Dissertação em PDF

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE, UNICENTRO-PR
NUTRIÇÃO, FISIOLOGIA E PRODUTIVIDADE DE
SOJA INOCULADA COM Azospirillum brasilense E
REGULADORES VEGETAIS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
JULIO JOSÉ NONATO
GUARAPUAVA-PR
2016
JULIO JOSÉ NONATO
NUTRIÇÃO, FISIOLOGIA E PRODUTIVIDADE DE SOJA INOCULADA COM
Azospirillum brasilense E REGULADORES VEGETAIS
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual do Centro-Oeste, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação
em Agronomia, área de concentração em
Produção Vegetal, para a obtenção do título
de Mestre.
Prof. Dr. Itacir Eloi Sandini
Orientador
GUARAPUAVA – PR
2016
Catalogação na Publicação
Biblioteca Central da Unicentro, Campus Cedeteg
N812n
Nonato, Julio José
Nutrição, fisiologia e produtividade de soja inoculada com Azospirillum
brasilense e reguladores vegetais / Julio José Nonato. – – Guarapuava,
2016
xv, 77 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual do Centro-Oeste,
Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em
Produção Vegetal, 2016
Orientador: Itacir Eloi Sandini
Banca examinadora: Itacir Eloi Sandini, Elizabeth Orika Ono, Laercio
Ricardo Sartor, Elisa Adriano
Bibliografia
1. Agronomia. 2. Produção vegetal. 3. Glycine max L.. 4. Bactéria
promotora de crescimento de plantas. 5. Hormônios vegetais. 6. Enzimas
estresse oxidativo. I. Título. II. Programa de Pós-Graduação em Agronomia.
CDD 633.34
“Não adianta se entregar
aos sonhos, se você se
esquece de viver”
(J.K. Rowling).
A minha mãe, Marta Sonsin,
pelo apoio e sacrifícios
realizados,
dedico.
AGRADECIMENTOS
A minha família, Marta, Julio, Priscilla, Gabriela e Silvia, agradeço pelo incentivo,
apoio em todo o período de mestrado, mostrando que a distância nunca existiu e por me
ensinarem que mesmo nas piores adversidades, nosso amor, amizade e companheirismo
será a base para superá-las. Em especial, agradeço a minha mãe, Marta, pelo suporte
financeiro, por me aconselhar e sempre me ouvir, mesmo nos momentos mais difíceis.
Ao meu orientador, Professor Dr. Itacir, pela enorme paciência que teve comigo e
pelos grandes conselhos acerca do programa de pós-graduação, sobre o projeto de pesquisa
e sobre a vida.
Aos colegas do laboratório de “Plantas e Lavouras” e membros do grupo de
pesquisa e desenvolvimento agropecuário, AgrisusBrasil pela excepcional ajuda na
condução e manutenção dos experimentos em campo.
Os grandes amigos e companheiros de pós-graduação, que me auxiliaram nas
muitas avaliações, pelos conselhos e bons momentos partilhados. Adriano, André, Anna
Cláudia, Andressa, Elizandro, Fabiéli, Gabriel, Juliane, Kelly, Luciana, Regina, Ril,
Vanessa, Verônica, entre tantos outros. Meus sinceros agradecimentos pelas contribuições
tanto na minha vida pessoal como profissional.
As amizades únicas feitas nesse período de vivencia em Guarapuava. Bruna, Carlos
e Ozélia, companheiros que me trataram como membro de família, agradeço pelas boas
risadas e madrugadas de conversas filosóficas. A Mare sou grato por me ajudar em
momentos de extrema dificuldade, mesmo sem estar ciente dos problemas. A vocês, minha
profunda e eterna gratidão.
A Universidade Estadual do Centro-Oeste, pelo espaço e estrutura cedida, bem
como a todos os professores e funcionários, em especial a Lucília da Rosa, pela enorme
compreensão e suporte.
SUMÁRIO
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS.................................................................. i8
LISTA DE TABELAS ....................................................................................................... 10
ii
iii
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................ 12
iv
RESUMO............................................................................................................................ 14
v
ABSTRACT ....................................................................................................................... 15
1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................ 1
2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 2
2.1 Objetivo geral .......................................................................................................................................... 2
2.2 Objetivos específicos ............................................................................................................................... 2
3. REFERÊNCIAL TEÓRICO .......................................................................................... 3
3.1 Importância da soja.................................................................................................................................. 3
3.2 Bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCP) ........................................................................ 4
3.2.1 Bactérias do gênero Azospirillum ......................................................................................................... 4
3.3 Reguladores vegetais ............................................................................................................................... 6
3.3.1 Produto comercial Stimulate® ............................................................................................................. 7
3.4 Enzimas de estresse oxidativo ................................................................................................................. 7
4. CONSIDERAÇÕES ........................................................................................................ 9
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 10
6. CAPÍTULO I – MÉTODOS DE INOCULAÇÃO DE Azospirillum brasilense NA
CULTURA DA SOJA ....................................................................................................... 16
RESUMO .................................................................................................................................................... 16
6.1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 18
6.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................................... 18
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................... 21
6.4 CONCLUSÃO ....................................................................................................................................... 27
6.5 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................... 27
7. CAPÍTULO II – INOCULAÇÃO DE Azospirillum brasilense ASSOCIADO A
NÍVEIS CRESCENTES DE REGULADOR VEGETAL NA CULTURA DA SOJA 30
RESUMO .................................................................................................................................................... 30
7.1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 32
7.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................................... 33
7.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................... 37
7.4 CONCLUSÃO ....................................................................................................................................... 56
7.5 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................... 56
APÊNDICE I ...................................................................................................................... 63
APÊNDICE II .................................................................................................................... 64
i
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
® - Marca registrada
µL - Microlitro
µmol - Micromol
A – Taxa de assimilação de CO2
AIA – Ácido indolacético
ASB – Albumina de soro bovino
BPCP - Bactéria promotora do crescimento de plantas
Ca – Cálcio
CAT - Catalase
cm – Centímetros
CO2 – Gás carbônico
Cu – Cobre
CV – Coeficiente de variação
DAP – Dias após plantio
E - Transpiração
EiC – Eficiência instantânea de carboxilação
EROs – Espécies reativas de oxigênio
EUA – Eficiência do uso de água
FBN – Fixação biológica de nitrogênio
g – Força g
g kg-1 – Gramas por quilograma
GL – Graus de liberdade
gs – Condutância estomática
H2O – Água
IRGA - Infrared Gas Analyzer
K – Potássio
kg ha-1 – Quilograma por hectare
L ha-1 – Litros por hectare
m – Metros
M - Molar
m2 – Metros quadrados
m-2 s-1 – Metros quadrados por segundo
MDA – Malondialdeído
mg kg-1 – Miligramas por quilograma
mL - Mililitro
mL ha-1 – Mililitros por hectare
mL kg-1 – Mililitros por quilograma
mm – Milímetros
mM - Milimolar
MMG – Massa de mil grãos
mmol - Milimol
Mn – Manganês
N – Nitrogênio
N2 – Nitrogênio gasoso
nm – Nanômetro
º C – Graus Celsius
O2 – Oxigênio gasoso
P – Fósforo
pH - Potencial hidrogeniônico
PL – Peroxidação de lipídeos
POX - Peroxidase
R1 – Estádio reprodutivo 1
R2 – Estádio reprodutivo 2
S - Enxofre
SOD - Superóxido dismutase
TBA – Ácido tiobarbitúrico
TCA - Ácido tricloroacético
TS – Tratamento de sementes
UFC – Unidades formadoras de colônia
V4 – Estádio vegetativo 4
Zn – Zinco
ii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Diferentes formas de aplicação e doses de inoculante comercial contendo
Azospirillum brasilense, em soja utilizada no experimento conduzido durante a safra
agrícola 2013/2014 em Guarapuava, PR. ..................................................................... 20
Tabela 2. Quadrados médios para a produtividade (kg ha-1), massa de mil grãos
((MMG) (g)), índice spad (SPAD), nitrogênio foliar ((N) (g kg-1)), fósforo foliar ((P)
(g kg-1)), potássio foliar ((K) (g kg-1)), enxofre foliar ((S) (g kg-1)), cálcio foliar ((Ca)
(g kg-1)), cobre foliar ((Cu) mg kg-1)), manganês foliar ((Mn) mg kg-1)), ferro foliar
((Fe) mg kg-1)) e zinco foliar ((Zn) mg kg-1)), em função da inoculação de Azospirillum
brasilense na cultura da soja. Guarapuava, PR, 2016. .................................................. 22
Tabela 3. Quantidade de macronutrientes ((nitrogênio (N), fósforo (P) e enxofre (S),
em g kg-1)) acumulados em folhas de soja inoculada com Azospirillum brasilense, para
a safra agrícola de 2013/2014. Guarapuava, PR, 2016. ................................................ 26
Tabela 4. Doses de regulador vegetal associado ou não à Azospirillum brasilense, em
sementes de soja utilizadas no experimento conduzido durante a safra agrícola
2013/2014 em Guarapuava, PR. ................................................................................... 34
Tabela 5. Quadrados médios para a produtividade (kg ha-1), massa de mil grãos
((MMG) (g)), índice spad (SPAD), nitrogênio foliar ((N) (g kg-1)), fósforo foliar ((P)
(g kg-1)), potássio foliar ((K) (g kg-1)), enxofre foliar ((S) (g kg-1)), cálcio foliar ((Ca)
(g kg-1)), cobre foliar ((Cu) mg kg-1)), manganês foliar ((Mn) mg kg-1)), ferro foliar
((Fe) mg kg-1)), zinco foliar ((Zn) mg kg-1)), superóxido dismutase, peroxidase e
peroxidaçao de lipídeos aos 9, 19, 29, 39 e 49 dias após plantio (DAP) (unidades mg-1
proteína) em função da inoculação de Azospirillum brasilense e regulador vegetal na
cultura da soja. Guarapuava, PR, 2016. ........................................................................ 38
Tabela 6. Atividade média da enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD)
(unidades mg-1 proteína) para a coleta aos 9 dias após o plantio de soja inoculada com
Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava, PR, 2016. .......................... 42
Tabela 7. Médias dos teores de potássio foliar (g kg-1) e da atividade da enzima
antioxidante peroxidação de lipídeos (unidades mg-1 proteína) aos 19 dias após o
plantio (DAP), para plantas de soja inoculada com Azospirillum brasilense na safra
agrícola de 2013/2014, Guarapuava, PR, 2016............................................................. 49
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Taxa de assimilação de CO2 (A, μmol CO2 m-2s-1), condutância estomática
(gs, mol H2O m-2s-1), transpiração (E, mmol H2O m-2s-1), eficiência do uso da água
((EUA, (μmol CO2 (mmol H2O)) e eficiência instantânea de carboxilação ((EiC,
(μmol m-2s-1) (μmol mol-1)-1)) em folhas de plantas de soja cultivadas em campo na
safra agrícola de 2013/2014, inoculadas com Azospirillum brasilense, Guarapuava,
PR, 2016. ................................................................................................................... 23
Figura 2. Produtividade (kg ha-1) de soja inoculada com Azospirillum brasilense,
para a safra agrícola de 2013/2014. Guarapuava, PR, 2016. Médias seguidas da
mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de
probabilidade. ............................................................................................................ 24
Figura 3. Taxa de assimilação de CO2 (A, μmol CO2 m-2s-1), condutância estomática
(gs, mol H2O m-2s-1), transpiração (E, mmol H2O m-2s-1), eficiência do uso da água
((EUA -A/E, μmol CO2 (mmol H2O)) e eficiência instantânea de carboxilação ((EiC,
(μmol m-2s-1) (μmol mol-1)-1)) em folhas de plantas de soja cultivadas em campo na
safra agrícola de 2013/2014, inoculadas com Azospirillum brasilense e regulador
vegetal, Guarapuava, PR, 2016. ................................................................................ 41
Figura 4. Atividade média da enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD)
(unidades SOD mg-1 proteína) para a coleta aos 19 (A), 39 (B) e 49 (C) dias após o
plantio (DAP) de soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal,
Guarapuava, PR, 2016. **,*,º significativo a 1, 5 e 10% de probabilidade,
respectivamente. As barras referem-se ao erro padrão. ............................................. 44
Figura 5. Atividade média da enzima antioxidante peroxidase (POX) (unidades
POX mg-1 proteína) para a coleta aos 9 (A) e 19 (B) dias após o plantio (DAP) de
soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava, PR,
2016. **,* significativo a 1 e 5% de probabilidade, respectivamente. As barras
referem-se ao erro padrão. ......................................................................................... 46
Figura 6. Atividade média da enzima antioxidante peroxidação de lipídeos (PL)
(unidades PL mg-1 proteína) para a coleta aos 29 (A) e 49 (B) dias após o plantio
(DAP) de soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal,
Guarapuava, PR, 2016. **,* significativo a 1 e 5% de probabilidade,
respectivamente. As barras referem-se ao erro padrão. ............................................. 48
Figura 7. Concentrações foliares (g kg-1) de nitrogênio (A), potássio e cálcio, para
soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, para a safra agrícola
de 2013/2014, Guarapuava, PR, 2016. **,* significativo a 1 e 5% de probabilidade,
respectivamente. As barras referem-se ao erro padrão. ............................................. 52
Figura 8. Concentrações foliares (mg kg-1) de zinco (A), manganês (B) e cobre (C),
para soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, para a safra
agrícola de 2013/2014, Guarapuava, PR, 2016. **,*,º significativo a 1, 5 e 10% de
probabilidade, respectivamente. As barras referem-se ao erro padrão. ..................... 55
iv
RESUMO
Julio José Nonato. Nutrição, Fisiologia e Produtividade de Soja Inoculada com
Azospirillum brasilense e Reguladores Vegetais
Objetivando avaliar a eficiência da inoculação de Azospirillum brasilense, aplicado
em semente, sulco de semeadura e via foliar, associado ou não a níveis crescentes de
reguladores vegetais na cultura da soja, foram realizados dois experimentos na área
experimental da Universidade Estadual do Centro–Oeste, no município de Guarapuava,
PR, na safra agrícola de 2013/2014. O experimento I foi composto por 4 repetições de 11
tratamentos contendo o uso de inoculante líquido comercial de A. brasilense, nas doses de
2 e 4 mL kg-1 em tratamento de sementes, 200, 400 e 600 mL ha-1 via foliar (estádio V4) e
sulco de semeadura. Já para o experimento II foram 8 tratamentos com 4 repetições, sendo
os tratamentos realizados em sementes, com dose fixa de 3 mL kg-1 de inoculante líquido
comercial para A. brasilense, e o regulador vegetal Stimulate®, nas doses de 0, 2,5, 5 e 7,5
mL kg-1. Para ambos foi utilizando delineamento de blocos inteiramente ao acaso. Na soja
foram avaliados: taxa de assimilação de CO2; condutância estomática; transpiração;
eficiência no uso de água; eficiência instantânea de carboxilação; clorofila em índice
SPAD; teores de macro e micronutrientes foliares; produtividade; massa de mil grãos;
atividade da superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POX) e peroxidação de lipídeos
(PL). Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas
pelo teste de Tukey e análise de regressão para verificar o comportamento das variáveis,
em função das doses do produto à 1, 5 e 10% de probabilidade. A partir dos dados obtidos,
observou que a inoculação da bactéria promoveu incrementos nas trocas gasosas,
incrementos no acúmulo de N, P e S e a aplicação foliar obteve o maior rendimento de
grãos. Verificou-se que o regulador, associado ou não ao microrganismo apresentou
influência para atividade da SOD, POX e PL, além de aumentar os teores foliares de N, P,
Ca, Zn, Mn e Cu. Conclui-se que o uso dessas tecnologias podem melhorar os parâmetros
avaliados para a cultura da soja.
Palavras-chave: Glycine max L., bactéria promotora do crescimento de plantas,
hormônios vegetais, enzimas estresse oxidativo.
v
ABSTRACT
Julio José Nonato. Nutrition, Physiology and Productivity of Soybean inoculated with
Azospirillum brasilense and Plant Growth Regulators
Aiming to evaluate the efficiency of inoculation with Azospirillum brasilense, applied in
seeds, furrow and foliar, with or without crescent levels of plant growth regulators in
soybean, two studies were conducted in the experimental area of the Universidade Estadual
do Centro–Oeste, in Guarapuava, PR, in the season of 2013/2014. The first trial consisted
of 4 replications of 11 treatments using commercial inoculant containing A. brasilense, in
doses of 2 and 4 ml kg-1 in seeds treatment, 200, 400 and 600 mL ha-1 foliar (V4 stage) and
furrow. As for the second trial were 8 treatments with 4 replications, and all the treatments
was in seeds, with a steady dose of 3 mL kg-1 of a commercial liquid inoculant with A.
brasilense, associated or not to plant growth regulator Stimulate® in doses 0, 2.5, 5 and 7.5
ml kg-1. For both was using completely randomized block design. Soybeans were
evaluated: CO2 assimilation rate; stomatal conductance; transpiration; efficient use of
water; instantaneous carboxylation efficiency; chlorophyll in SPAD index; levels of macro
and micronutrients; productivity; thousand grain weight; activity of superoxide dismutase
(SOD), peroxidase (POX) and lipid peroxidation (PL). Data were subjected to analysis of
variance and means compared by Tukey test and regression analysis to verify the behavior
of the variables depending on the doses of the produc at 1, 5 and 10% probability. From
the data obtained, it is observed that the inoculation of bacteria promoted gas exchange
increases, increases in accumulation of N, P and S and foliar application had the highest
grain yield. It was found that the plant growth regulators, with or without the
microorganism presented influences in the activity of SOD, POX and PL, besides
increasing the leaf contents of N, P, Ca, Zn, Mn and Cu. It is concluded that the use of
these technologies can improve the parameters evaluated for the soybean crop.
Keywords: Glycine max L., plant growth promoter bacteria, plant hormones, oxidative
stress enzymes.
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
O grão oleaginoso da soja tem uma produção expressiva tanto no contexto nacional
como no mundial. Com isso, o seu uso tem expandido significativamente, tanto na
produção de óleos, como na alimentação humana e animal.
Devido à essas diversas utilizações, faz-se necessário um aumento da
produtividade, sem aumento da área cultivada. Uma das soluções é a busca por produtos e
tecnologias que apresentem bons resultados e ainda possuam baixo custo. Dois grandes
exemplos são: inoculação de bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCP) e o
uso de reguladores.
As BPCP recebem essa classificação, devido à capacidade de estimular o
crescimento dos vegetais de forma direta ou indireta. Direta na fixação ou solubilização de
nutrientes e indireta na ação antagônica contra patógenos e estresses ambientais (Hungria
et al. 2013).
Um importante gênero de BPCP é o Azospirillum, que além de fixarem nitrogênio
atmosférico (HAN et al., 2005), ainda induzem a produção dos hormônios vegetais
(VANDE BROEK & VANDERLEYDEN, 1995), tais como: auxinas, giberelinas,
citocininas e etileno.
Os reguladores vegetais são substâncias químicas exógenas que imitam a ação dos
hormônios endógenos vegetais, podendo assim alterar a morfologia e a fisiologia das
plantas (VIEIRA e CASTRO, 2002). A combinação de dois ou mais reguladores vegetais
com outras substâncias benéficas é conhecida como regulador vegetal (LEITE et al., 2003).
Considerando os benefícios de ambos, microrganismo e reguladores, o objetivo
deste estudo propõe avaliar a eficiência isoladamente ou em conjunto destas tecnologias,
em benefício da cultura da soja na região Centro-Sul do Paraná.
2
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
O objetivo do presente trabalho foi o de avaliar o efeito de indutores de crescimento
vegetal químico e biológico em soja, no teor de nutrientes foliar, eficiência fotoquímica,
atividade bioquímica e produtividade da cultura na região Centro-Sul do Estado do Paraná.
2.2 Objetivos específicos
1) Observar a eficiência fotossintética da cultura sob influência dos indutores de
crescimento.
2) Identificar a dose de A. brasilense e de reguladores vegetais com maior
eficiência nos parâmetros avaliados.
4) Averiguar a forma de aplicação mais efetiva do A. brasilense isoladamente.
5) Verificar se há influência destes indutores na absorção, acúmulo e sinergismo
dos macro e micronutrientes e na produtividade de grãos.
6) Analisar a atividades das enzimas de estresse oxidativo (SOD, POX e PL).
3
3. REFERÊNCIAL TEÓRICO
3.1 Importância da soja
A soja (Glycine max (L.) Merrill) é uma espécie que teve origem no continente
asiático, na região conhecida como a China Antiga, de onde chegou em áreas europeias,
seguindo para as Américas, e por fim ao Brasil no final do século XIX (DIEHL, 1997).
Onde passou a ser utilizada como cultura somente a partir de meados do século XX com a
demanda de matéria prima para a indústria, que necessitava de óleos vegetais e devido aos
subsídios políticos para exportação de produtos nacionais. Atualmente as atividades
sojícolas se expandiram de tal forma, que a planta passou a ser cultivada em praticamente
todo o território nacional. Dentre todos os cultivos brasileiros, o grãos de soja possui um
dos maiores teores de proteicos com um baixo custo de produção quando comparado a
outras culturas (OCEPAR, 1994; EMBRAPA, 1999).
O óleo proveniente dos grãos é um dos principais e mais importantes subprodutos
da soja. Contudo, outros têm importância igualitária, assim como a lecitina de soja
emulsificadora e os ingredientes à base da proteína de soja: farinha de soja, concentrados
de soja e isolados de soja, que são altamente utilizados para fins alimentícios e industriais.
Para Campos (2005) quase 60% dos produtos nacionais possuem ingredientes a base de
soja.
Em sua composição química, as plantas de soja, possuem compostos isoflavonóides
que desempenham importantes funções biológicas, tais como atividade antioxidante
(EZAKI et al., 1999) e anticancerígena (DENIS et al., 1999).
Hoje em dia, como principal commodity agrícola brasileira, tem grande expressão
também no mercado internacional, deixando o país em segundo colocado no ranque
mundial, com uma produção estimada em 96.243,3 mil de toneladas na safra de
2014/2015, sendo superado apenas pelos Estados Unidos (FAO, 2014; CONAB, 2016).
Em nível nacional, o Estado do Paraná ocupa a segunda colocação, com uma
produtividade de aproximadamente 17.210,5 mil toneladas na safra supracitada, ficando
atrás apenas do Mato Grosso. Contudo, consegue manter uma média de produtividade de
3.294 kg ha-1, acima da nacional de 2.999 kg ha-1 (CONAB, 2016).
4
Para Hirakuri (2011), a grande expansão econômica do setor produtivo sojícola nas
últimas décadas se deve ao fato da construção de um consistente mercado internacional de
comercialização dos produtos derivados diretamente e indiretamente da soja. Ainda para o
mesmo autor, dentre esses produtos, um dos mais importantes é sua utilização como
importante fonte de proteína vegetal, que está diretamente ligada ao crescente setor de
produção de produtos de origem animal.
3.2 Bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCP)
Este seleto grupo de microrganismos, estimulam diretamente o crescimento com a
fixação de nitrogênio (HAN et al., 2005), capacidade de solubilizar nutrientes
(RODRÍGUEZ & FRAGA, 1999), produzir hormônios vegetais (DONATE et al., 2004) e
indiretamente por antagonismo a fungos patogênicos (RENWICK et al., 1991).
Chavarria e Mello (2011) citam as bactérias do gênero Azospirillum como fixadores
de N e de acordo com Vande Broek e Vanderleyden (1995) elas ainda são capazes de
produzir fitormônios, que estimulam tanto o crescimento radicular (OKON E
LABANDERA - GONZALEZ, 1994) como o da parte aérea (HUNGRIA et al., 2013).
Após um levantamento realizado por Okon e Labandera - González (1994), no qual,
durante 20 anos em todo o mundo foram avaliados dados de experimentos de inoculação
com Azospirillum, perfizeram que mesmo em condições edáficas e climáticas distintas
essas bactérias são capazes de incrementar a produtividade de importantes culturas.
Resposta esperada em virtude da rápida colonização na rizosfera e estimulação no
crescimento (FIGUEIREDO et al., 2010).
Para Moreira e Siqueira (2006) a inoculação com BPCP, será uma das técnicas mais
importantes para o aumento da produção, pois o desenvolvimento da agricultura
sustentável é crescente, minimizando assim a utilização de fertilizantes químicos nos
sistemas de produção.
3.2.1 Bactérias do gênero Azospirillum
Dentre os gêneros dos grupos de BPCP o Azospirillum possui como uma de suas
principais características a vida livre, o que permite serem encontrados em diversas
5
localidades no mundo, também há registros de que os mesmo ainda podem ser endofiticos
facultativos (DÖBEREINER & PEDROSA, 1987; HUERGO et al., 2008).
Beijerinck em 1978 foi pioneiro na descrição da espécie Spirillum lipoferum, que
mais tarde passou por uma reclassificação e tornou-se Azospirillum no mesmo período em
que outras duas espécies estavam sendo descritas, Azospirillum lipoferum e Azospirillum
brasilense (TARRAND et al., 1978).
O elemento nitrogênio em sua forma de gás (N2), constitui aproximadamente 78%
da atmosfera terrestre contudo, nem plantas ou animais são capazes de utilizá-lo como
fonte nutricional, pois a tripla ligação entre os dois átomos de N é muito forte (HUNGRIA,
2011). Espécies de bactérias possuem a habilidade de produzir uma enzima denominada
dinitrogenase, capaz de romper a tripla ligação do nitrogênio gasoso, reduzindo-o a amônia
(assimilável por vegetais) (HUNGRIA et al., 2007). Esses mesmos pesquisadores ainda
definem tais microrganismos como diazotróficos ou fixadores de nitrogênio e afirmam que
realizam diversas formas de associações com as plantas, tornando a classificação mais
específica, bactérias associativas endofíticas ou simbióticas.
Os Azospirillum são bactérias associativas e por conta disso não conseguem suprir
toda a necessidade nutricional das plantas, pois excretam parcialmente o N fixado
(HUNGRIA, 2011).
Trabalhos relatam a capacidade desses microrganismo na indução da produção de
fitormônios. Foi verificado por Tien et al. (1979) que o A. brasilense promove o
crescimento das raízes pela liberação de ácido indolacético (AIA), giberelinas e
citocininas.
Devido ao maior crescimento radicular proporcionado pelos fitormônios, foram
relatados benefícios secundários, tais como: melhorias na absorção da água e minerais,
maior tolerância a estresses como salinidade e seca, resultando em uma planta mais
vigorosa e produtiva (BASHAN & HOLGUIN, 1997; DOBBELAERE et al., 2001;
BASHAN et al., 2004). Correa et al. (2008) relataram também maior tolerância aos agentes
patogênicos, fato que provavelmente pode ser explicado pelo maior vigor dos vegetais
associados.
Barassi et al. (2008), realizando uma revisão em trabalhos sobre as respostas
fisiológicas de plantas inoculadas com Azospirillum, observaram que houveram
incrementos nos parâmetros: fotossíntese, teor de clorofila foliar, condutância de
6
estômatos, aumento nos teores de prolina nas raízes e parte aérea, melhor potencial hídrico,
maior produção de biomassa e plantas mais altas.
Avaliando pigmentação, Bashan et al. (2006) relataram aumentos significativos em
pigmentos relacionados a fotossíntese, tais como clorofila a, b, e pigmentos fotoprotetivos
auxiliares, como violaxantina, zeaxantina, ateroxantina, luteína, neoxantina e betacaroteno.
3.3 Reguladores vegetais
Para Castro e Vieira (2001) os fitormônios, ou hormônios vegetais, possuem uma
composição molecular orgânica e são produzidos naturalmente pelas plantas, que possuem
a função de estimular, inibir e/ou modificar processos na morfologia e fisiologia vegetal.
Contudo, há substâncias sintéticas que, aplicadas exógenamente, possuem ações similares
aos grupos de reguladores vegetais conhecidos (citocininas, giberelinas, auxinas, ácido
abscísico e etileno) (VIEIRA & CASTRO, 2002).
Estas substâncias, segundo Lamas (2001), conhecidas como reguladores vegetais
são constituições sintéticas que tem efeito sobre o metabolismo vegetal, agindo de forma
similar aos hormônios, porém, o termo reguladores vegetais não é restrito somente aos
compostos sintéticos, mas também aos de ocorrência natural. Para tanto, pode-se concluir
que são compostos sintéticos e/ou naturais que influenciam de alguma forma o
desenvolvimento das plantas com ação expressiva nos processos fisiológicos (PAROUSSI
et al., 2002).
Jaleel et al. (2007) relatam que a ação dos reguladores variam em função da espécie
vegetal, variedade, idade da planta, condições ambientais, estados fisiológicos e
nutricionais, estádio de desenvolvimento e o balanço endógeno hormonal.
Visando solucionar entraves nos sistemas de produção, tais como melhorias na
quantidade e qualidade da produção agrícola, o efeito benéfico destas substâncias têm sido
estudados (CASTRO & VIEIRA, 2003).
Para Ramos (2013), um dos efeitos desses produtos está no incremento da
fotossíntese líquida, pois com a minimização da produção do hormônio etileno, há uma
redução temporária da respiração dos vegetais, provocando um menor consumo de carbono
e resultando em uma maior geração de energia.
Trabalhos realizados por Sirtoli (2010), Amaro (2011) e Macedo (2012) mostram
7
forte ação desses produtos na atividade de enzimas antioxidantes, tendo sido determinadas
as atividades da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e peroxidase (POX),
evidenciando ação antiestresse nas plantas tratadas, e também do melhoramento da
eficiência fotoquímica das plantas (RHICHARDSON et al., 2004).
3.3.1 Produto comercial Stimulate®
O Stimulate® é um produto comercial produzido pela Stoller do Brasil S.A., sendo
constituído por: 0,005% do ácido indolbutírico (auxina), 0,009% de cinetina (citocinina) e
0,005% de ácido giberélico (giberelina), sendo eles hormônios sintéticos vegetais que
atuam como mediadores de processos morfológicos e fisiológicos. Acredita-se que este
regulador pode, em função da sua composição, concentração e proporção de substâncias,
incrementar o crescimento e o desenvolvimento vegetal, estimular a divisão celular
podendo, também, aumentar a absorção de água e nutrientes pelas plantas (VIEIRA &
CASTRO, 2002).
Segundo Leite et al. (2003), é crescente a prática da utilização de combinações
diversificadas destes reguladores, pois como possuem ações específicas, essas misturas são
necessárias para produção de um bom efeito fisiológico.
Milléo (2010), avaliando a eficiência agronômica do Stimulate®, aplicado via
tratamento de sementes e foliar na cultura da soja, verificou que o produto foi
agronomicamente eficiente, favorecendo a maior produção de vagens e grãos.
Atualmente o uso de reguladores vegetais pode ser considerado uma ferramenta
imprescindível para a otimização de sistemas tecnificados de produção, pois além de
contribuir, significativamente, para a eficiência do uso racional de fertilizantes e amenizar
eventuais situações de estresse, incrementa os ganhos de rendimento de grãos e os níveis
de sustentabilidade da atividade agrícola (FANCELLI, 2010).
3.4 Enzimas de estresse oxidativo
Estresses ambientais como elevadas ou baixas temperaturas, seca, salinidade,
radiação ultravioleta, ozônio e infecções patogênicas são potencialmente prejudiciais às
plantas (VAN BREUSEGEM et al., 2001). Uma das alterações metabólicas importante
8
para as plantas em condições de estresse é o aumento da produção de espécies reativas de
oxigênio (EROs) (APEL & HIRT, 2004; FOYER & NOCTOR, 2005).
O estresse oxidativo é ocasionado pela superprodução das EROs, tais como radicais
superóxido (O2°-), radicais hidroxila (°OH), peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio
singleto (1O2) (THÉROND et al., 2000; SCANDALIOS, 2005).
Os radicais livres e as EROs atuam de forma prioritária nas proteínas, cuja oxidação
leva à perda de função ou à degradação antecipada, podendo direcionar a mutações
gênicas, anomalias na síntese proteica, alteração na expressão gênica e à morte celular
(SORG, 2004). Além disso, as EROs são continuamente produzidas sob condições
normais, como na respiração mitocondrial (MOLLER, 2001; DOUDICAN et al., 2005) e
nos processos ocorrentes nos cloroplastos (ASADA, 1999). As EROs também podem ser
utilizadas de maneira benéfica pelas plantas, pois desempenham papel importante na
indução de mecanismos de proteção quando as mesmas são submetidas aos estresses
bióticos e abióticos (VAN BREUSEGEM et al., 2001).
Para evitar o acúmulo das EROs as plantas possuem sistemas de defesa
antioxidantes eficientes (HERNÁNDEZ et al., 2001), dentro deles está o sistema defensivo
enzimático, envolve as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalases (CAT),
peroxidases (POX), glutationa peroxidase (GPX), ascorbato peroxidase (APX), glutationa
redutase (GR) e glutationa S-transferase (GSTs) (BLOKHINA et al., 2003;
SCANDALIOS, 2005).
A superóxido dismutase atua na primeira linha de defesa contra a EROs,
dismutando o superóxido (O2°-) em peróxido de hidrogênio (H2O2) (SCANDALIOS,
2005).
No processo de ação desse metabolismo, tudo se inicia com a redução enzimática
realizada pelo superóxido, originando assim oxigênio no meio. A reação seguinte se dá
entre outro íon superóxido e a enzima reduzida, formando assim um H2O2, que
posteriormente sofrerá dismutação pela catalase ou peroxidase, dando origem a água e
oxigênio molecular (BERG et al. 2004).
A catalase, juntamente com a SOD, é considerada a mais eficiente entre as enzimas
antioxidantes. Possui a capacidade de degradar rapidamente o peróxido de hidrogênio em
H2O e O2 e por isso é muito importante no sistema antioxidativo. Ambas apresentam uma
função combinada, de modo que a CAT converte o H2O2, originado em função da
9
atividade da SOD, em H2O e O2 (SCANDALIOS, 1993).
Uma das mais importantes funções de desempenho da peroxidase está na
biossíntese da parede celular, auxiliando assim na defesa aos ataques patogênicos e ainda
estão envolvidas nas respostas aos estresses. De acordo com Inzé & Van Montagu (1995),
são consideradas as mais importantes na eliminação de H2O2 no citosol e nos cloroplastos.
Sua atividade é frequentemente aumentada em resposta ao estresse, pois a proteção celular
contra as reações oxidativas é uma das principais funções dessa enzima (SIEGEL, 1993).
Isso se deve ao fato das peroxidardes decomporem o H2O2 produzido nas reações
catalisadas pela SOD (BOR et al., 2003).
4. CONSIDERAÇÕES
Devido a atual conjuntura da agricultura brasileira, há uma crescente busca por
tecnologias que incrementem a produtividade com o menor impacto possível ao meio
ambiente. Com isso, a inoculação com a bactéria A. brasilense e o uso de reguladores
tornam-se alternativas de foco para estudos com as culturas de interesse agronômico de
forma geral.
A associação do A. brasilense em plantas de soja auxiliam a suprir parte da
necessidade de nitrogênio para a cultura, devido a sua capacidade de fixação biológica de
nitrogênio. Além disso, esses microrganismos possuem uma capacidade de induzir o
crescimento dos vegetais pela produção de fitormônios, tais como: auxinas, citocininas e
giberelinas. Em resposta a essa indução temos um melhor stand inicial, plantas mais
vigorosas, maior crescimento do sistema radicular, que por consequência aumenta a
resistência ao déficit hídrico e melhor absorção de nutrientes, e também uma maior
tolerância ao ataque de patógenos.
Os reguladores são uma mistura compostas por reguladores vegetais (hormônios
sintéticos) e substâncias nutritivas, que em quantidades adequadas têm como finalidade
modificar e influenciar de forma positiva tanto a morfologia quanto a fisiologia das
plantas.
Como cultura agronômica de maior representatividade na produção de grãos do
país, a utilização de ambas as tecnologias, isoladas ou em conjunto, em plantas de soja será
10
discutido no presente trabalho em dois capítulos. No capítulo I será abordado doses e
formas de aplicação de A. brasilense. No capítulo II o foco do estudo é a associação do
microrganismo anteriormente citado, com diferentes doses de regulador vegetal comercial.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMARO, A. C. E. Efeitos fisiológicos de fungicidas no desenvolvimento de plantas de
pepino japonês enxertadas e não enxertadas, cultivadas em ambiente protegido.
Dissertação de Mestrado – Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2011.
APEL, K.; HIRT, H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal
transduction. Annual Review of Plant Biology, Gray, v. 55, n. 123, p. 373-399, 2004.
ASADA, K. The water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation
of excess photons. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,
Gray, v. 50, n. 118, p. 601-39, 1999.
BASHAN, Y.; BUSTILLOS, J.J.; LEYVA, L.A.; HERNANDEZ, J.-P.; BA- CILIO, M.
Increase in auxiliary photoprotective photosynthetic pigments in wheat seedlings induced
by Azospirillum brasilense. Biology and Fertility of Soils, v.42, p.279-285, 2006.
BASHAN, Y.; HOLGUIN, G. Azospirillum – plant relationships: environ- mental and
physiological advances (1990-1996). Canadian Journal of Microbiology, v.43, p.103121, 1997.
BASHAN, Y.; HOLGUIN, G.; DE-BASHAN, L.E. Azospirillum-plant relations
physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003).
Canadian Journal of Microbiology, v.50, p.521-577, 2004.
BERG, J.M., TYMOCZKO, J.L. & STRYER, L. Bioquímica. 5.ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2004.
BLOKHINA, O.; VIROLAINEN, E.; FAGERSTEDT, K.V. Antioxidants, oxidative
damage and oxygen deprivation stress: a review. Annals of Botany, London, v. 91, n. 2, p.
179-194, 2003.
BOR, M.; ÖZDEMIR, F.; TÜRKAN, I. The effect of salt stress on lipid peroxidation and
antioxidants in leaves of sugar beet Beta vulgaris L. and wild beet Beta maritima L. Plant
Science, Limerick, v.164, p.77-84, 2003.
CAMPOS, De M. F. Efeitos de reguladores vegetais no desenvolvimento de plantas de
soja (Glycine max (L.) Merrill). Tese de Doutorado – Universidade Estadual Paulista,
Botucatu, 2005.
11
CASTRO, P.R.C.; VIEIRA, E.L. Aplicação de Reguladores Vegetais na Agricultura
Tropical. 2001, 131p.
CASTRO, P.R.E.; VIEIRA, E.L. Ação de bioestimulante na cultura do feijoeiro. Feijão
irrigado: tecnologia e produtividade. Piracicaba, 2003. 28 p.
CHIVARRIA, G.; MELLO, N. Bactérias do gênero Azospirillum e sua relação com
gramíneas.
Plantio
Direto,
2011.
Disponível
em:
<http://www.plantiodireto.com.br/?body=cont_int&id=1075>. Acesso em: 04 fev. 2014.
CONAB
(Companhia
Nacional
de
Abastecimento).
<http://www.conab.gov.br> Acesso em: 06 jan. 2016.
Disponível
em:
CORREA, O.S.; ROMERO, A.M.; SORIA, M.A.; DE ESTRADA, M. Azospirillum
brasilense-plant genotype interactions modify tomato response to bacterial diseases, and
root and foliar microbial communities. In: CASSÁN, F.D.; GARCIA DE SALAMONE, I.
(Ed.) Azospirillum sp.: cell physiology, plant interactions and agronomic research in
Argentina. Argentina: Asociación Argentina de Microbiologia, 2008. p.87-95.
DENIS, L.; MORTON, M. S.; GRIFFITHS, K. Diet and its preventive role in prostatic
disease. European Urology, v. 35, n. 5/6, p. 377 - 87,1999.
DIEHL, S. R. L. Soja (Glicine max). In: Coordenadoria de Assistência Técnica Integral.
Manual técnico das culturas. 2. ed. Campinas: Graça D'Auria, 1997. v. 1. p. 457 - 517.
DOBBELAERE, S.; CROONRNBORGHS, A.; THYS, A.; PTACEK, D.;
VANDERLEYDEN, J.; DUTTO, P.; LABANDERA-GONZALEZ, C.; CA- BALLEROMELLADO, J.; AGUIRRE, J.F.; KAPULNIK, Y.; BRENER, S.; BURDMAN, S.;
KADOURI, D.; SARIG, S.; OKON, Y. Responses of agronomically important crops to
inoculation with Azospirillum. Australian Journal of Plant Physiology, v.28, p.871-879,
2001.
DÖBEREINER, J.; PEDROSA, F.O. Nitrogen-fixing bacteria in nonleguminous crop
plants. Science Tech, Springer Verlag, Madison, USA, p. 1-155, 1987.
DONATE-CORREA, J.; LEON-BARRIOS, M.; PEREZ-GALDONA, R. Screening for
plant growth-promoting rhizobacteria in Chamaecytisus proliferus (tagasaste), a forage
tree-shrub legume endemic to the Canary Islands. Plant and Soil, v. 266, p. 261-272,
2004.
DOUDICAN, N.A., SONG, B., SHADEL, G.S., DOETSCH, P.W. Oxidative DNA
damage causes mitochondrial genomic instability in Saccharomyces cerevisiae. Molecular
and Cellular Biology, Washington, v. 25, p. 5196-204, 2005.
EMBRAPA SOJA. Recomendações técnicas para a cultura da soja do Paraná. Ed.
1999/2000. Londrina: Embrapa soja, 1999. 236 p.
EZAKI, H.; WATANABE, R.; ONOZAKI, H.; KAWAKISHI, S.; OSAWA, T. Formation
12
mechanism for potent antioxidative β-dihidroxyisoflavones in soybean fermented with
(Aspergillus saitoi). Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. v. 63, n. 5, p. 851 -58,
1999.
FANCELLI, A. L. Boas práticas para o uso eficiente de fertilizantes na cultura de milho.
IPNI Informações Agronômicas, n.131. Piracicaba, 2010. 24p.
FAO. FAOSFAT - Agricultural statistics database. Rome: World Agricultural
Information Centre, 2014. Disponível em: <http://faostat.fao.org>. Acesso em: 09 fev.
2016.
FIGUEIREDO, M. do V. B.; BURITY, H. A.; OLIVEIRA, J. de P.; SANTOS, C. E. de R.
e S.; STAMFORD, N. P. Biotecnologia aplicada à agricultura: textos de apoio e
protocolos experimentais. Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica; Recife:
Instituto Agronômico de Pernambuco, 2010.
FOYER, C.H., NOCTOR, G. Oxidant and antioxidant signalling in plants: a reevaluation
of the concept of oxidative stress in a physiological context. Plant, Cell & Environment,
v. 28, p. 1056-71, 2005.
HAN, J.; SUN, L.; DONG, X.; CAI, Z.; SUN, X.; YANG, H.; WANG, Y.; SONG, W.
Characterization of a novel plant growth-promoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis
HR4 both as a diazotroph and a potential biocontrol agent against various pathogens.
Systematic and Applied Microbiology, v. 28, p. 66-76, 2005.
HERNANDEZ, J.A.; FERRER, M.A.; JIMENEZ, A.; BARCELO, A.R.; SEVILLA, F.
Antioxidant systems and O2 / H2O2 production in the apoplast of pea leaves. Its relation
with salt-induced necrotic lesions in minor veins. Plant Physiology, Minneapolis, v. 127,
p. 827-831, 2001.
HIRAKURI, M. H. Evolução e perspectiva de desempenho econômico associados com
a produção de soja nos contextos mundial e brasileiro. Londrina: Embrapa Soja, 2011.
HUERGO, L.F.; MONTEIRO, R.A.; BONATTO, A.C.; RIGO, L.U.; STE- FFENS,
M.B.R.; CRUZ, L.M.; CHUBATSU, L.S.; SOUZA, E.M.; PE- DROSA, F.O. Regulation
of nitrogen fixation in Azospirillum brasilense. In: CASSÁN, F.D.; GARCIA DE
SALAMONE, I. Azospirillum sp.: cell physiology, plant interactions and agronomic
research in Argentina. Asociación Argentina de Microbiologia, Argentina, 2008. p.17-35.
HUNGRIA, M. Inoculação com Azospirillum brasiliense: inovação em rendimento a
baixo custo. Londrina: Embrapa Soja, 2011. 36p.
HUNGRIA, M.; CAMPO, R.J.; MENDES, I.C. A importância do processo de fixação
biológica do nitrogênio para a cultura da soja: componente essencial para a
competitividade do produto brasileiro. Londrina: Embrapa Soja, 2007. 80p.
HUNGRIA, M.; NOGUEIRA, M.A.; ARAUJO, R.S. Co-inoculation of soybeans and
common beans with rhizobia and azospirilla: strategies to improve sustainability. Biology
13
and Fertility of Soils, 2013.
INZÉ, D.; VAN MONTAGU, M., Oxidative stress in plants. Current Opinion in
Biotechnology, Maryland Heights, v. 6, p. 153-158, 1995.
JALEEL, C.A.; KISHOREKUMAR, A.; MANIVANNAN, P.; SANKAR, B.;
GOMATHINAYAGAM, M.; GOPI, R.; SOMASUNDARAM, R.; PANNEERSELVAM,
R. Alterations in carbohydrate metabolism and enhancement in tuber production in white
yam (Dioscorea rotundata Poir.) under triadimefon and hexaconazole applications. Plant
Growth Regulation, Dordrecht, v. 53, p. 7-16, 2007.
LAMAS, F.M. Reguladores de Crescimento. In: EMBRAPA AGROPECUÁRIA
OESTE. Algodão: tecnologia de producao, Dourados, 2001. 296 p.
LEITE, V.M; ROSOLEM, C.A.; RODRIGUES, J.D. Giberelina e citocinina no
crescimento da soja, Scientia Agricola. Piracicaba, v. 60, n. 3, p. 537-541, 2003.
MACEDO, A.C. Efeitos fisiológicos de fungicidas no desenvolvimento de plantas de
melão rendilhado, cultivadas em ambiente protegido. Dissertação de Mestrado Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2012.
MILLÉO, M. V. R. Avaliação da eficiência agronômica do produto Stimulate®
aplicado no tratamento de sementes e em pulverização foliar sobre a cultura da soja
(Glycine max L.). Relatório Técnico. Ponta Grossa: Universidade Estadual de Ponta
Grossa, 2000. 18p.
MOLLER, I.M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH
turnover, and metabolism of reactive oxygen species. Annual Review of Plant Physiology
and Plant Molecular Biology, Palo Alto, v. 52, p. 561-91, 2001.
MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e bioquímica do solo. 2ed.
Lavras: UFLA, 2006.
OCEPAR - ORGANIZAÇÃO DAS COOPERATIVAS DO ESTADO DO PARANÁ.
Recomendações técnicas para a cultura da soja do Paraná. Ed. 1994/95. Cascavel:
Ocepar/Embrapa, 1994. 140 p.
OKON, Y.; LABANDERA-GONZÁLEZ, C. A. Agronomic applications of Azospirillum:
An evaluation of 20 years of worldwide field inoculation. Soil Biology and Biochemistry,
v. 26, p. 1591–1601, 1994.
PAROUSSI, G.; VOYIATZIS, D.G.; PAROUSSIS, E.; DROGOUDI, P.D. Growth,
flowering and yield responses to GA3 of strawberry grown under different environmental
conditions. Scientia Horticulturae, New York, v. 96, p. 103-113, 2002.
RAMOS, A. R. P. Produtos de efeitos fisiológicos no desenvolvimento de plantas de
tomate ‘giuliana’, na produção e pós-colheita de frutos. Tese de Doutorado Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2013.
14
RENWICK, A. R.; CAMPBELL, R.; COE, S. Assessment of in vivo screening systems for
potential biocontrol agents of Gaeumannomyces graminis. Plant Pathology, v. 40, p. 524532, 1991.
RICHARDSON, A.D.; AIKENS, M.; BERLYN, G.P.; MARSHALL, P. Drought stress
and paper birch (Betula papyrufera) seedlings: effects of na organic bioestimulant on plant
health and stress tolerance, and detection of stress effects with instrument-based, non
invasive methods. Journal of Arboriculture, Illinois, v. 30, p. 52-61, 2004.
RODRÍGUEZ, H.; FRAGA, R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant
growth promotion. Biotechnology Advances, v. 17, p. 319-339, 1999.
SCANDALIOS, J.G. Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals
triggering antioxidant gene defenses. Brazilian Journal of Medical and Biological
Research, Ribeirão Preto, v. 38, n. 7, p. 995-1014, 2005.
SCANDALIOS, J.G. Oxygen stress and superoxide dismutases. Plant Physiology,
Minneapolis, v. 101, p. 7-12, 1993.
SIEGEL, B.Z. Plant peroxidases: an organism perspective. Plant Growth Regulation,
Dordrecht, v. 12, p. 303-312, 1993.
SIRTOLI, L.F. Fisiologia do pepineiro japonês, com e sem enxertia, tratado com
fungicida boscalida. Tese de Doutorado - Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2010.
SORG, O. Oxidative stress: a theoretical model or a biological reality? Comptes Rendus
Biologies, Maryland Heights, v. 327, p. 649-662, 2004.
TARRAND, J.J.; KRIEG, N R.; DÖBEREINER, J. A taxonomic study of the Spirillum
lipoferum group, with descriptions of a new genus, Azospirillum gen. nov. and two species,
Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb. nov. and Azospirillum brasilense sp. nov.
Canadian Journal of Microbiology, v.24, p.967-980, 1978.
THÉROND, P., BONNEFONT-ROUSSELOT, D., DAVIT-SPRAUL, A., CONTI, M.,
LEGRAND, A. Biomarkers of oxidative stress: an analytical approach. Current Opinion in
Clinical Nutrition and Metabolic Care, Brussels, v. 3, p. 373-84, 2000.
TIEN, T.M.; GASKINS, M.H.; HUBBELL, D.H. Plant growth substances produced by
Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennisetum
americanum L.). Applied and Environmental Microbiology, v.37, p.1016-1024, 1979.
VAN BREUSEGEM; F., VRANOVÁ, E., DAT, J.F., INZÉ, D. The role of active oxygen
species in plant signal transduction. Plant Science, Limerick, v. 161, p. 405-14, 2001.
VANDE BROEK, A.; VANDERLEYDEN,L. Rewiew: genetics of Azospirrilum-plant root
association. Critical Rewiew in Plant Science, v.14, p. 445-466, 1995.
15
VIEIRA, E.L.; CASTRO, P.R.C. Ação de Stimulate no desenvolvimento inicial de
plantas de algodoeiro (Gossypium hirsutum L.). Piracicaba: USP, Departamento de
Ciências Biológicas, 2002.
16
6. CAPÍTULO I – MÉTODOS DE INOCULAÇÃO DE Azospirillum brasilense NA
CULTURA DA SOJA
METHODS OF Azospirillum brasilense INOCULATION IN SOYBEAN CROP
RESUMO
A crescente demanda pelos produtos derivados da soja torna necessária a busca por
tecnologias alternativas que incrementem a produção e a qualidade dos grãos. A utilização
de bactérias promotoras do crescimento de plantas tem sido estudada ao longo dos anos
pelo mundo todo. Bactérias no gênero Azospirillum, possuem capacidade de fixar N2 e
induzir as plantas na produção de hormônios vegetais. Usualmente a inoculação desses
microrganismos é realizada em tratamento de sementes, porém estudos revelam que sua
aplicação em sulco de semeadura também é eficaz. Este trabalho teve como objetivo
avaliar a eficiência do A. brasilense em plantas de soja, sob três diferentes formas de
aplicação. O experimento foi conduzido na área experimental da Universidade Estadual do
Centro-Oeste, no município de Guarapuava, PR. Os tratamentos consistiram na inoculação
de Azospirillum brasilense em sementes nas doses de 2,0 e 4,0 mL kg-1, em sulco de
semeadura e foliar (estágio V4), nas doses de 200, 400 e 600 mL ha-1. O delineamento
experimental foi em blocos ao acaso com 11 tratamentos e 4 repetições. Avaliaram-se as
trocas gasosas, teores de macro e micronutrientes foliares, produtividade, massa de mil
grãos e clorofila em índice SPAD. Os dados foram submetidos à análise de variância e as
médias comparadas pelo teste de Tukey a 1 e 5% de probabilidade. Verificou-se que a
presença da bactéria apresentou boas taxas nas trocas gasosas, incrementos no acúmulo
foliar de N, P e S, e a dose de 400 mL ha-1 via foliar mostrou um aumento expressivo da
produtividade quando comparada ao controle absoluto. Sendo assim, conclui-se que a
aplicação deste microrganismo na cultura da soja pode ser eficaz, mas ainda é necessário
mais estudos do caso, devido à inconstância dos resultados nos trabalhos com esta bactéria.
Palavras-chave: Glycine max L., sulco de semeadura, via foliar, bactéria promotora do
crescimento de plantas.
17
ABSTRACT
The growing demand for products derived from soybean makes necessary the search for
alternative technologies that increase the production and quality of grain. The use of plant
growth promoter bacteria has been studied over the years worldwide. Bacterias of the
genus Azospirillum, have the ability to fix N2 and induce plants in the production of plant
hormones. Usually the inoculation of these microorganisms is carried out in seed treatment
but studies show that its application in furrow is also effective. This study aimed to
evaluate the efficiency of A. brasilense in soybean plants under three different methods of
application. The experiment was conducted in the experimental area of the Universidade
Estadual do Centro-Oeste, in Guarapuava, PR. The treatments consisted of Azospirillum
brasilense inoculation in seed at rates of 2.0 and 4.0 mL kg-1, furrow and foliar (V4 stage)
at doses of 200, 400 and 600 mL ha-1. The experimental design was a randomized block
with 11 treatments and 4 replications. Evaluated the gas exchange, macro and
micronutrients foliar levels, productivity, thousand grain weight and SPAD index. The data
were submitted to analysis of variance and means compared by Tukey test at 1 and 5%
probability. It was found that the presence of the bacteria showed good gas exchanges
rates, increases in leaf accumulation of N, P and S. In the dose of 400 mL ha-1 foliar
showed increase in productivity when compared to absolute control. Therefore, it is
concluded that the application of this microorganism in soybeans can be effective, but it
still needs more study of the case, due to the variability of results when working with this
bacteria.
Keywords: Glycine max L., furrow, foliar, plant growth promoting bacteria.
18
6.1 INTRODUÇÃO
Com o crescente aumento da competitividade do mercado do complexo soja, faz-se
necessário a busca por tecnologias alternativas que sejam economicamente viáveis
apresentem boas respostas produtivas. Dentre essas tecnologias inovadoras está a
inoculação de microrganismos capazes de promover o crescimento das plantas.
Este seleto grupo de microrganismos do solo e benéfico às plantas são assim
conhecidos por uma associação capaz de gerar diversos processos biológicos
(CHAPARRO et al., 2012). Esses processos incluem a indução na produção de
fitormônios, tais como auxinas (TIEN et al., 1979; ASHRAF et al., 2011), giberelinas
(BOTTINI et al. 1989), citocininas (TIEN et al., 1979; STRZELCZYK et al., 1994) e
etileno (STRZELCZYK et al., 1994). Além disso, também promovem a indução de
resistência a doenças, estresses ambientais (WANG et al., 2009) e fixação biológica do
nitrogênio (DÖBEREINER & PEDROSA 1987; ASHRAF et al., 2011).
Entre esses microrganismos estão as bactérias do gênero Azospirillum, sendo estas
muito estudadas por sua eficiente associação com as gramíneas. Contudo, estudos recentes
revelam boas respostas para a produção de grãos quando inoculadas em sementes ou em
sulco de semeadura na cultura da soja (HUNGRIA et al., 2013).
Após décadas de pesquisas com essas bactérias a adoção dessa tecnologia nos
sistemas agrícolas ainda é incipiente. Isso pode estar relacionada a inconsistência dos
resultados de pesquisa, que podem variar de acordo com a cultivar, condições
edafoclimáticas e metodologia de condução da pesquisa (REPKE, 2013).
Por isso, o presente trabalho objetivou avaliar a eficiência da inoculação do
Azospirillum brasilense na cultura da soja em três formas de aplicação, sendo elas:
tratamento de sementes, sulco de semeadura e foliar, na região centro-sul do Estado do
Paraná.
6.2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido na área experimental da Universidade Estadual do
Centro – Oeste (UNICENTRO), Campus CEDETEG, situada no município de
19
Guarapuava, PR, durante a safra agrícola de 2013/2014. Com localização geográfica nas
coordenadas de latitude 25° 23’ 36’’ S e longitude 51° 27’ 19’’ W, de altitude estimada em
1025m.
Segundo o proposto por Köppen, o clima da região foi classificado como Cfb
(subtropical mesotérmico úmido), sem estação seca e com verões frescos (IAPAR, 2011).
Para este período, safra agrícola de verão, a temperatura média máxima foi de 24,5 ºC e a
média mínima de 14,39 ºC, com precipitação de aproximadamente 1590,40 mm. Dados
pluviométricos do início ao fim do experimento estão no APÊNDICE I.
Segundo a classificação proposta pela Embrapa (2006), o solo desta área se adequa
as características do Latossolo Bruno distroférrico típico. Previamente a instalação do
experimento foi realizado coleta de solos nas profundidades de 0 à 10 cm e de 10 à 20 cm,
para análise química, cujos resultados contam na APÊNDICE II.
As sementes foram tratadas com produto comercial contendo Piraclostrobina,
MetilTiofananato, Fipronil, Estrobilurinas, Benzimidazol e Pirazol na dose de 1,56 mL kg1
semente. Foi inoculado 2 mL kg-1 semente de inoculante líquido comercial, contendo 7,0
x 109 UFC de Bradyrhizobium japonicum das estirpes SEMIA 5079 e SEMIA 5080, exceto
para o tratamento do controle absoluto. Entre as aplicações as sementes foram secas em
temperatura ambiente a sombra.
Com delineamento experimental em blocos inteiramente casualizados, os
tratamentos realizados encontram-se na Tabela 1, o qual consistiu da inoculação da
bactéria Azospirillum brasilense das estirpes Abv5 e Abv6 encontradas em inoculante
líquido comercial na concentração de 2,0 x 108 UFC mL-1 em diferentes doses e formas de
inoculação.
Os tratos culturais foram realizados à medida que necessários, seguindo produtos
comerciais e doses específicos para a cultura. Quando necessário, as pulverizações foliares
foram realizadas utilizando pulverizador costal contendo pontas de pulverização de jato
leve (leque), espaçadas em 0,40 m, com pressão de trabalho de 30 lb pol-2, resultando num
volume de calda de 200 L ha-1.
A semeadura, mecanizada, foi realizada no dia 17/12/2013, em sistema de
semeadura direta, utilizando a cultivar NA 5909 RG, com unidade experimental
constituída de 4 linhas de 5 m, espaçadas em 0,40 m, totalizando 8 m2 por parcela. Como
área útil foi utilizada as duas linhas centrais, descartando-se 0,5 m de cada extremidade,
20
totalizando 3,2 m2. A densidade de plantio foi ajustada para uma população de 350.000
plantas ha-1, com adubação de base de 200 kg ha-1 do formulado N-P-K, 08-20-20.
Tabela 1. Diferentes formas de aplicação e doses de inoculante comercial contendo
Azospirillum brasilense, em soja utilizada no experimento conduzido durante a safra
agrícola 2013/2014 em Guarapuava, PR.
Tratamento
Doses de inoculante
1. Tratamento em sementes (TS 2)
2,0 mL kg-1
2. Tratamento em sementes (TS 4)
4,0 mL kg-1
3. Sulco de semeadura (Sulco 200)
200 mL ha-1
4. Sulco de semeadura (Sulco 400)
400 mL ha-1
5. Sulco de semeadura (Sulco 600)
600 mL ha-1
6. Via foliar*1 (Foliar 200)
200 mL ha-1
7. Via foliar*1 (Foliar 400)
400 mL ha-1
1
8. Via foliar* (Foliar 600)
600 mL ha-1
9. Controle com rizóbio (Cont. Inoc)
-----10. Controle com fertilizante nitrogenado*2 (Cont. Nitro)
-----11. Controle absoluto (Cont. Abs)
-----*1 As pulverizações foliares foram realizadas com pulverizador costal contendo pontas de pulverização de
jato leve (leque), espaçadas em 0,40 m, com pressão de trabalho de 30 lb pol -2, resultando num volume de
calda de 200 L ha-1, quando as plantas encontravam-se em estádio V4 (FEHR & CAVINESS, 1977).
*2 150 kg ha-1 de nitrogênio em forma de uréia, parcelado em duas doses, sendo 50% em estádio V4 e 50%
em R1 (FEHR & CAVINESS, 1977).
O teor SPAD, foi medido na data de 05/02/2014, sendo escolhido três plantas na
área útil de cada parcela e delas foram feitas duas leitura em um dos folíolos da última
folha totalmente expandida do ramo principal. Essa análise ocorreu com o uso do
clorofilômetro portátil do modelo Falker CFL 1030 no médoto SPAD (unidade de medida
adimensional). Neste aparelho as unidades de mensuração são estimadas pela leitura
diferencial da quantidade de luz transmitida pela folha em três regiões de comprimento de
onda (635, 660 e 880 nm) (FALKER, 2008).
Para as mensurações das trocas gasosas, na data de 07/02/2014, utilizando-se um
equipamento de sistema aberto de fotossíntese com analisador de CO2 e vapor d’água
através de radiação infravermelha (Infra Red Gas Analyser – IRGA, LI-6400XT, LI-COR,
Inc., Lincoln, NE, USA), procedeu-se às aferições das respectivas variáveis, no estádio de
desenvolvimento R2 (FEHR & CAVINESS, 1977) adotando-se, como critério, leitura em
um dos folíolos da última folha totalmente expandida, no ápice do ramo principal.
As caracteriscias das trocas gasosas analisadas foram: taxa de assimilação de CO2
(A, μmol m-2s-1), transpiração (E, mmol de H2O m-2s-1) e condutância estomática (gs, mol
m-2s-1). Essas medidas foram calculadas pelo programa de análise de dados do
21
equipamento estimador de fotossíntese, que utiliza a equação geral de trocas gasosas de
Von Caemmerer & Farquhar (1981).
A partir destes dados, foram quantificadas a eficiência do uso de água [(EUA, μmol
m-2s-1) (mmol H2O m-2s-1)-1], determinada através da relação entre a assimilação de CO2 e a
taxa de transpiração, e a eficiência instantânea da carboxilação [(EiC, μmol m-2s-1 ) (μmol
mol-1)-1], que foi determinada através da relação entre a taxa de assimilação de CO2 e a
concentração intercelular de CO2 na folha.
Na data de 10/02/2014, período em qual as plantas encontravam-se no estádio de
crescimento R2 (FEHR & CAVINESS, 1977), foram coletadas 15 folhas aleatórias de cada
parcela, sendo essas as terceiras folhas completamente expandidas no ramo principal, para
extração dos teores dos macro e micronutrientes foliares. Seguiu-se a metodologia descrita
pela Embrapa (SILVA, 2009).
O experimento foi colhido em 19/04/2014, período de maturidade fisiológica das
plantas. Foram coletadas todas as plantas presentes na área útil de cada parcela. Após a
trilhar as vagens, foi efetuada a massa de grãos por parcela e com a pesagem de 300 grãos
estimou-se a massa de mil grãos. O peso foi convertido para 13% de umidade e a massa de
grãos por parcela foi convertida para kg ha-1.
Após a realização de todas as avaliações, os dados foram submetidos à análise de
variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 1% e 5% de probabilidade,
utilizando o programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2008).
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A partir dos resultados obtidos na análise de variância (Tabela 2), pode-se observar
que a produtividade de grãos, as concentrações foliares de nitrogênio, fósforo e enxofre
foram influenciados pela inoculação com A. brasilense.
22
Tabela 2. Quadrados médios para a produtividade (kg ha-1), massa de mil grãos
((MMG) (g)), índice spad (SPAD), nitrogênio foliar ((N) (g kg-1)), fósforo foliar ((P) (g kg1
)), potássio foliar ((K) (g kg-1)), enxofre foliar ((S) (g kg-1)), cálcio foliar ((Ca) (g kg-1)),
cobre foliar ((Cu) mg kg-1)), manganês foliar ((Mn) mg kg-1)), ferro foliar ((Fe) mg kg-1)) e
zinco foliar ((Zn) mg kg-1)), em função da inoculação de Azospirillum brasilense na cultura
da soja. Guarapuava, PR, 2016.
Fator de variação
GL
3
Bloco
10
Tratamento
30
Erro
CV %
Média
Continuação Tabela 1.
Fator de variação
GL
Bloco
Tratamento
Erro
CV %
Média
3
10
30
Produtividade
MMG
SPAD
96944,39 ns
159514,51 *
65174,9
6,49
3933,02
26,12 ns
9,05 ns
17,28
2,7
153,74
1,81 ns
2,34 ns
3,51
4,46
42,04
Macronutrientes
N
P
K
2,02 ns 0,056 ns 8,09 ns
30,33 ** 0,27 *
3,99 ns
7,39
0,12
4,78
4,46
13,87
7,45
60,94
2,47
29,34
Cu
3,66 ns
4,78 ns
4,48
20,58
10,28
Micronutrientes
Mn
Fe
Zn
49,92 ns 64,09 ns 13,29 ns
13,75 ns 44,91 ns 21,37 ns
21,47
52,86
18,21
13,02
10,9
10,78
35,58
66,7
39,58
Macronutrientes
S
Ca
2,21 ns
1,77 ns
7,06 *
0,19 ns
2,73
0,26
29,46
6,29
5,06
8,05
CV coeficiente de variação. GL graus de liberdade. **significativo ao nível de 1% de probabilidade (p <
0,01), *significativo ao nível de 5% de probabilidade (p < 0,05).
A Figura 1 representa os resultados obtidos nas trocas gasosas das folhas. A
coinoculação do Azospirillum brasilense e Bradyrhizobium japonicum, independente da
forma de aplicação, não obteve valores superiores à inoculação padrão (somente B.
japonicum) em nenhum dos parâmetros.
23
Figura 1. Taxa de assimilação de CO2 (A, μmol CO2 m-2s-1), condutância
estomática (gs, mol H2O m-2s-1), transpiração (E, mmol H2O m-2s-1), eficiência do uso da
água ((EUA, (μmol CO2 (mmol H2O)) e eficiência instantânea de carboxilação ((EiC,
(μmol m-2s-1) (μmol mol-1)-1)) em folhas de plantas de soja cultivadas em campo na safra
agrícola de 2013/2014, inoculadas com Azospirillum brasilense, Guarapuava, PR, 2016.
Para Flexas et al. (2006), valores de condutância estomática entre 0,05 a 0,10 mol
H2O m-2 s-1, a fotossíntese fica limitada pela restrição da difusão do CO2, revelando assim
um estado de estresse das plantas. Com isso pode-se observar que não houve condições de
estresse, pois os valores de condutância variaram entre 0,32 a 0,47 mol H2O m-2 s-1.
A taxa de assimilação de CO2 está diretamente ligada ao processo fotossintético
(Taiz & Zeiger, 2013) e segundo Flexas et al. (2008), durante a fotossíntese, o CO2 se
24
move da atmosfera ao redor da folha para a cavidade interna subestomática pelo estômato,
e de lá para o sítio de carboxilação dentro do estroma do cloroplasto através do mesofilo
foliar.
A transpiração foliar é essencial para dissipar o excesso de energia absorvida pelas
folhas, e a redução da disponibilidade de água limita o controle da temperatura no dossel
da planta (Zhu et al., 2010).
Baixas taxas de condutância estomática, por consequência, levam a quedas na
transpiração, pois segundo Jadoski et al. (2005), a condutância estomática refere-se ao
mecanismo fisiológico das plantas que controla a transpiração.
Figura 2. Produtividade (kg ha-1) de soja inoculada com Azospirillum brasilense,
para a safra agrícola de 2013/2014. Guarapuava, PR, 2016. Médias seguidas da mesma
letra não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
De acordo com a Figura 2, a produção de grãos de soja com uso de inoculante
contendo A. brasilense, via foliar na dose de 400 mL ha-1, foi superior em 632,24 kg ha-1
quando comparado ao controle absoluto, o que corrobora com Hungria et al. (2013), pois
em um experimento conduzido em plantas de soja, encontraram um incremento de 475 e
418 kg ha-1 na produtividade, quando coinocularam Bradyhizobium japonicum e
Azospirillum brasilense. Entretanto, Bárbaro et al. (2009) encontrou uma relação de
25
neutralidade aos inocular A. brasilense também em plantas de soja.
Hungria et al. (2013) concluiu que a inoculação de Azospirillum em sulco de
semeadura para feijoeiro promoveu um incremento de produtividade quando comparado
com a inoculação padrão, entretando a Figura 2 revela que não houve diferenças para a
inoculação padrão em comparação com a em sulco.
Ainda não houveram diferenças na produtividade quando comparados a
coinoculação com a inoculação padrão, resultados que divergem de Burdmann et al.
(2000), onde cita que em vários ensaios a campo com A. brasilense, verificaram-se
incrementos nos rendimentos das leguminosas com a inoculação mista, obtendo-se valores
superiores aos obtidos com somente a inoculação com Bradyrhizobium. Okon &
Vanderleyden (1997) reforçam o citado acima, reportando efeitos positivos para diversos
tipos de leguminosas inoculadas com Azospirillum.
Estes efeitos podem ser devido a diversos mecanismos, entre eles, uma antecipação
na FBN dos nódulos, incremento na massa seca dos nódulos (DASHTI et al., 1998;
SINGH & RAO, 1979), promoção na ocorrência de nodulação heteróloga através do
aumento da formação de pêlos radiculares e raízes secundárias – aumento nos sítios de
infecção (SRINIVASAN et al., 1997).
Segundo Oliveira et al. (2003) estes efeitos promovidos pela coinoculação de BPCP
e rizóbios, parecem estar sobre a influência de sinais específicos entre os genótipos
bacterianos envolvidos e o genótipo da planta hospedeira.
A literatura reporta que bactérias denominadas de BPCP, como o A. brasilense
pode atuar nas relações entre rizóbios e leguminosas, promovendo incrementos no
crescimento vegetal e no rendimento de grãos, no nitrogênio total biologicamente fixado,
além de melhorias no aproveitamento do nitrogênio obtido pela planta através da simbiose
com rizóbios (BÁRBARO, 2009).
Os valores de nitrogênio acumulados nas folhas (Tabela 3), para os tratamentos em
sementes, a dose de 200 mL ha-1 em sulco de semeadura, a dose de 400 mL ha-1 via foliar e
o controle com fertilizante nitrogenado, obtiveram valores superiores ao controle absoluto.
Estes dados corroboram com um experimento de coinoculação com B. japonicum e A.
brasilense em soja e feijão conduzido por Hungria et al. (2013), onde encontraram
diferenças significativas no teor de N foliar para os tratamentos que continham ambos
micro-organismos para as duas leguminosas.
26
Tabela 3. Quantidade de macronutrientes ((nitrogênio (N), fósforo (P) e enxofre
(S), em g kg-1)) acumulados em folhas de soja inoculada com Azospirillum brasilense, para
a safra agrícola de 2013/2014. Guarapuava, PR, 2016.
N**
P*
Tratamento
S*
g kg-1
TS 2
62,49 a
2,42 ab
6,11 ab
TS 4
63,55 a
2,55 ab
5,74 ab
Sulco 200
64,23 a
2,38 ab
7,14 ab
Sulco 400
61,89 ab
2,68 ab
7,58 a
Sulco 600
58,41 ab
2,39 ab
6,21 ab
Foliar 200
61,98 ab
2,99 a
5,82 ab
Foliar 400
62,32 a
2,72 ab
6,60 ab
Foliar 600
58,55 ab
2,48 ab
4,75 ab
Cont. Inoc
58,64 ab
2,13 b
3,50 b
Cont. Nitro
62,91 a
2,27 ab
4,19 ab
Cont. Abs
55,41 b
2,14 b
4,00 ab
Média
60,94
2,47
5,6
Médias seguidas da mesma letra minúscula nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey, ** ao nível
de 1% de probabilidade e * ao nível de 5% de probabilidade.
Na Tabela 3 é possível observar que para os teores de fósforo foliar, a dose de 200
mL ha-1 inoculado via foliar foi superior ao tratamento padrão, mostrando que para essas
condições a presença do Azospirillum aumentou o acúmulo desde nutriente. Fato que pode
ser explicado por Rodríguez & Fraga (1999), pois citam que algumas BPCP têm a
capacidade de solubilizar nutrientes do solo.
O tratamento com a dose de 400 mL ha-1 via sulco de semeadura apresentou teores
foliares de enxofre (Tabela 3) 116,4% superior ao tratamento com inoculação padrão
(somente Bradyrhizobium japonicum).
BPCP podem produzir uma variedade de fitormônios, este mecanismo ainda não
está completamente compreendido e altas concentrações desses hormônios, tais como o
etileno, ou ainda outros compostos, podem influenciar negativamente no desenvolvimento
27
dos vegetais (MARTÍNEZ-VIVEROS et al., 2010; BHATTACHARYYA & JHA, 2012).
6.4 CONCLUSÃO
A presença de ambas as bactérias influenciaram positivamente nos parâmetros
avaliados para as trocas gasosas.
A dose de 400 mL ha-1 via foliar obteve uma maior produção de grãos, superior em
632,24 kg ha-1.
O uso do inoculante aumentou o acúmulo de N e S foliares.
Alguns resultados ainda são inconclusivos, por isso faz-se necessário um novo
estudo para esclarecimento.
6.5 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
ASHRAF, M. A.; RASOOL, M.; MIRZA, M. S. Nitrogen fixation and indole acetic acid
production potential of bacteria isolated from rhizosphere of sugarcane (Saccharum
officinarum L.). Advances in Biological Regulation, p. 348–355, 2011.
BÁRBARO, I.M.; MACHADO, P. C.; BÁRBARO JUNIOR, L. S.; TICELLI, M.;
MIGUEL, F. B.; SILVA, J. A. A. Produtividade da soja em resposta à inoculação padrão e
co-inoculação. Colloquium Agrariae, p. 1–7, 2009.
BHATTACHARYYA, P. N.; JHA, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR):
emergence in agriculture. World Journal of Microbiology and Biotechnology, p. 1327–
1350, 2012.
BOTTINI. R.; FULCHIERI, M.; PEARCE, D.; PHARIS, R. Identification of gibberelins
A1, A3, and iso-A3 in cultures of A. lipoferum. Plant Physiology, p. 45–47, 1989.
BURDMANN, S.; HAMAOUI, B.; OKON, Y. Improvement of legume crop yields by
coinoculation with Azospirillum and Rhizobium. The Otto Warburg Center for
Agricultural Biotechnology. Israel: The Hebrew University of Jerusalem, 2000.
CHAPARRO, J. M.; SHEFLIN, A. M.; MANTER, D. K.; VIVANCO, J. M. Manipulating
the soil microbiome to increase soil health and plant fertility. Biology and Fertility of
Soils, p. 489–499, 2012.
DASHTI, N. et al. Plant growth promotion rhizobacteria accelerate nodulation and increase
nitrogen fixation activity by field grown soybean. [Glycine max (L.) Merr.] under short
season conditions. Plant and Soil The Hague, v. 200, p. 205-213, 1998.
28
DÖBEREINER, J.; PEDROSA, F. O. Nitrogen-fixing bacteria in nonleguminous crop
plants. Springer, Madison, 1987.
EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA – EMBRAPA. Sistema
brasileiro de classificação de solos. 2ed. Rio de Janeiro: 2006. 306p.
FALKER AUTOMAÇÃO AGRÍCOLA Ltda. Manual do medidor eletrônico de clorofila
(ClorofiLOG/ CFL 1030). Porto Alegre: Falker Automação Agrícola, 2008. 33p.
FEHR, W. R.; CAVINESS, C. E. Stages of soybean development. Ames: Iowa State
University of Science and Technology, 1977. 11p. (Special Report, 80).
FERREIRA, D.F. SISVAR: um programa para análises e ensino de estatística. Revista
Symposium, v.6, p.36-41, 2008.
FLEXAS, J.; BOTA, J.; GALMÉS, J.; MEDRANO, H.; RIBAS-CARBÓ, M. Keeping a
positive balance under adverse conditions: responses of photosynthesis and respiration to
water stress. Physiologia Plantarum, 2006.
FLEXAS, J.; RIBAS-CARBÓ, M.; DIAZ-ESPEJO, A.; GALMÉS, J.; MEDRANO, H.
Mesophyll conductance to CO2: current knowledge and future prospects. Plant, Cell and
Environment, 2008.
HUNGRIA, M.; NOGUEIRA, M. A.; ARAUJO, R.S. Co-inoculation of soybeans and
common beans with rhizobia and azospirilla: strategies to improve sustainability. Biology
and Fertility of Soils, 2013.
INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ – IAPAR. Cartas climáticas do Paraná.
Online. Disponível em: <http://www.iapar.br/modules/conteudo/conteudo.php?conteudo
=863>. Acesso em: 27 jan. 2014.
JADOSKI, S. O.; KLAR, A. E.; SALVADOR, E. D. Relações hídricas e fisiológicas em
plantas de pimentão ao longo de um dia. Ambiência, v. 1, n. 1, p. 11-19, 2005.
MARTÍNEZ-VIVEROS, O.; JORQUERA, M. A.; CROWLEY, D. E.; GAJARDO, G.;
MORA, M. L. Mechanisms and practical considerations involved in plant growth
promotion by rhizobacteria. Journal of Soil Science and Plant Nutrition, p. 293–319,
2010.
OKON, Y; VANDERLEYDEN, J. Root associatied Azospirillum species can stimulate
plants. ASM News, v. 63, n. 7, p. 364-370, 1997.
OLIVEIRA, A. L. M.; URQUIAGA, S.; BALDANI, J. I. Processos e mecanismos
envolvidos na influência de microorganismos sobre o crescimento vegetal. Seropédica:
Embrapa Agrobiologia. 2003. 40p. (Embrapa Agrobiologia. Documentos, 161).
PIRES, E.J.P. Emprego de reguladores de crescimento em viticultura tropical. Informe
Agropecuário, Belo Horizonte, v.19, n.194, p.34-39, 1998.
29
REPKE, R. A. Eficiência da Azospirillum brasilense na fixação de nitrogênio em milho.
Dissertação de Mestrado – Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2013.
RODRÍGUEZ, H.; FRAGA, R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant
growth promotion. Biotechnology Advances, v. 17, p. 319-339, 1999.
SILVA, F. C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. 2 ed.
Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica, 2009. 627 p.
SINGH, C. S.; RAO, N. S. S. Associative effect of Azospirillum brasilense with Rhizobium
japonicum on nodulation and yield of soybean (Glycine max). Plant and Soil, Dordrecht,
v. 53, n. 3, p. 387-392, 1979.
SRINISAVAN, M.; PETERSEN, D. J.; HOLL, F. B. Nodulation of Phaseolus vulgaris by
Rhizobium etli is enhanced by the presence of Bacillus. Canadian Journal of
Microbiology, Ottawa, v. 43, n. 1, p. 1-8, 1997.
STRZELCZYK, E.; KAMPER, M.; LI, C. Cytocinin-like-substances and ethylene
production by Azospirillum in media with different carbono sources. Microbiological
Research, p. 55–60, 1994.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 5 ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. 954p.
TIEN, T. M.; GASKINS, M. H.; HUBBELL, D. H. Plant growth substances produced by
Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennisetum
americanum L.). Applied Environmental Microbiology, p. 1016–1024, 1979.
VON CAEMMERER, S.; FARQUHAR, G.D. Some relationships between the
biochemistry of photosynthesis and the gas exchange of leaves. Planta, v.153, n.4, p. 376387, 1981.
WANG, S.; HUIJUN, W.; JUNQING, Q.; LINGLI, M.; JUN, L.; YANFEI, X.; XUEWEN,
G. Molecular mechanism of plant growth promotion and induced systemic resistance to
tobacco mosaic virus by Bacillus spp. Journal of Microbiology and Biotechnology, p.
1250–1258, 2009.
ZHU, X. G.; LONG, S.P.; ORT, D.R. Improving photosynthetic efficiency for greater
yield. Annual Review of Plant Biology, 2010.
30
7. CAPÍTULO II – INOCULAÇÃO DE Azospirillum brasilense ASSOCIADO A
NÍVEIS CRESCENTES DE REGULADOR VEGETAL NA CULTURA DA SOJA
INOCULATION OF Azospirillum brasilense ASSOCIATED WITH GROWING
LEVELS OF PLANT GROWTH REGULATOR IN SOYBEAN CROP
RESUMO
Os reguladores vegetais são hormônios sintéticos vegetais que promovem ou
modificam a morfologia e fisiologia das plantas. O Azospirillum brasilense é um microorganismo classificado como bactérias promotoras do crescimento de plantas, devido a sua
capacidade de fixar N2 e por induzir as plantas na produção de fitormônios. Este estudo
objetivou avaliar a ação do A. brasilense associado a níveis crescentes do regulador vegetal
Stimulate®. O experimento foi conduzido na área experimental da Universidade Estadual
do Centro-Oeste, no município de Guarapuava, PR. Os tratamentos consistiram na
aplicação de Stimulate® em sementes, nas doses de 0; 2,5; 5,0 e 7,5 mL kg-1, associado ou
não a inoculação de Azospirillum brasilense na dose de 3,0 mL kg-1 sementes de inoculante
liquido comercial contendo as estirpes Abv5 e Abv6. O delineamento experimental foi
blocos ao acaso com 8 tratamentos e 4 repetições. Avaliaram-se as trocas gasosas, teores
de macro e micronutrientes foliares, produtividade, massa de mil grãos, clorofila em índice
SPAD e atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POX) e
peroxidação de lipídeos (PL), em 5 épocas: 09, 19, 29, 39 e 49 dias após o plantio (DAP).
Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de
Tukey e análise de regressão para verificar o comportamento das variáveis, em função das
doses do produto, a 1, 5 e 10% de probabilidade. Verificou-se que a associação do
regulador com a bactéria, apresentou melhorias nas trocas gasosas. Revelou também,
influência na atividade da SOD, POX, PL, acúmulo foliar de N, Ca, Zn, Mn e Cu. Deste
modo, conclui-se que a aplicação de ambos podem influenciar positivamente nos fatores
testados.
Palavras-chave: Glycine max L., enzimas antioxidantes, nutrição, produção.
31
ABSTRACT
The plant regulators are a synthetic plant hormones that promote or modify the
morphology and physiology of plants. The microorganism Azospirillum brasilense is a
bacteria classified as plant growth promoter, due to its ability to fix N2 and to induce the
production of phytohormones. This study aimed to evaluate the action of A. brasilense
associated or not with increasing levels of plant growth regulator Stimulate®. This trial
was conducted in the experimental area of the Universidade Estadual do Centro-Oeste, in
Guarapuava, PR. The treatments consisted of applying Stimulate® in seeds, at rates of 0,
2.5, 5.0 and 7.5 mL kg-1, with or without the inoculation of Azospirillum brasilense in
seeds at a dose of 3.0 mL kg-1 from a commercial liquid inoculant containing Abv5 and
Abv6 strains. The experimental design was a randomized block with 8 treatments and 4
replications. Evaluated the gas exchange, macro and micronutrients foliar levels,
productivity, thousand grain weight, chlorophyll in SPAD index and activity of superoxide
dismutase (SOD), peroxidase (POX) and lipid peroxidation (PL) in 5 periods: 09, 19, 29,
39 and 49 days after planting (DAP). The data were submitted to analysis of variance and
means compared by Tukey test and regression analysis to verify the behavior of the
variables, depending on the doses of the product at 1, 5 and 10% probability. It has been
found that the combination of plant growth regulator with the microorganism, showed
improvements in gas exchanges. Also showed influence on the activity of SOD, POX, PL,
foliar accumulation of N, Ca, Zn, Mn and Cu. Thus, it is concluded that the application of
both can positively influence in the factors tested.
Keywords: Glycine max L., antioxidant enzymes, nutrition, production.
32
7.1 INTRODUÇÃO
Como principal commodity agrícola brasileira, a soja tem grande expressão
internacional, deixando o país em segundo colocado no ranque mundial, com uma
produção estimada em 96.243,3 mil de toneladas na safra de 2014/2015, sendo superado
apenas pelos Estados Unidos (FAO, 2014; CONAB, 2016).
Para atender ao crescente mercado de comercialização dos grãos de soja, há uma
necessidade de aumento quantitativo e qualitativo, para isso há a necessidade de estudo de
tecnologias que busquem esses objetivos. A inoculação com bactérias promotoras do
crescimento de plantas e a utilização de reguladores são grandes exemplos.
Os reguladores vegetais são substâncias sintéticas que, aplicadas exógenamente,
possuem ações similares aos grupos de reguladores vegetais conhecidos (citocininas,
giberelinas, auxinas, ácido abscísico e etileno) (VIEIRA & CASTRO, 2002). Para Vieira e
Castro (2003), estas possuem a capacidade de incrementar a produção com possíveis
melhorias na qualidade, através da inibição, promoção ou modificação dos processos
morfológicos e fisiológicos nos vegetais.
As giberelinas determinam importantes alterações fisiológicas nas plantas, como o
retardamento da senescência, a abscisão, a quebra de dormência de gemas e a manutenção
da dominância apical (COLL et al., 2001; DAVIES, 2004). Com aplicação exógena há
uma melhoria na coloração verde das folhas (TAIZ & ZEIGER, 2013).
As citocininas promovem o retardamento da senescência foliar. Quando folhas
isoladas são tratadas com cinetina, esta aparentemente impede a ação das proteases e
RNAases da folha, promotoras da senescência (CASTRO, 2015), mantendo assim boas
taxas de clorofila.
O gênero de bactérias dos Azospirillum, são classificados como bactérias
diazotróficas, por fixarem N2 (HAN et al., 2005) e além disso, são promotoras do
crescimento de plantas, devido a indução na produção dos hormônios vegetais (VANDE
BROEK & VANDERLEYDEN, 1995). Em alguns casos, foram relados, também, a
indução de resistência a patógenos (RENWICK et al., 1991) e estresses ambientais.
As taxas metabólicas das plantas são influenciadas pelas condições ambientais; elas
determinam as taxas e proporções da fotossíntese e da respiração (perdas e ganhos no
balanço das trocas gasosas) e, eventualmente, a produtividade biológica e econômica
33
dessas plantas e a fotossíntese líquida é um indicador da taxa de assimilação do carbono
(POPOV et al., 2003). Vale ressaltar que, em estudos visando ganhos de produtividade, é
importante buscar informações sobre a assimilação de CO2, assim como, sobre a eficiência
do uso da água durante esse processo (BRANDÃO FILHO et al., 2003).
Os níveis das atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT) e peroxidase (POX) tem aumentado com o uso de reguladores (ZHANG &
SCHMIDT, 1999; ZHANG & ERVIN, 2004), além do melhoramento da eficiência
fotoquímica das plantas (RHICHARDSON et al., 2004).
Os benefícios promovidos por estas substâncias têm sido pesquisados com a
finalidade de resolver problemas do sistema de produção e melhorar qualitativa e
quantitativamente a produtividade (CASTRO & VIEIRA, 2003).
Deste modo, o objetivo desde trabalho foi estudar os efeitos da inoculação de
Azospirillum brasilense, associados ou não a regulador vegetal nas trocas gasosas,
atividade bioquímica, produtividade, teor de clorofila e nutrição de plantas de soja (Glycine
max (L.) Merrill) na região centro-sul do Estado do Paraná.
7.2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido na área experimental da Universidade Estadual do
Centro – Oeste (UNICENTRO), Campus CEDETEG, situada no município de
Guarapuava, PR, durante a safra agrícola de 2013/2014. Com localização geográfica nas
coordenadas de latitude 25° 23’ 36’’ S e longitude 51° 27’ 19’’ W, de altitude estimada em
1025m.
Segundo o proposto por Köppen, o clima da região foi classificado como Cfb
(subtropical mesotérmico úmido), sem estação seca e com verões frescos (IAPAR, 2011).
Para este período, safra agrícola de verão, a temperatura média máxima foi de 24,5 ºC e a
média mínima de 14,39 ºC, com precipitação de aproximadamente 1590,40 mm. Dados
pluviométricos do início ao fim do experimento estão no APÊNDICE I.
Segundo a classificação proposta pela Embrapa (2006), o solo desta área se adequa
as características do Latossolo Bruno distroférrico típico. Previamente a instalação do
34
experimento foi realizado coleta de solos nas profundidades de 0 à 10 cm e de 10 à 20 cm,
para análise química, cujos resultados constam no APÊNDICE II.
As sementes foram tratadas com Carbensazim e Tiram, e Fipronil na dose de 2mL
kg-1 semente para ambos. Foi inoculado 2mL kg-1 semente de inoculante líquido comercial,
contendo 7,0 x 109 UFC de Bradyrhizobium japonicum das estirpes SEMIA 5079 e
SEMIA 5080. Entre as aplicações as sementes foram secas em temperatura ambiente na
sombra.
Com delineamento experimental em blocos ao acaso em esquema fatorial 2x4,
sendo presença e ausência do inoculante com 4 doses do regulador crescimento vegetal, os
tratamentos realizados encontram-se na Tabela 4, os quais consistiram na inoculação da
bactéria Azospirillum brasilense das estirpes Abv5 e Abv6 encontradas em inoculante
líquido comercial na concentração de 2,0 x 108 UFC mL-1 e o regulador vegetal utilizado
foi produto comercial Stimulate®, contendo as concentrações de 0,005% do ácido indolilbutírico, 0,009% de cinetina e 0,005% de ácido giberélico.
Tabela 4. Doses de regulador vegetal associado ou não à Azospirillum brasilense,
em sementes de soja utilizadas no experimento conduzido durante a safra agrícola
2013/2014 em Guarapuava, PR.
Doses
Tratamento
(mL kg-1 semente)
1. A. brasilense (3mL kg-1 semente) + Stimulate®
0
2. A. brasilense (3mL kg-1 semente) + Stimulate®
2,5
3. A. brasilense (3mL kg-1 semente) + Stimulate®
5
-1
4. A. brasilense (3mL kg semente) + Stimulate
®
7,5
5. Stimulate®
0
6. Stimulate®
2,5
7. Stimulate
®
5
8. Stimulate
®
7,5
Os tratos culturais foram realizados à medida que necessários, seguindo produtos
comerciais e doses específicos para a cultura. Quando necessário, as pulverizações foliares
foram realizadas utilizando pulverizador costal contendo pontas de pulverização de jato
leve (leque), espaçadas em 0,40 m, com pressão de trabalho de 30 lb pol-2, resultando num
volume de calda de 200 L ha-1.
35
A semeadura, mecanizada, foi realizada no dia 17/12/2013, em sistema de
semeadura direta, utilizando a cultivar NA 5909 RG, com unidade experimental
constituída de 4 linhas de 5 m, espaçadas em 0,40 m, totalizando 8 m2 por parcela. Como
área útil foi utilizada as duas linhas centrais, descartando-se 0,5 m de cada extremidade,
totalizando 3,2 m2. A densidade de plantio foi ajustada para uma população de 350.000
plantas ha-1, com adubação de base de 200 kg ha-1 do formulado N-P-K, 08-20-20.
O teor SPAD, foi medido na data de 05/02/2014, sendo escolhido três plantas na
área útil de cada parcela e delas foram feitas duas leitura em um dos folíolos da última
folha totalmente expandida do ramo principal. Essa análise ocorreu com o uso do
clorofilômetro portátil do modelo Falker CFL 1030 no médoto SPAD (unidade de medida
adimensional). Neste aparelho as unidades de mensuração são estimadas pela leitura
diferencial da quantidade de luz transmitida pela folha em três regiões de comprimento de
onda (635, 660 e 880 nm) (FALKER, 2008).
Para as mensurações das trocas gasosas, na data de 07/02/2014, utilizando-se um
equipamento de sistema aberto de fotossíntese com analisador de CO2 e vapor d’água
através de radiação infravermelha (Infra Red Gas Analyser – IRGA, LI-6400XT, LI-COR,
Inc., Lincoln, NE, USA), procedeu-se às aferições das respectivas variáveis, no estádio de
desenvolvimento R2 (FEHR & CAVINESS, 1977) adotando-se, como critério, leitura em
um dos folíolos da última folha totalmente expandida, no ápice do ramo principal.
As caracteriscias das trocas gasosas analisadas foram: taxa de assimilação de CO2
(A, μmol m-2s-1), transpiração (E, mmol de H2O m-2s-1) e condutância estomática (gs, mol
m-2s-1). Essas medidas foram calculadas pelo programa de análise de dados do
equipamento estimador de fotossíntese, que utiliza a equação geral de trocas gasosas de
Von Caemmerer & Farquhar (1981).
A partir destes dados, foram quantificadas a eficiência do uso de água [(EUA, μmol
m-2s-1) (mmol H2O m-2s-1)-1], determinada através da relação entre a assimilação de CO2 e a
taxa de transpiração, e a eficiência instantânea da carboxilação [(EiC, μmol m-2s-1 ) (μmol
mol-1)-1], que foi determinada através da relação entre a taxa de assimilação de CO2 e a
concentração intercelular de CO2 na folha.
Na data de 10/02/2014, período em qual as plantas encontravam-se no estádio de
crescimento R2 (FEHR & CAVINESS, 1977), foram coletadas 15 folhas aleatórias de cada
parcela, sendo essas as terceiras folhas completamente expandidas no ramo principal, para
36
extração dos teores dos macro e micronutrientes foliares. Seguiu-se a metodologia descrita
pela Embrapa (SILVA, 2009).
O experimento foi colhido em 19/04/2014, período de maturidade fisiológica das
plantas. Foram coletadas todas as plantas presentes na área útil de cada parcela. Após a
trilhar as vagens, foi efetuada a massa de grãos por parcela e com a pesagem de 300 grãos
estimou-se a massa de mil grãos. O peso foi convertido para 13% de umidade e a massa de
grãos por parcela foi convertida para kg ha-1.
Para as análises bioquímicas foram coletadas amostras de dois discos de folha com
18 mm de diâmetro aos 09, 19, 29, 39 e 49 dias após plantio (DAP). Durante o
procedimento, cada amostra coletada foi imediatamente acondicionada em envelopes de
papel alumínio e congelada com nitrogênio líquido.
A partir desses discos de folha congelados foram obtidos os extratos, em
procedimento no qual consistiu em que as amostras de folhas foram homogeneizadas
mecanicamente em 2 mL de tampão fosfato de potássio 0,01 M (pH 7,0) (tampão de
extração), em almofariz de porcelana. O homogenato foi centrifugado a 13.500 g durante
30 min a 4º C, sendo o sobrenadante obtido considerado como extrato enzimático, para
posterior determinação da atividade das enzimas e conteúdo proteico.
A determinação da atividade das peroxidases (POX) foi determinada a 30º C em
espectrofotômetro a 470 nm. A mistura da solução consistiu de 2,9 mL de solução
contendo 250 μL de guaiacol e 306 μL de peróxido de hidrogênio em 100 mL de tampão
fosfato de potássio 0,01 M (pH 6,0) e 100 μL de extrato enzimático (LUSSO &
PASCHOLATI, 1999). A atividade de peroxidases foi expressa em absorbância min-1 mg-1
de proteína.
A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi dada pela capacidade da enzima em
inibir a fotorredução do azul de nitroblutetrazólio (NBT) na presença de luz
(GIANNOPOLITIS & RIES, 1977). A reação foi feita em um volume final de 3,0 mL de
meio de reação e 20 µL de extrato enzimático e leitura em espectrofotômetro a 560 nm. O
meio de reação constituiu da solução de tampão fosfato de potássio (TFK) 52,5 mM em pH
7,8, EDTA 0,1 µM, NBT 0,075 mM, metionina 13 mM e riboflavina 2 µM.
A peroxidação lipídica foi avaliada através da produção de metabólitos reativos a
ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), principalmente malondialdeído (MDA) (BUEGE & AUST,
1978; HEATH & PACKER, 1968). Os resultados estão expressos em conteúdo de MDA,
37
usando um coeficiente de extinção de 155 mM cm–1. Para a reação foi utilizado 0,250 mg
de folha macerada com 5 mL de ácido tricloroacético (0,1%) contendo aproximadamente
20%
PVPP
(polivinilpolipirrolidona),
sem
nitrogênio
líquido.
Após
perfeita
homogeneização foi para centrifugação a 13.500 g por 5 minutos, com posterior adição de
1 mL de ácido tricloroacético (20%, contendo 0,5% de ácido tiobarbitúrico) em 0,5 mL do
sobrenadante a mistura mantendo por 30 minutos a 95 ºC. O material foi passado
novamente em centrifuga a 13.500 g por 10 minutos e as leituras foram realizadas em
espectrofotômetro a 535 e 600 nm. As determinações das concentrações de MDA,
expressas em mMol MDA g MF-1 foram adquiridas a partir da seguinte fórmula:
MDA = C x 1000 mg
mg 1g
Para o teor de proteínas totais, foi utilizado o método proposto por Bradford (1976).
A concentração de proteínas, expressa em termos equivalentes de μg de albumina de soro
bovino (ASB) em 1,0 mL de amostra (μg proteína mL-1), foi determinada utilizando-se
curva padrão de concentrações de ASB.
Após a realização de todas as avaliações, os dados foram submetidos à análise de
variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey e análise de regressão para
verificar o comportamento das variáveis, em função das doses do produto, a 1, 5 e 10% de
probabilidade, utilizando o programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2008).
7.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Interações significativas entre os tratamentos com inoculação de Azospirillum
brasilense e regulador ocorreram para acúmulo foliar de nitrogênio, cálcio, zinco,
manganês e cobre, para atividade da superóxido dismutase (SOD) aos 9, 19 e 39 dias após
o plantio (DAP), peroxidase (POX) aos 19 DAP e peroxidação de lipídeos (PL) aos 29 e 49
DAP (Tabela 5).
Ainda para a mesma tabela, nos tratamentos com aplicação de regulador, houve
diferenças significativas para teor foliar de potássio, atividade da SOD aos 49 DAP e da
POX aos 9 DAP.
38
Tabela 5. Quadrados médios para a produtividade (kg ha-1), massa de mil grãos
((MMG) (g)), índice spad (SPAD), nitrogênio foliar ((N) (g kg-1)), fósforo foliar ((P) (g kg1
)), potássio foliar ((K) (g kg-1)), enxofre foliar ((S) (g kg-1)), cálcio foliar ((Ca) (g kg-1)),
cobre foliar ((Cu) mg kg-1)), manganês foliar ((Mn) mg kg-1)), ferro foliar ((Fe) mg kg-1)),
zinco foliar ((Zn) mg kg-1)), superóxido dismutase, peroxidase e peroxidaçao de lipídeos
aos 9, 19, 29, 39 e 49 dias após plantio (DAP) (unidades mg-1 proteína) em função da
inoculação de Azospirillum brasilense e regulador vegetal na cultura da soja. Guarapuava,
PR, 2016.
Fator de
Variação
GL
3
Bloco
3
Azospirillum (A)
3
Reg. Vegetal (B)
3
AxB
21
Erro
CV %
Média
Continuação Tabela 5.
Fator de
Variação
GL
3
Bloco
3
Azospirillum (A)
3
Reg. Vegetal (B)
3
AxB
21
Erro
CV %
Média
Continuação Tabela 5.
Fator de Variação
GL
Bloco
Azospirillum (A)
Reg. vegetal (B)
AxB
Erro
CV %
Média
3
3
3
3
21
Produtividade
MMG
SPAD
491,25 ns
18624,5 ns
63276,75 ns
73244,42 ns
75741,44
6,88
3999,25
9,12 ns
5,99 ns
8,68 ns
23,98 ns
22,78
3,06
156,22
2,92 ns
1,32 ns
0,41 ns
4,47 ns
2,73
4,09
40,39
Macronutrientes
S
Ca
1,77 ns
0,31 ns
0,32 ns
7,61 **
0,51 ns
3,74 **
0,56 ns
2,59 *
0,66
0,54
32,57
9,44
2,5
7,78
9 DAP
1253,89 *
860,5 ns
498,44 ns
1009,64 º
350,47
37,14
50,4
Macronutrientes
N
P
K
15,92 ns 0,43 ns 11,78 ns
6,13 ns 0,14 ns 21,17 *
13,3 ns 0,07 ns 20,18 *
27,45 * 0,58 ns 9,17 ns
7,25
0,23
4,8
4,25
20,5
14,24
62,76
2,31
15,39
Micronutrientes
Cu
Mn
Fe
Zn
3,11 ns 22,03 ns 10,59 ns 32,42 ns
10,76 º 45,82 ns 392,21 ns 17,7 ns
2,04 ns 85,42 ** 274,12 ns 55,31 ns
19,02 ** 96,1 ** 187,94 ns 101,23 *
3,63
25,49
138,59
30,12
17,48
12,61
16,45
13,44
10,91
40,03
71,57
40,85
Superóxido Dismutase
19 DAP
29 DAP
219,79 ns
298,54 *
1753,5 *
0,11 ns
1617,55 **
120,31 ns
1868,65 **
24,21 ns
325,57
92,86
41,24
28,7
43,75
33,57
39 DAP
49 DAP
274,39 ns 99,55 ns
99,62 ns
8,31 ns
353,4 ns 858,45 **
844,53 º 210,22 ns
295,28
119,44
45,66
65,49
37,63
16,69
39
Continuação Tabela 5.
Fator de Variação
GL
3
Bloco
3
Azospirillum (A)
3
Reg. Vegetal (B)
3
AxB
21
Erro
CV %
Média
Continuação Tabela 5.
Fator de Variação
GL
Bloco
Azospirillum (A)
Reg. Vegetal (B)
AxB
Erro
CV %
Média
3
3
3
3
21
9 DAP
0,82 ns
0,9 ns
2,72 º
0,16 ns
0,92
67,52
1,42
Peroxidase
19 DAP
29 DAP
1,27 ns
29,9 ns
45,94 **
2,47 ns
36,93 **
24,54 ns
5,39 **
19,59 ns
0,83
15,49
17,86
47,57
6,18
8,27
39 DAP
0,94 ns
0,25 ns
4,46 ns
0,98 ns
1,93
80,96
1,72
49 DAP
0,16 ns
0,37 ns
0,03 ns
0,13 ns
0,22
70,98
0,65
9 DAP
0,61 *
0,69 ns
0,11 ns
0,44 ns
0,17
17,21
2,59
Peroxidação Lipídica
19 DAP
29 DAP
0,09 ns
4,53 ns
2,91 *
47,4 **
0,89 ns
20,52 **
0,94 ns
15,83 **
0,52
1,68
16,99
38,9
4,06
3,74
39 DAP
2,14 **
0,05 ns
0,34 ns
0,52 ns
0,38
12,55
5,14
49 DAP
3,91 ns
0,36 ns
4,43 ns
10,37 **
1,72
16,6
8,7
CV coeficiente de variação. GL graus de liberdade. **significativo ao nível de 1% de probabilidade (p <
0,01), *significativo ao nível de 5% de probabilidade (p < 0,05), ºsignificativo ao nível de 10% de
probabilidade (p < 0,1).
Na Tabela 5, a inoculação da bactéria mostrou diferenças para o acúmulo foliar de
potássio e atividade da PL aos 19 DAP.
A taxa de assimilação de CO2 foi superior no tratamento com inoculação do
Azospirillum na dose de 0 mL kg-1. O uso dos reguladores promoveram um incremento
nesse parâmetro na dose de 7,5 mL kg-1.
Larcher (2006), explica que mesmo as altas assimilações de CO2 não são sinônimos
de maior crescimento e acúmulo de carboidratos pelos vegetais, pois dependem não
somente da quantidade de dióxido de carbono, mas do balanço hormonal e do padrão
específico de cada planta.
De acordo com a Figura 3, o tratamento inoculado associado à dose de 2,5 mL kg-1
apresentou uma maior condutância estomática, contudo esse fato se inverte na dose de 5,0
mL kg-1, onde o não inoculado apresentou-se superior.
As maiores médias na taxa de assimilação de CO2 e condutância estomática em
presença da inoculação podem ser explicadas em função da indução hormonal promovida
40
por estes micro-organismos, pois ambos os fatores podem estar associadas à presenca das
citocininas, as quais estão envolvidas na abertura estomática e na síntese de proteínas da
enzima Rubisco (SALISBURY & ROSS, 1994; DAVIES, 2004; TAIZ & ZEIGER, 2013).
Ainda na mesma figura, para a variável transpiração, na dose de 2,5 mL kg-1 a
presença do A. brasilense mostrou-se superior para esse tratamento, e também para as
demais doses inoculadas com o micro-organismo. Taiz & Zeiger (2013) também relatam
que mudanças na resistência estomática são importantes para a regulação da perda de água
pelas plantas e para o controle da taxa de absorção de CO2, necessária à fotossíntese.
Segundo Jadoski et al. (2005), a condutância estomática refere-se ao mecanismo
fisiológico das plantas que controla a transpiração, fato que corrobora com a interação
entre os tratamentos na dose de 2,5 mL kg-1.
Em um experimento conduzido com plantas submetidas à extresse hídrico, Isoda
(2005) afirma que há uma correlação positiva entre a transpiração, condutância estomática
e taxa de assimilação de CO2 para plantas de soja, contudo, este resultado não foi
encontrado neste trabalho.
Na eficiência do uso da água, a utilização do micro-organismo nas doses de 0 e 5
mL kg-1, influenciou de forma positiva (Figura 3).
A eficiência instantânea de carboxilação, também conhecida como eficiência da
rubisco, foi influenciada pela bactéria, pois na dose 0 mL kg-1 o tratamento inoculado
apresentou superioridade (Figura 3). Dados que podem ser correlacionados com o
resultado encontrado para a taxa de assimilação de CO2. Para Taiz & Zeiger (2013), a
capacidade fotossintética da planta depende de reações bioquímicas e da capacidade do
tecido foliar para a assimilação fotossintética de CO2 que depende, em grande parte, do
conteúdo da enzima ribulose difosfato carboxilase (Rubisco).
Em folhas de soja da cultivar BRS 245 RR, Fioreze et al. (2013) encontraram
valores para assimilação de CO2 variando entre 9,0 a 11,0 μmol m-2 s-1, para transpiração
entre 5,7 a 6,9 mmol H2O m-2 s-1 e condutância estomática entre 0,3 a 0,5 μmol CO2 m-2 s-1,
diferenças que podem estar associadas a capacidade de resposta de cada cultivar
(LARCHER, 2006).
41
Figura 3. Taxa de assimilação de CO2 (A, μmol CO2 m-2s-1), condutância
estomática (gs, mol H2O m-2s-1), transpiração (E, mmol H2O m-2s-1), eficiência do uso da
água ((EUA -A/E, μmol CO2 (mmol H2O)) e eficiência instantânea de carboxilação ((EiC,
(μmol m-2s-1) (μmol mol-1)-1)) em folhas de plantas de soja cultivadas em campo na safra
agrícola de 2013/2014, inoculadas com Azospirillum brasilense e regulador vegetal,
Guarapuava, PR, 2016.
Conduzindo um experimento com estresse hídrico, Flexas et al. (2006), concluíram
que para valores de condutância estomática entre 0,05 – 0,10 mol H2O m-2 s-1, a
fotossíntese fica limitada pela restrição da difusão do CO2, e que valores abaixo dessa faixa
provocam um prejuízo foto e bioquímico, pois a fotossíntese acaba sendo indiretamente
42
limitada pelo extresse oxidativo, o que de fato não ocorreu com essas plantas, pois a média
de condutância ficou entre 0,3 e 0,56 mol H2O m-2 s-1 (Figura 3).
Tabela 6. Atividade média da enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD)
(unidades mg-1 proteína) para a coleta aos 9 dias após o plantio de soja inoculada com
Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava, PR, 2016.
Inoculação de A. brasilense
Doses Reg. Vegetal (mL
kg semente -1)
0
2,5
5
7,5
Média
(mL kg semente -1)
0
3
SOD (unidades SOD mg-1 proteína) º
55,06 a
25,86 b
41,22 a
58,6 a
73,73 a
45,68 b
52,35 a
50,74 a
55,59
45,22
Médias seguidas da mesma letra minúscula nas linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey, º ao nível de
10% de probabilidade.
Na Tabela 6 temos que a inoculação da BPCP em sementes, associada às doses de 0
e 5 mL ha-1, mostraram baixos valores da atividade da SOD aos 9 DAP (Tabela 6). De
acordo com Ramos (2013), esta enzima atua como primeira na linha de defesa a estresses
ambientais, produzindo H2O2, água e substrato para que a ação da POX possa auxiliar no
controle do estresse das plantas.
Anuradha et al. (2010), explica que no metabolismo normal das plantas ocorrem a
produção de EROs, que se intensificam em condições de esresses abióticos, que ativam
mecanismos de defesa. Nayyar & Gupta (2006) complementam afirmando que moléculas
como as de superóxidos, peróxidos e hidroxilas causam danos à célula podendo provocar
uma reação em cadeia.
Por conta dos possíveis danos celulares, a retirada dessas moléculas de EROs é uma
das respostas mais comuns de defesa contra os estresses abióticos e depende do mecanismo
de detoxificação fornecido por um sistema integrado de moléculas não-enzimáticas
reduzidas e de antioxidantes enzimáticos (JALEEL et al., 2008; ANURADHA et al.,
2010).
43
Portanto, pode-se considerar que para esse período de desenvolvimento nestes
tratamentos, essas plantas estavam com níveis de estresse baixos, pois segundo Tgert &
Tevini (2002), as plantas se protegem sintetizando antioxidantes como os caroténoides,
ascorbato, α-tocoferol, glutationa e flavonóides e aumentando o teor de enzimas
antioxidativas como a POX, SOD e CAT.
Na Figura 4A, temos que aos 19 DAP a SOD teve diferenças significativas de sua
atividade, porém sem regressão na ausência do inoculante, mas com um comportamento
linear na interação do A. brasilense com as doses do regulador, revelando que a presença
do microrganismo na dose de 7,5 mL kg-1 uma elevação acentuada na atividade desta
enzima. Contudo, quando as plantas já estavam maiores, aos 39 DAP (Figura 4B), este
mesmo tratamento apresentou uma redução na atividade desta enzima.
44
Figura 4. Atividade média da enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD)
(unidades SOD mg-1 proteína) para a coleta aos 19 (A), 39 (B) e 49 (C) dias após o plantio
(DAP) de soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava,
PR, 2016. **,*,º significativo a 1, 5 e 10% de probabilidade, respectivamente. As barras
referem-se ao erro padrão.
45
Para esse mesmo período, observou-se um comportamento inverso entre as doses
do regulador perante a presença e a ausência da inoculação.
A quinta coleta de dados, aos 49 DAP (Figura 4C), não houve interação
significativa entre a interação, mas o efeito das doses do regulador vegetal apresentou um
efeito quadrático com tendência a redução após a dose de 5 mL kg-1.
Vasconcelos et al. (2009), avaliando a atividade enzimática em plantas de soja e
milho tratadas com 3 diferentes reguladores, não encontrou diferenças estatísticas para
atividade da SOD nenhum dos tratamento com leituras aos 42 e 60 dias após o plantio.
Mecanismos antioxidativos podem promover uma estratégia de aumentar a
tolerância das plantas aos estresses, atuando como uma importante defesa contra a
toxicidade mediada por um radical, protegendo os danos causados pelos radicais livres
(ANURADHA et al., 2010), para que isso ocorra é necessário incluir alguns sistemas
complexos enzimáticos como a catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e peroxidase
(POX) (JALEEL et al., 2008).
A capacidade de manutenção, em níveis elevados, da atividade da SOD, é essencial
para a manutenção do equilíbrio entre a formação e a remoção do H2O2 do ambiente
intracelular (CAKMAK & HORST, 1991).
Os incrementos nos valores de SOD podem proporcionar um aumento na
resistência das plantas quando estas estiverem submetidas a algum tipo de estresse
(ZHANG et al., 2005). Vasconcelos (2006) estudando a aplicação de reguladores vegetais
na cultura do milho, observou um aumento na atividade da SOD nas amostras coletadas
aos 60 dias após semeadura, com a aplicação do produto contendo nutrientes minerais e
compostos orgânicos com a dose 100% maior que a recomendada.
Aos 9 DAP (Figura 5A) a atividade da POX não apresentou significância para a
ainteração dos tratamentos, mas um efeito perante as diferentes doses do regulador com
regressão linear e aos 19 DAP (Figura 5B), houveram interações significativas com
regressões quadráticas.
Segundo Gaspar et al. (1985) e Lima et al. (1999) a formação de peróxidos ocorre
quando as plantas estão sob condições de estresse podendo a atividade da peroxidase ser
utilizada como marcador bioquímico de estresse, indicando mudanças fisiológicas, por
conta disso pode-se dizer que pelo comportamento linear aos 9 DAP (Figura 5A), as
maiores doses do produto utilizado apresentaram uma tendência anti-estresse nas plantas.
46
Figura 5. Atividade média da enzima antioxidante peroxidase (POX) (unidades
POX mg-1 proteína) para a coleta aos 9 (A) e 19 (B) dias após o plantio (DAP) de soja
inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava, PR, 2016. **,*
47
significativo a 1 e 5% de probabilidade, respectivamente. As barras referem-se ao erro
padrão.
Seguindo essa linha, temos que a atividade da POX aos 19 DAP (Figura 5B)
apresentou um comportamento quadrático com tendência a reduzir, na medida que foram
aumentadas as doses.
A POX é do grupo das óxido-redutases, sendo capaz de catalisar um grande número
de reações oxidativas em plantas (FREITAS et al., 2008), ficando localizada,
principalmente, na parede celular ela cataliza a oxidação do substrato utilizando o poder
oxidante do H2O2 ou de peróxidos orgânicos (RAMOS, 2013).
Andersen (1986) afirmou que esta enzima também pode ser usada como uma
marcadora de organogênese e estádios de desenvolvimento, por participar da regulação
endógena de ácido indolilacético (AIA), agindo como AIA oxidase, sistema enzimático
capaz de oxidar o AIA, fato que talvez explique a menor atividade com inoculação aos 19
DAP (Figura 5B), para as doses de 0 e 5 mL kg-1, pois segundo Vande Broek &
Vanderleyden (1995) os Azospirillum são capazes de produzir fitormônios.
Como pode ser observado na Figura 6A, houve interação entre os tratamentos, mas
os tratamentos sem a inoculação naõ apresentaram regressão.
A atividade da PL
apresentou comportamento quadrático aos 29 DAP (Figura 6A). A inoculação do
Azospirillum brasilense reduziu drasticamente nas doses de 5 e 7,5 mL kg-1, apresentando
diferenças de 5,31 e 4,39 mMol MDA g MF-1.
A peroxidação lipídica é indicativo de estresse oxidativo, e este pode ser gerado
pela competição entre as espécies num mesmo sítio, induzindo maior quantidade de
radicais livres que desencadeiam o processo de peroxidação das membranas das células
(Kruse et al., 2006).
48
Figura 6. Atividade média da enzima antioxidante peroxidação de lipídeos (PL)
(mMol MDA g MF-1) para a coleta aos 29 (A) e 49 (B) dias após o plantio (DAP) de soja
inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, Guarapuava, PR, 2016. **,*
significativo a 1 e 5% de probabilidade, respectivamente. As barras referem-se ao erro
padrão.
49
Silva et al. (2014), realizando um experimento em plantas de soja, com aplicação
do herbicida glyphosate para controle de planta daninha resistentes e suscetíveis, encontrou
que em presença da espécie com resistência, a atividade da PL aumenta significativamente
para soja. Em contrapartida, Langaro et al. (2011) dizem que os efeitos de danos celulares,
por meio da peroxidação lipídica, na competição entre as plantas indicaram que a
competição intraespecífica causa maiores danos.
A atividade desta enzima aos 49 DAP (Figura 6B), apresenta comportamento
semelhante aos 29 DAP, pois o tratamento inoculado com a bactéria também tende a
reduzir, em regressão linear, a atividade da PL na medida em que se aumenta as doses do
regulador vegetal, e já o sem a BPCP tendeu ao aumento da atividade enzimática.
Essa tendência em reduzir a atividade da PL nos tratamentos inoculados
apresentados na Figura 6, também é revelado na Tabela 7, onde aos 19 DAP, a atividade
dessa enzima foi menor em 0,6 unidades mg-1 proteínas, do que os tratamentos com a
ausência da mesma. Podendo nos levar a conclusão de que a inoculação do Azospirillum
brasilense em plantas de soja, associadas ou não a reguladores vegetais, minimiza os danos
causados a parede das células pela atividade da peroxidação de lipídeos.
Tabela 7. Médias dos teores de potássio foliar (g kg-1) e da atividade da enzima
antioxidante peroxidação de lipídeos (unidades mg-1 proteína) aos 19 dias após o plantio
(DAP), para plantas de soja inoculada com Azospirillum brasilense na safra agrícola de
2013/2014, Guarapuava, PR, 2016.
Tratamento
Controle
Azospirillum
Média Geral
Peroxidação Lipídeos
(19 DAP) *
Potássio
Foliar *
unidades PL mg-1 proteína
g kg-1
4,56 a
3,96 b
4,26
14,57 b
16,2 a
15,39
Médias seguidas da mesma letra minúscula nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey, * ao nível
de 5% de probabilidade.
De acordo com Mittova et al. (2000), as EROs são causadoras de danos por indução
da PL, o que pode provocar danos ao DNA, proteínas, clorofilas e ainda, de acordo com
Silva et al. (2014), alterar a produção de compostos fenólicos.
50
Plantas sob condições adiversas, a fim de combater o estresse oxidativo,
desenvolvem defesas, através do aumento da atividade de enzimas antioxidantes, como a
superóxido dismutase, para limitar a peroxidação de lipídios produzida pelos radiciais
superóxido (CATANEO et al., 2005).
As respostas no acúmulo de N foliar apresentou regressão linear com a inoculação,
mas não houve regressão para o tratamento sem a bactéria (Figura 7A).
O comportamento das concentrações de nitrogênio foliar teve efeito linear crescente
nas doses para os tratamentos com inoculação da bactéria (Figura 7A), fato que pode estar
associado à capacidade desses micro-organismos em fixar o N2 (HAN et al., 2005) e pelo
crescimento tanto das raízes, como da parte aérea promovido pelos hormônios sintéticos
presentes no produto (VIEIRA & CASTRO, 2003).
A inoculação com Azospirillum nos ensaios conduzidos no Brasil foi relatado não
só o aumento do N foliar, mas também de outros nutrientes, como o P e K, fato também
relatado em outros países (BASHAN & HOLGUIN, 1997; STEENHOUDT &
VANDERLEYDEN, 2000; BASHAN et al., 2004). Em contrapartida, dos elementos
citados, para este estudo, apenas o N e o K sofreram influência da inoculação.
Em seus estudos de diagnose foliar, Malavolta (2006), concluiu que a faixa de
suficiência para os teores foliares N em soja está entre 55 a 58 g kg-1, mas neste estudo, os
teores médios encontrados foram superiores, na faixa de 60,6 a 66,45 g kg-1 (Figura 7).
Hungria et al. (2013) em um experimento de coinoculação, concluiu que a
inoculação de Azospirillum brasilense em sulco de semadura, associado a Bradyrhizobium
japonicum, elevaram os teores de acúmulo de nitrogênio nas folhas de soja e feijão.
Na Figura 7B, o macroelemento Ca apresentou regressões quadráticas para os
tratamentos, com diferenças significativas entre as doses de 0 e 7,5 mL kg-1 sementes do
regulador vegetal.
De acordo com Yan et al. (2006), a sinalização celular em resposta à presença de
espécies reativas de oxigênio tem a participação do cálcio como mensageiro secundário, o
qual ativa enzimas do estresse oxidativo de forma direta ou amplifica o sinal, por meio da
ativação da calmodulina, fenômemo não encontrado neste trabalho, pois os tratamentos
com as maiores quantidades de Ca foliar, inoculados e com 2,5 e 7,5 mL kg-1 do produto
(Figura 7B), apresentaram baixa atividade tanto da POX e PL como para a SOD aos 39
DAP.
51
O tratamento inoculado associado com a dose de 2,5 mL kg-1, apresenta maiores
taxas de transpiração quando comparados com os tratamentos com a dose 0 mL kg-1
(Figura 3). Essa mesma tendência foi encontra para os teores de Ca foliar (Figura 7B), isto
pode ter ocorrido pelo fato deste nutriente se movimentar basicamente em regiões
apoplásticas de tecidos vegetais (WHITE & BROADLEY, 2003), por isso a baixa
vascularização de algumas estruturas (MONDAL et al., 2011), associada à baixa taxa de
transpiração (WHITE & BROADLEY, 2003), resulta em limitações ao fluxo de cálcio,
seja de raízes ou mesmo de folhas.
52
Figura 7. Concentrações foliares (g kg-1) de nitrogênio (A), potássio e cálcio, para
soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, para a safra agrícola de
2013/2014, Guarapuava, PR, 2016. **,* significativo a 1 e 5% de probabilidade,
respectivamente. As barras referem-se ao erro padrão.
53
Sem interação entre os tratamentos, as doses do regulador apresentaram um efeito
quadrático com tendência decrescente para os teores de K (Figura 7C), no qual a dose 0
mL kg-1 apresentou valor inferior as demais doses e a partir da dose de 2,5 mL kg-1, os
valores começaram a declinar.
Foloni & Rosolem (2008) citam Bataglia & Mascarenhas (1977), que verificaram
que as maiores taxas de absorção de potássio ocorrem na fase vegetativa da cultura.
Os resultados para os níveis foliares de zinco apresentaram efeito linear crescente,
sem a inoculação de A. brasilense, já os tratamentos inoculados, apresentaram um efeito
quadrático com redução e posterior elevação do acúmulo deste nutriente (Figura 8A).
Ainda nesta mesma figura, os valores médios deste elemento variaram de 32,46 a
44,52 mg kg-1, resultados que se enquadram no intervalo de suficiência de 20 a 50 mg kg‑1,
para os teores foliares de Zn, no florescimento da soja (TECNOLOGIAS DE PRODUÇÃO
DE SOJA, 2011).
Na Figura 8B, o elemento manganês apresentou interação e comportamento
quadrático com tendência ao aumento e posterior redução em seu acúmulo para todos os
tratamentos.
Stefanello et al. (2011), trabalhando com as cultivares BRS 245 RR e Charrua RR,
observou teores variáveis de manganês foliar, 81,95 mg kg-1 e 163,33 mg kg-1,
respectivamente, valores muito acima do encontrado neste trabalho, pois variaram entre
32,37 a 46,86 mg kg-1 (Figura 8B). Lavres Junior et al. (2008) explica que esta variação
existente na absorção de Mn por diferentes cultivares se deve a diferenças genotípicas
quanto à absorção, transporte ou distribuição do elemento na planta.
Magalhães (2002) explica que em mecanismos enzimáticos envolvendo o extresse
oxidativo, o Mn está no processo bioquímico para oxidação do Mn+2 a Mn+3 in vivo, que
visa uma paralisação dos EROs. Através do sistema de peroxidase, a oxidação enzimática
do manganês do estado divalente ou trivalente. Mecanismo representado na reação abaixo
(HEWITT & NICHOLAS, 1963):
H2O2 + 2 H+ + 2 Mn 2+
2 Mn 3+ + 2 H2O
Íons livres de Mn3+ não apresentam longevidade e são rapidamente reduzidos por
difenóis, catecol, pirogalol, guaiacol e ácido cafeico, voltando ao estado divalente (Mn2+)
(MAGALHÃES, 2002).
54
Entretanto, nenhuma das respostas enzimáticas expostas nas Figuras 4, 5 e 6,
apresentam a mestra tendência comportamental quadrática que o acúmulo foliar de Mn
(Figura 8B).
55
Figura 8. Concentrações foliares (mg kg-1) de zinco (A), manganês (B) e cobre (C),
para soja inoculada com Azospirillum brasilense e regulador vegetal, para a safra agrícola
de 2013/2014, Guarapuava, PR, 2016. **,*,º significativo a 1, 5 e 10% de probabilidade,
respectivamente. As barras referem-se ao erro padrão.
56
Os teores de cobre nos tecidos foliares apresentaram um comportamento
quadrático, mas com efeitos contrários. A presença da BPCP inicialmente reduziu os
valores, com posterior aumento, já em sua ausência, o comportamento foi decrescente
(Figura 8C).
Os valores médios para o acúmulo de Cu foliar variou entre 7,85 a 13,17 mg kg-1
(Figura 8C), valores que vão contra o proposto por Malavolta (2006), pois este autor com a
finalidade de melhor compreensão da diagnose da nutrição foliar de plantas de soja,
estabeleceu que a faixa de suficiência para o Cu é de 12 a 15 mg kg-1. Entretanto, estas
plantas não apresentaram sintomas de deficiência nutricional por falta deste elemento,
portanto essa diferença pode estar relacionada com a capacidade de absorção e acúmulo de
cada cultivar.
7.4 CONCLUSÃO
A inoculação de A. brasilense e o uso de regulares vegetais promoveram melhorias
nos parâmetros avaliados, trocas gasosas, teores de nutrientes foliares e atividade
enzimática.
Contudo, é necessário conduzir mais testes com os produtos para obtenção de
resultados mais precisos.
7.5 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
ANDERSEN, W.C.A. A revised medium for shoot multiplication of Rhododendron.
Journal American Society Horticultural Science, v. 109, p. 343-347, 1986.
ANURADHA, V.E.; JALEEL, C.A.; SALEM, M.A.; GOMATHINAYAGAM, M.;
PANNEERSELVAM, R. Plant growth regulators induced changes in antioxidant potential
and andrographolide content in Andrographis paniculata Wall ex. Nees. Pesticide
Biochemistry and Physiology, v. 98, p. 312-316, 2010.
BASHAN, Y.; HOLGUIN, G. Azospirillum – plant relationships: environmental and
physiological advances (1990-1996). Canadian Journal of Microbiology, v. 43, p. 103121, 1997.
57
BASHAN, Y.; HOLGUIN, G.; DE-BASHAN, L. E. Azospirillum-plant relations
physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003).
Canadian Journal of Microbiology, v. 50, p. 521-577, 2004.
BATAGLIA, O.C. & MASCARENHAS, H.A.A. Absorção de nutrientes pela soja.
Campinas, Instituto Agronômico de Campinas, 36 p., 1977.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
biochemistry, v.72, p.248-254, 1976.
BRANDÃO FILHO, J.U.T.; GOTO, R.; GUIMARÃES, V.F.; HABERMANN, G.;
RODRIGUES, J.D.; CALLEGARI, O. Influência da enxertia nas trocas gasosas de dois
híbridos de berinjela cultivados em ambiente protegido. Horticultura Brasileira, v.21, p.
474-477, 2003.
BUEGE, J. A.; AUST, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology, v.
52, p. 302-310, 1978.
CAKMAK, I.; HORST, J. H. Effects of aluminum on lipid peroxidation, superoxide
dismutase, catalase, and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycine max).
Physiologia Plantarum, v. 83, p. 463- 468, 1991.
CASTRO, P. Revisão sobre hormônios vegetais. Online. Disponível em:
<http://www.scribd.com/doc/3319812/Hormonios-Vegetais>. Acesso em 12 mar. 2015.
CASTRO, P.R.E.; VIEIRA, E.L. Ação de bioestimulante na cultura do feijoeiro. Feijão
irrigado: tecnologia e produtividade. Piracicaba, 2003. 28 p.
CATANEO, A. C.; CHAMMA, K. L.; FERREIRA, C. L.; DÉSTRO, G. F. G.; SOUSA, D.
C. F. Atividade de superóxido dismutase em plantas de soja (Glycine max L.) cultivadas
sob estresse oxidativo causado por herbicida. Revista Brasileira de Herbicidas, v. 4, n. 2,
p. 23-31, 2005.
COLL, J.B.; RODRIGO, G.N.; GARCIA, B.S.; TAMES, R.S. Fisiologia vegetal. Madrid:
Ediciones Piramide, 2001. 662p.
CONAB
(Companhia
Nacional
de
Abastecimento).
<http://www.conab.gov.br> Acesso em: 06 jan. 2016.
Disponível
em:
DAVIES, P. J. Plant hormones and their roles in plant growth and development. New
York: Editor P. J. Davies, 2004, 614p.
EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA – EMBRAPA. Sistema
brasileiro de classificação de solos. 2ed. Rio de Janeiro: 2006. 306p.
FALKER AUTOMAÇÃO AGRÍCOLA Ltda. Manual do medidor eletrônico de clorofila
(ClorofiLOG/ CFL 1030). Porto Alegre: Falker Automação Agrícola, 2008. 33p.
58
FAO. FAOSFAT - Agricultural statistics database. Rome: World Agricultural
Information Centre, 2014. Disponível em: http://faostat.fao.org. Acesso em: 09 fev.
2016.
FEHR, W. R.; CAVINESS, C. E. Stages of soybean development. Ames: Iowa State
University of Science and Technology, 1977. 11p. (Special Report, 80).
FERREIRA, D.F. SISVAR: um programa para análises e ensino de estatística. Revista
Symposium, v.6, p.36-41, 2008.
FIOREZE, S. L.; RODRIGUES, J. D.; CARNEIRO, J. P. C.; SILVA, A. A.; LIMA, M. B.
Fisiologia e produção da soja tratada com cinetina e cálcio sob déficit hídrico e
sombreamente. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.48, n.11, p.1432-1439, 2013.
FLEXAS, J.; BOTA, J.; GALMÉS, J.; MEDRANO, H.; RIBAS-CARBÓ, M. Keeping a
positive balance under adverse conditions: responses of photosynthesis and respiration to
water stress. Physiologia Plantarum, n. 127, p. 343-352, 2006.
FOLONI, J. S. S.; ROSOLEM, C. A. Produtividade e acúmulo de potássio na soja em
função da antecipação da adubação potássica no sistema de plantio direto. Revista
Brasileira de Ciência do Solo, v. 32, p. 1549-1561, 2008.
FREITAS, A.A. DE; FRANCELIN, M.F.; HIRATA, G.F.; CLEMENTE, E.; SCHMIDT,
F.L. Atividades das enzimas peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO) nas uvas das
cultivares Benitaka e Rubi e em seus sucos e geléias. Ciência e Tecnologia de Alimentos,
Campinas, v. 28, n. 1, p. 172-177, 2008.
GASPAR, T.; PENEL, C.; CASTILLO, F.J.; GREPPIN, H.A. Two step control of basic
and acidic peroxidase and significance for growth and development. Physiologia
Plantarum, Lund, v. 64, p. 418-423, 1985.
GIANNOPOLITIS, C.N.; Ries, S.K. Superoxide Dismutases I. Occurrence in higher
plants. Plant physiology, v. 59, p. 309-314, 1977.
HAN, J.; SUN, L.; DONG, X.; CAI, Z.; SUN, X.; YANG, H.; WANG, Y.; SONG, W.
Characterization of a novel plant growth promoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis
HR4 both as a diazotroph and a potential biocontrol agent against various pathogens.
Systematic and Applied Microbiology, v. 28, p. 66-76, 2005.
HEATH, R. L.; PACKER, L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and
stochiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics, v.
1251, p. 89-198, 1968.
HEWITT, E. J.; NICHOLAS, D. J. D. Metabolic inhibitors. In: HOCHSTER, R. M.;
UASTEL, J. H. (Ed.). Metabolic inhibitors a comprehensive treatise. New York:
Academic Press, v.1, 1963.
59
HUNGRIA, M.; NOGUEIRA, M.A.; ARAUJO, R.S. Co-inoculation of soybeans and
common beans with rhizobia and azospirilla: strategies to improve sustainability. Biology
and Fertility of Soils, 2013.
INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ – IAPAR. Cartas climáticas do Paraná.
Online. Disponível em: <http://www.iapar.br/modules/conteudo/conteudo.php?conteudo
=863>. Acesso em: 27 jan. 2014.
ISODA, A. Adaptative responses of soybean and cotton to water stress II. Changes in CO2
assimilation rate, chlorophyll fluorescence and photochemical reflectance index in relation
to leaf temperature. Plant Production Science, v.8, p. 131-138, 2005.
JADOSKI, S. O.; KLAR, A. E.; SALVADOR, E. D. Relações hídricas e fisiológicas em
plantas de pimentão ao longo de um dia. Ambiência, v. 1, n. 1, p. 11-19, 2005.
JALEEL, C. A.; LAKSHMANAN, G. M. A.; GOMATHINAYAGAM, M.;
PANNEERSELVAM, R. Triadmefon-induced salt stress tolerance in Withania somnifera
and its relation-ship to antioxidant defense system. South African Jorunal of Botany, v.
74, p. 126-132, 2008.
KRUSE, N. D. et al. Estresse oxidativo em girassol (Heliantus annuus) indica sinergismo
para as misturas dos herbicidas metribuzin e clomazone. Planta Daninha, v. 24, n. 2, p.
379-390, 2006.
LANGARO, A. C. et al. Danos celulares em plantas de arroz e capim-arroz cultivadas sob
condições de competição. In: CONGRESSO BRASILEIRO DO ARROZ IRRIGADO, 7.,
2011, Balneário Camboriú. Anais… Balneário Camboriú: p. 423-426, 2011.
LARCHER, W. Ecofisiologia vegetal. São Carlos: RIMA Artes e Textos, 2006. 532p.
LAVRES JUNIOR, J.; MORAES, M. F.; CABRAL, C. P.; MALAVOLTA, E. Influência
genotípica na absorção e na toxidez de manganês em soja. Revista Brasileira de Ciência
do Solo, v. 32, p. 173-181, 2008.
LIMA, G.P.P.; BRASIL, O.G.; OLIVEIRA, A.M. Poliaminas e atividade da peroxidase em
feijão (Phaseolus vulgaris L.) cultivado sob estresse salino. Scientia Agricola, v. 56, p.
21- 25, 1999.
LUSSO, M.; PASCHOLATI, S. F. Activity and isoenzymatic pattern of soluble
peroxidases in maize tissues after mechanical injury or fungal inoculation. Summa
Phytopathologica, v. 25, p. 244-249, 1999.
MAGALHÃES, G. C. Análise da atividade de algumas enzimas antioxidantes em
plantas de soja (Glycine max L. Merr.) sob níveis de manganês, em função da
micorriza arbuscular. Dissertação de Mestrado. Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz, Piracicaba, 2002.
60
MALAVOLTA, E. Manual de nutrição mineral de plantas. São Paulo, Agronômica
Ceres, 2006. 638p.
MITTOVA, V.; VOLOKITA, M.; GUY, M.; TAL, M. Activities of SOD and the
ascorbateglutathione cycle enzymes in sub cellular compartments in leaves and roots of the
cultivated tomato and its wild salttolerant relative Lycopersicon pennellii. Physiologia
Plantarum, v. 110, n. 1, p. 42-51, 2000.
MONDAL, M.M.A.; FAKIR, M.S.A.; AZAD UD DOULA PRODHAN, A.K.M.;
ISMAIL, M.R.; ASHRAFUZZAMAN, M. Deflowering effect on vasculature and yield
attributes in raceme of mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek]. Australian Journal of
Crop Science, v. 5, p. 1339-1344, 2011.
NAYYAR, H.; GUPTA, D. Differential sensitivity of C3 and C4 plants to water deficits:
association with oxidative stress and antioxidants. Environmental Experimental Botany,
v. 58, p. 106-113, 2006.
POPOV, E.G.; TALANOV, A.V.; KURETS, V.K.; DROZDOV, S.N. Effect of
temperature on diurnal changes in CO2 exchange in intact cucumber plants. Russian
Journal of Plant Physiology, v.50, n.2, p.178-182, 2003.
RAMOS, A. R. P. Produtos de efeitos fisiológicos no desenvolvimento de plantas de
tomate ‘Giuliana’, na produção e pós-colheita de frutos. Tese Doutorado –
Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2013.
RENWICK, A. R.; CAMPBELL, R.; COE, S. Assessment of in vivo screening systems for
potential biocontrol agents of Gaeumannomyces graminis. Plant Pathology, v. 40, p. 524532, 1991.
RICHARDSON, A.D.; AIKENS, M.; BERLYN, G.P.; MARSHALL, P. Drought stress
and paper birch (Betula papyrufera) seedlings: effects of na organic bioestimulant on plant
health and stress tolerance, and detection of stress effects with instrument-based, non
invasive methods. Journal of Arboriculture, Illinois, v. 30, p. 52-61, 2004.
SALISBURY, F.B.; ROSS, C.W. Fisiologia vegetal. Trad. Velazquez, V. G. Mexico:
Iberoamerica, 1994. 759 p.
SILVA, D. R. O.; AGOSTINETTO, D.; VARGAS, L.; LANGARO, A. C.; DUARTE, T.
V. Habilidade competitiva, alterações no metabolismo secundário e danos celulares de soja
competindo com Conyza bonariensis resistente e suscetível a glyphosate. Planta Daninha,
v. 32, n. 3, p. 579-589, 2014.
SILVA, F. C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. 2 ed.
Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica, 2009. 627 p.
STEENHOUDT, O.; VANDERLEYDEN, J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing
bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects.
FEMS Microbiology Reviews, v. 24, p. 487-506, 2000.
61
STEFANELLO, F. F.; MARCHETTI, M. E.; SILVA, E. F.; STEFANELLO, J.; DORETO,
R. B. S.; NOVELINO, J. O. Efeito de glyphosate e manganês na nutrição e produtividade
da soja transgênica. Semina: Ciências Agrárias, v. 32, n. 3, p. 1007-1014, 2011.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. 954p.
TECNOLOGIAS de produção de soja – região Central do Brasil 2012 e 2013. Londrina:
Embrapa Soja, 2011. 261p. (Embrapa Soja. Sistemas de produção, 15).
TGERT, M.; TEVINI, M. Influence of drought on some physiological parameters
symptomatic for oxidative stress in leaves of chives (Allium schoenoprasum).
Environmental and Experimental Botany, v. 48, p. 43-49, 2002.
VANDE BROEK, A.; VANDERLEYDEN,L. Rewiew: genetics of Azospirrilum-plant root
association. Critical Rewiew in Plant Science, v.14, p. 445-466, 1995.
VASCONCELOS, A. C. F. Uso de bioestimulante nas culturas de milho e de soja. Tese
Doutorado – Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 2006.
VASCONCELOS, A. C. F.; ZHANG, X.; ERVIN, E. H.; KIEHL, J. C. Enzymatic
antioxidant responses to biostimulants in maize and soybean subjected to drought. Scientia
Agricola, v.66, n.3, p.395-402, 2009.
VIEIRA, E.L.; CASTRO, P.R.C. Ação de bioestimulante na cultura do feijoeiro
(Phaseolus vulgaris L). Feijão Irrigado Tecnologia & Produtividade. Cosmópolis, p.
73-100, 2003.
VIEIRA, E.L.; CASTRO, P.R.C. Ação de Stimulate no desenvolvimento inicial de
plantas de algodoeiro (Gossypium hirsutum L.). Piracicaba: USP, Departamento de
Ciências Biológicas, 2002.
VON CAEMMERER, S.; FARQUHAR, G.D. Some relationships between the
biochemistry of photosynthesis and the gas exchange of leaves. Planta, v.153, n.4, p. 376387, 1981.
WHITE, P.J.; BROADLEY, M.R. Calcium in plants. Annals of Botany, v. 92, p. 487-511,
2003.
YAN, Y.; WEI, C.L.; ZHANG, W.R.; CHENG, H.; LIU, J. Cross talk between calcium
and reactive oxygen species signaling. Acta Pharmacologica Sinica, v.27, p.821 826,
2006.
ZHANG, X.; ERVIN, E. Cytokinin-containing seaweed and humic acid extracts associated
with creeping bentgrass leaf cytokinins and drought resistance. Crop Science, Madison,
v.44, p. 1737-1745, 2004.
62
ZHANG, X.; ERVIN, E.; EVANYLO, G.; SHERONY, C.; PEOT, C. Biosolids impact on
tall fescue drought resistance. Journal of Residuals Science & Technology, Lancaster, v.
2, p.173 -180, 2005.
ZHANG, X.; SCHMIDT, R. E. Antioxidant response to hormone-containing product in
Kentucky blueglass subjected to drought. Crop Science, Madison, v.39, p. 545-551, 1999.
63
140,0
35,0
120,0
30,0
100,0
25,0
80,0
20,0
60,0
15,0
40,0
10,0
20,0
5,0
0,0
0,0
Precipitação
Temp. Miníma
Temperatura (º C)
Precipitação (mm)
APÊNDICE I
Temp. Máxima
Distribuição pluviométrica, temperatura máxima e mínima nos meses de setembro de 2013 à junho de 2014 para a região de Guarapuava,
PR. Dados obtidos da Estação Meteorológica oficial, situada no CEDETEG.
64
APÊNDICE II
Resultados da análise das características químicas do solo no local do experimento, para a
safra agrícola de 2013/2014, nas profundidades 0-10 e 10-20 cm. Guarapuava, PR.
pH
Mo
P
cmol dm-3
Gleba
mg
CaCl2 g dm-3
K
Ca Mg Al Al + H SB
CTC pH 7,0
dm-3
0 - 10
4,90 49,70 6,00 0,16 2,80 2,20 0,00 4,95 5,09
10,04
cm
10 4,90 48,30 2,10 0,14 2,70 2,00 0,00 4,77 4,82
9,59
20 cm
mg dm-3
Saturações (%)
Gleba
Bases V Al M
S
B
Fe
Cu
Mn
Zn
Ca
Mg
K
(%)
(%)
0 - 10
7,50 0,22 18,60 0,90 14,00 1,00 50,70
0,00 27,70 21,40 1,60
cm
10 6,20 0,42 19,10 0,50 11,00 0,80 50,30
0,00 27,80 21,10 1,50
20 cm