RNA
Procariotos
– RNA polimerase separa os pares de base do DNA,
desenrolando o DNA, dando início a síntese de RNA,
formando uma bolha de transcrição no DNA.
Proteína transcrição: Fator Sigma.
Eucariotos
– 3 classes de RNAs polimerases no núcleo:
Polimerase I: sintetiza o precursor de rRNA (subunidade
maior).
Polimerase II: sintetiza precursores dos mRNAs.
Polimerase III: sintetiza os RNAs pequenos, os tRNAs e
o rRNA ribossômico (subunidade menor)
Várias proteínas: Fatores de transcrição (TF)
Transcrição:
Uma cópia do gene (DNA) é transcrita em RNA
Transcrição do mRNA
mRNA
RNAm contém uma seqüência linear de bases
que são complementares ao DNA que serviu
de molde.
Tradução
Síntese de Proteínas
Tradução: Síntese de
proteínas
RNA mensageiro
RNA transportador
Ribossomas
Vários fatores
protéicos
Enzimas
Tradução
Transcrição/Tradução
Dogma Central
Genomas
Tecnologia do DNA
recombinante
Caracterização genômica e Diagnóstico
viral
Quimeras
Vacinas: “nova geração”
Vírus
Parasitas intracelulares obrigatórios
Genoma: DNA ou RNA
Simples ou complexos
Mecanismos de replicação
Utilizam a maquinaria celular
Interferem no metabolismo celular
Vírus: genoma DNA
DNA fita dupla: Herpesvírus (Aujeszky)
DNA fita dupla: Poxvírus (vaccinia)
DNA fita simples circular: Circovírus
Vírus genoma RNA
RNA fita simples (+): Vírus
da Peste Suína Clássica
RNA fita (-): Influenza aviária
RNA fita dupla: Bluetongue
RNA fita (-): vírus da
doença de Newcastle
Métodos Moleculares
Conhecimentos precursores
Eletroforese em gel
Técnica de separação de moléculas
Migração de partículas em um
determinado gel durante a aplicação
de uma diferença de potencial.
As moléculas são separadas de acordo
com o seu tamanho:
– Poros do gel
– Menor massa - migração maior
Eletroforese
SDS - PAGE
Agarose- ácido nucléico
Fragmentos de DNA
Enzimas de Restrição (1953):
fenômeno de restrição/modificação
Bacteriófago
Nucleases bacterianas
específicas
– Clivagem de DNA
estranho
Restrição
Degradação do DNA estranho
Modificação
Proteção do próprio DNA
Enzimas de restrição – clivagem do
DNA: Tesouras moleculares
Plasmídeos
Aplicação direta
Enzimas de restrição
– Padrões de corte
Mapas de restrição
Tecnologia do DNA Recombinante
– Clonagem
Vetores
Inserção e deleção de genes
Mapa de restrição: Herpesvirus suíno 1
(doença de Aujeszky)
Técnicas de Hibridização
de ácidos nucléicos
Pareamento dos nucleotídeos em fitas
complementares de DNA ou RNA
Hibridizações
Hibridização “in situ”
– Sondas ou Probes
Blotting
– Southern blotting
– Northern blotting
Hibridização: conceito
Hibridização “in situ” - ISH
Pareamento:
– DNA-DNA; DNA-RNA; RNA-RNA
Detecção de DNA ou mRNA:
– Localizar com precisão um gene específico ou
seus transcritos em um tipo de população celular
ou áreas.
– Detectar a presença do DNA ou RNA infecciosos
em processos patológicos.
– Oncogênese
Hibridização “in situ”
Sonda fluorescente
Teste de paternidade
Clonagem genética
Fundamentos e aplicações
Clonagem
Origem do termo - Genética Bacteriana
uma colônia de bactérias como um clone
porque todos os indivíduos são
geneticamente idênticos à bactéria inicial.
Clonagem molecular: isolamento e
propagação de moléculas de DNA idênticas.
Clonagem: precursores
Seleção do vetor:
– Plasmídeos, Levedura, Vírus
Seleção do local para inserção de gene
estranho: mapa de restrição
1o. estágio
inserto
vetor
2o. estágio
Clonagem: “shot gun”
Técnica aplicada sobre o DNA purificado de
Herpes – clonagem em E.coli
Clonagem: várias
aplicações
Vacinas recombinantes
“nova geração”
Vacinas de nova geração
Inativadas
– Vacinas de
subunidades
– Proteínas sintéticas
Vacinas Vivas
deletadas
Vivas Recombinantes
– vetor
Vacinas DNA
Precursores para as vacinas
Primeiramente: identificação de proteínas
imunogênicas do agente infeccioso
– resposta imune similar ao vírus íntegro.
Em segundo lugar: identificação das
proteínas que não são necessárias:
– não imunogênicas, não atuem na replicação e
nem estejam relacionadas com a virulência.
– Deleção
Vetores de expressão
Genes que codificam as
proteínas de interesse:
– selecionados, clonados e
expressos usando
vetores.
Principais vetores:
– E. coli, Leveduras,
Baculovirus
Vacinas recombinantes
Vacinas de subunidades:
– Gene da Proteína E
(envelope)
– Febre aftosa
– Peste suína clássica
Vacinas Vivas deletadas:
– Doença de Aujeszky
Vivas Recombinantes:
– Febre aftosa
– Peste suína clássica
Peste suína clássica
O gene da gp 55 foi
clonado e expresso em
baculovirus.
Ensaio em suínos
– Produção de anticorpos
neutralizantes
– Aprimoramento
Vacina DNA
Transgenes
Transgênicos
Inserção de um gene estranho no
patrimônio genético de outro
organismo
Organismos geneticamente
modificados – OGM
Tabaco com luciferina
Transgenia
Aplicação da tecnologia do DNA
recombinante
Seleção do gene, cortes com enzimas,
clonagem ou amplificação, purificação,
avaliação do produto
Inserção no organismo alvo
Transferência do DNA
Em plantas
Resistência a pragas:
Bacillus thuringiensis - BT
Seleção do gene da proteína tóxica para
a praga
gene CRY (crystal protein gene)
Gene CRY
cry gene
Agrobacterium
tumefaciens
Bacillus thuringiensis
Clonagem do cry gene
Milho transgênico - Bt
Clonagem e amplificação do gene cry1C, no
controle da Lagarta-do-cartucho Embrapa Sete
Lagoas, 2005.
Enriquecimento das
plantas
Plantas modificadas para produzir menos ácidos
graxos saturados. Utilização: produção de
margarinas menos prejudiciais à saúde.
Arroz dourado, maior teor de betacaroteno,
precursor da vitamina A. Pensa-se também em
desenvolver um arroz com teor aumentado de
ferro, para controlar a anemia.
Batata com gene da bactéria Escherichia coli,
funciona como uma vacina contra a diarréia
causada por essa mesma bactéria e imuniza contra
a cólera.
Comerciais
Cenoura Betasweet : Mais doce do que as
comuns, contém doses extras de betacaroteno.
Batata: Não fica escura depois de
descascada. Seleção e inversão da
seqüência do gene do escurecimento
(Austrália)
Melão : mais resistente a vírus (Upjohn,
EUA)
Ervilha: conservação (DNA Plant
Tecnology, EUA)
Mais exemplos
Milho - Cry gene
Soja
Broto de Trigo
Algodão
