universidade federal da paraíba centro de ciências

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR
JAÍSE PAIVA BRAGANTE DE ARAÚJO
ANÁLISE DE POLIMORFISMO DO GENE GSTP1 EM CÂNCER GÁSTRICO
JOÃO PESSOA, PARAÍBA
2013
2
JAÍSE PAIVA BRAGANTE DE ARAÚJO
ANÁLISE DE POLIMORFISMO DO GENE GSTP1 EM CÂNCER GÁSTRICO
Monografia apresentada ao Curso de
Ciências Biológicas (Trabalho Acadêmico de
Conclusão de Curso), como requisito parcial
à obtenção do grau de Bacharel em Ciências
Biológicas da Universidade Federal da
Paraíba.
Orientador: Prof. Dr. Eleonidas Moura Lima
João Pessoa, Paraíba
2013
3
JAÍSE PAIVA BRAGANTE DE ARAÚJO
ANÁLISE DE POLIMORFISMO DO GENE GSTP1 EM CÂNCER GÁSTRICO
Monografia
apresentada
ao
Curso
de
Ciências Biológicas, como requisito parcial à
obtenção do grau de Bacharel em Ciências
Biológicas
Data: 26 de abril de 2013
Resultado: ____________________________
BANCA EXAMINADORA:
Orientador: Prof. Dr. Eleonidas Moura Lima
Universidade Federal da Paraíba/ CCEN
Prof. Dr. Clayton Zambeli Oliveira
Universidade Federal da Paraíba/ CCEN
Profª. Drª. Hilzeth de Luna Freire Pessôa
Universidade Federal da Paraíba/ CCEN
4
AGRADECIMENTOS
A meus pais Anísio e Jaidete, meu irmão Igor, meus avós Clênia e João, minha
tia Juliene e todos os meus familiares e amigos, pelo apoio e motivação.
Ao professor Eleonidas Moura Lima, pela orientação e disponibilidade; aos
colegas do laboratório Cynthia, Rubistênia, Talitta, Juarez e João, pela imensa ajuda,
paciência, ensinamentos e convivência.
Aos membros da banca, os professores Clayton e Hilzeth, que aceitaram julgar
o meu trabalho e me ajudar a crescer cada vez mais.
A todos os professores da graduação que foram importantes para a construção
dos meus conhecimentos e possibilitaram o alcance de meu objetivo. Aos meus
colegas e amigos de graduação que compartilharam desafios e conquistas, desde 2009.
Aos coordenadores do curso de Ciências Biológicas, em especial, Eliete,
sempre solícita; sem sua ajuda seria impossível chegar até aqui.
A todos que fazem parte do Departamento de Biologia Molecular e do Centro
de Ciências Exatas e da Natureza.
5
RESUMO
O câncer gástrico ocorre no estômago e é a segunda causa de morte mais
comum em todo o mundo, tendo como principal fator de risco a infecção pela bactéria
Heliobacter pylori. Enzimas responsáveis pelo metabolismo dos xenobióticos podem
exercer um papel fundamental no desenvolvimento do câncer, visto que os
xenobióticos são mutagênicos em potencial. Um polimorfismo simples, de troca de um
nucleotídeo, pode fazer com que uma enzima diminua ou perca sua função, causando
desequilíbrios e, dependendo de que processo esta enzima participe, alterações nos
controles de crescimento e morte celular, conduzindo à carcinogênese. Polimorfismos
nas enzimas envolvidas no metabolismo de xenobióticos, como a GSTP1, vêm sendo
estudados na busca pela associação com o desenvolvimento do câncer. Este trabalho
teve como objetivo investigar a associação entre um polimorfismo de base única que
causa uma troca de Isoleucina para Valina, e o desenvolvimento de câncer gástrico. Há
evidências de que a atividade catalítica das enzimas codificadas por estas variantes
encontra-se alterada, influenciando, assim, na susceptibilidade ao câncer. Este estudo
analisou amostras de DNA de 23 indivíduos que desenvolveram câncer gástrico do
tipo intestinal. Foram utilizadas técnicas de PCR Alelo Específica e Eletroforese em
gel de Poliacrilamida para análises moleculares. Não foram encontradas associações
estatisticamente significativas das variantes genéticas com o câncer gástrico.
Palavras-chave: Genética, Oncogenética, Câncer Gástrico, Polimorfismo, GSTP1.
6
ABSTRACT
Gastric cancer occurs in the stomach and is the second most common cause of
death around the world, with the infection by the bacteria Helicobacter pylori as main
risk factor. Enzymes responsible for xenobiotics metabolism may play a key role in
cancer development, since xenobiotics are potentially mutagenic. A Single Nucleotide
Polymorphism can make an enzyme reduces or loses its function, causing imbalances,
and depending on which enzyme participates this process, changes the control of
growth and cell death, leading to carcinogenesis. Polymorphisms in enzymes involved
in the metabolism of xenobiotics, as the GSTP1, have been studied in the search for
association with the development of cancer. This study aimed to investigate the
association between a polymorphism that causes a single base exchange of isoleucine
to valine and the development of gastric cancer. There is evidence that the catalytic
activity of the enzymes encoded by these variants are altered, thus influencing in
cancer susceptibility. This study analyzed DNA samples from 23 individuals who
developed intestinal type gastric cancer. Were used Allele Specific PCR and
polyacrylamide gel electrophoresis techniques for molecular analysis. There were no
statistically significant associations between genetic variants and gastric cancer.
Keywords: Genetics, Oncogenetics, Gastric Cancer, Polymorfisms, GSTP1.
7
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: TNM Patológico ..................................................................................... 16
TABELA 2: Amostras de câncer gástrico do tipo intestinal e informações clínicas dos
pacientes diagnosticados ............................................................................................. 22
TABELA 3: Iniciadores utilizados para amplificação do fragmento específico em
estudo (TA = Temperatura de anelamento; TFA = Tamanho do fragmento
amplificado; pb = Pares de bases) ............................................................................. 24
8
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Representação esquemática das partes e curvaturas do estômago ........ 14
FIGURA 2: Conjugação da glutationa (GSH) a um xenobiótico por ação da GST
resultando na formação da glutationa-S- conjugado ................................................. 18
FIGURA 3: Centrífuga ................................................................................................ 23
FIGURA 4: Termociclador Bio-Rad® ........................................................................ 25
FIGURA 5: Fonte Bio-Rad® e Cuba Loccus® Biotecnologia para Eletroforese ...... 26
FIGURA 6: Fotografia do Gel de Poliacrilamida das amostras 22, 23, 26, 27 e 28.
Onde não aparece a segunda banda, relativa ao alelo G, considera-se o genótipo
homozigoto para AA ................................................................................................... 27
9
SUMÁRIO
RESUMO .......................................................................................................... 5
ABSTRACT ...................................................................................................... 6
LISTA DE TABELAS ...................................................................................... 7
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... 8
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................... 11
1.1
O CÂNCER ..................................................................................................... 11
1.2
O CÂNCER GÁSTRICO ................................................................................ 12
1.2.1 Epidemiologia .................................................................................................. 12
1.2.2 Localização ...................................................................................................... 13
1.2.3 Tipos ................................................................................................................ 14
1.2.4 Fatores de Risco .............................................................................................. 14
1.2.5 Sintomas, Diagnóstico e Tratamento ............................................................... 15
1.2.6 Estadiamento do Câncer Gástrico e Sistema TNM ......................................... 16
1.3
TRANSFERASE-S DA GLUTATIONA (GST) ............................................. 17
1.3.1 POLIMORFISMO DO GSTP1 ....................................................................... 19
2
JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 20
3
OBJETIVOS .................................................................................................... 21
3.1
GERAL ............................................................................................................ 21
3.2
ESPECÍFICOS ................................................................................................ 21
4
METODOLOGIA ............................................................................................ 22
4.1
ASPECTOS ÉTICOS ...................................................................................... 22
4.2
AMOSTRAS ................................................................................................... 22
4.3
EXTRAÇÃO DO DNA ................................................................................... 23
4.4
VALIDAÇÃO IN SÍLICO .............................................................................. 24
4.6
ALELO ESPECÍFICO PCR (AE-PCR) .......................................................... 24
4.6
ELETROFORESE ........................................................................................... 25
4.7
ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................. 26
5
RESULTADOS ............................................................................................... 27
10
6
DISCUSSÃO ................................................................................................... 28
7
CONCLUSÃO ................................................................................................. 30
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 31
11
1
INTRODUÇÃO
1.1
O CÂNCER
Toda a célula tem um conjunto de informações que controla a forma como
cresce e se comporta. O câncer ocorre quando há alterações nestas informações e a
célula passa a crescer e se multiplicar descontroladamente. Este processo de
transformação progressiva de células normais em malignas é denominado
carcinogênese (HANAHAN & WEINBERG, 2000).
Há muitas razões pelas quais isso pode ocorrer. Alterações epigenéticas que
regulam a atividade protéica, mutações que se acumulam ao longo do tempo, fatores
externos, como xenobióticos que interagem com o DNA ou radiação. Vírus e
infecções bacterianas também são capazes de modificar o código genético, originando
alterações irreversíveis e tumorigências. Quando as alterações carcinogênicas são
herdadas, caracterizam uma predisposição daquele indivíduo ao desenvolvimento de
câncer.
Os polimorfismos, por sua vez, são variações de sequencia do DNA (alelos)
presentes numa população e também podem caracterizar uma predisposição à
carcinogênese ou alteração de proteínas críticas. Os de nucleotídeo simples, ou Single
nucleotide polymorphisms (SNPs) são a forma de variação sequencial mais comum no
genoma, representando cerca de 90% dos polimorfismos de DNA humano.
(BROOKES, 1999).
O sucesso da carcinogênese depende de quais proteínas terão suas funções
alteradas devido às mutações, polimorfismos ou alterações epigenéticas. São várias as
que controlam o ciclo celular, a morte celular programada, a reparação do DNA
durante o ciclo celular, a fixação das células no tecido. É uma perda ou alteração de
função nestas proteínas críticas que dá início à transformação da célula (BREIVIK,
2005).
Duas classes de genes foram identificadas de acordo com as suas funções em
relação à carcinogênese: oncogenes e genes supressores de tumor. As mutações
carcinogênicas agem de certa forma a promover o crescimento celular ativando
oncogenes e inibir o controle deste crescimento desativando genes supressores de
tumor (HANAHAN & WEINBERG, 2000; BREIVIK, 2005).
12
Outros genes envolvidos com a progressão do tumor são os genes de reparo,
que atuam durante o ciclo celular evitando e corrigindo possíveis erros de transcrição
de DNA. São os responsáveis pela estabilidade genética e falhas no reparo destes erros
de transcrição podem acumular-se, alterando o equilíbrio celular (ALBERTS et al.,
2004).
Uma vez transformada, a célula passa a multiplicar-se, formando um
aglomerado de células chamado tumor. Um tumor sofre pressão do ambiente tecidual
para ser eliminado, tanto através de sinalização celular para a morte quanto ataques do
sistema imunológico. O tumor precisa evadir a estes sinais, manter sempre uma fonte
de nutrição, conseguir desprender-se do tecido e invadir outros (metástase).
(HANAHAN & WEINBERG, 2000). Quando ocorre a metástase, o tumor é
considerado maligno, denominando-se câncer.
Após o diagnóstico, o câncer é classificado de acordo com o tecido de origem,
podendo ser Carcinoma (células epiteliais), Sarcoma (tecido conjuntivo), Leucemia
(células hematopoiéticas) ou tumor do sistema nervoso (WEINBERG, 2008). O
diagnóstico ainda é complicado e muitas vezes tardio. A medicina caminha para
diagnósticos mais precisos e particulares, baseados no padrão genético de cada
indivíduo.
1.2
O CÂNCER GÁSTRICO
1.2.1 Epidemiologia
A incidência do câncer do estômago está diminuindo nos países desenvolvidos,
mas é alta nos países em desenvolvimento. Esta incidência aumenta com a idade e é
maior no homem. O câncer do estômago era o mais incidente do mundo nos anos 80,
mas atualmente perde para os tumores de pulmão (KASSAB & LEME, 2003).
O Câncer Gástrico (CG) é a segunda causa de morte mais comum ao redor do
mundo (FERLAY et al, 2010). A alta mortalidade é registrada atualmente na América
Latina, principalmente na Costa Rica, Chile e Colômbia. Porém, o maior número de
casos ocorre no Japão, onde são encontrados 780 doentes por 100.000 habitantes. A
Sociedade Americana de Câncer estimou para câncer gástrico nos Estados Unidos,
neste ano, aproximadamente 21.600 casos serão diagnosticados e 10.990 pessoas
morrerão deste tipo de câncer.
13
No Brasil, as estatísticas do Instituto Nacional de Câncer – INCA para 2012
estimaram 12.670 casos novos de CG em homens e 7.420 em mulheres. Esses valores
correspondem a um risco estimado de 13 casos novos a cada 100 mil homens e 7 a
cada 100 mil mulheres (INCA, 2012).
O CG em homens é o segundo mais frequente nas regiões Norte e Nordeste e o
quarto nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste. Para as mulheres, ocupa a quarta
posição na região Norte, quinta na região Centro-Oeste e a sexta nas regiões Sudeste,
Sul e Nordeste (INCA).
A sobrevida geral em cinco anos do CG é baixa, variando entre 10% e 20%
(GONZALEZ et al, 2002; FAIVRE et al., 1998; BERRINO et al., 1999). Esta continua
sendo uma doença de prognóstico ruim e alta mortalidade, atrás apenas do câncer de
pulmão como a maior causa de morte relacionada a câncer do mundo. Em geral, países
com maiores incidências de CG apresentam melhores taxas de sobrevivência que
países com incidências menores (CREW & NEUGUT, 2006).
1.2.2 Localização
O CG origina-se no estômago, órgão muscular e glandular em forma de saco,
responsável pelo armazenamento do alimento mastigado e ingerido e pelo início da
digestão através da secreção de sucos gástricos. A mistura de alimento e suco gástrico
é despejada no duodeno, primeiro segmento do intestino.
O estômago possui cinco partes: cardia, fundo, corpo, antro e piloro (Figura 1).
As três primeiras partes formam o estômago proximal, cujas células produzem ácidos
e pepsinas. As duas últimas partes são chamadas de estômago distal. O estômago tem
duas curvas, formando as bordas internas (curvatura menor) e externas (curvatura
maior).
São cinco as camadas do estômago. Na mucosa, a camada mais interna, são
sintetizadas enzimas digestivas e ácido. Os cânceres gástricos na quase totalidade
iniciam-se nesta camada. Seguindo em direção à camada mais externa, temos a
submucosa e a musculares propria, camada grossa de musculatura responsável pelos
movimentos peristálticos. As camadas mais externas, subcerosa e cerosa, envolvem o
órgão. As camadas são importantes para o diagnóstico do câncer, uma vez que este
cresce da mucosa para as camadas mais externas (Amercian Cancer Society, 2013).
14
Figura 1: Representação esquemática das partes e curvaturas do estômago. Retirada de:
http://ruirodrigues.net/radioterapia/images/stories/estomago.jpg
1.2.3 Tipos
De acordo com a localização, podemos identificar os seguintes tipos:
Adenocarcinoma, quando se originam do tecido glandular estomacal, localizado na
mucosa. Aproximadamente 90% dos casos são adenocarcinomas (DIMITRIOS et al,
2002).
Os outros 10% estão divididos entre linfomas gástricos e sarcomas. Linfomas
quando trata-se do câncer no tecido linfático próximo ao estômago, e sarcomas quando
ocorre nas células musculares do órgão (DIMITRIOS et al, 2002).
1.2.4 Fatores de risco
Estudos comparativos entre orientais e ocidentais sugerem origem étnica um
possível fator de risco (DAVIS & TAKESHI, 2001; GORE, 1997; PRANKIN et al.,
1997). Por outro lado, fatores ambientais podem superar a baixa incidência de uma
determinada etnia (GORE, 1997). Ramon et al. (1993) identificaram a dieta rica em
sal, o tabagismo ou alimentos mal preservados, nitratos, nitritos e amino-secundários
como associados a um aumento do risco de CG.
Os CG apresentam ocorrência esporádica, estima-se que apenas de 8% a 10%
possuem um componente familiar herdável (LA VECCHIA et al., 1992). Foram
identificadas algumas proteínas críticas que estão mutadas em indivíduos que
desenvolveram CG: a proteína p53, do ciclo celular, BRCA2, E-cadeirina, responsável
15
pela adesão celular (FENOGLIO et al. 2000; HUNTSMAN et al., 2001; ASCANO et
al., 2001; DUSSAULX-GARIN et al., 2001; MACHADO et al., 1999).
Existem síndromes que funcionam como uma predisposição do indivíduo
portador ao desenvolvimento de CG. Como exemplo, temos o Câncer colorretal nãopoliposo hereditário, a Polipose adenomata familiar (FAP), Síndrome de Cowdens,
Síndrome de Peutz-Jeghers (BEVAN & HOULSTON, 1999).
O maior fator de risco para o desenvolvimento do CG, porém, é a infecção
através da bactéria Heliobacter pylori. Esta bactéria causa uma inflamação ativa
crônica da mucosa gástrica na maioria dos infectados, seguida de perda das glândulas
gástricas e estabelecimento de gastrite atrófica. Em resposta a este estresse, as células
sofrem metaplasia e erros constantes no código genético, resultando em câncer
gástrico. (KUIPERS, 1999). H. pylori também pode agir através de outros
mecanismos, como hiperproliferação das células gástricas e interferência nas funções
antioxidantes (GONZALEZ et al., 2002).
1.2.5 Sintomas, Diagnóstico e Tratamento
Os principais sintomas são: dor abdominal, fezes escuras, dificuldade para
deglutir, declínio geral na saúde, perda de apetite, náusea e vômito, vômito de sangue,
fraqueza ou cansaço e perda de peso (NATIONAL CANCER INSTITUTE, 2010).
A Endoscopia ainda é o método de diagnóstico mais sensível, permitindo a
visualização direta da localização do tumor, extensão da mucosa afetada e retirada de
amostra para biópsia. Quando combinada com modalidades radiológicas, pode
maximizar a identificação do estádio tumoral por prover informações a respeito da
profundidade de invasão tumoral (KARPEH & BRENNAN, 1998; SADOWSKI &
RABENECK, 1997; DICKEN et al., 2005).
A remoção cirúrgica do estômago (gastrectomia) é o único tratamento curativo.
A radioterapia e a quimioterapia auxiliam, mas não garantem a cura (RUSTGI, 2007;
GUNDERSON et al., 2008)
No intuito de facilitar a identificação e prognóstico dos pacientes, tanto quanto
estudos epidemiológicos e patogênicos, surgiram as classificações para os vários
cânceres, inclusive o gástrico. A classificação de Laurén, primeiro descrita em 1965,
divide o CG em dois tipos de acordo com a aparência histológica: o Tipo Intestinal
16
assemelha-se com o câncer de cólon e é precedido por uma gastrite crônica; O Tipo
Difuso, por sua vez, ocorre apenas no estômago, incide em pacientes mais jovens e
inicia-se numa mucosa comum – este tipo é o mais maligno (LAURÉN, 1965).
Definir o estadiamento do tumor é outra forma de classifica-lo, nesse caso em
inicial ou avançado, permitindo-se conhecer as chances de sobrevivência do paciente.
O estádio da doença, na ocasião do diagnóstico, pode ser um reflexo não somente da
taxa de crescimento e extensão da neoplasia, mas também do tipo de tumor e da
relação tumor-hospedeiro (INCA, 2004).
1.2.6 Estadiamento do Câncer Gástrico e Sistema TNM
Após diagnóstico do câncer gástrico, a determinação do estadiamento da
doença é fundamental para a tomada de decisão terapêutica. O sistema mais utilizado
para se realizar o estadiamento do câncer gástrico é o TNM, proposto pela UICC
(União Internacional Contra o Câncer), o qual se apoia em três componentes: T- a
extensão do tumor primário na parede gástrica, N- ausência ou presença e extensão das
metástases em linfonodos regionais e M- ausência ou presença de metástases à
distância (UICC, 2011).
Tabela 1: TNM Patológico (UICC, 2011)
TX
T0
Tis
T1
T2
T2a
T2b
T3
T4
NX
N0
N1
N2
N3
MX
M0
M1
Tumor Primário (pT)
Tumor primário não pode ser avaliado
Sem evidência de tumor primário
Carcinoma in situ
Tumor invade a lâmina própria ou submucosa
Tumor invade a muscular própria ou suberosa
Tumor invade a muscular própria
Tumor invade subserosa
Tumor invade a serosa sem invadir estruturas adjacentes
Tumor invade estruturas adjacentes
Linfonodos Regionais (pN)
Linfonodos regionais não podem ser avaliados
Sem metástase para linfonodos regionais
Metástase em 1 a 6 linfonodos regionais
Metástase em 7 a 15 linfonodos regionais
Metástase em mais de 15 linfonodos regionais
Metástase a Distância (pM)
Presença de metástase a distância não pode ser avaliada
Sem metástase a distância
Com metástase a distância
17
Essas classificações são meramente descritivas, não abrangendo os aspectos
etiológicos e anomalias genéticas (KUIPERS, 1999). Após a conclusão do projeto
genoma, a pesquisa médica do câncer tomou outro rumo, sendo importante hoje a
identificação dos genes envolvidos na tumorigênese, como eles interagem e quais os
papéis das proteínas por eles codificadas nas vias moleculares (RYU et al, 2003).
Desta forma, é possível identificar as particularidades de cada câncer e oferecer
tanto um diagnóstico quanto um tratamento personalizado de acordo com a genética
individual do paciente. Este trabalho investiga um gene que possa ter relação com o
CG, visando a soma de conhecimentos a respeito deste câncer e possíveis alvos
genéticos para tratamento.
1.3
TRANSFERASE-S DA GLUTATIONA (GST)
A Transferase-S da Glutationa ou Glutationa s-transferase (GST) é uma
proteína associada ao câncer, uma vez que protege os tecidos contra danos oxidativos,
tendo uma via de detoxificação para vários xenobióticos incluindo carcinogênicos
(PICKETT, 1989), está superexpresso em lesões preneoplásicas e neoplásicas
(HARRIES et al, 1997), e é relacionado com a resposta à quimioterapia (STRANGE
et al, 2000). Significa, portanto, um interessante alvo gênico para os estudos sobre o
câncer.
As GST são parte de um complexo grupo de proteínas com duas superfamílias
distintas: a citosólica e a associada à membrana. A superfamília GST, como são
denominadas as citosólicas, são solúveis e possuem 8 famílias: GSTA, M, P, S, T, Z,
O
e K. As associadas à membrana são denominadas MAPEG (SHERRATT &
HAYES, 2001).
O metabolismo de químicos exógenos (carcinógenos, poluentes e drogas
anticâncer); detoxificação de componentes reativos endógenos (função anti-oxidante)
e síntese e inativação das prostaglandinas (SHERRATT & HAYES, 2001).
Recentemente, foi descoberto um papel não enzimático na sinalização celular,
regulando vias de proliferação e morte celular programada (LABORDE, 2010).
O metabolismo dos xenobióticos acontece em dois momentos ou fases. Na fase
I, são oxidados por enzimas específicas, aumentando sua reatividade e potencialidade
de interação. Na fase II, esta reatividade é equilibrada por enzimas que fazem a
18
conjugação entre substratos endógenos, como as glutationas. A quantidade final
efetiva de carcinógenos produzida depende da ação competitiva entre os mecanismos
de ativação e detoxificação, envolvendo as enzimas que tomam parte nessas vias
bioquímicas da célula (HAYES, 1995) (Figura 2).
Figura 2: Conjugação da glutationa (GSH) a um xenobiótico por ação da GST resultando na
formação da glutationa-S- conjugado (CORREIA, 2010).
Na fase I, compostos xenobióticos como as nitrosamidas, várias drogas
medicamentosas e os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs) são convertidos
a metabólitos altamente reativos pelas enzimas oxidativas, principalmente pelas
enzimas da superfamília do citocromo P-450 (CYPs). Assim, se introduz grupamentos
hidroxila ao substrato, aumentando a capacidade reativa e transformando um prócarcinógeno em carcinógeno. Como exemplo, o benzopireno é convertido em epóxido
de benzopireno, um composto altamente reativo.
Por outro lado, as reações da Fase II conjugam um substrato endógeno (como
glutationa, sulfato, glicose e acetato) através das glutationa-Stransferases (GSTs),
UDP-glucoroniltransferases e N-acetiltransferases (NATs), que agem então como
enzimas inativadoras dos produtos da Fase I, tornando tais metabólitos mais
hidrofílicos e, portanto, passíveis de excreção (UMENO et al., 1988; PERSSON et al.,
1993; BOIS et al., 1995; KROEMER & EICHELBAUM, 1995; RAUNIO et al.,
1995).
A proteína abordada especificamente neste estudo é a Glutathiona S-transferase
P1 (GSTP1), que além da supracitada função antioxidante, participa da sinalização
celular e da regulação das vias que controlam a proliferação celular e a apoptose. Ou
seja, GSTP também pode contribuir para o escape da célula da morte, por isso está
19
superexpressa em tumores resistentes às drogas, tendo em vista que algumas drogas
utilizam-se da via apoptótica para agir (LABORDE, 2010).
O gene GSTP1 pertence à classe pi da família gênica, localizada no
cromossomo 11q13, o único membro desta classe a ser expresso em humanos
(AUTRUP, 2000; HARRIS et al., 1998). Estende-se por 2.48kb de DNA e
compreende 7 éxons (MORROW et al, 1989 e BORA et al., 1997), os quais codificam
a enzima citosólica.
1.3.1 Polimorfismo do GSTP1
Nos últimos anos, SNPs ocuparam o lugar dos microssatélites como
marcadores em estudos do DNA humano (MILLER et al., 2005; SABETI et al., 2007).
Estudos recentes sugerem que a análise dos SNPs pode lançar luz na compreensão dos
mecanismos envolvidos na carcinogênese gástrica (EL-OMAR et al, 2001). Vários
xenobióticos que influenciam na etiologia de doenças são ativados ou desativados por
enzimas polimórficas, entre elas, as GSTs (DALY et al., 1993).
O presente trabalho aborda uma transição A-G (rs1695) no éxon 5 do gene
GSTP1, causando uma mudança do aminoácido Isoleucina para Valina no resíduo
105. Esta troca reduz a atividade catalítica dessa enzima (KATOH et al., 1999).
20
2.
JUSTIFICATIVA
O Projeto Genoma transferiu as atenções para a variação genética individual e
sua capacidade de definir variabilidade em predisposição a doenças assim como um
novo alvo para tratamentos (DASGUPTA et al., 2003).
Diferenças interindividuais como essas em mecanismos celulares de ativação
ou detoxificação de químicos potencialmente carcinogênicos, podem conferir diversos
graus de susceptibilidade ao câncer (VAN IERSEL et al., 1999).
Informações obtidas a partir de estudos como este se referem à genética
populacional, e são importantes para o entendimento do genótipo de uma população de
um determinado local, sob determinadas influências do meio ambiente, podendo-se
inferir fatores e causas que levaram estes indivíduos a desenvolver o câncer em
questão.
21
3.
OBJETIVOS
3.1
GERAL
Analisar a associação do polimorfismo genético do gene GSTP1 (rs1695) à
carcinogênese gástrica.
3.2
ESPECÍFICOS
o Identificar os genótipos e frequências gênicas de uma população de
indivíduos que desenvolveram câncer gástrico;
o Comparar os valores observados com os esperados, calculados através
do Equilíbrio de Hardy-Weinberg;
o Validar estatisticamente estas comparações utilizando o teste Quiquadrado;
o Interpretar se estes resultados significam associação entre o
polimorfismo e o desenvolvimento do câncer.
22
4.
METODOLOGIA
4.1
ASPECTOS ÉTICOS
Atendendo à Resolução nº 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (Ministério
da Saúde, 2003), que trata das normas para pesquisa envolvendo seres humanos, este
projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (CEPHC-FMRP) e à Comissão Nacional de
Ética em Pesquisa (CONEP), em Brasília. O presente trabalho foi avaliado e aprovado
pelo CEPHC-FMRP sob o número 12479/2004 (Anexo I).
Os pacientes, ou seus responsáveis legais foram informados a respeito da
utilização das amostras e seu objetivo, tendo assinado um Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE). As amostras ocultam a identidade dos pacientes.
4.2
AMOSTRAS
Neste estudo foram analisadas 23 amostras de câncer gástrico do banco de
amostras do Laboratório de Biologia Molecular Estrutural e Oncogenética – LBMEO
(Tabela 2). Os indivíduos dos quais se retiraram amostras de câncer foram
diagnosticados com o tipo histopatológico intestinal, de acordo com a classificação de
Laurén (LAURÉN, 1965).
Tabela 2: Amostras de câncer gástrico do tipo intestinal e informações clínicas dos
pacientes diagnosticados.
Amostra
Idade
Sexo
Estadiamento
3
5
6
7
10
11
12
13
17
18
22
23
26
27
28
29
72
47
42
57
60
61
49
62
70
49
71
73
66
59
72
64
Feminino
Masculino
Masculino
Masculino
Masculino
Feminino
Masculino
Masculino
Masculino
Feminino
Masculino
Feminino
Masculino
Masculino
Feminino
Feminino
T3N2
T3N2
T3N0
T2N2Mx
T3N1Mx
T3N1
T2N0
T3N1
T3N1Mx
T2N0
T3N1
T3N1
T2N0
T2N1
T3N0
T3N1
23
30
33
37
47
49
211
216
4.3
56
54
63
59
63
71
59
Masculino
Masculino
Masculino
Masculino
Feminino
Masculino
Masculino
T4N1
T3N0
T3N0
T2N1
T3N1Mx
T3N1
T2N1
EXTRAÇÃO DO DNA
Os procedimentos de extração do DNA foram realizados no Laboratório de
Biologia Molecular Estrutural e Oncogenética (LBMEO), localizado ao Departamento
de Biologia Molecular (DBM) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João
Pessoa, Paraíba.
Aproximadamente 1cm3 de tecidos neoplásicos foram macerados e
criopreservados em nitrogênio líquido a -196ºC. Após a pulverização, foram
centrifugadas (Figura 2) as amostras com 5 mL de tampão de extração (Tris 1M;
EDTA 0,5 M; NaCl 5 M), 50 µL de proteinase K (10 mg/mL) e 0,5 mL de SDS 20%
até obtenção de uma mistura homogênea. Posteriormente, incubou-se em banho-maria
a 37ºC overnite.
Figura 3: Centrífuga (Foto: Anísio Henriques, 2013)
Adicionou-se 5 mL de fenol/ clorofórmio/ álcool isoamílico (25:24:1) e
homogeneizou-se suavemente por cinco minutos. Esta solução homogênea foi
centrifugada a 3000 rpm durante 10 minutos, transferindo-se o sobrenadante para
24
outro tubo, adicionando-se 3 mL de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e
homogeneizando-se mais uma vez durante cinco minutos.
Por último, retirou-se o sobrenadante e adicionou-se 7.5 M de acetato de
amônio, equivalente a um terço do volume do sobrenadante e um volume de etanol
absoluto, correspondente a três vezes o volume do sobrenadante.
Agitou-se o frasco até a precipitação do DNA, este posteriormente lavado em
etanol absoluto e ressuspendido em 100-500 L de água Milli-Q estéril. Estocaram-se
as amostras a -20ºC.
4.4
VALIDAÇÃO IN SÍLICO
Para desenhar os primers, utilizou-se o banco de dados Ensembl Genome
Browser, disponível online, onde se encontra descrito o genoma humano. A
temperatura de anelamento, formação de estrutura secundária e tamanho do fragmento
amplificado foram analisados pelo programa Gene Runner (Versão 3.05, 1994
Hastings Software Inc.) (Tabela 3). Os dados foram enviados para síntese em
Integrated DNA Technologies - IDT®, Estados Unidos.
Tabela 3: Iniciadores utilizados para amplificação do fragmento específico em estudo (TA =
Temperatura de anelamento; TFA = Tamanho do fragmento amplificado; pb = Pares de bases).
Gene
Sequências dos iniciadores
TA (ºC)
TFA (pb)
56ºC
71 pb
F1: 5’ -AGG ACC TCC GCT GCA AAT ACA- 3’
GSTP1
F2: 5’-AGG ACC TCC GCT GCA ATT ACG- 3’
R: 5’-GTG CCC AAC CCT GGT GCA- 3’
4.5
ALELO ESPECÍFICO PCR (AE-PCR)
A técnica AE-PCR consiste em desenhar iniciados específicos para os diferentes
polimorfismos, ela apresenta alta sensibilidade e pode ser usada para qualquer
polimorfismo de base única. No presente trabalho a técnica AE- PCR foi padronizada
para o polimorfismo do gene GSTP1 (rs1695) em amostras de câncer gástrico.
A reação da PCR-AE foi realizada em um volume final de 25 μL contendo 200
μM de dNTPs (deoxinucleotídeo trifosfato), 2.0 mM de MgCl2 (Cloreto de magnésio),
50 ng de DNA, 200 pM de cada oligonucleotídeo (primer) e 0.5U AmpliTaq GOLD
25
(Applied Biosystems, Foster City, CA). As condições da AE-PCR para amplificação
dos alelos serão as seguintes: uma desnaturação prévia por 5 minutos a 95ºC e 35
ciclos de 95°C por 1 minuto, 56°C por 1 minuto e 72°C por 40 segundos, com uma
extensão final de 5 min a 72°C, essa reação foi realizada no Termociclador Bio-Rad®
(Figura 4).
Figura 4: Termociclador Bio-Rad® (Foto: Anísio Henriques, 2013)
4.6
ELETROFORESE
O resultado da amplificação foi observado através da técnica de eletroforese
em gel de Poliacrilamida, na concentração de 8% a partir de uma solução de
acrilamida 30% (sistema 29:1), contendo tampão TBE 10x, persulfato de amônia e
Temed, a 20ºC, durante aproximadamente 1 hora a 100 Volts. Utilizou-se a Fonte BioRad® e Cuba Loccus® para Eletroforese no LBMEO (Figura 5).
Para revelação do gel, utilizou-se 50 mL de solução fixadora (etanol 18%;
ácido acético glacial 0,75%, concentrações finais) acrescida de 1 mL de solução de
Nitrato de Prata a 5% por 5 minutos; lavou-se o gel com água deslitada e por fim,
revelou-se em meio básico (NaOH 9%; formaldeído 0,3%, concentrações finais)
durante 5 minutos. O gel mostra bandas de peso molecular 71 pb (peso do fragmento)
onde a amplificação ocorreu com sucesso.
26
Figura 5: Fonte Bio-Rad® e Cuba Loccus® Biotecnologia para Eletroforese (Foto: Anísio
Henriques, 2013)
4.7
ANÁLISE ESTATÍSTICA
De acordo com o autor Mark Ridley (2006),
“O Teorema de Hardy-Weinberg depende de três prerrogativas
principais: ausência de seleção natural, cruzamentos aleatórios
e tamanhos populacionais grandes. Em uma população natural,
qualquer uma dessas três poderia ser falsa; não podemos
assumir que populações naturais estejam em equilíbrio de
Hardy-Weinberg. Na prática, podemos descobrir se uma
população está em equilíbrio para um loco simplesmente por
meio da contagem das frequências genotípicas.” (RIDLEY,
2006).
A fim de determinar se os resultados obtidos estão em equilíbrio, utilizou-se o
conceito de equilíbrio de Hardy-Weinberg, da genética de populações, com validação
dada pelo teste Qui-quadrado.
27
5
RESULTADOS
As amostras foram analisadas através da técnica PCR Alelo Específica,
utilizando-se três primers específicos, sendo um para a fita molde e os outros dois com
a modificação de um nucleotídeo referente ao polimorfismo. Foram analisadas 23
amostras de câncer, a distribuição genotípica foi AA = 8; AG = 15 e GG = 0 e as
frequências alélicas encontradas foram: p = 0,67 (frequência alélica de A) e q = 0,33
(frequência alélica de G). Através da análise estatística a população encontra-se em
equilíbrio de Hardy-Weinberg e o resultado não foi estatisticamente significativo para
associação do polimorfismo do gene GSTP1 (rs1695) ao desenvolvimento de câncer
gástrico (χ2 = 5,521) (Figura 6).
Amostra: 22
23
26
27
28
71 pb
Genótipo: A G/ A G/A G/A G/ A G
Figura 6: Fotografia do Gel de Poliacrilamida das amostras 22, 23, 26, 27 e 28. Onde não
aparece a segunda banda, relativa ao alelo G, considera-se o genótipo homozigoto para AA.
28
6
DISCUSSÃO
O câncer gástrico é a segunda causa de morte mais comum ao redor do mundo
(FERLAY et al, 2010). Embora o maior fator de risco ainda seja a infecção por H.
pylori, fatores ambientais e genéticos também contribuem para o desenvolvimento
desta neoplasia, que ocorre no estômago. O entendimento do metabolismo dos
xenobióticos trouxe possibilidades de associação da atividade catalítica envolvida
neste processo e a carcinogênese, uma vez que as enzimas de conjugação neutralizam
possíveis agentes mutagênicos. Uma dessas enzimas, a GSTP1, alvo deste trabalho, já
foi abordada em busca de associação com todos os tipos de câncer (WELFARE et al.,
1999; HONG et al., 2006; LEE et al., 2000 e PARK et al., 1999).
Os estudos envolvendo câncer e polimorfismos da enzima GSTP1, apresentam
resultados semelhantes aos deste trabalho, não mostrando associação entre o
polimorfismo e o desenvolvimento do câncer em questão. Um estudo de 2006 feito por
Hong et al., analisou o câncer gástrico e não mostrou diferenças significativas entre
casos e controles (HONG et al., 2006). Outros estudos abordando outros tipos de
câncer corroboram com este resultado, Park et al (1999), analisaram associação entre
polimorfismo de GSTP1 e câncer de boca. Gsur et al (2001), avaliaram associação do
polimorfismo do gene GSTP1 a desenvolvimento de câncer de próstata. Quanto a
susceptibilidade da presença de mutação polimórfica do gene GSTP1 em câncer
colorretal, Welfare et al (1999) não observaram diferença significativa entre os casos e
os controles.
Por outro lado, sempre que uma variável é adicionada, como o tabagismo, a
estatística tende a mostrar significância e associação entre o metabolismo dos
xenobióticos do cigarro e o aumento do risco de desenvolvimento do câncer, como
visto em Lee et al (2000) e Park et al (1999), que estudaram os cânceres de esôfago e
boca, respectivamente.
Outra forma de abordar uma associação seria estudar a variação da expressão e
função das proteínas entre os indivíduos e no mesmo indivíduo, inclusive. O fato de
não apresentar significância estatística não exclui completamente a possibilidade de
aquele polimorfismo exercer influência no desenvolvimento do câncer, já que os genes
podem contribuir de forma diferenciada na expressão das proteínas e estas trabalham
29
em associação com outras, podendo o erro está em qualquer parte do sistema ou até
mesmo em outro polimorfismo da mesma proteína.
O nosso resultado sugere que não há associação polimorfismo de GSTP1
estudado e aumento do risco de desenvolvimento de câncer gástrico, porém não é
conclusivo por um motivo: o tamanho amostral reduzido. No caso deste trabalho,
apenas 23 amostras de DNA representavam o câncer gástrico, o que significa muito
pouco para a estatística. Por outro lado, fazendo uma projeção percentual sobre os
resultados obtidos neste trabalho, vê-se que este estudo tem potencial, apresentando
uma tendência de significância em estudos que abordassem maior tamanho amostral.
30
7
CONCLUSÃO
A partir deste trabalho, conclui-se que o polimorfismo genético do gene
GSTP1 (rs1695) não está associado à carcinogênese gástrica nestes pacientes, pois se
encontram todos em equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Entretanto, precisa-se observar que o tamanho amostral foi pequeno para uma
análise estatística. Portanto, este resultado não exclui completamente a possibilidade
destes genes exercerem influência na carcinogênese gástrica.
Para futuros estudos de associação entre polimorfismo e desenvolvimento de
câncer, recomenda-se um acréscimo de tamanho amostral e estudos funcionais das
enzimas codificadas pelos genes polimórficos, além de observar diferentes variáveis
como idade, sexo e tabagismo entre os pacientes da pesquisa.
31
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBERTS, B. Et al. Biologia molecular da célula. 4ª edição, Porto Alegre: Artmed,
2004.
AMERICAN CANCER SOCIETY. Gastric Cancer. 2013
ASCANO, J. J., FRIERSON, H. JR, MOSKALUK, C. A., et al. Inactivation of the Ecadherin gene in sporadic diffuse-type gastric cancer. Modern Pathology, v.14, p.942–
949, 2001.
AUTRUP, H. Genetic polymorphisms in human xenobiotica metabolizimg enzymes
as susceptibility factors in toxic response. Mutation Research, n.464, p.65-76, 2000.
BEVAN, S., HOULSTON, R.S. Genetic predisposition to gastric cancer (Minireview). Q J Med, v.92, p.5–10, 1999.
BOCCIA, S., A SAYED-TABATABAEI, F., PERSIANI, R., GIANFAGNA, F.,
RAUSEI, S., ARZANI, D., LA GRECA, A., D'UGO, D., LA TORRE, G., VAN
DUIJN, C. M., RICCIARDI, G. Polymorphisms in Metabolic Genes, their
Combination and Interaction with Tobacco Smoke and Alcohol Consumption and Risk
of Gastric Cancer: A Case-Control Study In An Italian Population. BioMedCentral
Cancer, n.7, v.206, p.1-8, 2007.
BERRINO, F., CAPOCACCIA, R., ESTEVE, J. Survival of Cancer Patients in
Europe: The EUROCARE-2 Study. IARC Scientific Publications, n.151, 1999.
BOIS, F.; KROWECH, G.; ZEISE, L. Modeling human interindividual variability in
metabolism and risk: the example of 4-aminobiphenyl. Risk Analysis, v.15, p.201-213,
1995.
BORA, P. S., GURUGE, B. L., MILLER, D. D. Human fatty acid ethyl ester
synthase-III gene: genomic organization, nucleotide sequencing and chromosomal
localization. Molecular Cell Biochemistry. n.173, p.145-151, 1997.
BRASIL. Instituto Nacional do Câncer (INCA), 2013.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Instituto Nacional de
Câncer. TNM: classificação de tumores malignos / traduzido por Ana Lúcia Amaral
Eisenberg. 6. ed. - Rio de Janeiro: INCA, 2004.
BREIVIK, J. The evolutionary origin of genetic instability in cancer development
(Review). Seminars in Cancer Biology, v.15, p.51-60, 2005.
BROOKES, A. J. The essence of SNPs. Gene, v.234, p.177–186, 1999.
CORREIA, F. M. R. P. Genes de Metabolismo de Genotóxicos: Papel na
Susceptibilidade e Tratamento do Cancro da Mama. 86 pg. Dissertação - Faculdade de
Medicina da Universidade de Coimbra. Portugal, 2010.
CREW, K.D.; NEUGUT, A. I. Epidemiology of gastric cancer. World Journal of
Gastroenterology, v.12, n.3, p.354-362, 2006.
32
DALY, A. K.; CHOLERTON, S.; GREGORY, W.; IDLE, J.R. Metabolic
polymorphisms. Pharmacology & Therapeutics.,v. 57, p.129-160, 1993.
DASGUPTA et. al. Polymorphic variation in GSTP1 modulates outcome following
therapy for multiple myeloma. Blood Journal, v.102, n.7, p.2345-2350, 2003.
DAVIS, P.; TAKESHI, S. The difference in gastric cancer between Japan, USA, and
Europe: what are the facts? What are the suggestions? Critical Reviews in
Oncology/Hematology, v.40, p.77–94, 2001.
DICKEN, B. J.; BIGAM D, L.; CASS, C.; MACKEY, J. R.; JOY, A. A.;
HAMILTON, S. M. Gastric Adenocarcinoma: Review and Considerations for Future
Directions. Annals of Surgery, v.241, n.1, 2005.
DIMITRIOS, H., ROUKOS, M. D., NIKI, J., AGNANTIS, M. D., MICHAEL, M. D.,
ANGELOS, M., KAPPAS, M. D. Gastric Cancer: Introduction, Pathology,
Epidemiology (Mini review). Gastric Breast Cancer, n.1, v.1, p.1-3, 2002.
DUSSAULX-GARIN, L., BLAYAU, M., PAGENAULT, M., et al. A new mutation
of E-cadherin gene in familial gastric linitis plastica cancer with extradigestive
dissemination. European Journal of Gastroenterology & Hepatology, v.13, p.711–
715, 2001.
EL-OMAR, E. M., CHOW, W. H., RABKIN, C.S. Gastric cancer and H. pylori: Host
genetics open the way. Gastroenterology, v.4, n.121, p.1002-1004, 2001.
ESTADOS UNIDOS. National Cancer Institute. Gastric cancer treatment, 2010.
GONZALEZ, C. A., SALA, N., CAPELLA, G. Mini Review: Genetic Susceptibility
and Gastric Cancer Risk. International Journal of Cancer, n.100, p.249–260, 2002.
GORE, R. Gastrointestinal cancer. Radiologic Clinics of North America. V.35, p.295–
310, 1997.
GSUR, A., HAIDINGER, G., HINTEREGGER, S., BERNHOFER, G., SCHATZ, G.,
MADERSBACHER, S., MARBERGER, M., VUTUC, C., MICKSCHE, M..
Polymorphisms of glutathione-S-transferase genes (GSTP1, GSTM1 and GSTT1) and
prostate-cancer risk. International Journal of Cancer, v.95, n.3, p.152–155, 2001.
GUNDERSON, L. L., DONOHUE, J. H., ALBERTS, S. R. Cancer of the stomach. In:
Abeloff MD, et al., eds. Abeloff's Clinical Oncology. 4th ed. Philadelphia, Pa:
Saunders Elsevier;2008:chap 79.
FAIVRE, J.; FORMAN, D.; ESTEVE, J.; GATTA, G. Survival of patients with
oesophageal and gastric cancers in Europe. Europe Journal of Cancer, v.34, p.21672175, 1998.
FENOGILO-PREISER, C., CARNEIRO, F., CORREA, P., et al. Gastric carcinoma.
In: Hamilton S, Aaltonin L, eds. Pathology and Genetics. Tumors of the Digestive
System, vol 1. Lyon, France: Lyon Press, p.37–52, 2000.
FERLAY, J., SHIN, H. R., BRAY, F., FORMAN, D., MATHERS C., PARKIN D. M.
Cancer Incidence and Mortality Worldwide. IARC CancerBase n.10, v.1.2, 2010.
33
HANAHAN, D., WEINBERG, R. A., The Hallmarks of Cancer. Cell, v.100, p.57-70,
2000.
HARRIES, L. W., STUBBINS, M. J., FORMAN, D., HOWARD, G. C. W., WOLF,
C. R. Identification of Genetic Polymorphisms at the Glutathione S-transferase Pi
Locus and Association with Susceptibility to Bladder, Testicular and Prostate Cancer.
Carcinogenesis, v.18, n.4, p.641–644, 1997.
HARRIS, M. J., COGGAN, M., LANGTON, L., WILSON, S. R., BOARD, P. G.
Polymorphism of the Pi class glutathione S-transferase in normal populations and
cancer patients. Pharmacogenetics, v.8, n.1, p.27-31, 1998.
HAYES, R. B. Genetic susceptibility and occupational cancer. La Medicina del
lavoro., v,86, p.206-213, 1995.
HUNTSMAN, D. G.; CARNEIRO, F.; LEWIS, F. R., et al. Early gastric cancer in
young, asymptomatic carriers of germ-line E-cadherin mutations. The New England
Journal of Medicine, v.344, p.1904 –1909, 2001.
KARPEH, M., BRENNAN, M. Gastric carcinoma. Annals of Surgical Oncology, v.5,
p.650– 656, 1998.
KASSAB, P.; LEME, P. L. S. Revista da Associação Médica Brasileira, v.49, n.3,
p.225-43, 2003.
KATOH, T., KANEKO, S., TAKASAWA, S., NAGATA, N., INATOMI, H.,
IKEMURA, K., ITOH, H., MATSUMOTO, T., KAWAMOTO, T., BELL, D. A.
Human glutathione S-transferase P1 polymorphism and susceptibility to smoking
related epithelial cancer; oral, lung, gastric, colorectal and urothelial cancer.
Pharmacogenetics, v.9, n.2, p.165-169, 1999.
KROEMER, H.; EICHELBAUM, M. Molecular bases and clinical consequences of
genetic cytochrome P450 2D6 polymorphism. Life Sciences, v.56, p.2285-2298, 1995.
KUIPERS, E. J. Review article: exploring the link between Helicobacter pylori and
gastric cancer. Alimentary Pharmacology & Therapeutics, n.1, v.13, p.3-11, 1999.
LA VECCHIA, C., NEGRI, E., FRANCESCHI, S., et al. Family History and the Risk
of Stomach and Colorectal Cancer. Cancer, n.70, p.50 –55, 1992.
LABORDE, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved
in cell proliferation and cell death (Review). Cell Death and Differentiation, v.17,
p.1373–1380, 2010.
LAURÉN, P. The two histological main types of gastric carcinoma: diffuse and socalled intestinal-type carcinoma. Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica,
n.64, p.31-49, 1965.
LEE, J.-M., LEE, Y.-C., YANG, S.-Y., SHI, W.-L., LEE, C.-J., LUH, S.-P., CHEN,
C.-J., HSIEH, C.-Y., WU, M.-T.. Genetic Polymorphisms Of P53 And GSTP1,But
Not NAT2,Are Associated With Susceptibility To Squamous-Cell Carcinoma Of The
Esophagus. International Journal of Cancer, v. 89, n.5, p.458–464, 2000.
34
MACHADO, J., SOARES, P., CARNEIRO, F., et al. E-cadherin gene mutations
provide a genetic basis for the phenotypic divergence of mixed gastric carcinomas.
Laboratory Investigation, v.79, p.459–465, 1999.
MILLER R. D et al. High-density single-nucleotide polymorphism maps of the human
genome. Genomics, v.86, p.117–126, 2005.
MORROW, C. S., COWAN, K. H, GOLDSMITH, M. E. Structure of the human
genomic glutathione S-transferase-pi gene. Gene, n.75, p.3-11, 1989.
MULLIS, K., FALOONA, F., SCHARF, S., SAIKI, R., HORN, G., ERLICH, H.
Specific Enzymatic Amplification of DNA in Vitro: The Polymerase Chain Reaction.
Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, v.51, 1986.
PARK, J. Y., SCHANTZ, S. P., STERN, J. C., KAUR, T., LAZARUS, P. Association
between glutathione S-transferase pi genetic polymorphisms and oral cancer risk.
Pharmacogenetics, v.9, n.4, p.497-504, 1999.
PERSSON, I.; JOHANSSON, T.; BERGLING, H.; DAHL, M.L.; SEIDEGARD, J.;
RYLANDER, R.; RANNUG, A.; HÖBERG, J.; SUNDBERG, M.I. Genetic
polymorphism of cytochrome P450 2E1 in a Swedish population. Relationship to
incidence of lung cancer. FEBS Letters, v.319, p.207-211, 1993.
PICKETT, C. B. Glutathione S-Transferases: Gene Structure, Regulation and
Biological Function. Annual Reviews of Biochemistry, n.58, p.743-764, 1989.
PRANKIN, D.; WHELON, S.; FERLAY, J.; et al. Cancer Incidence in Five
Continents. Lyon, France: IARC Press; 1997.
RAMON, J. M., SERRA, L., CERDO, C., et al. Dietary factors and gastric cancer risk.
A case–control study in Spain. Cancer, v.71, p.1731–1735, 1993.
RAUNIO, H.; HUSGAFVEL-PURSIANEN, H.; ANTILLA, S.; HIETANEN, E.;
HIRVONEN, A.; PELKONEN, O. Diagnosis of polymorphism in carcinogenactivating and inactivating enzymes and cancer susceptibility - a review. Gene, v.159,
p.113-121, 1995.
RIDLEY M. Evolução. 3a. ed. Porto Alegre: Artmed Editora, 2006.
RUSTGI, A. K. Neoplasms of the stomach. In: Goldman L, Ausiello D, eds. Cecil
Medicine. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007:chap 202.
RYU, J-W., KIM, H-J., LEE, Y-S., MYONG, N-H., HWANG, C-H., LEE, G-S.,
YOM, H-C. The Proteomics Approach to Find Biomarkers in Gastric Cancer. Journal
of Korean Medical Science, v.18, p.505-509, 2003.
SABETI, P. C., VARILLY, P., FRY, B., LOHMUELLER, J., HOSTETTER, E.,
COTSAPAS, C., X. XIE, E.H. BYRNE, S.A. MCCARROLL, R. GAUDET, S.F.
SCHNAFFER, E.S. LANDER, T.I.H. Consortium Genome-wide detection and
characterization of positive selection in human populations. Nature, v.449, p.913–
919, 2007.
35
SADOWSKI, D. C.; RABENECK, L. Gastric ulcers at endoscopy: brush, biopsy, or
both? The American Journal of Gastroenterology, v.92, p.608–613, 1997.
SHEEHAN, D., MEADE, G., FOLEY, V. M., DOWD, C. A. Structure, Function and
Evolution of Glutathione Transferases: Implications for Classification of NonMammalian Members of an Ancient Enzyme Superfamily. Biochemestry Journal,
v.360, p.1-16, 2001.
SHERRATT, P. J., HAYES, J. D. Glutathione S-transferases. Enzyme Systems that
Metabolise Drugs and Other Xenobiotics, University of Dundee, UK, 2001.
STRANGE, R. C., JONES, P. W., FRYER, A. A. Glutathione S-transferase: genetics
and role in toxicology. Toxicology Letters, 112–113, p. 357–363, 2000.
TOWNSEND, D. M., MANEVICH, Y., HE, L., HUTCHENS, S., PAZOLES, C. J.,
TEW, K. D. Novel Role for Glutathione S-Transferase: Regulator of Protein SGlutathionylation Following Oxidative and Nitrosative Stress. Journal of Biological
Chemistry, v.284, n.1, p.436-445, 2009.
UMENO, M. MCBRIDE, O.; YANG, C.; GELBOIN, H.; GONZALEZ, F. Human
ethanolinducible P450IIE1: complete gene sequence, promoter characterization,
chromosome mapping and Cdna-directed expression. Biochemistry, v.27, p.90069013, 1988.
VAN IERSEL, M. L., VERHAGEN, H., van BLADEREN, P.J. The role of
biotransformation in dietary (anti)carcinogenesis. Mutation Research, v.443, p.259270, 1999.
WEINBERG, R. A. A Biologia do Câncer. Porto Alegre: Artmed, 2008.
WELFARE, M., ADEOKUN, A. M., BASSENDINE, M. F., DALY, A. K..
Polymorphisms in GSTP1, GSTM1, and GSTT1 and Susceptibility to Colorectal
Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Preview, 1999.
36
ANEXO
37
ANEXO 1: Reprodução do ofício de aprovação do trabalho de pesquisa pelo Comitê
de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto (CEPHC-FMRP) e Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP), em
Brasília. O presente trabalho foi avaliado e aprovado pelo CEPHC-FMRP sob o
número 12479/2004.