morfologia e ultra- estrutura de bactérias

16/03/2016
MORFOLOGIA E ULTRAESTRUTURA DE
BACTÉRIAS
Aula 4
Microbiologia FFI 0751
Profa. Dra. Ilana Camargo
Aula de hoje...
o Tamanhos
o Parede celular
o Forma celular
o Estruturas internas à parede
o
o
o
o
o
o
o
Membrana citoplasmática
Material genético
Ribossomos
Inclusões
Endósporos
Estruturas externas à parede
o
Glicocálice (ou glicocálix)
o
Flagelos
o
Fímbrias e Pili
Locomoção da célula bacteriana
o
Flagelar
o
Deslizamento
o
Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
1
16/03/2016
A célula procariótica
o Parede celular
*Estrutura da célula
eucariótica: membrana,
citoplasma e núcleo.
o Membrana plasmática
o Citoplasma (80% água, proteínas, carboidratos, lipídeos, íons
orgânicos, compostos de baixo peso molecular) – não possui
citoesqueleto.
o Área Nuclear ou nucleóide
o DNA circular grande de dupla fita (=cromossomo
bacteriano), fixado à membrana plasmática.
o Plasmídeo: DNA circular pequeno de dupla fita,
replicação independente, 5 a 100 genes, transportam
genes relacionados à resistência a antibióticos, tolerância a
metais tóxicos, produção de toxinas e síntese de enzimas.
1 a várias cópias, 1 ou mais tipos por célula.
o Ribossomos – milhares, conferindo aspecto granular ao
citoplasma; 70S (30s+50S); sensível à ação de antibióticos.
o Inclusões
A célula procariótica típica
Corte transversal de uma bactéria. a) Esquema. b) Micrografia.
(Tortora et al., 2005)
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16/03/2016
Tamanho das células
Madigan et al., 2004
Tamanho das células - gigantes
Epulopiscium sp, bactéria endossimbionte de peixes herbívoros marinhos.
Células podem atingir o tamanho de 600 µm por 80 µm.
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=107617
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16/03/2016
Mycoplasma – as menores
Classe Mollicutes
Ordem Mycoplasmatales
Familia Mycoplasmataceae
2 gêneros: Mycoplasma e Ureaplasma
•São os menores procariotos capazes de
se multiplicar de modo independente
(0,2 – 0,3 µm);
•Pleomórficos;
•Não possui parede celular;
•Membrana possui colesterol;
•Requerem esteróis para o crescimento;
•Genoma pequeno (580 – 2200 kpb)
Aula de hoje...
 Tamanhos
o Parede celular
o Forma celular
o Estruturas internas à parede
o
o
o
o
o
o
o
Membrana citoplasmática
Material genético
Ribossomos
Inclusões
Endósporos
Estruturas externas à parede
o
Glicocálice (ou glicocálix)
o
Flagelos
o
Fímbrias e Pili
Locomoção da célula bacteriana
o
Flagelar
o
Deslizamento
o
Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
4
16/03/2016
Parede celular
Parede celular
Função
5
16/03/2016
Parede celular - Função
o Estrutura complexa, semi-rígida e que confere forma à célula.
o Previne a ruptura da célula (Lise celular) – fornece rigidez contra a
pressão de turgor (meio intracelular é geralmente mais concentrado
em solutos que o meio externo).
o Proteção contra choques físicos;
o
Essencial para crescimento e divisão da célula;
o Importância clínica e taxonômica;
Septo de divisão
o Visualização individualizada somente em microscopia eletrônica.
Parede celular
6
16/03/2016
Parede celular
Estrutura
Parede celular – Gram-Positivo e Gram-Negativo
Camada rígida
7
16/03/2016
Parede celular – composição e estrutura
Ácido
N-acetilmurâmico
N-acetilglicosamina
(NAM)
(NAG)
o Peptideoglicano (ou mureína) –
principal componente da camada
rígida da parede (só encontrado em
Bacteria).
o Unidades repetidas de dois derivados
de açúcar unidas por polipeptídeos.
Ligação  1,4  sensível à lisozima!!
Cadeia de glicano (ligações covalentes)
Interligadas através da ligação cruzada
de suas cadeias de tetrapeptídeos para
formar peptídeoglicano
Ponte cruzada de peptídeos (interpeptídica)
Cadeia adjacente de glicano
Parede celular – composição e estrutura
álcool
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16/03/2016
Parede celular de
Staphylococcus aureus
Ligações peptídicas
Parede celular – composição e estrutura
Ligações glicosídicas
Organização das unidades repetitivas
formando a camada de peptideoglicano.
a) Ligação cruzada em bactérias Gramnegativas. b) Ponte interpeptídica de
glicina em bactérias Gram-positiva
(Staphylococcus aureus). c) Várias fitas de
peptídeoglicano unidas por ligações
cruzadas.
(Madigan et al., 2004).
Obs.: DAP (ácido diaminopimélico) ocorre nas Gramnegativo e poucas Gram-positivo; Lys (lisina), maioria
dos cocos Gram-positivo.
9
16/03/2016
Paredes celulares de Bacteria
Diagrama esquemático das paredes celulares de
bactérias Gram-positivo (a) e Gram-negativo (b)
(Fonte: Madigan et al., 2004)
Paredes celulares de Bacteria
(c) Micrografia eletrônica de Arthrobacter crystallopoietes (Grampositiva). (d) Leucothrix mucor (Gram-negativa). (e) e (f) MEV de
Bacillus subtilis e E.coli.
(Fonte: Madigan et al., 2004).
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16/03/2016
Parede das bactérias Gram-positivo
Micrografia eletrônica de transmissão de Staphylococcus aureus
Parede celular medida em nm
(Camargo et al, AAC 2008)
Parede das bactérias Gram-positivo
o
o
o
Muitas camadas (até ~25) de peptideoglicano (corresponde a 90% da parede).
Apresentam ácido teicóico e lipoteicóico (polissacarídeo ácido, com resíduo de glicerol
fosfato ou ribitol fosfato), que conferem carga negativa à superfície celular, regulando o
movimento de íons + (Ca2+ e Mg2+) na célula.
Ácidos teicóicos – respondem pela especificidade antigênica da parede, tornando
possível a identificação de bactérias em testes laboratoriais.
Ligação covalente com resíduos do ácido
murâmico
Ligação covalente com lipídeos da membrana
Fonte: Madigan et al, 2004.
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16/03/2016
Parede das bactérias Gram-positivo
Lisozima e Protoplastos
Proteína que cliva as ligações
β-1,4 entre N-actilglicosamina e
ácido N-acetil murâmico
Intumescimento!
Presente em secreções animais
(lágrimas, saliva e outros fluidos) e atua
como principal linha de defesa contra
infecções bacterianas
Protoplasto
Esferoplasto
• Célula desprovida de qualquer material
residual da parede celular
• Apresenta porções da parede celular
associadas à estrutura envolta por membrana
Parede das bactérias Gram-negativo
o
o
o
Membrana externa composta de lipopolissacarídeo (LPS), lipoproteínas e
fosfolipídeos.
Periplasma – espaço entre a MP e a ME – fluido com alta concentração de
enzimas e proteínas de transporte (consistência de gel).
Uma ou poucas camadas de peptideoglicano (que não contém ácido teicóico).
Fonte: Madigan et al, 2004.
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16/03/2016
Parede das Gram-negativo
o Membrana externa
o Permeável a pequenas moléculas pela presença de porinas, que permitem a
passagem de moléculas hidrofílicas de baixa massa molecular (alguns
nucleotídeos, dissacarídeos, peptídeos, aminoácidos, vitamina B12 e ferro).
o Propriedade tóxica: associada ao lipídeo A (=endotoxina) do LPS.
Exemplos de gêneros patogênicos Escherichia, Salmonella e Shigella.
o Polissacarídeos O do LPS atuam como antígenos e são úteis para diferenciar
espécies de bactérias Gram-negativas.
Estrutura do lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas. A composição
química do lipídeo A e dos polissacarídeos é variável nas diferentes espécies.
Fonte: Madigan et al, 2004.
Exemplos de antígenos bacterianos:
http://www.scilproj.org/Heart%26CVS_knowledge.html
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16/03/2016
Características comparativas entre Gram – e +
Característica
Gram-positivo Gram-negativo
Reação de Gram.
Retém o
corante violeta
Aparece o
contracorante
(safranina)
Camada de peptideoglicano.
Espessa –
múltiplas
Camada única –
fina
Ácidos teicóicos.
Presentes em
muitas
Ausentes
Espaço periplasmático.
Ausente
Presente
Membrana externa.
Ausente
Presente
Conteúdo de LPS.
Nenhum
Alto
Conteúdo de lipídeos e lipoproteínas.
Baixo
Alto (devido à
ME)
Toxinas produzidas.
Exotoxinas
Endotoxinas
Resistência à ruptura física.
Alta
Baixa
Ruptura da parede por lisozima.
Alta
Baixa
Sensibilidade à penicilina e às sulfonamidas. Alta
Baixa
Sensibilidade à estreptomicina, cloranfenicol
e tetraciclina.
Alta
Baixa
Adaptado de Tortora et al., 2005.
Parede celular de Archaea
N-acetilglicosamina
N-acetil talosaminurônico
Algumas espécies de
Archaea, como
Methanobacterium.
Pseudomureína de Archaea: ligações peptídicas cruzadas entre
os resíduos do NAT (N-acetil talosaminurônico). Madigan et al, 2004.
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16/03/2016
Parede celular de Archaea
Camada S – proteínas ou
glicoproteínas
Mais comum camada superficial
paracristalina (também encontrada
em Bacteria)
Sempre camada mais externa
S-layers on cell walls of cyanobacteria
Fig. 1 Schematic presentation of the molecular
architecture of the major types of the bacterial cell
envelopes covered by S-layers (modified from
<ce:cross-ref refid="BIB59"> Sleytr et al.,
1996</ce:cross-ref> ). (a) Most archaea: S-layer
as the only cell ...
Micron, Volume 33, Issue 3, 2002, 257 - 277
http://dx.doi.org/10.1016/S0968-4328(01)00031-2
Jan Šmarda , David Šmajs , Jiřı́ Komrska , Vladislav Krzyžánek
Schematic illustration of the S-layer lattice patterns (according to International Tables
for X-ray Crystallography). The building blocks of each crystalline lattice are formed
by its units, each of which is a symmetric array of identical mono-, di-, tri-, tetra- or
hexamers, the lattice subunits. Original Sleytr et al., 1996 (with courtesy of the
authors and R.G. Landes Bioscience, Georgetown).
Fig. 3. Electron micrographs of the most frequent S-layer types appearing on the walls
of bacterial cells (reproduced at the same magnification: 117.000×). The scale bars
correspond to 100 nm. Original, P. Messner and U.B. Sleytr, University for Agriculture,
Vienna. Square pattern (p4 symmetry): Desulfotomaculum nigrificans NCIB 8706.
15
16/03/2016
Parede celular de Archaea
o Diversidade de tipos de parede neste domínio – porém inexiste
peptideoglicano.
o Camada S: Tipo mais comum – camada superficial paracristalina (também
encontrada em Bacteria)
o formada por um arranjo bidimensional de proteínas, com várias simetrias;
o função pouco esclarecida: atua como barreira de permeabilidade – permite
passagem de pequenas moléculas;
o em bactérias patogênicas poderia proteger a célula contra mecanismo de
defesa da célula hospedeira.
o Retem proteínas próximo à superfície celular
o Paredes compostas por polissacarídeos, glicoproteínas ou proteínas
(Methanosarcina, Halococcus).
o Pseudomureína: presente em algumas espécies de Archaea, como
Methanobacterium.
o Possui o N-acetiltalosaminurônico (NAT), em substituição ao Nacetilmurâmico (NAM) de Bacteria.
o Ligações glicosídicas do tipo -1,3 (insensível à lisozima).
Parede celular e a forma
celular
16
16/03/2016
Morfologia celular: Forma
Espiroqueta
cocos
Pedúnculo
hifa
Bactérias com brotamento e
apendiculada
Bacilo
Espirilo
Bactérias filamentosas
Morfologia celular: Forma e arranjo
Coco
ovaladas
Bacilo
cilíndricas
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16/03/2016
Morfologia celular: Forma e arranjo
Células de várias espécies permanecem unidas em grupos ou conjuntos
após a divisão celular
Arranjos
Frequentemente os arranjos
são característicos de
determinados gêneros
Streptococcus sp.
Gênero
Staphylococcus sp.
Arranjo
Estreptococos
Estafilococos
Morfologia celular: Forma e arranjo
Espiraladas
Forma de estrela: Stella
Forma quadrada e plana: Haloarcula
Forma helicoidal (saca-rolhas)
com corpo rígido,
movimentação com flagelos
Bacilo torcido
Intensamente espiralada
Forma helicoidal (saca-rolhas)
com corpo flexível,
movimentação com filamento
axial (flagelo contido em
bainha externa flexível)
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16/03/2016
Morfologia celular: Forma e arranjo
Bactérias com brotamento e apendiculadas
Rhodomicrobium
Bactérias filamentosas
Chloroflexus
http://textbookofbacteriology.net/procaryotes_2.html
MreB e a forma da célula
Faixas espiraladas
Estruturas helicoidais não estáticas!
MreB posiciona a formação da parede
onde há contato com a membrana
citoplasmática
MreB (proteína do tipo actina) forma um citoesqueleto dinâmico e multifacetado
Recrutam outras proteínas que coordenam o crescimento da parede celular em
um padrão específico
Presentes em Bacteria e Archaea
Células sem MreB são cocoides!!
38
19
16/03/2016
MreB e a forma da célula
MreB atua posicionando a síntese de novo peptideoglicano e de outros componentes da
parede celular em localizações específicas ao longo do cilindro de uma célula bacilar durante
o crescimento.
Isso mostra que o novo material da PC de uma célula bacilar elongada é formado em
diversos pontos ao longo do seu eixo maior e não de uma única localização
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MreB e a forma da célula
Inserção de novo material de peptideoglicano
Proteína FtsZ ajuda na divisão celular
(veremos em outra aula!!)
40
20
16/03/2016
Crescentina e a forma da célula
Caulobacter crescentus
Além da MreB também apresenta
crescentina, uma proteína determinante
da morfologia que se organiza em
filamentos localizados na face côncava
da célula curva.
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Aula de hoje...
 Tamanhos
 Parede celular
 Forma celular
o Estruturas internas à parede
o
o
o
o
o
o
o
Membrana citoplasmática
Material genético
Ribossomos
Inclusões
Endósporos
Estruturas externas à parede
o
Glicocálice (ou glicocálix)
o
Flagelos
o
Fímbrias e Pili
Locomoção da célula bacteriana
o
Flagelar
o
Deslizamento
o
Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
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16/03/2016
Membrana citoplasmática
Membrana citoplasmática
Estrutura
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16/03/2016
Membrana citoplasmática dos procariotos
Bicamada de fosfolipídios (invertidos)
Porção hidrofílica
Porção hidrofóbica
Membrana citoplasmática de Bacteria
Estrutura de uma bicamada lipídica.
Madigan et al., 2004.
o Bacteria possuem hopanol, em substituição ao esterol das
MP dos eucariotos (esterol torna a MP menos rígida).
o Algumas bactérias possuem dobras internas da MP onde
localizam-se enzimas e pigmento envolvidos na fotossíntese
(cromatóforos ou tilacóides).
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16/03/2016
Membrana citoplasmática bacteriana
A maioria das Membranas Citoplasmáticas procarióticas não
contém esteróis (colesterol), por isso são menos rígidas que as
células eucarióticas.
Exceção são os micoplasmas, a única bactéria que não possui
parede celular.
Possuem esteróis junto à membrana citoplasmática ajudando a
manter sua integridade.
Moléculas planas e
rígidas
Mycoplasma – as menores bactérias
também não apresentam parede celular !!
Observe que elas não tem forma definida!!
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16/03/2016
Membrana citoplasmática de Archaea
•
Diferença dos domínios Bacteria e Eucarya está na
composição do lipídeo.
– Ligação do tipo éter entre glicerol e a cadeia lateral hidrofóbica.
– Cadeia lateral não é um ácido graxo e sim unidades repetitivas
de isopreno (hidrocarboneto de 5 C).
(a) Ligação éster (liga o glicerol ao ácido graxo em Eucarya e Bacteria).
(b) Ligação éter (liga o glicerol à cadeia lateral, em Archaea).
(c) Isopreno, estrutura da cadeia lateral hidrofóbica dos lipídeos de
Archaea.
Madigan et al., 2004.
Membrana citoplasmática de Archaea
•
Tipos de cadeia lateral definem a alta resistência a rupturas que
alguns grupos apresentam, inclusive as ocasionadas por altas
temperaturas (caso das arquéias hipertermófilas).
Unidades de isopreno
Principais lipídeos de Archaea e a
estrutura de suas membranas.
Madigan et al., 2004.
Na monocamada lipídica
as cadeias laterais de
fitanil de cada molécula
de glicerol estão
covalentemente ligadas,
formando o bifitanil, o
que confere a resistência
a rupturas.
25
16/03/2016
Membrana citoplasmática de Archaea
Crenarqueol – lipídeo
contendo anéis de 5
a 6 carbonos
Membrana citoplasmática
Funções
26
16/03/2016
Membrana citoplasmática
Funções
Membrana citoplasmática dos procariotos
Funções:
-Barreira para a maior parte das moléculas
solúveis em água, é muito mais seletiva que a
Parede Celular.
- Sítio de localização de Permeases, proteínas
específicas que transportam pequenas
moléculas para dentro da célula;
-Enzimas produzem energia e auxiliam a
síntese da Parede Celular.
27
16/03/2016
Membrana citoplasmática bacteriana
Funções de barreira:
Osmose e Difusão
Permite a osmose - entrada de
água
quando
em
uma
solução
hipotônica (baixa concentração de
soluto) e saída de água de dentro da
célula para fora quando em solução
hipertônica (alta concentração de
soluto).
Também permite a difusão simples, a entrada de moléculas pequenas como
oxigênio e dióxido de carbono, dissolvidos por meio da membrana citoplasmática
sem gasto de energia (um processo passivo);
Entretanto, a maior parte dos nutrientes é transportada por permeases e
requer gasto de energia (processo ativo)
Membrana citoplasmática dos procariotos
Força proton motiva é composta de
∆pH e ∆ (potencial de membrana)
Redox loop and electron transfer chain
Sítio de geração
e utilização da
força próton
motiva
Dehydrogenase + quionone + Proton pump + cytochrome + ATP synthase
28
16/03/2016
Aula de hoje...
 Tamanhos
 Parede celular
 Forma celular
o Estruturas internas à parede
 Membrana citoplasmática
o Material genético
o Ribossomos
o Inclusões
o Endósporos
o
o
Estruturas externas à parede
o
Glicocálice (ou glicocálix)
o
Flagelos
o
Fímbrias e Pili
Locomoção da célula bacteriana
o
Flagelar
o
Deslizamento
o
Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
Endósporos
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16/03/2016
Formação do endósporo
•
Condição de limitação de um ou mais nutrientes essenciais.
•
Em B. subtilis, ~ 200 genes envolvidos no processo de
esporulação. Processo completo pode levar 8 horas.
•
Interrupção da síntese de proteínas envolvidas nas funções da
célula vegetativa e ativação da síntese das proteínas específicas
do esporo, em resposta a um sinal ambiental.
Endósporo seco,
metabolicamente inerte
e extremamente
resistente
Célula vegetativa: Célula
com metabolismo ativo
e úmida
Formação do endósporo
Endósporos
Estágio latente de um ciclo de vida:
Esporulação
?
germinação
?
Célula vegetativa  endósporo  célula vegetativa
Estruturas ideais para dispersão de um organismo pela ação do vento, da
água, do trato gastrointestinal;
30
16/03/2016
Endósporos
•
Estruturas de resistência (ao calor, à agentes químicos, à
dessecação, radiação), desidratadas e duráveis.
•
São formados em condições de exaustão de nutrientes no meio.
•
Geralmente em bactérias do solo, Gram-positivo (descritos em
cerca de 20 gêneros de Bacteria). Não se observou em Archaea.
•
Bem estudados nos gêneros Clostridium e Bacillus.
•
Podem permanecer dormentes por longos períodos de tempo:
– Clostridium aceticum: 34 anos, frasco perdido em depósito da
Universidade da Califórnia.
– Thermoactinomyces: 2.000 anos. Fragmentos de ruínas de sítio
arqueológico romano no Reino Unido.
Endósporos
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16/03/2016
Endósporos
Exospório
Incorporação Ca+2
+ ácido dipicolínico
Desidratação adicional
Produção de PPASs e
Formação das capas
Desidratação
Cerne
Estrutura do endósporo
•
Camadas adicionais e externas à parede
celular que protegem o DNA, formadas
basicamente por proteínas.
•
Núcleo: parcialmente desidratado (contém
de 10 a 30% de água da célula vegetativa) inativa as enzimas, aumenta a
termoresistência.
– Apresenta altas [ ] de PPASs (pequenas
proteínas de ácido solúveis de esporo): liga-se
ao DNA, protegendo-o de possíveis danos
causados pela radiação ultravioleta, calor seco e
dessecamento; pode ser utilizado como fonte de
energia e carbono na extrusão durante a
germinação do esporo.
– Ácido dipicolínico: exclusivo dos esporos,
corresponde a 10% do peso seco do esporo.
Endósporo bacteriano. (a) MET
de esporo maduro de Bacillus
megaterium. (b) Fotomicrografia
de fluorescência de célula de B.
subtilis em esporulação. O corante
liga-se a uma proteína da capa do
esporo.
Madigan et al., 2004.
32
16/03/2016
Endósporo  célula vegetativa
Ativação
Aquecimento (temperatura subletal) + nutrientes
Germinação
Perde refringência
Extrusão
Intumescimento visível (++H2O)
Germinação do endósporo
•
Ativada por lesão física
(aquecimento) ou química no
revestimento do esporo.
•
Enzimas do endósporo rompem
as camadas extras.
•
Intumescimento devido à
entrada de água; síntese de
novas moléculas de RNA,
proteínas e DNA (se condições
nutricionais foram favoráveis).
Germinação de um
endósporo em
Bacillus. (a) esporo
maduro. (b) ativação –
perda de refringência.
(c) e (d) extrusão –
nova célula emergindo.
Madigan et al., 2004.
33
16/03/2016
Endósporos
•
Endósporos - Se formam dentro da célula, são exclusivos das
bactérias.
•
Possuem parede celular espessa;
•
São altamente refratáveis;
•
Altamente resistentes às mudanças do ambiente, à exposição
a compostos químicos tóxicos (desinfetantes).
•
Em M. O. - Coloração específica após o aquecimento do
material para que os mesmos absorvam o corante.
•
Variam em forma e localização dentro da célula!
Coloração de Schaeffer-Fulton
Bacillus anthracis – Endósporos e células vegetativas
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16/03/2016
Localização, tamanho e forma dos endósporos
Esporos ovais:
localização central
(Bacillus cereus)
Esporos esféricos:
localização terminal
(Clostridium tetani)
Esporos ovais:
localização subterminal
(Clostridium subterminale)
Geralmente em culturas que se aproximam do final de um crescimento
ativo.
Localização, tamanho e forma dos endósporos
Endósporos bacterianos.
Fotomicrografia de contraste
de fase ilustrando localizações
intracelulares de endóporos
em diferentes espécies. (a)
Terminais (b) Subterminais
(c) Centrais.
Madigan et al., 2004.
35
16/03/2016
Atrapalhou a tentativa de contrariar a
Teoria da Geração Espontânea
Condições de experimentos não eliminavam as formas latentes
de bactérias e fungos;
No combate ao carbúnculo, os microbiologistas compreenderam
que as formas latentes do bacilo do carbúnculo poderiam
sobreviver no solo por anos!!
Clostridium botulinum
Causam a intoxicação alimentar - Botulismo.
Possui endósporos: resistem a fervura durante horas;
As células vegetativas são mortas por temperaturas acima de 70°C,
mas a maioria dos endósporos pode resistir a 80°C por até 10
minutos.
 Perda de água durante a esporulação;
Resistência
ao calor
 Presença em grande quantidade de ácido
dipicolínico (DPA) combinado com grande
quantidade de cálcio.
36
16/03/2016
Clostridium sp.
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