CITOLOGIA_Microscopia_2014 - AULAS VERA REGINA ANDRADE
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Vera Andrade http://histologiavvargas.wordpress.com/ Microscópio • O microscópio é um instrumento que permite observar objetos não visíveis a olho nu. • Isto se consegue através de um sistema óptico composto por lentes de cristal que aumentam a imagem do objeto. Microscopia de Luz Evolução do microscópio de luz • Galileu Galilei inventou o telescópio no século XVI – duas lentes num tubo • Zacarias Jansen (holandês) inventou o primeiro microscópio composto, em 1660 Século XVII, formado por três tubos encaixados 1 Microscopia de Luz Evolução do microscópio de luz Leeuwenhoek, final de 1600 Microscopia de Luz Evolução do microscópio de luz Robert Hooke Microscopia de Luz Evolução do microscópio de luz 2 Microscópio óptico, Microscópio composto ou Microscópio de Campo claro • Instrumento usado pelo estudante de citologia, histologia, microbiologia e outras disciplinas que estudam microrganismos ou objetos com medidas micrométricas • Constituído por uma parte mecânica e uma parte óptica Parte Mecânica Tubo Coluna ou braço Revólver Platina Parafuso Macrométrico Parafuso Micrométrico Base ou pé • Parte Mecânica Base ou pé suporte Coluna ou braço apoio paras as estruturas Tubo peça de ligação entre a ocular e o revólver Revólver peça giratória que contém as lentes objetivas – Platina suporta a preparação – Parafuso Macrométrico, de passo largo, é para movimento de grande amplitude – Parafuso Micrométrico, de pequeno passo, é destinado a focar o material – – – – 3 Parte Óptica Lentes oculares Lentes objetivas Condensador Parte Óptica – Condensador, concentra os raios luminosos objeto • possui um diafragma de diâmetro modificável, proporciona uma maior ou menor intensidade luminosa – Lentes objetivas, próximas do objeto, projetam a imagem ampliada do objeto em direção a ocular – Lente ocular, funciona como uma lupa, amplia a imagem fornecida pela objetiva Parte Óptica • CONDENSADOR – geralmente negligenciado - não interfere no aumento da imagem, mas ele influencia em sua nitidez e riqueza de detalhes • Age no LIMITE DA RESOLUÇÃO do sistema óptico, embora esta propriedade dependa principalmente das lentes objetivas 4 LIMITE DE RESOLUÇÃO • LR de um microscópio é a capacidade de: – Separar detalhes – Produzir imagens separadas de partículas muito próximas – É a menor distância que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam separado Limite de Resolução LR = K . AN – K é uma constante 0,612 – é o comprimento de onda luz branca (verdeamarelo) = 0,55 m – AN é a abertura numérica da lente objetiva LR = 0,612 . 0,55 AN – O limite e resolução é diretamente proporcional ao comprimento de onda e inversamente proporcional a abertura numérica. • ABERTURA NUMÉRICA (AN), vem gravado na lente objetiva e sua determinação cabe ao fabricante da lente. • Indica a resolução de uma lente objetiva • Capacidade de captar a luz • Fornecer detalhes da amostra AN = n. sen – n = menor índice da refração – = semi-ângulo de abertura 5 • As objetivas trazem outras informações – 160 ou 170, indica em milímetro o comprimento do tubo do microscópio, onde devem ser usadas as objetivas para que dêem melhores resultados. – 0,17, distância de trabalho, que significa o tamanho da lamínula, para a qual as aberrações são corrigidas. Códigos de cores das lentes objetivas Aumento Cores 4X ou 5X 10X 40 ou 50X 100X Imersão – óleo Vermelho Amarelo Azul claro Branco 6 Imagem real ampliada e invertida • Outros tipos de microscópios – Microscópios Ópticos – MO • Microscópio • Microscópio • Microscópio • Microscópio de Contraste de Fase de Campo Escuro de Fluorescência de Polarização – Microscópio Eletrônico – ME Microscópio de contraste de fase – células vivas • Usa as propriedades da refração da luz – Refração é a passagem da luz de um meio para outro. • Microscópio de contraste de fase transforma diferentes fases luminosas em diferentes intensidade luminosa 7 Microscopia de luz convencional Microscopia de contraste de fase Microscópio de campo escuro Objetiva LUZ • Condensador é substituído por um condensador de fundo escuro • A preparação é iluminada por raios oblíquos CONDENSADOR • A célula fica com aparência brilhante e o fundo escuro Microscopia de campo escuro - células de sangue. 8 Microscópio de Polarização 2 raios de luz = Raios polarizados • Quando um raio de luz atravessa certas substâncias do nosso corpo acontece uma dupla refração • Substâncias como dentes, ossos, fibras de colágeno e outras possuem um estado cristalino, arranjo molecular interno • Prisma utiliza as propriedades de um único raio eliminando o outro Microscópio de luz polarizada: da dentina (dente). Microscópio de luz polarizada: Fibras de colágeno exibem birrefringência (brilhantes ou amarelas). Microscópio de Fluorescência Utiliza luz fluorescente – permite detectar proteínas ou estruturas marcadas com compostos fluorescentes Similar ao MO, exceto pela luz empregada Luz ultra-violeta e pelos 2 conjuntos de filtros que desviam os raios do olho do observador. 9 Cultivo de astrócitos. Imunofluorescência verde contra GFAP (proteína de filamentos intermediários) e azul (união com DNA) Alberts et al. Biología Molecular de la célula. (1996) p. 856. Microscopia Eletrônica Microscopia Eletrônica • Inventado em 1932, na Alemanha, Ernest Ruska e Max Knoll • Utiliza elétrons, comprimento de onda muito pequeno, limite de resolução 1.000X menor que microscópio de luz 10 Microscopia eletrônica, músculo estriado cardíaco. Medidas 11 Medidas Unidade de medida Símbolo Valor Micrômetro m 0,001 mm Nanômetro nm 0,000001 mm (10-6 mm) ou 10-3 m Medidas Discuta com seus colegas e responda: • Para transportar um microscópio, qual a melhor maneira de segurálo? • Que peça é movimentada quando giramos o parafuso macrométrico? • Para que serve o parafuso micrométrico? O que ocorre quando o giramos? O movimento é tão nítido quanto o do parafuso macrométrico? • Como calcular o aumento que o microscópio fornece? • Onde deve ser colocada a lâmina contendo a preparação para observação? Qual objetiva deve ser inicialmente usada para o procedimento de focalização? • Qual parafuso deve ser usado inicialmente para focalizar o material? • Acoplado ao condensador existe um diafragma. Descrever o que ocorre quando se move a alavanca do diafragma. • O que é limite de resolução de um microscópio. • Quais as diferenças que existem entre o MO e ME? 12
