capacitação técnica de pesquisadores do instituto biológico para o

Capacitação técnica de pesquisadores do Instituto Biológico para o diagnóstico
DIVULGAÇÃO
TÉCNICA
laboratorial do vírus
da Laringotraqueíte
Infecciosa das Galinhas (LTI).
CAPACITAÇÃO TÉCNICA DE PESQUISADORES DO INSTITUTO BIOLÓGICO PARA O
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DO VÍRUS DA LARINGOTRAQUEÍTE
INFECCIOSA DAS GALINHAS (LTI)
N.M. Soares1, M.R. Buim1, A.J.P. Ferreira2, A.A. Ikuno3,
C. Del Fava3, M.M. Ishizuka2*, F.G. Buchala4, R.L. Luciano1
Instituto Biológico, Centro Avançado de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio Avícola, Unidade de Pesquisa e Desenvolvimento de Bastos, Av. Gaspar Ricardo, 1700, CEP 17690-000, Bastos, SP, Brasil. E-mail:
[email protected]
1
RESUMO
Este artigo descreve as etapas da capacitação dos pesquisadores científicos do Instituto Biológico nas técnicas de diagnóstico laboratorial da Laringotraqueíte Infecciosa das Galinhas (LTI).
Este treinamento foi realizado no Poultry Diagnostic and Research Center do College of Veterinary Medicine da University of Georgia, em Athens, Georgia, Estados Unidos, no Laboratório
Nacional Agropecuário – LANAGRO, em Campinas, SP e na Faculdade de Medicina Veterinária
e Zootecnia da USP.
PALAVRAS-CHAVE: Diagnóstico, vírus da laringotraqueíte das galinhas, capacitação técnica.
ABSTRACT
TECHNICAL TRAINING OF RESEARCHERS FROM Instituto Biológico FOR THE DIAGNOSIS
OF INFECTIOUS LARYNGOTRACHEITIS (ILT). This article describes the steps in the technical
training of researchers in the diagnosis of Infectious Laryngotracheitis (ILT), in order to employ
them in the laboratories of the Instituto Biológico. This training was conducted in the Poultry Diagnostic and Research Center, of the College of Veterinary Medicine, at the University of Georgia in
Athens, Georgia, United States, in the Laboratório Nacional Agropecuário Laboratório Nacional
Agropecuário – LANAGRO from Campinas/SP and in the Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia of the University of São Paulo of the USP.
KEY WORDS: Diagnosis, infectious laryngotracheitis virus, technical training.
A Laringotraqueíte infecciosa das aves (LTI) é uma
doença respiratória aguda, contagiosa, causada por
um membro da família Herpesviridae e subfamília Alfaherpesvirinae e taxonomicamente identificado como
Gallid herpesvirus 1, que afeta o sistema respiratório
das aves. Esse agente possui a capacidade de infectar
as aves e persistir de forma latente no gânglio trigêmio e na mucosa da traqueia, o que dificulta tanto
o controle como a erradicação. É uma doença de
distribuição geográfica cosmopolita, frequentemente
relatada em áreas de grande concentração avícola,
com elevado impacto econômico, devido às perdas
ocasionadas pela mortalidade e/ou diminuição da
postura. Os grandes surtos em áreas de alta produção têm sido causados pela disseminação de vírus
de campo e de vírus vacinal. A manifestação clínica
depende diretamente de fatores estressantes, entre
os quais transporte prolongado, manejo inadequado,
superlotação, criação conjunta de aves de diferentes
idades, calor excessivo e muda forçada, e outras
doenças respiratórias intercorrentes, que reduzem
a imunidade da ave e a predispõe à doença.
Técnicas de diagnóstico do vírus da laringotraquíte
As primeiras provas de detecção do vírus
consistiam na inoculação de material suspeito na
membrana corioalantoide de ovos embrionados,
seguida da enumeração de lesões. O isolamento viral, imunofluorescência direta e PCR, convencional
e RFLP em tempo real, são os meios de diagnóstico,
Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, São Paulo, SP, Brasil.
Instituto Biológico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal, São Paulo, SP, Brasil.
4
Coordenadoria de Defesa Agropecuária do Estado de São Paulo, Campinas, SP, Brasil.
*Comitê Estadual de Sanidade Avícola.
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atualmente, mais utilizados. As provas de biologia
molecular associam especificidade e sensibilidade,
sendo que a PCR-RFLP utiliza enzimas de restrição
e permite a diferenciação de amostras de campo e
de vírus vacinal.
No diagnóstico histopatológico, a presença
de inclusão intranuclear nas células epiteliais da
conjuntiva, laringe e traqueia coradas por Hematoxilina-Eosina é patognomônica. Além dessa, são
observadas outras alterações, como hiperplasia de
células epiteliais respiratórias, perda de cílios, edemaciação, formação de sincício e infiltrado inflamatório
mononuclear na lâmina própria. Nos casos severos
observa-se hemorragia e desprendimento da camada
epitelial da mucosa.
Para o diagnóstico laboratorial indireto e pesquisa de anticorpos, a OIE recomenda métodos
como imunodifusão em gel de ágar (IDGA), vírusneutralização, imunofluorescência indireta e o teste
de ELISA.
Capacitação técnica dos pesquisadores do Instituto Biológico
No final de 2008, o projeto “Capacitação técnica de equipe multidisciplinar para o programa
oficial de controle, erradicação e diagnóstico da
laringotraqueíte infecciosa das galinhas, na região
de Bastos, Estado de São Paulo” foi aprovado pelo
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq) – Processo nº 578354/20080, sob a coordenação da pesquisadora Nilce Maria
Soares Queiroz Gama da Unidade de Pesquisa de
Desenvolvimento de Bastos/CAPTAA/IB. Nesse
projeto, além de outros objetivos, está previsto o
treinamento de técnicos do Instituto Biológico no
Poultry Diagnostic and Research Center do College
of Veterinary Medicine da University of Georgia
(PDRC-UGA-EUA), em Athens, Geórgia, EUA. O
treinamento recebido neste centro, que é referência
internacional no diagnóstico das principais enfermidades avícolas, foi realizado sob a orientação dos
John R. Glisson, Maricarmen García, Susan Williams e
Guilhermo Zavala, especialistas em patologia aviária.
A capacitação técnica, nos EUA, ocorreu em duas
etapas. No período de 28 de junho a 6 de julho de
2009, os pesquisadores científicos do IB, Cláudia
Del Fava e Marcos Roberto Buim receberam treinamento em histopatologia e técnicas biomoleculares,
respectivamente. Em seguida, no período de 19 a 27
de outubro de 2009, os pesquisadores Alice Akimi
Ikuno e Renato Luís Luciano foram capacitados
para o treinamento em isolamento viral e técnicas
moleculares.
Durante o treinamento, os professores do PDRC
apresentaram três conferências: na primeira o Dr.
Guilhermo Zavala apresentou a Patogenia, Epide-
miologia e Controle da Laringotraqueíte Infecciosa
das Aves (LTI) nos Estados Unidos. Na segunda,
Maricarmen García apresentou uma revisão de todas
as técnicas que podem ser utilizadas para o diagnóstico da enfermidade: histopatologia, imunofluorescência, imunohistoquímica, reação de polimerização
em cadeia do DNA (PCR) convencional, reação de
polimerização em cadeia do DNA em tempo real
(ReTi-PCR) e isolamento viral em cultura celular e
na membrana corioalantoide de ovo embrionado. A
terceira palestra, ministrada pela Dra. Maricarmen
García, enfatizou a importância do controle de qualidade na reação de PCR.
O diagnóstico laboratorial para a detecção do vírus da LTI é imprescindível, visto que o diagnóstico
clínico não é conclusivo e só é possível suspeitar de
LTI diante de quadros clínicos severos e agudos da
doença, que são caracterizados pela ocorrência de
alta mortalidade, expectoração sanguinolenta das
aves e intensa dispneia.
Os ensaios rápidos para a detecção do vírus,
geralmente, são realizados em combinação com o
isolamento, com a finalidade de tornar mais ágil
o diagnóstico da doença. O isolamento viral para
o diagnóstico do vírus da LTI caracteriza-se pela
observação da replicação viral em diferentes tecidos
durante o curso da infecção, além da formação de
placas e efeito citopático dos diferentes isolados
em cultura celular ou em ovo embrionado. Assim,
o isolamento viral é considerado o método padrão,
ou “gold standart” para verificar uma infecção viral
ativa, enquanto que pelo exame histopatológico
pode se visualizar a lesão patognomônica para o
diagnóstico rápido da LTI.
Além do exame histopatológico, outros ensaios
rápidos, tais como a imunofluorescência direta,
utilizando conjugados com anticorpos policlonais
ou monoclonais, pode ser utilizado com sucesso,
possibilitando a visualização do antígeno viral em
cortes de traqueias.
A Profa. García enfatizou em sua apresentação
que a reação de PCR convencional ou ReTi-PCR associada com o exame histopatológico compõe o ensaio
mais utilizado para o diagnóstico rápido da LTI em
aves comerciais. Outra prova molecular utilizada
é o PCR em tempo real, ReTi-PCR. Essa reação é
rápida e sensível, com elevada reprodutibilidade e
riscos reduzidos de contaminação cruzada. Além
disso, é possível quantificar o ácido nucleico viral
diretamente nas amostras clínicas. Outras vantagens:
a amplificação pode ser monitorada em tempo real,
não ocorre processamento pós-PCR, diminuindo o
risco de contaminação e a ciclagem é ultrarápida, de
30 minutos a 2 horas.
Durante o ano de 2010, o pesquisador Marcos
Roberto Buim realizou na FMVZ/USP o treinamento
de técnicas moleculares para diferenciação entre o
Biológico, São Paulo, v.73, n.1, p.61-68, jan./jun., 2011
Capacitação técnica de pesquisadores do Instituto Biológico para o diagnóstico
laboratorial do vírus da Laringotraqueíte Infecciosa das Galinhas (LTI).
vírus LTI de campo e vacinais, sob a orientação do
Prof. Dr. Antonio José Piantino Ferreira. Isso ocorreu
em atendimento sugestão da Profa. Maricarmen
Garcia, da Universidade da Geórgia. O objetivo foi
desenvolver uma técnica diagnóstica PCR-RFLP/
LTI, capaz de diferenciar as cepas vacinais das cepas
de campo encontradas no Brasil. Um programa de
restrição enzimática utilizando 4 enzimas de restrição, ApoI, BccI, DpnI e HhaI foi delineado para
diferenciar as amostras, baseado nas sequencias
obtidas de estudos anteriores.
Ainda no ano de 2010, os pesquisadores Antonio
Guilherme de Castro, Nilce Maria Soares, Renato Luís
Luciano e Marcos Roberto Buim, do Centro Avançado
de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio Avícola, IB,
receberam treinamento técnico no Laboratório Nacional Agropecuário, em Campinas, SP, LANAGRO/
SP. A capacitação nas técnicas sorológicas de ELISA
e imunodifusão em gel de Agar para o diagnóstico de
ILT, foi realizada sob a supervisão da Dra. Dilmara
Reischak e de Soraya Cecília Albieri Camillo. Esse
treinamento também objetivou atender à exigência do
Ministério da Agricultura, Pecuária e AbastecimentoMAPA, no credenciamento de laboratórios para o
diagnóstico sorológico para LTI.
indicativo da presença do vírus na granja e deve ser
imediatamente comunicado ao serviço oficial de defesa sanitária animal. A Figura 1 apresenta lesões da
mucosa laringotraqueal ocasionadas pelo vírus LTI.
Ensaios diagnósticos desenvolvidos na capacitação técnica
Ensaios moleculares
Toda a base teórica da PCR foi recordada pela Dra.
Maricarmen García, que enfatizou a necessidade de se
realizar o diagnóstico da LTI pela PCR convencional
ou em tempo real (ReTi-PCR), tendo em vista que
são provas rápidas, específicas e sensíveis. A parte
prática de extração de DNA viral foi realizada sob
supervisão da assistente de pesquisa Sylva Riblet,
assim como a realização das reações de PCR.
No Laboratório de Biologia Molecular foi realizada
a extração do DNA viral de amostras de raspados de
traqueias de aves doentes, utilizando o kit de extração QiAamp DNA mini kit e, em seguida, a reação
de PCR convencional, análise dos produtos do PCR
por RFLP (polimorfismo de fragmentos de restrição) e ReTi-PCR, para comparação da sensibilidade
analítica das técnicas. O set de primers utilizados na
reação de PCR amplificaram um segmento de 688 pb
de uma região conservada do gene ICP4 (infected cell
protein 4) do vírus da LTI que, quando combinado
com RFLP, proporciona um teste rápido e específico
para a detecção e caracterização de isolados da LTI. A
análise do gene ICP4 por PCR-RFLP pode ser utilizada
como ferramenta para diferenciar amostras vacinais
e de campo, identificando regiões de diversidade e
geneticamente categorizar os isolados do vírus da LTI.
A Figura 5 mostra o perfil eletroforético obtido
nas amostras por PCR onde todas foram positivas,
com a presença de DNA do vírus da LTI. O set de
primers delineados a partir de sequências do gene
ICP4 demonstrou ser específico para o vírus.
Histopatologia
O objetivo foi realizar a capacitação para o diagnóstico histopatológico diferencial das enfermidades
do trato respiratório de aves. Segundo a Dra. Susan
Williams, anatomopatologista responsável técnica
pelo diagnóstico histopatológico do PDRC-UGA,
a triagem das amostras suspeitas de LTI fixadas
em formol tamponado e emblocadas em parafina,
a partir do qual são realizados cortes histológicos
corados pela hematoxilina/eosina (HE) é um método diagnóstico rápido, pois permite a liberação de
resultados em até 24 horas, desde que o laboratório
de histotécnica esteja automatizado. O exame histopatológico busca, fundamentalmente, a identificação
da inclusão viral eosinofílica no núcleo das células
epiteliais da mucosa conjuntiva e do trato respiratório, seios infraorbitários, laringe e traqueia, sendo essa
lesão patognomônica em aves enfermas no estágio
inicial da doença, de 5 a 7 dias após a infecção. Nos
casos severos, quando ocorre desprendimento da
mucosa, as inclusões intranucleares podem ser observadas nos debris celulares do lúmen da traqueia.
As amostras inconclusivas na coloração HE devem
ser submetidas à imunohistoquímica e ou PCR para
comprovação da infecção viral. Nos Estados Unidos,
a identificação de pelo menos uma ave com inclusão
intranuclear eosinofílica em uma amostragem de
um lote de aves com sinais clínicos respiratórios é
Isolamento viral em cultura celular de rins de
galinha
Inicialmente, células de rim de galinha SPF (specific
pathogen free) de 3 semanas de idade, foram cultivadas
em meio mínimo essencial de Earle suplementado
com 10% de soro fetal bovino e incubadas em estufa
com 5% de CO2 por 24h, (conforme mostra a Fig. 2).
O efeito citopático característico do vírus é observado
3-5 dias após a inoculação da suspensão de raspados
de traqueias de galinha infectadas com LTI, conforme
ilustra a Figura 3.
Isolamento viral em ovos embrionados
A inoculação do vírus da LTI em ovos embrionados de galinha SPF de 9-11 dias de idade é feita
por via membrana corioalantoide (MCA), seguida
de incubação dos ovos e o exame diário para verificação do espessamento e formação de pocks, placas
opacas, na MCA. Esse processo ocorre 3 dias após a
inoculação do vírus, conforme ilustrado na Figura 4.
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Tabela 1 - Resultados do Real Time-PCR para detecção do vírus da LTI.
Identificação
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
Sample ID
71287-4
77601-1
77601-2
77601-3
77601-4
ePBS
1874 Pos control
gC 1000copies
water
Os sítios de clivagens dos produtos do PCR (PCRRFLP) foram comparados utilizando-se as enzimas
de restrição (RE) Apo I e Bcc I.
A Profa. García sugeriu a utilização dessas enzimas de restrição nas amostras brasileiras. Esses marcadores tornam possível a diferenciação de amostras
vacinais e de campo brasileiras. Essa discriminação
é fundamental para estudos epidemiológicos, tendo
em vista que o vírus vacinal pode causar enfermidade
pela possibilidade de reversão de patogenicidade.
No Brasil, devido à utilização da vacina com vírus
vivo, a genotipagem das amostras de vírus da LTI
por meio da PCR com enzimas de restrição (RFLP),
possibilitou a diferenciação do vírus de campo do
vírus vacinal na região de Bastos, SP.
Em continuidade aos estudos moleculares, para
comparação da sensibilidade analítica da PCR convencional, realizou-se uma ReTi-PCR, utilizando-se o kit
Quantitect Probe PCR (Qiagen, Valencia, Califórnia,
EUA). Nessa reação, os primers e o probe (marcador
fluorescente) foram desenhados para amplificar um
produto de 103 pb do gene que codifica para a glicoproteína C do envelope (gC) do vírus da LTI.
Os resultados da reação estão na Tabela 1 e na Figura 6.
Para cada reação, o número de ciclo threshold
(valor CT) foi determinado como o número de ciclo
do PCR no qual a fluorescência da reação excedeu
30 unidades de fluorescência, ou seja, a diluição
mais alta do DNA viral no qual a fluorescência foi
superior a 30 unidades de fluorescência. Os valores
CT obtidos para cada diluição (10-1 a 106 cópias) do
gene gC foram plotados contra o log10 do número de
cópias do genoma viral (GCN) e uma equação linear
(y = -0,294x + 12.059) foi gerada com um valor de R2
= 0,999. O limite de quantificação foi determinado
ser de 100 cópias molde. Baseado nesses resultados,
amostras com valores de CT menores ou iguais a
36.14 foram consideradas positivas, com a presença
do DNA do vírus da LTI, correspondendo a uma
quantidade de DNA maior do que 100 cópias, o qual
no PCR convencional corresponde a 100 fg.
Segundo considerações da Profa. García, os ensaios
de PCR convencional e o ReTi-PCR são altamente
FAM Ct
13,91
30,44
28,53
20,85
24,47
37,47
12,33
31,61
0
Resultados
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
POS
POS
NEG
sensíveis e específicos para a detecção do vírus da LTI
em amostras de campo, sendo que o ReTi-PCR requer
menos tempo e proporciona uma análise final mais
objetiva quando comparado ao PCR convencional.
A reação de PCR para a identificação do vírus
da LTI, quando comparada ao isolamento viral,
demonstou ser altamente sensível e reprodutível.
Tal fato ocorre porque a presença de bactérias e outros vírus não interferem na amplificação do DNA
viral, o que não ocorre na cultura celular, que tem
seu crescimento inibido na presença de interferentes.
A reação de ReTi-PCR tem o limite mínimo de
detecção de 100 cópias do vírus da LTI, enquanto
que na cultura celular esse limite passa a ser de
100.000 cópias virais. Além de mais sensível que o
isolamento viral, quando comparado a outros ensaios
rápidos como a histologia e a IF, a ReTi-PCR permite quantificar o número de cópias amplificadas no
genoma viral, além de permitir a diferenciação da
doença na fase aguda e crônica e reduzir possíveis
falsos positivos.
No campo, casos de LTI geralmente são relatados
quando a presença de sinais clínicos são confirmados
pela detecção da lesão histopatológica característica,
que aparece durante os estágios agudos da infecção. Nesses casos, o ensaio por ReTi-PCR pode ser
utilizado como um teste rápido para confirmar o
diagnóstico histopatológico. Em surtos da doença, é
fundamental a caracterização biológica dos isolados
do vírus da LTI em cultura celular com posterior
confirmação por ensaio molecular
O estudo, com o objetivo de desenvolver a técnica
diagnóstica PCR-RFLP/LTI, capaz de diferenciar as
cepas vacinais das cepas de campo encontradas no
Brasil, foi realizado por Marcos Roberto Buim, na
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo, sob a orientação do Prof.
Antônio Piantino, tendo sido uma sugestão da Profa.
Maricarmen Garcia, da Universidade da Geórgia.
Um programa de restrição enzimática utilizando 4
enzimas de restrição (ApoI, BccI, DpnI e HhaI) foi
delineado para diferenciar as amostras, baseado nas
sequências obtidas de estudos anteriores. Amostras
de traqueias e cabeças (n = 52) de galinhas foram
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Capacitação técnica de pesquisadores do Instituto Biológico para o diagnóstico
laboratorial do vírus da Laringotraqueíte Infecciosa das Galinhas (LTI).
maceradas e submetidas à extração de DNA usando o kit Brazol®. Como controles positivos foram
utilizadas as vacinas CO e TO. As PCRs convencionais foram realizadas para detectar um segmento
parcial (688pb) do gene da proteína reguladora da
transcrição de células infectadas (ICP4) do vírus da
LTI. As amostras positivas na PCR foram submetidas
à RFLP utilizando a enzima de restrição HhaI. No
segmento amplificado das cepas vacinais ocorre um
sítio de restrição para essa enzima, clivando-o em dois
fragmentos, enquanto que nos segmentos das cepas
de campo não ocorre esse sítio e, consequentemente,
não haverá clivagem. Das 52 amostras examinadas,
12 (23,07%) apresentaram amplificação do produto
de 688 pb sendo, então, consideradas como positivas
para o vírus da LTI. Após a realização da RFLP, todas
as 12 amostras foram identificadas como cepas de
campo, pois não houve clivagem do produto amplificado. Na fase final de padronização dessa técnica
com a enzima HhaI foi realizado o sequenciamento
das amostras positivas de campo, assim como as
vacinais, para melhor estudar as diferenças entre
as amostras, localizar os sítios de restrição e assim
confirmar a técnica. Quanto às demais enzimas (ApoI,
BccI e DpnI), que devem ser empregadas para diferenciar e permitir um agrupamento filogenético das
amostras, os resultados obtidos foram inconclusivos
e requerem uma melhor padronização e otimização
da técnica. A PCR convencional de um fragmento
menor, seguida da RFLP utilizando uma enzima
mostrou-se rápida, de menor custo e eficiente na
diferenciação de cepas vacinais e de campo.
Fig. 1 - Células epiteliais sinciciais no lúmen da traqueia,
contendo corpúsculos de inclusão intranuclear eosinofílica
(seta) com a presença do vírus da LTI (HE 1000x).
Fig. 2 - Cultura de células primárias de rim de galinha de
3 semanas de idade.
Diagnóstico sorológico
O treinamento nas técnicas sorológicas de ELISA
e IDGA para a detecção de anticorpos para o vírus
da LTI foi realizado no Laboratório de Doenças
Aviárias, do Laboratório Nacional Agropecuário –
LANAGRO, em Campinas, SP.
Ensaio de ELISA para detecção de anticorpos
para o vírus da LTI
O teste de ELISA-LTI é um ensaio indireto, sendo
utilizado como triagem sorológica, pois mede o nível
relativo de anticorpos para ILT em amostras de soro
de aves. O kit utilizado foi o CIVTEST AVI ILT®.
Fig. 3 - Fotos ilustrativas do processo de isolamento do vírus da LTI em cultura de células primárias de rim de galinha
de 3 semanas de idade células. A- Cultura celular normal, B- Cultura celular 24h após a inoculação do vírus, C- No 2º
dia após a inoculação do vírus, o efeito citopático é observado através de células arredondadas e gigantes com inclusões
intranucleares.
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Fig. 4 - Fotos ilustrativas de lesões na membrana corioalantoide de ovo embrionado de 9-11 dias de idade causado pelo
vírus da LTI. A- Inoculação na MCA de ovo embrionado, B- MCA, após 3 dias de inoculação do vírus, apresentando
numerosas lesões brancas, circunscritas e com necrose central, C- Necrose na CAM de ovo embrionado inoculado com
o vírus da LTI (extraída de Versteeg, 1985).
Fig. 5 - Perfil eletroforético da amplificação por PCR, do fragmento de 688 pb pertencente ao gene ICP4 do vírus da
LTI. Linhas 1 a 17 = amostras clínicas, linha 18 = controle positivo, linha 19 = controle negativo, M = Marcador de peso
molecular de 10 kb (Condições da eletroforese: 10 µL do produto de PCR, gel de agarose a 1,5% em TBE corado com
brometo de etídeo (0,02 mg/µL). Corrida a 100 v/30 minutos.
Fig. 6 - Gráfico óptico do Real-Time PCR para detecção do vírus da LTI.
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Capacitação técnica de pesquisadores do Instituto Biológico para o diagnóstico
laboratorial do vírus da Laringotraqueíte Infecciosa das Galinhas (LTI).
Fig. 7 - Resultado da prova de IDGA para pesquisa de anticorpos para o vírus da LTI. Legenda: Ag – Antígeno do vírus
LTI. 1, 3, 7 e 9: soros controle positivos, 2, 4 e 6: amostras positivas, 8 e 10: amostras negativas.
12: soro controle negativo.
Tabela 2 - Resultados do ensaio de ELISA para diagnóstico do nível de anticorpos para o vírus da LTI.
Coeficiente M/P
Menor ou igual a 0,15
Entre 0,15 e 0,25
Maior que 0,25
Título ILT
0-387
388-688
≥689
Os soros foram diluídos em 1:500 e transferidos
para uma microplaca de 96 cavidades previamente
sensibilizada com o antígeno de LTI, sendo adicionado, também, soros-controle positivo e negativo
nas cavidades específicas. A reação colorimétrica,
diretamente relacionada à quantidade de anticorpos presentes no soro, foi mensurada por meio de
espectrofotometria em filtro de 405 nm. Os resultados obtidos foram validados, por meio dos valores
obtidos pelos controles e as amostras classificadas
como positivas, negativas e suspeitas, conforme
mostra a Tabela 2.
Ensaio de IDGA para pesquisa de anticorpos
para LTI
Com a utilização dessa técnica é possível detectar anticorpos precipitantes para o vírus da LTI. A
difusão do antígeno e do soro a ser testado ocorre
em uma placa de petri contendo ágar gel, com a formação de uma linha de precipitação. O kit utilizado
foi proveniente da empresa Charles River Laboratories (CT, EUA). As amostras foram consideradas
positivas, quando houve formação de uma linha
contínua, linha de identidade, similar entre a linha
formada entre as cavidades do controle-positivo e
o antígeno. Nas amostras negativas houve ausência
Resultado
Negativo
Suspeito
Exposição (vacinação ou enfermidade)
de linha de identidade. Os resultados dessa prova
estão na Figura 7.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
É importante ressaltar que o processo de capacitação dos pesquisadores foi complementado com as
palestras e orientações de Fernando Gomes Buchala,
coordenador do Programa Estadual de Sanidade
Avícola do Estado de São Paulo e Masaio Mizuno
Ishizuka, Coordenadora do Comitê Estadual de
Sanidade Ávícola.
Após a capacitação técnica dos pesquisadores do
Instituto Biológico foram implantadas as técnicas
laboratoriais para o diagnóstico do vírus da LTI,
no Laboratório de Anatomia Patológica, a histopatologia e no Laboratório de Imunologia, os ensaios
moleculares. Esses laboratórios integram o Centro
de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal
– IB/SP. A unidade de Pesquisa e Desenvolvimento
de Bastos/CAPTAA/IB, obteve o credenciamento,
junto ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA, para a realização das técnicas
sorológicas de IDGA e ELISA. O Centro Avançado
de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio Avícola/IBDescalvado, SP, encontra-se apto para a realização de
Biológico, São Paulo, v.73, n.1, p.61-68, jan./jun., 2011
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ensaios moleculares e, atualmente, está em processo
de obtenção do credenciamento para realização das
provas sorológicas de ELISA e IDGA.
Sendo assim, o Instituto Biológico é capaz de
realizar o diagnóstico laboratorial da enfermidade
Laringotraqueíte das Galinhas, não apenas para o
Estado de São Paulo, mas também para auxiliar o
diagnóstico dessa doença para todos os Estados
do Brasil.
Segundo o Médico Veterinário Fernando Gomes
Buchala, coordenador do Programa Estadual de Sanidade Avícola do Estado de São Paulo, a utilização
de testes diagnósticos para o monitoramento da LTI,
permite a detecção das fontes de infecção e o melhor conhecimento da condição epidemiológica das
regiões onde ocorre a laringotraqueíte, assim como
avaliar a eficácia das medidas de profilaxia adotadas.
Ressalta, ainda, que é fundamental a padronização
dos procedimentos técnicos e científicos, no sentido
de subsidiar a legislação de Defesa Sanitária Animal.
BIBLIOGRAFIA
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Recebido em 15/4/11
Aceito em 16/5/11
Biológico, São Paulo, v.73, n.1, p.61-68, jan./jun., 2011