2. Resumo - FACUAL - Fundo de Apoio à Cultura do Algodão

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Fundação Parque Tecnológico da Paraíba
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Embrapa Algodão
Relatório Final
Determinação do fluxo gênico entre lavouras de algodão e entre
lavouras de algodão e populações naturais de Gossypium
barbadense visando fornecer subsídios para a liberação de
variedades transgênicas de algodão
Campina Grande – Paraíba
2004
Índice
1. Introdução ............................................................................................................................. 2
2. Resumo .................................................................................................................................. 4
3. Revisão de literatura ............................................................................................................ 5
4. Metodologia ........................................................................................................ 12
4.1 Caracterização in situ e coleta de plantas de G. barbadense no estado do
Mato Grosso ...................................................................................................... 12
4.2. Plantio das estacas ......................................................................................... 12
4.3. Extração do DNA ............................................................................................. 13
4.4. Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso – RAPD. ................................ 14
4.5 –Seqüências Simples Repetidas – SSR.......................................................... 14
4.6 Coloração do gel de acrilamida ....................................................................... 15
4.7. Distância percorrida pelo pólen do algodoeiro ............................................ 15
5. Resultados .......................................................................................................... 17
5.1. Fluxo gênico entre populações naturais de algodão e o algodão
cultivado ............................................................................................................ 17
5.1.1 Caracterização in situ das populações ........................................................ 17
5.1.2 Caracterização molecular das plantas de G. barbadense ........................ 32
5.2. Distância percorrida pelo pólen do algodoeiro ....................................... 33
5.2.1 Experimento para verificar a eficiência de barreira de 100 metros de
milho ......................................................................................................................... 33
5.2.2 Experimento para verificar o efeito da distância física sem barreiras na
redução da taxa de cruzamento ........................................................................... 38
5.2.3. Experimento para verificar a taxa de cruzamento dentro de um campo
de algodão ............................................................................................................... 40
7. Discussão............................................................................................................ 42
8. Conclusões ......................................................................................................... 47
9. Bibliografia .......................................................................................................... 48
1
1. Introdução
A legislação brasileira somente permite a liberação de variedades
transgênicas para comercialização e plantio após a realização de diversos estudos
que comprovem que o cultivo e consumo em larga escala de produtos
geneticamente modificados oferecem os mesmos riscos de danos ao meio
ambiente, à saúde humana e animal do que os assumidos por variedades
convencionais. No Brasil, a transferência de genes de lavouras transgênicas para
lavouras não transgênicas e para populações naturais do gênero Gossypium deve
ser o principal entrave para a liberação de variedades geneticamente modificadas de
algodão.
G. barbadense é uma espécie sexualmente compatível com o algodoeiro
herbáceo cultivado (G. hirsutum var. latifolium). Populações naturais e semiselvagens são encontradas em algumas regiões brasileiras, inclusive no estado do
Mato Grosso. A ocorrência de fluxo gênico de variedades transgênicas para plantas
de G. barbadense pode afetar a capacidade de sobrevivência das populações em
seu ambiente. Em casos extremos, a introdução de genes que desfavoreçam o
desenvolvimento pode comprometer a existência da população no longo prazo.
Embora no caso de algodoeiros esta hipótese seja bastante remota, genes que
confiram maior capacidade de competição e adaptação ao ambiente podem tornar a
população agressiva o suficiente para ser considerada daninha no ambiente natural.
Já o fluxo gênico entre lavouras convencionais e transgênicas pode ser um
problema durante a produção de sementes e na certificação de produtos não
transgênicos. Na produção de sementes pode ser necessário adotar procedimentos
diferentes dos atualmente utilizados para garantir que variedades convencionais não
possuam o transgene, pois além da pureza genética desejada, problemas de
propriedade intelectual podem surgir. Em casos em que se necessita produzir
produtos não transgênicos, o fluxo gênico pode inviabilizar o comércio da fibra para
o mercado que se havia sido planejado, que muitas vezes pode fornecer uma
remuneração adicional ao produtor, como no caso do algodão orgânico.
Para que os riscos do fluxo gênico sejam minimizados é preciso determinar
ações que dificultem ou mesmo impeçam a transferência dos transgenes para outras
variedades e populações nativas. Um passo importante neste sentido, e primordial
para a liberação de variedades transgênicas, é estabelecer a intensidade do fluxo
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gênico entre lavouras e de lavouras para populações naturais sob diferentes
distâncias e cercadas por barreiras para a contenção do pólen.
Este projeto realizou estudos preliminares para a definição do fluxo gênico
existente entre campos de algodão, e campos de algodão e populações de
Gossypium barbadense da região do pantanal Matogrossense.
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2. Resumo
Este projeto foi desenvolvido para quantificar o fluxo gênico existente entre
campos de algodão e entre campos de algodão e populações de Gossypium
barbadense no estado do Mato Grosso. Para atingir o primeiro objetivo foram
montados três experimentos a campo, utilizando como a ausência de glândulas de
gossipol, marcador morfológico controlada por dois genes recessivos. No primeiro,
cujo propósito foi estimar o efeito de uma barreira de 100m de milho na contenção
do cruzamento via pólen, verificou-se taxa de cruzamento média de 0,15%, com
valores mais altos nas linhas mais próximas à lavoura fonte de pólen. O segundo
experimento foi realizado para verificar a taxa de cruzamento dentro de uma lavoura
comercial de algodão do Mato Grosso, sendo observada uma taxa média de
cruzamento de 7,7%. Não foram observadas diferenças significativas nas taxas de
cruzamento em pontos mais próximos ou mais distantes da bordadura do talhão. O
terceiro e último experimento, que consistiu de parcelas armadilhas a distâncias
crescentes de uma lavoura de algodão, permitiu verificar que a taxa de cruzamento
tende a reduzir a medida que a distância física sem barreira aumenta. Também foi
realizada uma expedição para caracterização in situ e coleta de material para estudo
de fluxo gênico de G. barbadense existente nas regiões do Pantanal e do Cerrado
do Mato Grosso. Verificou-se que G. barbadense ocorre, principalmente, na forma
de plantas de fundo de quintal. De modo geral, as plantas encontradas tem entre 1 a
2 anos, são usadas como medicinal, pertencem à variedade botânica brasiliensis e
estão presentes em pequeno número por quintal (1 a 3). Foram realizadas extrações
de DNA e reações com RAPD e SSR para iniciar a avaliação da variabilidade
genética presente e o fluxo gênico com algodoeiro herbáceo cultivado.
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3. Revisão de literatura
O fluxo gênico em vegetais pode ocorrer pela fecundação de flores com pólen
proveniente de outro genótipo ou pela introdução de propágulos em locais onde
originalmente não estavam presentes. Atenção especial tem sido dada ao fluxo
gênico depois do advento das plantas geneticamente modificadas (GM). Conforme
consideraram Dale et al. (2002), algumas alterações causadas pelo melhoramento
usando plantas GM provavelmente têm paralelos com as ocasionadas pelo
melhoramento convencional, e que, portanto, o impacto causado pela hibridização
entre variedades convencionais e populações naturais pode ser instrutivo para a
interpretação dos efeitos da hibridização entre alguns tipos de variedades GM e
populações naturais.
Segundo Dale et al. (2002), a probabilidade de ocorrência de fluxo gênico e a
sua conseqüência são determinadas por cinco elementos básicos: i) a distância que
pólen percorre; ii) a sincronia do florescimento entre a cultura e a população a
receber o pólen; iii) a compatibilidade sexual entre as espécies; iv) a ecologia da
espécie receptora; v) a natureza do novo gene.
Espécies de Gossypium encontradas no Brasil
As três espécies do gênero Gossypium encontradas no Brasil apresentam
compatibilidade sexual entre si, havendo diferentes proporções de viabilidade dos
híbridos, que é, geralmente, alta. As características de cada espécie e raça são
brevemente descritas:
Gossypium hirsutum L. var. latifollium: É o algodoeiro amplamente cultivado no
Brasil, também denominado de algodoeiro herbáceo. É um alotetraplóide originário
da América Central, sendo uma das 50 espécies classificadas do gênero Gossypium
(Craven et al., 1994). As taxas de fecundação cruzada variam muito com genótipo, o
local, as condições ambientais e a freqüências de insetos polinizadores, havendo
relatos de níveis de polinização cruzada no Brasil desde 2% até 88% (Freire &
Costa, 1999). Sua distribuição no Brasil é ampla, sendo cultivado em quase todos os
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estados. A área cultivada na safra 2001/2002 foi de cerca de 750 mil hectares, e
abrangia regiões de ocorrência de G. barbadense.
Gossypium hirsutum L. r. marie galante: Trata-se do algodão popularmente
conhecido como mocó ou arbóreo. Seu centro de origem abrange uma grande área,
que vai da costa da Colômbia e Venezuela até o sudeste de El Salvador e Antilhas
(Stephens, 1973). Sua distribuição também é ampla, estendendo-se do México ao
semi-árido nordestino. O algodão mocó já foi amplamente cultivado no Nordeste
brasileiro, chegando a ocupar área superior a dois milhões de hectares na década
de setenta. A partir de 1983, ano da chegado do bicudo na região, o plantio entrou
em declínio. Estima-se que menos de cinco mil hectares sejam cultivados
atualmente, sendo as lavouras restritas a região do Seridó paraibano e potiguar.
Imigrantes nordestinos mantêm plantas de algodão mocó em alguns municípios da
região amazônica para uso medicinal ou caseiro (Freire 2000). A taxa de alogamia
do mocó é mais alta do que a do algodão herbáceo, podendo chegar a 100% (Freire
& Costa, 1999).
Gossypium mustelinum: É uma espécie alotetraplóide endêmica do nordeste
brasileiro, não havendo relatos na literatura de sua distribuição em outras regiões do
mundo. Atualmente, populações naturais somente são conhecidas em sítios
específicos nos municípios de Caicó (RN), Macurerê (BA) e Caraíba (BA) (Freire,
2000). Pickersgill et al. (1975) relatam a existência de indivíduos de G. mustelinum
herbarizados em 1838, a partir de coleta realizada na cidade do Crato (CE). Porém,
expedições recentes para coleta de germoplasma não foram capazes de localizar
qualquer população neste local.
Gossypium barbadense
Trata-se de outra espécie alotetraplóide. No Brasil, são encontradas duas
variedades, ambas na forma semi-domesticada. O Rim-de-Boi (G. barbadense var.
brasiliense) possui sementes sem linter, fortemente coladas umas as outras, com
aspecto de rim. A outra variedade, (G. barbadense var. barbadense) conhecida
como Quebradinho ou Maranhão, possui sementes sem linter e descoladas. É
proveniente das do norte do Peru e sul do Equador e deve ter sido introduzida no
Brasil por populações indígenas, cujos descendentes até hoje utilizam sua fibra na
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confecção artesanal de tecidos, como planta medicinal e para a confecção de pavios
para lamparinas. Ambas variedades são arbóreas e perenes. Sua distribuição no
Brasil é ampla, sendo preservados por lavradores a muitas gerações. São
encontrados na região amazônica, nas terras baixas do Maranhão e do Piauí, nas
cidades do ciclo de mineração do Estado do Mato Grosso, nas áreas circunvizinhas
ao Pantanal Matogrossense e na Mata Atlântica, desde o Rio Grande do Norte até o
Espírito Santo. A dispersão das duas variedades de G. barbadense pelos diferentes
locais ocorreu devido a práticas de agricultura (Boulanger & Pinheiro, 1972; Smith &
Cothren, 1999).
Dispersão das sementes
Em algodão, o fluxo gênico pode ocorrer de duas maneiras distintas: pela
dispersão de pólen e pela dispersão de sementes. A dispersão de sementes
dificilmente ocorre a partir das lavouras, visto serem grandes, cobertas por
abundante quantidade de fibras e raramente transportadas por animais (Llewellyn &
Fitt, 1996). Para germinar, as sementes requerem grande quantidade de água e,
quando o fazem em ambientes não agrícolas, as plantas formadas têm pouca
chance de sobrevivência devido à sua pequena capacidade colonizadora (Wozniack,
2002). A dispersão das sementes pode ocorrer durante o transporte, ou, mais
comumente no Brasil, acompanhando imigrantes e pelo transporte e uso indevido de
“caroços”, sementes destinadas à alimentação animal ou na fabricação de óleo
comestível, como material propagativo (Freire, comunicação pessoal).
Dispersão do pólen do algodão cultivado e taxa de cruzamento
Os grãos de pólen do algodoeiro são grandes e viscosos, não sendo
facilmente disperso pelo vento (Thies, 1953, Wozniack, 2002). Sua dispersão ocorre
com o auxílio de insetos, principalmente abelhas (Thies, 1953). Os estudos para
verificar a distância percorrida pelo pólen do algodoeiro têm sido realizados sob os
mais diferentes designs experimentais, utilizando marcadores colorimétricos,
morfológicos, bioquímicos e moleculares (Queiroga et al., 1993; Queiroga et al.,
7
1986, Umbeck et al., 1991; Llewellyn & Fitt, 1996; Xanthopoulos & Kechagia, 2000,
Yasuor et al., 2000; Moresco, 2001).
Em alguns casos, em distâncias muito pequenas como 20 metros não se
encontram mais plantas provenientes de cruzamento a partir de uma determinada
fonte de pólen. Contudo, grande parte dos estudos mostram ainda haver fecundação
cruzada no distância máxima medida, geralmente menor que 100 metros, embora a
freqüência seja pequena. A totalidade dos estudos observou que a dispersão do
pólen e/ou a fecundação cruzada diminui a medida que a distância da fonte de pólen
aumenta (Queiroga et al., 1993; Queiroga et al., 1986, Umbeck et al., 1991;
Llewellyn & Fitt, 1996; Xanthopoulos & Kechagia, 2000, Yasuor et al., 2000; Jia,
2002). Porém, a distância máxima em que a polinização pode ocorrer é função de
fatores que podem apresentar grande variabilidade, como os hábitos dos insetos
polinizadores e o tempo que o pólen permanece viável sob condições em que é
transportado.
No Estado do Mato Grosso, Moresco et al. (2001) avaliaram as taxas de
cruzamento em cinco localidades. Foram verificadas taxas médias que variaram de
68,5% a 6,5%. Os autores atribuíram estas diferenças marcantes pela atividade
diferencial dos insetos polinizadores, causada pela presença de maior quantidade de
área nativa (de onde devem partir os polinizadores), pelas diferenças no tipo de
agricultura praticada e pelo tempo em que o algodão é explorado de modo extensivo
na região.
Fluxo gênico entre o algodão herbáceo e outros tipos de algodão e suas
conseqüências
O fluxo gênico pode ser uma potente força evolutiva (Slatkin, 1987). Quando
os níveis de hibridização são elevados e a taxa de incorporação de alelos externos
supera as taxas de mutação, o fluxo gênico torna-se a principal força evolutiva da
população (Ellstrand et al., 1999). Os efeitos do fluxo gênico dependem do tipo de
ação do alelo na população. Quando o alelo é neutro, a evolução depende da deriva,
e é importante, principalmente, em pequenas populações (Wright, 1969).
Quando os alelos introgredidos são desfavoráveis e a freqüência de
imigrantes é superior ao coeficiente de seleção contra os alelos imigrantes, a
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população reduz seu vigor (Slatkin, 1987). Esta redução de vigor pode, em casos
extremos, determinar a extinção da população.
Se os alelos introgredidos são favoráveis, a seleção natural deverá atuar no
sentido de aumentar suas freqüências na população. Este tipo de introgressão é
relativamente comum entre plantas cultivadas e não cultivadas. O aumento da
agressividade das populações é uma das conseqüências de introgressões deste
tipo, que pode ocasionar o aumento da capacidade de competição das plantas. Em
ambientes agrícolas, este processo pode resultar em uma nova espécie invasora ou
no aumento da importância econômica de uma planta que já era considerada
daninha. No caso de populações nativas, a maior aptidão a sobrevivência das
plantas pode resultar em aumento do tamanho das populações, perturbando
ambientes em relativo equilíbrio. O impacto econômico e ambiental dependerá de
quanto será o aumento da agressividade (Ellstrand et al., 1999). Genes que
conferem maior resistência a doenças e ao ataque de insetos estão entre os que
podem aumentar a capacidade de competição, sejam eles provenientes de
variedades melhoradas por métodos clássicos ou de variedades transgênicas.
Uma grande quantidade de fluxo gênico por diversas gerações pode também
levar a extinção uma espécie rara (Ellstrand & Elam, 1993), principalmente se o
gene é benéfico ou neutro.
A única espécie do gênero Gossypium considerada planta invasora é G.
tomentosum, cuja ocorrência se restringe ao Havaí (Holm et al., 1979). Portanto, as
atenções para a introgressão de genes oriundos de variedades cultivadas,
transgênicas ou não, em plantas de ocorrência natural devem ser voltadas para o
próprio ambiente em que estas plantas ocupam.
Ellstrand et al. (1999) avaliaram a literatura pertinente a fluxo gênico nas 13
mais importantes espécies de plantas cultivadas e verificaram que em 12 há relatos
de hibridação espontânea entre o material cultivado e o selvagem. Em sete eles
verificaram indícios de aumento da importância do material selvagem como planta
daninha. Em dois o fluxo gênico pode levar a extinção dos materiais selvagens.
Entre estes dois está incluído o algodão, G. hirsutum, mas não G. barbadense.
O fluxo gênico entre o algodão cultivado e selvagem já foi documentado.
Analisando a morfologia de G. darwinii nas Ilhas Galápagos e G. tomentosum no
Havaí, Fryxell (1979) sugeriu que ambas espécies correm risco de extinção devido a
hibridização com G. hirsutum. O alto nível de hibridização e introgressão gênica
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entre G. darwinii e o algodoeiro cultivado foi confirmado por marcadores
aloenzimáticos (Wendel & Percy, 1990). Contudo, DeJoode & Wendel (1992) não
encontraram evidências de introgressão interespecífica em G. tomentosum
utilizando o mesmo tipo de marcador.
Wendel et al. (1994) verificaram que mesmo durante séculos de simpatria
com G. barbadense e G. hirsutum, há poucas evidências de introgressão
interespecífica dos alelos isoenzimáticos provenientes de outras espécies para G.
mustelinum (Wendel et al., 1994). Os dados também mostraram que o número de
alelos e a heterozigosidade por panmixia foram extremamente baixos, quando
comparados a outras espécies do gênero. Os resultados levaram os autores a
levantarem a hipótese de que G. mustelinum seja uma espécie paleoendêmica.
Estudos morfológicos fornecem mais evidências de que o nível de introgressão de
genes de outras espécies para G. mustelinum é baixo (Freire & Moreira, 1998;
Freire et al., 1998; Freire et al., 1999).
Dados aloenzimáticos mostraram também existir introgressão interespecífica
de genes das duas espécies mais cultivadas de algodão para populações naturais.
Wendel et al. (1992) e Brubaker et al. (1993) verificaram que introgressões de G.
barbadense em populações naturais de G. hirsutum eram relativamente comuns em
regiões em que havia simpatria. O nível de introgressão de genes de G. hirsutum em
G. barbadense nativo parece ser bem menor (Percy & Wendel, 1990; Brubaker et
al., 1993). Quando detectado, são mais freqüentes em populações de G.
barbadense provenientes da Argentina e do Paraguai (Percy & Wendel, 1990).
Como G. hirsutum não ocorre em populações naturais nestes países e as plantas
em que se observaram introgressão apresentam evidências de manipulação
humana, Percy & Wendel (1990) sugerem que elas devem ser resultado do
desenvolvimento agronômico mais recente e que os alelos introgredidos foram
mantidos por seleção para características agronômicas (Brubaker et al., 1999).
Em relação ao fluxo gênico entre lavouras de algodão, ela é indesejável,
principalmente, em duas circunstâncias: i) quando a lavoura que recebe o pólen se
destina a produção de sementes; ii) quando o produto a ser comercializado não
permite que haja contaminação do produto com transgênico (Moyles & Dale, 1999).
A portaria 607 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento,
publicada em 14/12/2001 no Diário Oficial da União, determina que um campo
destinado à produção de sementes de algodão deve ficar 250 metros de outras
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lavouras ou a 100 metros quando o campo de produção de sementes está separado
de outra lavoura de algodão por uma barreira de plantas mais altas. Esta distância
deve garantir a qualidade genética de sementes básicas, cuja tolerância de plantas
fora do tipo é 0,1‰. Não há indicativo neste documento de que os valores tenham
sido definidos com base em experimentos em campos grandes o suficiente para
observação direta da contaminação genética via pólen. Ele deve ter sido estipulado
com base na análise de dados históricos e na extrapolação dos resultados obtidos
em experimentos realizados em áreas inferiores às determinadas pela portaria (ver
Queiroga et al., 1993; Queiroga et al., 1986, Umbeck et al., 1991; Llewellyn & Fitt,
1996; Xanthopoulos & Kechagia, 2000). Se o nível de contaminação de sementes
transgênicas tolerado for inferior a estes valores, distâncias maiores devem ser
respeitadas, principalmente para o caso de plantas Bt, que devem propiciar uma
ação mais efetiva dos agentes polinizadores no transporte de seu pólen por
utilizarem menor quantidade de inseticidas.
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4. Metodologia
4.1 Caracterização in situ e coleta de plantas de G. barbadense no estado do Mato
Grosso
Uma expedição de coleta foi realizada em agosto/setembro de 2003 visando
caracterizar as populações de G. barbadense ocorrentes nas regiões do Pantanal e
do Cerrado do estado do Mato Grosso.
A caracterização in situ das de G. barbadense foi realizada através da
entrevista do proprietário da planta e da análise do ambiente em que as plantas
estavam inseridas. Foram levantados:
a) Tipo de população
b) Idade da planta
c) Origem declarada
d) Localização geográfica
e) Número de plantas por ponto de coleta
f) Variedade botânica
g) Presença de linter nas sementes
h) Presença de mancha nas pétalas
i) Usos
De cada planta amostrada foram tomadas estacas, tecidos vegetais (folhas
e/ou pétalas) e sementes para a realização das análises com marcadores
moleculares.
4.2. Plantio das estacas
Pelo menos seis estacas de 20 a 30cm, sem folhas, foram coletadas de cada
acesso. As estacas foram acondicionadas em sacos plásticos, umedecidas com
água, conservadas em gelo e mantidas na câmara fria a 4˚C até o momento do
plantio.
As estacas foram tratadas com solução com 50ml de solução de auxina 0,1%
(AIA) por 10 minutos e foram plantadas em sacolas plásticos de 30x40cm, contendo
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solo adubado e esterilizado como substrato. Cada acesso foi plantado em uma única
sacola.
4.3. Extração do DNA
Para extração de DNA utilizou-se folhas frescas provenientes das estacas ou
tecido vegetal desidratado (folhas ou pétalas). O método empregado foi o CTAB,
descrito por Ferreira e Grattapaglia (1998), com modificações, de acordo com os
seguintes passos.
1 – Amostras com 40mg de material foliar dessecado ou 240mg de folhas frescas
foram acondicionadas em tubos de 2ml;
2 – Adicionou-se 700μl de tampão de extração previamente aquecido a 65˚C e 2%
de β-mercaptoetanol;
3 – O tecido vegetal foi triturado no equipamento “fast prep”, homogeneizado
em“vortex” e incubado a 65˚C por 60 minutos, em banho-maria.
4 - Acrescentou-se 600μl de CIA (clorofórmio e álcool isoamílico (24:1)),
emulsificando as fases aquosa e orgânica por inversões dos tubos;
5 – As fases foram separadas por centrifugação a 12.000rmp por 10 minutos e 450μl
da fase aquosa em foram retirados e colocados tubos de 1,5 ml. Os passos 4 e
5 foram repetidos uma vez;
6 – Foi adicionado 400μl de isopropanol mantido a -20˚C misturar gentilmente e
incubar por 30min a -20˚C.
7 – Recuperou-se o precipitado (DNA) por centrifugação a 11.000rpm por 15
minutos.
8 – O sobrenadante foi lavado 2 vezes com 500ul de etanol 70% e etanol puro, por 5
min.;
9 - A solução foi descartada e os pellets foram secos à temperatura ambiente.
10 - Acrescentou-se de 20 a 40 μl de solução TE-Rnase (1 M Tris-HCl pH 8,0; 0,5 M
EDTA pH 8,0) aos tubos, os quais permaneceram por 30 minutos na estufa a
36˚C para a ressuspenção do DNA.
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A quantificação do DNA obtido foi realizada pela comparação visual com DNA
de concentração conhecida. Posteriormente o DNA foi diluído (1ng/μl) para as
reações de RAPD e SSR.
4.4. Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso – RAPD.
Para verificar a qualidade dos DNAs e sua capacidade de servir de molde
para a reações PCR foram realizadas reações RAPD.
As reações de RAPD foram feitas em termociclador em volume de 13 μl
contendo 3ng de DNA, 30nm de primer, uma unidade de Taq DNA polimerase,
0,2mM de dNTP, 0,2ng de BSA, 1,5 mM de cloreto de magnésio e tampão PCR. As
reações foram submetidas a 40 ciclos de amplificação após desnaturação inicial a
92° C por um minuto. Cada ciclo era composto por uma denaturação (94°C por um
minuto), um anelamento dos primers (um minuto a 35°C) e uma amplificação (dois
minutos a 72°C). A reação foi finalizada com uma extensão final de cinco minutos a
72°C (Ferreira & Grattapaglia, 1998)
Os primers usados foram o W3 e V17. Os resultados foram analisados em gel
de agarose 1,5 % (p/v), utilizando o tampão de corrida TBE 1X. O Ladder 1 kb foi
usado como marcador de peso molecular. Os géis foram corados com brometo de
etídio e fotografados sob luz UV.
4.5 –Seqüências Simples Repetidas – SSR.
As reações para a detecção de marcadores SSR foram realizadas em
termociclador em volume final de 13 μl. Cada reação foi realizada na presença de
3ng de DNA molde, 20ng de cada primer, 1,3 unidades de taq DNA polimerase,
2,5mM de dNTP, 0,25ng de BSA, 1,5mM de cloreto de magnésio e tampão PCR. As
reações foram realizadas em 29 ciclos de amplificação após desnaturação inicial a
94° C por 5 minutos. Cada ciclo constituiu de um minuto a 94°C, um minuto a 56°C e
um minuto a 72 °C. A extensão final foi de 7 minutos a 72 °C, adaptado de Liu et al.
(2000).
Os primers usados foram os BNL 3034, BNL 1440(2) e CM 43, segundo Liu et
al (2000). Os resultados foram visualizados em gel de poliacrilamida 4%, os quais
foram corados conforme o protocolo de Creste (2001), descrito abaixo.
14
4.6 Coloração do gel de acrilamida
a) Preparação do gel
Uma solução estoque de acrilamida 40% foi preparada utilizando 380g de
acrilamida, 20g de bisacrilamida e água qsp 1000ml. Uma segunda solução estoque
(acrilamida 4%) foi realizada utilizando 210g de uréia, 25ml de TBE 10X, 50ml da
solução estoque de acrilamida 40% e água qsp 500ml. Para a confecção de cada
gel foi misturado 40ml da solução de acrilamida 4% e 274ul de perssulfato de
amônia 10%.
A acrilamida 4% foi colocada entre duas placas de vidro separada por
espaçadores de 4mm. Uma placa foi previamente tratada com uma solução “bind
silane” (995 μl etanol 100%; 5 μl ácido acético e 3 μl de bind silane), e outra com a
solução “repel silane”. Após a polimerização do gel, este foi pré-aquecido até atingir
a temperatura de 50˚C. As amostras receberam tampão de formamida e foram
desnaturadas a 92˚C por 5 minutos. Com o auxílio de uma pipeta multicanal as
amostras foram pipetadas nos géis, tendo como marcadores o Ladder 10 kb.
A corrida foi feita em tampão de corrida TBE 1X durante 40 minutos a 2000 V
e 100 mA e, a seguir, coradas pelo método de coloração com nitrato de prata
conforme descrito por Creste et al. (2001).
As placas foram separadas e a placa contendo o gel foi colocada em solução
de oxidação (ácido acético 10% em etanol) por 10 minutos, lavadas em água
destilada por 1 minuto, colocadas na na solução de oxidação (ácido nítrico 1,5%) por
3 minutos. Após nova lavagem em água, o gel foi impregnada com nitrato de prata
(solução 0,2%) por 20 minutos, lavado novamente com água e as bandas reveladas
com solução contendo 3% de carbonato de sódio e 0,02% de formaldeído. Quando
as bandas apresentavam contratação adequada, a reação de revelação foi
interrompida em solução aquosa de ácido acético 5%.
4.7. Distância percorrida pelo pólen do algodoeiro
15
Foram montados três experimentos na Fazenda Itaquerê, município de Novo
São Joaquim, visando determinar taxas de cruzamento do algodoeiro sob diferentes
condições.
O primeiro consistiu em parcelas de algodão sem gossipol no interior de um
talhão comercial (1850 x 1350m de dimensão) plantado com a variedade ST474.
Cada parcela é composta por duas linha de cinco metros. Cinco conjuntos de
parcelas foram alocados. Em dos conjuntos, as parcelas distavam 0, 5, 10, 20, 30,
40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1250 e 1500 metros da
bordadura do talhão vizinho a uma área de vegetação nativa. Os demais conjuntos
possuem 5 parcelas a 0, 25, 50, 100 e 200m da bordadura do talhão. O manejo
utilizado foi o mesmo empregado no talhão. As plantas de cada parcela foram
colhidas em bulk. Uma amostra das sementes de cada parcela foi retirada,
beneficiada avaliada quanto à presença de glândulas de gossipol.
O segundo experimento foi composto por parcelas de duas linhas de cinco
metros, a distâncias de 10, 20, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500
e 2000m da lavoura comercial fonte de pólen. As parcelas estavam dispostas dentro
de uma lavoura de soja. A colheita e o beneficiamento foram realizados da mesma
maneira descrita no experimento anterior.
O terceiro experimento consistiu de três parcelas de algodão sem gossipol,
sendo cada parcela composta por 10 linhas de 10 metros. As parcelas distavam 100
metros de uma lavoura comercial de algodão, fonte de pólen. A distância entre as
parcelas e a lavoura foi preenchida com plantas de milho, utilizadas como barreira.
Foram colhidos todos os capulhos de 20 plantas de cada linha (uma planta a cada
0,5 metro), ou seja, de cada parcela foram colhidas 200 plantas individuais,
totalizando 600 plantas nas três parcelas.
16
5. Resultados
5.1. Fluxo gênico entre populações naturais de algodão e o algodão cultivado
5.1.1 Caracterização in situ das populações
A coleta dos materiais para a realização da avaliação do fluxo gênico
existente entre o algodoeiro cultivado e o algodoeiro nativo (Gossypium barbadense)
foi realizada nos meses de agosto e setembro. Foram coletadas 210 plantas de G.
Barbadense em 15 municípios do Mato Grosso: Cuiabá, Várzea Grande, Santo
Antônio do Leverger, Nossa Senhora do Livramento, Poconé, Cáceres, Jaciara, São
Pedro da Cipa, Jucimeira, Rondonópolis, São José do Povo, Pedra Preta, Itiquira,
Poxoréu e Primavera do Leste. O tempo gasto para a realização das coletas no
Cerrado e na Baixada Cuiabana (incluindo o Pantanal) foi similar. Conforme pode
ser observado na Figura 1, o maior número de plantas (128) foi coletado nos
municípios do Pantanal e Baixada Cuiabana do que na região dos cerrados (82).
N° plantas amostradas
40
35
30
25
20
15
10
5
Várzea Grande
S. Ant. Leverger
S. José do Povo
S.Pedro Cipa
Rondonópolis
Primavera
Poxoréu
Poconé
Pedra Preta
N.Sa.Livramento
Jucimeira
Jaciara
Itiquira
Cáceres
Cuiabá
0
Figura 01. Número de plantas amostradas segundo o município do estado do Mato
Grosso.
A maioria das plantas eram jovens, com um a dois anos (77,5%). A planta
mais velha encontrada tinha sete anos, segundo declaração dos proprietários
(Figura 2). Estas plantas apresentavam porte mais alto e tronco mais grosso e
17
estavam sob condições ambientais bastante adequadas – em solos aparentemente
ricos e livre de competição com outras plantas.
0%
1%
5%
19%
1 ano
42%
2 anos
3 anos
4 anos
5 anos
7 anos
33%
.
Figura 2. Idade declarada das plantas coletadas
Verificou-se que G. barbadense ocorre em fundos de quintais, como
bordadura de lavouras de toco e de modo espontâneo (Figura 3). As plantas de
fundo de quintal aparecem em freqüência muito mais elevada do que os demais
tipos (97%), sendo mantidas com a finalidade principal de serem usadas como
plantas medicinais. A grande maioria das plantas localizadas na região do Pantanal
e todas as do cerrado eram plantas em fundos de quintal.
Apenas duas plantas foram coletas em situações que permitiram classificá-las
como espontâneas, asselvajadas ou ferais. A primeira estava localizada em Várzea
Grande, às margens do Rio Cuiabá, em uma pequena população formada por três
plantas adultas e cerca de 10 plantas jovens derivadas das plantas adultas. Apesar
da não haver indício de cultivo ou tratos culturais recentes, estas plantas estavam ao
lado de um caminho utilizado por pessoas para terem acesso ao Rio, dentro de um
pomar abandonado contendo mangueiras e outras fruteiras. A outra planta foi
encontrada em um terreno baldio no município de Cáceres (Figura 4). No mesmo
terreno não foram observadas plantas jovens. Não havia evidências de que o terreno
18
houvesse sido cultivado anteriormente com algodoeiro arbóreo, mas o terreno
aparentava ter uso “agrícola”. O capim napier, planta mais abundante no terreno,
tinha sido cortado recentemente em uma parte e em outra foi observado evidências
de que também tivesse sido cortado a mais tempo. Em ambos casos as plantas não
devem ter surgido de modo natural. Ambas devem ter sido plantadas e
posteriormente abandonadas. Apenas no caso de Várzea Grande as plantas podem
vir a constituir uma população feral sustentável. A ausência completa de plantas
jovens no terreno de Cáceres não deverá permitir a formação de uma população
sustentável ao longo do tempo, pois a morte da única planta adulta resultará no
desaparecimento da espécie do terreno.
2%
1%
Bordadura
Espontânea
Fundo
97%
Figura 3. Percentual de plantas de G. barbadense coletadas no estado do Mato
Grosso segundo o tipo de população
19
Figura 4. Planta de algodoeiro em terreno baldio em Cáceres (MT) Pontos escuros
(seta) são maças abertas.
Foram classificadas como bordaduras de lavoura as plantas encontradas em
dois locais em Cuiabá e em dois locais em Poconé, nenhuma no Cerrado. A primeira
população encontrada em Cuiabá foi observada na zona rural do município, em
localidade conhecida como Rio dos Peixes, próximo à BR 070 (Figura 5). Pelas
descrições de como G. barbadense era cultivado no passado, este foi o local em que
a tradição foi mantida de modo mais fiel. As plantas de algodão ficavam na
bordadura de uma roça de toco, formada em método muito similar aos utilizados por
indígenas e caboclos. Diversas roças de toco estavam presentes na propriedade,
cada uma com uma idade diferente. Tais roças eram explorados por 5 a 6 anos e
depois abandonadas. Apenas a roça mais nova continha plantas de algodão,
plantadas na bordadura e separando plantações de cana-de-açúcar e mandioca.
Depois de muitos anos, havia sido a primeira vez que o proprietário havia plantado
G. barbadense. As sementes que deram origem aos algodoeiros foram colhidas em
um único indivíduo de fundo de quintal. Portanto, não se tratava de uma variedade
20
local propriamente dita, mas de uma expansão de um genótipo de fundo de quintal.
O proprietário pretendia colher as plantas e enviá-la à uma tecelã para fibra fosse
fiada e, posteriormente, confeccionadas redes e mantas.
Figura 5. Roça de toco cultivada em Cuiabá (MT). Setas mostram plantas de G.
barbadense
A segunda população de bordadura de roça encontrada em Cuiabá não pode
ser definida propriamente como bordadura. Na verdade era uma lavoura de algodão
consorciada com outras espécies, como mandioca e quiabo. Ele se localizava dentro
da zona urbana de Cuiabá, às margens de um córrego na Av. Getúlio Vargas,
próximo ao número 28 (Figura 6). Esta população contava com 50 a 60 plantas, que
já haviam sido colhidas e podadas. O plantio havia sido feito em covas, com 2 a 3
plantas, com espaçamento entre plantas e entre linhas de cerca de 1m. As
sementes utilizadas para o plantio foram obtidas junto a uma ex-fiandeira e tecelã de
Cuiabá, sendo uma mistura de algodoeiros rim-de-boi. Portanto, da mesma maneira
que para a outra população de Cuiabá, o material não se constituía uma variedade
local, mas sim uma mistura de sementes de diferentes localidades, que tem
similaridade com a mistura de sementes de diferentes variedades que uma
algodoeira possui após uma safra. O responsável pela plantação, Sr. Martiniano,
pretendia vender o algodão colhido para a mesma pessoa que havia fornecido as
sementes. Ao levarmos o Sr. Martiniano à casa desta senhora, ela nos informou
21
que, devido a idade avançada, havia abandonado a atividade e não poderia comprar
a colheita.
Figura 6. Lavoura urbana de G. barbadense localizada dentro do município de
Cuiabá (MT). A esquerda córrego canalizado; à direita no fundo uma das vias da Av.
Getúlio Vargas.
As duas populações de bordadura de roça de Poconé não eram exploradas
comercialmente, nem sua fibra utilizada para a fiação. A primeira era constituída de
poucas plantas, cujas fibras e sementes estavam soltas no chão. Próximo às plantas
adultas havia cerca de 10 a 15 plantas jovens, que segundo a proprietária seriam
carpidas. A segunda estava localizada em uma roça de toco abandonada e havia
apenas uma planta ainda viva, sem plantas jovens que poderiam dar origem a uma
população feral.
O número de plantas por ponto de coleta reflete a predominância de plantas
de fundo-de-quintal (Figura 7). A grande maioria dos locais visitados possuía apenas
uma planta, sendo que os locais em que eram mantidas com uma a três plantas
representam 87,6% dos locais.
22
120
100
Frequencia
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
10
12
13
30
45
190
Núm ero de plantas no local de coleta
Figura 7. Número de plantas presentes em cada ponto de coleta.
As plantas de fundo de quintal são mantidas principalmente por mulheres,
que as usam, de modo geral, como planta medicinal. A atribuição de propriedades
medicinais ao G. barbadense é a principal razão para que seja mantido em fundos
de quintais. Diversos tipos de efeito terapêutico são citados (Tabela 1), sendo mais
freqüentes como cicatrizante e antiinflamatório. A folha é usada na forma de chás,
macerados, infusões e extratos foliares (chamados pela população local de sumo),
sendo ambos empregados via oral e tópica. Os chás são feitos com folhas jovens e
empregados em compressas, banhos de imersão e ingeridos por via oral. O relato
mais comum de uso está relacionado a parturientes, que tomam ou chá ou fazem
uma banhos de imersão. Usam-no antes e/ou após o parto durante, durante a “dieta”
ou “resguardo”. Também foi relatado seu uso para o combate a bronquite,
cicatrização de ferimentos e problemas gástricos. O extrato foliar também é muito
usado por parturientes, na forma oral. Também foram levantados usos como
cicatrizante (oral e/ou tópico), antiinflamatório (oral e/ou tópico) e para problemas
respiratórios (oral). O tegumento externo da maça foi relatado mais de uma vez
como um agente antifúngico, no combate a micoses.
Tabela 1. Modo de uso das partes de G. barbadense e efeito atribuído
Extrato
foliar
Folha
Chá macerada
Tegumento
da maça
Pluma e
semente Maçã
23
Cicatrizante
X
X
Problemas
respiratórios
X
X
Antiinflamatório
X
X
X
X
X
X
Antifúngico
X
As plantas de G. barbadense de fundo de quintal também são usadas para
outros fins. Observando a Figura 8, percebe-se que parte dos proprietários declarou
utilizar as plantas para mais de um fim, por isso, o número total de usos supera o
número proprietários entrevistados.
160
91 %
140
75,5%
120
Frequência
100
80
60
40
20
5,8%
2,6%
2,6%
1,2%
0,6%
0,6%
0,6%
0
Medicinal
Têxtil
Chumaço
Pavio
Ornamental
Alimen.
Comércio
Alimen. humana Artesan.
animal
Tipo de us o
Figura 8. Usos declarados das plantas de Gossypium barbadense
Um percentual elevado dos proprietários declarou usar a pluma do algodão
como chumaço ou algodão similar ao comprado em farmácias. Os demais tipos de
uso foram declarados por poucos proprietários. O item que mais chama a atenção é
o relato de um proprietário, que faz uso de um chá feito com as sementes
maceradas como uma bebida quente. Segundo relatos, o uso como pavio já foi mais
difundido; declinando sensivelmente com a expansão da rede elétrica para a zona
rural.
24
Em tempos antigos, a fibra deste algodão era usada para a fabricação de
produtos têxteis, principalmente redes (Figura 9), mantas e coxonilhos. Era uma
atividade predominantemente feminina, sendo de responsabilidade da mulher o
plantio das sementes na bordadura das roças de toco, sua colheita, a preparação
dos fios e a tecelagem. O sistema de produção incluía o beneficiamento manual ou
em descaroçador de rolo feito de madeira (Figura 9 A), afofado com um instrumento
similar à um arco (Figura 9 C), fiado em fusos de madeira (Figura 9 C) ou em rocas
(Figura 9 B). Uma pequena parte dos artesãos cardava a fibra antes de fiá-la. O fio
era tecido em tear rústico feito de madeira (Figura 9 D) e destinado ao comércio
local ou, na maioria das vezes, para consumo próprio. As famílias que não possuíam
tear vendiam o fio que produziam ou contratavam alguém para que tecessem suas
mantas e redes.
O uso têxtil da fibra do G. barbadense está mais arraigado nos municípios
antigos do estado. Em nenhum caso foi observado semelhante uso em municípios
novos do cerrado. O bairro da Figueira, em Poconé, foi o único local encontrado em
que ainda se produziam têxteis artesanais com a fibra do G. barbadense, sendo que
apenas uma família preserva esta tradição. Esta família confecciona redes
mesclando fios de G. barbadense, na tonalidade cru, a fios industriais coloridos de
herbáceo. Em outros bairros de Poconé (Boi-de-Carro, Canga), Cáceres (Bom
Retiro), Cuiabá (Rio dos Peixes, Jardim Independência), Santo Antônio do Leverger
(Varginha) e Itiquira (Centro), Poxoréu (Vila Sta Terezinha) e Cáceres (Bom Retiro)
foram encontradas pessoas que ocasionalmente ainda fiavam o algodão, sendo o fio
destinado à realização de pequenos consertos.
25
A
B
C
D
E
F
Figura 9. Equipamentos usados na fiação e tecelagem da fibra de G. barbadense e
redes artesanais produzidas. A. Descaroçador de rolo; B. Roca; C. Fusos, batedor e
novelos; D. Tear; E. Rede; F. Detalhe da rede
A citação mais freqüente é que as mães de mulheres com 50 anos ou mais
realizavam atividades têxteis com a fibra de G. barbadense. Em alguns casos,
pessoas com idade avançada relataram ter fiado por um determinado tempo, tendo
26
abandona este trabalho artesanal por motivo de saúde, geralmente problemas de
visão, ou devido à facilidade de adquirir fios industrializados.
De modo geral, as plantas apresentavam boas condições fitossanitárias no
momento em que as observações foram realizadas. Plantas com sintomas
característicos de mosaico comum e doença azul foram encontradas, mas em
pequenas quantidades, o mesmo sendo válido para bacteriose.
Três plantas apresentaram grande quantidade de galhas (Figura 10), cujos
sintomas se assemelham aos causados em mandioca por Jatrophobia brasiliensis,
uma pequena mosca. As galhas foram encontradas nas faces abaxial e adaxial de
folhas, em pecíolos de frutos e folhas, em brácteas e em pétalas de flor. Em alguns
casos, a intensidade era bastante alta. Contudo, as plantas não aparentavam menor
vigor ou capacidade produtiva.
Figura 10. Pecíolo, bráctea e folha de G. barbadense com galhas
O principal problema fitossanitário observado na época em que as coletas
foram realizadas foi a infestação das plantas com lagarta rosada, Pectinophora
gossypiella (Figura 11). Muitas plantas apresentavam quase todas as sementes
danificadas pela praga. Em plantas próximas a lavouras de algodão os danos eram
mais intensos, embora plantas bastante danificadas tenham sido encontradas a
27
grandes distâncias de plantações comerciais. Os danos eram ainda maiores quando
associados a fungos, que apodreciam as maças causando sua mumificação
(carimã).
Figura 11. Danos causados por lagarta rosada em G. barbadense. A) Flor atacada;
B) e C) lagarta em sementes; D) Maça mumificada (carimã) após ação de fungo que
penetrou em orifício feito pela lagarta; E) Capulho sadio
A variedade botânica de G. barbadense mais freqüentemente encontrada foi
a brasiliensis, cujas sementes de uma loja aderidas umas às outras formam uma
figura similar a um rim e por isso chamado de rim-de-boi (Figura 12). A
predominância da variedade botânica brasiliensis em relação à barbadense (com
sementes soltas e por isso chamada de quebradinho) deve ter origem histórica, visto
que indígenas e caboclos sempre cultivaram de modo mais intensivo a primeira.
28
Adicionalmente, há uma crença que as propriedades medicinais de algodoeiros rimde-boi são mais intensas e que sua fibra apresenta melhor qualidade. Parte das
plantas de quebradinho vieram de outras localidades, como Goiás e Minas Gerais.
Em onze municípios foram encontradas plantas de quebradinho e rim-de-boi, sendo
que apenas em São José do Povo a freqüência de plantas de quebradinho foi mais
alta do que de rim-de-boi (Tabela 2).
Tabela 2. Número de plantas de rim-de-boi e quebradinho, segundo o município
Município
Rim-de
Boi
Quebradinho
Cáceres
19
2
Cuiabá
32
3
Itiquira
10
0
Jaciara
6
2
Jucimeira
4
2
N.Sa.Livramento
4
0
Pedra Preta
4
2
Poconé
35
2
Poxoréu
7
0
Primavera
17
3
Rondonópolis
11
3
S. Pedro da Cipa
2
0
São José do Povo
4
5
Sto Antonio Leverg.
19
1
Várzea Grande
9
2
Total
183
27
Flor com
mancha
15
34
10
8
6
4
6
37
7
20
14
2
9
20
9
201
Flor sem
mancha
6
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
9
Com
Linter Glabra
20
1
34
1
9
1
8
0
5
1
4
0
5
1
37
0
7
0
17
3
14
0
2
0
8
1
20
0
8
3
198
12
29
13%
Rim-de-boi
Quebradinho
87%
Figura 12. Plantas de G. barbadense amostradas no estado do Mato Grosso
segundo o tipo de semente.
A presença de linter nas sementes foi verificada exclusivamente em plantas
rim-de-boi (Figura 13). Este linter difere daquele verificado em plantas de algodoeiro
herbáceo, sendo extremamente curtos e dão um aspecto aveludado às sementes.
Tal linter apresentava coloração esverdeada que assumia tonalidades marrons
alguns dias após o beneficiamento.
6%
Sem linter
Com linter
94%
Figura 13. Sementes de G. barbadense coletas no estado do Mato Grosso com e
linter recobrindo as sementes.
30
A maioria das plantas apresentava flores com manchas vermelhas nas
pétalas (Figuras 14 e 15). Embora a presença de manchas nas pétalas seja
predominante na espécie, a ausência é bem documentada na literatura. Portanto,
sua ausência não indica, necessariamente, que tenha ocorrido fluxo gênico.
9%
Com mancha
Sem mancha
91%
Figura 14. Proporção de plantas de G. barbadense que apresentavam flores com e
sem manchas vermelhas nas pétalas.
Figura 15. Flores de G. barbadense com e sem mancha na pétala
31
5.1.2 Caracterização molecular das plantas de G. barbadense
O DNA foi extraído de todas as folhas e flores desidratadas retirados in situ.
Os acessos em que não foi possível obter tecidos desidratados tiveram seus DNAs
extraídos de material fresco proveniente de brotações das estacas plantadas na
casa de vegetação. A maior quantidade total de DNA extraída foi de 15.000ng/μl, e a
menor foi 500ng/μl, sendo que a média total de DNA extraído foi de 4971,68 ng/μl.
As quantificações foram cruciais para entendimento e verificação da
qualidade dos DNAs extraídos. Em cima destes dados calculou-se a quantidade de
DNA presente para cada acesso. A partir destes resultados foram feitas as diluições
das amostras para 1 ng/μl, volume necessário para realização das reações de PCR.
Tanto as reações de RAPD quanto as reações de SSR foram realizadas para
que se pudesse avaliar a qualidade do DNA extraído de algodão e, no caso do SSR,
avaliar o funcionamento dos pares de primers à temperatura de anelamento de
56°C, além da escolha dos primers mais polimórficos para realização das primeiras
reações. Os três pares de primers para SSR mais polimórficos escolhidos foram BNL
3034, BNL 1440(2) e o CM 43, os quais foram testados em todos os indivíduos.
Os produtos de amplificação das reações de SSR foram analisadas em gel
denaturante de poliacrilamida 4% corado com prata, a qual se mostrou eficiente. A
análise preliminar com os marcadores SSR mostrou haver grande diversidade
genética em G. barbadense no estado do Mato Grosso. O modo com que esta
diversidade se divide no estado e o fluxo gênico estão sendo avaliados em 2004.
32
5.2. Distância percorrida pelo pólen do algodoeiro
A identificação visual de sementes com e sem glândulas de gossipol (Figura
16) pode ser facilmente realizada a olho nu. Quando dúvidas a respeito da presença
das glândulas persistiam, foi utilizado uma lupa de bolso para confirmar a presença.
Figura 16. Sementes de algodoeiro com glândulas de gossipol (esquerda) e sem
glândulas de gossipol (direita).
5.2.1 Experimento para verificar a eficiência de barreira de 100 metros de milho
Foram analisadas 600 plantas de algodoeiros, duzentas por parcela. De cada
planta foram avaliadas 200 sementes ou o número total de sementes produzidas
pelas plantas, totalizando 102.249 sementes. Destas, 155 apresentaram glândulas
de gossipol e 102.094 não possuíam glândulas.
Portanto, a taxa média de
cruzamento foi de 0,15%. O croqui da área experimental pode ser visualizado na
Figura 17.
33
Algodoeiro
Milho
100m
100m
40m
40m
100m
100m
Figura 17. Croqui do experimento em que parcelas de algodoeiro foram circundadas
por barreira de 100 metros de milho.
As taxas médias de cruzamento de cada linha podem ser observadas na
Figura 18. Verifica-se que as maiores percentagens de sementes com glândulas,
foram obtidas nas linhas mais próximas à lavoura fonte de pólen (0,4%). À medida
que as linhas ficavam mais distantes da fonte de pólen, as taxas foram reduzindo. O
coeficiente de correlação linear observado foi de -0,82 (p<0,05). Apesar da
correlação linear ter sido significativo, a equação com melhor ajuste foi exponencial
(r2=0,91).
A observação da Figura 19 permite verificar que, em média, a posição da
planta dentro da linha não foi um fator importante na distribuição da fecundação
cruzada. O coeficiente de correlação linear verificado foi de 0,09 (p>0,71). Isto deve
ter acontecido em razão de todas as plantas dentro de cada linha estarem a mesma
distância da fonte externa de pólen. Caso a orientação das parcelas experimentais
fosse diferente, com as linhas dispostas de maneira perpendicular à fonte de pólen,
é provável que fosse verificado que o efeito da posição da planta dentro da linha,
conforme verificado em Santa Helena de Goiás (Barroso, dados não publicados).
34
Sementes com glândula (%)
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Linha
Figura 18. Percentagem média de sementes com glândulas de gossipol nas plantas
Sementes com glândula (%)
amostradas em cada linha.
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Distância da extremidade esquerda da parcela (m)
Figura 19. Percentagem média de sementes com glândulas de gossipol, segundo a
posição da planta dentro da linha.
A Figura 20 mostra a localização das plantas que apresentaram sementes
com glândula gossipol de dentro de cada parcela, considerando a média de todas as
parcelas. Pode-se observar que a quantidade de plantas em que foram detectados
35
cruzamento dentro das linhas foi relativamente homogênea. Também se observa
que o número de plantas com glândulas de gossipol tendeu a ser mais alto nas
linhas mais próximas à fonte de pólen.
2
1
3
2
4
3
5
4
Linha
Linha
1
6
5
7
6
8
7
9
8
10
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2da margem
3
4 esquerda
5
6 da
7 parcela
8
9(m) 10
Distância
0
0.1
0.25
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Distância da margem esquerda da parcela (m)
Figura 20. Locais em que se observou sementes oriundas de cruzamento com
cruzamento dentro das parcelas.
Para comprovar que o número de plantas que apresentavam pelo menos uma
semente com glândulas de gossipol foi independente da posição das plantas dentro
da linha, foi realizada uma contagem considerando quatro grupos: o primeiro
composto pelas plantas amostradas mais a esquerda, o segundo pelas plantas
centrais a esquerda, o terceiro pelas plantas centrais a direita e o quarto pelas cinco
plantas mais a direita (Tabela 3). A comparação das contagens pelo teste de quiquadrado revelou que o número de plantas com glândulas foi similar entre os
quartos (p>0,10).
Já a divisão das linhas em dois grupos, um formado pelas cinco linhas mais
próximas à fonte de pólen (linhas 1 a 5) e outro pelas cinco restantes (linhas 6 a 10),
revelou que o número de plantas com glândulas em cada grupo foi diferente
segundo o teste de qui-quadrado (Tabela 3)
36
Tabela 3. Número de plantas que apresentaram glândulas de gossipol de acordo
com a posição das plantas na linha e a linha a que pertencem.
Posição da planta na linha 1° quarto1 2° quarto2 3° quarto3 4° quarto4 Total
Plantas com glândula
16
26
Qui-quadrado
6,30
P=0,10
Linha
1a5
6 a 10
Total
45
26
71
5,08
P=0,02
Plantas com glândula
Qui-quadrado
13
16
71
1 Corresponde ao conjunto formado pelas plantas mais a esquerda de cada linha.
2 Corresponde ao conjunto formado pelas plantas a centro-esquerda de cada linha
3 Corresponde ao conjunto formado pelas plantas a centro-direita de cada linha.
4 Corresponde ao conjunto formado pelas plantas mais a direita de cada linha.
Os resultados observados permitem concluir que as taxas de cruzamento
verificadas neste experimento foram muito baixas, sendo a barreira de 100 metros
de milho bastante eficiente no controle da polinização cruzada. O fato de haver
redução na taxa de cruzamento dentro das parcelas à medida que se distancia da
fonte de pólen é uma forte evidência de que o próprio algodão pode se constituir em
uma importante barreira para conter pólen vindo de áreas externas. Portanto, a
associação de barreiras de milho e algodão podem propiciar um isolamento
reprodutivo bastante eficiente.
Para que sementes com gossipol sejam produzidas em plantas sem gossipol
é necessário que os agentes polinizadores, provavelmente abelhas (Figura 21),
visitem flores de plantas com gossipol, adquiram pólen e, depois, depositem este
pólen sobre estigmas de flores de plantas sem gossipol. O mecanismo de contenção
do cruzamento observado neste experimento deve abranger dois fatores: a) uma
redução da quantidade de abelhas que visitaram as flores da lavoura antes de entrar
nas parcelas; b) a perda do pólen durante o vôo e a movimentação das abelhas, que
deve ser tanto maior quanto maior o tempo entre a visita às flores da lavoura e da
parcela. Estes dois fatores, juntos, devem explicar a baixa de sementes com
gossipol verificadas dentro da área.
A redução da taxa de cruzamento nas linhas mais distantes da lavoura pode
ter ocorrido pela deposição do pólen oriundo de plantas com glândulas durante as
primeiras visitas, que devem ter ocorrido nas primeiras linhas. Nestas visitas, as
abelhas também adquiririam pólen das plantas da parcela, ou seja pólen de plantas
37
sem gossipol. Isto faria com que os grãos de pólen de flores externos à parcela
(produzidos em plantas sem gossipol) que ainda estivessem sobre o corpo das
abelhas ficassem em menor quantidade do que o pólen das plantas sem gossipol.
Este processo de diluição do pólen externo no corpo do polinizador reduz a
probabilidade de que haja cruzamentos entre as plantas sem gossipol da parcela e
as plantas com gossipol da lavoura de algodão.
A
B
C
Figura 21. Abelhas africanizadas sobre flores de plantas sem gossipol. (A) Abelha
entrando no flor, (B) se alimentando no néctar floral e (C) deixando a flor.
5.2.2 Experimento para verificar o efeito da distância física sem barreiras na redução
da taxa de cruzamento
Estes experimento mostrou que quanto maior a distância entre a parcela
armadilha e a lavoura fonte de pólen, em média, menor a taxa de fecundação
(Figura 22). Contudo, os resultados experimentais não foram apresentaram a
mesma consistência observada no experimento anterior. As taxas de cruzamento
entre 300 e 1000m foram maiores do que se poderia prever pelo comportamento das
primeiras e últimas parcelas armadilhas. Os resultados mais consistentes foram
obtidos quando apenas as parcelas armadilhas entre 20 e 200m são consideradas
(Figura 23), no qual se percebe uma redução quase linear da taxa de cruzamento.
38
Proporção de sementes com glândula (%)
10
8
6
4
2
0
0
250
500
750
1000 1250 1500 1750 2000
Distância da fonte de pólen
Proporção de sementes com glândula (%)
Figura 22. Taxa de cruzamento verificada em parcelas armadilha dispostas de 10 a
2000m de uma lavoura de algodão.
8
6
4
2
0
0
40
80
120
160
200
240
Dis tância da fonte de pólen
Figura 23. Taxa de cruzamento verificada nas parcelas armadilha dispostas de 20 a
200m de uma lavoura de algodão.
As razões que levaram ao aumento da taxa de cruzamento nas parcelas de
300 a 1000m não foram detectadas. Mas, pode-se especular alguns fatores que
podem ter ocasionado tais resultados, como a presença de colméias de abelhas nas
imediações destas parcelas, que aumentariam a atividade de polinizadores nas
parcelas. Como trata-se de uma informação importante, experimentos com
características similares foram montados em 2003/2004 em Novo São Joaquim e
Porto Alegre do Norte. Para evitar que os resultados tivessem a mesma fragilidade
interna, foram realizadas melhorias metodológicas.
39
5.2.3. Experimento para verificar a taxa de cruzamento dentro de um campo de
algodão
Foram avaliadas 15.200 sementes, sendo verificadas 1176 sementes com
glândulas de gossipol e 14.024 sementes sem glândulas. As taxas de cruzamento
dentro do campo de algodoeiro foram 51,6 vezes mais altas do que as verificadas
quando utilizada a barreira de milho (0,15%), com média de 7,74%.
Considerando o conjunto contendo 18 parcelas, com distância máxima da
bordadura vizinha ao cerrado de 1500 metros, verifica-se que as taxas de
cruzamento foram similares, não havendo acréscimos ou decréscimos significativos
(Figuras 24). O valor máximo foi verificado a 200 metros da bordadura, com taxa de
17,5%. A correlação linear da taxa de cruzamento das parcelas com a distância da
bordadura foi nula, –0,01 (p>0,98), corroborando a independência das taxas em
relação ao início do talhão.
Os quatro conjuntos de parcelas que se estendiam até 200 metros da
bordadura do talão apresentaram comportamento similar ao conjunto de parcelas
descrito acima, ou seja, não houve relação (r = –0,18, p>0,77) entre a localização da
parcela dentro da lavoura e o percentual de sementes com glândulas de gossipol
(Figura 25).
20.0
Taxa de cruzamento (%)
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Distância do início do talhão (m)
40
Figura 24. Taxas de cruzamento verificadas em parcelas com plantas sem gossipol
dentro de uma lavoura comercial de plantas de algodão com gossipol, segundo a
distância da parcela à extremidade do talhão mais próxima ao cerrado.
Taxa de cruzamento (%)
8
7
6
5
4
3
2
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Distância da bordadura do talhão (m)
Figura 25. Taxas de cruzamento verificadas em parcelas com plantas sem gossipol
dentro de uma lavoura comercial de plantas de algodão com gossipol, segundo a
distância da parcela à bordadura do talhão.
Como já descrito, para que as sementes com glândulas sejam produzidas em
plantas sem glândulas, é necessário que o agente polinizador, provavelmente uma
abelha, tenha anteriormente visitado flores de plantas normais (com glândulas).
Neste experimento as plantas sem glândulas de gossipol não estavam separadas
das plantas com gossipol por nenhum tipo de barreira, estando as plantas sem
glândulas de gossipol ao lado de plantas com glândulas. Logo, a perda do pólen e a
diluição do pólen vindo de plantas externas não existiu neste experimento.
Considerando os resultados, pode-se inferir que a visitação de abelhas foi
relativamente homogênea no campo de algodão.
41
7. Discussão
A) Fluxo gênico entre materiais cultivados comercialmente e outros tipos de
algodões
A discussão será realizada pensando na possibilidade de ocorrência de fluxo
gênico entre variedades transgênicas e as plantas de G. barbadense.
Ocorre simpatria entre as plantas de G. barbadense e lavouras de algodão no
cerrado do estado do Mato Grosso. Nos municípios do cerrado pôde-se encontrar
plantas de G. barbadense na periferia das cidades, bairros rurais e em propriedades
rurais, principalmente dos pequenos produtores. A quantidade e densidade de
plantas nestas cidades é, geralmente, menor do que a encontrada nos municípios da
Baixada Cuiabana e Pantanal.
Em município novos, como Primavera do Leste, pode-se perceber claramente
que a maioria das plantas estão em residências de pessoas provenientes do próprio
Mato Grosso ou de outros estados da região Centro-Oeste, cujo uso da espécie
como planta medicinal é um aspecto cultural. Para aquelas pessoas provenientes de
estados sem tradição de uso de G. barbadense, como Rio Grande do Sul e Paraná,
a manutenção de plantas em suas casas corresponde a um processo de aculturação
pelo qual estão passando.
Embora possa haver cruzamentos com algodoeiros transgênicos próximos às
cidades, o problema deverá ser mais acentuado quando indivíduos de G.
barbadense estiverem em bairros rurais ou em pequenas propriedades próximas a
grandes lavouras, como verificado no assentado aos fundos da Fazenda São
Francisco, em Rondonópolis, e no bairro ou distrito de Ouro Branco do Sul, em
Itiquira.
A proximidade entre a lavoura e as plantas nestes locais é menor,
propiciando condições mais favoráveis para que cruzamentos ocorram. Este fato
será estudado na continuidade deste projeto.
A análise preliminar realizada com os marcadores SSR permitiu observar
grande diversidade genética nos entre os acessos coletados no estado. As análises
com marcadores que estão sendo executadas em 2004 devem determinar a
diversidade existente nos diferentes locais e o nível de fluxo gênico existente. Caso
se verifique que a diversidade é maior entre populações, a estratégia de
42
manutenção da variabilidade in situ deverá privilegiar a preservação de G.
barbadense em diversos locais. Em contrário, ou seja, a diversidade seja maior
dentro de populações, a manutenção das populações com maior diversidade deve
ser suficiente para a adequada conservação in situ. Neste caso, deve-se considerar
também a possibilidade de ocorrência de fluxo gênico com algodoeiros herbáceos
cultivados (transgênicos e convencionais) para a escolha das populações a serem
preservadas, priorizando aquelas cuja probabilidade de cruzamento com cultivares é
mais baixa. Como o cultivo de algodoeiro nos estado do Mato Grosso não é
realizado na Baixada Cuiabana e no Pantanal, estas populações devem ser
preferidas para a conservação caso apresentem alta diversidade.
A utilização das sementes das plantas de fundo de quintal é esporádica,
resumindo-se ao replantio e fornecimento para parentes, vizinhos e amigos que
desejam possuir uma planta. O número de plantas mantido em cada quintal é
pequeno, de modo geral, de uma a três plantas. Segundo relato dos proprietários, a
renovação é feita de modo espontâneo: as sementes caem no chão e germinam.
Como a quantidade de novas plantas germinadas é maior do que os proprietários
desejam manter, este excesso de plantas é eliminado com a capina do terreno.
Logo, a quantidade usada para gerar novas plantas representa uma fração ínfima do
total de sementes produzidas, mesmo naqueles locais em que o ataque de pragas,
como a lagarta rosada, é alto.
Para aqueles transgênicos que conferem maior tolerância às lagartas que
atacam os capulhos, o plantio de sementes híbridas deve conferir maior capacidade
à planta de gerar sementes, fato ainda a ser comprovado pela experimentação ou
durante o monitoramento após a liberação para cultivo comercial de algodoeiros
geneticamente modificados.
Este fato deve ser interpretado sob três pontos de vista:
a) Aumento da capacidade competitiva das plantas em ambientes agrícolas
As espécies do gênero Gossypium possuem baixa capacidade competitiva.
G. barbadense não foge à regra. O incremento na agressividade e competitividade
que eventualmente as plantas contendo o transgene possa adquirir não deve ser
suficiente para torná-las plantas daninhas em ambiente agrícola, pois não deverá
alterar o comportamento das plantas em relação a outros caracteres importantes
43
para o sucesso de plantas daninhas, como a não indução de alelopatia, o
crescimento lento, o ciclo longo, a ausência de dormência nas sementes e sua
longevidade relativamente baixa.
b) Aumento da capacidade competitiva das plantas em ambientes naturais
Por conceito, populações ferais são aquelas que formadas por indivíduos
domesticados que reverteram estavelmente seu estado para uma condição similar à
selvagem. Portanto, a estabilidade a longo prazo é um preceito básico para
classificar uma população como feral.
Seguindo este conceito, não se localizou nenhuma população tipicamente
feral durante o período em que a coleta foi realizada. Ao contrário, muitos
agricultores e moradores da região que conhecem bem a planta dizem desconhecer
populações em ambientes naturais. Relatam que algumas vezes são encontradas
em taperas, locais que havia sido ocupado por humanos e posteriormente
abandonados, havendo sido plantadas por antigos moradores. Ainda segundo os
relatos, tais populações são transitórias, desaparecendo gradualmente até sua
completa supressão após alguns anos. Este fato se relaciona a dois fatores
importantes para a região: as plantas não resistem às queimadas, que ocorrem
espontaneamente ou são ocasionadas por práticas agrícolas e acidentes, e não são
capazes de competir com as espécies mais agressivas.
c) Alteração das propriedades medicinais
Este é um problema que merece atenção. Sempre que indagadas, as
pessoas entrevistadas afirmavam que as propriedades medicinais de G. barbadense
eram superiores àquelas do algodoeiro cultivado, não sendo localizadas plantas do
algodão herbáceo mantidas como medicinal. Caso esta informação esteja correta e
o fluxo gênico seja intenso, é possível que o efeito terapêutico das plantas de G.
barbadense seja perdido junto com a descaracterização das espécie. Mas, não se
pode esquecer que as plantas híbridas serão fenotipicamente diferentes das plantas
de G. barbadense puras em relação ao porte, tamanho e formato das folhas, flores e
sementes. Todos estes caracteres morfológicos podem e são usados para eliminar
indivíduos híbridos dos puros, salvaguardando o uso da espécie. Também deve-se
deixar claro que a perda das características medicinais ocorrerá da mesma forma
com fluxo gênico de plantas transgênicas e convencionais.
44
B) Fluxo gênico entre lavouras
Os níveis de cruzamento verificados no experimento em que a barreira de
milho foi utilizada foram baixos o suficiente para serem usados para qualquer fim
que não a comercialização como semente básica. Para usar os grãos como
sementes, a barreira de milho deve garantir a produção de sementes contendo
níveis de contaminação genética dentro dos limites preconizado pelo Ministério da
Agricultura para sementes básicas, 0,01% de plantas fora do tipo. Contudo, deve-se
considerar que o campo de produção de sementes ocupa áreas bem maiores do que
as parcelas utilizadas. Como as taxas de cruzamento tendem a cair a medida que as
plantas estão mais longes da bordadura do talhão mais próxima à fonte de pólen
externo, as plantas mais no interior do campo devem apresentar taxas
extremamente baixas de fecundação cruzada. Caso se despreze a bordadura dos
talhões, os 15 primeiros metros por exemplo, a pureza genética deve ser ainda
maior.
Em relação à separação física exclusiva, sem o uso de barreiras, os
resultados obtidos permitem inferir que a taxa de cruzamento reduz à medida que a
distância física aumenta. Problemas verificados nos resultados deste experimento
nas parcelas entre 300 e 1000m da fonte de pólen tornaram necessário repeti-lo na
continuidade deste projeto para verificar a acurácia dos dados gerados.
A taxa de cruzamento dentro de um campo de algodão foi relativamente
homogênea. Isto indica que o polinizador não apresentou maior atividade nas
bordaduras do talhão, tendo sido ativo de modo relativamente homogêneo ao longo
de toda a área amostrada. Este resultado fortaleça a hipótese que a perda de pólen
durante a movimentação do polinizador e a diluição de externo pela visitação das
flores de dentro da parcela sejam os responsáveis pela redução na taxa de
fecundação cruzada observada no experimento da barreira de milho e em outros
trabalhos (Moresco et al., 2002; Xanthopoulos & Kechagia, 2000; Queiroga et al.,
1993; Queiroga et al., 1986, Umbeck et al., 1991; Llewellyn & Fitt, 1996;
Xanthopoulos & Kechagia, 2000, Yasuor et al., 2000; Jia, 2002).
45
O percentual de transgênicos em alimentos e ingredientes alimentares a partir
do qual é exigido a rotulagem dos produtos varia de acordo com os países. Nos EUA
a não existe um limite e a rotulagem é facultativa. O valor mais baixo foi estipulado
pela União Européia, 0,9%. Brasil, China, Austrália e Nova Zelândia determinaram
que produtos com níveis acima de 1% devem ser rotulados. Japão, Canadá e
Rússia estabeleceram como teto 5%. As taxas verificadas dentro das parcelas
protegidas por barreiras de milho apresentaram valores bem abaixo destes limites.
Cabe considerar que a fibra formada em sementes oriundas de cruzamento
provém do tegumento do óvulo, sendo, portanto, de origem materna. Assim, todas
as sementes, mesmo aquelas formadas por cruzamento, são recobertas por fibra de
formada exclusivamente em células maternas. Isto significa que uma planta
convencional fecundada por pólen transgênico produzirá fibra exclusivamente não
transgênica. Este detalhe importante genético pode permitir que a fibra produzida
em lavouras de plantas convencionais seja classificada como não transgênica,
mesmo nos casos em que os níveis de cruzamento excedam o percentual aceito
para rotulagem. Porém, em casos em que o rigor é maior, como para fibra certificada
como orgânica, provavelmente este aspecto biológico seja desconsiderado. O
mesmo não ocorre com os grãos. Grãos provenientes de fecundação cruzada serão
heterozigotos para o transgene e haverá expressarão as proteínas transgênicas no
embrião e nos cotilédones.
Unindo as informações disponíveis na literatura e os resultados obtidos neste
trabalho, é possível idealizar um primeiro esboço da metodologia de contenção de
fluxo gênico via pólen, associando barreiras de plantas mais altas, barreiras do
próprio algodão e distância física.
46
8. Conclusões
As conclusões preliminares a que este projeto chegou foram:
1) As plantas de G. barbadense estão sendo relativamente bem preservadas nas
regiões do Pantanal, Baixada Cuiabana e Cerrado do Estado do Mato Grosso;
2) G. barbadense é utilizado como planta medicinal, tendo sido quase perdida a
cultura da fiação e da confecção de artefatos artesanais com sua fibra;
3) Há grande diversidade genética em G. barbadense no estado do Mato Grosso;
4) A barreira de 100 m de milho é suficiente para reduzir a níveis muito baixos a
polinização cruzada entre variedades de algodoeiro;
5) A taxa de cruzamento existente dentro de um campo de algodão é similar,
independente da posição da planta dentro do campo;
6) O aumento da distância física entre plantas de algodão e uma fonte de pólen
reduz a taxa de.cruzamentos.
47
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