Capitulo 7: Tecnologia do DNA recombinante

Capitulo 7: Tecnologia do DNA recombinante (aulas 1,2,3 e 4 -
2º semestre)
A tecnologia do DNA recombinante revolucionou o estudo da célula. Hoje o DNA é a
macromolécula mais fácil de analisar e sequenciar: é possível excisar segmentos
específicos, multiplica-los, determinar a sua sequência, modificá-la e mesmo inseri-los
no genoma de outros organismos (engenharia genética). Estas técnicas têm
implicações médicas: permitem analisar cromossomas e genoma de células humanas
na procura de mutações causadoras de doenças; permitem a produção de células
humanas em bactérias para posterior utilização terapêutica (ex. insulina); e inserir
genes saudáveis nas células de doentes com mutações desfavoráveis (terapia génica).
Técnicas mais importantes:
1. Clivagem do DNA por enzimas endonucleases de restrição: isolar genes ou
outras sequências específicas.
2. Sequenciação rápida dos nucleotideos de um fragmento tornando possível
identificar genes e deduzir a cadeia de aminoácidos da cadeia especificada.
(permite estabelecer os limites de um gene e do aminoácido que ele codifica)
3. Hibridização de ácidos nucleicos: possibilita encontrar uma sequencia especifica
de DNA ou RNA através de outra complementar – a sonda – de entre todas as
outras sequencias não complementares.
4. Clonagem de DNA: permite que uma molécula de DNA seja multiplicada criando
um número ilimitado de cópias (vectores de clonagem por PCR).
5. Engenharia de DNA: sequências de DNA modificadas e reintroduzidas em
organismos, criando versões modificadas de genes e proteínas.
6. Monitorização da expressão de genes numa células através de hibridização dos
mRNAs presentes no seu citosol com sondas complementares de DNA.
Fragmentação de moléculas de DNA:
 Um gene é uma pequena região de uma molécula de DNA muito maior,
constituída por sequencias de apenas 4 nucleotideos – logo não é possível
separá-los com base em diferenças de carga e especificidade de ligação com as
proteínas.
 O único modo de separá-los é através de fragmentação seguida de separação de
acordo com diferenças do tamanho de fragmentos. Contudo a fragmentação tem
de ser previsível isto é, tem de produzir fragmentos com a mesma sequência e
tamanho todas as vezes que for efectuado, de modo que um gene fique sempre
em determinado fragmentado de determinado tamanho.
 Este problema é resolvido pelas enzimas endonucleases de restrição. Estas
enzimas são produzidas e purificadas de bactérias cujo DNA é protegido de
clivagem por metilação – adição de grupos CH3 às bases de DNA – as
endonucleases não conseguem clivar DNA metilado. Cada endonuclease de
restrição cliva sempre o DNA em sequências especificas de 4 a 8 nucleotideos,
ou seja, corta sempre nos mesmos sítios, determinados pela sequencia local.
Logo determinada hélice-dupla de DNA é sempre clivada da mesma forma todas
as vezes, produzindo vários fragmentos de restrição de tamanhos diversos.
 A maior parte das endonucleases cliva, uma fita de DNA e a fita complementar da
mesma hélice-dupla em locais afastados alguns nucleotideos (clivagens assimétricas)
produzindo fragmentos de hélice-dupla com extremidades de cadeia simples não
emparelhadas – extremidades coesivas. Estas podem ligar-se em condições
adequadas com outros fragmentos (ex. de outro genoma) de extremidades
Página 1
coesivas complementares produzidas pela mesma enzima (endonuclease de
restrição), e através da formação de ligações covalentes por outra enzima – a
DNA ligase – formar DNA recombinante (fragmentos de DNA de origem diferente
unidos formando uma única molécula)
Separação dos fragmentos de DNA
 Os segmentos podem ser separados de acordo com o seu tamanho por
electroforese em gel (ex: de policrilamida (mais pequenos), de agarose
(maiores)), submetidos a campo eléctrico constante que arrasta o DNA para o
pólo positivo devido à carga negativa dos fosfatos dos nucleótidos. Como os
fragmentos menores avançam mais no gel, forma-se uma série de bandas de
fragmentos com cada banda mais avançada formada por fragmentos
sucessivamente menores. Estas bandas são incolores logo tem que ser coradas
ou marcadas por fluorescência ou radioactividade As moléculas radioactivas
emitem radiação detectável em película fotográfica sobreposta, enquanto as
fluorescentes emitem luz visível se expostas a radiação UV.
 Se se sabe o tamanho do fragmento de DNA onde está determinado, pode-se
purificar o gene do restante genoma pela electroforese.
E electroforese em campo pulsado (muda periodicamente a direcção do campo)
permite a separação de moléculas de DNA extremamente longas, ao contrário
da electroforese em campo eléctrico constante, na medida em que nesta última
as moléculas migram uniformemente independentemente do seu tamanho por
se encontrarem espiradas (?) devido à acção do campo eléctrico. No campo
pulsado, como há mudança de direcção, isto vai forçar as moléculas a
reorientarem-se sendo que esta orientação é tão mais morosa e difícil quanto
maior for o tamanho da molécula, e portanto, as mais longas migram menos.
Sequenciação do fragmento de DNA:
 Há duas técnicas para determinar a sequência exacta dos fragmentos de DNA
(e portanto do genoma): método químico e método enzimático. Estes são
rápidos e fáceis logo são utilizados até para adivinhar a sequência de proteínas
a partir da sequência do seu gene, já que a sequência de aminoácidos é mais
difícil.
 O Método químico consiste em tratar quatro amostras do DNA com reagentes
que destroem uma das 4 bases. Por exemplo, a 1ª amostra com um reagente
que cliva o DNA nas adeninas, o 2ª com reagente que cliva as timinas, o 3ª as
citosinas, e 4 as guaninas. Como o tratamento é brando, cada molécula de DNA
apenas é clivada em dois fragmentos (só é destruída numa das 4 bases), em média.
Seguidamente marcam-se os fragmentos com fosfato radioactivo (com a enzima
endonuclease cinase) e procede-se a electroforese de cada uma das quatro
amostras lado a lado. A amostra tratada com reagente que cliva as timinas, vai
aparecer na electroforese com fragmentos de vários tamanhos, cada um dos
quais começa ou termina. Se esse fragmento por apenas ligeiramente maior
(banda ligeiramente mais atrás) que uma banda de amostra ao lado (ex: tratada
com reagente clivador de citosinas) que termina numa citosina, há indicação
que nessa porção do DNA uma citosina se segue a uma timina, deste modo
pode ser determinada toda a sequência.
 O método enzimático é o procedimento mais utilizado hoje. O DNA a ser
sequenciado é usado como molde para análise da cadeia complementar in vitro
pela DNA polimerase. São adicionadas além de quatro bandas normais, a cada
Página 2

uma de 4 amostras, 1 de 4 bases alteradas (dideoxirribonucleotideos) que
bloqueiam a progressão da polimerização. Assim se na amostra com
didesoxiadenina a DNA polimerase encontrar uma timina no molde, ela pode
integrar na cadeia uma adenina normal, e a polimerização prossegue, ou, por
acaso, uma didesoxiadenina, e a polimerização pára. Logo, são formadas
cadeias complementares de tamanhos diferentes, cada uma terminando numa
amostra, em determinada base (ex: na amostra 1 todas as cadeias bloqueadas,
em diferentes pontos, pela dideoxiadenina, na amostra 2 pela dideoxicitosina,
etc). Por electroforese lado a lado podem se comparar os tamanhos das
cadeias terminadas. Se uma cadeia da amostra 2 for ligeiramente maior que
uma da amostra 1, significa que nessa porção a uma C se segue uma A.
O método automatizado consiste na aplicação do método enzimático por
máquinas especializadas.
--Hibridização e sondas de DNA ou RNA
 Desnaturação: as ligações entre cadeias complementares rompem-se a altas
temperaturas (100ºC) ou pH (↑). É reversível por descida da temperatura ou pH
– hibridização de cadeias complementares (a 65%).
 Cadeias com sequências complementares podem hibridizar mesmo tendo
origens diferentes.
 Sonda de DNA ou RNA: cadeia simples com fosfato radioactivo ( 32P) ou outro
grupo facilmente detectável (ex: fluorescente brometo de etideo) que pode ser
usada para encontrar e quantificar concentração de uma sequência
complementar na amostra. Método sensível que permite detectar uma única
cadeia complementar de entre muitas.
 Também é possível detectar, com sondas de DNA, mRNA complementar no
citosol da célula ou in vitro), de modo a quantificar o nível de expressão ou
actividade de um gene na célula. Permite ainda determinar sequências de
intrões através da excisão e determinação das partes da sonda DNA-genómico
que não emparelham com o mRNA – SPLICING.
 Há três técnicas de marcar fragmentos de DNA (ex. sondas) radioactivamente
ou com grupos fluorescentes: nick translation, marcação aleatória de
primers e end labelling.
 End labelling: nesta técnica o fragmento de DNA (sonda) que se pretende
marcar é incubada com uma enzima DNA cinase na presença de fosfato
radioactivo adicionado. A enzima adiciona os fosfatos radioactivos às
extremidades 5’ marcando a sonda. Como cada sonda de DNA só tem dois
fosfatos radioactivos emite pouca radiação, pode ser difícil de detectar na
película fotográfica.
 Nick translation é um método baseado na acção de três enzimas no DNA, num
tubo de ensaio com desoxirribonucleotideos trifosfatados com fosfato
radioactivo. A enzima desorribonuclease I remove bases aleatórias na cadeia de
DNA, criando “nicks” (regiões onde há uma base desemparelhada por a outra
ter sido removida). A segunda enzima: DNA polimerase 1- exonuclease, remove
os nucleótidos a partir do “nick”, e simultaneamente a terceira enzima DNA
polimerase I, restabelece a dupla hélice de DNA a partir da cadeia intacta com
nucleotidos radioactivos.
Página 3
 Marcação aleatória de primers: oligonucleotideos cm 6-8 bases em
sequências variadas aleatórias (todas as possíveis de 6 ou 8 bases) são
produzidos artificialmente por métodos químicos. De seguida estes
oligonucleotideos são adicionados em solução a 65º C ao fragmento
desnaturado (por elevadas temperaturas) (em cadeia simples) do qual se quer
fabricar sondas complementares, juntamente com desoxirribonucleotideos
trifosfatados radioactivos ou fluorescentes, e a enzima DNA polimerase I.
Alguns destes oligonucleotideos de sequência aleatória são complementares às
cadeias do fragmento, logo poderão hibridizar com ela e servir de primers à
DNA polimerase, que sintetiza cadeia complementar com as bases radioactivas
ou fluorescentes. Esta nova cadeia, a sonda, é separada da cadeia molde por
novo aquecimento a 100ºC, e pode ser usada para identificar o mesmo
fragmento de entre todos os outros na folha de nitrocelulose em um blotting.
 Hibridização in situ é a introdução de sondas de ácidos nucleicos marcadas (ex:
radioactivas ou com grupos reconhecidos por anticorpos com grupos
fluorescentes) em
o 1. Células vivas para detecção e seguimento dos RNA’s intracelulares; ou
o 2. Fora de células para identificar a posição de determinadas sequências
(ex: genes) no cromossoma inteiro (cujo DNA foi temporariamente
separado nas suas cadeias simples por exposição a pH alto) com sondas
de DNA com grupos químicos reconhecíveis por anticorpos fluorescentes
– chromossome painting.
Northern, western e southern blotting
 Blotting é o processo de transferência de partículas (de RNA no northern blot,
DNA no southern blot, proteínas no western blot) submetidas a electroforese,
do gel usado no processo para uma membrana de nitrocelulose. Consiste em
colocar o gel com as bandas de partículas numa esponja em tampão liquido
abundante e papel absorvente. À medida que o papel absorve o tampão
liquido, este passe pelo gel levando o RNA, DNA ou proteínas consigo. Estas
ficam retidas na membrana de nitrocelulose acima, conservando a estrutura em
bandas.
 Northern Blotting: técnica para examinar RNA’s celulares: RNA celular é
separado dos restantes componentes celulares. E então submetido a
electroforese em gel, separando-se em bandas de acordo com tamanhos.
Estes tamanhos são comparados pela electroforese, ao lado, de outra amostra
de RNA de tamanhos já conhecidos (padrões de RNA). De modo a permitir
acesso a sondas é permitido o blotting. Após o blotting, a folha de nitrocelulose
é incubada a 65ºC com uma solução que contém as sondas de cadeia simples
de DNA com fosfato radioactivo ou com grupos fluorescentes ligados. Estas
sondas ligam-se aos RNA’s complementares (hibridização) identificando-os. A
folha de nitrocelulose é então lavada com tampão para remover sondas não
ligadas e revelada por película fotográfica em câmara escura (se sondas
marcadas por fosfato radioactivo) ou iluminação por UV (se sondas com grupos
fluorescentes). As bandas com o RNA procurado são assim identificadas.
(Northern blotting – electroforese + blotting + sondas de DNA).
 Southern Blotting é um método de identificação idêntico ao northern blotting só
que com DNA celular em vez de RNA. O DNA é clivado com enzimas de
Página 4
restrição (endonucleases) e submetido a electroforese. O resto do método é
idêntico ao do northern blotting, com identificação de sequencias por sondas de
DNA.
(Southern blotting – electroforese de DNA + blotting + sondas de DNA)
 Western Blotting é uma técnica de análise de proteínas semelhante aos outros
dois blots. As proteínas são tratadas com o detergente SDS ( que as “soltam” das
membranas), submetidas a electroforese e transferidas para folha de nitrocelulose
por blotting. Seguidamente a folha de nitrocelulose é incubada com anticorpos
(em vez de sondas de DNA) radioactivos ou fluorescentes específicos das
proteínas que se procura, com os quais os anticorpos se ligam. Após lavagem
para retirar anticorpos não ligados em excesso, é feita revelação das bandas
por película fotográfica ou exposição a radiação UV.
(western blotting – electroforese de proteínas + blotting + sondas de anticorpos.
RFLP’s, VTR’s e microsatelites:
Diferenças na cadeia de nucleotideos em indivíduos são chamadas mutações se raras
ou polimorfismos se comuns.
-- Diferenças em determinados nucleotideos podem ser suficientes para uma
endonuclease de restrição clivar a amostra de DNA proveniente de um individuo
mas não de outro (formando um fragmento maior ou dois menores). Delecções
ou inserções do DNA num individuo significa que nesse individuo determinados
fragmentos de um mapa de restrição serão maiores ou menores que noutro.
Estes polimorfismos detectáveis através de electroforese e comparação dos
tamanhos dos fragmentos de restrição entre dois indivíduos são RFLPs
(restriction fragment Lenght Polymorfisms).
 Há tipos de RFLP que são muito variáveis na população humana, se se sabe
que um gene normal está em geral acompanhado num fragmento de restrição
por um RFLP de determinado tamanho enquanto o alelo correspondente à
doença é acompanhado em geral no seu fragmento por um RFLP de outro
tamanho, é possível deduzir qual o gene presente efectuando uma electroforese
do fragmento (marcado pró sonda) de um paciente comparando a posição da
banda onde está o gene com os de pessoas saudáveis ou com mutação.
 Um VNTR (variable number of tandem repeats) é um tipo muito utilizado de
RFLP muito comum e altamente variável no genoma humano. É constituída por
um conjunto de bases de DNA que se repete várias vezes seguidas, como
GTTGTTGTTGTT, e que faz parte da porção não codificante do genoma. Um
VNTR em que a sequencia se repete é menor do que 4 bases é denominado
um microsatelite. Como o número de repetições é altamente variável, um
indivíduo num determinado VNTR pode ter cinco repetições seguidas da
sequncia, enquanto noutro poderá haver 10 nesse local e 7 noutro. Logo, se se
examinar vários sítios de VNTR simultaneamente, combinação do número de
repetições em cada um deles é altamente especifico do individuo, como um
código um impressão digital – DNA fingerprint. (É portanto uma característica do
individuo que está relacionada com o número de repetições das bases de DNA em cada VNTR).


Como um filho recebe metade do seu DNA do pai, também é possível confirmar
a paternidade examinando se pelo menos metade das repetições em vários
VNTR’s do filho são idênticos aos do pai.
Técnica para examinar para examinar se os locais VNTR’s tem repetições em
número igual ou diferente: se a sequência em redor do VNTR for conhecida,
Página 5
pode ser efectuado PCR com adição de primers para ampliar apenas
determinadas regiões onde se sabe estarem VNTR’s altamente variáveis. Esta
ampliação é feita para o DNA do pai e do filho; ou do suspeito e cabelo
encontrado na cena do crime. Se um indivíduo tiver nessa região ampliada 20
repetições no VNTR’s, os fragmentos ampliados terão tamanho maior do que
noutro que só tenha 5. Logo estas diferenças de tamanho podem ser
detectadas por electroforese das regiões de VNTR, ampliadas do genoma pela
PCR, seguida da hibridização com sondas que detectam os VNTR’s ou seja
SOUTHERN BLOOTING (electroforese de DNA + sondas de DNA)
Clonagem de DNA
 A clonagem de DNA consiste na inserção de um gene ou sequencia de
interesse no genoma de um elemento genético auto-replicativo como uma
bactéria, vírus bacteriófago ou cromossoma artificial eucariótico em célula
funcional – o vector de clonagem. Esta sequência é então multiplicada
juntamente com o resto do genoma do vector, do qual pode ser mais tarde
obtida em maior número de cópias ou estudado o seu efeito no organismovector ou as proteínas produzidas a partir dela.
 Um fago ou bacteriófago é um vírus que infecta bactérias nas quais injecta o
seu genoma. Alguns bacteriófagos em determinado ciclo de vida não matam as
bactérias injectam, limitando-se a introduzir o seu DNA no cromossoma
bacteriano, que é reproduzido juntamente com a bactéria. Com mudança de
ciclo o vírus pode matar a bactéria e utilizar os seus recursos para se
autorreplicar. São portanto bons vectores para introduzir e replicar DNA em
bactérias.
 Um plasmideo é um pequeno circulo de DNA de cadeia dupla helicoidal
bacteriano, distinto do grande cromossoma circular genómico principal e que
normalmente contem genes de adaptação a condições especiais como os da
resistência antibiótica. As bactérias têm mecanismos para absorver plasmideos
que sejam colocados no seu meio de cultura. (são por isso, também muito bons
vectores para introduzir e replicar o DNA em bactérias)
 Um vector plasmideo ou bacteriófago só pode inserir fragmentos relativamente
pequenos de DNA. Para fragmentos grandes é necessário usar cromossomas
artificiais eucarióticos, com centrómeros e telómeros, como vectores, os YAC’s
(yeast artifical chromossomes – cromossomas artificias de levedura), MAC’s (c.
a. de mamíferos) ou HAC’s (c. a. humanos) que são introduzidos juntamente
com o fragmento integrado em células eucarióticas onde são replicados pela
célula juntamente com os restantes cromossomas.
 Um banco de DNA é uma colecção de fragmentos de DNA de um genoma
distribuídos por células de um vector. Um fragmento por cada célula do vector
(ex: uma bactéria com plasmideo, vírus bacteriófago ou uma célula eucariótica
com cromossoma artificial). Há dois tipos de banco de DNA: genómico e de
cDNA
 Um banco genómico de vectores plasmideos é formado pelo tratamento de
plasmideos e todo o genoma que se quer analisar com a mesma endonuclease
de restrição. Esta cria fragmentos do genoma a plasmideos clivados com
extremidades coesivas complementares. Quando se criam condições para a
hibridização do DNA alguns plasmideos vão hibridizar, pelas suas extremidades
coesivas, com um fragmento do genoma formando círculos de DNA hibridizado
que são covalentemente selados por uma enzima adicionada ao tubo de ensaio
Página 6




– a DNA ligase. Em seguida os círculos de DNA são transfectados para
bactérias tornadas temporariamente permeáveis a eles. Como os plasmideos
são geralmente portadores de genes de resistência a antibióticos, as bactérias
que foram transfectadas com plasmideos são seleccionadas pela adição de um
antibiótico ao meio de cultura – apenas elas sobrevivem. Os plasmideos
replicam-se juntamente com as bactérias. Cada bactéria com determinado
fragmento e todas as suas bactérias-filhas (com o mesmo fragmento) formam
uma colónia com esse fragmento.
Um banco de cDNA é um banco de DNA clonado contendo apenas os genes
ou sequencias traduzidas em mRNA em determinada célula, ou seja, excluindo
as partes do genoma que não são transcritas nessa célula. É formado através
da recolha dos mRNA de uma célula e sua transcrição reversa em cDNA pela
enzima transcriptase reversa (dos retrovírus). Após formação da complementar
de DNA polimerase, este cDNA são inseridos em plasmideos e bactérias –
criando clones de cDNA.
Os bancos de cDNA contem apenas DNA complementar dos mRNA
produzidos em determinada célula, logo não contém a maioria do DNA
genómico não codificante, intrões, ou genes não expresso nesse momento pela
célula.
---------Se se pretende obter ou estudar determinado gene, é preciso descobrir qual ou
quais as colónias de bactérias do meio de cultura que contém o fragmento
(clone) que contém o gene de interesse. Isto é feito através da retirada de
algumas bactérias do meio de cultura com uma folha de papel à qual algumas
bactérias de cada colónia aderem (formando um “mapa” das colónias simétrico
à disposição das colónias no disco de petri de cultivo). Seguidamente procedese à lise (rebentamento da membrana) das bactérias no papel, separação da
dupla hélice em meio alcalino (=desnaturação do DNA) e inserção de uma
sonda complementar ao gene ou a uma outra porção do fragmento procurado
no papel revelando a posição da colónia pretendida (por película fotográfica se
a sonda for radioactiva ou exposição a UV se for fluorescente). Também se
pode fazer hibridização in situ (sondas de DNA/RNA são usadas com anticorpos
para localizar sequencias especificas de ácidos nucleicos “in situ”), ou pela
análise das proteínas produzidas pelas bactérias, por anticorpos específicos de
proteína procurada.
Cromossome walking é um método para obter a localização de um gene no
cromossoma ou sequenciar cromossomas – ou seja para descobrir a posição de
um fragmento de restrição relativamente aos outros no cromossoma. Após
criação de dois bancos genómicos do mesmo cromossoma, obtidos por
clivagem de duas amostras do cromossoma cada uma por uma endonuclease
de restrição diferente, uma colónia bacteriana de um dos bancos, com
determinado fragmento do cromossoma, é seleccionada. O fragmento é
sequenciado e purificado das bactérias da colónia e é fabricada uma sonda
complementar a uma extremidade do fragmento. Esta sonda é utilizada para
identificar a colónia do segundo banco que contém um fragmento com
sobreposição parcial ao primeiro, ou seja, com parte da sequência
complementar, que também é sequenciado. Desta segunda colónia é fabricada
uma sonda complementar ao extremo oposto desse fragmento, a qual é por sua
vez utilizada para determinar a colónia do primeiro banco com sobreposição
Página 7

parcial a essa extremidade, que é sequenciado, e cuja extremidade oposta é
usada para fabricar uma nova sonda, etc., até todo o cromossoma estar
sequenciado.
Clonagem posicional é uma técnica utilizada quando se sabe que determinada
doença é genética (causada por mutação de um gene) – através de um estudo
das arvores genealógicas de famílias onde a doença é frequente, mas não se
sabe qual exactamente o gene em causa, para descobrir qual é e onde se
encontra esse gene no genoma humano.
 O DNA de um doente e dos seus familiares é estudado de modo a
determinar quais os RFLP’s co-herdados com a doença. E portanto
presumivelmente com o gene mutado (que terá de estar no mesmo
cromossoma perto do RFLP’s ou de outro modo não seria co-herdado
com esses RLP’s pois provavelmente já se teriam separado por crossingover.
 São fabricados dois bancos de clones genómicos diferentes de todo o
DNA entre os RFLP’s herdados que se julga flanquearem (?) o gene, e


que são usados pelo método chromossome walking para sequenciar toda a
região;
Determina-se as porções importantes do DNA entre os RFLP’s através de
comparação com DNA de cobaias: como 99% dos exões de cobaias são
praticamente iguais aos dos humanos mas os intrões são diferentes (porque
não são importantes e os seus mutantes não sofrem selecção natural) é
possível adivinhar quais os exões que existem perto desses RFLP’s
comparando essa região do genoma humano com a região correspondente nas
cobaias: as zonas que forem muito parecidas são provavelmente exões –
alguns dos quais provavelmente correspondem ao gene procurado.
Determinação da expressão do DNA em mRNAs: se a doença genética só se
exprime em determinado tecido do doente (ex: na pele) o gene procurado
expressa-se em mRNA apenas nesse tecido. Logo, examinando os mRNA’s
numa célula desse tecido do doente e comparando-os através de sondas aos
exões possíveis para o gene (determinados no passo anterior) podem eliminarse de consideração aqueles exões que não correspondem a mRNA’s no doente
e que portanto não são expressos – esses não podem corresponder ao gene
causador da doença; detecção por southern blotting de delecções ou inserções
nessas sequências importantes que possam inviabilizar o gene: quando exões
possíveis para o gene já são poucos porque as outras sequências perto do
RFLP’s já foram eliminadas pelos passos anteriores, basta comparar esses
exões nos doentes e nas pessoas normais: aqueles que estiverem alterados
apenas nos doentes corresponderão ao gene causador da doença procurado.
 PCR ou polymerase chain reaction: técnica que permite clonar ou amplificar
(multiplicar) um fragmento de DNA ilimitadamente sem recorrer a vectores ou
células vivas. É necessário que pelo menos parte (as duas extremidades) da
sua sequência já seja conhecida. A sequência dos dois extremos (primers) é
utilizada para sintetizar artificialmente pequenos oligonucleotideos (moléculas
de DNA com 6-8 bases) complementares, numa extremidade, a uma das
cadeias, e no outro à segunda cadeia da dupla hélice do fragmento. Esses
oligonucleotideos são necessários para servir de iniciadores da enzima DNA
polimerase que não consegue iniciar a polimerização sem eles. Num tubo de
ensaio é colocado o fragmento a ampliar + grande quantidade de dois
iniciadores (primers) um para cada cadeia) + DNA polimerase +
ribonucleotideos-trifofatados (DNTP’s ?). Após aquecimento até 100ºC a dupla
hélice do fragmento separa-se; depois com arrefecimento até 65ºC há
Página 8
hibridização: como existem muitos iniciadores na solução cada cadeia do
fragmento associa-se com o iniciador complementar e vai servir de molde – são
criadas duas cadeias complementares novas pela DNA polimerase. Com novo
aquecimento as 2 duplas-hélices separam-se, com arrefecimento hibridizam
novamente com iniciadores e são replicadas dando origem a 4 duplas hélices.
Cada aquecimento e arrefecimento e polimerização pela DNA polimerase
duplica o número de hélices idênticas. Este procedimento é actualmente
automatizado e cada ciclo demora cerca de 5 min. É possível detectar e ampliar
quantidades minúsculas de DNA – mesmo uma única molécula – até grandes
quantidades em pouco tempo.

Página 9