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CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR DI S S E RT AÇ ÃO DE M E S T RAD O DIVERSIDADE GENÉTICA POPULACIONAL NAS ESPÉCIES PIONEIRAS Cyperus ligularis L., C. odoratus L. (CYPERACEAE) e Miconia prasina (Sw.) DC. (MELASTOMATACEAE) OCORRENTES EM REMANESCENTES DA FLORESTA ATLÂNTICA DE PERNAMBUCO DETECTADA PELOS MARCADORES MOLECULARES DAF E ISSR. GEYNER ALVES DOS SANTOS CRUZ RECIFE 2009 1 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DIVERSIDADE GENÉTICA POPULACIONAL NAS ESPÉCIES PIONEIRAS Cyperus ligularis L., C. odoratus L. (CYPERACEAE) e Miconia Prasina (Sw.) DC. (MELASTOMATACEAE) OCORRENTES EM REMANESCENTES DA FLORESTA ATLÂNTICA DE PERNAMBUCO DETECTADA PELOS MARCADORES MOLECULARES DAF E ISSR. GEYNER ALVES DOS SANTOS CRUZ Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE Orientador: Profª Drª Ana Maria Benko Iseppon Co-orientador: Profº Dr. Marccus Vinícius Alves RECIFE 2009 2 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... 3 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... 4 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Aos meus familiares e especialmente meus pais: Cícero José da Cruz Neto e Rosalva Alves dos Santos Cruz, pelo apoio incondicional sem o qual não teria chegado até aqui. Dedico 5 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Agradecimentos Primeiramente gostaria de agradecer de forma especial aos meus pais Cícero José da Cruz Neto e Rosalva Alves dos Santos Cruz e meus irmãos Geizy Alves dos Santos Cruz e Gleyson Alves dos Santos Cruz pela imensa dedicação, apoio e amor em todos os momentos sem os quais eu não teria ultrapassado nenhum degrau da vida. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa concedida, que foi fundamental para o desenvolvimento deste trabalho. Ao Parque Florestal de Dois Irmãos, pela permissão da realização de inúmeras coletas na Reserva Ecológica de Dois Irmãos. À Prefeitura da cidade do Recife, pelo apoio através da Brigada Ambiental em coleta na Ilha do Bananal. À Usina São José, pela concessão para realização de estudos e coletas nos fragmentos de Floresta Atlântica, Pezinho, Macacos e Zambana. À minha orientadora, Profª Drª Ana Maria Benko Iseppon, por todos os ensinamentos e orientação desde a minha graduação, além da paciência, compreensão, caráter e competência, sendo um exemplo de profissional a se espelhar. Ao meu co-orientador, Profº Drº Marccus Vinícius Alves, por sua contínua paciência e compreensão além de principalmente sempre me apoiar e ajudar ao longo de todo o desenvolvimento do trabalho desde a graduação, bem como aos inúmeros incentivos e colaborações. Ao Profº Drº Rodrigo Augusto Torres por toda sua disponibilidade, pelos ensinamentos, paciência e colaboração para o melhor andamento do trabalho. À Islene Araújo pelo imenso companheirismo, amor, dedicação, carinho, apoio, amizade e por os inúmeros momentos de felicidade, os quais se tornaram inesquecíveis. Aos “brothers” Diegos - Diego Pontes e Diego Pinangé - pela grande amizade, incentivos, apoios importantes e por podermos partilhar muitos momentos de alegria os quais foram fundamentais na construção dessa etapa da minha vida. Ao Mário Correia, Rodrigo Sotero (Designer Biólogo), Nara Diniz e Helena Macedo pela amizade e por sempre serem presentes e dispostos a ajudar, por todo o apoio e por partilhar muitos momentos de lazer e descontração. A Amaro Castro e Ebenézer Bernardes (Dom Bené) pelo grande apoio, ensinamentos, paciência e por os inúmeros momentos de descontração tornando o ambiente de trabalho mais produtivo, harmonioso e agradável. 6 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... À Profª Ana Christina Brasileiro Vidal pelos ensinamentos, apoio constante e colaborações. Aos colegas da Turma de Mestrado em Genética 2007, em especial a Felipe Alecrim pelo convívio harmonioso, amizade e troca de experiências durante o cumprimento dos créditos obrigatórios. Aos demais colegas e técnicos do laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal, especialmente, Kyria Bortoleti, Santelmo Vasconcelos, Rodrigo Oliveira, Hayana Azevedo, Luciene Silva, Isaac Cansansão, Karla Barbosa, Giovane Feitosa, Bruno Leite, Rafaela Oliveira, Alberto Vinícius, Lidiane Amorim, Petra Barros, Gabriela Souto, Nina Mota, Ana Carolina, Jaílson Gitaí, Luis Belarmino, Agatha Silva, Derovil Santos, Claudete Marques, Vanessa Souza e Valéria Fernandes pela colaboração e incentivo. Ao Departamento de Genética da UFPE, no qual desenvolvi todo o meu trabalho com toda a infra-estrutura necessária, aos funcionários técnicos administrativos, aos docentes e em especial a Dona Zizi por sempre estar “ranzinza”, mas sempre disposta a ajudar em diversas ocasiões, e ao funcionário Romildo por toda prestação, apoio, colaboração e cuidados na casa de vegetação. Agradeço ainda a todos que direta ou indiretamente ajudaram na concretização deste trabalho. Muito Obrigado. 7 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... SUMÁRIO Página Lista de Figuras........................................................................................................... IX Lista de Tabelas........................................................................................................... X Lista de Abreviações................................................................................................... XI Resumo......................................................................................................................... 13 1. Introdução................................................................................................................ 14 2. Revisão da Literatura............................................................................................. 16 2.1. Floresta Atlântica............................................................................................. 16 2.1.1. Fragmentação......................................................................................... 20 2.1.2. Fragmentos Urbanos e Periurbanos....................................................... 21 2.2. Espécies Pioneiras de Ambiente Natural......................................................... 22 2.3. O gênero Cyperus L. s.l................................................................................... 24 2.3.1 Biologia e Ecologia de Cyperus..................................................................... 25 2.4 O gênero Miconia L. s.l.................................................................................... 26 2.4.1 Biologia e Ecologia de Miconia.............................................................. 28 2.5 Marcadores Moleculares................................................................................... 29 2.5.1 Marcadores Moleculares na Análise da Diversidade em Vegetais......... 30 2.5.1.a Análise de DAF (DNA Amplification Fingerprinting)................ 32 2.5.1.b. Análise de ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)...................... 33 2.6 Análises Genéticas em Populações Vegetais.................................................... 34 2.7 Análise de Diversidade Genética e Parentesco em Plantas.............................. 36 2.7.1 Em Cyperaceae........................................................................................ 39 3. Referências Bibliográficas...................................................................................... 40 4. Capítulo I: Diversidade Genética em Populações de Cyperus odoratus L. e C. 50 ligularis L. (Cyperaceae) ocorrentes em um Fragmento de Floresta Atlântica através de Fingerprinting de DNA............................................................................................ 4.1 Resumo............................................................................................................. 51 4.2 Materiais e métodos.......................................................................................... 53 4.3 Resultados......................................................................................................... 55 4.4 Discussão.......................................................................................................... 56 4.5 Referências Bibliográficas................................................................................ 61 4.6 Tabelas.............................................................................................................. 65 4.7 Figuras.............................................................................................................. 68 8 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... 5. Capítulo II: Diferenciação Genética entre Quatro Populações de Miconia 70 prasina (Sw.) DC. (Melastomataceae) ocorrentes em Fragmentos de Floresta Atlântica de Terras Baixas em Pernambuco, através de Fingerprinting de DNA 5.1 Resumo............................................................................................................. 71 5.2 Materiais e métodos.......................................................................................... 73 5.3 Resultados......................................................................................................... 76 5.4 Discussão.......................................................................................................... 78 5.5 Referências Bibliográficas................................................................................ 83 5.6 Tabelas.............................................................................................................. 88 5.7 Figuras.............................................................................................................. 93 6. Conclusões………………………………………………………………………… 97 7. Abstract…………………………………………………………………………… 99 8. Anexo: Normas da revista Genetics and Molecular Research.................................. 100 9 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Lista de Figuras Revisão da Literatura Página Figura 1: Distribuição Geográfica da Mata Altântica 18 Figura 2: Heterogeneidade da Mata Atlântica 19 Figura 3: Classificação da Família Cyperaceae 24 Figura 4: Classificação da Família Melastomataceae 27 Capítulo I Figura 1: Plots de coleta das espécies C. odoratus e C. ligularis. 68 Figura 2: Dendrograma gerado a partir da técnica DAF entre 40 amostras de C. 69 odoratus e C. ligularis Capítulo II Figura 1: Área de estudo de Miconia prasina 93 Figura 2: Dendograma DAF entre 22 amostras de M. prasina 94 Figura 3: Dendograma ISSR entre 22 amostras de M. prasina 95 Figura 4: Dendograma DAF/ISSR entre 22 amostras de M. prasina 96 IX 10 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Lista de Tabelas Capítulo I Página Tabela 1: Banco de DNA e germoplasma 65 Tabela 2: Lista de primers DAF 66 Tabela 3: Polimorfismos gerados pelo marcador DAF em C. odoratus e C. ligularis 67 Capítulo II Tabela 1: Distribuição dos indivíduos coletados 88 Tabela 2: Sequências e designação de primers DAF e ISSR 89 Tabela 3: Polimorfismo gerado pelo marcador DAF 90 Tabela 4: Polimorfismo gerado pelo marcador ISSR 91 Tabela 5: Dados populacionais de Gst e Nm 92 X 11 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Lista de Abreviações Adh Desidrogenase do álcool AFLP Amplified Fragment Length Polimorfism, Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados ca. Cerca de CTAB Cetyl-trimethyl-amoniumbromide DAF DNA Amplification Fingerprinting, Impressão Genômica do DNA Amplificado DNA Desoxiribonucleic Acid, Ácido Desoxirribonucléico dNTP Dinucleotídeo trifosfato EST Expressed Sequence Tags, Etiqueta de Seqüência Expressa g Grama h Hora ha. Hectare He Diversidade Geral de Espécie Hp Diversidade Geral de Populações ISSR Inter Simple Sequence Repeats, Inter seqüências únicas repetidas ITS Nuclear Ribosomal Internal Transcribed Spacer, Espaçador transcrito interno de ribossomo nuclear Km Quilômetro MEGA 4.0 Molecular Evolucionary Genetics Analysis, Análises Moleculares de Genética Evolutiva MHP Mini Harpin, Mini grampo µL MicroLitro µM Micromolar min Minuto mL Mililitro mm Milímetro ng Nanograma XI 12 CRUZ, G.A.S. NJ Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Neighbor joining, Juntando os Vizinhos pb Pares de base PCR Polymerase Chain Reaction, Reação em Cadeia da Polimerase Pe Locos Polimórficos dentro de Espécie Pp Locos Polimórficos dentro de Populações RAPD Random Amplified Polymorphic DNA, Polimorfismo de DNA Amplificado Aleatoriamente rbcL Ribonuclease RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism, Polimorfismos no Comprimento de Fragmentos de Restrição RNA Ribonucleic acid Ácido ribonucléico seg Segundo SSR Simple Sequence Repeat, Seqüência Simples Repetida Taq Thermophylus aquaticus U Unidade UFPE Universidade Federal de Pernambuco UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean, Método Ponderado de Grupos em Pares por Meio Aritmético USA United States of América, Estados Unidos da América YAC Yeast Artificial Chromosomes, Cromossomos Artificiais de Levedura XII 13 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Resumo A Floresta Atlântica tem sofrido contínuas retrações resultando em urgente demanda por novas estratégias para sua preservação e para o entendimento das conseqüências da fragmentação, especialmente visando à sua conservação. Considerando este cenário, as famílias Cyperaceae e Melastomataceae representam importante papel, devido à sua função como pioneiras e regeneradoras florestais. O presente trabalho objetivou estudar a diversidade genética e o fluxo gênico entre populações das espécies pioneiras Cyperus ligularis e C. odoratus (Cyperaceae) ocorrentes em um fragmento urbano de Floresta Atlântica da Reserva de Dois Irmãos Recife (PE) e em seus arredores, bem como de Miconia prasina (Melastomataceae) ocorrente em três fragmentos periurbanos de Floresta Atlântica na Usina São José (USJ) em Igarassu (PE), mediante marcadores moleculares DAF (DNA Amplification Fingerprinting) e ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). O fenograma gerado através do DAF para as populações de C. ligularis e C. odoratus demonstrou total separação genética entre estas espécies, sustentado por 165 marcas polimórficas interespecíficas. Adicionalmente, as populações apresentaram alta diversidade genética entre si de acordo com o índice Gst de Nei (Gst- 0,3632), correlacionada a uma baixa taxa de fluxo gênico a partir do índice de número de migrantes observado Nm- 0,8766. Os indivíduos da espécie C. odoratus foram coletados apenas nas proximidades de dois açudes da Reserva de Dois Irmãos constituída por um fragmento de Floresta Atlântica, apresentando maior diversificação genética entre eles do que os de C. ligularis, ocorrentes também na Reserva de Dois Irmãos bem como em populações adjacentes sob forte influência antrópica, havendo distância de até 3 km entre os plots amostrados. Estes resultados sugerem a existência de maior variação intraespecífica e intrapopulacional para C. odoratus. Em contrapartida a menor variabilidade observada em C. ligularis sugere a influência de um possível efeito fundador na capacidade em ocupar áreas urbanas mais secas ou úmidas e poluídas, limitada a uma combinação específica de fatores genéticos, a despeito da diversidade de locais e áreas amostradas, desta forma agruparam-se aleatoriamente sugerindo a formação de uma metapopulação. Foram obtidos para as populações de M. prasina 237 loci polimórficos a partir do DAF e ISSR onde a estimativa global de diversidade genética (Dg%) foi de 91 e 85,5% para DAF e ISSR, respectivamente, tendo o fragmento de Floresta Atlântica Macacos (Mac) como a maior contribuinte e os fragmentos Açude do Prata (Apr) e Pezinho (Pez) como os menores, sugerindo que Mac se apresenta com maior potencial de adaptabilidade. Os dados de Dg% intrapopulacional apontam Mac com o maior índice, provavelmente devido à polinização e dispersão neste, e Apr e Pez, com os menores sugerindo maior atenção no sentido de conservação destes. A partir dos agrupamentos foram observados indícios de estruturação genética da população Apr em relação às demais, fato também indicado por as análises populacionais (Gst e Nm). A partir dos Gst e Nm globais por DAF e DAF/ISSR foi observada uma divergência genética entre os fragmentos de Floresta Atlântica analisados, sugerindo-se que tal fenômeno seria conseqüência das expansões e retrações da Floresta Atlântica ocorridas durante o Quaternário, bem como da pressão antrópica. A associação destes dados com observações de campo e de biologia reprodutiva devem auxiliar no entendimento da dinâmica das populações analisadas e do papel destas plantas nos processos sucessionais. Palavras-Chave: Fragmentação, Estrutura populacional, Miconia, Cyperus, Fingerprinting de DNA. 14 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... 1. Introdução A Floresta Tropical representa uma organização biológica de grande importância do ponto de vista da biodiversidade, nela se encontram diferentes formações vegetacionais que servem de abrigo a diversas formas de vida e que, no decorrer do tempo, tem servido a atividades desordenadas e outras práticas de exploração. Com a destruição acelerada dessas florestas, grande parte da biodiversidade presente nesses ecossistemas está se perdendo, antes mesmo que se tenha inteiro conhecimento de sua riqueza natural. Dentre as formações florestais tropicais que ocorrem no Brasil, pode-se destacar a Floresta Ombrófila Densa (Mata Atlântica), que se encontra distribuída ao longo de toda sua costa litorânea, resultante de díspares combinações de espécies em cada parte ou unidade da floresta, formando um grande mosaico constituído por manchas de várias idades e diferentes estágios sucessionais, originadas por perturbações externas e processos de sucessão secundária. Em Pernambuco, a Mata Atlântica foi eliminada em grande parte e os remanescentes florestais existentes estão sujeitos à degradação por empobrecimento gradativo em diversidade biológica devido à sua pequena área, merecendo atenção prioritária. Grande parte da faixa litorânea encontra-se ocupada por diversos municípios com destaque para a Região Metropolitana do Recife (RMR), onde a expansão urbana desordenada tende a isolar, diminuir e descaracterizar as poucas manchas de vegetação nativa, mesmo estando algumas protegidas por legislação. Portanto, de acordo com as informações supracitadas uma das maiores preocupações para a conservação da Floresta Atlântica refere-se à transformação e exploração deste habitat modificando severamente sua estrutura, atuando diretamente no padrão de distribuição espacial e fenológico das espécies nativas, já que diferentes fatores do ambiente, como luz incidente, umidade e disponibilidade de nutrientes também são afetados. Porém, tais alterações nos ambientes naturais permitem o estabelecimento de espécies ditas pioneiras e indicadoras de degradação ambiental como as Cyperaceae e Melastomataceae, sendo estas caracterizadas por apresentar grande resistência a condições ambientais mais extremas tendo como principal importância a capacidade de se desenvolver em condições ambientais não muito favoráveis para a sobrevivência de outros vegetais, assim destacando-se por sua potencialidade de recuperação florestal. Um aspecto importante a ser considerado para a conservação das formações florestais é antes de qualquer plano de ação, conhecer a composição e estrutura dos remanescentes, o 15 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... que é de suma relevância para que se façam intervenções e elaboração de planos de manejo sustentável. O sucesso do manejo e preservação de populações de espécies vegetais depende de uma investigação acurada da diversidade genética como, por exemplo, através dos índices estatísticos F de Wright ou Gst de Nei - em populações naturais é influenciada pelo seu tamanho, distribuição geográfica, polinizações e fluxo gênico, além de ser estruturada no tempo e no espaço - a fim de apontar questões com respeito às relações genéticas entre indivíduos e níveis de variação da estrutura genética populacional, contribuindo para o melhor direcionamento dos esforços de preservação. Vários são os métodos utilizados para detectar a distribuição espacial da variabilidade e conectividade genética em populações. As que são claramente fragmentadas ou contínuas nas quais se observam unidades fisionômicas, a distribuição da variação genética pode ser estudada entre os grupos existentes. Marcadores fingerprinting de DNA têm uma ampla aplicação em análises de variação genética e medição de fluxo gênico a nível específico, particularmente em investigações de diferenciação e estrutura genética populacional, incluindo estimação de índices de diferenciação genética populacional (Fst, Gst), variação genética em espécies sem nenhum conhecimento genético prévio - como é o caso da maioria das espécies neotropicais - e dentro de populações Portanto, os estudos extensivos de dados compilados a partir de marcadores moleculares são potenciais na produção de informações com implicações importantes na biologia evolutiva, ecologia e principalmente na conservação biológica de plantas nativas. O presente estudo teve como objetivo analisar parâmetros de diversidade genética e fluxo gênico entre populações das espécies pioneiras e indicadoras de degradação ambiental, Miconia prasina (Melastomataceae), Cyperus ligularis e C. odoratus (Cyperaceae) ocorrentes em fragmentos de Floresta Atlântica e arredores, na região Metropolitana do Recife, PE, podendo contribuir para o melhor entendimento da estrutura genética das populações fornecendo uma perspectiva histórica das mudanças evolutivas que caracterizam uma espécie e permitem indicar como as populações responderão a eventos futuros de origem natural e artificial, sendo estas informações fundamentais no direcionamento dos esforços de manejo e conservação entre os fragmentos estudados. 16 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... 2. Revisão da Literatura 2.1 Floresta Atlântica As Florestas Tropicais vêm sofrendo, paulatinamente, uma redução de suas áreas, por meio de desmatamentos para retirada de madeira, exploração de recursos minerais, implantação de projetos agropecuários e queimadas criminosas (SILVA & ANDRADE, 2005). A Floresta Atlântica é a segunda maior floresta pluvial tropical do continente americano, que originalmente estendia-se de forma contínua ao longo da costa brasileira, penetrando até o leste do Paraguai e nordeste da Argentina em sua porção sul. No passado cobria mais de 1,5 milhões de km2 – com 92% desta área no Brasil (FUNDAÇÃO SOS MATA ATLÂNTICA & INPE, 2001; GALINDO- LEAL & CÂMARA, 2003). A Floresta Atlântica é um dos 25 hotspots mundiais de biodiversidade. Embora tenha sido em grande parte destruída, ela ainda abriga mais de 8.000 espécies endêmicas de plantas vasculares, anfíbios, répteis, aves e mamíferos (MYERS et al., 2000). Relativamente heterogênea em sua composição, a Floresta Atlântica estende-se atualmente de 4o a 32oS e cobre um amplo rol de zonas climáticas e formações vegetacionais, de tropicais a subtropicais. A elevação vai do nível do mar até 2.900 m, com mudanças abruptas no tipo e profundidade dos solos e na temperatura média do ar (MANTOVANI, 2003). Variações longitudinais são igualmente marcantes. Quanto mais interioranas, mais sazonais tornam-se as florestas, com índices de pluviosidade caindo de 4.000 mm a 1.000 mm em algumas áreas da Serra do Mar (OLIVEIRA-FILHO & FONTES, 2000; MANTOVANI, 2003). Junto com a floresta tropical, a Floresta Atlântica abrange formações mistas de araucária ao sul, com distinta dominância de lauráceas, bem como florestas decíduas e semidecíduas no interior. Várias formações encontram-se associadas a esta floresta, como mangues, restingas, formações campestres de altitude e brejos (CÂMARA, 2003). A área costeira do Brasil, considerando-se as formações sobre as restingas e a Floresta Atlântica, representa uma região com índice elevado de endemismos (THOMAZ et al., 1998), onde ocorrem, por exemplo, 39 espécies endêmicas de Chrysobalanaceae (PRANCE, 1987). Das 127 espécies lenhosas descritas para região costeira na Flora Neotropica, 68 (53,5%) são endêmicas (MORI et al., 1981). De acordo com diversos autores (MORI et al., 1983; PEIXOTO & GENTRY, 1990; JOLY et al., 1991; BARROS et al., 1991), além do elevado grau de endemismo observado em alguns grupos vegetais, a floresta atlântica apresenta elevada riqueza de espécies e diversidade florística que, em alguns locais, é superior às observadas em trechos de Floresta Amazônica (BROWN JR. & BROWN, 1992). 17 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Considera-se que a riqueza de plantas lenhosas nas Florestas Tropicais esteja relacionada a cinco gradientes principais: o latitudinal, o de precipitação, o edáfico, o altitudinal e o intercontinental (GENTRY, 1988a , CLINEBELL et al., 1995). Com exceção de Myrtaceae, as famílias com maior riqueza de plantas lenhosas nas florestas neotropicais têm seus principais centros de riqueza fora da região costeira brasileira. Como maior riqueza de arbustos destaca-se o gênero Miconia que pertence à família Melastomataceae (GENTRY, 1982). A história da ocupação da Floresta Atlântica é marcada por certa confusão com a chegada dos portugueses ao país e o processo de colonização. Antes de sua intensa destruição, esta cobria largas áreas ao longo da costa brasileira, do Nordeste ao Sul do país, avançando para o interior em extensões variáveis, possuindo uma grande diversidade de solos, relevos e climas, tendo como elemento comum a exposição aos ventos úmidos que sopram do oceano (LIMA, 1998). Apesar da enorme carência de dados específicos e comprobatórios da sua devastação, reconhece-se que a densa e diversificada floresta encontrada pelos colonizadores tem ao longo dos séculos sido intensamente explorada e/ou substituída, passando a ser considerada como um dos ecossistemas mais ameaçados do mundo (CORRÊA, 1995). No decorrer do processo de ocupação das terras pelos colonizadores portugueses, diversos tipos de atividades destruidoras se destacaram na eliminação das matas no Nordeste, e particularmente, em Pernambuco. Uma delas, nos primeiros tempos da colonização, deveuse à destruição deliberada das florestas visando facilitar a defesa dos colonos contra os ataques constantes de indígenas (COIMBRA-FILHO & CÂMARA, 1996). Adicionalmente, as queimadas realizadas no curso das frequentes lutas dos colonizadores contra indígenas, entre tribos rivais e no decorrer da expulsão de invasores, representam outro tipo de atividade devastadora. Na maioria das vezes, recomendava-se a remoção das matas como estratégia militar (LIMA, 1998). Outra significativa atividade destruidora foi a da extração do pau-brasil (Caesalpinia echinata Lam.) que praticamente desapareceu do seu ambiente natural, assim como, outras madeiras valiosas. Desta forma, a extração desta espécie pode ser considerada como uma das primeiras atividades responsáveis por alterações ecológicas de vulto, que afetaram as formações atlânticas silvestres (LIMA, 1998). Um quarto tipo de atividade antrópica de exploração inclui as derrubadas destinadas ao desenvolvimento da pecuária bovina extensiva. Concomitantemente, devem ser consideradas atividades múltiplas, tais como o desmatamento visando à construção de estradas, barragens, vilas, cidades, mineração, entre outras. Vale salientar, como de grande expressão, as derrubadas para ocupação com plantações agrícolas como canaviais, cafezais, 18 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... mandiocais, dentre outros (LIMA, 1998). Sobre esse assunto, Gilberto Freyre descreveu em seu livro Nordeste, o que foi a devastação das matas nordestinas pelos colonizadores, e mais precisamente em Pernambuco, para abrir espaço à monocultura canavieira (COIMBRAFILHO & CÂMARA, 1996). A substituição da Floresta Atlântica pela cultura da cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) a partir do período colonial representa a principal causa do seu processo de degradação, agravando-se com o programa governamental “Pro-Álcool”, em 1974. A destruição dos ecossistemas silvestres nordestinos constituiu, portanto, um processo multiforme e contínuo de origem antrópica, com indiscutível realimentação, que descaracterizou a fisionomia original da região (LIMA, 1998). Tal pressão antrópica existente há mais de 500 anos já provocou a perda de mais de 93% de sua área (MYERS et al., 2000), restando menos de 100.000 km2 de vegetação remanesce (Fig. 1). Algumas áreas de endemismo, como Pernambuco, agora possuem menos de 5% de sua floresta original (GALINDO-LEAL & CÂMARA, 2003). Dez por cento da cobertura florestal remanescente foi perdida entre 1989 e 2000 apenas, apesar de investimentos consideráveis em vigilância e proteção (A. AMARANTE, dados não publicados). Antes cobrindo áreas enormes, as florestas remanescentes foram reduzidas a vários agrupamentos de fragmentos florestais muito pequenos, bastante separados entre si (GASCON et al., 2000). As matas do Nordeste já estavam em grande parte devastadas (criação de gado e exploração de madeira mandada para a Europa) no século XVI (COIMBRA-FILHO & CÂMARA, 1996). Figura 1: Distribuição atual da Mata Altântica. Fonte: Folha de São Paulo – BBC Brasil. 19 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Dados indicaram para o Nordeste um percentual de 36,8% de sua área coberta com matas no início do século XX e para Pernambuco um percentual de 34,14% (LIMA, 1998). Atualmente Pernambuco mantém apenas 2% da cobertura original, em fragmentos rodeados por monoculturas e aglomerados urbanos (VIANA et al. 1997; CHIARELLO, 1999; SILVA & TABARELLI 2000), sendo 48% dos remanescentes abaixo de 10 ha e apenas 7% acima de 100 ha (média de 34 ha) (RANTA et al. 1998). Diante desse quadro de intensa exploração, na atualidade a vegetação preservada da Floresta Atlântica ocorre de maneira totalmente fragmentada ao longo da faixa litorânea do Brasil principalmente em inclinações íngremes de montanhas, de forma a constituir uma gama de florestas altamente heterogêneas tais como a floresta estacional semidecidual, a floresta ombrófila aberta e densa (Fig. 2), justificando seu reconhecimento como um grande foco de biodiversidade (PREFEITURA DA CIDADE DO RECIFE, 2002). Figura 2: Distribuição heterogênea da Mata Altântica. Fonte: INPE – Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais. Devido à ocorrência de fragmentos da Floresta Atlântica em boa parte do litoral brasileiro, esta se apresenta subdividida em dois conjuntos (Nordeste e Sudeste/Sul) os quais se assemelham em determinados padrões florísticos. Vale citar que, por causa da sua localização geográfica, o estado do Espírito Santo parece conter uma flora intermediária entre os dois blocos (SILVA, 1996). 20 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Dentro de um contexto geográfico, referindo-se ao clima, morfologia do relevo e área de ocorrência, reporta-se que a Floresta Atlântica é composta por várias biorregiões de grande importância ambiental, apresentando ecossistemas diferenciados em vários estágios de regeneração principalmente nos fragmentos que estão sob proteção ambiental (DIAS et al., 2003). 2.1.1 Fragmentação Grandes extensões territoriais de paisagens “naturais” sofreram transformações significativas, especialmente, no último século. Assim, a Floresta Atlântica apresenta-se como um mosaico composto por poucas áreas relativamente extensas, principalmente nas regiões sul e sudeste (zonas núcleo de preservação de acordo com o Conselho Nacional da Reserva da Biosfera da Mata Atlântica) e uma porção bem maior composta de áreas em diversos estágios de degradação (ZAÚ, 1998). Neste quadro, os fragmentos florestais de diversos tamanhos e formas, assumem fundamental importância para a perenidade da Floresta Atlântica (ZAÚ, 1998). A fragmentação da paisagem produz uma série de manchas de vegetação “remendada” e cercada por uma matriz de diferentes vegetações e/ou de terra. Como efeitos preliminares podem-se citar alterações do microclima dentro e ao redor da mancha remanescente, isolando-as do resto da paisagem circunvizinha (SAUNDERS et al., 1991). A remoção da vegetação nativa e sua substituição por espécies com a arquitetura e fenologia diferentes alteram o contrapeso da radiação solar que, por sua vez, passa a ser maior durante o período noturno. Outras consequências desta ação antrópica são alterações no comportamento eólico devido às mudanças da arquitetura do ambiente, modificações do regime de águas alterando assim vários ciclos hidrológicos, isolamento do fragmento, diminuição ou eliminação de habitats o que incide de maneira aguda na biota presente nos diversos ecossistemas (SAUNDERS et al., 1991). Esse processo de fragmentação e isolamento contribuiu para extinções expressivas, tornando urgente a necessidade de compreensão da dinâmica dos diversos ecossistemas os quais compõem a Floresta Atlântica. Considerada uma das maiores ameaças a biodiversidade, a fragmentação dos ambientes naturais conduz à perda qualitativa de espécies, sendo o estudo, a medição e previsão das implicações dessa fragmentação um dos maiores desafios à ciência no momento (SILVA, 1996). Além da necessidade premente da conservação, manejo e recuperação dos fragmentos, do que resta da Floresta Tropical Atlântica, torna-se imprescindível que conceitos 21 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... teóricos básicos dos ecossistemas tropicais sejam invocados, para a construção de tecnologias adequadas para essas ações, sendo fundamental a junção de conceitos da ecologia de populações e da genética de populações de forma a orientar as ações a serem efetuadas e definir parâmetros adequados para o monitoramento das mesmas (KAGEYAMA & GANDARA, 1998). Considerando-se a necessidade de utilização racional do meio, enfatiza-se a proposta de múltiplos usos para áreas florestadas, como alternativa ao uso atual da terra, baseado na transformação e consequente fragmentação das florestas ainda existentes. Neste contexto o conhecimento da dinâmica ecológica em fragmentos florestais e corredores de vegetação torna-se de suma importância no binômio conservação/desenvolvimento (ZAÚ, 1998). 2.1.2 Fragmentos Urbanos e Periurbanos Um importante aspecto contemporâneo é a preocupação com a situação ambiental que é fundamental para qualidade de vida das pessoas, pelo fato da grande concentração humana estar presente nas urbes (COSTA, 2004). A principal característica do crescimento populacional tem sido o novo perfil de crescimento no qual a migração no sentido do campo para as cidades passou a ocorrer de forma mais intensa, com consequente diminuição da população rural, ocasionando um “inchaço” nas cidades, de maneira que as ocupações dos territórios urbanizados foram realizadas de forma desordenada (DUARTE, 2003). Assim, em virtude da abertura e expansão de áreas agrícolas, crescimento urbano desordenado, implantação de projetos industriais, entre outros processos, a paisagem nativa cedeu espaço a uma paisagem antrópica, formada por padrões de áreas urbanas, rodovias, culturas agrícolas, pastagens, áreas degradadas e também remanescentes da vegetação nativa. Estes remanescentes, também conhecidos como fragmentos florestais, desempenham importante função de mantenedores da biodiversidade existente na região afetada e devem ser considerados como elementos-chave no planejamento visando à conservação ambiental. A biodiversidade ainda presente no local que, mesmo impactada e diversa de sua condição natural, dependerá do tempo de isolamento/fragmentação, da distância entre fragmentos adjacentes e do grau de conectividade entre fragmentos para não entrar em rota de extinção (SAUNDERS et al., 1991). A presença de coberturas vegetais urbanas e periurbanas implicam na melhoria de fatores para o bem estar e maior qualidade de vida da população, pois harmoniza um maior equilíbrio climático, de modo a torna-se fundamental na prevenção de vários problemas urbanos como inundações e deslizamentos, poeira e mau-cheiro, dentre outros. Além destes 22 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... tipos de melhoramentos contribui para o bem estar social por meio de redução da densidade populacional local, do fluxo de trânsito, entre outros (MORAWETZ & BENKO-ISEPPON, 2005; BENKO-ISEPPON et al., 2007). Considerando-se a importância apresentada por tais vegetações e as condições de degradação às quais estas se encontram submetidas, uma das propostas para minimizar os efeitos da fragmentação causada pela ação antrópica nos centros urbanos inclui o estabelecimento de corredores ecológicos interligando o maior número possível de fragmentos, favorecendo o deslocamento de animais silvestres inter-fragmentos, aumentando a dispersão de sementes e a área de ocorrência de algumas espécies, diminuindo a taxa de extinção de espécies, entre outros benefícios (MARTINS et al., 1998). 2.2 Espécies Pioneiras de Ambiente Natural Uma das maiores preocupações para a conservação das florestas tropicais tem sido a transformação e exploração deste habitat (ROSSI & HUGUCHI, 1998), a qual pode modificar severamente sua estrutura (LIEBERMAN & DOCK, 1982; HOFFMAN, 1998), atuando diretamente no padrão de distribuição espacial (ALMEIDA et al., 1998) e fenológico das espécies nativas (CLARK & CLARK, 1987; COSTA & MAGNUSSON, 2003), já que diferentes fatores do ambiente, como luz incidente, umidade e disponibilidade de nutrientes também serão afetados (ROSSI & HUGUCHI, 1998). Por outro lado, a alteração de ambientes naturais permite a entrada de novas espécies nestes ambientes, principalmente espécies que possuam uma grande resistência a condições ambientais mais extremas e que podem ser consideradas espécies pioneiras ou invasoras. Essas plantas apresentam como atributo importante a capacidade de se desenvolver em condições ambientais não muito favoráveis para a sobrevivência de outros vegetais (ROY, 1990). Plantas pioneiras ou intolerantes à sombra são aquelas que necessitam de clareiras naturais como sítio de ocorrência, colaborando para processos de regeneração da vegetação. Nesse grupo estão incluídas as árvores e os arbustos pioneiros de ciclo de vida curto (< 50 anos de idade) e as pioneiras de ciclo de vida longo (> 50 anos), também classificadas como grandes pioneiras (TABARELLI & MANTOVANI, 1999). Portanto, a abertura de clareiras naturais, causada pela queda de uma ou mais árvores do dossel, vem sendo considerada um mecanismo de manutenção da diversidade de espécies nas florestas tropicais (HARTSHORN, 1980; TERBORGH, 1992; apud TABARELLI & MANTOVANI, 1999). Conforme DENSLOW (1987) e BROWN & BROWN (1992) apud TABARELLI & MANTOVANI 23 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... (1999) clareiras representam nichos distintos de colonização, permitindo a coexistência na floresta de espécies com diferentes características. Estes vegetais pioneiros produzem anualmente e por longos períodos, sementes pequenas que são dispersas pelo vento ou por animais, por médias a longas distâncias; podendo estas sementes permanecer no solo durante um tempo considerável, compondo o banco de sementes da espécie. Tais plantas são muito bifurcadas e possuem raízes superficiais apresentando rápido crescimento e produzindo madeira macia e de baixa densidade. Suas folhas respondem periodicamente, realizam altas taxas fotossintéticas e respiratórias, apresentam baixa toxicidade, sendo susceptíveis à predação por herbívoros e patógenos. As espécies pioneiras apresentam alta plasticidade fenotípica e ampla ocorrência geográfica por possuírem alto potencial de aclimatação e rápida resposta às mudanças nos níveis de recursos (RIBAS, 2003). Tais organismos possuem características próprias de extinção local e recolonização que, juntamente com a existência de bancos de sementes, apresentam importantes consequências genéticas e ecológicas para as espécies. Exemplo claro é dado pelo fato dos bancos de sementes poderem agir como “tampão gênico” devido à sua capacidade de repor a diversidade genética perdida pela população de plantas e a longa distância de dispersão de sementes e pólen reduzir a distância entre populações geograficamente distintas (RIBAS, 2003). Espécies de Cyperaceae e Melastomataceae apresentam grande importância na conservação de ambientes uma vez que são componentes dominantes de muitos ecossistemas e, por conseguinte são indicadores de confiança de ambientes deteriorados (SIMPSON et al., 2003). Em decorrência da degradação de diversas formações vegetacionais no entorno de alguns pólos industriais no Brasil e mesmo em matas urbanas decorrentes de ocupações ou atividades inapropriadas, Oliva & Figueiredo (2005) sugeriram que o uso de organismos indicadores, como abordagem alternativa e/ou complementar em programas de monitoramento de poluição ambiental, permitiria uma interpretação melhor das relações ecológicas envolvidas. Para isso, um pré-requisito essencial é que as espécies a serem empregadas como indicadores ativos ou passivos sejam de ampla distribuição regional e que apresentem sensibilidade diferenciada aos poluentes. Como forma de exemplificar a aplicação de plantas bioindicadoras, Oliva & Figueiredo (2005), em estudo de regiões poluídas com flúor devido a atividades industriais, demonstraram que no caso específico de F-, um dos métodos protocolados e amplamente aceito recomendou o uso do azevém (em inglês ‘ryegrass’), da espécie Lolium multiflorum L. 24 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... italicum (A. Braun) Husnot var. lema, cultivada em pequeno volume de substrato comercial, apresentando capacidade de responder ao poluente em curto prazo. 2.3 O gênero Cyperus L. s.l. O gênero Cyperus é o segundo maior da família Cyperaceae (Ordem Poales) (Fig. 3), com cerca de 600 espécies e alta diversidade taxonômica nos trópicos (MUASYA et al., 2002). Figura 3: Classificação da Família Cyperaceae. Fonte: mobot.org Assim como em outros gêneros da família, apresenta um grande número de espécies pioneiras, responsáveis pela sucessão primária em ambientes perturbados. Apresenta alguns questionamentos taxonômicos, não existindo acordo em sua circunscrição ou classificação infragenérica. Dessa forma, é tratado como um amplo gênero com inúmeros subgêneros ou encontra-se subdividido em vários grupos segregados, sendo os mais conhecidos Kyllinga, Mariscus e Pycreus (MUASYA et al., 2002). Cyperus apresenta como característica marcante hastes geralmente sólidas e em forma triangular. As folhas são alternas, comumente em três fileiras; a base da bainha é fechada, com venação paralelinérvea e limbo pontiagudo. As flores são diminutas e 25 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... unissexuais sendo encontradas no ápice da haste, arranjadas em espiral ou disticamente nas espículas. O perianto foi reduzido a cerdas, auxiliando na dispersão das sementes que ocorre por vários meios. O androceu consiste geralmente em três estames distintos, contudo um, dois ou raramente seis podem estar presentes (LINDER & RUDALL, 2005). O gineceu é formado por um único pistilo composto de geralmente dois ou três carpelos, um único estilete comumente com dois ou três lóbulos e um ovário superior com um único lóculo contendo apenas um óvulo basal. Os frutos (aquênios) são geralmente pequenos, raramente alcançam 1,5 cm compr. (KERN, 1974). 2.3.1 Biologia e Ecologia de Cyperus Vários estudos ecológicos utilizando Cyperus como objeto de análise encontram-se disponíveis na literatura acadêmica. Leck & Schütz (2005) desenvolveram pesquisas ecológicas com as sementes de algumas espécies do referido gênero (dispersas pelo vento, água e animais), envolvendo dados sobre germinação, dispersão, respostas de dormência em relação à germinação, viabilidade, longevidade e ainda comparações entre diferentes habitats. Estes autores observaram que a interação entre todos esses traços parece ter conduzido às estratégias de baixo-risco da germinação facilitando a formação de bancos persistentes da semente. Além disso, estes estudos mostraram estratégias reprodutivas variadas dentro dos habitats, da persistência, e da habilidade de muitas espécies colonizarem habitats perturbados. Foram realizadas também outros estudos ecológicos em diversas escalas a partir da análise de bancos de sementes como no estudo supracitado, destacando-se trabalhos salientando o conhecimento da persistência e determinação da disponibilidade das sementes, a fim de selecioná-las para restauração de um habitat, bem como, a conservação de espécies (WETZEL et al., 2001). Grime (1989) e Hogenbirk & Wein (1992) afirmam ainda que os bancos de sementes sejam de utilidade para o monitoramento de habitats e de mudanças climáticas. Balzano et al. (2002) resumiram que os objetivos da recuperação ambiental podem ser gerais ou mais específicos, desta forma, o sucesso de cada intervenção apresenta possibilidades de variação. Por exemplo, considerando um empreendimento bem sucedido em Nova Jersey (USA), os pântanos tornaram-se dominados por espécies herbáceas em 92%, enquanto que as florestas úmidas apresentaram apenas 1% de ervas. Leck & Schütz (2005) consideram um interesse bastante recente e apreciável o uso de bancos de sementes de Cyperaceae e de várias outras espécies para a restauração e conservação dos habitats. 26 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Carneiro & Yrgang (1999), a partir de estudos de colonização vegetal em aterros sanitários, observaram uma variação de 67 espécies nestes aterros, sendo 61 pertencentes a 51 gêneros e 18 famílias, bem como seis indivíduos não identificados, os quais correspondiam a plântulas, principalmente representantes das famílias Poaceae ou Cyperaceae. Porém, além destas foi identificada a presença de Cyperus rotundus L., C. eragrostis Lam. e C. flavus (Vahl) Nees. corroborando com outros estudos a importância de espécies deste gênero no papel de reocupação de ambientes devastados. Estudos realizados por Stock et al. (2004) mostram que como as Poaceae (gramíneas), e Cyperaceae apresentam múltiplos padrões fotossintéticos C4, tornam-se um excelente grupo para que as hipóteses das vantagens ecológicas sobre a fotossíntese C4, derivadas em sua maior parte das Poaceae, possam ser testadas. Desta forma, contribuindo para um melhor entendimento ecológico, estes autores concluíram que a fotossíntese C4 evoluiu sob condições de solos úmidos ou encharcados, para espécies do gênero Cyperus, sendo o sucesso ecológico do grupo em territórios alagados inférteis uma consequência da eficiência elevada do uso do nitrogênio associado com o padrão C4. Dentre os vários estudos ecológicos tem se observado que Cyperus apresenta um destaque especial em relação à colonização de ambientes, especialmente aqueles que contêm um alto grau de degradação. Ball & Glucksman (1975) observaram que, dentre as plantas pioneiras e colonizadoras, as espécies de Cyperus obtiveram maior êxito na ilha de Motmot formada a partir de erupção vulcânica confirmando a vocação reflorestadora destas espécies. 2.4 O gênero Miconia L. s.l. A família Melastomataceae (Fig. 4) apresenta cerca de 4.570 espécies distribuídas pelas regiões tropicais e subtropicais de todo o globo (CLAUSING & RENNER, 2001). Cerca de um quarto destas espécies (1.056, segundo GOLDENBERG & ALMEIDA, in prep.) pertencem ao gênero Miconia caracterizando este como o maior da família, incluindo espécies que podem ser componentes do sub-bosque de florestas primárias, porém ocorrem principalmente em áreas secundárias, bordas de floresta e clareiras naturais no interior de florestas, por esta razão podendo ser consideradas como espécies pioneiras ou invasoras (SCHUPP et al.. 1989; DENSLOW et al., 1990; ELLISON et al., 1993). 27 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Figura 4: Classificação da Família Melastomataceae. Fonte: mobot.org A classificação infragenérica reconhece 11 secções para o gênero (GOLDENBERG & ALMEIDA, in prep.) estabelecidas a partir de características morfológicas relativas ao hipanto, cálice, pétalas e, principalmente, aos estames. Da forma pela qual se encontra delimitado, este gênero pode ser reconhecido principalmente pelo cálice com lacínias externas reduzidas, pétalas com ápice arredondado ou emarginado, nunca agudo e frutos bacáceos (GOLDENBERG, 2004). Em geral, as plantas desse gênero são extremamente diversas em sua arquitetura reprodutiva e vegetativa (JUDD, 1986), produzem uma grande quantidade de microsementes que são dispersas por várias espécies de pássaros frugívoros (LEVEY, 1986). Segundo Snow (1965) e Stiles & Rosselli (1983) as plântulas podem rapidamente se estabelecer em ambientes degradados. São geralmente polinizadas por abelhas que coletam o pólen disposto em anteras tubiforme, com forma variável, mas quase sempre com deiscência poricida (BUCHMANN, 1983). De acordo com Goldenberg & Varassin (2001) determinadas espécies de Miconia apresentam reprodução de frutos apomíticos (fenômeno pelo qual uma planta é capaz de produzir sementes com embriões viáveis sem que antes houvesse fusão de gametas e formação de zigoto) como Miconia latecrenata e M. petropolitana, porém, em algumas espécies a exemplo de M. pusilliflora existe um mecanismo de auto-incompatibilidade. 28 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... O gênero ocorre desde o sul do México até a Argentina. No Brasil, as espécies ocorrem em diferentes ecossistemas, desde o nível do mar, nas restingas, até as florestas altomontanas, no domínio da Floresta Atlântica, bem como em formações vegetacionais na região central do país, como os cerrados e os campos rupestres (MARTINS et al., 1996). Três espécies são abundantes em fragmentos de mata peri-urbanos na Região Metropolitana de Recife (M. minutiflora (Bonpl.) DC.; M. prasina (Sw.) DC. e M. ciliata (Rich.) DC. (ALVESARAÚJO et al., 2008) 2.4.1 Biologia e Ecologia de Miconia O gênero Miconia é constituído por espécies de grande importância ecológica em processos sucessionais (pioneiras), principalmente em fragmentos florestais de estágio secundário de regeneração, desta forma é frequentemente utilizado em estudos ecológicos de populações, a fim de uma maior contribuição para o entendimento da dinâmica populacional de espécies nativas colaborando diretamente para fins de conservação e manejo (GASTON, 1994). Em estudo realizado por Antonini & Nunes-Freitas (2004) a respeito da estrutura e distribuição espacial de duas populações de Miconia prasina, pôde ser observado um padrão agregado de distribuição entre estas que é característico de plantas com dispersão de sementes por animais ou que realizam sua dispersão por autocoria (barocoria), estando relacionado com a quantidade de sementes produzidas e a duração do período de frutificação. Este resultado permitiu aos autores concluírem que o padrão de distribuição agregado encontrado para as duas populações de M. prasina pode estar relacionado tanto à estratégia de dispersão barocórica (e à associação desta com a zoocoria), quanto com a estrutura da vegetação e, consequentemente, com a incidência de luz, das áreas estudadas. Outro aspecto relevante que influencia na dinâmica populacional de espécies de Miconia é a herbivoria. Braga e colaboradores (2007) em estudo sobre os impactos da herbivoria em indivíduos de M. prasina constataram que a intensidade luminosa, dependendo da faixa florestal em que estas espécies ocorrem, é um aspecto abiótico importante na ocorrência dos diversos tipos de herbivoria como galhas, minas e galerias sendo este um fator significativo para o hábito de herbívoros sésseis e livres. Apesar da importância ecológica das espécies de Miconia na regeneração de habitats, algumas como M. calvescens DC são consideradas invasoras. Roux e colaboradores (2008) se utilizando de marcadores de microssatélites e ISSRs (Inter Simple Sequence Repeats), realizaram um estudo com populações provenientes do Pacífico Sul e Norte, não encontrando 29 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... diferenças genéticas significativas entre estas populações, sugerindo assim a ocorrência de bottlenecks (efeito “gargalo”) devido principalmente ao pequeno tamanho das populações atrelado a um alto nível de endogenia. Porém, mesmo diante da falta de diversidade genética esta espécie obtêm um alto nível de sucesso na colonização de ambientes no Pacífico. Perez & Johnson (2007) em estudo a respeito de controle biológico desta espécie através do Hymenoptera Antomacera petroa Smith realizado também com M. calvescens no Havaí e em algumas Ilhas do Pacífico puderam concluir que este tipo de controle se mostrou eficiente não só para esta espécie, mas também em relação a mais duas espécies de Melastomataceae que se encontram na mesma condição nessas localidades. Mesmo diante da ampla ocorrência e importante característica ecológica deste gênero nos fragmentos de Floresta Atlântica no Nordeste brasileiro, inexistem investigações utilizando marcadores moleculares na avaliação da estrutura genética populacional de espécies nativas ou subespontâneas em fragmentos de mata situados em perímetro urbano. 2.5 Marcadores Moleculares As plantas são geralmente vistas como uma fonte importante de energia para a sobrevivência e a evolução do reino animal, constituindo a base da pirâmide ecológica. Nas últimas décadas seus genomas têm sido extensivamente estudados, proporcionando uma revolução nesta área. Os marcadores moleculares são fundamentais para a análise de genomas, motivo pelo qual têm-se transformado em valiosa ferramenta para tal direcionamento. Estes marcadores podem ser rotineiramente empregados em vários aspectos da análise de genomas vegetais, com desdobramentos quanto à sua taxonomia, filogenia e ecologia, dentre outros (JOSHI et al., 1999). O desenvolvimento de tecnologias de marcadores de DNA representou um grande avanço quando comparado às análises isoenzimáticas, uma vez que acessam características genéticas mais informativas do ponto de vista evolutivo, sem influência de mecanismos fisiológicos ou do meio ambiente, gerando um número quase ilimitado de polimorfismos (BENKO-ISEPPON, 2001). Portanto, marcadores bioquímicos ou moleculares vêm sendo amplamente utilizados na caracterização genética, detectando polimorfismos para alelos de um determinado gene ou de pequenos fragmentos de DNA, permitindo a distinção de indivíduos da mesma espécie, mesmo aqueles proximamente aparentados (BENKOISEPPON, 2001; BENKO-ISEPPON et al., 2003). Os marcadores moleculares ideais para genotipagem devem apresentar várias características como herança co-dominante, comportamento altamente polimórfico, alta 30 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... reprodutibilidade, acesso unambíquo a diferentes alelos, comportamento seletivamente neutro, distribuição ao longo do genoma, facilidade de acesso e fácil intercâmbio de dados entre laboratórios de pesquisa, além de baixo custo (JOSHI et al., 1999). Considerando-se que é extremamente difícil encontrar um marcador que especificamente atenda a todos os critérios citados, dependendo do estudo a ser desenvolvido, um sistema de marcadores deve ser escolhido que atenda ao maior número de critérios considerando os objetivos do estudo (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1996). Isto é bem exemplificado através de projetos de melhoramento, os quais utilizam inúmeros tipos de marcadores a fim de garantir uma caracterização genética mais eficiente do organismo em estudo. Weising e colaboradores (2005) efetuaram uma ampla revisão bibliográfica sobre marcadores do tipo Fingerprinting de DNA (Impressão Genômica do DNA), destacando o caráter discriminativo destes marcadores, face à complexidade de locos que acessam concomitantemente, prestando-se para identificar centros de origem e dispersão. Atualmente, além da correlação de marcadores realizada em projetos de melhoramento, esse tipo de análise é crescente em estudos de diversidade genética entre espécies vegetais nativas, no intuito principalmente de elucidar relações taxonômicas e gerar conhecimento da distribuição da variabilidade genética para o melhor direcionamento de esforços de conservação. Adicionalmente é bastante dificultosa a identificação de hibridização entre duas espécies vegetais principalmente quando consideradas apenas análises morfológicas; portanto, a aplicação de marcadores nesse intuito é fundamental, permitindo um maior detalhamento, em especial na formação de novas espécies por hibridização interespecífica em populações simpátricas (HEGARTY & HISCOCK, 2004). 2.5.1 Marcadores Moleculares na Análise da Diversidade em Vegetais Dada a evolução das técnicas moleculares e a precisão de sua utilização, tem sido possível ao homem acessar de forma segura e esclarecedora o genótipo e a variabilidade genética de uma boa parte das plantas. Tais investigações têm promovido um avanço no entendimento do comportamento fenotípico dos vegetais, o que propicia maior facilidade na sua manipulação tanto no sentido de auxiliar a produção de novas cultivares, no que se refere ao melhoramento, como na compreensão das tendências evolutivas (FREITAS & BERED, 2003). Alguns marcadores de DNA são amplamente utilizados em estudos genéticos de plantas, podendo-se destacar o DAF (DNA Amplification Fingerprinting; Impressão genômica do DNA amplificado) (WINTER et al., 2000), ISSR (Inter Simple Sequence 31 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Repeats; Inter seqüências únicas repetidas), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA; Polimorfismo de DNA Amplificado Aleatoriamente) (PENTEADO et al., 1996; SAWAZAKI et al., 1997; FERGUSON et al., 1998), AFLP (Amplified Fragment Length Polimorfism; Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados), RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism; Polimorfismos no Comprimento de Fragmentos de Restrição) (DEMISSIE, 1996) e SSR (Simple Sequence Repeats; Sequências Simples Repetida) (SEFC et al., 1998). Sob o ponto de vista genético, as técnicas de RFLP e SSR são mais refinadas comparativamente ao RAPD e ao DAF. Contudo, os dois últimos mencionados são os mais frequentemente utilizados por sua fácil implementação e de rápida execução, possibilitando resultados de grande validade prática (WADT, 2001). Segundo Ferreira & Grattaplaglia (1996) marcadores RFLP foram estudados pela primeira vez em um experimento destinado à detecção de mutações em DNA de vírus, tornando-se em pouco tempo uma ferramenta útil e importante em várias áreas da biologia, sendo utilizados com eficácia para aprofundar o conhecimento de diferentes temas biológicos. Este marcador é geralmente utilizado em conjunto com um traço específico, seja morfológico ou fisiológico como, por exemplo, resistência a alguma praga, apresentando capacidade de auxiliar eficientemente em programas de seleção de plantas de interesse (JOSHI et al., 1999). Ao longo dos anos RFLPs foram sendo sido aplicados em menor escala, devido ao seu custo e complexidade de aplicação, prevalecendo o uso de marcadores baseados em PCR (Polymerase Chain Reaction; Reação em Cadeia da Polimerase) como o DAF, o RAPD e o AFLP (FERREIRA & GRATTAPLAGLIA, 1996). Através de RAPD Cavallari (2004) realizou um estudo de diversidade genética abrangendo espécies do gênero Encholirium: E. biflorum (Mez) Forzza, E. pedicellatum (Mez) Rauh e E. subsecundum (Barker) Mez (Bromeliaceae), obtendo grande variabilidade interespecífica bem como entre diferentes populações destas espécies, contribuindo para taxonomia não resolvida por caracteres morfológicos, bem como para o direcionamento de manejo e conservação de espécies ameaçadas de extinção no grupo. Microssatélites ou SSRs estão entre os mais variáveis tipos de DNA repetitivo em tandem presentes em mamíferos e plantas (EDWARDS et al., 1991; VOSMAN & ARENS, 1997). Como marcadores moleculares, os SSRs combinam várias propriedades desejáveis, como elevados níveis de polimorfismo, dispersão uniforme, neutralidade seletiva, alta reprodutibilidade, codominância e acesso genotípico simples e rápido (LI et al., 2001). A associação das características dos genomas e da técnica de SSR, as sequências repetitivas se tornaram importantes ferramentas para análise genética, pois oferecem a 32 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... possibilidade de amostrar simultaneamente um grande número de locos genéticos polimórficos dispersos no genoma (FERREIRA & GRATTAPLAGLIA, 1996). Portis e colaboradores (2004) se utilizaram da aplicação combinada de AFLP e SSR com a finalidade de analisar a diversidade genética de importantes cultivares de Cynara cardunculus L. var. altilis DC. usadas para alimentação na Itália, Espanha e sul da França. Puderam observar através dos dados fornecidos pelo marcador AFLP que os cultivares da Espanha e da Itália apresentam conjuntos gênicos distintos, havendo uma substancial distinção entre os acessos que compõem estas populações. Por outro lado, através do SSR foi detectada uma variação limitada. 2.5.1.a Análise de DAF (DNA Amplification Fingerprinting; Impressão Genômica do DNA Amplificado) A metodologia de DAF foi publicada simultaneamente (no mesmo mês e ano) que a técnica de RAPD, tendo se tornado menos conhecida, por ser mais onerosa devido à proporção que é estimada para o uso de DNA e iniciadores (BENKO-ISEPPON et al., 2005). Como estratégia de exploração do genoma se utiliza oligonucleotídeos arbitrários visando sítios caracteristicamente discretos do DNA para mapeamento e várias aplicações de impressão genômica (CAETANO-ANOLLÉS & GRESSHOFF, 1996). O DAF é utilizado com primers curtos com cinco nucleotídeos, porém o tamanho deste pode apresentar uma grande variação, utilizando-se em geral de oito a 18 nucleotídeos para produzir perfis de DNA (CAETANO-ANOLLÉS & GRESSHOFF, 1996). Este produz polimorfismos altamente informativos uma vez que os oligonucleotídeos utilizados nesta técnica podem variar não só em tamanho como foi mencionado, mas também em tipo, podendo ser utilizados primers estruturados em forma de grampo (designados como hairpin primers) principalmente quando desenhados com sequências típicas de microssatélites na extremidade 3’ (CAETANO-ANOLLÉS et al., 1991; WINTER et al., 2000; BENKOISEPPON et al., 2003). A execução desta técnica apoiada na utilização de primers estruturados em forma de grampos proporciona uma extraordinária estabilidade o que assegura a aplicação deste marcador em várias categorias de DNA-molde, desde DNA plasmidial a genomas de plantas e de animais (CAETANO-ANOLLÉS & GRESSHOFF, 1996). Estes oligômeros arbitrários ainda aumentam a detecção do polimorfismo do DNA e dirigem-se à amplificação de inúmeras moléculas do molde, gerando desse modo "assinaturas de sequências" a partir de plasmídeos, YACs (Yeast Artificial Chromosomes; Cromossomos Artificiais de Levedura), 33 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... DNA clonado e PCR (CAETANO-ANOLLÉS & GRESSHOFF, 1996). Devido às características que são particulares a este marcador, tem-se proposto seu uso associado a géis de poliacrilamida corados com prata, de modo a facilitar a visualização do grande número de bandas geradas (BENKO-ISEPPON et al., 2005). 2.5.1.b. Análise de ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat; Inter Seqüências Únicas Repetidas) Microssatélites ou repetições únicas de sequência (SSR) são ubíquos em genomas eucarióticos. Os marcadores SSR foram desenvolvidos para um bom número de espécies; contudo, existe um grande gargalo no desenvolvimento desses marcadores devido à necessidade de conhecimento das sequências flanqueadoras para se desenhar primers ancorados na região 5’ do DNA molde usado na PCR. Já para o desenvolvimento do fingerprinting por ISSR não é necessário o conhecimento prévio de sequências de DNA, sendo os primers baseados em sequências repetitivas como (CA)n ou degenerados na posição 3’ (GODWIN et al., 1997). Ao contrário do RAPD, os ISSR são detectados se utilizando de primers semiarbitrários relativamente longos para amplificação de sequências de DNA entre dois SSRs invertidos sob elevadas condições de estringência, assim, sendo considerados como marcadores reproduzíveis e altamente polimórficos. Desta forma, os amplicons provenientes da PCR baseada em ISSR são correspondentes a regiões entre SSRs resultando em um sistema de marcador multilocus útil para fingerprinting de DNA, análise de diversidade e mapeamento genômico (BORNET & BRANCHARD, 2001). Bornet & Branchard (2001) reportaram que a técnica de ISSR é estável através de uma escala larga de parâmetros do PCR, revelando polimorfismos abundantes entre sete espécies de dicotiledôneas testadas com dois primers tri-nucletídeos e dois tetra-nucleotideos, concluindo-se que os marcadores do tipo ISSR são uma boa escolha para o fingerprinting de DNA. Para examinar a estrutura genética de populações, o ISSR vem sendo amplamente aplicado principalmente para plantas com reprodução vegetativa (clones) uma vez que os marcadores tradicionais (ex. variação morfológica) são limitados na distinção de indivíduos similares; portanto, tais marcadores tem se mostrado eficientes na detecção da distribuição dos genótipos de populações clonais (KELLER, 2000). Este tipo de aplicação pode ser exemplificado por Li et al. (2006), os quais se utilizaram de marcadores ISSR e RAPD no estudo da estrutura genética de seis populações clonais de plantas aquáticas invasivas (Eichhornia crassipes (Mart.) Solms, Pontederiaceae) estabelecidas no Sudeste da China, 34 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... observando uma diversidade genética inter e intrapopulacional extremamente baixa para os dois marcadores, indicando que todas as populações originaram-se de um mesmo genótipo. Os autores propuseram que a rápida expansão desta espécie na China deve ter ocorrido devido à sua grande capacidade de adaptação, e não à sua diversidade genética. De uma maneira geral os marcadores ISSR tem sido muito aplicados para estudos de diversidade genética, como o realizado por Okun e colaboradores (2008) na avaliação de bancos de sementes de eucalipto (Eucalyptus grandis Hill.). A partir deste estudo os autores observaram uma significativa diversidade genética entre os bancos de sementes (Gst = 0,264), tendo tal variabilidade sido atribuída a associações ecológicas e geográficas, bem como aos baixos índices de fluxo gênico. 2.6 Análises Genéticas em Populações Vegetais A fragmentação de habitats causada por ações humanas reduziu o tamanho das populações de muitas espécies vegetais, aumentando seu isolamento espacial. Pequenos tamanhos populacionais juntamente com o aumento do isolamento geográfico podem levar à erosão genética e a um aumento da divergência genética entre as populações através da deriva genética e nos níveis de cruzamento entre indivíduos aparentados, levando a redução dos níveis de fluxo gênico, quebra do processo de polinização e elevação da probabilidade de extinção local de populações dentro de uma metapopulação (KOLB, 2005). A erosão genética devido aos efeitos da fragmentação ambiental pode ser uma preocupação imediata se as mudanças genéticas influenciarem diretamente na adaptação dos indivíduos e na viabilidade em curto prazo das populações remanescentes (FRANKHAM, 2005). Desta forma, genética de populações, filogeografia e metodologias filogenéticas, vêm progressivamente sendo utilizadas para reconstrução de padrões e processos que levaram à distribuição da diversidade genética presentemente observada nas espécies e ainda para geração de informações no campo de fatores que induziram esta distribuição (CATERINO & CHATZIMANOLIS, 2008). A estrutura genética de uma espécie vegetal pode ser definida como a distribuição da variabilidade genética inter e intrapopulacional. Portanto, esta estrutura resulta da combinação entre mutação, migração, seleção e deriva genética, as quais definem a distribuição da variabilidade genética nas populações. Em populações naturais, a distribuição da variabilidade genética é influenciada pelo seu tamanho, distribuição geográfica, polinizações e fluxo gênico, além de ser estruturada no tempo e no espaço (HAMRICK, 1982). 35 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... A caracterização de populações de espécies vegetais depende de uma investigação acurada da diversidade genética. A distribuição dessa variação dentro e entre populações pode ser estimada pelas estatísticas F de Wright ou Gst de Nei a fim de apontar questões com respeito às relações genéticas entre indivíduos e níveis de variação da estrutura genética populacional, contribuindo para o melhor entendimento da dinâmica das populações (RENAU-MORATA et al., 2005). No entanto, a escala na qual a estrutura genética é considerada torna-se importante, pois diferentes padrões podem ser obtidos dependendo da importância relativa dos fatores que afetam a estrutura genética em determinada escala espacial. Modelos de autocorrelação espacial também podem ser usados para avaliar a estrutura genética de populações (SLATKIN, 1985; EPPERSON, 1995). Neste contexto, são utilizados importantes parâmetros para quantificar a variação genética populacional como as proporções de locos polimórficos dentro de espécies (Pe) e dentro de populações (Pp) e a diversidade geral de uma dada espécie (He) e das respectivas populações (Hp) (HAMRICK, 1994). Estudos de diversidade genética nas populações exigem o estabelecimento de limites geográficos a fim de permitir uma avaliação da qualidade genética das populações no que diz respeito, principalmente, aos fragmentos de mata. Como referencial teórico para estas avaliações, geralmente incluem-se a deriva genética e a endogamia – face aos efeitos genéticos da fragmentação – para a discussão do problema genético de populações pequenas (KAGEYAMA & GANDARA, 1998). O fluxo gênico ou a dispersão de pólen e sementes entre populações estabelecidas reduzem a diversidade genética entre elas, figurando entre os mecanismos responsáveis pela introdução de novas variações genéticas na população receptora. A taxa de fluxo gênico pode ser medida em termos de número equivalente de migrantes (Nm) que se movem de uma população à outra (WADT, 2001). Vários são os métodos utilizados para detectar a distribuição espacial da variabilidade e conectividade genética em populações. Marcadores de DNA têm uma ampla aplicação em análises de variação genética e medição de fluxo gênico em nível específico, particularmente em investigações de diferenciação e estrutura genética populacional, incluindo estimação de estatísticas F de Writgh, variação genética em espécies sem nenhum conhecimento genético prévio através de marcadores do tipo fingerprinting de DNA como o DAF (DNA Amplification Fingerprinting) - caso da maioria das espécies neotropicais - e também dentro de populações (NYBOM & BARTISH, 2000). Através da aplicação do marcador de microssatélite SSR (Simple Sequence Repeat) Markwith & Scanlon (2007) analisaram em múltipla escala a diversidade e estrutura genética 36 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... (Gst e Fst) além do fluxo gênico (Nm) entre populações de Hymenocallis coronária (LeConte) Kunth (Amaryllidaceae), podendo observar que a divergência genética entre as 10 populações da espécie supracitada era relativamente baixa. O maior valor de Gst entre duas das populações foi 0,0960, as quais distavam 55,6 km entre si. Adicionalmente, a estimativa de fluxo gênico (M) apontou para um índice baixo quando comparado com outros dados de populações de espécies próximas indicando que as populações amostradas de H. coronária ainda estão em equilíbrio gênico, sugerindo-se que quanto maior a distância entre as populações estudadas maiores seriam as chances da perda deste equilíbrio. Marcadores do tipo RAPD foram usados, por exemplo, para detectar as variações existentes entre indivíduos e populações de duas espécies leguminosas arbóreas nativas da América Central e do México (Gliricidia sepium (Jacq.) Walp. e G. maculata (Kunth) Kunth ex Walp.), parcialmente influenciadas pelo homem em vista de seu extrativismo e cultivo para extração de madeira (WEISING et al., 1995). Os resultados evidenciaram populações altamente monomórficas para todos os iniciadores (primers) avaliados na região de cultivoextrativismo, enquanto as populações naturais apresentavam altos níveis de polimorfismo, confirmando avaliações morfológicas e estudos morfométricos previamente realizados. Aparentemente a área que sofreu influência antrópica foi selecionada unidirecionalmente, decorrendo em um decréscimo da diversidade. Agelone e colaboradores (2007) a partir da aplicação de uma combinação de marcadores ISSR e cpDNA investigaram a dinâmica populacional regional de acordo com a estrutura da diversidade genética local de Sorbus torminali L. ,concluindo que novas populações desta espécie seriam fundadas a partir de amostras aleatórias de sementes originando novas populações em uma ampla área geográfica. No intuito de testar a resolução de marcadores moleculares para determinação da diversidade genética de populações clones de Posidonia oceânica L. Arnaud-Haond e colaboradores (2005) geraram marcadores do tipo SSR (di e trinucleotídeos), obtendo dados contrastantes com aqueles obtidos anteriormente através de RAPD e isoenzimas. Os autores observaram que as populações estudadas em sua maioria apresentaram baixos níveis de Gst como sugerido por estudos através de RAPD e isoenzimas, porém, de acordo com variações nos marcadores como no caso da aplicação de dinucleotídeos de SSR foi obtido resultados de maior divergência genética em relação às outras técnicas. 37 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... 2.7 Análise de Diversidade Genética e Parentesco em Plantas As plantas demonstram uma surpreendente diversidade morfológica, adaptativa e ecológica, produto de milhões de anos de divergência e diversificação de linhagens (SCHAAL et al., 1998). Desta forma, um dos maiores desafios para a biologia da conservação tem sido fornecer planejamento de conservação com prioridades de esforços (MYERS et al., 2000). Muitas atenções estão sendo focadas em hotspots de biodiversidade. Contudo, a conservação dos processos evolutivos vem sendo também reconhecida como prioridade em face das mudanças climáticas globais (MACE et al., 2003). A diversidade filogenética é o índice da biodiversidade que mensura o tamanho dos caminhos evolutivos que conectam os táxons (VANE-WRIGHT et al., 1991; FAITH, 1992). Portanto, a diversidade genética identifica grupos de táxons que maximizam a acumulação de características de diversidade, concluindo-se que a riqueza de táxons é um bom hospedeiro para a diversidade filogenética (TORRES & DINIZ, 2004, BROOKS et al., 2006). Para inferências de diversidade e parentesco em plantas diversos tipos de marcadores genéticos e citológicos vêm sendo utilizados. Pode-se evidenciar o estudo de Forest e colaboradores (2007) de construção filogenética realizado com 735 espécies representantes de angiospermas se utilizando de sequências de DNA plastidial rbcL, no qual concluíram que a proteção da diversidade filogenética é a melhor estratégia para preservação da diversidade, principalmente nas floras Sul Americanas Assim, a aplicação de estudos de diversidade filogenética é de grande utilidade para a identificação de regiões ambientais chave para futuras opções, tanto para a continuidade da evolução da vida sobre a Terra como em benefício da sociedade (FOREST et al., 2007). As florestas tropicais são admiradas, em todo mundo, principalmente por sua biodiversidade, caracterizando-se por uma grande heterogeneidade no modo de ocorrência de suas espécies e pela sua diversidade genética. Em decorrência destas características a diversidade genética existente em populações naturais deve ser quantificada e analisada quanto à sua localização geográfica inter e intrapopulacional, uma vez que sua distribuição apresenta grande variação por ser influenciada pelo tamanho efetivo populacional, ocorrência geográfica das espécies, modo de reprodução e sistema de cruzamento, pelos mecanismos de dispersão de sementes e até mesmo pelo estágio de sucessão ecológica da espécie em questão (RIBAS, 2003). Para o estudo da diversidade e parentesco genético de uma determinada espécie também são bastante aplicados marcadores moleculares como DAF e AFLP, muito úteis quando não existe nenhum conhecimento genético prévio da espécie a ser estudada como é o 38 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... caso da maioria das espécies neotropicais (GUSON, 2003). A redução de vários ecossistemas, determinada pelos processos degenerativos resultantes da desordenada atividade humana tem causado perdas inestimáveis de importantes repositórios de diversidade biológica (GUSON, 2003). Desta maneira, os estudos de diversidade e relação entre as diversas espécies são fundamentais, no intuito de desenhar uma atividade de utilização sustentável dos ambientes naturais. A análise de Fingerprinting de DNA pode esclarecer alguns aspectos da diversidade genética e da origem das plantas ocorrentes em alguns ambientes. Um exemplo clássico encontra-se na espécie Microseris pygmaea D. Don, a qual ocorreria subspontaneamente no Chile, havendo a hipótese de que sua introdução tenha se dado a partir de uma única semente trazida da América do Norte. Enquanto isoenzimas revelaram apenas baixos níveis de variabilidade, hibridização pós-restrição do DNA com o microssatélite GATA resultou em Fingerprint altamente polimórfico, contrariando a hipótese anterior (WEISING et al., 1995). Sawazaki e colaboradores (1998) concentraram estudos mediante polimorfismo enzimático em gel de poliacrilamida e polimorfismo de DNA com base em marcadores RAPD, a fim de caracterizar a variabilidade genética em algumas espécies e ecótipos de palmeiras dos gêneros Euterpe Mart., Bactris Kunth., Elaeis Jacq. e Syagrus Mart. O estudo de diversidade de vegetais também vem sendo muito destacado em programas de melhoramento uma vez que há a necessidade de identificação de diversas variáveis de cultivares depositadas em bancos genéticos. Estes programas se atêm comumente às características morfológicas, fisiológicas e genéticas, a fim de selecionar exemplares mais viáveis. Como exemplo deste tipo de estudo pode ser citado o melhoramento do eucalipto. De acordo com Bernardes (2006) esta cultura apresenta diversas características morfológicas de interesse, fazendo-se necessária a utilização de marcadores morfológicos (por exemplo, espessamento do caule) atrelados a genéticos (como genes relacionados à produção da celulose) para uma caracterização mais adequada da diversidade desta cultura. Para o nordeste brasileiro ainda há poucas espécies analisadas do ponto de vista de diversidade genética com metodologias de Fingerprinting de DNA. Destaca-se um estudo preliminar com a metodologia de DAF (DNA Amplification Fingerprinting, ou Impressão Genômica da Amplificação do DNA) em cultivares selvagens e domesticados de feijão Vigna, incluindo o feijão de corda (V. unguiculata (L.) Walp.), supostamente introduzido da África e domesticado em várias regiões pelo sertanejo nordestino. O estudo em questão revelou uma variabilidade acima da esperada para o nível intra-específico, provavelmente devido à pressão de seleção exercida pelo pequeno produtor, associada às condições extremas do ambiente (SIMON, 2007). 39 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... 2.7.1 Em Cyperaceae Em Cyperaceae caracteres morfológicos (ex. anatomia foliar, inflorescência), o comportamento fotossintético e aspectos ultraestruturais não apresentam resolução suficiente para esclarecimento das relações filogenéticas (SIMPSON et al., 2003), levando à realização de estudos de caráter genético abrangendo tanto regiões codificantes como não expressas. Por exemplo, Yano e colaboradores (2004) analisaram a filogenia molecular no gênero Eleocharis R. Br. Baseando-se em sequências de ITS (Nuclear Ribosomal Internal Transcribed Spacer; Espaçador Transcrito Interno de Ribossomo Nuclear) e evolução cromossômica. Considerando que as relações infragenéricas pouco entendidas da tribo Schoenoid, Verboom (2006) realizou estudo de filogenia molecular através de sequências de DNA plastidial e comparou os dados obtidos com dados da literatura, observando que existem evidências de radiação adaptativa no passado, provavelmente em decorrência da separação dos continentes que compunham Gondwana, suposição apoiada pelo fato de existirem muitas linhagens dessa tribo com espécies africanas e não africanas. Adicionalmente, o autor destaca que o gênero Schoenoid é endêmico da África enquanto os gêneros Tetraria e Costularia são polifiléticos. Entre os táxons de Cyperaceae com grande complexidade taxonômica o gênero Cyperus destaca-se, não havendo um consenso geral e abrangente quanto à sua classificação infragenérica, tratando-se de um dos poucos que apresentam tanto espécies C3 como C4 (SIMPSON et al., 2003). Portanto, existem diversos estudos abrangendo espécies deste gênero a fim de auxiliar no entendimento da diversidade e principalmente do parentesco entre as espécies que o compõem. Muasya e colaboradores (2002) analisaram as relações filogenéticas em Cyperus utilizando sequências de cpDNA, destacando que a classificação de Cyperus s. str. nos subgêneros Cyperus e Anosporum (baseada na presença da anatomia Kranz; isto é, Clorociperoide versus Eucyperoide) seria apoiada pelos dados de sequenciamento de DNA. Contudo, muitos dos gêneros em Cyperaceae, reconhecidos por uma ou poucas autapomorfias morfológicas são acomodados dentro de Cyperus s.l. e Cyperus s.str. Outros trabalhos podem ser destacados na família Cyperaceae como os estudos realizados por Roalson & Friar (2004), que mostraram as relações filogenéticas existentes entre os gêneros Carex e Acrocystis através das semelhanças entre a família do gene nuclear da desidrogenase do álcool (Adh), combinando ainda análises de sequências de ITS e EST (Expressed Sequence Tags; Etiqueta de Sequência Expressa) de ribossomo nuclear. 40 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... 3. Referências Bibliográficas ALMEIDA, D. R.; COGLIATTI-CARVALHO, L.; ROCHA, C. F. D. As bromeliáceas da Mata Atlântica da Ilha Grande, RJ: composição e diversidade de espécies em três ambientes diferentes. Bromélia, v. 5, n.1, p. 54-65, 1998. ANGELONE, S.; HILFIKER, K.; HOLDEREGGER, R.; BERGAMINI, A.; HOEBEE, S. E. Regional population dynamics define the local genetic structure in Sorbus torminalis. Molecular Ecology, v. 16, p. 1291-1301, 2007. 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(2) Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Botânica, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50732-970, Recife – PE. (3) Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Zoologia, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50732-970, Recife- PE. Autor para Correspondência: Benko-Iseppon, A.M. E-mail: [email protected] Resumo Um importante aspecto contemporâneo é a preocupação com a situação ambiental, aspecto fundamental para a qualidade de vida das pessoas, onde a presença de coberturas vegetais urbanas e periurbanas implicam na melhoria de fatores para o bem estar da população. Neste contexto, a família Cyperaceae apresenta grande valor por incluir espécies pioneiras, importantes regeneradores destas coberturas florestais. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar a diversidade genética e fluxo gênico entre duas populações de Cyperus ligularis e C. odoratus coletados em uma Reserva de Floresta Atlântica em Recife (PE), mediante o uso do DAF. Foram geradas 172 bandas polimórficas a partir das quais foi obtido um fenograma e calculados valores de Gst e Nm. O fenograma demonstrou separação genética entre as espécies e adicionalmente, estas apresentaram diversidade genética significativa (Gst=0,3632), porém baixo fluxo gênico médio (Nm=0,8766). Embora todos os indivíduos de C. odoratus tenham sido coletados em plots próximos e apenas em área de preservação ambiental (Reserva de Dois Irmãos, Recife, PE), observou-se maior variabilidade entre estes que entre os indivíduos de C. ligularis que apresentam maior índice de reprodução vegetativa sendo encontrados em outras áreas e agruparam-se aleatoriamente sugerindo a formação de uma metapopulação. Estes resultados sugerem a existência de maior variação intraespecífica e intrapopulacional para esta espécie. Porém, a menor variabilidade em C. ligularis sugere a influência de efeito fundador na capacidade de ocupar várias áreas urbanas, limitada a uma combinação específica de fatores genéticos, a despeito da diversidade de locais e áreas amostrados. A associação destes dados com observações de campo e de biologia reprodutiva devem enriquecer o entendimento da dinâmica das populações analisadas e do papel destas plantas nos processos sucessionais. Palavras-chave: Bioindicadores, DAF, Estrutura genética, Gst, Nm, Efeito fundador. 52 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Introdução As florestas tropicais como a Floresta Atlântica vêm sofrendo paulatinamente uma redução de suas áreas por meio de desmatamentos, explorações de recursos minerais, implantação de projetos agropecuários e queimadas criminosas (Silva e Andrade, 2005). Neste quadro, os fragmentos florestais de diversos tamanhos e formas, assumem fundamental importância para a perenidade da Floresta Atlântica (Zaú, 1998). A exploração modifica severamente a estrutura do habitat atuando diretamente no padrão de distribuição espacial e fenológico das espécies nativas, já que diferentes fatores do ambiente – como incidência de luz, umidade e disponibilidade de nutrientes – também serão afetados (Costa, 2003). Portanto, a alteração de ambientes naturais pode permitir a colonização por novas espécies, principalmente aquelas que possuam resistência a condições ambientais mais extremas, o que inclui algumas espécies pioneiras, colaborando para processos de regeneração da cobertura vegetação (Tabarelli e Mantovani, 1999). A família Cyperaceae é a terceira maior família de monocotiledôneas, constando de 104 gêneros e 5.000 espécies, perdendo apenas para as Orchidaceae e Poaceae (Goetghebeur, 1998). Esta apresenta grande importância na conservação de ambientes por incluir espécies pioneiras, bem como algumas dominantes em muitos ecossistemas, por conseguinte, indicadoras de ambientes deteriorados (Simpson et al., 2003). Adicionalmente, Cyperaceae é uma família diferenciada, uma vez que seus caracteres morfológicos (ex. anatomia foliar, inflorescência), atrelados a vias fotossintéticas e aspectos ultraestruturais são frequentemente difíceis de interpretar nos termos da homologia (Simpson et al., 2003). Por conseguinte, são realizados vários estudos de diversidade genética em populações abrangendo tanto regiões de DNA expressas como não expressas, sendo para isto, utilizados marcadores moleculares a fim de auxiliar no entendimento da diversidade e relações de parentesco entre as espécies que compõe a família supracitada. Em virtude do crescimento urbano desordenado, a paisagem natural cedeu espaço a uma paisagem antrópica com áreas degradadas e também remanescentes da vegetação nativa em perímetro urbano (Saunders et al., 1991). É fundamental a preservação destas coberturas vegetais urbanas e periurbanas, pois colaboram em vários aspectos para maior qualidade de vida da população, proporcionando, por exemplo, maior equilíbrio climático além de benefícios de âmbito social (Benko-Iseppon et al., 2007). Diante deste panorama, considerando-se a importância apresentada por tais vegetações e as condições de degradação às quais estas se encontram submetidas, no intuito de minimizar os efeitos da fragmentação causada pela ação antrópica nos centros urbanos torna-se essencial 53 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... o entendimento das conseqüências da fragmentação de habitats. Pequenas populações juntamente com o aumento do isolamento geográfico podem levar à erosão genética e aumento da divergência genética entre as populações através da deriva genética, aumento nos níveis de cruzamentos entre indivíduos aparentados, redução dos níveis de fluxo gênico, quebra do processo de polinização e elevação da probabilidade de extinção local de populações dentro de uma metapopulação (Kolb, 2005). Desta forma, a genética de populações, a filogeografia e metodologias filogenéticas estão progressivamente sendo utilizadas para reconstrução de padrões e processos que levaram à distribuição da diversidade genética presentemente observada, bem como para geração de informações no campo de fatores que colaboraram para esta distribuição (Caterino e Chatzimanolis, 2008). O presente estudo visou analisar molecularmente a diversidade genética (Gst) e fluxo gênico (Nm) entre populações das espécies pioneiras e bioindicadoras C. ligulares L. e C. odoratus L. (Cyperaceae) ocorrentes em um fragmento de Floresta Atlântica e em seus arredores em Recife (PE, Brasil), no intuito de investigar a estrutura e conectividade genética destas populações. Material e Métodos Coleta de Material Biológico Foram coletados tecidos (folhas jovens) de 40 indivíduos das espécies C. odoratus (20) e C. ligularis (20) (Tabela 1) com uma distância mínima de três metros entre estes a partir da determinação de uma área de estudo (Figura 1) abrangendo diferentes populações (Açude da Prata, Reserva Ecológica de Dois Irmãos - APR, Distrito de Apipucos – API, Ilha do Bananal - ILB, Fábrica da Macaxeira - FMX e Estrada dos Passarinhos – EPS) em espaços livres bem como em um fragmento urbano de Floresta Atlântica no período de setembro de 2007 a julho de 2008. As amostras foram mantidas a -80°C no Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal (LGBV) da Universidade Federal de Pernambuco, até seu processamento. Dados Moleculares Extração de DNA O isolamento do DNA nuclear usando protocolo CTAB - Maxi-Prep seguiu o descrito por Weising et al. (2005) com modificações na utilização proporção de tecido foliar que foi 54 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... reduzido de 5 g para 2 g em relação ao tampão de extração (12 mL), bem como no que diz respeito ao processo de lavagem do material, onde este foi lavado apenas por uma vez com álcool isoamílico e clorofórmio ao invés de duas vezes como descrito no referido protocolo. Para a quantificação do DNA extraído foi utilizado método comparativo em gel de agarose 1,2% usando-se diferentes concentrações de λ-DNA (200, 100, 50 e 20 ng/µL) como referencial. A purificação do RNA foi feita a partir de 0,25 µL/mL de RNAse a 10 mM/µL com incubação overnight, à temperatura ambiente ou ainda a 37 ºC por 2h. Geração de Dados Moleculares Para análise de Fingerprinting de DNA genômico foi empregado o marcador DAF (DNA amplification fingerprinting) utilizando-se de primers de sequências aleatórias seguindo o descrito por Caetano-Anollés et al. (1991), com modificações introduzidas por Winter et al. (2000) e Benko-Iseppon et al. (2003). Assim, o emprego da técnica consistiu na utilização de 0,5 ng/µL de DNA molde, 1,5 µL 10x PCR buffer, 2,5 mM de MgCl2, 10 mM de dNTP-mix (Fermentas), 20 µM de ‘primer’ decâmeros e 15 meros e 1,0 U de ‘Taq DNA polimerase’ (Fermentas), com o volume final de 15 µL. As reações de amplificação ocorreram em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradiente, com 2 min de desnaturação inicial a 95°C, seguidas de 40 ciclos compostos de três etapas: desnaturação de 15 seg a 95°C; pareamento de 1 min a 35°C e alongamento final de 2 min a 72°C. Ao final dos 40 ciclos a reação foi completada com um alongamento final de 2 min a 72°C. Os produtos amplificados foram separados eletroforeticamente em gel de agarose (1,8%), corados com brometo de etídio (1,5 µL/100 mL de gel), visualizados sob luz ultravioleta e fotografados com câmera digital Sony Cybershot W5 (zoom óptico 3.0 Megapixel). Seleção de primers A seleção de oligonucleotídeos foi realizada a partir de um conjunto de 50 primers (Tabela 2), através de um experimento de PCR/DAF se utilizando de um total de quatro amostras, sendo duas de cada espécie (C. odoratus: amostras 1 e 2, População AP e C. ligularis: amostra 5, População IB e amostra 27*, População API). A partir dos resultados obtidos deste experimento foram selecionados os dez primers mais informativos em relação ao número total de bandas bem com de loci. 55 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Aplicação dos primers selecionados A partir da seleção de primers foram escolhidos dez iniciadores informativos para a aplicação no experimento geral através do marcador DAF. O experimento foi composto de 20 amostras de cada espécie ocorrentes na área delimitada para o estudo seguindo o mesmo protocolo descrito no item geração de dados moleculares. Todos os dados obtidos através deste experimento foram compilados na forma de polimorfismo intra e interespecíficos e intra e interpopulacionais (Tabela 3). Análise de Polimorfismo A partir de análises dos loci obtidos os dados foram agrupados para dois tipos de análises. Na primeira, foi constituída uma matriz binária onde A representa presença e C ausência de bandas para cada loco analisado. Esta matriz foi submetida ao método de Neighbor Joining - NJ (Saitou e Nei, 1987) através do programa MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007) (Molecular Evolucionary Genetics Analysis) baseado no método p-distance com Bootstrap de 1.000 repetições, no qual foi gerado um agrupamento fenético entre os 40 indivíduos das duas espécies estudadas. Para a segunda análise foi confeccionada outra matriz binária de presença (1) e ausência (0) no intuito de investigações de diversidade genética (Gst) e fluxo gênico (Nm) entre as duas populações estudadas, uma de cada espécie. Para isto, a matriz foi analisada através do software Popgene 3.2 (Yeh et al., 2001) onde os cálculos estatísticos foram realizados com parâmetro de 1.000 simulações. Resultados No experimento inicial (seleção) foram utilizados 50 primers e obtidas 919 bandas, das quais 500 foram polimórficas (ca. 55%) distribuídas em percentuais distintos de polimorfimos intra e interespecíficos e intrapopulacionais. A espécie que mais contribuiu com a geração das bandas polimórficas foi C. ligularis com um total de 574 bandas, em especial a amostra Cyp 002 IB com 252 ~ 27,5 % (Tabela 2). Ainda através da seleção, foi observada uma variação de pesos moleculares dos diferentes loci desde 120 a 1200 pb. No que diz respeito aos fragmentos polimórficos se observou desde iniciadores que produziram apenas bandas monomórficas (R260-10 e OPI-16) a um primer (15-mero) com até 15 fragmentos polimórficos (15_1). A partir da aplicação dos primers mais informativos na amostragem total foi observado inicialmente reprodutibilidade dos dados quando comparado com o gerado na seleção de 56 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... primers. Este experimento gerou 2.190 bandas onde o primer 15_12 foi o maior contribuinte para este total com 332 bandas (15,15%), enquanto o primer 15_8 apresentou o menor número de polimorfismos com 108 bandas (4,93%). Já a média de bandas por primer foi de 219. Este experimento gerou um total de 172 locos, variando em peso molecular de 110 a 1200 pb, sendo o polimorfismo distribuído em 198 bandas em nível intraespecífico, 165 interespecífico, 353 intrapopulacional e 74 interpopulacional. Cyperus odoratus destacou-se em relação ao polimorfismo intraespecífico, contribuindo com 124 bandas das 198 geradas além do alto índice de bandas polimórficas em nível intrapopulacional e no âmbito total (Tabela 3). De acordo com a análise dos locos foi obtido pelo método NJ um fenograma de similaridade genética entre os indivíduos e populações de C. odoratus e C. ligularis (Figura 2). Os genótipos avaliados no fenograma se organizaram em dois grandes grupos (Figura 2, G1 e G2), enfatizando total separação genética entre C. odoratus e C. ligularis, sendo sustentada por 165 marcas polimórficas interespecíficas. Adicionalmente, este agrupamento é destacado pela formação de cinco ramos (Figura 2, C-I, CII, CIII, CIV e CV) com diferentes níveis de similaridade genética variando de 100 a 83% e também cinco subclados (Figura 2, SC-A, SC-B, SC-C, SC-D e SC-E). Embora as espécies desta análise apresentem reprodução vegetativa intensa e a coleta das amostras de C. odoratus tenha sido realizada apenas nos arredores de dois açudes próximos a Reserva de Dois Irmãos, observou-se no fenograma maior variabilidade de ramos entre os indivíduos desta espécie do que entre aqueles de C. ligularis. Esta última é mais abundante em áreas fortemente degradadas e com até 3 km de distancia entre as populações amostradas. Adicionalmente às observações de similaridade genética, análises de diversidade genética (Gst) e fluxo gênico (Nm) foram realizadas entre as duas populações (C. odoratus e C. ligularis), onde estes dados (Gst=0,3632; Nm=0,8766) separando as duas espécies totalmente, tal como observado no agrupamento de similaridade genética. Discussão Para inferências de diversidade genética e parentesco em vegetais, diversos tipos de marcadores genéticos e citológicos vêm sendo utilizados. Os marcadores constituídos por primers de sequências arbitrárias como DAF (DNA Amplification Fingerprinting; Impressão genômica do DNA amplificado) e RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA; Polimorfismo de DNA Amplificado Aleatoriamente), são importantes, pois fornecem dados informativos quando não existe nenhum conhecimento genético prévio da espécie a ser 57 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... estudada. Este é o caso das espécies aqui analisadas, onde as sequências de DNA são desconhecidas. Adicionalmente, a determinação da utilização do marcador DAF no presente estudo foi baseada na sua reprodutibilidade, geração de um grande número de polimorfismos e ser de fácil aplicação. Esta afirmação foi corroborada por Winter et al. (2000) e BenkoIseppon et al. (2001) em acessos de grão-de-bico (Cicer arietinum L.), uma cultura com estreita base genética. Nos estudos de mapeamento genético desta cultura, os autores observaram distorções nos padrões de segregação usando marcadores RAPD, o que não aconteceu com os polimorfismos gerados por DAF ou com outros tipos de marcadores usados. Além deste estudo, foi atestado um alto grau de reprodutibilidade para o DAF através da comparação entre os experimentos de seleção e aplicação de primers do presente estudo além de análises de caracterização molecular de espécies pertencentes à família Araceae, onde as amplificações foram testadas pelo menos duas vezes e comparadas com um DNA padrão (Correia-da-Silva, dados não publicados do nosso grupo), sendo assim contribuindo na justificativa do uso deste marcador. Um aspecto relevante é a consistência da estimativa da diversidade genética de um organismo, onde o número de primers a ser utilizado na análise é um fator que deve ser considerado. Porém, o número de locos obtido parece se constituir em um critério mais importante do que propriamente o número de primers utilizado (Telles, 2001; Hollingsworth e Ennos, 2004). De acordo com Telles (2001), são necessários no mínimo 60 loci para uma estimativa consistente da variação genética, uma vez que a partir desta quantidade são observadas reduções significativas nos desvios-padrão e, conseqüentemente, nos coeficientes de variação. Este estudo foi realizado com um total de seis primers. Segundo Hollingsworth e Ennos (2004), o uso de no mínimo 50 loci para marcadores RAPD revela alta consistência no que se refere à recuperação de topologias não resolvidas, apresentando altos índices de diferenciação populacional (ex. FST _ 0,15). Assim, pode se observar através dos parâmetros supracitados, que a consistência das análises de diversidade genética aumenta juntamente com um maior número de loci e bandas no geral obtidos. Em relação aos parâmetros de consistência de diversidade genética mencionados nos estudos acima o presente trabalho encontra-se de acordo uma vez que, foi observada 172 loci (marcadores) a partir da aplicação de 10 primers (Tabela 3, Anexo I). Considerando a análise dos 172 loci, foi constituído um fenograma de similaridade genética entre os 40 indivíduos de C. odoratus e C. ligularis. Através da análise deste fenograma foi observada total distinção entre estas espécies (G1 e G2; Fig. 2), sustentada por 165 marcas polimórficas interespecíficas (Tabela 3). Estes resultados contrastam com os dados de Luceño et al. (1997) uma vez que, estes autores sugerem a ocorrência de 58 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... hibridização entre táxons simpátricos da família Cyperaceae incluindo os aqui analisados que apresentaram espículas articuladas e de alta variabilidade populacional. Adicionalmente, os dados aqui observados também diferem de resultados prévios ainda não publicados por o nosso grupo em estudo sobre diversidade genética das espécies C. odoratus e C. ligularis através do marcador DAF em um total de 26 indivíduos (4 C. odoratus e 22 C. ligularis), onde nesta análise foi observada a possibilidade de hibridização entre estas espécies, pois um dos quatro indivíduos de C. odoratus foi agrupado juntamente com indivíduos de C. ligularis. Porém, análises de anatomia foliar interna entre populações de C. odoratus e C. ligularis realizados por Martins e Alves (2009), apontam para total separação destas espécies, assim como foi observado no fenograma de similaridade genética gerado neste trabalho. Os indivíduos da espécie C. odoratus mesmo ocorrendo apenas restritamente nos arredores do Açude do Prata, apresentaram maior variabilidade de ramos observada no fenograma (CII, CIII e CIV, Figura 2) em relação aos de C. ligularis que são de ocorrência ampla (CV, Figura 4), bem como em relação aos polimorfismos intraespecíficos (124 e 74 bandas respectivamente, Tabela 3). Um importante aspecto é que geralmente em estudos demográficos sobre populações de plantas clonais, (como no caso das espécies C. odoratus e C. ligularis), a despeito do fato destas apresentarem regulação no processo de florescimento e na produção de sementes, é possível a ocorrência de diminuição da variabilidade genética ao longo do tempo nestas populações (Ericksson, 1989) assim, de acordo com os índices de polimorfimos intraespecíficos supracitados pode-se sugerir que esta tendência seja maior em relação a C. ligularis que C. odoratus. Seabloom et al. (1998) realizaram um estudo sobre a influência da quantidade da água e temperatura do solo na composição inicial de plântulas de cerrado e ambientes alagados a partir da germinação dos bancos de sementes, incluindo espécies como C. odoratus e C. ligularis. Os autores sugerem que estes fatores ambientais afetam a distribuição inicial das espécies emergentes dos bancos de sementes do solo, onde a quantidade de água é melhor correlacionada a plantas perenes/anuais e à resistência de seus indivíduos adultos, enquanto a temperatura seria o fator determinante da proporção da comunidade de plântulas de espécies anuais. De acordo com as observações supracitadas e com as realizadas durante as incursões de coleta no campo sugere-se que C. odoratus se apresenta melhor estabelecida em ambientes encharcados em relação a C. ligularis, tornando-a por um lado mais restrita quanto à sua distribuição e por outro, melhor adaptada neste ambiente, fato que pode contribuir para uma maior variabilidade genética em relação a C. ligularis. Adicionalmente, esta última apresenta maior índice de reprodução vegetativa em relação a C. odoratus contribuindo para uma maior 59 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... proporção de indivíduos clonais e consequentemente menor variabilidade genética (Alves, 2009 com. pess.). Por outro lado, a menor variabilidade de ramos observada no fenograma e de locos polimórficos intraespecíficos para C. ligularis quando comparado com C. odoratus, pode estar aliada à maior capacidade de estabelecimento de C. ligularis em distintos ambientes em relação a C. odoratus. Tal constatação pode sugerir um possível efeito fundador associado à capacidade de C. ligularis de ocupar áreas fortemente degradadas, secas ou úmidas, capacidade esta limitada a uma combinação específica de fatores genéticos, a despeito da diversidade de locais e áreas amostrados. Austerlitz et al. (2000) demonstraram através de marcadores de DNA nuclear e cpDNA que para espécies anuais a exemplo de C. ligularis há um grande impacto do efeito fundador onde a diversidade genética de cada população cai substancialmente nas primeiras gerações depois de cada evento de colonização. Porém, caso haja alta taxa de fluxo de pólens a diversidade pode ser rapidamente recuperada. O processo de colonização é fundamental para todos os organismos na ocupação principalmente de áreas fragmentadas. Isto se aplica tanto na ocupação não equilibrada por uma espécie em um novo habitat, durante sua expansão em uma nova região, assim como pela sua persistência em uma metapopulação, em que extinções da população local são balanceadas pela colonização de outro habitat disponível (Wakeley, 2004). Para C. ligularis, o ramo C-V no fenograma (Figura 2) sugere, devido aos agrupamentos não definidos entre os indivíduos pertencentes a diferentes populações, que estes provavelmente formam uma metapopulação. Isto corrobora dados prévios não publicados estabelecidos por nosso grupo através do DAF em uma amostragem de 22 indivíduos de C. ligularis coletados nas mesmas populações do presente estudo. As sementes de Cyperus ligularis apresentam dispersão ornitocórica, mirmecórica, hidrocórica e anemocórica (Linder e Rudall, 2005) fatores que, quando associados à sua facilidade de estabelecimento em diversas condições ambientais, favorecem a formação de pequenas populações, além de manter o fluxo gênico entre estas. Cyperus apresenta grande complexidade taxonômica e a sua sustentação filogenética é dificultada pelo baixo índice de coletas e estudos nas regiões tropicais, onde as espécies deste grupo ocorrem em sua maioria (Simpson et al., 2003). Portanto, além dos estudos já apresentados foram realizadas análises de diversidade genética (Gst e Nm) entre as populações de C. odoratus e C. ligularis. Os dados populacionais (Gst=0,3632; Nm=0,8766) corroboraram com os resultados de similaridade genética previamente descritos, indicando alta diversidade genética, evidente pelos valores de Gst acima de 0,25 (Wright, 1978), enquanto valores de Nm<1 apontam para cenários favoráveis à diferenciação genética (Almeida et al., 2003). Desta forma, estes dados sustentam a não ocorrência de cruzamentos 60 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... entre indivíduos das duas espécies, mesmo estas sendo simpátricas, como observado na população APR. A diversidade genética é o resultado de um longo período de evolução, representando o potencial evolutivo de uma dada espécie (Sheng, et al., 2006). Portanto, análises como as realizadas neste trabalho são fundamentais e informativas, principalmente quando se tratam de espécies como as deste estudo que sobrevivem em ambientes degradados. Geralmente espécies de ambientes impactados sofrem alterações em alguns aspectos, acumulando uma maior variação genética a fim de adaptar-se às várias pressões antrópicas e ambientais (Li et al. 1999). Além das informações de âmbito de diversidade genética, os resultados obtidos podem ser associados com observações de campo e de biologia reprodutiva no intuito de enriquecer ainda mais o conhecimento sobre a dinâmica das populações analisadas e do papel destas plantas nos processos sucessionais e de restauração ambiental. 61 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Referências Bibliográficas Almeida FS, Sodré LMK and Contel EPB (2003). Population structure analysis of Pimelodus maculatus (Pisces, Siluriformes) from the Tietê and Paranapanema Rivers (Brazil). Genet. Mol. Biol. 26: 301-305. Austerlitz F, Mariette S, Machon, N, Gouyon, PH and Godelle B (2000). 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Fragmentação da Mata Atlântica: Aspectos Teóricos. Rev. Floresta e Ambiente 5: 160-170. 65 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Tabela 1: Características e populações (Açude do Prata – AP, Estrada dos Passarinhos – EP. Ilha do Bananal – IB, Distrito de Apipucos – API e Fábrica da Macaxeira – FM) dos indivíduos coletados das espécies de Cyperus ligularis e C. odoratus e suas localizações georeferenciadas. Espécie Nº de indivíduos Populações Característica do Ambiente Georeferenciamento Cyperus odoratus (Cyp 001) 20 Açude do Prata (AP) Ambiente conservado, bastante úmido exposto a alagamentos em épocas chuvosas 8º00’24.15”S – 34º56’57.23”O Cyperus ligularis (Cyp 002) 6 Açude do Prata (AP) 3 Estrada dos Passarinhos (EP) Zona no entorno do fragmento de mata degradado por ocupações 8º00’50.18”S – 34º56’29.07”O 2 Ilha do Bananal (IB) Ilha circundada pelo o rio Capibaribe caracterizada pela agricultura familiar 8º01’30.76”S – 34º56’08.61”O 7 Distrito de Apipucos (API) Região degradada pela ocupação em massa não planejada 8º01’05.84”S – 34º55’50.88”O 2 Fábrica da Macaxeira (FM) Local degradado caracterizado por atividades pastoris 8º00’51.12”S – 34º55’53.74”O 66 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Tabela 2: Lista de Primers DAF utilizados para seleção dos mais informativos além de números e porcentagens de bandas geradas. Primers 460_02 OPK-8 OPL-14 OPE-12 R260-10 R160-05 OPE-6 G10 OPG-5 OPI-1 A-IV OPN-11 G12 OPJ-13 S06 OP4-5 U03-1 OPI-16 OPK-14 OPJ-16 K06 OPL-5 OPN-06 OPI-5 OPN-05 R370_9 G05 OPH-1 15_1 15_2 15_3 15_4 15_5 15_6 15_7a 15_7b 15_8 15_9 15_10 15_11 15_12 15_13 15_14 15_15 15_16e 15_16g 15_17 15_18 15_19 15_20 TOTAL Cyp 001: 1 AP 7 0 12 0 1 7 7 6 8 5 10 0 3 3 2 3 0 0 7 5 2 8 9 3 0 3 2 0 3 4 4 4 5 5 0 4 3 5 4 4 6 4 5 6 3 6 4 4 1 1 199 Cyp 001: 2 Cyp 002: 5 Cyp 002: 27* Total AP IB API 5 8 9 29 11 13 4 28 4 5 3 24 0 5 2 7 1 1 1 4 7 4 10 28 8 8 0 23 0 0 9 15 6 7 8 29 5 5 8 23 5 6 0 21 0 1 6 7 3 0 4 10 4 6 8 21 3 3 3 11 7 7 6 23 1 1 1 3 2 2 2 6 10 9 9 35 8 8 8 29 4 2 5 13 13 13 13 47 5 5 4 23 2 2 2 9 7 7 6 20 1 6 0 10 1 7 11 21 0 4 8 12 16 16 16 51 4 4 4 16 5 6 6 21 5 6 6 21 6 5 4 20 6 5 5 21 0 4 0 4 4 3 0 11 6 2 0 11 6 6 2 19 5 4 2 15 3 3 3 13 10 10 9 35 0 4 4 12 5 8 6 24 6 5 4 21 3 2 2 10 8 8 7 29 4 3 3 14 5 2 2 13 1 0 0 2 1 2 1 5 232 252 236 919 % 3,18 3,15 2,61 0,76 0,43 3,15 2,5 1,65 3,18 2,5 2,28 0,76 1 2,28 1,2 2,5 0,32 0,65 3,8 3,18 1,42 5,11 2,5 0,97 2,17 1 2,28 1,3 5,54 1,74 2,28 2,28 2,17 2,28 0,43 1,19 1,19 2 1,63 1,41 3,8 1,3 2,61 2,28 1 3,18 1,52 1,41 0,21 0,54 100 67 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Tabela 3: Loci polimórficos dos tipos intra e interespecíficos e intra e interpopulacionais gerados a partir da aplicação de dez primers através do marcador DAF em Cyperus odoratus e C. ligularis. Nº Nome 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 15_1 15_4 15_9 15_10 15_14 15_12 15_5 15_6 15_8 OPJ16 Primer Polimorfismos Seqüência Intraespecífico Interespecífico Intrapopulacional Interpopulacional Total Cyp001 Cyp002 AP/001 API/002 AP/002 IB/002 FM/002 EP/002 5’→ 3’ TGCGTGCTTGTATAA 17 7 11 17 4 4 2 0 3 7 18 TGCGTGCTTGATATA 13 8 16 13 7 1 3 0 3 8 16 TGCGTGCTTGTTCAT 10 3 14 10 4 0 0 0 0 3 14 AGGTCTTGGGTATAA 12 6 14 12 2 5 0 4 5 6 14 GTGGGCTGACGTGGG 16 6 18 16 5 1 0 0 5 6 18 AGGTCTTGGGTAGGC 14 21 28 14 19 13 10 1 4 21 28 TGCGTGCTTGAGAGA 10 3 17 10 3 0 0 0 0 3 17 TGCGTGCTTGAAGAA 12 7 14 12 4 1 4 0 3 7 14 TGCGTGCTTGTTAAT 15 1 16 15 1 1 0 0 1 1 16 TCTCCGCCCT 5 12 17 5 12 8 2 4 5 12 17 TOTAL 198 165 353 74 172 68 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Figura 1: Plots de coleta das espécies C. odoratus (triângulos laranjas) e C. ligularis (triângulos vermelhos) localizados no interior e entorno da Reserva de Dois Irmãos. Pontos de coleta indicados por siglas (Açude do Prata - AP, Estrada dos Passarinhos - EP, Fábrica da Macaxeira - FM, Distrito de Apipucos - API e Ilha do Bananal - IB) e suas respectivas áreas de ocorrência. Fonte: Google earth, com modificações. 69 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... C odoratus-17-APR 73 79 C odoratus-25-APR 59 C odoratus-14-APR C odoratus-34-APR C odoratus-30-APR SC-E C odoratus-15-APR C odoratus-28-APR C odoratus-37-APR C odoratus-11-APR SC-C 87 C odoratus-13-APR C odoratus-33-APR C-IV 86 G1 C odoratus-9-APR C odoratus-32-APR C-II 83 82 C odoratus-24-APR C odoratus-31-APR C-I C odoratus-40-APR C odoratus-35-APR C-III 100 C odoratus-36-APR SC-B C odoratus-38-APR 94 C odoratus-23-APR C ligularis-27-API C ligularis-26-API 65 C ligularis-16-APR C-V 100 60 84 C ligularis-21-API C ligularis-5-API C ligularis-28-API SC-A 67 55 C ligularis-7-ILB C ligularis-1-APR C ligularis-4-EPS SC-D C ligularis-3-EPS C ligularis-20-API G2 C ligularis-23-APR C ligularis-4-API C ligularis-13-APR C ligularis-4-ILB C ligularis-8-FMX C ligularis-15-APR C ligularis-4-APR C ligularis-4-FMX C ligularis-14-EPS 0.05 Figura 2. Fenograma gerado a partir de marcadores DAF usando o método Neighbor joining entre 40 amostras de C. odoratus e C. ligularis Populações: APR=Açude do Prata; API= Distrito de Apipucos; EPS= Estrada dos Passarinhos; FMX=Fábrica da Macaxeira; ILB=Ilha do Bananal. G1 e G2: Grupo 1 e 2. Barra: Escala de estimativa da diversidade genética. 70 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Capítulo II Manuscrito de artigo científico a ser enviado à revista Genetics and Molecular Research (Ribeirão Preto, SP) 71 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Diferenciação Genética entre Quatro Populações de Miconia prasina (Sw.) DC. (Melastomataceae) ocorrentes em Fragmentos de Floresta Atlântica de Terras Baixas em Pernambuco, através de Fingerprinting de DNA Cruz, G.A.S.1, Pinangé, D.S.B.1, Alves, M.V.2 Torres, R.A.3 & Benko-Iseppon, A.M. 1 (1) Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Genética, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50732-970, Recife – PE. (2) Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Botânica, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50732-970, Recife – PE. (3) Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Zoologia, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50732-970, Recife- PE. Autor para Correspondência: Benko-Iseppon, A. M. E-mail: [email protected] Resumo A floresta Atlântica vem sendo reduzida paulatinamente, tornando-se essencial o entendimento das conseqüências da fragmentação de habitats para a sua preservação e regeneração, processo no qual a espécie Miconia prasina representa papel fundamental. O objetivo do presente estudo foi analisar a diversidade genética (Gst) e o fluxo gênico (Nm) entre quatro populações de M. prasina de remanescentes de Floresta Atlântica de Terras Baixas, em Recife e Igarassu, PE (Brasil) usando-se marcadores DAF e ISSR. Foram gerados 255 loci polimórficos onde a estimativa global de diversidade genética (Dg%) foi de 91 e 85,5% para DAF e ISSR, respectivamente, tendo o fragmento Macacos como a maior contribuinte e Açude do Prata e Pezinho como as menores, sugerindo que Macacos se apresenta com maior potencial de adaptabilidade. Os dados de Dg% intrapopulacional apontam Macacos com o maior índice, provavelmente devido à polinização e dispersão neste, e Açude do Prata e Pezinho, com os menores sugerindo maior atenção no sentido de conservação destes. A partir dos agrupamentos foram observados indícios de estruturação genética da população Açude do Prata em relação às demais, fato também indicado por as análises populacionais (Gst e Nm). A partir dos Gst e Nm globais por DAF e DAF/ISSR foi observada uma divergência genética entre os fragmentos florestais analisados, sugerindo-se que tal fenômeno seria conseqüência da pressão antrópica, bem como das expansões e retrações ocorridas durante o Quaternário. Em adição às informações obtidas sugere-se que observações de campo e de biologia reprodutiva devam colaborar de forma relevante na tentativa de enriquecer ainda mais o conhecimento sobre a dinâmica das populações analisadas, tendo em vista o papel fundamental destas plantas nos processos sucessionais. Palavras-chave: DAF, ISSR, Estrutura genética, Gst, Nm, Fragmentação, Espécies Pioneiras. 72 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Introdução A Floresta Atlântica é um dos 25 hotspots mundiais de biodiversidade, tratando-se de um ecossistema que originalmente estendia- se de forma contínua ao longo da costa brasileira, penetrando até o leste do Paraguai e o nordeste da Argentina em sua porção sul, época em que cobria mais de 1,5 milhões de km2, com 92% desta área no Brasil (Fundação SOS Mata Atlântica e INPE, 2001; Galindo-Leal e Câmara, 2003). Embora grande parte desta floresta tenha sido destruída, tornando-se constituída por fragmentos, considera-se que a mesma ainda abrigue mais de 8.000 espécies endêmicas de plantas vasculares, anfíbios, répteis, aves e mamíferos (Myers et al., 2000). Neste quadro, os fragmentos florestais de diversos tamanhos e formas, assumem fundamental importância para a perenidade da Floresta Atlântica (Zaú, 1998). A exploração humana modifica severamente a estrutura do habitat atuando diretamente no padrão de distribuição espacial e fenológico das espécies nativas, já que diferentes fatores do ambiente, como luz incidente, umidade e disponibilidade de nutrientes também serão afetados (Costa, 2004). Portanto, alterações em ambientes naturais permitem a colonização por novas espécies, principalmente aquelas que possuam grande resistência às condições ambientais mais extremas e que sejam consideradas pioneiras, colaborando para processos de regeneração da vegetação (Tabarelli e Mantovani, 1999). Estima-se que Melastomataceae apresente 4.570 espécies distribuídas pelas regiões tropicais e subtropicais de todo o globo (Clausing e Renner, 2001). Cerca de um quarto destas espécies (1.056, segundo Goldenberg e Almeida, in prep.) pertencem ao gênero Miconia, caracterizando este como o maior da família, onde suas espécies podem apresentar-se como componentes do sub-bosque de florestas primárias, ocorrendo principalmente em áreas secundárias, bordas de floresta e clareiras naturais no interior de florestas. Por esta razão, estas espécies são consideradas pioneiras representando importante papel ecológico em processos sucessionais, principalmente em fragmentos florestais que se encontram em estágio secundário de regeneração. Assim, são freqüentemente utilizadas em estudos ecológicos de populações, a fim de propiciar um maior entendimento da dinâmica populacional de espécies nativas, colaborando diretamente para fins de conservação e manejo (Gaston, 1994). Considerando o exposto, é essencial o entendimento das conseqüências da fragmentação de habitats causada por ações humanas que reduziram o tamanho das populações de muitas espécies vegetais aumentando seu isolamento espacial. Pequenas populações juntamente com o isolamento geográfico podem resultar em erosão genética e aumento da divergência genética entre as populações através da deriva genética, aumento nos 73 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... níveis de endocruzamento, redução dos níveis de fluxo gênico, quebra do processo de polinização e elevação da probabilidade de extinção local de populações dentro de uma metapopulação (Kolb, 2005). Portanto, genética de populações, filogeografia e metodologias filogenéticas, estão progressivamente sendo aplicadas para reconstrução de padrões e processos que levaram à distribuição da diversidade genética presentemente observada nas espécies, e ainda para geração de informações no campo de fatores que induziram esta distribuição (Caterino e Chatzimanolis, 2008). O presente estudo teve como objetivo analisar a diversidade genética (Gst) e fluxo gênico (Nm) entre quatro populações da espécie pioneira Miconia prasina (Sw.) DC. (Melastomataceae) ocorrentes em fragmentos de Floresta Atlântica de Terras Baixas em Pernambuco no intuito de auxiliar no entendimento das consequências da fragmentação na diversidade genética e estrutura populacional. Material e Métodos Coleta de Material Biológico Foram estudadas 24 amostras de indivíduos (folhas jovens) de M. prasina (Tabela 1) ocorrentes em remanescentes de Floresta Atlântica de Terras Baixas de formas e tamanhos variados nas Reservas Ecológicas de Dois Irmãos (DI; Fragmento Apr, seis indivíduos, 388,67 ha), Recife – PE; Usina São José (USJ; Fragmentos Pezinho, Pez, 22 ha; Macacos, Mac, 310 ha; Zambana, Zbn, 380 ha – seis indivíduos em cada fragmento), Igarassu – PE. As coletas ocorreram no período de setembro de 2007 a julho de 2008. Os materiais biológicos foram mantidos a -80°C no Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal (LGBV) da Universidade Federal de Pernambuco. Material testemunho (exsicatas) das populações estudadas está depositado no Herbário Geraldo Mariz (UFP). Extração de DNA O isolamento do DNA nuclear foi realizado a partir do protocolo de extração descrito por Weising et al. (2005) com modificações na proporção de tecido foliar que foi reduzido de 5 g para 2 g em relação ao tampão de extração (12 mL), bem como no que diz respeito ao processo de lavagem do material, onde este foi lavado apenas por uma vez com álcool 74 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... isoamílico e clorofórmio ao invés de duas vezes como descrito no referido protocolo. Para a quantificação do DNA extraído foi utilizado método comparativo em gel de agarose 1,2% usando-se diferentes concentrações de λ-DNA (200, 100, 50 e 20 ng/µL) como referencial. A limpeza do RNA foi feita a partir de 0,25 µL/mL de RNAse a 10 mM/µL onde as amostras ficaram em repouso overnight a temperatura ambiente ou foram expostas a 37 ºC por 2 h. Geração de Marcadores Moleculares Para análise de Fingerprinting de DNA genômico foram empregados os marcadores DAF (DNA amplification fingerprinting) e ISSR (inter-simple sequence repeat). O DAF foi aplicado a partir de primers de sequências aleatórias seguindo o descrito por Caetano-Anollés et al. (1991), com modificações introduzidas por Winter et al. (2000) e Benko-Iseppon et al. (2003). O emprego da técnica consistiu na utilização de 1,0 µL de DNA genômico (0,5 ηg), 1,5 µL de PCR buffer (10x), 1,5 µL de MgCl2 (2,5 mM), 1,5 µL de dNTPmix (10mM), 1,0 µL de primer (20 µM - 15meros) e 0,2 µL de Taq DNA polimerase (1 U), com o volume final de 15 µL por amostra. As reações de amplificação ocorreram em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradiente, com 2 min de desnaturação inicial a 95°C, seguidos de 40 ciclos compostos de três etapas: desnaturação de 15 seg a 95°C; pareamento dos primers de 1 min a 35°C e extensão de 2 min a 72°C. Ao final dos 40 ciclos a reação foi completada com uma extensão final de 2 min a 72°C. Por fim, os produtos amplificados foram separados eletroforeticamente em gel de agarose (1,8%), sendo corados com brometo de etídio (0,5 µg/mL) e visualizados sob luz ultravioleta e fotografados com câmera digital Sony Cybershot W5 (zoom óptico 3.0 Megapixel). Para o ISSR foram empregados primers de sequências previamente conhecidas seguindo o descrito por Bornet e Branchard (2001). Desta forma, foram utilizados 4 µL de DNA genômico (5 ηg), 2 µL de PCR buffer (10x), 2 µL de MgCl2 (25 mM), 1,5 µL de dNTP-mix (10 mM), 1 µL de primer (50 pmol) e por fim 0,15 µL de Taq DNA polimerase (5 U), totalizando uma reação final de 20 µL por amostra. As reações tipo PCR para este marcador procederam em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradiente, com 4 min de desnaturação inicial a 94ºC, seguida de 35 ciclos constituídos das etapas: desnaturação a 94ºC por 30 seg, pareamento dos primers a 52ºC por 45 seg e extensão a 72ºC por 2 min. Após o término dos 35 ciclos o programa aplicado procedeu com uma extensão final a 72ºC por 7 min. Posteriormente às amplificações os 75 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... produtos gerados foram separados eletroforeticamente em gel de agarose (1,8%), corados com brometo de etídio (0,5 µg/mL), visualizados sob luz ultravioleta e fotografados com câmera digital Sony Cybershot W5 (zoom óptico 3.0 Megapixel). Seleção de primers A seleção de oligonucleotídeos para os marcadores DAF e ISSR foi realizada a partir de um conjunto de 20 e 10 primers respectivamente (Tabela 2), através de experimentos de PCR/DAF e PCR/ISSR, de acordo com o descrito no item geração de dados moleculares. Foi utilizado de um total de quatro amostras, sendo cada uma pertencente a uma população (Serrambi = Serr, Macacos = Mac, Pezinho = Pez e Zambana = Zbn). A partir dos resultados obtidos deste experimento foram selecionados os dez primers mais informativos para o DAF e cinco para ISSR em relação ao número total de bandas bem como de loci. Aplicação dos primers selecionados Primers mais informativos foram selecionados para ambos os tipos de marcadores (DAF e ISSR) em uma amostragem de 27 indivíduos, sendo 24 provenientes das populações: Pez – 6, Zbn - 6, Mac – 6 e Apr – 6. Devido às diferenças no tamanho dos fragmentos estudados realizou-se uma adequação amostral, visto que seis foi o número máximo de indivíduos encontrados no menor fragmento (Pez). A aplicação dos marcadores seguiu o mesmo protocolo descrito no item geração de marcadores moleculares. Todos os dados obtidos através deste experimento foram compilados na forma de polimorfismos intraespecíficos e intra e interpopulacionais (Tabelas 3 e 4). Análise de Polimorfismos A partir de análises dos loci obtidos os dados foram agrupados para dois tipos de análises. Na primeira, foi analisada a diversidade genética das amostras através da constituição de três matrizes binárias onde A representa presença e C ausência de bandas para cada loco analisado dos marcadores DAF, ISSR e DAF/ISSR. Estas matrizes foram submetidas ao método de Neighbor Joining - NJ (Saitou e Nei, 1987) através do programa MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007) (Molecular Evolucionary Genetics Analysis) baseado no modelo p-distance com Bootstrap de 1000 repetições, onde foram gerados três agrupamentos fenéticos entre 20 indivíduos das populações estudadas uma vez que, os indivíduos mic-prid22-Zbn, mic-pr-id6-Mac, mic-pr-id4-Mac, mic-pr-id5-Apr e mic-pr-id2-Serg foram excluídos destas análises devido a dificuldades de cálculo de similaridade. 76 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Para a segunda análise foi calculada a estimativa global de diversidade genética (Dg%) através da divisão entre o número de locos variantes pelo total (Nlv/Ntl) obtendo-se a representatividade da Dg% de cada população em relação ao todo amostrado (Nei, 1972, 1973). Já o nível de Dg% próprio de cada população consistiu da sobreposição entre Nlv/Ntl, considerando-se isoladamente os locos pertencentes a cada população. Adicionalmente, foram confeccionadas mais três matrizes binárias de presença (1) e ausência (0) de acordo com os dados de DAF, ISSR e DAF/ISSR no intuito de realizar investigações de diversidade genética (Gst) e fluxo gênico (Nm) entre as quatro populações estudadas (Zbn, Pez, Mac, Apr) compostas por 24 indivíduos, além de análises par a par (dicotômicas) entre as populações estudadas. Para isto, as matrizes foram analisadas através do software Popgene 3.2 (Yeh et al., 2001), onde os cálculos estatísticos foram realizados usando-se o parâmetro de 1.000 simulações. Resultados A partir do experimento geral do DAF foram obtidas 1607 bandas variando em peso molecular de 150 a 3.000 pb. As bandas polimórficas foram distribuídas em nível intra e interpopulacional conforme a Tabela 3. No que se refere aos marcadores ISSR, o número total de bandas foi de 1127, com o peso molecular variando de 250 a 1800 pb. Assim como para o marcador DAF, as bandas polimórficas foram distribuídas nos níveis intra e interpopulacionais de acordo com a Tabela 4. Os dez primers utilizados para o DAF amplificaram um total de 166 loci onde destes 15 foram monomórficos e 151 polimórficos, propiciando uma estimativa global de diversidade genética (Dg%) da ordem de 91% para M. prasina na área de estudo do presente trabalho. A representatividade da Dg% de cada população em relação ao todo amostrado foi de: Zbn – 42,7%, Pez – 50%, Mac – 61,4% e Apr – 30,1%. Já o nível de Dg% própria de cada população consistiu em: Zbn – 60,3%, Pez – 65,3%, Mac – 78% e Apr – 45%. Para o experimento de ISSR a partir de cinco primers observaram-se 83 loci, dos quais 12 monomórficos e 71 polimórficos. O DG% para M. prasina a partir deste marcador foi da ordem de 85,5% para a área de estudo abordada. As populações analisadas apresentaram Dg% de: Zbn – 54,2%, Pez – 42,1%, Mac – 75,9% e Apr – 45,7%. O índice Dg% próprio de cada população foi de: Zbn- 65,2%, Pez – 47,2%, Mac – 85,1% e Apr – 54,2%. 77 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Considerando o método NJ utilizado para análise de diversidade genética entre as amostras foram constituídos três fenogramas de acordo com os dados provenientes dos marcadores DAF, ISSR e DAF/ISSR (Figuras 2, 3 e 4). O fenograma gerado por DAF (Figura 2) apresentou dois grupos genéticos (G1 e G2). Todos os indivíduos pertencentes ao G1 são dos três fragmentos da USJ (Zbn, Mac e Pez), onde foi observado em que as amostras do fragmento Zbn foram agrupadas com 70% de similaridade genética em ramos próximos. Os indivíduos do Mac se apresentaram também agrupados em ramos próximos , porém, de maneira mais isolada em relação às populações Zbn e Pez. Já os espécimes do Pez foram agrupados mais aleatoriamente, inclusive partilhando ramos tanto com indivíduos de Zbn como de Mac. Em G2 foram agrupados isoladamente todos os indivíduos provenientes de Apr juntamente com alguns de Mac e um de Pez. Através da análise realizada a partir do fenograma gerado pelo marcador ISSR (Figura 3) foi novamente observada uma separação entre as amostras em dois grupos (G1 e G2). O G1 compreende indivíduos de todas as populações neste grupo os indivíduos de Pez apresentaram maior correlação com as amostras do Zbn. Três amostras pertencentes a Apr agruparam-se parcialmente isoladas das demais. Ainda foi observado que dois representantes do Apr apresentaram proximidade genética com indivíduos dos fragmentos Mac e Pez. O G2 foi composto apenas por três indivíduos pertencentes às populações de Mac e Zbn. O agrupamento gerado a partir da junção dos marcadores DAF/ISRR apresentou divisão em dois grupos (G1 e G2). O primeiro grupo foi composto por indivíduos de todas as populações (Zbn, Pez, Apr e Mac) observando-se maior similaridade entre os indivíduos de Pez e Zbn . Os indivíduos de Apr apresentaram-se isolados em relação aos demais. Já o G2 foi composto por três indivíduos do Mac . Os dados gerados a partir das análises populacionais (Gst e Nm) globais de acordo com os marcadores DAF, ISSR e a combinação DAF/ISSR demonstram uma grande tendência geral de estruturação das populações de acordo com os índices de Gst, em contrapartida, os índices globais de Nm também foram altos. Já as análises populacionais (Gst e Nm) comparadas par a par entre as quatro populações revelarem maior a tendência de estruturação entre a população Apr em relação às demais e Mac, se considerados os três fragmentos da USJ (Tabela 5). 78 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Discussão Para a espécie estudada neste trabalho é inexistente o conhecimento prévio a respeito de sequências ou marcadores de DNA que constituem os seus genomas. Portanto, a determinação da utilização dos marcadores DAF e ISSR no presente estudo, foi baseada no fato de que estes não requerem conhecimento prévio da constituição genética dos indivíduos analisados, bem como devido as suas características de reprodutibilidade e capacidade de gerar um grande número de polimorfismos. Winter et al. (2000) e Benko-Iseppon et al. (2001) na geração de um mapa gênico de grão-de-bico (Cicer arietinum) observaram distorções nos padrões segregação usando marcadores RAPD, o que não aconteceu quando usados polimorfismos gerados por marcadores DAF ou com outros tipos de marcadores. Além desta análise, foi atestado o alto grau de reprodutibilidade do DAF em estudos não publicados do nosso grupo através da caracterização molecular de espécies pertencentes à família Araceae onde todas as amostras foram testadas pelo menos duas vezes e comparadas com padrões de peso molecular. De acordo com Telles (2001) são necessários no mínimo 60 loci para uma estimativa consistente da variação genética, uma vez que a partir desta quantidade são observadas reduções significativas nos desvios-padrão e, conseqüentemente, nos coeficientes de variação, tendo usado em seu estudo seis primers para a geração dos polimorfismos necessários. Segundo Hollingsworth e Ennos (2004), o uso de no mínimo 50 loci para marcadores RAPD revela alta consistência no que se refere à recuperação de topologias não resolvidas, apresentando altos índices de diferenciação populacional (ex. FST=0,15). Assim, pode-se observar através dos parâmetros supracitados, que a consistência das análises de diversidade genética aumenta juntamente com um maior número de loci. Em relação aos parâmetros de consistência de diversidade genética mencionados nos estudos acima, o presente trabalho encontra-se de acordo, uma vez que, foram observados 166 loci polimórficos para o marcador DAF, utilizando-se dez primers (Tabela 3), enquanto os marcadores ISSR geraram 83 loci a partir da aplicação de cinco primers (Tabela 4). Considerando-se a representatividade percentual da diversidade genética de cada população a partir do conjunto de loci analisado, a população que contribuiu mais significativamente para o total de diversidade observada foi a Mac em relação a ambos os marcadores analisados (DAF=61,4% e ISSR=75,9%). Por outro lado, as que menos contribuíram foram Apr para o DAF com 30,1% e Pez para o ISSR com 42,1%. Um importante fator a ser destacado é que a diversidade genética é um conceito central da biologia evolutiva, a qual relaciona-se à complexidade organismal (Lynch e Conery, 2003), à 79 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... recuperação do ecossistema (Reusch et al, 2005), e à habilidade da espécie em responder às mudanças ambientais (O’brien, 1994). A falta de diversidade está entre os fatores que colaboram para um potencial declínio da população, colocando-a em perigo (Amos e Balmford, 2001; Spielman et al, 2004). Portanto, considerando-se ambos os marcadores, é sugerido que a população Mac apresenta-se como a que possui um maior potencial de adaptabilidade em relação às mudanças impostas pelo meio, pois é a que detêm maior índice de variabilidade genética dentre todas as amostradas, mesmo considerando que esta diversidade apresentada seja conseqüência de, por exemplo, fatores como deriva genética. No que tange às populações Apr e Pez, estas se destacaram como as que apresentaram os menores índices de diversidade, o que pode refletir em um menor potencial adaptativo. No que diz respeito aos índices de diversidade genética própria de cada população, Mac apresentou o maior índice de diversidade intrapopulacional tanto em relação ao DAF (78%, sustentado por 102 bandas polimórficas; Tabela 3) como ao ISSR (85,1%, 63 bandas; Tabela 4). Estes dados sugerem maior diferenciação genética do Mac em relação aos outros fragmentos, onde este fato pode estar relacionado à ação dos polinizadores (geralmente abelhas) e dispersores de sementes (aves frugívoras, em sua maioria) nos fragmentos estudados (Buchmann, 1983; Levey, 1986). Em trabalho realizado por Antonini e NunesFreitas (2004) a respeito de estrutura populacional de M. prasina, foi observado que apesar da elevada taxa de visitação em M. prasina pela avifauna local, grande parte dos frutos e sementes seria depositada em local próximo à planta-mãe, naturalmente ou pelos seus dispersores. Considerando estas características ecológicas, bem como as diferentes pressões antrópicas às quais os fragmentos estudados estão submetidos (como a matriz da cultura canavieira) e, adicionalmente, o tamanho e formato destes fragmentos, fatores que juntos influenciam na extensão do efeito da borda (local de ocorrência de M. prasina) nestes fragmentos (MMA, 2003), infere-se que todas estas características podem influenciar na dinâmica de visitação por polinizadores e dispersores naturais em cada fragmento, auxiliando na diferenciação genética entre estes. Os índices de diversidade genética própria ainda apontaram – de acordo com o DAF e ISSR – para as populações Apr (45%) e Pez (47,2%), respectivamente, como sendo as menos diversas. Estes dados sugerem uma maior atenção no sentido de conservação em relação a estes dois fragmentos, uma vez que Apr é um fragmento urbano que vem sendo constantemente agredido e alterado, principalmente em decorrência da ação antrópica das comunidades localizadas em seu entorno (Lima e Corrêa, 2008). Em relação a Pez, além do baixo índice de Dg% este fragmento é o menor (22 ha) dentre os estudados e o mais recortado (invaginado), sugerindo-se que o tamanho e formato irregular do fragmento podem ter 80 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... influenciado sua diversidade genética, principalmente devido ao efeito de borda, fato destacado em outras abordagens metodológicas na mesma área (Viana, 1991; Primack e Rodrigues, 2001). Portanto, a baixa concentração de variabilidade genética pode estar relacionada à diversidade de condições locais, ao tamanho do fragmento e ao histórico de perturbação da área (Parker e Picket, 1999), podendo assim indicar necessidade de maior atenção para direcionamento de esforços de conservação nestes fragmentos. O presente trabalho também avaliou a similaridade genética entre os indivíduos provenientes das populações Pez, Mac, Zbn e Apr usando-se matrizes de dados gerados por DAF, por ISSR e pela combinação de ambos (DAF+ISSR). De acordo com os três tipos de análise descritas nos resultados, o agrupamento gerado pela combinação dos marcadores (DAF/ISSR) formado a partir de 237 loci polimórficos foi o mais informativo por apresentar os melhores valores de bootstrap consequentemente favorecendo uma análise mais coerente das estruturações apresentadas por as populações. Considerando o fenograma DAF/ISSR (Figura 4), observou-se que os representantes de Pez e Zbn localizados na USJ (com exceção de um indivíduo do Pez) agruparam-se próximos, com bom índice de similaridade genética (56% ); porém, o baixo padrão de estruturação indica que os efeitos da fragmentação florestal provavelmente não foram ainda suficientes para uma maior diferenciação entre estes fragmentos (Sival et al., 2008). Já o terceiro fragmento da USJ (Mac) agrupou-se separadamente, quando comparado com Pez e Zbn , sugerindo que Mac (dentre os fragmentos da USJ) apresenta uma maior tendência de estruturação. Em relação a Apr, trata-se do fragmento melhor estruturado, pois agrupa-se isoladamente apresentando características de estruturação mais clara em decorrência aos efeitos da fragmentação florestal ao contrário dos fragmentos da USJ . A sugestão de tendência de maior estruturação genética para a população Apr em decorrência da diversidade entre os indivíduos no fenograma (DAF/ISSR) é também indicada pelas análises populacionais par a par de Gst e Nm, realizadas entre as quatro populações (Apr, Pez, Zbn e Mac). Entre os três tipos de correlações possíveis da população Apr com as demais abordadas (Apr e Pez, Apr e Zbn, Apr e Mac) para cada marcador (DAF, ISSR e DAF/ISSR totalizando nove inferências em quatro destas, 44,4%), foram observados índices de Gst acima de 0,25 onde estes valores apontam para uma estruturação evolutiva bem acentuada (Wright, 1978). Já os índices de Nm para estas correlações são altos (Tabela 5) uma vez que valores de Nm<1 apontam para uma ação em favor de uma diferenciação genética (Almeida et al., 2003). Desta forma, pode-se sugerir que apesar de uma maior tendência de estruturação de Apr, este ainda apresenta fluxo gênico histórico com as populações Pez, Zbn e 81 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Mac, mesmo considerando as várias barreiras geográficas entre estas (ex. rodovias, moradias, dentre outros) e adicionalmente a distância que as separa (aproximadamente 35 km). As observações par a par entre as populações que estão localizadas na USJ (Zbn, Pez e Mac), revelaram em 65% das inferências índices moderadamente altos de Gst com destaque para o fragmento Mac que apresentou este índice em 100% de suas inferências, indicando maior tendência de estruturação em relação à Zbn e Pez a exemplo do que foi observado nos agrupamentos fenéticos supracitados. Já em 100% das inferências de Nm foram observados índices muito altos, sugerindo a ocorrência de fluxo gênico histórico e ausência de uma estruturação genética melhor definida principalmente em Zbn e Pez. Considerando-se que os fragmentos situados na USJ são próximos e que várias espécies de Melastomataceae apresentam como polinizadores além de abelhas, também moscas (mais abundantes no fragmento Pez – observação pessoal), morcegos ou beija-flores, tendo ainda as sementes dispersas por pássaros (Renner, 1989; Goldenberg e Shepherd, 1998), estas características podem ser um importante fator contribuinte para os altos índices de fluxo gênico histórico entre estes fragmentos. A partir dos valores globais de Gst e Nm, apesar do alto índice de fluxo gênico histórico (Nm) observado (DAF=1,3714, ISSR=1,8145 e DAF/ISSR=1,4851) os resultados apontam para uma tendência a estruturação genética global entre as populações, uma vez que o índice de Gst é alto (DAF=0,2672, ISSR=0,2160 e DAF/ISSR=0,2519), sugerindo a distribuição variada da diversidade genética entre os indivíduos das diferentes populações analisadas. Silva et al. (2008) encontrou dados similares através de estudo de diversidade e estrutura genética em populações de Tapirira guianensis Aubl. através de marcadores isoenzimas nos mesmos fragmentos aqui abordados, obtendo diversidade genética de 100% e fluxo gênico de 2,45. Entretanto, diante destes resultados e de trabalhos similares realizados na mesma área, torna-se difícil determinar se a diversidade genética foi o resultado da fragmentação recente, humano-negociada ou de fatores biogeográficos em longo prazo (Cardoso et al., 1998). Porém, alguns autores (Lira et al., 2003; Cardoso et al., 2005) sugerem que determinados fragmentos da Floresta Atlântica não são resultado de um sistema contínuo que foi fragmentado exclusivamente nos últimos 500 anos. Embora esta fragmentação seja extremamente realçada pela super-exploração e pela pressão urbana, as expansões e retrações da Floresta Atlântica durante os períodos frios, secos e de mudanças de clima cíclicas do Quaternário podem ter influenciado na distribuição genética (Cardoso et al., 2005). Devido aos efeitos da fragmentação de florestas, a erosão genética pode ser uma conseqüência imediata, especialmente se as mudanças genéticas influenciarem diretamente na adaptação dos indivíduos e na viabilidade em curto prazo das populações remanescentes 82 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... (Frankham, 2005). Portanto, estudos de acesso à diversidade genética via marcadores moleculares de DNA associados a modernas ferramentas analíticas tornam-se fundamentais, pois contribuem significativamente para o entendimento dos processos históricos (bióticos e abióticos) que modulam a diversidade intraespecífica da biota, especificamente a diversidade populacional; desta forma auxiliando no direcionamento de esforços de conservação dos remanescentes de Floresta Atlântica (Avise 1994, 2000; Templeton, 1998; Posada e Crandall 2001; Brant e Ortí 2003; Ali et al., 2004). Além das informações obtidas no âmbito da diversidade e conectividade genética entre populações naturais de remanescentes de Floresta Atlântica, estes dados podem ser utilizados para a determinação filogeográfica de M. prasina a partir das populações estudadas, podendo ser associados com a aplicação de outros tipos de marcadores moleculares como o seqüenciamento de cpDNA, no intuito de elucidar aspectos adicionais da estrutura populacional. Adicionalmente os resultados obtidos podem também ser integrados a observações de campo e de biologia reprodutiva, na tentativa de enriquecer ainda mais o conhecimento sobre a dinâmica e estrutura das populações analisadas, tendo em vista o papel fundamental destas plantas nos processos de sucessão florestal. 83 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Referências Ali BA, Huang TH, Qin DN and Wang X.M (2004). A review of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in fish research. Rev. 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Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Tabela 1: Distribuição dos indivíduos coletados em Pernambuco (Recife, Igarassu e Serrambi) e em Sergipe (Itabaiana) e suas respectivas populações, bem como dados de georeferenciamento correspondente de cada indivíduo. Local / Município Populações Pezinho (Pez) Usina São José - USJ (Igarassu - PE) Macacos (Mac) Zambana (Zbn) Indivíduos Georeferenciamento 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 07º47’20.9”S - 35º01’0.6”O 07º47’20.7”S - 35º01’07.9”O 07º47’21.05”S - 35º01’09.03”O 07º47’20.05”S - 35º01’09.5”O 07º47’22.0”S - 35º01’07.6”O 07º47’22.4”S - 35º01’07.8”O 07º46’49.3”S - 35º00’40.8”O 07º46’50.6”S - 35º00’40.4”O 07º46’54.2”S - 35º00’39.9”O 07º46’55.5”S - 35º01’07.8”O 07º47’22.4”S - 35º01’07.8”O 07º47’22.4”S - 35º01’07.8”O 07º42’7.8”S- 34º58’58.9”O 07º42’6.7”S - 34º58’37.8”O 07º42’8.7”S - 34º58’59.6”O 07º42’19.5”S - 34º58’01.0”O 07º42’20.4”S - 34º58’00.2”O 07º42’09.9”S - 34º58’00.7”O 08º00’36.10”S - 34º56’56.88”O 08º00’28.41”S - 34º56’57.57”O 08º00’26.43”S - 34º56’58.11”O 08º00’23.44”S - 34º56’59.92”O 08º00’20.24”S - 34º56’59.81”O 08º00’17.29”S - 34º56’58.38”O Reserva de Dois Irmãos Recife - PE Açude da Prata (Apr) Serrambi - PE Serrambi (Serr) 1 08º32’56.57”S –35º00’44.87”O Parque Nacional Itabaiana, Itabaiana - SE Sergipe (Serg) 1 2 10º41’15.14”S –37º24’30.63”O 10º41’15.25”S –37º24’30.80”O 89 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Tabela 2: Sequências e designação de primers DAF e ISSR utilizados para seleção dos mais informativos. Primer Seqüência (5’- 3’) Tamanho bp Marcador 15_1 TGCGTGCTTGTATAA 15 DAF 15_2 TGCGTGCTTGCGCGG 15 DAF 15_3 TGCGTGCTTGAGAGA 15 DAF 15_5 TGCGTGCTTGAGAGA 15 DAF 15_6 TGCGTGCTTGAAGAA 15 DAF 15_7B TGCGTGCTTGTGTGT 15 DAF 15_9 TGCGTGCTTGTTCAT 15 DAF 15_11 AGGTCTTGGGTAGGG 15 DAF 15_12 AGGTCTTGGGTAGGC 15 DAF 15_13 AGGTCTTGGGTAAGG 15 DAF 15_14 GTGGGCTGACGTGGG 15 DAF 15_15 ACATCGCCCAACATC 15 DAF 15_16A GAACCTACGGTGAAG 15 DAF 15_16C GAACCTACGGTAGGG 15 DAF 15_16D GAACCTACGGTAAGG 15 DAF 15_19 CTATGCCGACCCGAC 15 DAF Z-10 CCGACAAACC 10 DAF Z-15 CAGGGCTTTC 10 DAF Z-04 AGGCTGTGCT 10 DAF Z-05 TCCCATGCTG 10 DAF 825 ACACACACACACACACT 17 ISSR 807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 17 ISSR 816 CACACACACACACACAT 17 ISSR 818 CACACACACACACACAG 17 ISSR 819 GTGTGTGTGTGTGTGTA 17 ISSR 844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 18 ISSR 886 VDVCTCTCTCTCTCTCT 17 ISSR 890 VHVGTGTGTGTGTGTGT 17 ISSR 891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 17 ISSR 884 HBHAGAGAGAGAGAGAG 17 ISSR 889 DBDACACACACACACAC 17 ISSR 90 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Tabela 3: Loci polimórficos dos tipos intra e interpopulacionais gerados a partir da aplicação de dez primers através do marcador DAF nas populações Zbn = Zambana, Pez = Pezinho, Mac = Macacos e Apr = Açude da Prata de Miconia prasina. Primer Polimorfismos Nº Nome Seqüência Intrapopulacional Interpopulacional / Parcial 2x2 Interpopulacional / Geral Total Zbn Pez Mac Apr Zbn/Pez Zbn/Mac Zbn/Apr Pez/Mac Pez/Apr Mac/Apr 5’→ 3’ 1. 15_16A GAACCTACGGTGAAG 4 5 11 12 4 15 15 15 16 18 20 21 2. 15_9 TGCGTGCTTGTTCAT 6 6 6 3 7 11 10 10 9 11 13 13 3. 15_14 GTGGGCTGACGTGGG 3 4 5 2 5 8 7 8 7 7 9 11 10 6 5 10 11 5 12 10 8 10 16 4. 15_15 ACATCGCCCAACATC 9 5. 15_12 AGGTCTTGGGTAGGC 3 11 12 0 12 13 8 14 12 13 14 17 6. 15_1 TGCGTGCTTGTATAA 11 20 24 11 21 24 21 26 26 28 30 30 1 16 16 15 15 14 12 16 17 7. 15_2 TGCGTGCTTGCGCGG 14 13 11 8. 15_13 AGGTCTTGGGTAAGG 10 4 13 4 10 15 12 14 8 16 15 16 9. 15_7B TGCGTGCTTGTGTGT 2 3 7 11 4 12 12 13 12 13 13 14 10. 15_16D GAACCTACGGTAAGG 8 8 7 1 10 10 10 9 9 7 10 11 99 135 115 136 123 133 151 166 Total 70 84 102 50 91 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Tabela 4: Loci polimórficos dos tipos intra e interpopulacionais gerados a partir da aplicação de dez primers através do marcador ISSR nas populações Zbn = Zambana, Pez = Pezinho, Mac = Macacos e Apr = Açude da Prata de Miconia prasina. Primer Polimorfismos Nº Nome 1. 2. 3. 4. 5. 844 884 889 886 890 Seqüência Intrapopulacional Zbn Pez 5’→ 3’ CTC TCT CTC TCT CTC TRC 15 13 HBH AGA GAG AGA GAG AG 11 10 DBD ACA CAC ACA CAC AC 12 8 VDV CTC TCT CTC TCT CT 7 4 VHV GTG TGT GTG TGT GT 2 0 Total 47 35 Interpopulacional Parcial 2/2 Mac Apr Zbn/Pez Zbn/Mac Zbn/Apr Pez/Mac Pez/Apr Mac/Apr 14 9 16 17 16 16 14 14 13 9 12 13 14 14 13 14 17 7 18 18 15 20 10 18 9 8 7 10 10 10 9 11 10 5 2 10 5 10 5 10 63 38 55 68 60 70 51 67 Interpopulacional Total / Geral 17 14 20 10 10 71 17 14 20 16 16 83 92 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Tabela 5: Dados populacionais de variabilidade genética (Gst) e número de migrantes (Nm) gerados a partir das análises geral e dicotômica (par a par) de loci polimórficos das populações Zbn = Zambana, Pez = Pezinho, Mac = Macacos e Apr = Açude do Prata, a partir dos marcadores DAF, ISSR e DAF/ISRR através da utilização do programa Popgene 32. População DAF ISSR DAF + ISSR Gst Nm Gst Nm Gst Nm Zbn X Pez 0.1469 2.9044 0.1180 3.7386 0.1386 3.1083 Zbn X Mac 0.2191 1.7825 0.2263 1.7096 0.2215 1.7570 Zbn X Apr 0.2875 1.2392 0.1253 3.4899 0.2426 1.5611 Pez X Mac 0.1647 2.5352 0.2005 1.9935 0.1769 2.3262 Pez X Apr 0.2556 1.4561 0.0938 4.8299 0.2126 1.8523 Mac X Apr 0.1061 4.2127 0.1172 3.7669 0.1098 4.0533 Global 0.2672 1.3714 0.2160 1.8145 0.2519 1.4851 93 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Figura 1: Área de estudo abrangendo as populações de Recife (Açude da Prata – Apr) e Igarassu dentro do triângulo azul (Zambana - Zbn, Pezinho - Pez e Macacos - Mac). A seta grande vermelha indica uma distância aproximada entre as populações de Recife e Igarassu de aproximadamente 35 Km. Nas populações de Igarassu as setas amarelas apontam para a distância de aproximadamente em 12 Km entre Pezinho e Zambana, 4 Km entre Pezinho e Macacos e 8 Km entre Macacos e Zambana. 94 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Mic pr 5-Pez Mic pr-4-Pez Mic pr-25-Zbn Mic pr-26-Zbn R-IV 70 Mic pr-21-Zbn G1 Mic pr-23-Zbn Mic pr-24-Zbn 54 R-II 67 Mic pr-1-Pez Mic pr-2-Pez Mic pr-3-Pez Mic pr-5-Mac Mic pr-2-Mac 73 Mic pr-3-Mac Mic pr-6-Pez R-I Mic pr-1-Mac G2 Mic pr-8-Apr Mic pr-9-Apr R-III 53 Mic pr-1-Apr 55 Mic pr-10-Apr 86 Mic pr-2-Apr 0.02 Figura 2. Relações de distância genética gerada a partir do marcador DAF usando o método NJ entre 20 amostras de M. prasina pertencentes às populações: Zbn Pez Mac Apr Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos ramos. Barra: Escala de estimativa da diversidade genética. 95 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Mic pr-24-Zbn 59 81 Mic pr-1-Pez Mic pr-5-Pez Mic pr-4-Pez Mic pr-3-Pez Mic pr-21-Zbn R-IV Mic pr-3-Mac Mic pr-9-Apr 95 G1 Mic pr-10-Apr Mic pr-8-Apr Mic pr-25-Zbn Mic pr-2-Pez R-III Mic pr-23-Zbn Mic pr-6-Pez Mic pr-2-Apr R-II 51 Mic pr-1-Apr Mic pr-5-Mac Mic pr-1-Mac G2 Mic pr-26-Zbn R-I 82 Mic pr-2-Mac 0.02 Figura 3. Relações de distância genética gerada a partir do marcador ISSR usando o método NJ entre 20 amostras de M. prasina pertencentes às populações: Zbn Pez Mac Apr Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos ramos. Barra: Escala de estimativa da diversidade genética. 96 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Mic pr-5-Pez 56 33 Mic pr-4-Pez Mic pr-21-Zbn 57 Mic pr-24-Zbn R-III 29 70 Mic pr-1-Pez Mic pr-23-Zbn 34 Mic pr-25-Zbn 23 48 56 Mic pr-26-Zbn Mic pr-2-Pez G1 Mic pr-3-Pez R-I 20 Mic pr-6-Pez 25 Mic pr-5-Mac Mic pr-8-Apr 14 Mic pr-1-Apr 22 Mic pr-2-Apr 61 Mic pr-9-Apr 65 73 Mic pr-10-Apr Mic pr-3-Mac Mic pr-2-Mac R-II 46 G2 Mic pr-1-Mac 0.02 Figura 4. Relações de distância genética gerada a partir do marcador DAF/ISSR usando o método NJ entre 20 amostras de M. prasina pertencentes às populações: Zbn Apr Pez Mac Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos ramos. Barra: Escala de estimativa da diversidade genética. 97 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... 6. Conclusões O marcador DAF apresentou-se como uma ferramenta eficaz para detectar, de maneira rápida, a variabilidade genética em plantas pioneiras permitindo um melhor entendimento da ecologia e dinâmica populacional e gerando um nível significativo de polimorfismos. As espécies Cyperus odoratus e C. ligularis se apresentaram totalmente distintas, tanto em nível de similaridade genética, quanto diversidade e fluxo gênico populacionais. É sugerido que C. odoratus seja melhor adaptada em ambientes alagados que C. ligularis, o que torna sua ocorrência mais restrita, porém este fato pode contribuir para sua maior variabilidade genética. As populações de C. ligularis provavelmente formam metapopulações sob influência de efeito fundador. É sugerido que a população Macacos apresenta maior potencial adaptativo em relação a mudanças do meio ambiente, visto que foi a população que apresentou o maior índice de diversidade genética (Dg%) global. Os menores índices de diversidade genética (Dg%) global foram observados para as populações Açude da Prata e Pezinho desta forma, é sugerido que estas populações apresentem um menor potencial adaptativo em relação às mudanças do meio ambiente. De acordo com o Dg% próprio a população Macacos foi o mais diverso geneticamente em relação aos demais, possivelmente devido à dinâmica de polinizadores e dispersores, bem como devido às características dos fragmentos estudados. 98 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Através da similaridade genética e da diversidade e fluxo gênico populacionais foi observado que a população Açude da Prata é a mais estruturada entre as populações Zambana, Pezinho e Macacos sendo esta última a que apresenta maior tendência de estruturação entre os estudados na Usina São José. A partir dos valores globais de Gst e Nm, foi observada tendência a estruturação das populações estudadas sendo presente entre estas fluxo gênico histórico, podendo estar correlacionado aos processos de expansão e retração da Floresta Atlântica no Quaternário. 99 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... 7. Abstract The Atlantic Forests have suffered continuous reductions resulting in urgent need of new strategies for its preservation and for the understanding of the fragmentation consequences, especially aiming its preservation. Regarding this scenario, the plant families Cyperaceae and Melastomataceae play an important role, due to its function as pioneers and forest regenerators. The present work aimed to evaluate the genetic diversity and the gene flow among populations of Cyperus ligularis and C. odoratus (Cyperaceae) collected in a urban Atlantic Forest fragment in the Dois Irmãos Reserve (Recife, Pernambuco, Brazil) and surrounding areas. Additionally, populations of Miconia prasina (Melastomataceae) occurring in three Atlantic Forest fragments in an area surrounded by sugarcane plantations (Usina São José, USJ in the city of Igarassu, Pernambuco, Brazil) were also analyzed using DAF (DNA Amplification Fingerprinting) and ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) markers. The generated phenogram using DAF for C. ligularis and C. odoratus separated both species in distinct branches, a segregation supported by 165 interspecific polymorphic marks. Additionally, significant genetic diversity was observed within populations according with Nei Gst index (Gst- 0.3632), correlated to a low gene flow tax, represented by the observed migrant number (Nm- 0.8766). C. odoratus specimens occurred exclusively inside the Dois Irmãos Reserve, bearing larger genetic diversity than that observed among C. ligularis individuals, distributed in Dois Irmãos Reserve as well as in adjacent areas under strong human influence, with a maximal distance of 3 km between collection points. Such results suggested the existence of higher intraspecific and intrapopulational variation for C. odoratus while the lower variability observed in C. ligularis suggested the influence of a possible founder effect as an explanation for its capacity to occupy urban areas subjected to stressing conditions of drought or pollution, limited to a specific combination of genetic factors. Additionally, these individuals have been grouped randomly, suggesting the formation of a metapopulation. For M. prasina 237 DAF and ISSR polymorphic loci have been detected with an estimated global genetic diversity (Dg%) of 91 and 85.5% for DAF and ISSR respectively, with the Macacos fragment (Mac) as the major contributor and the Açude do Prata (Apr) and Pezinho (Pez) fragments as minor contributors, suggesting that Mac have major adaptability potential. The Mac fragment presented a higher intrapopulacional Dg% value, probably due to most effective pollination and dispersion. Considering Apr and Pez lower Dg values indicated that these fragments need additional attention due to their lower diversity and fragility. The generated phenograms indicated genetic structuring for the Apr population as compared to other here analyzed populations, a fact also indicated by the population analyses (Gst and Nm). The global Gst and Nm values for DAF and DAF/ISSR indicated considerable genetic divergence among the analyzed fragments, suggesting that this phenomenon would be consequence of past expansions and retractions of the Atlantic Forest during the Quaternary period, as well as of human pressure. The association of these data with field observations and reproductive biology shall bring a better understanding of the population dynamic in the studied area and also of the participation of these plants in the successive processes. Key words: Fragmentation, population structure, gene flow, DNA fingerprinting. 100 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... 8. Anexo Instructions for Authors Genetics and Molecular Research (GMR) publishes research articles, research reports, technical notes, scientific commentaries, news, views, and review articles with regard to genetics, evolution, molecular biology and bioinformatics. It is an exclusively online journal. The journal is maintained by the not-for-profit scientific foundation Ribeirão Preto Foundation for Scientific Research (FUNPEC-RP). The fee per accepted submission is R$ 700.00 for Brazilian authors and US$400.00 for authors from other countries. The US dollar amount reflects the approximate current foreign exchange rate and is subject to change. This fee covers part of the expenses for final language and technical revision, for page setup, and for publishing online. Payment of the publishing fee should be made by the authors only after receiving a letter of acceptance. After payment is received by our office, the manuscript will be processed further for publication. Payment, both from within or outside Brazil, should be made by bank deposit (Banco do Brasil or Commerce Bank) or by credit card (Visa). Instructions for payment of the publishing fee will be sent together with the letter of acceptance for publication. Please contact the editorial office ([email protected]) if you have any questions. All GMR articles must meet the highest scientific quality standards, both in terms of originality and significance, and the research reported should make substantial advances. As it is a journal serving a wide and varied scientific community, article abstracts, introductions and conclusions should be accessible to the non-specialist, stressing any wider implications of the work. However, the papers should not compromise on the scientific rigor and detail demanded by an international research journal. The broad readership that GMR attracts gives authors an opportunity to convey to a large audience, as well as to specialists, the importance of their work. The journal is currently indexed in over 64 services (see http://www.funpecrp.com.br/gmr/indexers.htm). Contributions should be sent either by e-mail as attachments to [email protected]. It is a fundamental condition that submitted manuscripts have not been published and will not be simultaneously published elsewhere. With the acceptance of a manuscript for publication, the publishers acquire full and exclusive copyright for all languages and countries. The use of registered names, trademarks, etc., in this publication does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations and therefore free for general use. All papers should be prepared in U.S. English. An initial evaluation of the language will be made upon receipt of each manuscript. Those that are considered inadequate for initial review will be returned or sent out for correction, at the discretion of the author. The manuscript will be considered officially received when the corrected version is ready to be sent to the referees. Before final acceptance, a submission letter with the title of the article and names and signatures of all the authors should be posted to the above address or faxed to the journal at 55 (16) 3621-1991. Galley proofs will be sent in “pdf” form via e-mail for final revision. All authors are co-responsible for their submissions and they should make every effort to check the paper before this final step to avoid costly reformatting and possible introduction of new errors. GMR articles have no rigid length restrictions. They should contain sufficient technical detail for an expert reader to understand and assess the methods and results. There is no page limit for GMR articles, but authors should still be concise, for two main reasons. First, our electronic refereeing system relies on e-mail, and very large files occasionally cause problems. Second, lengthy manuscripts can be cumbersome to read and study. Referees tend to dislike them, and they take longer to process. In addition, readers of electronic journals often print articles to read them. Remember that a 10,000-word article takes up around 11 pages. How many pages would you be willing to read on-screen or print out? Editorial policies: Genetics and Molecular Research is a refereed journal. Only original manuscripts will be considered for publication. Manuscripts will be reviewed by at least two independent reviewers before a decision is made on publication. The whole process is conducted electronically to speed progress and final publication. 101 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Papers will be published (placed online) within two months after final acceptance. Papers accepted in their final form from January 1 to March 31 constitute the first issue of each volume, and so on. There are four issues per year. Manuscripts (in U.S. English), together with a cover letter from the author responsible for all correspondence, should be submitted to the Editor at [email protected] in electronic format as .doc files saved in Microsoft Word 97 for Windows, or later version. Do not use formatting such as Word’s “Heading” or “Style Sheets.” Spelling, punctuation, sentence structure, spacing, length, and consistency of usage in form and descriptions should be checked before submission. Please also check references for accuracy. Ensure that all figures and tables are mentioned in the text, and that all references are cited in the text. Figure and table files (see below) should be separate. Submission information Authors are required to provide the following information with their electronic submissions: Article submitted by, Article title, Authors (full list), Article type and session, Status of article (e.g., new, revised, etc.), Postal address, E-mail address, Phone number, Fax number, Names and types of the files sent. Brazilian authors should not translate their institutional addresses. These should remain in the original (Portuguese) language. Revised versions: Authors submitting a revised version of an article, must remember to include a list of changes, and replies to the referees (or technical editor). All the files, not just those revised, for the final draft of paper should be sent. Acknowledgment of electronic submissions: Successful receipt and processing of the author’s submission will be acknowledged by e-mail when the submitted manuscript has been checked. If no reply has been received within one week, the author should contact the editor at [email protected]. Review: Articles are reviewed anonymously by independent referees. Authors are encouraged to suggest names of expert reviewers, but selection remains the prerogative of the editors. To facilitate the review process, the authors can send supplementary material, such as cited accepted but not yet published papers, which may be important for assessment of the manuscript. A review article should contain: an abstract of 250 words or less, no more than 6 key words, a running tittle and no more than 60 references. It should be divided into sections with appropriate tittles and subtitles. Preparation of the manuscript Order the sections comprising the manuscript as follows: title, running title, author, address, abstract, key words, introduction, material and methods, results, discussion, acknowledgments, and references. Title Page: The title page should include the title of the article, authors’ names, and authors’ affiliation. The affiliation should comprise the department, institution (usually university or company), city, and state (or nation). The title page should include the name and complete mailing address, telephone number, fax number, and e-mail address of the author designated to review proofs. The title page should start below the top margin, be single-spaced, and have no space left before the Summary/Abstract. A running title of no more than 60 characters (including spaces) should be provided. Abstract: An abstract of up to 250 words, single-spaced, is required of research articles and reports and should be arranged in one paragraph. The following information (without headings) should be included: purpose, methods, results, and conclusions. Review articles also require an abstract, which need not include all of these items. Key words: A list of key words or indexing terms (up to six) should be included. Text Format: Headings should be bold, first letters capitalized and left-aligned. All text should be set in Times New Roman font, 12 point, left-aligned, single-spaced. Do not justify the right margin. Leave only one (1) space after periods. Paragraphs should not be indented; there should not be any blank lines between them. Use line returns only at the end of paragraphs. Do not use tabs or spaces to create indents. Use the Symbol font for symbols and special characters. Do not use equation editors or footnoting utilities. Save equations as images. Equations should be numbered consecutively with Arabic numerals in parentheses on the right hand side of the page. Footnotes: Footnotes should be avoided. When their use is absolutely necessary, footnotes should be numbered consecutively using Arabic numerals and should be placed at the bottom of the page to which they refer. Place a line above the footnote, so that it is set off from the text. Tables/Charts: Special care should be taken to ensure that all tables are properly formatted. Scientific symbols used should be in Symbol or Times New Roman. Tables should be on a separate page, numbered consecutively (with Arabic numerals) referred to by number in the text and designed to fit the column or page size of the journal. Use tables with cells to separate columns. Do not use spaces, tabs or vertical lines. Left justify the title above the table. 4 102 CRUZ, G.A.S. Diversidade genética populacional nas espécies pioneiras Cyperus ligularis L. ... Indicate each table’s location within the manuscript. Illustrations: Illustrations/figures (photographs, drawings, diagrams, and charts) should each be in a single file, numbered in a consecutive series of Arabic numerals in the order in which they are cited in the text. Illustrations must be submitted as separate files. All illustrations are to be supplied in JPEG (jpg) format in either color or black and white. Images must be saved as separate, stand-alone files. The image resolution should be 300 dpi. Do not embed images within the text file. The placing of graphics in the paper should be indicated in the text and should include the captions for the figures. The authors should also send, by mail, a printed version of the figures. These should be at least 10 x 15 cm, up to US letter size, so that figures can be scanned to guarantee good quality for publishing online. Abbreviations: Try to use abbreviations in the text sparingly. Write out abbreviations in full the first time they are cited in text. Use the metric system for all measurements without periods (cm, mL, s). Define all symbols used in equations and formulas. Do not abbreviate the word “Figure” or “Table” in titles or text. Acknowledgments: All acknowledgments (including those for grant and financial support) should be typed in one paragraph directly preceding the reference section. Authors of manuscripts submitted to GMR are requested to state the source of all funding that enabled the described research to be undertaken. Reference: References in the text should include the name of the author and the year in parentheses, e.g. (Searle, 1961) or (King and Wilson, 1975). When a reference with more than two authors is cited, only the first author is named, e.g., (Comstock et al., 1958). The references must be cited in the text in chronological order, e.g., (Ideber, 2001; Uetz, 2002; Ottavai, 2004). References to “unpublished results” and “submitted papers” should appear in the text in parentheses following the name(s) of the individual(s). Example: (Pereira KS, Martins PK and Silva TM, unpublished results). No more than 40 references should be cited in a Full-length paper, 20 references in a Short Communication and 60 references in a Review article. Reference, under the heading “References”, should include only works referred to in the text. It should be arranged in alphabetical order under the first author’s last name. References should be cited as follows: journal papers - names and initials of the first four authors (after that using et al.), year, full title, journal abbreviated according to Index Medicus or I.S.I. web of science, volume number, first and last page numbers; books - names of authors, year, full title, edition, publishers, address (city); articles published in symposia - names of authors, year, full title of book, name(s) of editor(s) in parentheses, publisher, address (city), first and last page numbers. The references should consist of indexed articles only. References for techniques that are essential for understanding or repeating the methodology should always be in easily accessible journals. Reference style: The list of references at the end of the paper should follow the format requested by GMR. The link below can be accessed to see how the references should appear. Examples of reference style 103
