taís nitsch mazzola - Repositório da Produção Científica e

JÉSSICA SANTANA BERNACHI
MATURAÇÃO E FUNÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS
DERIVADAS DE MONÓCITOS DE CRIANÇAS E
ADOLESCENTES INFECTADOS PELO HIV
CAMPINAS
2014
i
ii
___________________________________________________________
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
JÉSSICA SANTANA BERNACHI
MATURAÇÃO E FUNÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE
MONÓCITOS DE CRIANÇAS E ADOLESCENTES INFECTADOS PELO HIV
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para obtenção do Título de Mestra em Ciências, na
Área de Concentração em Saúde da Criança e do Adolescente.
ORIENTADORA: Profa. Titular Dra. Maria Marluce dos Santos Vilela
CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Taís Nitsch Mazzola
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA
DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA JÉSSICA
SANTANA BERNACHI E ORIENTADA PELA PROFA. DRA.
MARIA MARLUCE DOS SANTOS VILELA.
__________________________
Assinatura da Orientadora
Campinas
2014
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Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Bernachi, Jéssica Santana, 1990B456m
Maturação e função de células dendríticas derivadas
de monócitos de crianças e adolescentes infectados pelo
HIV / Jéssica Santana Bernachi. -- Campinas, SP : [s.n.],
2014.
Orientador : Maria Marluce dos Santos Vilela.
Coorientador : Taís Nitsch Mazzola.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de
Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
1. HIV. 2. Células dendríticas. 3. Criança. 4.
Adolescente. I. Vilela, Maria Marluce dos Santos,1947-.
II. Mazzola, Taís Nitsch,1982-. III. Universidade Estadual
de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV.
Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Monocyte-derived dendritic cell maturation and function from
HIV-infected children and adolescentes
Palavras-chave em inglês:
HIV
Dendritic cells
Child
Adolescent
Área de concentração: Saúde da Criança e do Adolescente
Titulação: Mestra em Ciências
Banca examinadora:
Maria Marluce dos Santos Vilela [Orientador]
Maria Notomi Sato
Ronei Luciano Mamoni
Data de defesa: 18-11-2014
Programa de Pós-Graduação: Saúde da Criança e do Adolescente
iv
v
vi
RESUMO
A vacinação terapêutica com células dendríticas derivadas de monócitos (MDDC) têm sido
associada com o controle da carga viral em adultos infectados pelo HIV, mas os seus
efeitos em crianças não foram explanados. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi
avaliar a função das MDDC isoladas de crianças e adolescentes verticalmente infectados
pelo HIV sob terapia antiretroviral combinada.
Os pacientes foram recrutados no Ambulatório de Imunodeficiência Secundária Pediátrica
do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas, sendo 25 com carga viral
indetectável e 14 com carga viral ≥1000 cópias de RNA/mL. Além disso, 20 crianças e
adolescentes saudáveis participaram como controles. Monócitos obtidos do sangue
periférico foram cultivados durante seis dias com GM-CSF e IL-4 para a obtenção das
MDDC, as quais foram avaliadas por citometria de fluxo quanto à expressão de CD40,
CD80, CD83, CD86, DC-SIGN e HLA-DR. As MDDC foram pulsadas com HIV-1
inativado por aldritiol-2 e cocultivadas com linfócitos autólogos para avaliação da
expressão gênica e proteica de citocinas e da linfoproliferação HIV específica. Foram
avaliados também hemogramas, subpopulações de células dendríticas mielóides e
plasmocitóides e de linfócitos CD3, CD4 e CD8.
As MDDC dos pacientes infectados pelo HIV apresentaram um fenótipo semelhante aos
controles saudáveis e foram capazes de induzir a produção de citocinas do tipo Th1; no
entanto, crianças com carga viral ≥1000 cópias de RNA/mL apresentaram menor
linfoproliferação HIV-específica.
vii
Em geral, as MDDC de crianças verticalmente infectadas pelo HIV geradas in vitro foram
capazes de induzir resposta imune celular HIV específica, mostrando-se potenciais
candidatos para imunização terapêutica usando MDDC.
PALAVRAS-CHAVE: HIV; células dendríticas; criança; adolescente.
viii
ABSTRACT
Therapeutic vaccination with monocyte-derived dendritic cells (MDDC) has been
associated with viral load control in immunized HIV-infected adults, but its effects in
children were not explored yet. We aimed to evaluate the function of MDDC isolated from
vertically HIV-infected children and adolescents under combined antiretroviral therapy.
Patients were recruited at the Out-Patients Unit at the University of Campinas, which 25
patients had undetectable viral load and 14 patients had viral load ≥1000 RNA copies/mL.
In addition, 20 healthy children and adolescents served as controls. Monocytes obtained
from peripheral blood were cultured for six days with GM-CSF and IL-4 to get the MDDC,
which were assessed by flow cytometry for CD40, CD80, CD83, CD86, DC-SIGN and
HLA-DR expression. T cell proliferation and cytokine expression and production were
evaluated in cocultures of MDDC pulsed with aldrithiol-2-inactivated HIV-1 and
autologous lymphocytes. Hemogram, myeloid and plasmacytoid dendritic cells and CD3,
CD4 and CD8 lymphocytes were evaluated in the peripheral blood.
MDDC from HIV-infected children exhibited a similar phenotype to those in healthy
individuals and were able to induce a Th1-type cytokine production; however, T
lymphoproliferation was impaired in children with viral load ≥1,000 RNA copies/mL.
MDDC generated in vitro boosted HIV-specific cellular immune responses in vertically
HIV-infected children and could be potential candidates for MDDC therapeutic
immunization.
KEYWORDS: HIV; dendritic cells; child; adolescent.
ix
x
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
HIV e AIDS ......................................................................................................................... 1
Transmissão vertical e profilaxia ........................................................................................ 2
HIV e AIDS em pacientes pediátricos ................................................................................ 3
Terapia antirretroviral ......................................................................................................... 7
Células dendríticas e vacinas terapêuticas .......................................................................... 9
2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 17
Objetivo geral .................................................................................................................... 17
Objetivos específicos......................................................................................................... 17
3. MÉTODOS ................................................................................................................. 19
Populações estudadas ........................................................................................................ 19
População de pacientes e local do estudo ...................................................................... 19
Aspectos éticos .............................................................................................................. 20
Cálculo amostral ............................................................................................................ 21
População de controles saudáveis .................................................................................. 21
Coleta de sangue................................................................................................................ 21
Hemograma ....................................................................................................................... 22
Carga viral de HIV ............................................................................................................ 22
Imunofenotipagem de linfócitos T .................................................................................... 22
Fenotipagem de células dendríticas plasmocitóides e mielóides ...................................... 23
Coculturas de MDDC e linfócitos ..................................................................................... 24
Isolamento das células mononucleares do sangue periférico ........................................ 24
xi
Obtenção em cultura de MDDC .................................................................................... 24
MDDC pulsadas com HIV inativado ............................................................................. 25
Separação e viabilidade de linfócitos............................................................................. 26
Cocultivo de MDDC e linfócitos ................................................................................... 27
Produção de citocinas no sobrenadante ............................................................................. 27
Extração do RNAm e reação de transcrição reversa (cDNA) ........................................... 28
PCR quantitativo em tempo real ....................................................................................... 29
Linfoproliferação HIV específica ...................................................................................... 31
Análise estatística .............................................................................................................. 32
4. RESULTADOS .......................................................................................................... 33
População de estudo .......................................................................................................... 33
Hemograma, linfócitos CD3, CD4 e CD8 e carga viral .................................................... 35
Caracterização das subpopulações de células dendríticas do sangue periférico ............... 36
Caracterização das células dendríticas derivadas de monócitos ....................................... 38
Produção de citocinas no sobrenadante das culturas de MDDC ....................................... 42
Produção de citocinas no sobrenadante das coculturas de MDDC e linfócitos ................ 43
PCR quantitativo em tempo real ....................................................................................... 47
Linfoproliferação HIV específica ...................................................................................... 49
5. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 51
6. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 59
7. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 61
8. ANEXOS E APÊNDICES ......................................................................................... 73
xii
Dedico este trabalho aos meus pais, Tito e Cida,
meus ídolos que, com amor e paciência, me
apoiam em todas as minhas decisões.
xiii
xiv
AGRADECIMENTOS
A Deus, por se fazer tão presente em minha vida, por guiar meus passos, iluminar meus
pensamentos e pela parceria em desenvolver este mestrado comigo.
À Profa. Dra. Maria Marluce dos Santos Vilela, pela orientação, por abrir as portas de seu
laboratório, pela confiança a este trabalho e pela convivência acadêmica.
À minha co-orientadora Taís Mazzola, grande amiga, companheira, pela imensa paciência e
carinho diários, por acreditar em mim, pela disponibilidade, pelo incentivo à minha
carreira, pelas motivações e por compartilhar suas experiências comigo.
Ao Prof. Dr. Marcos Tadeu Nolasco da Silva, pela colaboração no desenvolvimento deste
trabalho.
À Dra. Telma Oshiro, pela colaboração na padronização do protocolo de diferenciação dos
monócitos.
Aos meus pais, Maria Aparecida Bernachi e José Domingos Bernachi, pelo amor, pela
compreensão, pelo cuidado, pela força, por estarem sempre comigo e por me fazer enxergar
sempre o lado bom de tudo. Amo vocês!
Aos meus irmãos Eleandro Bernachi e Fernando Bernachi, pela sabedoria, pelos exemplos,
pelas risadas e pela eterna amizade.
Ao meu querido sobrinho Gabriel Bernachi, por me lembrar que motivados por nossos
sonhos podemos ser o que quisermos, até mesmo super-heróis.
A todos meus tios e tias, primos e primas e demais familiares, pela motivação,
companheirismo e torcida em minha formação profissional.
Às companheiras Vanessa Ramalho, Beatriz Abramczuk, Vanessa Oya, Júlia Machado,
Caroline Natania, Lia Marega, Ana Luísa, Mariana Castelhano, Silvana Dalgé, os também
xv
companheiros Vitor Macedo, Marcelo Ananias, Emanuel Borges e Paulo César e todos os
funcionários do Centro de Investigação em Pediatria (CIPED) por toda a ajuda, pelas
risadas diárias e pela amizade.
À equipe de Imunodeficiência Secundária do Ambulatório de Pediatria do Hospital de
Clínicas (HC) e à assistente social Márcia Gimenez, pela ajuda clínica, burocrática e pela
dedicação aos pacientes pediátricos de HIV/AIDS.
Aos amigos do Centro de Hematologia e Hemoterapia (Hemocentro), Ana Leda Longhini,
Irene Pereira dos Santos, Luís Gustavo Fernandes, pela colaboração e dicas científicas
durante o desenvolvimento do projeto.
Aos funcionários das Seções de Coleta, Hematologia e Imunologia da Patologia Clínica,
Laboratório de Pesquisa em AIDS e Hospital Dia, pela ajuda com as coletas de sangue e
exames.
Às minhas amigas Josiane Tonetti, Rafaella Lelis, Juliana do Valle, Thatiane Kanazawa,
Lilian Arzenares, Daiane Teófilo, por estarem comigo desde a graduação, pelas risadas e
pela torcida!
A todos os meus amigos do Treinamento de Liderança Cristã, por serem espelhos de Deus,
pelo incentivo, pela serenidade transmitida, pelo crescimento espiritual e pessoal.
Ao Prof. Dr. Jörg Kobarg, Dra. Gabriela Meirelles e todos os amigos do LNBio, onde eu
aprendi o que é pesquisa científica, pelos preciosos ensinamentos que levarei por toda vida.
Ao meu namorado, Felipe Florindo, pelo amor infinito, pelo carinho, pela paciência, pela
motivação, pela ajuda espiritual, por ouvir os meus lamentos e principalmente por estar
sempre do meu lado.
xvi
Aos pacientes do ambulatório de Imunodeficiências Secundárias do Hospital de Clínicas da
Unicamp, seus responsáveis e todas as demais crianças que participaram deste trabalho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), por conceder minha
bolsa de mestrado (Processo Fapesp: 2012/06525-5) e suporte financeiro para o
desenvolvimento deste projeto (Auxílio Pesquisa: 2010/16513-9).
Ao curso de Pós Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente pelo apoio.
À Universidade Estadual de Campinas, pela oportunidade de realização deste trabalho.
xvii
xviii
“Não é o quanto fazemos, mas quanto amor
colocamos naquilo que fazemos. Não é o quanto
damos, mas quanto amor colocamos em dar.”
(Beata Madre Teresa de Calcutá)
xix
xx
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Painel de análise das células dendríticas periféricas por citometria de fluxo ... 37
Figura 2: Percentual de células dendríticas mielóides e plasmocitóides em relação ao total
de células mononucleares do sangue periférico de pacientes com CV indetectável, CV
≥1000 cópias de RNA/mL e controles ............................................................................... 38
Figura 3: Microscopia de contraste de fase da diferenciação de monócitos em MDDC em
cultura ................................................................................................................................. 39
Figura 4: Painel de análise de células dendríticas derivadas de monócitos por citometria de
fluxo ..................................................................................................................................... 40
Figura 5: Mediana da intensidade de fluorescência de CD40, HLA-DR, CD80, CD83,
CD86 e DC-SIGN das MDDC dos pacientes infectados por HIV com CV indetectável, CV
≥1000 cópias de RNA/mL e controles antes e após o estímulo com AT-2 HIV e com as
microvesículas H9 .............................................................................................................. 41
Figura 6: Concentração das citocinas IL-12 e TGF-β1 (pg/mL) nos sobrenadante de
culturas de MDDC de pacientes infectados pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000
cópias de RNA/mL e controles ........................................................................................... 43
Figura 7: Concentração das citocinas IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-α, TGF-β1
(pg/mL) nos sobrenadante das coculturas de MDDC e de linfócitos de pacientes infectados
pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL e controles ..................... 45
xxi
Figura 8: Expressão gênica relativa de IFN-γ, IL-8, IL-6, IL-9, IFN-α17 e IFN-β1 nas
coculturas de MDDC e linfócitos de pacientes com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de
RNA/mL e controles saudáveis, estimuladas com AT-2 HIV-1 ........................................ 48
Figura 9: Linfoproliferação HIV específica e estimulada por PHA e a porcentagem de
células blásticas CD4+ e CD8+ nas coculturas de MDDC e linfócitos sem estímulo ou
estimuladas com HIV, microvesículas ou PHA de pacientes com CV indetectável ou CV
≥1000 cópias de RNA/mL e controles saudáveis ............................................................... 50
xxii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Resumo da literatura dos principais resultados obtidos nos ensaios clínicos em
adultos, utilizando a vacina terapêutica com MDDC ......................................................... 14
Tabela 2: Genes e assays de expressão gênica de IFN-γ, IL-8, IL-6, IL-9, IFN-α17 e IFNβ1 ......................................................................................................................................... 30
Tabela 3: Dados clínicos dos pacientes infectados pelo HIV com CV indetectável e CV
≥1000 cópias de RNA/mL .................................................................................................. 34
Tabela 4: Mediana (mínimo - máximo) dos parâmetros de hemograma, fenotipagem e CV
de pacientes infectados pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL e
controles saudáveis ............................................................................................................. 35
Tabela 5: Valores de eficiência, R² e das equações das retas dos sistemas dos genes
alvo/gene de referência obtidos pela quantificação gênica absoluta nos experimentos de
RT-qPCR ............................................................................................................................ 47
xxiii
xxiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS: Síndrome da imunodeficiência adquirida (Acquired Immunodeficiency Syndrome)
APC: Aloficocianina (Allophycocyanin)
AT-2: Aldritiol-2
BDCA-2: Blood Dendritic Cell Antigen-2
Blimp-1: B-Lymphocyte–induced maturation protein-1
CBA: Cytometric Bead Array
CD: Cluster of Differentiation
CDC: Center for Diseases Control and Prevention
CMSP: Células Mononucleares do Sangue Periférico
CV: Carga Viral
DC: Células dendríticas (Dendritic Cells)
DC-LAMP: Dendritic Cell Lysossome-Associated Membrane Glycoprotein
DC-SIGN: Dendritic Cell-Specific Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing NonIntegrin
DEC-205: Dendritic Cell Receptor for Endocytosis-205
DMSO: Dimetil-sulfóxido
EDTA: Ácido diaminotetracético etileno (Ethylene Diaminetetraacetic Acid)
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FITC: Isotiocianato de fluoresceína (Fluorescein Isothiocyanate)
GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
GM-CSF: Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GranulocyteMacrophage Colony-Stimulating Factor)
xxv
HGNC: HUGO Gene Nomenclature Committee database
HIV: Vírus da imunodeficiência humana (Human Immunodeficiency Virus)
HLA: Antígenos leucocitários humanos (Human Leukocyte Antigens)
HPRT1: Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
HSV: Vírus herpes simplex (Herpes Simplex Virus)
HTLV: Vírus linfotrópico de células T humanas (Human T-cell Lymphotropic Virus)
ICAM: Intercellular Adhesion Molecule
IFN: Interferon
IL: Interleucina
IP: Inibidores da Protease
ITRN: Inibidores da Transcriptase Reversa análogos de Nucleosídeo/Nucleotídeo
ITRNN: Inibidores da Transcriptase Reversa Não-análogos de Nucleosídeos
LTNP: Long-Term Nonprogressors
MDA5: Melanoma Differentiation-Associated Gene-5
mDC: Células Dendríticas Mieloides
MHC:
Moléculas
do
complexo
principal
de
histocompatibilidade
(Major
Histocompatibility Complex)
MDDC: Células dendríticas derivadas de monócitos (Monocyte-Derived Dendritic Cells)
NK: Natural Killer
NOD-like: Nucleotide-Binding Oligomerization Domain-Like
PACTG 076: Pediatric AIDS Clinical Trials Group Protocol 076
PAMP: Padrões moleculares associados a patógenos (Pathogen-Associated Molecular
Pattern)
xxvi
PCR: Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction)
PBS: Tampão fosfato salino (Phosphate-Buffered Saline)
pDC: Células Dendríticas Plasmocitóides
PE: Ficoeritrina (Phycoerythrin)
PerCP: Clorofila peridinina (Peridinin Chlorophyll)
PGE2: Prostaglandina E2
PHA: Fitohemaglutinina (Phytohemagglutinin)
PRR: Receptores de reconhecimento de padrões (Pattern Recognition Receptors)
RAL: Raltegravir
RIG-I: Retinoic Acid-Inducible Gene-I
RNA: Ácido ribonucleico
RT-qPCR: PCR quantitativo em tempo real (Real Time Quantitative PCR)
SINAN: Sistema de Informação de Agravos de Notificação
SIV: Vírus da imunodeficiência símia (Simian Immunodeficiency Virus)
TARV: Terapia Antirretroviral
TARVc: Terapia Antirretroviral Combinada
TNF: Fator de necrose tumoral (Tumor Necrosis Factor)
TREC: Círculos de excisão do receptor de células T (T-cell Receptor Excision Circles)
TREG: Linfócitos T Regulatórios
WHO: World Health Organization
ZDV: Zidovudina
xxvii
xxviii
1.
INTRODUÇÃO
HIV e AIDS
A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired Immunodeficiency
Syndrome, AIDS) é caracterizada por uma imunossupressão profunda e progressiva gerada
pela infecção do Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Virus,
HIV), retrovírus da família Lentiviridae. Essa imunodeficiência secundária foi reconhecida
primeiramente em 1981, nos Estados Unidos (Barre-Sinoussi et al., 1983; Popovic et al.,
1984) e o primeiro caso no Brasil surgiu em São Paulo em 1980, mas só foi diagnosticado
em 1982 (Castilho & Chequer, 1997).
Atualmente, segundo a World Health Organization (WHO) e a Joint United Nations
Programme on HIV/AIDS, estima-se que 35,3 milhões de pessoas no mundo vivam com
HIV, sendo que destas, 3,3 milhões são crianças (UNAIDS, 2013). No Brasil foram
registrados 686.478 casos de AIDS no Sistema de Informação de Agravos de Notificação
(SINAN) no período de 1980 a 2013, com notificações de 14.352 casos de crianças com
AIDS na faixa etária de zero a 13 anos. Ainda, 12.551 crianças foram notificadas por
exposição vertical ao HIV (Ministério da Saúde, 2013).
Devido a diferenças na estrutura genômica e antigênica, foram identificadas duas
variantes do vírus: HIV-1 e o HIV-2, isolados em 1983 e 1986, respectivamente (Greene et
al., 1991; Feinberg et al., 1992). O HIV-2 possui uma imunossupressão mais lenta e parece
não ter uma transmissão eficiente (Cohen et al., 2008). Já o HIV-1 é mais virulento, com
maior probabilidade de transmissão e maior prevalência mundial, e é dividido em três
grupos de acordo com diferenças encontradas no gene Env (M, N e O). Desses, o grupo M
1
é o mais prevalente e subdividido em nove subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J e K) (Turner et
al., 1999; Simon et al., 2006; Cohen et al., 2008).
A infecção pelo HIV-1 acontece por meio da interação da proteína de seu envelope
viral, gp120, com o receptor CD4 e com os coreceptores de quimiocinas presentes na
superfície da célula-alvo (Turner et al., 1999; Chinen & Shearer, 2002). O curso da
infecção pelo HIV-1 é caracterizado por uma fase aguda com um rápido aumento da carga
viral (CV) e declínio acentuado na contagem dos linfócitos T CD4+ (CD4), que são as
principais células-alvo do HIV (Rosenberg et al., 1997). Nesta fase também há a
disseminação do vírus para os órgãos linfoides secundários e início do desenvolvimento de
uma resposta HIV-específica, principalmente com uma grande proliferação de linfócitos T
CD8+ (CD8) citotóxicos (Douek et al., 2003; Simon et al., 2006; Cohen et al, 2008).
Na fase crônica, as células CD8 e CD4 HIV específicas participam da contenção
parcial da replicação viral, desenvolvendo uma resposta celular contra o vírus (Norris &
Rosenberg, 2001; Munier & Kelleher, 2007). Com a progressão da doença, as respostas
citotóxicas específicas paulatinamente decaem e a conseqüência é a persistência do vírus
(Norris & Rosenberg, 2001). Concomitantemente há um aumento na ativação imunológica
crônica dos linfócitos T de memória e näive e consequente depleção sistêmica destas
células, deixando o indvíduo vulnerável a infecções oportunistas, levando à AIDS (Davison
& Nicoll, 1997; Chinen & Shearer, 2002; Douek et al., 2003).
Transmissão vertical e profilaxia
No adulto, a transmissão do HIV se dá pelo contato com fluídos orgânicos
contaminados a partir de relações sexuais, compartilhamento de agulhas e seringas,
2
transfusão de sangue e hemoderivados e acidentes em centros de saúde (Joshi et al., 1996;
Castilho & Chequer, 1997).
Na criança, a transmissão vertical do HIV é a principal responsável pelos casos de
AIDS e pode ocorrer durante a vida intra-uterina (passagem transplacentária), intra-parto
(exposição da pele ou mucosa do recém-nascido ao sangue ou secreções maternas) ou
durante o aleitamento materno (Blanche et al., 1989; Wara et al., 1993).
A introdução de medidas profiláticas como a investigação da infecção durante o
pré-natal, a cesárea eletiva e o não aleitamento materno, em conjunto com a administração
da terapia antirretroviral (TARV) às gestantes e aos recém-nascidos de mulheres infectadas,
proporcionaram uma significativa redução na transmissão vertical do HIV (Hawkins et al.,
2005; Ministério da Saúde, 2009). No Brasil, a transmissão vertical apresentou uma queda
de 63,8% entre 1996 a 2007, que coincidiu com a introdução de TARV e outras profilaxias
para a gestante (Ministério da Saúde, 2010). O estudo Pediatric AIDS Clinical Trials Group
Protocol 076 (PACTG 076) utilizou um protocolo constituído de Zidovudina (ZDV) oral a
partir da 14ª semana para a gestante, ZDV endovenoso 4 horas antes do parto e ZDV oral
para o recém-nascido por seis semanas, e observou uma redução de 67,5% na taxa de
transmissão vertical (Robinson & Lee, 2000). Atualmente, o Mnistério da Saúde indica o
início de TARV entre a 14ª e a 28ª semana de gestação e de ZDV ao recém-nascido por 30
dias de vida (Ministério da Saúde, 2010; Ministério da Saúde, 2014).
HIV e AIDS em pacientes pediátricos
No momento da transmissão vertical do HIV, o sistema imunológico ainda está em
desenvolvimento e maturação, o que resulta em uma interação vírus-hospedeiro diferente
3
da que ocorre nos adultos (Mc Closkey et al., 2004; Jaspan et al., 2006). A infecção pelo
HIV-1 via transmissão vertical é caracterizada por uma maior replicação viral e declínio da
CV plasmática de modo mais lento, o que pode acarretar em uma evolução clínica mais
rápida e grave (Usuga et al., 2008). Há três formas clínicas de progressão da infecção: os
progressores rápidos (10 a 15% das crianças), cujos sintomas surgem nos dois primeiros
anos de vida; os progressores intermediários (50 a 70%), com sintomas iniciais leves nos
primeiros cinco anos; e os progressores lentos (10 a 15%), os quais são livres de
manifestações até oito anos (Barnhart et al., 1996). Estes últimos podem permanecer
assintomáticos por períodos muito longos, mesmo na ausência de TARV, como é o caso de
alguns adultos, conhecidos como long-term nonprogressors (LTNP) (Ananworanich et al.,
2010). Nas crianças com progressão lenta observaram-se uma robusta resposta citotóxica
pelos linfócitos CD8 HIV específica (particularmente contra a proteína Gag), defeitos na
maquinaria de replicação do HIV (mutações no gene Nef), além de mutações no alelo do
co-receptor de quimiocina CCR5 (CCR5-∆32) (Pereyra et al., 2008; Miura et al., 2010;
Ananworanich et al., 2010). Outros estudos mostraram que a progressão da doença pode
estar relacionada com a similaridade do genótipo dos antígenos leucocitários humanos
(Human Leukocyte Antigens, HLA) entre a criança verticalmente infectada e sua mãe, visto
que a resposta imune materna modula a evolução do vírus autólogo. Assim, a criança
adquire um vírus com maior capacidade em escapar da resposta imune (Tiemessen & Kuhn,
2006). Curiosamente, as crianças que adquiriram o HIV por transfusões de sangue, mesmo
durante o período neonatal, tendem a ter um melhor prognóstico do que crianças
verticalmente infectadas (Frederick et al., 1994).
4
A primeira classificação de AIDS pediátrica foi publicada em 1987 e atualizada em
1994 pelo Center for Diseases Control and Prevention (CDC), a qual inclui quatro
categorias clínicas: N para crianças assintomáticas; A para crianças com sinais e/ou
sintomas clínicos leves; B para aqueles com sinais e/ou sintomas clínicos moderados; e C
para indivíduos com sinais e/ou sintomas clínicos graves. O CDC também classifica os
pacientes pediátricos de acordo com o status imunológico quanto ao percentual dos
linfócitos CD4, sendo Alteração Ausente quando CD4 >25%; Moderada entre 15 a 24%; e
Grave <15% (CDC, 1987; CDC, 1994; Ministério da Saúde, 2014).
Crianças verticalmente infectadas apresentam um amplo espectro de manifestações
clínicas, como, por exemplo, há a ocorrência de vômitos, febre, anemia, linfopenia, atipia
linfocitária, hepatoesplenomegalia, linfoadenopatia, diarreia crônica, sarcoma de Kaposi,
além de atraso no desenvolvimento neuromotor (Chakraborty, 2005). Nosso grupo já
relatou um comprometimento na curva de crescimento de crianças infectadas com relação a
crianças saudáveis (Leandro-Merhi et al., 2001), alterações no metabolismo e na
composição corporal (Ramalho et al., 2011). Há a ocorrência de infecções respiratórias de
repetição e bacterianas de pele, dermatites, lesões orais (especialmente candidíase) e
esofagianas, além da vulnerabilidade à infecção por Treponema pallidum, pelos vírus das
hepatites B e C, HTLV-1/2, vírus herpes simplex (Herpes Simplex Virus, HSV),
citomegalovírus, Toxoplasma gondii, Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis jiroveci
(Ministério da Saúde, 2014) e Epstein Barr Virus (Toro et al., 2010). Com relação ao estado
nutricional, seu comprometimento está relacionado à gravidade da infecção (Centeville et
al., 2005). Além disso, foram relatados níveis plasmáticos subnormais de antioxidantes,
5
como a glutationa, a qual foi inversamente correlacionada com a progressão da doença e
ocorrência de coinfecções (Moreno et al., 2006).
A transmissão vertical do HIV tem um importante impacto no desenvolvimento do
sistema imune e são relatadas alterações no número e função das células imunológicas
(Correa & Muñoz-Fernándes, 2002; Zacarelli-Filho et al., 2007), como depleção profunda
das células CD4, ativação policlonal das células B e persistente ativação imune associada
com a progressão da doença (Ananworanich et al., 2010).
Desde a infância, lactentes infectados apresentaram uma queda mais acentuada dos
valores percentuais e absolutos de CD4 e aumento significativo da subpopulação CD8,
promovendo uma inversão das porcentagens de células CD4 e CD8 (Gallagher et al. 1997).
Na fase crônica da infecção pelo HIV na criança, há um comprometimento do timo
e, conseqüentemente, do desenvolvimento da imunidade a antígenos T dependentes (Joshi
et al., 1990; Correa & Muñoz-Fernándes, 2002). O HIV-1 pode comprometer diretamente
os timócitos e danificar células epiteliais tímicas necessárias para uma timopoiese normal e
sinalização de timócitos (Correa & Muñoz-Fernándes, 2002; Chakraborty, 2005). Há uma
correlação inversa entre os valores de T-cell receptor excision circles (TREC) em crianças
e sua CV, que são considerados marcadores moleculares de emigrantes tímicos para
linfócitos T (Douek et al., 2003), confirmando o impacto do HIV na função do timo. Além
disso, já foi observada elevação da interleucina (IL)-7 plasmática em crianças infectadas e
expostas não infectadas, sugerindo que a exposição ao HIV ou a passagem das proteínas
virais pela placenta pode perturbar a timopoiese (Alfano & Poli, 2005; Resino et al., 2003).
Em crianças infectadas pelo HIV com imunossupressão grave, houve aumento da
porcentagem de linfócitos T regulatórios (Treg) em relação a controles, o que foi associado
6
à progressão à AIDS (Argüello et al., 2012). Há uma redução na produção de IL-17,
correlacionado inversamente com a viremia de HIV-1 (Ndhlovu et al., 2008). Já é descrito
um desequilíbrio das subpopulações de células Natural Killer (NK) (Ananworanich et al.,
2010) e NKT, devido à sua susceptibilidade à infecção pelo HIV (Sandberg et al., 2002).
Desde a fase aguda da infecção pelo HIV, o compartimento B apresentou redução do
número de linfócitos B totais e de memória (Ananworanich et al., 2010; Iwajomo et al.,
2011).
A infecção pelo HIV também compromete o funcionamento da medula óssea e é
freqüentemente associada com anormalidades hematológicas, especialmente anemia, além
de neutropenia, linfopenia, trombocitopenia e alterações na eritropoiese (Silva et al., 2001;
Meira et al., 2005), que podem ser atribuídas aos efeitos diretos e indiretos da infecção pelo
HIV-1, às infecções oportunistas e à toxicidade de TARV (Silva et al., 2001).
Estudos mostram que TARV em conjunto com a plasticidade de recuperação do
sistema imunológico de pacientes pediátricos provoca um aumento do número de células
CD4, o que possivelmente se explica pela reconstituição e função do timo e a constante
produção de linfócitos T naïves, mostrando uma capacidade de regenerar clones de células
T perdidos na infecção por HIV (Correia & Muñoz-Fernándes, 2002).
Terapia antirretroviral
Os progressos na compreensão sobre a dinâmica viral e celular na infecção pelo
HIV, ao lado do desenvolvimento de novas classes de drogas, propiciaram resultados
positivos no tratamento da AIDS. A introdução de TARV às crianças tem como objetivo a
redução da mortalidade e morbidade, adequação do crescimento e desenvolvimento,
7
aumento da qualidade de vida e preservação ou reconstrução do sistema imunológico, por
meio da supressão da replicação viral e consequente aumento dos números de linfócitos
CD4 (Ministério da Saúde, 2009; Guillén et al., 2010; Bunupuradah et al., 2011).
Uma das primeiras drogas utilizadas foi a ZDV, que inibe a replicação viral atuando
sobre a enzima transcriptase reversa e foi utilizada como TARV inicialmente em 1984
(Volberding et al., 1990; Jain & Deeks, 2010). Atualmente, o esquema terapêutico se baseia
em combinações de três ou mais drogas, compondo a TARV combinada (TARVc)
(Ministério da Saúde, 2009). O Ministério da Saúde (2009) agrupa em classes as drogas
utilizadas na TARV para crianças e adolescentes de acordo com o modo de atuação no
processo de replicação viral: inibidores da transcriptase reversa análogos de
nucleosídeo/nucleotídeo (ITRN), como abacavir e tenofovir; inibidores da transcriptase
reversa não-análogos de nucleosídeos (ITRNN), tais como nevirapina e efavirenz;
inibidores da protease (IP), como atazanavir, indinavir, lopinavir e ritonavir; inibidores de
fusão, como a enfuvirtida; e inibidores da integrase, como raltegravir (RAL).
No Brasil, recomenda-se o início de TARVc para crianças menores de 12 meses
com diagnóstico de infecção por HIV independentemente de manifestações clínicas,
porcentagem de células CD4 ou da CV plasmática (Ministério da Saúde, 2009), devido a
benefícios da terapia precoce na recuperação imunológica (Walker et al., 2004; Turkova et
al., 2012). Em maiores de 12 meses de idade, são tratadas as crianças nas categorias B ou
C, ou com porcentagem de CD4 <25% ou ainda com CV >100.000 cópias de RNA/mL
(Ministério da Saúde, 2014).
Entretanto, é sabido que TARV pode gerar toxicidade a curto e longo prazo nos
indivíduos tratados, como o desenvolvimento de anemia, neutropenia, dislipidemia,
8
trombocitopenia, rash cutâneo e exantema, aumento de risco de doenças cardiovasculares,
redução da densidade mineral óssea, nefrotoxicidade, disfunções neurológicas e hepáticas
(Funk et al., 2008; Foster & Fidler, 2010; Marón et al., 2010). A toxicidade de TARV
associada com a resistência viral aos medicamentos, má absorção, dose inadequada por
interações entre as drogas ou ingestão subótima, restrição de medicamentos para idade e má
adesão podem levar à falha no tratamento e ao rebote virológico após a supressão inicial
(Feeney et al., 2003; Geretti et al., 2008; Marón et al., 2010; Turkova et al., 2012; Rath et
al., 2013). A boa adesão está relacionada à supressão virológica e, consequentemente, à
melhora da função imune e qualidade de vida do paciente (Ministério da Saúde, 2009).
Em função destes fatores, a total supressão viral plasmática se faz mais difícil de
alcançar em crianças e adolescentes infectados (Feeney et al., 2003; Geretti et al., 2008). A
utilização de vacinas terapêuticas tem sido apontada como uma possível intervenção para
aumentar a capacidade do organismo infectado de responder contra o HIV, melhorando
assim a efetividade da TARVc (Kundu et al., 1998; Lu et al., 2004; García et al., 2005; Ide
et al., 2006; Van Gulck et al., 2006; Connolly et al., 2008; Allard et al., 2008; García et al.,
2013). Isto implicaria numa melhor qualidade de vida, menor taxa de transmissão do vírus e
diminuição efetiva do uso de drogas.
Células dendríticas e vacinas terapêuticas
A ativação da imunidade celular e humoral pelo hospedeiro desempenha um papel
fundamental na indução de respostas HIV específicas no controle da replicação viral
(Borrow et al., 1994; Koup et al., 1994). Neste sentido, vários estudos têm destacado a
importância das células dendríticas (Dendritic Cells, DC) no controle da infecção pelo HIV
9
(Kundu et al., 1998; Lu et al., 2004; Ide et al., 2006; Connolly et al., 2008; García et al.,
2005; García et al., 2013), visto seu papel como principais células apresentadoras de
antígeno, regulando assim o início da resposta imune mediada por linfócitos T contra
patógenos invasores (Banchereau & Steinman, 1998).
Na periferia, as DC podem se diferenciar em dois tipos principais: as de origem
mielóide (mDC) e as de origem plasmocitóide (pDC) (Siegal et al., 1999; Sabado et al.,
2010). As mDC são CD11c+ e estão associadas com a captação de antígenos, ativação de
células T e secretam altos níveis de IL-12 (Fonteneau et al., 2004; Azzoni et al., 2005). As
pDC são CD11c-CD123+BDCA-2+ e, além da função de apresentação de antígenos, são
potentes produtoras de interferon (IFN)-α, o qual inibe diversas fases da replicação viral
(Chehini et al., 2002).
Como outras células do sistema imunológico, as DC reconhecem padrões
moleculares associados a patógenos (pathogen-associated molecular patterns, PAMP) por
meio dos receptores de reconhecimento de padrões (pattern recognition receptors, PRR),
que transduzem sinais ativadores para dentro da célula (Wu & Schwartz, 2013). Dentre os
PRR expressos na membrana celular estão os receptores Toll-like e receptores de lectina do
tipo C, tais como DC-SIGN (DC-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin), DC-LAMP (DC lysossome-associated membrane glycoprotein), DEC-205 (DC
receptor for endocytosis-205), receptores de manose e langerina. Os PRR também podem
ser expressos no meio intracelular, como RIG-I (retinoic acid-inducible gene-I), MDA5
(melanoma
differentiation-associated
gene-5)
e
NOD-like
(nucleotide-binding
oligomerization domain-like), além de outros receptores Toll-like (Larsson et al., 2005; Wu
& Schwartz, 2013). Quando imaturas, as DC expressam um maior número de receptores
10
CD4 e de correceptores como CCR5 e CXCR4, entre outros, necessários no processo de
infecção do HIV na célula alvo (Douek et al., 2002; Teleshova et al., 2003).
Ao entrar em contato com o antígeno, as DC imaturas internalizam o antígeno por
fagocitose, endocitose ou macropinocitose em vesículas lisossomais. Em seguida, essas
células iniciam o processo de maturação, caracterizado pela redução na expressão dos PRR
(como DC-SIGN) e aumento da expressão das moléculas do complexo principal de
histocompatibilidade
(Major
Histocompatibility
Complex,
MHC),
moléculas
coestimulatórias (como CD40, CD80, CD83 e CD86) e moléculas envolvidas na
quimiotaxia (como CCR7) (Banchereau & Steinman, 1998; Wu & Schwartz, 2013). As DC
maduras também expressam moléculas de adesão, como intercellular adhesion molecule
(ICAM)-1 entre outras, adquirindo a capacidade de migrar através dos vasos linfáticos
aferentes até as áreas ricas em células T nos linfonodos. Nestes locais, as DC apresentam os
antígenos aos linfócitos T, estimulando a expansão clonal dos linfócitos T näives e
influenciando na diferenciação de outras células como NK, linfócitos B e Treg (Banchereau
& Steinman, 1998; Liu et al., 2001). Classicamente, as células CD8 reconhecem peptídeos
endógenos apresentados pelo MHC-I, provocando a lise direta de células infectadas (Hogan
& Hammer, 2001). Já as células CD4 reconhecem peptídeos exógenos apresentados via
MHC-II, secretando assim citocinas como IL-2, que levam a uma resposta citotóxica e
humoral anti-HIV (Donaghy et al., 2003).
Sabe-se que, uma vez nos tecidos linfóides, as DC são capazes de transmitir o HIV
aos linfócitos CD4, espalhando a infecção (Finke et al., 2004; Groot et al., 2006). Tem sido
proposto que o HIV pode aproveitar da função endocítica das DC para infectar as células
CD4 em um processo denominado trans-infecção, envolvendo a captura inicial e
11
internalização de vírions intactos, por meio da interação de alta afinidade de DC-SIGN com
a proteína de envelope gp120 do HIV (Geijtenbeek et. al., 2000; Boily-Larouche et al.,
2012). Além disso, DC-SIGN também está envolvido na formação de sinapses
imunológicas entre as DC e células T, interagindo com ICAM-3 expresso em células CD4
näives (Geijtenbeek et al., 2000; Wu & Schwartz, 2013).
É sabido que durante a infecção pelo HIV em adultos e crianças há o
comprometimento do número e função das subpopulações de DC periféricas e várias
hipóteses têm sido propostas para explicar a redução destas subpopulações na periferia, tais
como a morte destas células devido à infecção viral, um prejuízo de células precursoras de
DC, redução da expressão de marcadores de superfície ou a migração para tecidos linfóides
secundários (Barron et al., 2003; Fonteneau et al., 2004). O HIV também leva à alteração
na expressão e secreção de citocinas pelas DC, como IL-12, IL-15 e IFN-α (Finke et al.,
2004; Groot et al., 2006). A CV se correlaciona inversamente às porcentagens de pDC e
mDC de adultos e com a secreção de IFN-α (Donaghy et al., 2001; Barron et al., 2003;
Finke et al., 2004; Killian et al., 2006; Sabado et al., 2010). Desai et al. (2007) mostraram
uma correlação inversa da frequência de pDC com a ativação de linfócitos CD4 e CD8 ao
longo da progressão da infecção por HIV em crianças.
Crianças e adolescentes com HIV sob TARVc possuem uma tendência para
recuperar o número e a função das subpopulações de DC, possivelmente em função da
maior plasticidade do sistema imunológico nesses pacientes (Azzoni et al., 2005; Zhang et
al., 2006), enquanto que em adultos tratados permanecem diminuídas ao longo ao tempo
nas porcentagens de pDC (Chehimi et al., 2002). Há também maior nos níveis de IL-12 e
12
IFN-α em pacientes com CV indetectável relação aos pacientes com viremia não controlada
(Zhang et al., 2006).
Considerando o papel central que as DC desempenham no direcionamento da
resposta imune, tem sido proposta a manipulação do sistema imunológico para o controle e
eliminação da infecção pelo HIV por meio de vacinas terapêuticas utilizando estas células
como adjuvantes e carreadoras de antígeno para induzir respostas HIV específicas de
células T (Lu et al., 2004; Andrieu & Lu, 2007).
Em macacos, a imunoterapia com DC derivadas de monócitos (Monocyte-Derived
Dendritic Cells, MDDC) pré-cultivadas com o vírus da imunodeficiência símia (Simian
Immunodeficiency Virus, SIV) inativado e na presença oligodesoxinucleotideos
imunoestimuladores com motivos CpG foi capaz de promover o controle virológico e
aumento significativo na resposta celular e humoral SIV específica (Lu et al., 2003;
Teleshova et al., 2006). Além disso, outros estudos já demonstraram a eficácia de
protocolos de vacinação baseados em MDDC contra outras patologias, como o câncer
(Schuler et al., 2003) e doenças infecciosas causadas por Micobacterium tuberculosis
(Demangel et al., 1999), Bordetella pertussis (George-Chandy et al., 2001), Candida
albicans (d’Ostiani et al., 2000), HSV (Schön et al., 2001), entre outras.
Em adultos infectados pelo HIV-1, vários estudos têm mostrado que a vacina
terapêutica com MDDC pulsadas com peptídeos de HIV ou com o vírus inativado são
seguras e podem reduzir a CV mesmo na ausência de TARV e induzir respostas HIV
específicas, tais como a proliferação de células CD4 e CD8, estimulação de citotoxicidade,
indução de IFN-γ e IL-2, além de anticorpos para epítopos específicos do HIV-1 (Tabela 1)
13
(Kundu et al., 1998; Lu et al., 2004; García et al., 2005; Ide et al., 2006; Connolly et al.,
2008; García et al., 2011; García et al., 2013).
Tabela 1: Resumo da literatura dos principais resultados obtidos nos ensaios clínicos utilizando a vacina
terapêutica com MDDC.
Referência
N Pacientes /
Tratamento
Maturação
MDDC
Antígeno
Resultados
Kundu et al.,
1998
6 / näive
Sem
estímulo
gp160 ou peptídeos de Gag,
Pol e Env
Aumento de citotoxicidade HIV específica
e linfoproliferação
Lu et al., 2004
18 / näive
IL-1β, IL-6
e TNF-α
HIV-1 autólogo inativado
com AT-2
Redução de 90% na CV em 8 pacientes e
aumento de CD4 IL-2+ IFN-γ+
García et al.,
2005
12 / TARVc
IFN-α
HIV-1 autólogo inativado
com calor
Redução de 0,5 log na CV em 4 pacientes
e fraco aumento na linfoproliferação de
CD4 e nas células CD8 citotóxicas
Ide et al., 2006
4 / TARVc
TNF-α
Peptídeos de Gag, Env e Nef
Citotoxicidade moderada contra Nef em 2
pacientes
Connolly et al.,
2008
18 / TARVc
IL-1β, IL-6
e TNF-α
Peptídeos de Gag, Env e Pol
Aumento de citotoxicidade contra Gag,
Env e Pol
García et al.,
2011
24 / näive
IL-1β, IL-6
e TNF-α
HIV-1 autólogo inativado
com calor
Tendência de aumento da citotoxicidade
inversamente correlacionada com CV
24 / TARVc
IL-1β, IL6, TNF-α,
PGE2
HIV-1 autólogo inativado
com calor
Redução na CV inversamente
correlacionada com aumento da
linfoproliferação e produção de IFN-γ
García et al.,
2013
As MDDC podem ser geradas in vitro a partir de monócitos cultivados com o fator
estimulador de colônias de granulócitos e monócitos (GM-CSF) e IL-4 (Romani et al.,
1994). Como os monócitos não são alvos principais do HIV, o vírus não é detectado em
MDDC autólogas de pacientes infectados pelo HIV (Sapp et al., 1999). As MDDC
originadas de pacientes com HIV são CD14- e, após o estímulo de maturação in vitro,
apresentam expressão normal de CD40, CD80, CD83 e CD86, além de MHC-I e II,
14
importantes marcadores de maturação necessários para uma efetiva ativação das células T
(Carbonneil et al., 2003; Newton et al., 2006; Buisson et al., 2009).
Os ensaios clínicos publicados até hoje utilizando vacinas de MDDC se focaram na
imunoterapia de adultos. Nestes indivíduos, está claro o papel do controle da viremia pela
TARVc e seu impacto na restauração ou não do sistema imune. Visto o grande impacto da
infecção vertical pelo HIV no desenvolvimento do sistema imunológico dos pacientes
pediátricos, falta uma maior compreensão sobre a relação da infecção crônica e o
desenvolvimento de resposta celular específica para o HIV na faixa etária pediátrica. Sendo
as DC as principais apresentadoras de antígenos para linfócitos T, um melhor conhecimento
da maturação e função de MDDC de crianças e adolescentes com infecção crônica pelo
HIV trará novas informações para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para
melhorar a eficácia de TARVc nesses pacientes.
15
16
2.
OBJETIVOS
Objetivo geral
Analisar a influência da CV de HIV-1 nas DC periféricas e na maturação e função
de MDDC de pacientes pediátricos, utilizando partículas inativadas do HIV-1.
Objetivos específicos
Em crianças e adolescentes com infecção vertical pelo HIV sob TARVc, verificar:
1. Número de linfócitos CD3, CD4 e CD8;
2. As freqüências de mDC e pDC;
3. O fenótipo de maturação de MDDC quanto à expressão de CD40, CD80, CD83,
CD86, DC-SIGN e HLA-DR;
4. A produção de citocinas no sobrenadante de cultura de MDDC;
5. A interação entre MDDC e linfócitos T em coculturas pela avaliação da
linfoproliferação, expressão gênica e produção de citocinas frente ao estímulo com
partículas de HIV-1 inativado por aldritiol-2.
17
18
3.
MÉTODOS
Populações estudadas
População de pacientes e local do estudo
O estudo transversal foi conduzido dentre uma coorte de 180 crianças e
adolescentes infectados com HIV, com idade de zero a 21 anos, recrutados no Ambulatório
de Imunodeficiência Secundária da Pediatria do Hospital de Clínicas (HC) da Universidade
Estadual de Campinas (UNICAMP), localizada na cidade de Campinas, no estado de São
Paulo, Brasil. O acompanhamento dos indivíduos ocorreu no próprio Ambulatório.
Os critérios de inclusão foram a presença da infecção por transmissão vertical do
HIV comprovada de acordo com os critérios do Ministério da Saúde (2009) e uso de terapia
antirretroviral por, ao menos, seis meses.
Os critérios de não inclusão para os pacientes foram a evidência clínica e/ou
laboratorial de co-infecção por hepatite B ou C, citomegalovírus, sífilis, toxoplasmose ou
tuberculose e ocorrência de malformação congênita, doença genética ou condição clínica
grave. Os dados clínicos foram coletados dos prontuários dos pacientes.
As crianças eleitas tiveram anotados detalhadamente os endereços residenciais com
pontos de referência, telefone residencial, endereço e telefone comerciais dos responsáveis,
além de um endereço alternativo, para evitar as perdas por mudança de endereço.
Visando uma maior compreensão do impacto da CV sobre a resposta imune, os
pacientes foram separados em dois grupos, de acordo com sua CV plasmática de HIV-1:
- Pacientes com controle virológico: apresentavam CV indetectável (CV <50 cópias de
RNA/mL) na data de coleta dos exames e durante o último ano, no mínimo.
19
- Pacientes viremicos: apresentavam CV ≥1000 cópias de RNA/mL na data de coleta dos
exames e CV >50 cópias de RNA/mL nos últimos seis meses. Viremia acima de 1000
cópias de RNA/mL é considerada falha virológica em crianças (Bunupuradah et al., 2011).
Aspectos éticos
Na entrevista de acolhimento, os pais ou representantes legais, as crianças e
adolescentes foram informados sobre os objetivos, métodos, benefícios e duração do
estudo. Após ciência da natureza dos procedimentos e desconfortos aos quais os pacientes
seriam submetidos e com capacidade de livre arbítrio, sem qualquer coação, foi solicitado
que os responsáveis assinassem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(ANEXOS). Os riscos previstos para o paciente como ansiedade e o desconforto da coleta
de sangue foram informados. Os responsáveis pelo paciente (e o próprio paciente, no caso
dos adolescentes) e o pesquisador responsável pelo estudo assinaram o Termo em duas
vias, uma arquivada na instituição e outra entregue aos responsáveis. As amostras dos
pacientes foram identificadas com siglas para preservação do sigilo dos participantes.
Todos os procedimentos obedeceram às recomendações para pesquisas biomédicas
envolvendo seres humanos propostas pela Resolução de número 196 de 10 de outubro de
1996, do Conselho Nacional de Saúde. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética da
Faculdade de Ciências Médicas (FCM), da UNICAMP, com o protocolo de número
876/2010 (ANEXOS).
20
Cálculo amostral
Considerando um teste bicaudal com desvio padrão de 4,5 (em resultados
preliminares de ensaios de proliferação celular específica para o HIV-1), a diferença a ser
detectada de 5, o nível de significância de 5% e o poder do teste de 80%, o número
amostral calculado foi de 13 indivíduos em cada grupo de pacientes com HIV.
População de controles saudáveis
Crianças e adolescentes saudáveis entre quatro e 21 anos de idade foram convidados
a participar do estudo como controles. Foi realizada uma consulta médica e exames
laboratoriais para avaliar a saúde destes indivíduos. Os critérios de exclusão para os
controles foram a evidência clínica e/ou laboratorial de infecção por HIV, hepatite B ou C,
citomegalovírus, sífilis, toxoplasmose ou tuberculose, ou ocorrência de malformação
congênita, imunodeficiência primária, doença genética, condição clínica grave ou uso de
imunossupressor.
Coleta de sangue
Entre agosto de 2012 a maio de 2014, as coletas dos controles saudáveis foram
realizadas no Centro de Investigação em Pediatria (CIPED) na FCM da UNICAMP,
enquanto que as coletas das crianças infectadas com o HIV foram realizadas na Seção de
Coleta da Patologia Clínica do HC da UNICAMP. O volume total de amostra de sangue
periférico coletado foi de 20 mL a 50 mL.
21
Hemograma
O hemograma foi realizado a partir de um mililitro de sangue periférico coletado em
tubo com ácido diaminotetracetico etileno (EDTA) K3 líquido na Seção de Hematologia do
Laboratório de Patologia Clínica do HC da UNICAMP, havendo a contagem de células
global e diferencial no equipamento XE 5000 (Sysmex Corporation, Japão).
Carga viral de HIV
A quantificação da CV de HIV-1 foi realizada a partir do plasma obtido de 4 mL de
sangue periférico coletado em tubo com EDTA K3 líquido no Laboratório de AIDS do HC
da Unicamp, por meio do método quantitativo de Branched-DNA no equipamento Versant
440 (Siemens Healthcare Diagnostics inc., EUA) até março de 2013. A partir de abril de
2013, empregou-se o sistema Abbott M2000sp Real Time (Abbott Molecular, EUA). Os
limites mínimo e máximo para detecção do RNA de HIV-1 foram de 50 e 500.000 cópias
de RNA/mL, respectivamente.
Imunofenotipagem de linfócitos T
A imunofenotipagem dos linfócitos CD3, CD4 e CD8 foi realizada a partir de 0,5
mL de sangue periférico coletado em tubo com EDTA K3 líquido, por meio de citometria
de fluxo (citômetro de fluxo BD FACSCalibur, BD Biosciences, EUA). Os exames dos
pacientes foram efetuados no Laboratório de AIDS do HC da UNICAMP por citometria
com quatro marcadores: anti-CD3 conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC), antiCD4 conjugado a aloficocianina (APC), anti-CD8 conjugado a ficoeritrina (PE) e anti-
22
CD45 conjugado a proteína clorofila peridinina (PerCP), por meio do ensaio Trucount para
contagem absoluta de células. A imunofenotipagem dos controles saudáveis foi feita no
Laboratório de Marcadores Celulares do Centro de Hematologia e Hemoterapia
(HEMOCENTRO) da UNICAMP, usando citometria com três marcadores monoclonais:
anti-CD3 PerCP, anti-CD4 APC, e anti-CD8 PE, gerando as porcentagens de cada
população linfocitária. Para a contagem absoluta de linfócitos CD3, CD4 e CD8 dos
controles, foram usadas as contagens absolutas de linfócitos do hemograma da mesma
amostra.
Fenotipagem de células dendríticas plasmocitóides e mielóides
Após isolamento por gradiente de densidade (Ficoll-Paque, GE Healthcare, Suécia),
células mononucleares do sangue periférico (CMSP) na concentração de 1x106 células/mL
foram incubadas com anticorpos anti-CD14 PE, anti-HLA-DR PerCP, anti-CD11c FITC
(BD Biosciences, EUA) e anti-BDCA-2 APC (Miltenyi Biotec, Alemanha), para distinguir
as populações de células dendríticas plamocitóides e mielóides. Após lavagem, a leitura foi
realizada em citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, EUA). Foram adquiridos
no mínimo 30.000 eventos para análise no programa computacional FACSDiva versão 6.2
(BD Biosciences, EUA).
23
Coculturas de MDDC e linfócitos
Isolamento das células mononucleares do sangue periférico
As CMSP foram isoladas por centrifugação por gradiente de densidade (FicollPaque, GE Healthcare, Suécia). Após a contagem em câmara de Neubauer, as células foram
ressuspendidas em tampão para separação magnética (Miltenyi Biotec, Alemanha), na
concentração de 107 células em 80 µL de tampão.
Os monócitos foram separados dentre CMSP usando 20 µL de esferas magnéticas
contendo anti-CD14 para cada 107 células, de acordo com o protocolo do fabricante (kit de
seleção positiva, Miltenyi Biotec, Alemanha), para assim proceder a separação magnética
em equipamento VarioMacs (Miltenyi Biotec, Alemanha). Estas células foram utilizadas
para a obtenção de células dendríticas em cultura.
Obtenção em cultura de MDDC
As células CD14+ foram cultivadas na concentração de 2x106 células/mL em placas
de poliestireno de seis poços com fundo achatado (Nunc, Dinamarca) com até 4 mL/poço
em incubadora (Forma Scientific, Thermo Scientific, EUA) a 37ºC, com atmosfera de 5%
de CO2, em meio AIM-V (Gibco, EUA), com 50 ηg/mL de IL-4 e 50 ηg/mL de GM-CSF
(PeproTech, EUA) para promover a diferenciação de monócitos em células dendríticas.
No terceiro dia de cultura foi acrescentado um reforço de citocinas (50 ηg/mL de
IL-4 e 50 ηg/mL de GM-CSF) e meio de cultura AIM-V (Gibco, EUA). No sexto dia de
cultura, uma alíquota de MDDC foi incubada com anticorpos monoclonais humanos
produzidos em camundongo anti-CD11c FITC, anti-HLA-DR PerCP, anti-CD40 APC,
24
anti-CD80 PE, anti-CD83 APC, anti-CD86 PE e anti-DC-SIGN PE (BD Biosciences,
EUA) para verificação de sua diferenciação. A leitura foi realizada em citômetro de fluxo
FACSCalibur (BD Biosciences, EUA) com a aquisição de 5.000 eventos para análise no
programa computacional BD FACSDiva versão 6.2 (BD Biosciences, EUA).
MDDC pulsadas com HIV inativado
No sexto dia de cultura, as MDDC foram pulsadas por duas horas com HIV-1 clade
B (MN) inativado por aldritiol-2 (AT-2) cultivado em células H9, gentilmente cedido pelo
Dr. Jeffrey Lifson, coordenador de AIDS and Cancer Virus Program da Instituição SAICFrederick, NCI-Frederick, EUA. As células H9 são derivadas de uma linhagem de linfoma
cutâneo de linfócitos T, altamente permissiva à proliferação do HIV. O antígeno foi diluído
em PBS (Phosphate-Buffered Saline) estéril (Sigma-Aldrich, EUA) e utilizado na
concentração de 750 ηg/mL de equivalente de p24 em cultura e como controle negativo foi
usada uma solução de microvesículas de uma cultura de células H9 não infectadas por HIV1, também diluídas em PBS estéril (Sigma-Aldrich, EUA), em concentração protéica total
equivalente ao AT-2 HIV-1. Após a incubação com os antígenos, as células foram lavadas
com meio AIM-V e assim foi adicionado novo reforço de IL-4 e GM-CSF e também
citocinas recombinantes para a maturação das MDDC, sendo 50 ηg/mL de TNF-α, 100
ηg/mL de IL-6 e 10 ηg/mL de IL-1β (PeproTech, EUA).
No oitavo dia de cultura, a placa foi incubada em banho de gelo por seis minutos e o
sobrenadante foi retirado para posterior análise de citocinas por meio da técnica Cytometric
Bead Array (CBA) e Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Para maior
recuperação das células aderidas à placa, foi adicionado 1 mL de solução de 0,25% Tripsina
25
com EDTA (Gibco, EUA) durante 10 minutos e, em seguida, as células foram lavadas com
meio AIM-V e ressuspensas na concentração de 2x106 células/mL com meio AIM-V.
Uma alíquota de MDDC foi incubada com anticorpos monoclonais humanos
produzidos em camundongo anti-CD11c FITC, anti-HLA-DR PerCP, anti-CD40 APC,
anti-CD80 PE, anti-CD83 APC, anti-CD86 APC e anti-DC-SIGN PE (BD Biosciences,
EUA), para avaliar a maturação celular por citometria de fluxo.
Para ilustrar a diferenciação morfólogica de monócitos em MDDC, as células de um
controle saudável foram fotografadas por microscopia de contraste de fase no terceiro dia
de cultura com GM-CSF e IL-4, antes e após a indução da maturação com citocinas
próinflamatórias e incubação com AT-2 HIV-1.
Separação e viabilidade de linfócitos
Após a separação magnética, as células CD14- (em sua maioria linfócitos) foram
congeladas na concentração de 107 células/mL a -80ºC em soro bovino fetal com 10% de
dimetil-sulfóxido (DMSO) para posterior cocultivo. No dia anterior à incubação com as
MDDC, as células foram descongeladas em banho-maria a 37ºC e incubadas em meio
AIM-V (com 10% de soro bovino fetal) na concentração de 3x106 células/mL em placas de
poliestireno de seis poços com fundo achatado ou garrafas de cultura (TPP, Suíça) em
incubadora a 37ºC, com atmosfera de 5% de CO2 durante 24 horas. No dia seguinte, foi
verificada a viabilidade e acertada a concentração para 1x107 células/mL com meio AIMV.
26
Cocultivo de MDDC e linfócitos
As células dendríticas pulsadas com HIV inativado e com microvesículas H9 foram
incubadas com linfócitos, na proporção de 1 MDDC: 30 linfócitos em meio AIM-V com
10% de soro humano AB inativado (Sigma, EUA), em incubadora a 37ºC, com atmosfera
de 5% de CO2 durante 48 horas. No décimo dia, o sobrenadante da cocultura foi coletado e
congelado a -80°C para posterior análise das citocinas através das técnicas de CBA e
ELISA. As células foram ressuspensas em 350 µL de tampão RA1 do kit comercial Illustra
RNAspin Mini (GE Healthcare, EUA) para posterior extração do mRNA.
Produção de citocinas no sobrenadante
No oitavo dia de cultura, o sobrenadante das MDDC foi coletado e congelado a 80°C para posterior análise das citocinas, assim como o sobrenadante das coculturas de
MDDC e linfócitos após 48 horas de incubação. Foram verificadas as concentrações de IL2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α, IFN-γ e IFN-α pela técnica de CBA (Human Th1/Th2
Cytokine Kit e Human IFN-α Flex Set, BD Biosciences, EUA) em pg/mL no citômetro
FACSVerse (BD Biosciences, EUA). A análise foi realizada com o programa
computacional FCAP Array versão 3.0.1 (BD Biosciences, EUA). Os limites de detecção
foram 2,6 ρg/mL para IL-2 e IL-4, 2,4 ρg/mL para IL-5, 2,8 ρg/mL para IL-10 e TNF-,
7,1 ρg/mL para IFN- e 1,5 ρg/mL para IFN-α, sendo que para amostras que tiveram
concentrações inferiores a estes limites foram estabelecidos valores de metade dos limites
de detecção para respectiva citocina.
27
As concentrações de IL-12, IL-6 e Transforming Growth Factor (TGF)-β1 foram
verificadas pela técnica de ELISA, usando os kits comerciais Human IL-12 p40/p70 ELISA
Kit (Invitrogen, EUA), BD OpteiaTM IL-6 (BD Biosciences, EUA) e Human TGF-β1 Duo
Set ELISA Kit (R&D Systems, EUA). Os limites de detecção foram de 2,0 ρg/mL para IL12, 4,7 ρg/mL para IL-6 e 15,6 ρg/mL para TGF-β1, sendo também adotado o valor da
metade destas concentrações para amostras que tiveram concentrações inferiores aos limites
de detecção.
Extração do RNAm e reação de transcrição reversa (cDNA)
As células cultivadas na cocultura tiveram o RNAm extraído pelo kit comercial
Illustra RNAspin Mini (GE Healthcare, EUA). Para a quantificação de RNA foi usado o kit
comercial Qubit™ RNA BR (Invitrogen, EUA), segundo o protocolo do fabricante e leitura
no fluorômetro Qubit® 2.0 (Invitrogen, EUA).
A transcrição reversa foi efetuada utilizando o kit comercial High Capacity cDNA
Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, EUA) segundo o protocolo do fabricante.
Após pipetagem e centrifugação breve, as amostras foram incubadas em termociclador com
gradiente de temperatura (Mastercycler Eppendorf, EUA), em um ciclo de 25ºC por 10
minutos, 37º por 120 minutos, 85ºC por 5 minutos, seguido de um resfriamento a 4ºC. O
cDNA foi armazenado a -20°C.
28
PCR quantitativo em tempo real
Para uma análise preliminar da expressão gênica de citocinas das coculturas, foi
realizado PCR array usando a placa Human Common Cytokines PCR Array (Life
Technologies, EUA), que possui 28 genes de interesse das citocinas em triplicata e quatro
genes de normalização de expressão (housekeeping genes). Para o array, foram realizados
pools com amostras de seis pacientes com carga viral indetectável, seis com CV ≥1000
cópias de RNA/mL e de seis controles saudáveis, a fim de totalizar 10 ng/poço de RNA
convertido em cDNA. As reações de PCR foram realizadas de acordo com o protocolo do
fabricante, usando o reagente TaqMan® Gene Expression Master Mix (Life Technologies,
EUA), com o sistema ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems,
EUA). Foram identificados seis genes alvo com hiper ou hipoexpressão em relação ao
controle saudável estimulado com as microvesículas H9 (amostra de referência com
quantificação igual a 1,0), os quais foram avaliados utilizando assays específicos para a
confirmação destas diferenças. A Tabela 2 apresenta a nomenclatura dos genes de acordo
com o banco de dados de HUGO Gene Nomenclature Committee database (HGNC).
29
Tabela 2: Genes e assays de expressão gênica utilizados no estudo.
Símbolo
Nome
Task
Nº TaqMan Assay
Amplificado (pb)
GAPDH
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
Endógeno
4333764 F
122
HPRT1
Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Endógeno
4333768 F
100
IFN-α17
Interferon, alpha 17
Alvo
Hs00819693_sH
217
IFN-β1
Interferon, beta 1, fibroblast
Alvo
Hs01077958_s1
73
IFN-γ
Interferon, gamma
Alvo
Hs00989291_m1
73
IL-6
Interleukin 6 (interferon, beta 2)
Alvo
Hs00985639_m1
66
IL-8
Interleukin 8
Alvo
Hs00174103_m1
101
IL-9
Interleukin 9
Alvo
Hs00914237_m1
104
Antes de se realizar um experimento de expressão gênica utilizando a técnica de
PCR quantitativo em tempo real (Real Time Quantitative PCR, RT-qPCR), foi realizada a
quantificação absoluta validando o sistema gene alvo/gene de referência. Os genes alvo
foram validados para os genes de referencia GAPDH e HPRT1 utilizando-se sete
concentrações diferentes de cDNA (diluições seriadas de 5 vezes) de uma amostra de uma
cocultura de um controle saudável. A eficiência da curva (E=10(-1/slope)) foi calculada com o
programa 7500 software versão 2.0.5 (Life Technologies, EUA), devendo estar próxima ao
100%. A partir disto, construiu-se um gráfico do logaritmo das concentrações de cDNA
utilizadas pela diferença das médias dos ciclos threshold do gene de referência e do gene
alvo obtidas para cada concentração. Equações dos gráficos constituindo retas com
inclinação menor do que 0,1 foram consideradas estáveis nas concentrações testadas.
Prosseguiu-se então com os experimentos para quantificação relativa da expressão
gênica dos genes alvo. O produto da transcrição reversa realizada conforme descrito
30
anteriormente foi utilizado nas reações de RT-qPCR em triplicata utilizando um volume
total de reação de 12,5 μL pelo método TaqMan® (Applied Biosystems, EUA). As leituras
de fluorescência foram realizadas no equipamento ABI Prism 7500 Sequence Detection
System e, posteriormente, analisadas pelo 7500 software versão 2.0.5 (Applied Biosystems,
EUA). Para a avaliação da expressão gênica foi utilizado o método de 2-ΔΔCt, onde os dados
representam mudanças da expressão com relação ao controle saudável com o estímulo das
microvesículas H9 com quantificação relativa igual a 1,0, sendo todos os genes
normalizados com a combinação dos controles endógenos GAPDH e HPRT1.
Linfoproliferação HIV específica
Para avaliar a linfoproliferação HIV específica foram usadas as MDDC pulsadas
com AT-2 HIV-1, com microvesículas H9 e células não estimuladas. As MDDC foram
cocultivadas com linfócitos, na proporção de 1 MDDC: 30 linfócitos em meio AIMV com
10% de soro humano AB inativado, em placas de poliestireno de 96 poços com fundo
arredondado (Nunc, Dinamarca) a 37ºC, com atmosfera de 5% de CO2 durante 6 dias. A
fitohemaglutinina (PHA), na concentração de 7,5 µg/mL (Sigma, EUA), foi utilizada como
controle positivo e o meio AIM-V (Gibco, EUA) foi usado como cultivo sem estímulo.
Após a coleta da cultura, foi realizada a marcação fenotípica dos linfócitos com
anticorpos anti-CD3 PerCP, anti-CD4 FITC e anti-CD8 APC (BD Biosciences, EUA). A
leitura das amostras foi realizada no citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences,
EUA), adquirindo-se 50.000 eventos totais para análise no programa computacional BD
FACSDiva versão 6.2 (BD Biosciences, EUA). As células blásticas foram identificadas por
31
observação em forward e side light scatters. A proliferação linfocitária foi avaliada pelo
percentual de blastos viáveis CD3+. Para cada cultura, o percentual de blastos foi dado por:
Percentual de células no gate de blastos
x 100
Percentual de blastos + percentual de linfócitos pequenos
O cálculo de blastos para cada cultura estimulada foi feito da seguinte forma:
1. Blastos de HIV = percentual de blastos de HIV - percentual de blastos de
microvesículas.
2. Blastos de PHA = percentual de blastos de PHA - percentual de blastos do controle
sem estímulo.
As porcentagens das subpopulações CD4 e CD8 foram quantificadas dentre as
células no gate de blastos de cada cultura. Assim, foram comparadas as suas proporções e
não os números absolutos.
Análise estatística
Os dados foram organizados e analisados em SPSS® software for Windows versão
17.0. (SPSS Inc, EUA). A análise estatística foi realizada com os testes de Kruskal-Wallis,
Wilcoxon, Mann-Whitney, comparações múltiplas não paramétricas e Correlação de
Spearman. O nível de significância adotado foi p valor <0,05. Os gráficos foram feitos no
Software GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad Software, EUA).
32
4.
RESULTADOS
População de estudo
Para este estudo foram recrutados 39 pacientes infectados pelo HIV-1, em uso de
terapia antirretroviral, os quais foram agrupados de acordo com a CV plasmática de HIV-1,
sendo 25 pacientes com CV indetectável e 14 pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL
no dia da coleta. A Tabela 3 mostra os dados clínicos destes pacientes, coletados de seus
prontuários.
Para o grupo controle foram recrutados 20 indivíduos, sendo que destes nove eram
do sexo masculino. A mediana de idade foi de 16,39 anos, com a idade mínima foi de 4,06
e a máxima de 22,30. Não houve diferença de idade entre os três grupos (p=0,110, teste de
Kruskal-Wallis). Nenhum controle havia usado antiinflamatórios e antibióticos no período
de um mês antes da coleta. Também não apresentavam nenhum histórico familiar de
imunodeficiência primária.
O volume de sangue coletado de alguns pacientes e controles não foi suficiente para
realizar todos os experimentos descritos anteriormente. Alguns pacientes passaram por uma
segunda coleta de sangue para que fossem realizados os demais experimentos.
33
Tabela 3: Dados clínicos dos pacientes infectados pelo HIV com CV indetectável e CV ≥1000 cópias de
RNA/mL (CV ≥1000). CDC: Centro de Controle de Doenças e Prevenção; NA: não se aplica; ITRN:
Inibidores da transcriptase reveresa análogos à nucleosídeos e nucleotídeos; ITRNN: Inibidores da
transcriptase reveresa não-análogos à nucleosídeos e nucleotídeos; IP: Inibidores da protease; RAL:
raltegravir.
CV ≥1000
CV indetectável
n
Sexo
25
Masculino
13
Feminino
12
Mediana de idade em anos (mínimo - máximo)
13,50 (4,32 - 21,27)
Idade (anos)
≤2
0
2-5
1
>5
24
Classificação clínica pelo CDC
N
3
A
1
B
17
C
4
Classificação imunológica pelo CDC
1
4
2
11
3
10
CD4
≥ 25%
23
*15% - 24%
2
< 15%
0
Nadir médio (mínimo - máximo)
376 (10 - 954)
Idade no início da TARV em anos
1,95 (0,00 - 9,97)
Tempo de tratamento em anos
10,32 (3,24 - 19,58)
TARV
2 ITRN + 1 ITRNN
9
2 ITRN + 1 IP
8
2 ITRN + 2 IP
2
3 ITRN + 1 IP
0
**2 ITRN + 1 ITRNN + 1 IP
1
2 ITRN + 1 ITRNN + 1 IP + RAL
1
2 ITRN + 1 ITRNN + 2 IP + RAL
2
2 ITRN + 1 IP + RAL
1
2 ITRN + 2 IP + RAL
1
1 ITRN + 2 IP + RAL
0
*Em uma segunda coleta, um paciente mudou a classificação de CD4 para <15%.
** Em uma segunda coleta, um paciente mudou a TARV para 2 ITRN + 1 ITRNN.
34
14
6
8
9,13 (1,60 - 19,45)
2
1
11
3
1
6
4
2
4
8
6
5
3
351 (20 - 1377)
1,05 (0,00 - 6,70)
7,38 (1,30 - 18,43)
2
6
2
1
2
0
0
0
0
1
Hemograma, linfócitos CD3, CD4 e CD8 e carga viral
Foram realizados hemogramas e fenotipagens de linfócitos CD3, CD4 e CD8 de
todos os pacientes e controles. Na Tabela 4 são apresentados os valores referentes aos
hemogramas, imunofenotipagens e CV em sangue periférico dos pacientes e controles
saudáveis.
Tabela 4: Mediana (mínimo - máximo) dos parâmetros de hemograma, fenotipagem e CV de pacientes
infectados pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL (CV ≥1000) e controles saudáveis.
P valor corresponde à comparação dos grupos pelo teste de Kruskal-Wallis.
Leucócitos (109 cél/L)
Linfócitos (109 cél/L)
Monócitos (109 cél/L)
Neutrófilos (109 cél/L)
Eosinófilos (109 cél/L)
Basófilos (109 cél/L)
Eritrócitos (1012 cél/L)
Hemoglobina (g/dL)
Hematócrito (%)
Plaquetas (109 cél/L)
CD3 (106 cél/L)
CD4 (106 cél/L)
CD8 (106 cél/L)
Razão CD4/CD8
CV de HIV-1 (cópias RNA/mL)
CV de HIV-1 (log RNA/mL)
CV ≥1000
n=14
6,04 (3,52-19,75)
2,77 (1,81-13,88)
0,63 (0,39-2,62)
2,66 (0,57-7,35)
0,15 (0,08-0,77)
0,02 (0,01-0,11)
4,31 (3,29-5,14)
12,5 (9,0-14,3)
36,2 (29,5-43,3)
273 (134-522)
2218 (1617-8590)
822 (174-2161)
1285 (954-6216)
0,55 (0,08-1,40)
4820 (1215-471374)
3,7 (3,1-5,7)
CV indetectável
n=25
5,87 (3,23-10,10)
2,25 (1,30-5,92)
0,53 (0,28-0,82)
2,72 (0,41-5,10)
0,16 (0,00-1,07)
0,02 (0,00-0,06)
4,21 (3,18-5,82)
14,0 (11,6-16,4)
40,7 (34,2-47,5)
230 (156-428)
1842 (918-6004)
828 (372-2908)
937 (421-2828)
0,93 (0,46-1,96)
<50
N/A
Controles
n=20
6,73 (4,00-12,00)
2,28 (1,14-6,67)
0,46 (0,27-0,81)
3,14 (1,61-8,48)
0,15 (0,05-1,19)
0,02 (0,00-0,09)
4,83 (3,85-5,34)
13,4 (11,9-16,3)
39,5 (36,3-47,0)
256,5 (141-384)
1666 (896-4662)
891,5 (424-2210)
658,5 (361-1958)
1,32 (0,81-2,04)
N/A
N/A
p valor
0,459
0,031
0,029
0,370
0,911
0,862
0,016
0,005
0,002
0,385
0,008
0,872
<0,001
<0,001
N/A
N/A
Na série vermelha, os pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL tiveram menor
número absoluto de eritrócitos que os controles saudáveis (p<0,05, teste de comparações
múltiplas não paramétricas). Além disso, estes pacientes tiveram menor concentração de
hemoglobina e percentual de hematócrito em relação aos pacientes com CV indetectável e
35
em relação aos controles saudáveis (p<0,05, teste de comparações múltiplas não
paramétricas para todos os casos).
Na série branca, os pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL apresentaram
maior número absoluto de monócitos e de CD3 que os controles saudáveis (p<0,05, teste de
comparações múltiplas não paramétricas para ambos). Quanto à subpopulação de linfócitos
CD8, os pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL tiveram um maior número absoluto
de CD8 em relação aos pacientes com CV indetectável e os ambos os grupos de pacientes
apresentaram contagem de CD8 mais elevada e menor razão CD4/CD8 em relação ao
grupo controle (p<0,05, teste de comparações múltiplas não paramétricas para todos os
casos). Foi observada uma correlação negativa entre a CV e a porcentagem de células CD4
para os pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL (Spearman’s rho=-0,846, p<0,001,
n=14).
Caracterização das subpopulações de células dendríticas do sangue periférico
Na Figura 1 é mostrado um exemplo de caracterização das mDC e pDC por
citometria de fluxo, sendo descritas as suas porcentagens em 30.000 eventos totais de
CMSP. As mDC foram caracterizadas como CD14-CD11c+HLA-DR+ e as células pDC
foram caracterizadas como CD11-BDCA-2+HLA-DR+.
36
Figura 1: Painel de análise das DC periféricas por citometria de fluxo. Após seleção das células
mononucleares do sangue periférico foi desenhado um gate nas populações CD14-CD11c+ para as DC
mielóides (mDC), outro nas populações CD11c-BDCA-2+ para as DC plasmocitóides (pDC) e observou-se
então a expressão de HLA-DR. As porcentagens de mDC e pDC são calculadas em relação ao Grand Parent.
Na Figura 2 são apresentados os percentuais das subpopulações de mDC e pDC em
pacientes infectados por HIV e em controles saudáveis. Ao se comparar os três grupos,
houve uma diferença significativa para as duas subpopulações de DC periféricas, porém
estas diferenças não foram identificadas nos testes de comparações múltiplas não
paramétricas. Não foi observada correlação entre as porcentagens de ambas as
subpopulações de DC com a CV nos pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL, porém a
porcentagem de pDC correlacionou diretamente com o tempo do tratamento nos pacientes
com CV indetectável (Spearman’s rho=0,554, p=0,004, n=25).
37
B
p=0,041
8.0
2.0
6.0
1.5
pDC (%)
mDC (%)
A
4.0
2.0
p=0,045
1.0
0.5
0.0
CV indetectável
n=25
CV  1000
n=14
0.0
Controles
n=20
CV indetectável
n=25
CV  1000
n=14
Controles
n=20
Figura 2: Percentual de células dendríticas mielóides (A) e plasmocitóides (B) em relação ao total de células
mononucleares em sangue periférico de pacientes com CV indetectável (), CV ≥1000 cópias de RNA/mL
(CV ≥1000, ) e controles (■), obtido por citometria de fluxo. P corresponde à comparação dos grupos pelo
teste de Kruskal-Wallis.
Caracterização das células dendríticas derivadas de monócitos
Na Figura 3 é apresentado um exemplo da morfologia das MDDC obtidas em
cultura antes e após os estímulos de maturação. Quando imaturas, as MDDC são
caracterizadas por um aspecto arredondado, apresentando uma morfologia estrelada com
projeções dos dendritos após a maturação.
38
A
B
C
.
Figura 3: Microscopia de contraste de fase da diferenciação de monócitos em MDDC em cultura de um
controle saudável (A) no terceiro dia de cultura com GM-CSF e IL-4, (B) antes e (C) após a indução da
maturação com citocinas próinflamatórias e incubação com AT-2 HIV (aumento de 20x).
Na Figura 4 é apresentado o painel de caracterização das MDDC pela expressão dos
marcadores de maturação por citometria de fluxo. A diferenciação se deu com a partir de
monócitos isolados com pureza de aproximadamente 97% e as MDDC foram
caracterizadas como CD14-CD11c+. Foi analisada a expressão de CD40, HLA-DR, CD80,
CD83, CD86 e DC-SIGN.
39
Figura 4: Painel de análise das MDDC por citometria de fluxo. Após seleção das células viáveis em um
gráfico FSC x SSC é feito um gate nas populações CD11c+ (próximo a 100%) e observa-se então a expressão
de CD40, HLA-DR, CD80, CD83, DC-SIGN (CD209), CD86.
A Figura 5 mostra a comparação das medianas de intensidade de fluorescência entre
as MDDC antes e após o estímulo com AT-2 HIV-1 e com as microvesículas H9. Em geral,
houve maior expressão de todas as moléculas estudadas após o pulso antigênico para
pacientes e controles, exceto para DC-SIGN, que apresentou maior expressão antes do
estímulo. Não foi observada diferença entre as MDDC estimuladas com AT-2 HIV-1 ou
com as microvesículas H9, exceto para a expressão de CD86 nos controles saudáveis que
estava aumentada para as MDDC estimuladas com AT-2 HIV-1 em relação às MDDC
estimuladas com as microvesículas. Quando imaturas, a expressão de DC-SIGN nos
pacientes com CV indetectável foi menor que os controles saudáveis (p<0,05, teste de
comparações múltiplas não paramétricas).
40
A
B
CD40
10000
p=0,012
p=0,018
p=0,011
HLA-DR
30000
p=0,012
p=0,028
p=0,008
8000
20000
MFI
MFI
6000
4000
10000
2000
0
0
n=12
n=8
n=8
CV indetectável
C
n=11
n=7
n=7
CV  1000
n=12
n=9
n=12
n=9
Controles
p=0,012
p=0,018
10000
MFI
MFI
n=7
n=7
n=12
CV  1000
n=9
n=9
Controles
p=0,012
p=0,018
p=0,008
15000
5000
10000
5000
0
0
n=12
n=8
n=8
CV indetectável
E
n=11
n=7
n=7
CV  1000
n=12
n=9
n=12
n=9
Controles
n=8
F
CD86
p=0,017
n=8
p=0,018
n=11
n=7
n=12
n=9
n=9
Controles
DC-SIGN
p* <0,05
10000
p=0,008
n=7
CV  1000
CV indetectável
p=0,036
p=0,038
p=0,018
p=0,008
8000
MFI
60000
MFI
n=11
CD83
20000
p=0,008
20000
80000
n=8
D
CD80
30000
n=8
CV indetectável
40000
6000
4000
20000
2000
0
0
n=12
n=8
n=8
CV indetectável
n=11
n=7
n=7
CV  1000
n=12
n=9
n=9
n=12
Controles
n=8
n=8
CV indetectável
n=11
n=7
CV  1000
n=7
n=12
n=9
Controles
Figura 5: Mediana da intensidade de fluorescência (MIF) de CD40 (A), HLA-DR (B), CD80 (C), CD83 (D),
CD86 (E) e DC-SIGN (F) das MDDC dos pacientes infectados por HIV com CV indetectável, CV ≥1000
cópias de RNA/mL (CV ≥1000) e controles antes ( ) e após o estímulo com AT-2 HIV-1 ( ) e com as
microvesículas H9 ( , obtida por citometria de fluxo. P e p* correspondem às diferenças observada pelos
testes de Wilcoxon e comparações múltiplas não paramétricas, respectivamente.
41
n=9
Produção de citocinas no sobrenadante das culturas de MDDC
Foram realizadas as dosagens de IL-12, IFN-α e TGF-β1 nos sobrenadantes de
cultura de das MDDC incubadas com HIV e microvesículas H9. Na Figura 6 são
apresentadas as concentrações destas citocinas em pacientes infectados por HIV, com CV
indetectável ou CV ≥1000 cópias de RNA/mL e em controles saudáveis. Não houve
diferença significativa entre os grupos para IL-12 e TGF-β1 (Figura 6A e 6B) e não foi
observada qualquer produção de IFN-α pelas MDDC independentemente do grupo (CV
indetectável n=20; CV ≥1000 cópias de RNA/mL n=12; controles n=12). Foi observada
uma correlação positiva entre a concentração de IL-12 e TGF-β1 para os pacientes com CV
indetectável (Spearman’s rho=0,503, p=0,020, n=21) e para os controles (Spearman’s
rho=0,687, p=0,010, n=13).
42
A
B
Concentração de TGF-1 (pg/mL)
Concentração de IL-12 (pg/mL)
16000
12000
8000
4000
0
500
p=0,006
400
300
200
100
0
HIV
Micro
HIV
CV indetectável
n=21
Micro
CV 1000
n=11
HIV
Micro
HIV
Controles
n=13
Micro
CV indetectável
n=22
HIV
Micro
CV 1000
n=14
HIV
Micro
Controles
n=15
Figura 6: Concentração das citocinas IL-12 (A) e TGF-β1 (B) (pg/mL) nos sobrenadante de culturas de
MDDC de pacientes infectados pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL (CV ≥1000) e
controles, obtidas por testes de ELISA. () corresponde às MDDC estimuladas com AT-2 HIV-1 e ()
corresponde às MDDC estimuladas com microvesículas H9 (Micro). P corresponde a diferença observada
pelo teste de Wilcoxon
Produção de citocinas no sobrenadante das coculturas de MDDC e linfócitos
Na Figura 7 são apresentadas as concentrações de IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10,
TNF-α, IFN-γ, IFN-α e TGF-β1 dosadas nos sobrenadantes das coculturas de MDDC e
linfócitos em pacientes com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL e em controles
saudáveis. Houve uma diferença entre os grupos quanto à concentração de IFN-γ (Figura
7A). Interessantemente, foi observada uma maior produção de citocinas do padrão Th1
(IFN-γ, IL-2 e TNF-α) pelas coculturas estimuladas com HIV em relação às coculturas
estimuladas com microvesículas de ambos os grupos de pacientes, além da produção da
citocina pró-inflamatória IL-6 e da antiviral IFN-α (Figura 7A, 7B, 7C, 7F e 7G). O mesmo
43
não foi observado para as citocinas do padrão Th2, onde poucos pacientes apresentaram
produção de IL-4 e IL-5 acima dos limites de detecção e não foi observada produção de IL10 independentemente do grupo ou estímulo (CV indetectável n=17; CV ≥1000 cópias de
RNA/mL n=13; controles n=14).
No grupo de pacientes com CV indetectável, a concentração de IFN-γ
correlacionou-se à produção de IL-2 (Spearman’s rho=0,894, p<0,001, n=17) e IL-6
(Spearman’s rho=0,715, p=0,001, n=17). Para os pacientes com CV ≥1000 cópias de
RNA/mL foram observadas correlações positivas entre IFN-γ e IL-2 (Spearman’s
rho=0,714, p=0,006, n=13), IFN-γ e IFN-α (Spearman’s rho=0,674, p=0,011, n=13), IFN-α
e IL-2 (Spearman’s rho=0,608, p=0,028, n=13) e entre IL-2 e IL-6 (Spearman’s rho=0,782,
p=0,008, n=10).
44
A
B
p*=0,043
p=0,002
400
Concentração de IL-2 (pg/mL)
Concentração de IFN- (pg/mL)
10000
p=0,028
8000
4000
3000
2000
1000
0
p=0,028
300
200
100
0
HIV
Micro
CV indetectável
n=17
HIV
Micro
CV 1000
n=13
HIV
Micro
HIV
Controles
n=14
Micro
CV indetectável
n=17
C
HIV
Micro
CV 1000
n=13
HIV
Micro
Controles
n=14
D
800
p=0,038
Concentração de IL-4 (pg/mL)
150
Concentração de TNF- (pg/mL)
p=0,002
100
50
0
600
300
200
100
0
HIV
Micro
CV indetectável
n=17
HIV
Micro
CV 1000
n=13
HIV
Micro
HIV
Controles
n=14
Micro
CV indetectável
n=17
45
HIV
Micro
CV 1000
n=13
HIV
Micro
Controles
n=14
E
F
500
Concentração de IL-6 (pg/mL)
Concentração de IL-5 (pg/mL)
10
8
6
4
2
p=0,028
400
300
200
100
0
0
HIV
Micro
CV indetectável
n=17
HIV
Micro
CV 1000
n=13
HIV
HIV
Micro
Controles
n=14
Micro
CV indetectável
n=17
G
HIV
Micro
CV 1000
n=10
HIV
Micro
Controles
n=11
H
p=0,028
Concentração de TGF-1 (pg/mL)
3000
Concentração de IFN- (pg/mL)
p=0,003
2000
1000
200
150
100
50
2500
p=0,002
p=0,033
2000
1500
1000
500
0
0
HIV
Micro
CV indetectável
n=17
HIV
Micro
CV 1000
n=13
HIV
HIV
Micro
Micro
CV indetectável
n=18
Controles
n=14
HIV
Micro
CV 1000
n=13
HIV
Micro
Controles
n=13
Figura 7: Concentração das citocinas IFN-γ (A), IL-2 (B), TNF-α (C), IL-4 (D), IL-5 (E), IL-6 (F), IFN-α
(G), TGF-β1 (H) (pg/mL) nos sobrenadante das coculturas de MDDC e de linfócitos de pacientes infectados
pelo HIV com CV indetectável, CV ≥1000 cópias de RNA/mL (CV ≥1000) e controles, obtidas pelos testes
de ELISA e CBA. () corresponde às coculturas estimuladas com AT-2 HIV-1; e () corresponde às
coculturas estimulas com microvesículas H9 (Micro). P e p* correspondem às diferenças observadas pelos
testes de Wilcoxon e teste de Kruskal-Wallis, respectivamente.
46
PCR quantitativo em tempo real
Foram realizadas as validações dos sistemas gene alvo/gene de referência por meio
da quantificação da expressão gênica absoluta. Na Tabela 5 são apresentados os valores da
eficiência da amplificação, que estavam próximos a 100%, além das equações das linhas de
tendência, que apresentaram inclinação menor do que 0,1, apontando que os sistemas foram
validados.
Tabela 5: Valores de eficiência (Eff%), R² e das equações das retas dos sistemas dos genes alvo/gene de
referência obtidos pela quantificação gênica absoluta nos experimentos de RT-qPCR.
Gene alvo
R²
Equação da reta
Eff%
GAPDH
HPRT1
IFN-α17
0,962
101,48
y=0,0749x-12,148
y=0,0972x-8,5939
IFN-β1
0,962
102,52
y=-0,0667x-9,3659
y=0,0005x-6,8999
IFN-γ
0,991
100,29
y=0,0463x-4,1644
y=0,0593x-1,7044
IL-6
0,987
105,37
y=0,0483x-4,4637
y=0,0421x-1,8774
IL-8
0,990
107,75
y=0,0062x-1,1868
y=-0,0037x-5,7734
IL-9
0,983
103,91
y=0,0185x-12,328
y=0,0738x-8,0774
A Figura 8 mostra a análise da expressão dos seis genes identificados no PCR Array
com hiper ou hipoexpressão em relação aos controles saudáveis por RTqPCR de amostras
de 10 indivíduos de cada grupo. Para analisar a expressão dos genes alvo, o RNAm das
células estimuladas com microvesículas H9 foram utilizadas como referência com
quantificação igual a 1,0. Houve diferença significativa na expressão de IFN-γ, que foi
maior em ambos os grupos de pacientes em relação aos controles saudáveis (p<0,05, teste
de comparações múltiplas não paramétricas). Foi observada uma diferença na expressão
gênica de IL-8, porém a mesma não foi identificada no teste de comparações múltiplas não
paramétricas.
47
A
B
50
p<0,05
C
p*=0,038
5
15
30
20
10
0
CV indetectável CV  1000
3
2
1
2
0
CV indetectável CV  1000
Controles
Controles
F
60
Expressão relativa de IFN- 1
Expressão relativa de IFN-17
4
5
0
CV indetectável CV  1000
200
6
10
Controles
E
8
Expressão relativa de IL-9
4
0
CV indetectável CV  1000
Controles
D
Expressão relativa de IL-6
Expressão relativa de IL-8
Expressão relativa de IFN-
p<0,05
40
150
30
20
10
0
CV indetectável CV  1000
Controles
40
15
10
5
0
CV indetectável CV  1000
Controles
Figura 8: Expressão gênica relativa de IFN-γ (A), IL-8 (B), IL-6 (C), IL-9 (D), IFN-α17 (E) e IFN-β1 (F) nas
coculturas de MDDC e linfócitos de 10 pacientes com CV indetectável, 10 com CV ≥1000 cópias de
RNA/mL e 10 controles saudáveis, estimuladas com AT-2 HIV-1, obtida pelos ensaios de RT-qPCR. A
expressão foi avaliada em relação às amostras de referência estimuladas com microvesículas H9, com
quantificação igual a 1,0 e todos os genes foram normalizados com os controles endógenos GAPDH e
HPRT1. Dados apresentados como mediana, mínimo e máximo (Tukey); (●) correponde aos outliers; p e p*
correspondem às diferenças observadas pelos testes de comparações múltiplas não paramétricas e KruskalWallis, respectivamente.
48
Linfoproliferação HIV específica
Após a estimulação com AT-2 HIV-1 ou com as microvesículas, as MDDC maduras
foram cocultivadas com linfócitos autólogos para determinar a proliferação linfocitária. A
proliferação HIV específica foi maior nos pacientes com CV indetectável em comparação
com pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL (p=0,004, teste de Mann-Whitney,
Figura 9). Não houve diferença para a linfoproliferação estimulada por PHA entre os
grupos (p=0,067, teste de Kruskal-Wallis). Não foi observada diferença significativa entre
os grupos para as proporções de blastos CD4 e CD8 nas coculturas estimuladas com HIV
ou PHA (teste de Mann-Whitney e teste de Kruskal Wallis, p>0,05 em todos os casos). A
proliferação HIV específica nas coculturas dos pacientes com CV indetectável
correlacionou-se à produção de IL-2 (Spearman’s rho=0,834, p=0,005, n=9) e de IFN-α
(Spearman’s rho=0,749, p=0,020, n=9).
49
A
B
100
p=0,004
Linfoproliferação PHA específica (%)
40
20
0
-20
CV indetectável
n=10
80
60
40
20
0
CV  1000
n=8
Controles
n=8
CV indetectável
n=9
D
C
Controles
n=7
60
20
50
40
Blastos CD8+ (%)
100
CV indetectável
CV  1000
CV indetectável
Controles
CV  1000
Controles
Figura 9: Linfoproliferação HIV específica e estimulada por PHA (A, B) e a porcentagem de células
blásticas CD4 e CD8 (C, D) nas coculturas de MDDC e linfócitos sem estímulo (Neg: ●) ou estimuladas com
HIV (■), microvesículas (Micro: ▲) ou PHA (▼) de pacientes com CV indetectável ou ≥1000 cópias de
RNA/mL (CV ≥1000) e controles saudáveis, obtidas por citometria de fluxo. As barras indicam as medianas
e p corresponde à diferença observada pelo teste de Mann-Whitney.
50
PHA
Micro
HIV
Neg
PHA
Micro
HIV
Neg
PHA
Micro
HIV
Neg
PHA
Micro
HIV
Neg
PHA
Micro
HIV
Neg
PHA
Micro
HIV
0
0
Neg
Blastos CD4+ (%)
80
150
CV  1000
n=8
100
Linfoproliferação HIV específica (%)
60
5.
DISCUSSÃO
Embora a TARVc tenha reduzido drasticamente a morbidade e mortalidade dos
indivíduos infectados pelo HIV nos últimos anos, a total supressão viral plasmática ainda se
faz difícil de alcançar em crianças e adolescentes devido a fatores como a resposta
imunológica do indivíduo, a resistência viral, a toxicidade das drogas e a baixa adesão.
Assim, muitos estudos têm focado na utilização de vacinas terapêuticas com MDDC
pulsadas com o HIV inativado como uma estratégia promissora para indivíduos com
infecção crônica pelo HIV. Visto o papel das DC como potentes adjuvantes naturais
capazes de induzir a resposta imune celular, este estudo visou quantificar as subpopulações
periféricas de DC e avaliar o fenótipo e função das MDDC frente às partículas de HIV-1
inativado de pacientes pediátricos verticalmente infectados por HIV com CV indetectável e
com viremia persistente, bem como de controles saudáveis.
Nós analisamos os subconjuntos de DC periféricas para determinar se a viremia
plasmática afeta numericamente estas células em crianças com infecção crônica pelo HIV.
Ao se comparar os três grupos, foram observadas diferenças significativas nos percentuais
de mDC e pDC, porém estas diferenças não foram identificadas nos testes de comparações
múltiplas não paramétricas.
Já foi descrito uma diminuição do número de mDC no estágio primário e crônico da
infecção pelo HIV-1 (Pacanowski et al., 2001; Sabado et al., 2010) e uma correlação
negativa das mDC com a CV em adultos e também em crianças sem TARV (Chehimi et al.,
2002; Zhang et al., 2006).
Mesmo sem identificar qual grupo teve diferença na frequência de pDC, a maioria
dos pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL apresentou porcentagem de pDC próxima
51
a zero. Estudos anteriores correlacionaram alta CV com uma diminuição na produção de
IFN-α entre crianças (Azzoni et al., 2005) e adultos infectados pelo HIV (Finke et al., 2004;
Chehimi et al., 2002). Adicionalmente, foi relatada uma correlação inversa entre a CV e as
porcentagens de pDC de adultos (Donaghy et al., 2001; Barron et al., 2003; Killian et al.,
2006; Desai et al., 2007; Sabado et al., 2010), associada com a progressão da doença e
surgimento de infecções oportunistas (Desai et al., 2007). Alguns estudos apontam para
uma recuperação dos percentuais das subpopulações de DC de adultos sob TARVc após a
supressão viral (Donaghy et al, 2001; Pacanowski et al, 2001; Barron et al., 2003; Finke et
al., 2004; Desai et al. 2007). Contudo, o trabalho de Chehimi et al. (2002) mostra uma
redução persistente dos percentuais de pDC em comparação aos controles saudáveis. Já
Azzoni et al. (2005) e Zhang et al. (2006) comentam que, ao contrário dos adultos, crianças
e adolescentes infectados sob TARV, têm uma tendência para recuperação total das
percentagens de mDC e pDC, devido à maior plasticidade do sistema imune dessa faixa
etária. Além disso, observamos uma correlação direta entre a porcentagem de pDC e o
tempo de tratamento nos pacientes com CV indetectável, reforçando a importância da
TARV na recuperação das subpopulações de DC em crianças e adolescentes.
Os pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL apresentaram uma monocitose em
relação aos controles saudáveis, o que demonstra a preservação da medula óssea desses
pacientes em constante produção celular mesmo sob o estado da infecção crônica (Silva et
al., 2001). Os monócitos de ambos os grupos de pacientes foram diferenciados in vitro em
MDDC com sucesso, utilizando meio AIM-V suplementado com as citocinas
recombinantes GM-CSF e IL-4. Assim, as MDDC foram submetidas ao processo de
52
maturação utilizando coquetel de citocinas pró-inflamatórias pulsadas com AT-2 HIV-1 ou
microvesículas H9.
Após a maturação, as MDDC dos três grupos apresentaram maior expressão de HLADR, CD40, CD80, CD83 e CD86, corroborando com os dados da literatura para MDDC de
adultos infectados pelo HIV (Chougnet et al., 1999; Sapp et al., 1999; Newton et al., 2006;
Buisson et al., 2009). A expressão destas moléculas no estado maduro é extremamente
necessária para uma efetiva apresentação de antígenos e ativação das células T (Donaghy et
al., 2001; Pacanowski et al., 2001). Não foi observada diferença na expressão destes
marcadores entre as MDDC estimuladas com AT-2 HIV-1 ou com as microvesículas H9 e,
suplantando estes resultados, já foi verificado que o HIV por si só não é capaz de induzir a
maturação MDDC; ainda, a infecção pode comprometer este processo, reduzindo, por
exemplo, a expressão de MHC-II (Granelli-Piperno et al., 2004; Buisson et al., 2009;
Fairman et al., 2012). Nossos dados são similares aos obtidos por Newton et al. (2006), que
não encontraram diferenças no fenótipo entre as MDDC de adultos infectados pelo HIV sob
TARV com CV <1000 cópias de RNA/mL, sem TARV com CV >30900 cópias de
RNA/mL e controles saudáveis. Estes resultados nos mostram que MDDC de indivíduos
infectados por HIV com diferentes CV apresentam uma tendência à expressão normal das
moléculas coestimulatórias após a maturação.
As MDDC imaturas dos pacientes com CV indetectável apresentaram menor
expressão de DC-SIGN em relação aos controles saudáveis, igualmente relatado por
Carbonneil et al. (2003). DC-SIGN está envolvida na interação e captação de antígenos
(Engering et al., 2002; Caparrós et al., 2006), desempenhando um papel regulador na
maturação de MDDC, uma vez que as vias de processamento do HIV estimuladas por DC-
53
SIGN podem induzir a expressão de MHC de classe I e II (Moris et al., 2004; Moris et al.,
2006). Esses resultados demonstram que apesar da menor expressão de DC-SIGN, o
fenótipo de maturação das MDDC nos pacientes com CV indetectável foi semelhante aos
controles saudáveis.
Nesse sentido, foi analisada a capacidade das MDDC em apresentar o HIV para as
células T autólogas. Embora nos pacientes com CV ≥1000 cópias de RNA/mL o fenótipo
das MDDC maduras e o padrão de linfoproliferação para PHA terem sido normais, a
linfoproliferação HIV específica nas coculturas foi reduzida em comparação com
indivíduos com CV indetectável. Semelhante aos nossos resultados, as MDDC de pacientes
com CV suprimida estimuladas com p24 de HIV apresentaram uma maior capacidade
linfoproliferativa em relação aos indivíduos sem TARV (D’ettorre et al., 2004) ou com
CD4 <200 células/µL e CV >1000 cópias de RNA/mL (Hsieh et al., 2003). As MDDC de
pacientes com alta CV apresentaram menor capacidade de induzir a proliferação de células
NK (Mavilio et al., 2006). Desse modo, é possível que a falha na estimulação seja dos
linfócitos, como, por exemplo, na expressão da molécula coestimulatória CD28, que
interage com CD83 e CD86 e leva à expansão clonal de células T e aumento na secreção de
IL-2 (Bertram et al., 2004). Ou ainda, há uma maior expressão de B-Lymphocyte–induced
maturation protein-1 (Blimp-1) em linfócitos T estimulados por MDDC pulsadas com
HIV-1 (Shankar et al., 2011), a qual reprime diretamente a expressão de IL-2 e,
consequentemente, há menor linfoproliferação em pacientes com viremia (Seddiki et al.,
2013) e exaustão nas células T (Thaventhiran & Fearon, 2013).
Ao analisar a produção de citocinas por MDDC, não foi observada produção de IFNα, provavelmente devido ao fato que MDDC geradas in vitro apresentam um fenótipo
54
mielóide (Ghanekar et al., 2007). Comparando os três grupos, não houve diferenças na
produção de IL-12 e TGF-β1. Da mesma forma, Connolly et al. (2008) não observaram
diferenças na secreção de IL-12 entre MDDC maduras de adultos infectados pelo HIV sob
TARV e indivíduos saudáveis. IL-12 é um requisito para a eficácia da imunoterapia contra
a infecção pelo HIV e atua como modulador na diferenciação de CD4 näives em células do
tipo Th1, favorecendo respostas T citotóxicas antivirais e na secreção de IFN-γ
(Banchareau et al., 1998).
Quanto às citocinas produzidas pelas coculturas, as MDDC pulsadas com AT-2 HIV1 foram capazes de induzir a produção de citocinas do perfil Th1, como IL-2, TNF-α e
IFN-γ, mas sem diferenças entre os grupos. Interessantemente, nos ensaios de RT-qPCR,
houve uma maior expressão relativa de mRNA de IFN-γ em ambos os grupos de pacientes
em relação aos controles. Resultados semelhantes já foram relatados em coculturas de
MDDC de adultos eletroporadas com peptídeos de HIV (Van Gulck et al., 2006; Allard et
al., 2008). Vários ensaios clínicos já demonstraram um fenótipo Th1 induzido pelas MDDC
(Kundu et al., 1998; Lu et al., 2004; García et al., 2005), associado com o aumento de
respostas T anti-HIV (García et al., 2012) e com o controle da infecção pelo HIV (Reuter et
al., 2012). Em um dos primeiros ensaios publicados, Lu et al. (2004) mostraram que a
vacina com MDDC pulsadas com AT-2 HIV-1 em adultos infectados sem TARV reduziu a
CV em 90% após 1 ano da vacinação em 8 de 18 indivíduos vacinados e aumentou a
porcentagem de células CD4 HIV específicas expressando IL-2 e IFN-γ. Em nossos
resultados, nos pacientes com CV indetectável, a concentração de IL-2 correlacionou-se à
produção de IFN-γ e à linfoproliferação em coculturas. Da mesma forma, células CD4
polifuncionais (IL-2+IFN-γ+) foram mais frequentes em crianças com CV mais baixas
55
(Correa et al., 2007). Jost et al. (2014) mostraram que a vacina terapêutica em indivíduos
sob TARVc pode reconstituir a frequência de células CD4 IL-2+ HIV específicas, que, por
sua vez, promovem o aumento do número de células NK IFN-γ+. Concomitantemente, a
falta de secreção de IL-4, IL-5 e IL-10 observada em nossos resultados fortalece os dados
da literatura, nos quais as MDDC evitam a diferenciação de células do tipo Th2 (García et
al., 2012). Encontramos uma significativa concentração de IL-6 e IFN-α nas coculturas de
MDDC nos pacientes com CV indetectável, possivelmente produzidas por células NK ou
até mesmo pDC presentes no momento do congelamento das células CD14-, no caso de
IFN-α (Siegal et al., 1999; Hosmalin & Lebon, 2006). Esses resultados nos revelam que o
estímulo in vitro das MDDC com antígenos do HIV-1 promovem uma complexa resposta
imune HIV específica.
Nós observamos uma produção basal de TGF-β1 nas culturas de MDDC,
correlacionada fortemente com a produção de IL-12 nos pacientes com CV indetectável e
nos controles. Além disso, houve um aumento na secreção de TGF-β1 após a cocultura com
linfócitos. As DC são capazes de produzir TGF-β1, levando à diferenciação das células
Treg (Kushwah et al., 2011), que também secretam TGF-β1 (Sojka et al., 2008). Pacientes
vacinados com MDDC sob TARVc apresentam uma maior frequência de células Treg
(Connolly et al., 2008; Rinaldo et al., 2009), e quando há a depleção dessas células de
CMSP em cultura, há um aumento de respostas de células CD8 polifuncionais Gag
específicas (Macatangay et al., 2010). Estes dados sugerem que as células Treg podem
impedir uma resposta de células T anti-HIV mais robusta (Macatangay & Rinaldo, 2010).
Ao mesmo tempo, a presença de Treg pode controlar uma ativação imune exacerbada e
evitar a progressão mais rápida da doença (Card et al., 2010). Em nossos experimentos,
56
houve o desenvolvimento de respostas HIV específicas, mesmo com a presença de TGF-β1
nas coculturas.
As características imunológicas aqui apresentadas foram associadas com resultados
positivos publicados até hoje nos ensaios clínicos envolvendo a imunoterapia com MDDC
em adultos infectados pelo HIV (Kundu et al., 1998; Lu et al., 2004; García et al., 2005; Ide
et al., 2006; Van Gulck et al., 2006; Connolly et al., 2008; Allard et al., 2008; García et al.,
2013). Nós somos os primeiros a demonstrar que MDDC obtidas a partir de monócitos de
crianças e adolescentes verticalmente infectados pelo HIV apresentam um fenótipo e
função preservados. Quando cultivadas com linfócitos autólogos, as MDDC induziram
respostas antivirais, inclusive produção de citocinas do padrão Th1 e significativa
expressão gênica de IFN-γ em relação aos controles saudáveis. Contudo, observou-se um
prejuízo na linfoproliferação HIV específica nos pacientes com CV ≥1000 cópias de
RNA/mL. Nossos resultados representam um passo inicial para o desenvolvimento de
vacinas terapêuticas utilizando MDDC como alternativa para crianças e adolescentes que
apresentam a infecção pelo HIV desde o período perinatal e têm a perspectiva de uso
contínuo de TARVc ao longo de toda a sua vida.
57
58
6.
CONCLUSÃO
Após análise dos resultados deste trabalho, pôde-se concluir que:
1. Crianças e adolescentes verticalmente infectados pelo HIV-1 sob TARVc
apresentaram maior percentual de linfócitos T CD8 e menor razão CD4/CD8 em
relação aos controles saudáveis.
2. Em geral, crianças e adolescentes verticalmente infectados pelo HIV-1 sob TARVc
apresentaram percentuais de DC periféricas semelhantes aos controles saudáveis.
3. As MDDC geradas in vitro de crianças e adolescentes infectados pelo HIV-1
apresentaram um fenótipo normal após o estímulo de maturação, expressando
CD40, CD80, CD83, CD86 e HLA-DR semelhantemente aos controles saudáveis.
4. As MDDC de crianças verticalmente infectadas pelo HIV-1 foram capazes de
induzir respostas imunes celulares HIV específicas, como a produção de citocinas
do padrão Th1.
5. Houve um prejuízo na linfoproliferação nas coculturas de MDDC pulsadas com AT2 HIV-1 com linfócitos autólogos de crianças com CV >1000 cópias RNA/mL.
6. Crianças e adolescentes verticalmente infectados pelo HIV em fase crônica sob
TARVc a longo prazo se mostraram bons candidatos para a imunoterapia utilizando
as MDDC, sendo que aqueles com CV indetectável apresentaram resultados mais
promissores.
59
60
7.
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72
8.
ANEXOS E APÊNDICES
73
74
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (para crianças infectadas por HIV)
Declaro, por livre e espontânea vontade, que permito a participação de
___________________________________________, com registro hospitalar de no
_______________________________ que se encontra sob responsabilidade de
______________________________________________, com idade de ______ anos, com
o
RG
de
no
___________________,
residente
na
Rua
_________________________________________________________________________,
cujo grau de parentesco é _______________, na pesquisa intitulada “Infecção crônica pelo
HIV em crianças e adolescentes: resposta inata e adaptativa a partículas inativadas de
HIV”, promovida pelo Centro de Investigação em Pediatria, da Faculdade de Ciências
Médicas (FCM) da Unicamp, sob coordenação da Profª Dra Maria Marluce dos Santos
Vilela. Esta pesquisa tem o objetivo de investigar como o organismo das crianças e dos
adolescentes infectados pelo vírus da AIDS realiza as defesas contra esse vírus. Como o
organismo da criança e do adolescente está em processo de desenvolvimento, é importante
avaliar qualquer fraqueza nessa resposta de defesa que possa piorar a evolução da AIDS.
Atesto que recebi esclarecimentos quanto aos propósitos e procedimentos que serão
realizados, tais como:
a) entrevista para complementar a situação clínica atual do paciente;
b) coleta de sangue de veia com seringa descartável pela enfermeira para realizar exames
que medem a capacidade de defesa contra o vírus da AIDS.
Quanto aos riscos da coleta de sangue, recebi a informação de que ela causa dor pela picada
da agulha e ansiedade. A coleta será realizada por profissional preparado e com agulha e
seringa descartáveis somente em pacientes que não têm problemas de sangramentos. Dessa
maneira, a coleta de sangue não traz riscos para o paciente.
Compreendo que minha participação é voluntária e que posso sair a qualquer momento do
estudo, sem prejudicar ou influenciar os resultados. Autorizo a liberação dos dados obtidos
aos pesquisadores, aos membros da comissão de ética e à comissão científica da FAPESP,
assim como a publicação em revistas científicas especializadas e apresentação em
congressos e jornadas científicas.
Não existem danos imediatos ou futuros previsíveis decorrentes da pesquisa, e, portanto a
mesma não inclui a possibilidade de indenização. Estou ciente de que não receberei
remuneração em troca da minha participação na pesquisa e que todas as informações não
serão identificadas por nome, para garantir o absoluto sigilo. O pesquisador me garantiu
que receberei esclarecimento a qualquer dúvida em relação aos assuntos relacionados à
pesquisa, seja antes, durante ou após a realização da pesquisa. Fui informado de que
receberei uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
De acordo,
Responsável pelo Participante: ________________________________________________
Profª Drª Maria Marluce dos Santos Vilela (telefone 19 3521-8963):___________________
Campinas,____ de ______________ de _______.
Secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa:
Rua Tessália Vieira de Camargo, 126. Caixa Postal 6111, CEP 13083-887, Campinas, SP.
Telefone: 19-3521-8936
Fax: 19-3521-7187
E-mail: [email protected]
75
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (para adolescentes infectados por HIV)
Declaro, por livre e espontânea vontade, que eu, ______________________
_____________________________, com registro hospitalar de no _____________, sob
responsabilidade de ______________________________________________, com idade
de ______ anos, com o RG de no ___________________, residente na Rua
_________________________________________________________________________,
cujo grau de parentesco comigo é _______________, desejo participar da pesquisa
intitulada ““Infecção crônica pelo HIV em crianças e adolescentes: resposta inata e
adaptativa a partículas inativadas de HIV”, promovida pelo Centro de Investigação em
Pediatria, da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Unicamp, sob coordenação da Profª
Dra Maria Marluce dos Santos Vilela. Esta pesquisa tem o objetivo de investigar como o
organismo das crianças e dos adolescentes infectados pelo vírus da AIDS realiza as defesas
contra esse vírus. Como o organismo da criança e do adolescente está em processo de
desenvolvimento, é importante avaliar qualquer fraqueza nessa resposta de defesa que
possa piorar a evolução da AIDS.
Atesto que recebi esclarecimentos quanto aos propósitos e procedimentos que serão
realizados, tais como:
a) entrevista para complementar a situação clínica atual do paciente;
b) coleta de sangue de veia com seringa descartável pela enfermeira para realizar exames
que medem a capacidade de defesa contra o vírus da AIDS.
Quanto aos riscos da coleta de sangue, recebi a informação de que ela causa dor pela picada
da agulha e ansiedade. A coleta será realizada por profissional preparado e com agulha e
seringa descartáveis somente em pacientes que não têm problemas de sangramentos. Dessa
maneira, a coleta de sangue não traz riscos para o paciente.
Compreendo que minha participação é voluntária e que posso sair a qualquer momento do
estudo, sem prejudicar ou influenciar os resultados. Autorizo a liberação dos dados obtidos
aos pesquisadores, aos membros da comissão de ética e à comissão científica da FAPESP,
assim como a publicação em revistas científicas especializadas e apresentação em
congressos e jornadas científicas.
Não existem danos imediatos ou futuros previsíveis decorrentes da pesquisa, e, portanto a
mesma não inclui a possibilidade de indenização. Estou ciente de que não receberei
remuneração em troca da minha participação na pesquisa e que todas as informações não
serão identificadas por nome, para garantir o absoluto sigilo. O pesquisador me garantiu
que receberei esclarecimento a qualquer dúvida em relação aos assuntos relacionados à
pesquisa, seja antes, durante ou após a realização da pesquisa. Fui informado de que
receberei uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
De acordo,
Responsável pelo Participante: ________________________________________________
Participante: _______________________________________________________________
Profª Drª Maria Marluce dos Santos. Vilela (telefone 19 3521-8963):_________________
Campinas,____ de ______________ de _______.
Secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa:
Rua Tessália Vieira de Camargo, 126. Caixa Postal 6111, CEP 13083-887, Campinas, SP.
Telefone: 19-3521-8936
Fax: 19-3521-7187
E-mail: [email protected]
76
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (para crianças saudáveis)
Declaro, por livre e espontânea vontade, que permito a participação de
___________________________________________, com registro hospitalar de no
_______________________________ que se encontra sob responsabilidade de
______________________________________________, com idade de ______ anos, com
o
RG
de
no
___________________,
residente
na
Rua
_________________________________________________________________________,
cujo grau de parentesco é _______________, na pesquisa intitulada “Infecção crônica pelo
HIV em crianças e adolescentes: resposta inata e adaptativa a partículas inativadas de
HIV”, promovida pelo Centro de Investigação em Pediatria, da Faculdade de Ciências
Médicas (FCM) da Unicamp, sob coordenação da Profª Dra Maria Marluce dos Santos
Vilela. Esta pesquisa tem o objetivo de investigar como o organismo das crianças e dos
adolescentes infectados pelo vírus da AIDS realiza as defesas contra esse vírus. Como o
organismo da criança e do adolescente está em processo de desenvolvimento, é importante
avaliar qualquer fraqueza nessa resposta de defesa que possa piorar a evolução da AIDS.
Para isso, precisamos comparar sua defesa a de crianças saudáveis.
Atesto que recebi esclarecimentos quanto aos propósitos e procedimentos que serão
realizados, tais como:
a) entrevista para complementar a situação clínica atual do paciente;
b) coleta de sangue de veia com seringa descartável pela enfermeira para realizar exames
que medem a capacidade de defesa contra o vírus da AIDS.
Quanto aos riscos da coleta de sangue, recebi a informação de que ela causa dor pela picada
da agulha e ansiedade. A coleta será realizada por profissional preparado e com agulha e
seringa descartáveis somente em pacientes que não têm problemas de sangramentos. Dessa
maneira, a coleta de sangue não traz riscos para o paciente.
Compreendo que minha participação é voluntária e que posso sair a qualquer momento do
estudo, sem prejudicar ou influenciar os resultados. Autorizo a liberação dos dados obtidos
aos pesquisadores, aos membros da comissão de ética e à comissão científica da FAPESP,
assim como a publicação em revistas científicas especializadas e apresentação em
congressos e jornadas científicas.
Não existem danos imediatos ou futuros previsíveis decorrentes da pesquisa, e, portanto a
mesma não inclui a possibilidade de indenização. Estou ciente de que não receberei
remuneração em troca da minha participação na pesquisa e que todas as informações não
serão identificadas por nome, para garantir o absoluto sigilo. O pesquisador me garantiu
que receberei esclarecimento a qualquer dúvida em relação aos assuntos relacionados à
pesquisa, seja antes, durante ou após a realização da pesquisa. Fui informado de que
receberei uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
De acordo,
Responsável pelo Participante: ________________________________________________
Profª Drª Maria Marluce dos Santos Vilela (telefone 19 3521-8963):___________________
Campinas,____ de ______________ de _______.
Secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa:
Rua Tessália Vieira de Camargo, 126. Caixa Postal 6111, CEP 13083-887, Campinas, SP.
Telefone: 19-3521-8936
Fax: 19-3521-7187
E-mail: [email protected]
77
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (para adolescentes saudáveis)
Declaro, por livre e espontânea vontade, que eu, ______________________
_____________________________, com registro hospitalar de no _____________, sob
responsabilidade de ______________________________________________, com idade
de ______ anos, com o RG de no ___________________, residente na Rua
_________________________________________________________________________,
cujo grau de parentesco comigo é _______________, desejo participar da pesquisa
intitulada ““Infecção crônica pelo HIV em crianças e adolescentes: resposta inata e
adaptativa a partículas inativadas de HIV”, promovida pelo Centro de Investigação em
Pediatria, da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Unicamp, sob coordenação da Profª
Dra Maria Marluce dos Santos Vilela. Esta pesquisa tem o objetivo de investigar como o
organismo das crianças e dos adolescentes infectados pelo vírus da AIDS realiza as defesas
contra esse vírus. Como o organismo da criança e do adolescente está em processo de
desenvolvimento, é importante avaliar qualquer fraqueza nessa resposta de defesa que
possa piorar a evolução da AIDS. Para isso, precisamos comparar sua defesa a de
adolescentes saudáveis.
Atesto que recebi esclarecimentos quanto aos propósitos e procedimentos que serão
realizados, tais como:
a) entrevista para complementar a situação clínica atual do paciente;
b) coleta de sangue de veia com seringa descartável pela enfermeira para realizar exames
que medem a capacidade de defesa contra o vírus da AIDS.
Quanto aos riscos da coleta de sangue, recebi a informação de que ela causa dor pela picada
da agulha e ansiedade. A coleta será realizada por profissional preparado e com agulha e
seringa descartáveis somente em pacientes que não têm problemas de sangramentos. Dessa
maneira, a coleta de sangue não traz riscos para o paciente.
Compreendo que minha participação é voluntária e que posso sair a qualquer momento do
estudo, sem prejudicar ou influenciar os resultados. Autorizo a liberação dos dados obtidos
aos pesquisadores, aos membros da comissão de ética e à comissão científica da FAPESP,
assim como a publicação em revistas científicas especializadas e apresentação em
congressos e jornadas científicas.
Não existem danos imediatos ou futuros previsíveis decorrentes da pesquisa, e, portanto a
mesma não inclui a possibilidade de indenização. Estou ciente de que não receberei
remuneração em troca da minha participação na pesquisa e que todas as informações não
serão identificadas por nome, para garantir o absoluto sigilo. O pesquisador me garantiu
que receberei esclarecimento a qualquer dúvida em relação aos assuntos relacionados à
pesquisa, seja antes, durante ou após a realização da pesquisa. Fui informado de que
receberei uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
De acordo,
Responsável pelo Participante: ________________________________________________
Participante: _______________________________________________________________
Profª Drª Maria Marluce dos Santos. Vilela (telefone 19 3521-8963):_________________
Campinas,____ de ______________ de _______.
Secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa:
Rua Tessália Vieira de Camargo, 126. Caixa Postal 6111, CEP 13083-887, Campinas, SP.
Telefone: 19-3521-8936, Fax: 19-3521-7187
E-mail: [email protected]
78
Atividades profissionais e acadêmicas durante o período do mestrado
Atividades de Ensino
- Monitoria na 11ª edição do projeto Ciência e Artes nas Férias (9 de janeiro a 6 de
fevereiro de 2013), que envolveu o estágio de alunos do Ensino Médio no Laboratório de
Imunologia do Centro de Investigação em Pediatria da Faculdade de Ciências Médicas da
UNICAMP, em Campinas, SP.
- Monitoria na 12ª edição do projeto Ciência e Artes nas Férias (8 a 31 de janeiro de 2014),
que envolveu o estágio de alunos do Ensino Médio no Laboratório de Imunologia do
Centro de Investigação em Pediatria da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, em
Campinas, SP.
Participação em eventos científicos e cursos
- 2013, VIII Curso Avançado da Patogênese do HIV, 11 a 17 de abril, Faculdade de
Medicina da USP (FMUSP), São Paulo, SP.
- 2014, IX Curso Avançado da Patogênese do HIV, 19 a 26 de março, Faculdade de
Medicina da USP (FMUSP), São Paulo, SP.
- 2014, 16th International Congress on Infectious Diseases, de 2 a 5 de abril, na Cidade do
Cabo, África do Sul.
- 2014, VII Semana de Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas, de 19 a 22 de maio, em
Campinas, SP.
79
Apresentação de trabalhos em congressos
- Taís N. Mazzola, Jéssica S. Bernachi, Emanuel B.V. Anjos, Ana L.F. Longhini, Renata
Lemos, Sara T.O. Saad, Sandra C.B. Costa, Marcos T.N. Da Silva, Maria M.S. Vilela. Viral
load impact in HIV cellular immune response from children and adolescents. Pôster
apresentado no 15º Internacional Congress of Immunology, de 22 a 27 de agosto de 2013,
em Milão, Itália.
- Jéssica S. Bernachi, Taís N. Mazzola, Ana Leda F. Longhini, Emanuel B.V. Anjos, Luiz
G.R. Fernandes, Telma M. Oshiro, Renata M.B.P. Lemos, Marcos T.N. Da Silva, Maria
M.S. Vilela. Viral Load and Dendritic Cells from vertically HIV-Infected Children and
Adolescents. Pôster apresentado no 16th International Congress on Infectious Diseases, de 2
a 5 de abril de 2014, na Cidade do Cabo, África do Sul.
- Jéssica S. Bernachi, Taís N. Mazzola, Ana Leda F. Longhini, Emanuel B.V. Anjos, Luiz
G.R. Fernandes, Telma M. Oshiro, Renata M.B.P. Lemos, Marcos T.N. Da Silva, Maria
M.S. Vilela. Influência da carga viral nas células dendríticas de crianças e adolescentes
verticalmente infectados pelo HIV. Pôster presentado na VII Semana de Pesquisa da
Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, de 19 a 22 de maio
de 2014, em Campinas, SP. (Menção honrosa).
- Caroline N. Araújo; Taís N. Mazzola; Jéssica S. Bernachi; Renata M.B.P. Lemos;
Emanuel, B. V. dos Anjos; Marcos T.N. Da Silva, Maria M.S. Vilela. Cinética de produção
de citocinas frente ao HIV em cultura de células de pacientes pediátricos com infecção
vertical por HIV. Pôster presentado na VII Semana de Pesquisa da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de Campinas, de 19 a 22 de maio de 2014, em
Campinas, SP.
80