universidade federal do rio grande do norte
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRO-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ÉVERTON DO NASCIMENTO ALENCAR Avaliação da atividade antimicrobiana de sistemas emulsionados contendo óleos naturais para o tratamento de infecções cutâneas Natal-RN 2013 ÉVERTON DO NASCIMENTO ALENCAR Avaliação da atividade antimicrobiana de sistemas emulsionados contendo óleos naturais para o tratamento de infecções cutâneas Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Bioanálises e Medicamentos Orientador: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa de Egito Coorientador: Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves Natal-RN 2013 "Há homens que lutam um dia e são bons, há outros que lutam um ano e são melhores, há os que lutam muitos anos e são muito bons. Mas há os que lutam toda a vida e estes são imprescindíveis." (Bertold Brecht) Dedico este trabalho: Aos meus pais, que apesar de todas as dificuldades, sempre me apoiaram nesta jornada. AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus pais, Graça e Manoel, pelo apoio incondicional que sempre me deram. Às minhas irmãs, Clélia e Lidiane, pelo importante papel que tem na minha vida. Aos meus sobrinhos Hanry, Ravana e Derick pela felicidade que sempre me trouxeram. Aos amigos Gutemberg, Arion, Maria Luiza, Janaina, Deyse, Aline, Karídia e Leonardo pelos momentos de conversas, conselhos e alegrias. Aos que fazem parte do Laboratório de Sistemas Dispersos, Nednaldo, Rafael, Thales, Scheyla, Laura, Izabel, Alexandrino, Cybelle, Sarah, Christian Assunção, André e demais que compartilham alegrias e conhecimentos no dia-a-dia. Aos amigos e companheiros de equipe, Andreza, Lucas, Christian Melo, Teresa, Renata e em especial a Junior Xavier, pela orientação. À Elizabeth, por toda a disponibilidade e ensinamento no que diz respeito às bactérias utilizadas neste trabalho. À Universidade Federal do Rio Grande do Norte pelo excelente ensino e pela estrutura fornecida para o desenvolvimento deste trabalho. Ao Prof. Dr. Arnóbio Silva, Coordenador do Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, através do qual agradeço a todos os professores e funcionários do programa. Ao meu orientador, Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates pelos conhecimentos, correções e suporte financeiro em aquisição de materiais necessários. Ao Prof. Dr. Guilherme Maranhão, meu co-orientador, pelo apoio, interesse e correções. Assim como a seus alunos de pós-graduação Mariana e Plínio pelo apoio no Laboratório de Micologia Médica e Molecular. Não menos importante, agradeço a CAPES pela bolsa concedida e CNPq pelo financiamento de alguns materiais do projeto. LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS E SIGLAS ® Registrado % Porcentagem µg Micrograma µL Microlitro µm Micrômetro A/O Água em óleo A/O/A Água em óleo em água AC Amostra Clínica AnfB Anfotericina B ANOVA Análise de Variância ATCC American Type Culture Collection BHI Brain Heart Infusion C1 Primeira fração obtida na bioautografia do óleo de copaíba C2 Segunda fração obtida na bioautografia do óleo de copaíba CCD Cromatografia em camada delgada Cet Cetoconazol CG-EM Cromatografia gasosa acoplada a detector de espectrometria de massa CIM Concentração Inibitória Mínima Clor Cloranfenicol CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute DMSO Dimetilsulfóxido EHL Equilíbrio hidrofílico-lipofílico EOC Emulsão de óleo de copaíba EOEC Emulsão de óleo essencial de copaíba EOR Emulsão de óleo de rã-touro HPTLC High performance thin layer chromatography ICA Intercellular adhesion gene cluster IL-4 Interleucina 4 2 m Metros quadrados mg Miligrama min Minuto mL Mililitro mm Milímetro mOC Óleo de copaíba metilado mOEC Óleo essencial de copaíba metilado mOR Óleo de rã-touro metilado mR1 Fração metilada obtida na bioautografia do óleo de rã-touro mRC Fração resina do óleo de copaíba metilada NIST National Institute of Standards and Technology O/A Óleo em água O/A/O Óleo em água em óleo OC Óleo de copaíba ºC Graus Celcius OEC Óleo essencial de copaíba OR Óleo de rã-touro p/p Peso/peso R1 Fração obtida na bioautografia do óleo de rã-touro RC Fração Resina do óleo de copaíba S80 Span 80® T20 Tween 20® Th2 Células T helper tipo 2 TR Tempo de retenção YPD Yeast-Peptone-Dextrose LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1- Árvore de Copaíba (Copaifera langsdorffii)................................... 18 Figura 2- Rã-Touro (Rana catesbeiana Shaw)................................................ 20 Figura 3- Corte histológico da pele apresentando as três camadas e estruturas anexas (a). Disposição da epiderme, monócitos basais e vasos sanguíneos na derme (b)....................................................... 22 Figura 4- Cultivo de S. aureus ATCC 29213 em ágar manitol salgado.......... 25 Figura 5- Cultivo de S. epidermidis ATCC 12228 em ágar manitol salgado.. 26 Figura 6- Cultivo de P. aeruginosa ATCC 27853 em ágar cetrimida............. 27 Figura 7- Espécies de Candida diferenciadas em meio cromogênico CHROMagar Candida..................................................................... Figura 8- Esquema dos diferentes tipos de emulsão, O/A (A), A/O/A (B), A/O (C) e O/A/O (D)....................................................................... Figura 9- 29 32 Cromatograma obtido por CG-EM. A: óleo-resina de copaíba; B: óleo-resina de copaíba metilado; C: óleo essencial de copaíba; D: óleo essencial de copaíba metilado; E: fração resina metilada do óleo de copaíba obtido como resíduo da extração de óleo essencial........................................................................................... Figura 10- 41 Cromatograma obtido por CG-EM. A: óleo de rã-touro; B: óleo de rã-touro metilado......................................................................... 44 Figura 11- Perfil cromatográfico dos óleos de copaíba e rã-touro em Cromatografia de Camada Delgada. Adsorvente: Sílica; FM: 53 Hexano: Acetato de etila (9:1); Revelador: Vanilina Sulfúrica....... Figura 12- Cromatograma obtido por CG-EM da primeira fração (Rf 0,2) de óleo de copaíba obtida pela Bioautografia................................ Figura 13- Cromatograma obtido por CG-EM da segunda fração (Rf 0,15) de óleo de copaíba obtida pela Bioautografia.................................. Figura 14- 54 Cromatograma da fração (Rf 0,6) de óleo de rã-touro obtida pela Bioautografia.......................................................................... Figura 15- 53 56 Cromatograma da fração (Rf 0,6) metilada de óleo de rã-touro obtida pela Bioautografia.......................................................... 56 Figura 16- Formação de biofilme na presença de óleos de copaíba e emulsões contendo estes óleos......................................................... 58 Figura 17- Formação de biofilme na presença de óleo de rã-touro e emulsão contendo este óleo............................................................................ 59 LISTA DE TABELAS Pág. Tabela 1- Porcentagem dos compostos terpênicos majoritários das amostras de Copaíba (Copaifera langsdorffii)................................................. Tabela 2- 43 Porcentagem dos compostos majoritários das amostras de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw).................................................................. 45 Tabela 3- Caracterização físico-química das emulsões............................... 46 Tabela 4- Medidas dos halos de inibição (mm) da triagem antibacteriana....... 47 Tabela 5- Medidas dos halos de inibição (mm) da triagem antifúngica............ 48 Tabela 6- Concentração Inibitória Mínima dos óleos de copaíba e das emulsões contendo estes óleos (mg/L)........................................... Tabela 7- Concentração Inibitória Mínima dos óleos de rã-touro e da emulsão contendo este óleo (mg/L)............................................... Tabela 8- 50 52 Porcentagem dos compostos majoritários nas amostras obtidas da bioautografia...................................................................................... 55 RESUMO Os óleos naturais vêm chamando atenção da comunidade científica devido a suas atividades farmacológicas e seu caráter renovável. Os óleos de copaíba (Copaifera langsdorffii) e de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) ganham destaque, especialmente devido a ampla utilização na medicina popular como anti-inflamatórios e antimicrobianos. Sistemas emulsionados a base destes óleos podem ser produzidos com a finalidade de melhorar o odor e a palatabilidade dos mesmos, além de potencializar ação e reduzir toxicidade dos seus componentes. O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade antimicrobiana de emulsões contendo óleos de copaíba (óleo-resina e óleo essencial) e óleo de rã-touro frente a cepas de micro-organismos causadores de infecções cutâneas. Inicialmente, foi realizada a extração de óleo essencial e sua caracterização química por cromatografia gasosa acoplada a espectroscopia de massas. Em seguida, foram produzidas emulsões, ensaios de triagem microbiológica, microdiluição para determinação de concentração inibitória mínima, bioautografia para determinação dos componentes antimicrobianos e avaliação da atividade antibiofilme. Foram utilizadas cepas da American Type Culture Collection (ATCC) e clínicas de Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei e C. tropicalis. Foi observado que os sistemas emulsionados de óleo-resina de copaíba e óleo essencial de copaíba contribuíram na potencialização da atividade antimicrobiana, especialmente contra cepas do gênero Staphylococcus e Candida resistentes aos azóis. A emulsão de óleo de rã-touro assim como o óleo puro, apresentou menor atividade que as amostras de copaíba, porém exibiu significativa ação antibiofilme, demonstrando que este sistema é um potencial inibidor da adesão de micro-organismos. Deste modo, pode-se inferir que as emulsões a base destes óleos são promissores sistemas para o tratamento de infecções cutâneas fúngicas e bacterianas. Palavras-chave: Emulsão; Óleo de copaíba (Copaifera langsdorffii); Óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw); Atividade antimicrobiana. ABSTRACT Natural oils have shown a scientific importance due to its pharmacological activity and renewable character. The copaiba (Copaifera langsdorffii) and Bullfrog (Rana catesbeiana Shaw) oils are used in folk medicine particularly because the anti-inflammatory and antimicrobial activities. Emulsion could be eligible systems to improve the palatability and fragrance, enhance the pharmacological activities and reduce the toxicological effects of these oils. The aim of this work was to investigate the antimicrobial activity of emulsions based on copaiba (resin-oil and essential-oil) and bullfrog oils against fungi and bacteria which cause skin diseases. Firstly, the essential oil was extracted from copaiba oil-resin and the oils were characterized by gas chromatography coupled to a mass spectrometry (GC-MS). Secondly, emulsion systems were produced. A microbiological screening test with all products was performed followed (the minimum inhibitory concentration, the bioautography method and the antibiofilm determination). Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei and C. tropicalis American Type Culture Collection (ATCC) and clinical samples were used. The emulsions based on copaiba oil-resin and essential oil improved the antimicrobial activity of the pure oils, especially against Staphylococcus e Candida resistant to azoles. The bullfrog oil emulsion and the pure bullfrog oil showed a lower effect on the microorganisms when compared to the copaiba samples. All the emulsions showed a significant antibiofilm activity by inhibiting the cell adhesion. Thus, it may be concluded that emulsions based on copaiba and bullfrog oils are promising candidates to treatment of fungal and bacterial skin infections. Keywords: Emulsion; Copaiba (Copaifera langsdorffii) oil; Bullfrog (Rana catesbeiana Shaw) oil; Antimicrobial activity. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 14 2 REVISÃO DA LITERATURA 16 2.1 ÓLEOS NATURAIS NO DESENVOLVIMENTO DE NOVOS MEDICAMENTOS 16 2.1.1 O óleo de copaíba 17 2.1.2 O óleo de rã-touro 20 2.2 A PELE 22 2.3 MICRO-ORGANISMOS CAUSADORES DE INFECÇÕES CUTÂNEAS 23 2.3.1 Staphylococcus aureus 24 2.3.2 Staphylococcus epidermidis 25 2.3.3 Pseudomonas aeruginosa 26 2.3.4 Candida albicans 27 2.3.5 Candida parapsilosis 28 2.3.6 Candida tropicalis 28 2.3.7 Candida krusei 29 2.3.8 Candida glabrata 30 2.4 SISTEMAS EMULSIONADOS 30 3 33 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL 33 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 33 4 34 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 MATERIAIS 34 4.1.1 Substâncias químicas 34 4.1.2 Micro-organismos 34 4.2 MÉTODOS 35 4.2.1 Extração do óleo essencial de copaíba 35 4.2.2 Análise da composição química dos óleos 35 4.2.3 Preparo e caracterização das emulsões 36 4.2.4 Triagem antimicrobiana 36 4.2.5 Concentração Inibitória Mínima (CIM) 37 4.2.6 Bioautografia 38 4.2.7 Atividade antibiofilme 39 4.2.8 Análises estatísticas 39 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 40 5.1 EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS 40 5.2 PRODUÇÃO DOS SISTEMAS EMULSIONADOS 45 5.3 TRIAGEM MICROBIOLÓGICA 46 5.4 CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) 49 5.5 BIOAUTOGRAFIA 52 5.6 AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DE BIOFILME 56 6 CONCLUSÕES 61 7 REFERÊNCIAS 63 8 APÊNDICE 70 1 INTRODUÇÃO A pele é constantemente exposta a inúmeros micro-organismos patogênicos por apresentar contato com o meio externo e atuar como barreira física de proteção do organismo humano. Porém, fatores como imunodeficiência, alta virulência dos microorganismos ou abrasões locais podem facilitar a instalação de diversas infecções podendo-se destacar as infecções fúngicas ou bacterianas nesse órgão (BHAGAVATULA; POWELL, 2011). Dentre os micro-organismos causadores das infecções de pele estão as bactérias gram-positivas do gênero Staphylococcus, gram-negativas como Pseudomonas aeruginosa e fungos leveduriformes do gênero Candida (ROSENTHAL et al., 2011b; DAWSON; DELLAVALLE; ELSTON, 2012a). Os óleos naturais são utilizados como antimicrobianos na medicina popular desde séculos passados (SALEEM et al., 2010a). Devido ao crescente número de microorganismos resistentes aos fármacos utilizados na terapêutica, estes óleos estão sendo reconhecidos cientificamente, o que incentiva a inserção de novos produtos de origem animal e vegetal no mercado (SALEEM et al., 2010a). Dentre estes, o óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) e o óleo de copaíba (Copaifera langsdorffii) são amplamente utilizados na medicina popular. O óleo de copaíba é extraído de árvores conhecidas como Copaibeiras (Copaifera spp.) que estão distribuídas pela América do Sul e África. O óleo-resina de copaíba é utilizado tradicionalmente pela medicina popular por suas atividades antiinflamatória e antimicrobiana (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b). No cenário atual, a este óleo é dado grande destaque devido uma série de propriedades farmacológicas e cosméticas já elucidadas na literatura (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b; PIERI; MUSSI; MOREIRA, 2009a). O óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) é extraído através do processo de aproveitamento biotecnológico de descartes dos tecidos adiposos em ranários. Assim como a carne e a pele, seu óleo é rico em ácidos graxos poli-insaturados do tipo ômega, bastante importantes para sua atividade farmacológica (GONÇALVES; OTTA, 2008a; LOPES, V. D. S. et al., 2010). O uso in natura desses óleos por parte dos pacientes possui baixa adesão devido as suas características organolépticas desagradáveis. Deste modo, pode-se introduzir as emulsões, que são sistemas de liberação formados por fases imiscíveis, em que uma fase 14 está dispersa no interior da outra na forma de gotículas estabilizadas por tensoativos (BIBETTE; CALDERON; POULIN, 1999a). Sistemas emulsionados contendo estes óleos objetivam melhorar a biodisponibilidade, potencializar ou modificar a liberação dos componentes ativos e ainda melhorar as características organolépticas (XAVIERJÚNIOR et al., 2012a). 15 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 ÓLEOS NATURAIS NO DESENVOLVIMENTO DE NOVOS MEDICAMENTOS A resistência de patógenos humanos a fármacos é um dos problemas mais relevantes durante a atualidade. O consumo exagerado e sem orientação adequada de antimicrobianos resulta na resistência de populações bacterianas, causando sérios problemas de saúde pública (SALEEM et al., 2010a). Apesar dos intensos estudos e pesquisas nos últimos anos, poucos novos antimicrobianos sintéticos têm sido aprovados para comercialização. Diante deste contexto, a busca por novas substâncias antimicrobianas a partir de fontes naturais, incluindo óleos animais e vegetais, de forma sustentável e sem prejudicar a biodiversidade, tem ganhado importância nas companhias farmacêuticas. Além disto, o uso de óleos com atividade farmacológica para desenvolvimento de novos sistemas de liberação de fármacos também tem sido almejados, visto que estes visam a potencialização da atividade terapêutica, redução dos padrões de resistência e diminuição de toxicidade (SALEEM et al., 2010a). Estes óleos naturais, sejam de origem vegetal ou de origem animal, podem apresentar em sua constituição componentes não coerentes com sua real composição química. Este fato pode ser devido a adulterações praticadas pelos fabricantes, distribuidores ou revendedores. As adulterações são usualmente praticadas com óleos de menor valor agregado, como óleos vegetais ou minerais facilmente encontrados e de baixo custo. Adicionalmente, a não identificação correta da espécie envolvida pode acarretar em diferentes constituições químicas. Assim, a qualidade do óleo estará comprometida, influenciando em suas características físico-químicas e farmacológicas. Deste modo o conhecimento da constituição real dos óleos estudados através de técnicas analíticas faz-se necessário a fim de garantir a confiabilidade destes produtos (VEIGA JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005). 16 2.1.1 O óleo de copaíba O óleo de copaíba é extraído das copaibeiras (Copaifera spp.), pertencentes à família Fabaceae (Leguminosae), subfamília Caesalpinioideae. A família Fabaceae é de distribuição cosmopolita, na qual estão incluídas cerca de 18000 espécies divididas em 650 gêneros. Esta família é uma das maiores representantes das Angiospermas em todo o mundo. No Brasil, aproximadamente 1500 espécies de plantas são pertencentes a esta família. Os ecossistemas naturais brasileiros possuem dentre suas principais famílias, a Fabaceae. Destaca-se na região de cerrado a presença de barbatimão (Stryphnodendron spp.) e copaíba (Copaifera langsdorffii) (SOUZA; LORENZI, 2008). São conhecidas 43 espécies do gênero Copaifera e estas estão amplamente distribuída na América do Sul (37 espécies), na América Central (4 espécies) e na África ( 4 espécies). Dentre as espécies Sul-americanas, 28 delas encontram-se presentes em território brasileiro (DWYER, 1951; NASCIMENTO et al., 2012). Embora as primeiras descrições das árvores de copaíba datem de próximo ao descobrimento do Brasil, a primeira espécie, Copaifera officinalis, foi oficialmente descrita em 1760 e somente em 1821 o francês Desfontaines adicionou a espécie C. langsdorffii ao gênero (Figura 1) (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b). A espécie Copaifera langsdorffii é citada na literatura como a principal espécie brasileira do gênero Copaifera de uso medicinal. No Brasil, ela ocorre em seu habitat mais favorável, Amazonas, assim como em outros estados, entre eles Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Minas Gerais, Pará, São Paulo, na floresta da bacia do Paraná e nas partes mais úmidas da região Nordeste do País (LOZENZI; MATOS, 2008). A árvore de copaíba (Copaifera langsdorffii) é uma planta heliófita, semidecídua e seletiva xerófita, comuns das formações de transição do cerrado brasileiro. Anualmente, os especimes produzem uma grande quantidade de sementes viáveis, as quais são amplamente disseminadas por pássaros. Adicionalmente, esta árvore pode ocorrer nas regiões de mata primária densa como em formações secundárias (LORENZI, 2008). O óleo provindo desta espécie é comumente obtido como subproduto da indústria madeireira na Amazônia bem como de processos extrativos sustentáveis desenvolvidos na região (LOZENZI; MATOS, 2008). 17 Figura 1 – Árvore de Copaíba (Copaifera langsdorffii). (Fonte: PIERI; MUSSI; MOREIRA, 2009). O óleo de copaíba encontra-se nos canais secretores presentes em todo o tronco da árvore. Os canais secretores são formados a partir de espaços intercelulares (meatos) e são responsáveis por liberar exsudados em situação de lesão ou como defesa do vegetal a agentes externos (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b). Sendo assim, o óleo é responsável pela desintoxicação da árvore e atividade contra fungos, bactérias e insetos (BRITO et al., 2005). A extração sustentável do óleo-resina é realizada através de perfurações com dois cilindros no tronco da árvore, de modo que o primeiro furo seja feito a 1 metro da base do vegetal e o segundo a 1,5 metros do anterior (RIGAMONTE-AZEVEDO; WADT; WADT, 2006). A coleta do óleo é realizada pelo furo inferior com auxílio de um cilindro e para cessar o escoamento do óleo o furo superior deve ser obstruído. A obstrução dos furos pode ser realizada com material vedante plástico a fim de reduzir a chance de contaminação por fungos e bactérias. Esta medida se faz importante para que não seja necessário realizar novos furos na próxima coleta (RIGAMONTE-AZEVEDO; WADT; WADT, 2006). O óleo-resina é formado por uma mistura de compostos diterpênicos e uma porção volátil (óleo essencial) formada por componentes sesquiterpênicos, como álcoois ou hidrocarbonetos (NASCIMENTO et al., 2012). É relevante saber que a composição química do óleo varia quantitativa e qualitativamente de acordo com alguns fatores, 18 dentre eles a espécie, as condições climáticas, de solo, entre outros fatores (HERREROJAUREGUI et al., 2011). Entre seus principais componentes, o óleo de copaíba é composto por sesquiterpenos como: β-cariofileno, α-bisaboleno, α-humuleno (α-cariofileno), α e βselineno, α-bisabolol, β-elemeno, ciclosativeno, α-copaeno, β-elemeno, cis- α - bergamoteno, α-guaieno, γ-muuroleno, dentre outros (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b). Além destes componentes, os diterpenos contidos na porção resinosa descritos na literatura são: ácido hardwíckico, colavenol, ácido copaiférico ou copaífero, ácido copaiferólico, ácido calavênico, ácido patagônico, ácido copálico, entre outros, sendo este ultimo utilizado como um dos principais marcadores para identificação de óleo de copaíba. Estes componentes são normalmente comuns às várias espécies de copaíba, porém, quantitativamente há variações nas proporções dos componentes de acordo com estas diferentes espécies (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b; HERRERO-JAUREGUI et al., 2011; NASCIMENTO et al., 2012). Os óleos essenciais são constituídos de compostos mono e sesquiterpênicos, além de fenilpropanóides, que dispõem de relevantes atividades farmacológicas. Estes óleos são a fração volátil do Bálsamo (óleo-resina) de copaíba. Por concentrarem a maioria dos compostos sesquiterpênicos os óleos essenciais são conhecidos por sua elevada atividade farmacológica quando comparadas às partes dos quais são extraídos. Este processo extrativo é usualmente realizado por arraste a vapor das folhas, flores e óleos-resina de diversas espécies vegetais (BIZZO; HOVELL; REZENDE, 2009). Desde o período pré-colombiano os índios brasileiros já costumavam utilizar o óleo de copaíba externamente para tratamento de doenças de pele e proteção contra picadas de insetos. Após a introdução deste óleo em compêndios oficiais como antiblenorrárigo, seu uso como cicatrizante, antiinflamatório, antimicrobiano, diurético e expectorante passou a ser difundido popularmente. Além disto, comercialmente este óleo vem sendo utilizado em estabelecimentos farmacêuticos de manipulação na produção de sabonetes e outros cosméticos para tratamento de acnes e processos inflamatórios faciais (EL-NUNZIO, 1985). Atualmente, o óleo de copaíba é amplamente utilizado na medicina popular como antisséptico, anti-inflamatório e cicatrizante (LOZENZI; MATOS, 2008). Pesquisas científicas vêm atribuindo ao óleo de copaíba atividades antibacteriana (MENDONÇA; ONOFRE, 2009a; SOUZA et al., 2011), antifúngica (DEUS; ALVES; ARRUDA, 2011), anti-Leishmania (SANTOS et al., 2012), anti-inflamatória (BASILE 19 et al., 1988) cicatrizante (COMELLI JÚNIOR et al., 2010), antinociceptiva (GOMES et al., 2007), larvicida (SILVA; ZANON; SILVA, 2003), antineoplásica (GOMES NDE et al., 2008), entre outras (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b). Diante do descrito, a atividade antimicrobiana destaca-se devido à necessidade da inserção de novos medicamentos que apresentem potencial atividade contra fungos e bactérias. Atualmente, pesquisas vêm trazendo resultados preliminares de atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae dentre outros micro-organismos, porém os parâmetros de resistência envolvidos, a cinética de morte e o mecanismo de ação ainda precisam ser elucidados (LIMA et al., 2011; PIERI et al., 2012a). 2.1.2 O óleo de rã-touro A rã-touro é um anfíbio da espécie Rana catesbeiana Shaw, que também é chamada de Lithobates catesbeianus, pertencente à ordem Anura e família Ranidae. Esta família possui mais de 9 gêneros e 300 espécies identificadas. As espécies desta família abrangem os anfíbios menores (Asiáticos) e os de porte maior (Americanos). Após a deposição dos ovos e a liberação dos girinos, estes passam por cerca de 2-4 anos nesta forma até atingir a idade adulta (ZUG; VITT; CALDWELL, 2001). A rã-touro (Figura 2) vive preferencialmente em ambientes aquáticos ou terrestres úmidos, é nativa da América do Norte e foi trazida ao Brasil por volta de 1935 (NÓBREGA et al., 2007). Figura 2 - Rã-Touro (Rana catesbeiana Shaw). (Fonte: GONÇALVES; OTTA, 2008). O Rana catesbeiana Shaw é um animal ectotérmico, isto é, seu metabolismo depende da temperatura ambiente. Este fato interfere no processo de criação do animal, 20 pois, quando a alimentação ocorre numa faixa de temperatura ótima, ocorre maior consumo de alimentos e absorção de nutrientes, possibilitando maior ganho de massa e aumento do tecido adiposo (BRAGA; LIMA, 2001). Esta espécie tem sido cada vez mais requerida no mercado internacional no ramo alimentício, estimulando assim, seu cultivo em países Latino-americanos e Asiáticos (OLVERA-NOVOA; ONTIVEROSESCUTIA; FLORES-NAVA, 2007). A criação da rã-touro tem buscado reduzir as perdas na produção de modo que seus músculos são utilizados para fins alimentícios, o couro é utilizado pela indústria de bolsas e sapatos, a carcaça e patas são requeridas para produção de ração para girinos da mesma espécie. A carne de rã vem se tornando cada vez mais apreciada, não só pelo seu sabor, mas também por ser fonte de proteína de alto valor biológico (GONÇALVES; OTTA, 2008a). O tecido adiposo das rãs, material de descarte nos ranários, vem sofrendo aproveitamento biotecnológico e crescendo o seu uso para fins científicos, através da extração do óleo. A extração do óleo pode ser realizada com diferentes parâmetros, porém destaca-se que o uso de temperaturas mais brandas (aproximadamente 80 ºC) confere uma melhor relação de rendimento/características físico-químicas adequadas do óleo quando comparado a processos extrativos a temperaturas elevadas (200 ºC) ou temperaturas baixas (35 ºC) (MÉNDEZ et al., 1998a; LOPES, V. D. S. et al., 2010). Estudos de caracterização química do óleo demonstram seu potencial farmacológico, devido a presença de 62 compostos de ácidos graxos, dentre eles, ácido oleico (ômega 9), ácido linoleico (ômega 6), ácido linolênico (ômega 3), além dos ácidos esteárico, palmítico, mirístico (MÉNDEZ et al., 1998a; LOPES, V. D. S. et al., 2010). O óleo de rã-touro é utilizado pela população do estado do Rio Grande do Norte, Brasil, no tratamento de processos alérgicos e asma (LOPES, V. D. S. et al., 2010). Além disto, sua atividade antioxidante e reguladora de ácidos graxos vem sendo estudada (SILVA et al., 2004), assim como a atividade antiedematogênica, porém não são encontrados relevantes relatos científicos de sua atividade antimicrobiana. Entretanto, os estudos realizados até então demonstram elevada concentração de ácidos graxos do tipo ômega e estes são citados como responsáveis por exercer atividade antimicrobiana em alguns produtos (ISAACS; LITOV; THORMAR, 1995b; MÉNDEZ et al., 1998a; LOPES, V. D. S. et al., 2010). Diante deste cenário, o estudo da atividade antimicrobiana do óleo de rã-touro de forma sustentável e sem prejudicar a biodiversidade vem a contribuir para a busca de 21 novos compostos antimicrobianos e para seu uso no tratamento de infecções. No entanto, este óleo possui algumas desvantagens quando utilizado na forma in natura, dentre elas a baixa espalhabilidade, o odor desagradável e a baixa absorção cutânea. Sendo assim, se lança a possibilidade de desenvolvimento de sistemas emulsionados com base em óleos naturais, que almejam diminuir estes problemas e proporcionar uma liberação modificada dos princípios ativos. 2.2 A PELE A pele é um órgão humano que corresponde a cerca de 15 % do peso total do corpo de um indivíduo adulto e possui uma área de superfície em torno de 2 m2 (Figura 3). Sua camada mais externa é a epiderme, formada principalmente por queratinócitos (95 %), além de melanócitos e células do sistema imune. A epiderme pode ser subdividida em camadas de acordo com o grau de maturação dos queratinócitos e é de grande importância para o estudo dos quadros infecciosos, visto que alguns microorganismos possuem os queratinócitos como alvo de instalação e de nutrição (CANDI; SCHMIDT; MELINO, 2005). Figura 3 - Corte histológico da pele apresentando as três camadas e estruturas anexas (a). Disposição da epiderme, monócitos basais e vasos sanguíneos na derme (b). (Fonte: LAI-CHEONG; MCGRATH, 2009). A camada posterior à epiderme é a derme, que é constituída na sua maioria por colágeno (cerca de 70 % do peso seco da derme), além de outros elementos intersticiais 22 e celulares, como os fibroblastos, células dendríticas e histiócitos. Além disso, a derme é irrigada por vasos sanguíneos, linfáticos e terminações sensoriais. A camada mais profunda da pele é a hipoderme, que é formada especialmente por adipócitos e constitui a grande reserva de tecido adiposo do organismo (LAI-CHEONG; MCGRATH, 2009). A pele é um órgão constantemente exposto a diferentes micro-organismos, a maioria dos quais vive comensalmente, embora outros sejam extremamente patogênicos e causem infecções em todo o organismo (BHAGAVATULA; POWELL, 2011). Os organismos comensais, de acordo com o status imunológico do hospedeiro, podem provocar infecções oportunistas (SLAVIN; CHAKRABARTI, 2012). As bactérias dos gêneros Staphylococcus, Corynebacterium, Propionibacterium, Micrococcus, Streptococcus, Brevibacterium, Acinetobacterium e Pseudomonas são descritas por alguns estudos como gêneros de bactérias residentes da pele humana. Além das bactérias, algumas leveduras do gênero Candida vivem comensalmente nas superfícies de mucosas. Os indivíduos em situações de imunodepressão e hiperglicemia são predispostos a desenvolverem quadros de infecção cutânea na presença dessas leveduras (UENO et al., 2011). 2.3 MICRO-ORGANISMOS CAUSADORES DE INFECÇÕES CUTÂNEAS As infecções de pele podem ser causadas por agentes bacterianos, fúngicos e virais, as quais têm como fatores determinantes do seu prognóstico o micro-organismo causador, as camadas e as estruturas da pele afetadas (FLEISCHER; FELDMAN; RAPP, 2000). As bactérias são as causas mais recorrentes de infecções de pele e mucosas. Todavia, os fungos também são de alta recorrência e de difícil tratamento, quando comparados às bactérias. As infecções virais são de difícil erradicação e nos casos mais comuns, o vírus se mantém em estado latente e após eventos de diminuição da imunidade do indivíduo este retorna ao estado ativo e os sintomas se tornam evidentes novamente (DAWSON; DELLAVALLE; ELSTON, 2012). Assim sendo, é importante ressaltar alguns dos principais causadores das doenças que acometem a pele. Dentre as bactérias mais relevantes nas infecções de pele, o gênero Staphylococcus se destaca. S. aureus, e mais recentemente S. epidermidis vem adquirindo padrões de resistência e se tornando grandes causadoras de infecções cutâneas (OUMEISH; OUMEISH; BATAINEH, 2000). 23 Os fungos filamentosos e os leveduriformes também são causadores de infecções de pele e mucosas. Infecções superficiais são comumente causadas por dermatófitos dos gêneros Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton. Além destes, as leveduras do gênero Malassezia e, especialmente, as do gênero Candida são grande causadoras de infecções oportunistas da pele e mucosas (UENO et al., 2011). As espécies de Candida são comensais dos humanos, mas em quadros de imunossupressão agem como agentes oportunistas e causam infecções de pele, mucosa, unhas e até infecção disseminada, denominada de candidemia. Os fatores de virulência são importantes na conversão de agentes comensais em causadores de infecções. Destacam-se como fatores de virulência, a adesão a células epiteliais e endoteliais, formação de hifas (fenômeno conhecido como morfogênese), formação de biofilme, produção de fosfolipases e proteinases, além do “phenotypic switching” (JAYATILAKE; TILAKARATNE; PANAGODA, 2009). 2.3.1 Staphylococcus aureus S. aureus é uma bactéria extracelular gram-positiva causadora da maioria das doenças infecciosas de pele. Dentre elas, destacam-se impetigo que é de localização superficial, além das mais invasivas como celulites, foliculites e abscessos subcutâneos (KRISHNA; MILLER, 2012). Cepas de S. aureus apresentam uma maior resistência a altas concentrações salinas, é possível observar esse comportamento no cultivo em ágar manitol salgado devido sua alta concentração de Cloreto de Sódio (7,5 %), evidenciando a fermentação do D-manitol com liberação de intermediários ácidos e provocando o aparecimento de coloração amarela em presença do indicador Vermelho de fenol (Figura 4) (STOAKES et al., 2006). 24 Figura 4 - Cultivo de S. aureus ATCC 29213 em ágar manitol salgado (Fonte: autoria própria). Um dos fatores mais relevantes na instalação de uma infecção cutânea por S. aureus é sua fixação a componentes como fibrinogênio, fibronectina e citoqueratinas através do reconhecimento de moléculas matriciais adesivas. Esse mecanismo tem grande relevância em pacientes com dermatites, pois a resposta celular a essa patologia é mediada por citocinas Th2 (como IL-4) que aumentam a quantidade de fibrinogênio e fibronectina no local da inflamação, propiciando condições ideais para a instalação de S. aureus (CHO et al., 2001). Além disso, esta bactéria produz superantígenos (enterotoxinas A e B, toxina 1 da síndrome do choque tóxico) que escapam da resposta mediada por citocinas Th2, ação que favorece ainda mais a instalação do micro-organismo (WEIDENMAIER; GOERKE; WOLZ, 2012). 2.3.2 Staphylococcus epidermidis S. epidermidis é um micro-organismo comensal que possui como principal fator de virulência sua alta capacidade de adesão a superfícies sólidas, entre elas dispositivos médico-hospitalares. Assim sendo, devido à ampla utilização de cateteres em pacientes hospitalizados, este micro-organismo tornou-se um importante patógeno em infecções nas unidades hospitalares (ROGERS; FEY; RUPP, 2009). Adicionalmente, com a disseminação das cepas mais resistentes, a pele que é um habitat natural vem se tornando sitio alvo de infecções. À exemplo disto, as doenças causadas por S. epidermidis desencadeadas pela formação de biofilmes em equipamentos médicos são 25 mais difíceis de serem tratadas. Os biofilmes são ricas comunidades microbianas, constituídas de células sésseis embebidas em uma matriz exopolimérica, assim os micro-organismos permanecem protegidos da alta quantidade de antimicrobianos, em contrapartida se mantêm constantemente expostos a baixas concentrações dos fármacos antimicrobianos, gerando um mecanismo de resistência frente à maioria dos medicamentos (VUONG et al., 2004). Na figura 5 são observadas colônias de S. epidermidis ATCC 12228 em ágar manitol salgado. De modo semelhante aos outros Staphylococcus, S. epidermidis é capaz de crescer em ambiente com grande concentração salina, no entanto, difere-se de S. aureus por não provocar fermentação do D-manitol (STOAKES et al., 2006). Figura 5 - Cultivo de S. epidermidis ATCC 12228 em ágar manitol salgado. (Fonte: autoria própria). 2.3.3 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa causadora de diversas infecções, dentre elas, artrite séptica em pacientes que fazem aplicações injetáveis nas articulações, pneumonia, otite externa, bacteremia (ZHANEL et al., 2010; HIRSCH et al., 2012), ceratite por lente de contato (TRAN et al., 2012), infecções em regiões de queimaduras e foliculite (AGUSTI-MEJIAS et al., 2012). Um de seus principais fatores de virulência é a produção de biofilmes (TART; WOZNIAK, 2008). Esta bactéria vem apresentando progressivos aumentos no quadro de resistência a diversos antimicrobianos (COOK et al., 2008). Na figura 6 pode-se observar crescimento de P. aeruginosa ATCC 27853 em ágar cetrimida, evidenciando a pigmentação esverdeada 26 provocada pela produção de piocianina e pioverdina (BREIDENSTEIN; DE LA FUENTE-NÚÑEZ; HANCOCK, 2011). Figura 6 - Cultivo de P. aeruginosa ATCC 27853 em ágar cetrimida. (Fonte: autoria própria). 2.3.4 Candida albicans C. albicans é a espécie mais estudada do gênero e apresenta todo seu genoma sequenciado. Adicionalmente, essa espécie é a mais prevalente em infecções. Em condições normais, C. albicans é predominantemente encontrada na mucosa gastrointestinal. Nas mucosas, este fungo tem seu crescimento controlado pela microbiota residente, sistema imune inato e pelas barreiras epiteliais (GOW; HUBE, 2012). Até o início da década de 90, C. albicans ainda era a espécie mais isolada de infecções causadas por Candida spp, sendo responsável por cerca de 80% dos casos (FIDEL; VAZQUEZ; SOBEL, 1999). Desde o início dos anos 2000, as espécies de Candida não-C.albicans vem ganhando mais destaque nos estudos clínicos (KRCMERY; BARNES, 2002), visto que os estudos apresentam uma redução de infecções por C. albicans para cerca de 40% conforme a população avaliada e sítios de infecção (KRCMERY; BARNES, 2002). Deste modo, sabe-se que é importante o estudo de outras espécies diferentes de Candida devido ao elevado índice de mortalidade em casos de candidemia e maior padrão de resistência a antifúngico. Neste contexto, espécies como C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis, além de outras menos prevalentes como C. dubliniensis, C. lusitaniae, C. 27 rugosa e C. guilliermondii vem sendo cada vez mais estudadas e novas espécies sendo descobertas (TAVANTI et al., 2005). 2.3.5 Candida parapsilosis Apesar de C. albicans continuar sendo a espécie mais isolada dentre as demais do gênero, C. parapsilosis tem sido a segunda mais encontrada em isolados sanguíneos de indivíduos da América Latina e Ásia (TAVANTI et al., 2005). Estudos vêm demonstrando que esta espécie é a mais heterogênea geneticamente dentro do gênero. A espécie vem sendo aos poucos identificada como complexo Candida parapsilosis, em que existem três grupos distintos: o grupo I (C. parapsilosis), grupo II (C. orthopsilosis) e grupo III (C. metapsilosis). A nomenclatura do grupo foi feita por analogia aos compostos químicos aromáticos. Visto que já existia a espécie com prefixo -para, as demais foram nomeadas -ortho e -meta. Clinicamente esta nova nomenclatura ainda não está sendo levada em consideração, porém, à medida que o número de casos de pacientes infectados pelas novas espécies se aproximar dos casos de infecções por C. parapsilosis, espera-se que as diferentes espécies sejam levadas em consideração, visto que a diversidade genética influencia nos parâmetros de virulência e resistência (TAVANTI et al., 2005). 2.3.6 Candida tropicalis Candida tropicalis é uma espécie frequentemente encontrada em pacientes neutropênicos e em tratamento com medicamentos quimioterápicos. Em aspectos gerais, esta espécie é tão virulenta quanto C. albicans. A espécie C. tropicalis tem mostrado maior poder de disseminação nos pacientes neutropênicos que as demais espécies deste gênero, contribuindo assim para a alta mortalidade de pacientes em tratamento. Inicialmente, a espécie foi descrita como pouco susceptível a Miconazol e Cetoconazol, enquanto possuía relevante susceptibilidade a Fluconazol e Anfotericina B, porém, sabe-se que atualmente vem adquirindo resistência a esses antifúngicos devido ao uso indiscriminado (KRCMERY; BARNES, 2002). 28 2.3.7 Candida krusei Candida krusei é uma espécie emergente que tem ganhado relevância em casos de infecções em pacientes leucêmicos e transplantados, em sua maioria, associadas ao uso de Fluconazol como profilaxia, sendo raras em pacientes cirurgiados e neonatos. Sabe-se ainda que cerca de 30% das cepas reportadas como resistentes aos azólicos, são resistentes a Anfotericina B (KRCMERY; BARNES, 2002). Dentre as demais espécies mais prevalentes de Candida, suas características macroscópicas são diferenciadas especialmente pelo aspecto rugoso das colônias, além disso, em meio cromogênico CHROMagar as colônias apresentam coloração rosa claro (Figura 7). Figura 7- Espécies de Candida diferenciadas em meio cromogênico CHROMagar Candida. A: C. glabrata; B: C. parapsilosis; C: C. albicans; D: C. Tropicalis; E: C. krusei. (Fonte:(ODDS; BERNAERTS, 1994). 29 2.3.8 Candida glabrata Dentre o gênero Candida, a espécie C. glabrata é a única espécie das mais estudadas que não forma pseudo-hifas em temperaturas acima de 37ºC. Seus blastoconídeos são considerados menores que os de C. albicans e suas colônias em ágar Saboraud Dextrose são semelhantes, de modo que a diferenciação macroscópica pode ser auxiliada pelo semeio em CHROMagar Candida, em que o crescimento de C. glabrata tem coloração rosa escuro (Figura 5) (FIDEL; VAZQUEZ; SOBEL, 1999). No âmbito hospitalar esta espécie vem se tornando relevante devido ao crescente número de infecções proporcionadas pela diminuída sensibilidade aos antifúngicos azólicos (FIDEL; VAZQUEZ; SOBEL, 1999). 2.4 SISTEMAS EMULSIONADOS As emulsões podem ser definidas como sistemas constituídos da mistura de, no mínimo, dois líquidos imiscíveis, um disperso no interior de outro, formando gotículas de aproximadamente 1µm relativamente estabilizadas pela presença de um sistema tensoativo. Estes sistemas são utilizados para diversas finalidades, dentre elas para produção de cosméticos, alimentos, sistemas contendo imunobiológicos e fármacos insolúveis (BIBETTE; CALDERON; POULIN, 1999). Sistemas emulsionados são bastante úteis na veiculação de princípios ativos de administração desvantajosa quando comparados a sistemas mais tradicionais, como suspensões e soluções. Estes sistemas compartimentalizados são bem estabelecidos na indústria cosmética devido a capacidade de incorporar ativos insolúveis e proporcionar espalhabilidade e hidratação desejadas. Na indústria farmacêutica, além destas vantagens para desenvolvimento de formulações de uso tópicos as emulsões proporcionam adequadas absorções e garantem a segurança e eficácia durante o tratamento, baseado na liberação prolongada dos componentes ativos e na redução da liberação imediata destes compostos, reduzindo assim a toxicidade (SCHARAMM, 2005). Assim, o desenvolvimento de emulsões a base de produtos naturais, especialmente para uso tópico, para tratamento de doenças de pele vêm sendo requisitado como uma necessidade da sociedade afim de melhor aproveitar as propriedades terapêuticas que os produtos naturais têm a oferecer (XAVIER-JÚNIOR et al., 2012). 30 Os tensoativos são substâncias anfifílicas que interagem com as fases interna e externa diminuindo a tensão interfacial entre os líquidos, favorecendo a emulsificação e melhorando a estabilização do sistema (BIBETTE; CALDERON; POULIN, 1999). Usualmente a quantidade de tensoativos utilizada para gerar emulsões varia de 1 a 10 %. Como consequência dos componentes deste sistema e da estabilização gerada pelos tensoativos, o comportamento de fases deste tipo de sistema disperso é de extrema importância. Este comportamento de fases é uma propriedade relativa ao equilíbrio termodinâmico que ocorre nos sistemas formados e depende das variáveis relacionadas ao sistema, isto é, natureza dos diferentes componentes, temperatura, pressão e outros (SJÖBLOM, 2006). As emulsões apresentam-se geralmente como Óleo em Água (O/A), Água em Óleo (A/O) e ainda como Emulsões Múltiplas (O/A/O ou A/O/A) como esquematizado na figura 8 (FERRARI et al., 2008). Do mesmo modo que outros coloides, as emulsões exibem propriedades características do grupo: movimento Browniano, transição de fases reversível que pode ser gerada por forte alteração na interação das gotículas e ainda transições de fase irreversíveis levando a desestabilização e colapso do sistema (BIBETTE; CALDERON; POULIN, 1999). Relativo à sua formação e estabilidade, sabe-se também que, as emulsões possuem melhor estabilidade quando a mistura de tensoativos atinge o equilíbrio hidrofílico-lipofílico (EHL) requerido pela fase oleosa da emulsão usada no sistema (GRIFFIN, 1949; FERREIRA et al., 2010). Um dos métodos mais utilizados para produção de emulsões em nível de desenvolvimento baseia-se na inversão de fases. Esta inversão pode ser realizada de diversas maneiras, dentre eles a catastrófica, que consiste em adicionar crescentes quantidades do componente da fase interna a uma emulsão pré-formada (TYRODE et al., 2004). Além desta, a inversão transicional baseia-se na elevação da temperatura durante o processo de produção de uma emulsão até ultrapassar o ponto chamado de temperatura de inversão de fases, após atingida esta temperatura, o processo de produção da emulsão é iniciado devido a mudança da afinidade dos tensoativos. Este método é bastante utilizado, pois há a formação momentânea do sistema com uma característica contrária a desejada, e à medida que o componente que irá compor a fase externa é adicionado, o sistema inverte de fases, obtendo-se o sistema final devido à temperatura específica de inversão de fases dos tensoativos utilizados para formação do sistema (SJÖBLOM, 2006). 31 Figura 8 - Esquema dos diferentes tipos de emulsão, O/A (A), A/O/A (B), A/O (C) e O/A/O (D). (Fonte: autoria própria) Os parâmetros de tamanho de gotícula, distribuição das populações de gotículas, EHL e o potencial zeta são essenciais para a formulação de uma emulsão estável. Além destes, pH e condutividade podem ser utilizados objetivando auxiliar na identificação do tipo de sistema obtido. Quando estes parâmetros não são bem estudados e aplicados a emulsão pode não vir a ser formada ou pode se desestabilizar com maior facilidade devido a uma série de fenômenos (BIBETTE; CALDERON; POULIN, 1999). As emulsões estão sujeitas a fenômenos como cremagem, floculação, coalescência, separação de fases e pontes de Ostwald podem ocorrer nesses sistemas. A cremagem ocorre quando constituintes da emulsão sedimentam ou flutuam, levando a formação de uma porção mais opaca e cremosa na superfície do sistema, isto pode ocorrer devido a grandes diferenças de densidade dos componentes (ROLAND et al., 2003). No fenômeno de floculação, gotículas se aproximam formando agregados, porém estas são separadas por uma fina camada de constituintes da fase externa. A coalescência é caracterizada por grandes distribuições de tamanhos de gotícula devido à fusão das gotículas inicialmente formadas (ROLAND et al., 2003). No processo de instabilidade por pontes de Ostwald, pequenas gotículas com restrita solubilidade na fase externa tendem a se agregar a maiores gotículas, levando ao aumento das mesmas. Por fim, a separação de fases ocorre quando não é possível reverter o quadro de instabilidade do sistema (ROLAND et al., 2003). Os sistemas emulsionados tornam-se alternativas viáveis como sistemas de liberação de óleos naturais, visto que quando administrados in natura estes apresentam problemas de espalhabilidade, biodisponibilidade, além de odor e sabor muitas vezes desagradáveis (XAVIER-JÚNIOR et al., 2012). 32 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Avaliar a atividade antimicrobiana de emulsões contendo óleo de rã- touro e óleos de copaíba (óleo-resina e essencial) frente a leveduras e bactérias. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Obter óleo essencial de copaíba a partir de extração do óleo-resina; Realizar a caracterização química dos óleos do estudo através de Cromatografia Gasosa acoplada a detector de Espectroscopia de Massa; Obter sistemas emulsionados a base de óleo de rã-touro e óleos resina e essencial de copaíba; Realizar testes de triagem microbiológica dos sistemas e dos óleos puros frente a diferentes cepas clínicas e de referência da American Type Culture Collection (ATCC), dentre elas, leveduras oportunistas, bactérias gram-negativas e grampositivas; Conhecer a Concentração Inibitória Mínima dos sistemas que apresentarem atividade na triagem microbiológica; Identificar as frações e compostos antimicrobianos dos óleos de copaíba e de rãtouro através de Bioautografia e CG-EM; Determinar o efeito das emulsões sobre a formação de biofilmes pelos microorganismos. 33 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 MATERIAIS 4.1.1 Substâncias químicas O óleo de copaíba (Copaifera langsdorffii) foi adquirido pela Flores & Ervas (Piracicaba, SP, Brasil), o óleo de rã-touro foi doado pela Asmarana Produtos Naturais (Natal, RN, Brasil), o Span 80® (sorbitan 80 monooleate) foi adquirido da Sigma Aldrich Inc (St Louis, MO, USA), Tween 20® (polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate) pela VETEC (Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Os meios de cultura: Ágar Mueller-Hinton, Ágar Saboraud Dextrose, Caldo BHI (Brain Heart Infusion) e Caldo Mueller Hinton foram obtidos da Himedia (Mumbai, MU, India). Todos os reagentes utilizados foram de grau farmacêutico. 4.1.2 Micro-organismos As cepas bacterianas American Type Culture Collection (ATCC) utilizadas neste estudo foram: S. aureus ATCC 29213, S. epidermidis ATCC 12228 e P. aeruginosa ATCC 27853. De cada bactéria citada foram utilizadas três cepas (uma ATCC e duas clínicas). As leveduras utilizadas foram todas do gênero Candida, de modo que foram utilizadas uma cepa ATCC e uma amostra clínica (AC) de cada espécie conforme descrito: C. albicans ATCC 90028 e AC (14), C. parapsilosis ATCC 22019 e AC (73), C. glabrata ATCC 2001 e AC (15V3C), C. krusei ATCC 6258 e AC (LMMM54), C. tropicalis ATCC 13803 e AC (67A), de modo que todas as cepas clínicas de leveduras foram obtidas de sítio vaginal. Todas as cepas clínicas e de referência foram fornecidas pelo LMMM (Laboratório de Micologia Médica e Molecular), UFRN. As bactérias foram mantidas em Caldo BHI e as leveduras em Caldo YPD (Yeast-PeptoneDextrose), estocadas a -80 °C até o início dos experimentos. 34 4.2 MÉTODOS 4.2.1 Extração do óleo essencial de copaíba O óleo-resina de copaíba foi submetido à hidrodestilação com água deionizada por um período de 4 horas a 100 ºC utilizando o Clevenger. O óleo essencial obtido após extração foi seco com sulfato de sódio anidro e filtrado com uma membrana porosa (GALVÃO et al., 2012). Além do óleo essencial foi obtida fração resinosa remanescente do processo de hidrodestilação. 4.2.2 Análise da composição química dos óleos As amostras de óleo-resina de copaíba, óleo essencial de copaíba e óleo de rãtouro foram submetidas à análise de sua composição. Adicionalmente, foram realizadas análises das amostras metiladas, objetivando a melhor investigação dos componentes dos óleos, visto que o processo facilita a melhor separação e volatilização dos componentes que possuem ácidos carboxílicos. A derivatização das amostras foi realizada através de um processo utilizando diazometano, em que os óleos a serem derivatizados foram diluídos em acetato de etila, seguido da adição do diazometano e posterior evaporação, obtendo assim a amostra metilada. As análises foram realizadas em um cromatógrafo à gás Hewlett-Packard 6890 acoplado a detector seletivo de massas HP-5975 (CG-EM). A coluna utilizada para realização das análises foi a HP-5MS capilar (30 m x 0.25 mm x 0,25 µm). Para a amostra de óleo essencial de copaíba as condições cromatográficas foram as seguintes: a temperatura inicial da coluna foi de 60 ºC, com posterior aquecimento de 3 ºC/min até 240 ºC mantendo essa temperatura por 7 min. As temperaturas do Detector e Injetor foram 250 ºC e 220 ºC, respectivamente. As condições para as demais amostras foram: temperatura inicial da coluna: 110 ºC, seguido de aquecimento de 5 ºC/min até 280 ºC (26 min). Temperaturas do detector e injetor foram 300 ºC e 250 ºC, respectivamente. O volume injetado de cada amostra foi de 1 µL e a vazão do gás de arraste (Hélio super seco) foi 1,0 mL/min, independente do método. A identificação dos compostos foi baseada na comparação dos espectros de massa obtidos com os da biblioteca NIST (Software package, Finnigan) e dos 35 respectivos índices de retenção com a literatura. A determinação quantitativa foi baseada na área dos picos analisados. 4.2.3 Preparo e caracterização das emulsões Foram preparadas três emulsões distintas conforme desenvolvidas a partir de estudos anteriores, em que a fase oleosa foi óleo-resina de copaíba, óleo essencial de copaíba e óleo de rã-touro. As emulsões óleo em água continham a seguinte formulação: 5 % (p/p) de óleo, 93 % (p/p) de água, 1,56 % (p/p) de Tween 20® e 0,44 % (p/p) de Span 80® (XAVIER-JÚNIOR et al., 2012). Os sistemas foram preparados conforme a técnica de inversão de Fases (YU et al., 1993). A quantidade requerida de Span 80® foi dispersa na fase oleosa. Enquanto que o Tween 20® foi disperso na fase aquosa. As fases foram aquecidas separadamente a 70 ºC e em seguida, para formação do sistema, e em seguida foram homogeneizadas utilizando Ultra-Turrax® T 25 (IKA, Staufen, Germany) a 13.000 rpm por 10 minutos. Após um período de 24 horas do preparo das amostras, as análises de propriedades físico-químicas foram realizadas à temperatura de 25 ± 2 °C. O pH foi mensurado utilizando um pHmetro PG-2000 (GEHAKA, Morumbi, SP, Brasil). A condutividade elétrica foi avaliada utilizando um condutivímetro DM-32 (Digicrom Analytical, Campo Grande, SP, Brasil). Adicionalmente, as amostras foram diluídas em água deionizada numa proporção de 1:100 e foram avaliadas as medidas de tamanho de gotícula, polidispersividade e potencial zeta utilizando um ZetaPlus (Holtsville, NY, USA). 4.2.4 Triagem antimicrobiana A triagem foi realizada com os micro-organismos citados no item 4.1.2 frente às seguintes amostras diluídas separadamente em DMSO 1%: Óleo-resina e óleo essencial de copaíba, óleo de rã-touro, além do resíduo resinoso de copaíba obtido como descarte do processo de extração do óleo essencial. Também foram utilizadas soluções aquosas de Tween 20® 1,56 %, Span 80® 0,44 %, DMSO 1 %, Cloranfenicol 1,5 mg/mL, Cetoconazol 2,5 mg/mL e Anfotericina B 5 mg/mL como controle. Cloranfenicol foi usado frente às bactérias, enquanto Cetoconazol e Anfotericina B foram os antimicrobianos de referência frente aos fungos, de modo que as concentrações finais 36 por poço fosse equivalente a dos discos padronizados (CLSI, 2009b; a). As emulsões somente foram avaliadas na investigação da concentração inibitória mínima após a determinação dos resultados desta triagem. As bactérias utilizadas tiveram crescimento prévio de 24 h em ágar BHI e as leveduras de 48 h em ágar Saboraud Dextrose. A avaliação inicial da atividade antibacteriana e antifúngica foi realizada utilizando a adaptação para poços do teste de susceptibilidade com Agar Muller-Hinton para bactérias e Ágar Mueller-Hinton + Glicose 2% e 0,5 µg/mL de Azul de metileno para as leveduras (CLSI, 2009b; a). Uma quantidade de 20 µL de cada amostra foi adicionada aos poços no ágar após o semeio dos micro-organismos. O experimento em triplicata foi repetido três vezes a fim de garantir a confiabilidade dos resultados. As placas foram incubadas a 35 ± 2 ºC por 24 h e 48 h para as bactérias e fungos, respectivamente. A avaliação foi feita pela medição dos halos de inibição, considerando a medida inicial a partir de 5 mm, visto que esse é o diâmetro do poço. 4.2.5 Concentração Inibitória Mínima (CIM) A determinação da CIM foi realizada após a triagem dos micro-organismos com os óleos diluídos em DMSO a 1 % e as emulsões contendo estes óleos. O procedimento com os óleos e emulsões de copaíba foi feito com os micro-organismos que se demonstraram sensíveis na triagem, enquanto para as amostras de rã-touro foi determinada a CIM frente aos micro-organismos de referência (ATCC). As bactérias utilizadas tiveram crescimento prévio de 24 h em ágar BHI e as leveduras de 48 h em ágar Saboraud Dextrose. Para determinação da CIM das amostras foi utilizado o método de microdiluição em caldo. Para isto, foram realizadas sucessivas diluições volumétricas das amostras antimicrobianas em Caldo Mueller-Hinton estéril em concentrações de 1,0 a 248750,0 mg/L por poço (OSTROSKY et al., 2008). A suspensão de cada micro-organismo foi preparada em solução salina 0,9 % ajustada à escala 0,5 de McFarland e em seguida diluída em caldo Mueller-Hinton para obter uma concentração final entre 0,5 a 2,5 x 103 UFC/mL. Posteriormente, 100 µL de cada diluição foi adicionada nos poços. O teste foi realizado em triplicata e em seguida as microplacas foram incubadas a 35 ± 2 ºC em agitador horizontal (Tecnal) a 150 rpm por 24 h e 48 h para as bactérias e leveduras, respectivamente. 37 4.2.6 Bioautografia Para a realização da bioautografia, somente foram utilizados o óleo de rã e o óleo-resina de copaíba frente aos seguintes micro-organismos: S. aureus ATCC 29213, S. epidermidis ATCC 12228, P. aeruginosa ATCC 27853, C. albicans ATCC 90027, C. parapsilosis ATCC 22019, C. glabrata ATCC 2001, C. krusei ATCC 6258 e C. tropicalis ATCC 13803. As bactérias utilizadas tiveram crescimento prévio de 24h em ágar BHI e as leveduras de 48h em ágar Saboraud Dextrose. Foram realizadas cromatografias de camada delgada (CCDs) utilizando placas de HPTLC (High performance thin layer chromatography) com uma mistura de hexano/acetato de etila (9:1), como fase móvel. As amostras de óleo (copaíba e rãtouro) foram diluídas em metanol (2:8) e aplicadas com capilares na placa cromatográfica. A corrida cromatográfica foi de 5,0 cm, realizada com revelação por vanilina sulfúrica em estufa a 100 ºC por 5 min (Placa 1). Este revelador foi preparado conforme padrões farmacopéicos (ANVISA, 2010). Posteriormente, esta cromatografia foi replicada para cada micro-organismo, onde foram introduzidas em placas de Petri estéreis e colocadas em contato com o meio de cultura contendo a cepa em estudo (Placas 2), uma terceira CCD foi realizada para extrair os compostos das bandas cromatográficas , seguindo a caracterização por CG-MS da fração que apresentou atividade (Placas 3). O procedimento de bioautografia foi realizado conforme seguinte metodologia: Em tubos cônicos (Falcon) de 50 mL foram preparados os inóculos conforme escala de turvação 0,5 de McFarland em ágar fundido estéril a temperatura de aproximadamente 50 ºC. As bactérias foram inoculadas em ágar Mueller-Hinton, enquanto as leveduras foram inoculadas em ágar Mueller-Hinton acrescido de glicose 2 % e azul de metileno 0,5 µg/mL, conforme recomendação do CLSI para teste de sensibilidade (CLSI, 2009b; a). Depois de inocular cada micro-organismo com as placas de CCD (Placas 2) houve incubação a 35 ºC por 24 h para bactérias e 48 h para as leveduras. O resultado foi dado pela visualização de um halo de inibição na placa 2 ao redor de uma banda cromatográfica (Rf) que continha as substâncias antimicrobianas no devido óleo testado. Neste ponto foi medido o fator de retenção (Rf) das substâncias com base na banda cromatográfica que gerou um halo de inibição. Em seguida, a sílica 38 das áreas de inibição das placas 3, com o mesmo valor de Rf das placas 2, foram raspadas para cada micro-organismo. Para extração dos componentes do óleo, foi pesado 20 mg das amostras em sílica e foi adicionado 1,0 mL de acetato de etila seguido de 25 minutos de agitação em banho de ultrassom e filtração. Posteriormente, estas frações antimicrobianas foram submetidas a análises em Cromatografia Gasosa acoplada a detector de Espectrometria de Massas (CG-EM), conforme metodologia no tópico 4.2.2. 4.2.7 Atividade antibiofilme Os mesmos micro-organismos submetidos a analise da CIM foram analisados na avaliação da atividade antibiofilme frente aos óleos e emulsões previamente utilizados no teste de determinação da CIM. As cepas foram inoculadas em Caldo Mueller-Hinton e ajustadas conforme escala 0,5 McFarland. As amostras foram diluídas em Caldo Mueller-Hinton nos poços (12,5 %) e em seguida as suspensões de micro-organismos foram adicionadas. As microplacas foram incubadas a 35 ± 2ºC em agitador horizontal a 150 rpm por 24 h e 48 h para as bactérias e leveduras, respectivamente. Em seguida, o sobrenadante dos poços foi removido e os poços lavados com água estéril para remoção dos micro-organismos não aderidos. O conteúdo de micro-organismos aderidos foi corado com 200 µL de cristal violeta por 20 minutos. As placas foram lavadas com água corrente estéril e deixadas para secar, posteriormente, foram adicionados 200 µL de etanol PA e a Densidade Óptica foi medida em um leitor de ELISA (BioTek, µQuant) a 570 nm. Cetoconazol 2,5 mg/mL e Cloranfenicol 1,5 mg/mL foram utilizados como antimicrobianos de referência para fungos e bactérias, respectivamente. 4.2.8 Análises estatísticas Os resultados do trabalho são expressos como Média ± Desvio Padrão. Significância estatística entre 3 grupos ou mais foram avaliados por Análise de Variância (ANOVA) seguido do teste Tukey para múltipla comparação de médias. Análise entre 2 grupos foi realizado por Teste t de Student. Valores de P menores que 0,05 (p < 0,05) foram considerados como significantes. 39 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS O óleo essencial de copaíba extraído pelo método de hidrodestilação apresentou um rendimento de aproximadamente 10% em relação ao óleo-resina utilizado para extração, indicando que a fração volátil compõe uma parcela do óleo de copaíba. O percentual de óleo essencial obtido a partir do óleo-resina foi superior ao encontrado em outro estudo desta mesma espécie (Copaifera langsdorffii), em que o rendimento foi de aproximadamente 7,3% (GRAMOSA; SILVEIRA, 2005). Sendo assim, esse resultado nos permite sugerir que os parâmetros utilizados na metodologia de extração foram significantes para obtenção de um bom rendimento na extração do óleo essencial a partir de óleo-resina de copaíba. As análises dos óleos de copaíba demonstraram que os compostos terpênicos presentes apresentam menor tempo de retenção no óleo-resina de copaíba, quando comparados aos mesmos compostos no óleo essencial de copaíba (Figura 9), de modo que pode ser observado um deslocamento de todos os picos para a direita. Estes picos característicos dos compostos terpênicos podem ser observados em diversos estudos que analisaram a constituição química de óleos de copaíba (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002; BARRETO JÚNIOR et al., 2005). Além do deslocamento dos picos foi possível observar uma melhor resolução dos sinais no óleo essencial de copaíba (Figura 9). Essa separação dos sinais pode ter ocorrido devido às temperaturas menos elevadas utilizadas no processo, ocasionando dessa forma o aumento no tempo de retenção e possibilitando uma melhor resolutividade dos picos (BARTLE; MYERS, 2002). 40 Figura 9 - Cromatograma obtido por CG-EM. A: óleo-resina de copaíba; B: óleoresina de copaíba metilado; C: óleo essencial de copaíba; D: óleo essencial de copaíba metilado; E: fração resina metilada do óleo de copaíba obtido como resíduo da extração de óleo essencial. (Fonte: autoria própria). Para que fosse possível visualizar melhor os picos cromatográficos de componentes ácidos presentes nas amostras, foi realizada a metilação dos óleos de copaíba. Com essa técnica foi possível identificar a presença de ácidos graxos, visto que os ésteres formados foram melhor visualizados (BIAVATTI et al., 2006). Porém, a metilação proporcionou a variação da porcentagem dos hidrocarbonetos terpênicos, já que através da metilação há formação de diferentes hidrocarbonetos (BIAVATTI et al., 41 2006). Assim, a metilação mostrou-se de grande utilidade na investigação de diterpenos ácidos, assim como ácidos graxos. Conforme observado após a metilação do óleo de copaíba e da fração resinosa, permitiu-se a formação de dois grupos de picos cromatográficos, visto que após a metilação, é possível detectar com mais facilidade os terpenos ácidos, responsáveis pelo segundo grupo de picos cromatográficos (Figuras 9). Conforme demonstrado, o óleo de copaíba exibiu o primeiro grupo de picos no intervalo de 7 a 14 minutos e o segundo grupo entre 21 a 30 minutos (Figura 9). Estas faixas de tempo entram em concordância com o que está descrito para o óleo de copaíba em estudos de revisão deste gênero, ressalvando pequenas variações que podem ser ocasionalmente geradas pela diferença de espécies, conservação da amostra, do processo de extração ou ainda do equipamento (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002). Por outro lado, o óleo essencial metilado não apresentou o mesmo comportamento das amostras anteriores (Figura 9). Sabendo-se que o óleo essencial contém principalmente hidrocarbonetos terpênicos, não há a evidente formação de um segundo grupo de picos cromatográficos. Em contrapartida, o resíduo resinoso obtido após extração do óleo essencial, apresenta poucos compostos sesquiterpênicos restantes e maior quantidade de terpenos ácidos (segundo grupo de picos) (Figura 9). As análises dos cromatogramas do óleo-resina de copaíba sugerem que o βbisaboleno foi o composto majoritário identificado. Essa informação pode ser melhor visualizada na Tabela 1, que demonstra além do composto majoritário, outros componentes. O β-cariofileno e α-bermagoteno são os outros componentes que demonstram apresentar maior percentual. A porção resinosa obtida como resíduo após extração do óleo essencial apresentou menor quantidade de componentes sesquiterpênicos que o óleo-resina e o óleo essencial, além disso, outros componentes não se mostraram mais presentes, conforme exibido na Tabela 1. O óleo essencial apresentou um aumento relativo na concentração de alguns componentes presentes na sua constituição. Essa característica deve-se ao fato de que os sesquiterpenos concentram-se na porção volátil, restando menor quantidade no resíduo resinoso. Entretanto, tem sido observado que existe uma extensa variabilidade na composição dos óleos essenciais de copaíba de uma mesma espécie, inclusive quando extraído de diferentes porções da planta. 42 Tabela 1 - Porcentagem dos compostos terpênicos majoritários das amostras de Copaíba (Copaifera langsdorffii). Composição química TR (min) OC mOC mRC TR (min) OEC mOEC δ-elemeno 6,90 0,37 0,15 - 21,17 0,63 0,47 (+)-ciclosativeno 7,52 0,45 0,16 - 22,31 0,67 0,45 α-copaeno 7,66 0,93 0,35 0,06 22,76 1,39 1,08 β-elemeno 7,92 1,44 0,61 0,17 23,46 2,41 1,93 β-cariofileno 8,57 18,30 7,72 2,34 24,62 21,68 21,14 α-bergamoteno 8,74 15,61 6,97 2,26 25,29 20,53 18,90 α-guaieno 8,83 1,17 0,51 0,20 25,38 0,88 0,95 β-farneseno 9,03 1,61 0,75 0,30 26,11 1,56 1,66 α-cariofileno 9,22 2,80 1,25 0,53 25,95 2,85 2,82 τ-muuroleno 9,60 0,82 0,38 0,20 26,88 0,53 0,50 β-cubebeno 9,75 4,83 2,25 0,99 27,06 1,72 3,12 β-selineno 9,88 4,34 2,03 1,10 27,27 6,16 5,55 α-selineno - - - - 27,62 2,31 2,62 τ-gurjeneno - - - - 27,78 0,89 0,56 β-camigreno 10,04 5,63 2,72 1,52 - - - β-bisaboleno 10,21 24,76 12,13 7,14 28,24 23,67 24,26 β-sesquifelandreno 10,55 2,44 1,19 0,82 - - - α-curcumeno 12,29 0,35 0,17 0,20 - - - α-cedreno 12,85 0,53 0,07 0,08 - - - β-cedreno - - - - 28,76 1,40 2,12 α-himacaleno 13,01 1,74 - - 33,39 0,46 0,43 Caureno 20,98 0,39 0,23 0,31 - - - TR (min): Tempo de retenção em minutos; OC: Óleo de copaíba; mOC: Óleo de copaíba metilado; mRC: Fração resina de copaíba metilada; OEC: Óleo essencial de Copaíba; mOEC: Óleo essencial de copaíba metilado. Nascimento et al (2012) realizaram um estudo da composição química de diferentes amostras de óleos essenciais de Copaifera langsdorffii extraídos das folhas, frutos, caules e sementes, diferentemente do nosso estudo, que utilizou o óleo-resina 43 para obter este componente volátil. Pode ser observado que não há uma manutenção nas proporções dos componentes no óleo essencial quando se compara as diferentes fontes de obtenção do mesmo. Outros estudos com a espécie C. langsdorffii demonstraram concordância na presença da maioria dos componentes aqui apresentados, porém, foram observadas algumas divergências em relação aos componentes majoritários, estas podem ter sido apresentadas em decorrência da origem da amostra, data e condições climáticas na época de extração deste óleo-resina (GELMINI et al., 2013). O cromatograma do óleo de rã-touro apresentou poucos picos bem definidos, mostrando a prevalência de poucos compostos isolados (Figura 10), evidenciando que a análise direta de ácidos graxos não possibilita uma boa resolução de picos e separação ideal dos componentes. Figura 10 - Cromatograma obtido por CG-EM. A: óleo de rã-touro; B: óleo de rãtouro metilado. (Fonte: autoria própria). O processo de metilação o qual foi submetido o óleo rã-touro propiciou a melhor separação dos picos, bem como revelou a presença de ácidos graxos em sua forma esterificada que não haviam sido identificados anteriormente (Figura 10). O método de metilação de óleo de rã-touro foi utilizado previamente por Mendez et al (1998) e foi demonstrado que a derivatização dos ácidos graxos favorecem sua melhor separação e identificação. Assim como no estudo de Mendez et al (1998), os derivados do ácido oléico foram os compostos predominantes na amostra de óleo de rãtouro estudada, além da predominância de derivados do ácido palmítico e linoléico. Sendo estes três, os ácidos graxos monoinsaturados, saturados e polissaturados predominantes, respectivamente na amostra. 44 Na tabela abaixo é possível observar que o monooleato de glicerila apresenta-se como composto majoritário das amostras de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw). Após processo de metilação da amostra, componentes esterificados com a adição de grupamento metila foram encontrados, dentre eles, palmitoleato de metila, palmitato de metila, linoleato de metila e oleato de metila. Conforme mencionado anteriormente, estes ésteres encontrados após metilação correspondem aos ácidos graxos presentes no óleo de rã-touro. Tabela 2 - Porcentagem dos compostos majoritários das amostras de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) Composição química TR (min) OR mOR Palmitoleato de metila 18,25 - 2,23 Palmitato de metila 18,65 - 5,87 Linoleato de metila 21,84 - 4,79 Oleato de metila 21,94 - 9,26 1,2-dipalmitoil de glicerol 25,32 15,31 - Monooleato de glicerila 28,22 55,08 7,59 TR (min): Tempo de retenção em minutos; OR: Óleo de rã-touro; mOR: Óleo de rãtouro metilado. Estes resultados também se encontram em conformidade com o que foi observado por Lopes et al. (2010), que realizaram diferentes metodologias de extração de óleo de rã-touro e também observou a predominância dos ácidos oléico, linoléico e palmítico através da presença de seus ésteres. 5.2 PRODUÇÃO DOS SISTEMAS EMULSIONADOS Os sistemas demonstraram macroscopicamente uma característica leitosa e fluida. Além disto, não foi observado cremagem na região superior dos sistemas. As análises de condutividade confirmaram a fase externa aquosa do sistema, conforme esperado (XAVIER-JÚNIOR et al., 2012). Os valores de pH observados foram baixos, porém esta característica pode ser modificada a fim de obter a formulação final com compatibilidade adequada com a pele. O tamanho de gotícula médio observado para 45 todas os sistemas foi cerca de 0,2 µm, assim como apresentaram baixa polidispersividade, indicando que durante a produção destes sistemas são formadas poucas populações de tamanhos distintos. As análises de potencial zeta demonstraram valores distintos para os sistemas, conforme mostrados na Tabela 3. Esta variação aconteceu, provavelmente, devido a variação da composição dos óleos. O potencial zeta da emulsão de oleo de rã (- 11,86 ± 1,99) pode ser modificado através da adição de sais para que este esteja conferindo a estabilidade adequada à formulação final. Tabela 3 - Caracterização físico-química das emulsões EOC EOEC EOR pH 3,40 3,48 3,22 Condutividade (µS) 187,51 226,20 220,30 Tamanho (µm) 0,20 ± 0,00 0,28 ± 0,01 0,26 ± 0,00 Polidispersividade 0,24 ± 0,01 0,14 ± 0,02 0,27 ± 0,01 Potencial Zeta - 34,37 ± 2,50 - 27,08 ± 0,89 - 11,86 ± 1,99 EOC: Emulsão de óleo-resina de copaíba; EOEC: Emulsão de óleo essencial de copaíba; EOR: Emulsão de óleo de rã-touro. 5.3 TRIAGEM MICROBIOLÓGICA As análises microbiológicas realizadas para verificar se as amostras de óleo de copaíba apresentavam atividade antibacteriana frente às linhagens descritas demonstraram que cerca de 44 % das cepas estudadas foram inibidas por algumas das amostras de óleo de copaíba (Tabela 4). Os ensaios para testar o efeito antifúngico dos óleos de copaíba demostraram ação de inibição frente a 40 % das leveduras testadas, sendo as cepas de C. glabrata e C. krusei clínicas e ATCC as que se demonstraram mais sensíveis (Tabela 5). Os halos de inibição observados nas placas com micro-organismos cultivados nos permitiram observar que as cepas foram sensíveis aos óleos de copaíba e que o óleo de rã-touro não demonstrou ação antimicrobiana sobre os organismos testados. Não existem na literatura outros relatos de ensaios antimicrobianos com óleo de rã-touro, porém, estudos com óleos de copaíba extraídos da espécie Copaifera multijuga 46 demonstram halos de inibição em torno de 7,0 mm para cepa de S. aureus, assemelhando aos nossos resultados obtidos pelos óleos da espécie C. langsdorffii, em que o óleo-resina exibiu halo de inibição de 6,22 mm e o óleo essencial provocou inibição em torno de 9,0 mm para a cepa em questão (MENDONÇA; ONOFRE, 2009). Tabela 4 - Medidas dos halos de inibição (mm) da triagem antibacteriana Micro-organismos OC RC OEC OR Clor S. aureus ATCC 6,66 ± 1,32 6,00 ± 1,50 9,88 ± 2,14 27,78 ± 2,04 29213 22,11 ± 2,31 S. aureus AC1 22,44 ± 2,06 S. aureusAC2 S. epidermidis 5,44 ± 0,72 5,44 ± 0,72 14,00 ± 2,39 35,11 ± 3,68 ATCC 12228 S. epidermidis 11,89 ± 1,96 27,89 ± 3,14 AC1 S. epidermidis 13,11 ± 3,14 24,44 ± 6,34 AC2 P. aeruginosa 5,11 ± 0,33 ATCC 27853 P. aeruginosa 15,78 ± 2,77 AC1 P. aeruginosa 11,44 ± 1,59 AC2 (-): Não houve inibição; OC: Óleo de copaíba; RC: Fração resina de copaíba; OEC: Óleo essencial de copaíba; OR: Óleo de rã-touro; Clor: Cloranfenicol 1,5 µg/mL. Os ensaios de triagem para testar atividade antimicrobiana com óleo de rã-touro não demonstraram nenhuma atividade significante. Contudo, os dados encontrados podem nortear futuras pesquisas com esse óleo. Além disso, estudos baseados nos testes de sensibilidade por difusão em ágar não são conclusivos, visto que são requeridos testes posteriores de maior sensibilidade a fim de obter a confirmação dos dados obtidos (OSTROSKY et al., 2008). Embora a ação do óleo de rã-touro seja pouco investigada, estudos já avaliaram a ação antimicrobiana de peptídeos obtidos da rã-touro (Rana catesbeiana). Sabe-se que estes peptídeos foram isolados do estômago do anfíbio e em seguida foram quimicamente modificados. Além disso, a estrutura destes peptídeos serviu de base para a construção de peptídeos sintéticos. Estes compostos purificados e concentrados 47 exibiram atividade frente a cepas de Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Escherichia coli, além de fungos como Candida albicans e Cryptococcus neoformans (MINN; KIM; KIM, 1998). Tabela 5 - Medidas dos halos de inibição (mm) da triagem antifúngica Micro-organismos OC RC OEC OR Cet AnfB C. albicans ATCC 38,11 ± 2,61 20,89 ± 1,69 90027 40,00 ± 2,55 21,78 ± 3,63 C. albicans 14 (AC) C. glabrata ATCC 6,33 ± 2,06 12,89 ± 6,03 28,33 ± 2,50 20,44 ± 2,45 2001 C. glabrata 15V3C 9,88 ± 0,78 28,11 ± 2,08 21,89 ± 3,48 (AC) 13,67 ± 3,42 24,67 ± 2,87 17,00 ± 3,50 C. krusei ATCC 6258 C. krusei LMM54 13,78 ± 3,23 24,22 ± 4,35 18,33 ± 2,17 (AC) C. parapsilosis ATCC 24,22 ± 4,38 25,00 ± 1,73 22019 C. parapsilosis 73 29,78 ± 2,02 18,56 ± 1,94 (AC) C. tropicalis ATCC 29,56 ± 1,33 17,00 ±1,11 13803 43,56 ± 3,90 25,00 ± 3,84 C. tropicalis 67A (AC) (-): Não houve inibição; OC: Óleo de copaíba; RC: Fração resina de copaíba; OEC: Óleo essencial de copaíba; OR: Óleo de rã-touro; Cet: Cetoconazol 2,5 µg/mL; AnfB: Anfotericina B 5 µg/mL. Os ensaios com os óleos vegetais descritos no trabalho apresentaram resultados diferentes. Esse comportamento pode estar associado a sua composição diferenciada, conforme descrito em alguns estudos (SANTOS et al., 2008). Em seu estudo, foi realizada uma triagem microbiológica com poucos micro-organismos frente a diferentes óleos-resina obtidos de várias espécies de copaíba. A partir desta triagem foi observado que independente da composição química e das variadas espécies os óleos de copaíba foram mais ativos frente aos micro-organismos gram positivos, em concordância com os resultados obtidos neste estudo. O óleo essencial de copaíba mostrou uma atividade cerca de 50 % maior que o óleo-resina e que a fração resinosa residual frente à cepa de S. epidermidis ATCC 12228, indicando que a maior concentração dos compostos terpênicos proporciona uma 48 maior ação antibacteriana (Tabela 4) e antifúngica (Tabela 5). Outros estudos envolvendo atividade antimicrobiana de óleo de copaíba da espécie C. langsdorffii já demonstraram que este óleo provocou inibição no crescimento de S. aureus, P. aeruginosa e Escherichia coli (PIERI et al., 2012). PIERI et al. (2012) observaram que o óleo de copaíba da espécie C. langsdorffii induziu a formação de halos de inibição de diferentes tamanhos para cepas de referência de S. aureus. A cepa S. aureus ATCC 29213 foi utilizada neste estudo, assim como por estes autores, porém em nosso estudo o halo de inibição provocado pelo óleo de copaíba foi 50 % menor do que o observado por PIERI et al. (2012). Este fato pode ocorrer devido a variabilidade da composição química que ocorre entre plantas da mesma espécie, sendo assim, dá-se a importância de analisar a composição química do óleo em estudo para que se possa comparar a demais estudos. Um fato relevante a ser considerado foi a expressiva ação do óleo essencial de copaíba frente às cepas de C. krusei e C. glabrata, que são conhecidas por sua resistência aos antifúngicos azólicos, o que ressalta a importância desta atividade do óleo essencial frente a cepas resistentes aos antifúngicos mais utilizados no tratamento de infecções cutâneas. Além da realização dos testes para verificação de quais cepas do estudo seriam inibidas pelos óleos naturais, os tensoativos (Tween 20® e Span 80®) e o DMSO 1 % foram testados a fim de observar se estes provocariam inibição frente às linhagens de micro-organismos observados. Esta avaliação não demonstrou halos de inibição do crescimento de nenhum micro-organismo. Este dado é relevante, pois os tensoativos compõem o sistema emulsionado, porém não influenciam diretamente na atividade antimicrobiana, e sim, facilitam a interação do óleo com os micro-organismos através da redução da tensão interfacial entre a gotícula e o componente aquoso. 5.4 CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) As medidas de CIM sugerem que todas as amostras de óleo vegetal e animal utilizadas possuem uma ação inibitória de crescimento de bactérias e fungos. O óleoresina de copaíba apresentou menor CIM que o óleo essencial frente a S. epidermidis AC1 e C. glabrata AC1, possivelmente porque estas cepas possuem maior sensibilidade aos ácidos graxos presentes na fração resinosa do óleo-resina (Tabela 6). 49 Tabela 6 - Concentração Inibitória Mínima dos óleos de copaíba e das emulsões contendo estes óleos (mg/L) Microorganismos S. aureus ATCC OC EOC OEC EOEC > 234000,0 ± 0,0 > 249750,0 ± 0,0 55437,5 ± 0,0 > 249250,0 ± 0,0 > 234000,0 ± 0,0 > 249750,0 ± 0,0 221715,0 ± 0,0 > 249250,0 ± 0,0 0,9 ± 0,0 45,5 ± 21,5 221715,0 ± 0,0 > 249250,0 ± 0,0 > 234000,0 ± 0,0 > 249750,0 ± 0,0 221715,0 ± 0.0 > 249250,0 ± 0,0 > 234000,0 ± 0,0 971,7 ± 0,00 108,3 ± 76,6 15578,1 ± 0,0 0,9 ± 0,0 1,0 ± 0,0 108,3 ± 38,3 973,6 ± 0,0 > 234000,0 ± 0,0 > 249750,0 ± 0,0 34648.8 ± 0,0 15578,1 ± 0,0 > 234000,0 ± 0,0 > 249750,0 ± 0,0 34648,8 ± 0.0 3894,5 ± 0,0 29213 S. epidermidis ATCC 12228 S. epidermidis AC1 S. epidermidis AC2 C. glabrata ATCC 2001 C. glabrata 15V3C (AC) C. krusei ATCC 6258 C. krusei LMM54 (AC) OC: Óleo de copaíba; EOC: Emulsão de óleo de copaíba; OEC: Óleo essencial de copaíba; EOEC: Emulsão de óleo essencial de copaíba. Embora os estudos envolvendo atividades biológicas do óleo de copaíba apontem que os terpenos são seus principais compostos bioativos (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002), sabe-se que os ácidos graxos possuem propriedades antimicrobianas e que estes podem estar relacionados com a atividade deste óleo, especialmente do óleoresina (ISAACS; LITOV; THORMAR, 1995). As emulsões apresentaram uma ação antibacteriana e antifúngica com apenas 5% de óleo sendo bastante semelhante ao efeito obtido com o mesmo percentual para testes com óleos puros, sugerindo que um sistema em que o óleo está disperso em gotículas favorece o direcionamento dos componentes para o sítio alvo ocasionando 50 uma melhor ação dos óleos naturais, conforme descrito na literatura (FERREIRA et al., 2010; XAVIER-JÚNIOR et al., 2012). Adicionalmente, foi observada uma diminuição significativa (p < 0,05) na CIM para C. glabrata ATCC 2001 frente à emulsão de óleo de copaíba, o que contribui para afirmar a potencialidade dos sistemas emulsionados de óleos naturais. Foi observado um fenômeno para a cepa clínica de C. glabrata que se pode sugerir que seja um efeito paradoxal, em que as células fúngicas se mostram sensíveis a baixas concentrações de antimicrobiano, porém uma vez elevando-se a concentração do antimicrobiano ocorre crescimento fúngico, provavelmente devido a mecanismos de resistência. Outros estudos entraram em concordância com o fenômeno sugerido neste estudo, de modo que foi observado um efeito paradoxal na avaliação da concentração inibitória mínima de extratos de Alfavaca (Ocimum gratissimum) (LOUIS; NGUEFACK; ROY, 2011). Este fenômeno está sendo bastante descrito frente a um novo grupo de antifúngicos, as equinocandinas (CHAMILOS et al., 2007). Porém, mais testes precisam ser realizados para a confirmação deste resultado. O óleo de rã-touro e a emulsão contendo este óleo exibiram CIM superiores a maior concentração da diluição utilizada nesta metodologia (Tabela 7). Os dados obtidos com o óleo de rã-touro demonstraram uma menor atividade quando comparadas às amostras de óleo de copaíba, porém, não se descarta a atividade deste óleo e utilidade da emulsão como sistema de liberação de seus componentes, visto que outras cepas podem ser mais sensíveis que as utilizadas no presente estudo. Os óleos de origem animal possuem menos resultados reportados sobre atividade antimicrobiana que os óleos vegetais. Porém, este fato não indica que os componentes de origem animal possuem menor atividade. Isto ocorre devido o fato de que não é viável a utilização de animais para obtenção de componentes bioativos se este processo não for realizado de maneira ética e sustentável. Assim sendo, os produtos vegetais por serem fontes renováveis possuem maiores estudos, devido a viabilidade de futuros estudos. 51 Tabela 7 - Concentração Inibitória Mínima do óleo de rã-touro e da emulsão contendo este óleo (mg/L). Micro-organismos OR EOR S. aureus ATCC 29213 >228500,0 ± 0,0 >248500, 0 ± 0,0 S. epidermidis ATCC 12228 >228500,0 ± 0,0 >248500, 0 ± 0,0 P. aeruginosa ATCC 27853 >228500,0 ± 0,0 >248500, 0 ± 0,0 C. albicans ATCC 90027 >228500,0 ± 0,0 >248500, 0 ± 0,0 C. glabrata ATCC 2001 >228500,0 ± 0,0 >248500, 0 ± 0,0 C. krusei ATCC 6258 >228500,0 ± 0,0 >248500, 0 ± 0,0 C. parapsilosis ATCC 22019 >228500,0 ± 0,0 >248500, 0 ± 0,0 C. tropicalis ATCC 13803 >228500,0 ± 0,0 >248500, 0 ± 0,0 OR: Óleo de rã-touro; EOR: Emulsão de óleo de rã-touro. Diferente da maioria dos produtos de origem animal, o óleo de rã-touro é obtido através de aproveitamento biotecnológico das partes do animal que são utilizadas no ramo alimentício, assim sendo, mais estudos a fim de investigar a atividade antimicrobiana envolvendo este óleo frente a outros micro-organismos podem ser desenvolvidos, visto que a obtenção do mesmo é feita de maneira sustentável e sua futura utilização na terapêutica é viável. 5.5 BIOAUTOGRAFIA A bioautografia revelou duas bandas do óleo-resina de copaíba que provocaram inibição dentre as diversas bandas cromatográficas exibidas na cromatoplaca através de revelação com Vanilina Sulfúrica (Figura 11). Ainda no tocante ao óleo-resina de copaíba, uma banda cromatográfica inibiu a cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 (Rf 0,2) e outra banda inibiu o crescimento de S. aureus ATCC 29213 e S. epidermidis ATCC 12228 (Rf 0,15). 52 Figura 11 - Perfil cromatográfico dos óleos de copaíba e rã-touro em Cromatografia de Camada Delgada. Adsorvente: Sílica; FM: Hexano: Acetato de etila (9:1); Revelador: Vanilina Sulfúrica. Os perfis cromatográficos das frações obtidas pela bioautografia do óleo de copaíba demonstram-se semelhantes em sua constituição (Figuras 12 e 13). Figura 12 - Cromatograma obtido por CG-EM da primeira fração (Rf 0,2) de óleo de copaíba obtida pela Bioautografia. (Fonte: autoria própria). 53 Figura 13 - Cromatograma obtido por CG-EM da segunda fração (Rf 0,15) de óleo de copaíba obtida pela Bioautografia. (Fonte: autoria própria). Análises dos cromatogramas das frações nos permite verificar que poucos terpenos foram identificados, enquanto ésteres de glicerol e de ácidos graxos foram predominantes nestas frações, assemelhando-se aos resultados obtidos para o óleo de rãtouro em relação aos componentes graxos (Tabela 8). Os compostos α-curcumeno, α-himacaleno, Isotujol e α-fencheno estavam presentes na primeira fração de óleo de copaíba extraídos a partir da bioautografia enquanto que a segunda fração apresentou α-curcumeno e α-himacaleno na sua composição. A presença desses pode estar associada à propriedade antimicrobiana frente às cepas em testadas. Os compostos terpênicos do óleo de copaíba vêm sendo indicados como componentes ativos por diversos estudos. Os terpenos majoritários vêm sendo estudados isoladamente a fim de verificar suas atividades biológicas. Vários estudos vêm investigando a ação antimicrobiana especialmente do β-cariofileno, óxido de cariofileno e ácido copálico, por estarem presentes em grandes quantidades no óleo-resina de copaíba (LEANDRO et al., 2012). A amostra de óleo de rã-touro apresentou somente uma banda cromatográfica que exibiu atividade antimicrobiana dentre as bandas cromatográficas exibidas em CCD (Figura 11). Essa banda demonstrou uma ação de inibição de crescimento da cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 (Rf 0,6). 54 Tabela 8 - Porcentagem dos compostos majoritários nas amostras obtidas da bioautografia Composição química TR (min) C1 C2 R1 mR1 α-curcumeno 12,42 * * - - α-himacaleno 13,13 * 1,46 - - Isotujol 13.31 * - - - α-fencheno 13,58 * - - - Palmitoleato de metila 18,25 - - - - Palmitato de metila 18,65 - - - 0,90 Linoleato de metila 21,84 - - - - Oleato de metila 21,94 - - - - Estearato de metila 22,46 - - - 0,69 1,2-dipalmitoil de glicerila 25,32 8,56 7,73 8,06 - Monooleato de glicerila 28,22 33,62 63,31 46,55 46,54 Ácido Oleico 28,69 13,71 14,23 8,75 2,12 TR (min): Tempo de retenção em minutos; C1: Primeira fração obtida na bioautografia do óleo de copaíba; C2: Segunda fração obtida na bioautografia do óleo de copaíba; R1: Fração obtida na bioautografia do óleo de rã-touro; mR1: Fração obtida na bioautografia do óleo de rã-touro metilada. *Foi identificado por CG-EM, mas não quantificado. O perfil cromatográfico da fração obtida pela bioautografia do óleo de rã-touro demonstrou a presença de derivados dos ácidos linoléico, oléico e palmítico (Figura 14). Para visualizar e elucidar melhor sua constituição a fração foi metilada e dessa forma foi possível observar que ela é constituída também por ácido esteárico, que foi identificado na forma de éster após metilação (Figura 15). As amostras de óleo de rã-touro apresentaram predominância de compostos derivados do ácido oléico (Tabela 8). Essa informação é importante quando consideramos os estudos que indicam que o ácido oléico e monoglicerídeos são responsáveis por ação antimicrobiana no leite materno (ISAACS; LITOV; THORMAR, 1995), assim, sugere-se que este seja o componente ativo do óleo de rã-touro. 55 Figura 14 - Cromatograma da fração (Rf 0,6) de óleo de rã-touro obtida pela Bioautografia. (Fonte: autoria própria). Figura 15 - Cromatograma da fração (Rf 0,6) metilada de óleo de rã-touro obtida pela Bioautografia. (Fonte: autoria própria). Comparando-se os cromatogramas das figuras 12, 13 e 14 observou-se perfis cromatográficos semelhantes. Sabendo que estes cromatogramas representam as bandas cromatográficas que ocasionaram inibição de micro-organismos, pode-se sugerir que nas diferentes amostras existem diversos componentes em comum que podem estar proporcionando a inibição do crescimento bacteriano, dentre eles os ácidos graxos (ISAACS; LITOV; THORMAR, 1995). 5.6 AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DE BIOFILME 56 Os fatores de virulência, que são grandes responsáveis pelos baixos prognósticos conferidos a pacientes com infecções bacterianas ou fúngicas, devem ser estudados a fim de verificar a influência do uso de emulsões de óleos terapêuticos na diminuição destes fatores. Nesse estudo foram desenvolvidos biofilmes constituídos por comunidades de micro-organismos acumulados nas superfícies, arranjados tridimensionalmente e integrados a uma matriz polimérica extracelular (MARSH, 2006). Este estudo torna-se importante devido ao desenvolvimento de biofilmes promoverem modificações fenotípicas nos micro-organismos quando comparados àqueles na forma individualizada, e na maioria dos casos, essa mudança confere uma maior resistência aos antimicrobianos e aos fatores de defesa do sistema imunológico do hospedeiro (ARCIOLA et al., 2012). A avaliação da inibição de biofilme foi realizada com as amostras de óleo de copaíba e óleo de rã-touro e suas emulsões. As emulsões de óleo-resina e de óleo essencial de copaíba mostraram-se efetivas na diminuição da formação de biofilme frente a algumas das cepas em estudo. Quando comparamos as atividades das emulsões dos óleos de copaíba, observa-se uma semelhança na ação frente a maioria das cepas, porém houve um decréscimo significativo (p < 0,05) na formação de biofilme das cepas S. aureus ATCC 29213 e S. epidermidis ATCC 12228 pela emulsão de óleo essencial, em contrapartida, a cepa C. krusei LMMM54 (AC) foi mais sensível à ação da emulsão de óleo-resina. Adicionalmente, a emulsão do óleo essencial de copaíba demonstrou uma melhor ação antibiofilme que o Cetoconazol contra a cepa de referência de C. krusei ATCC 6258. Este resultado pode estar ligado à resistência intrínseca que as cepas de C. krusei possuem aos azólicos, especialmente fluconazol, porém devido a estrutura química semelhante, pode haver resistência cruzada dos micro-organismos frente aos antifúngicos (Figura 16). 57 Figura 16 - Formação de biofilme na presença de óleos de copaíba e emulsões contendo estes óleos. OC: Óleo de copaíba; EOC: Emulsão de óleo de copaíba; OEC: Óleo essencial de copaíba; EOEC: Emulsão de óleo essencial de copaíba; Clor/Cet: Cloranfenicol e Cetoconazol como antimicrobiano de referência para bactérias e fungos, respectivamente; CP: Controle positivo, sem antifúngico. (Fonte: autoria própria). As análises da formação de biofilme na presença das amostras de óleo de rãtouro e emulsão demonstraram uma significante atividade inibitória contra todas as leveduras quando comparados ao Cetoconazol, provavelmente porque as pequenas gotículas de óleo promovem uma melhor interação com a membrana fúngica e melhoram a ação farmacológica contra estes micro-organismos (Figura 17). A inibição da formação de biofilme causada pela emulsão do óleo de rã-touro frente à cepa de P. aeruginosa mostrou uma significante atividade quando comparada a inibição provocada pelo Cloranfenicol. Para esclarecer o mecanismo de ação do óleo de rã-touro frente à P. aeruginosa será necessária a realização de outras analises. 58 Figura 17 - Formação de biofilme na presença de óleo de rã-touro e emulsão contendo este óleo. OR: Óleo de rã-touro; EOR: Emulsão de óleo de rãtouro; Clor/Cet: Cloranfenicol e Cetoconazol como antimicrobiano de referência para bactérias e fungos, respectivamente. (Fonte: autoria própria). Adicionalmente, os micro-organismos mais responsivos À ação antibiofilme da emulsão de óleo de rã-touro foram cepas de Candida, dentre elas, C. glabrata and C. krusei, que são pouco sensíveis e resistentes aos antifúngicos azólicos, respectivamente. Assim, sugere-se que este sistema pode ser utilizado na terapia de infecções desencadeadas por formação de biofilme causado por fungos do gênero Candida, que são responsáveis por cerca de 80% das infecções fúngicas em ambiente hospitalar (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). Destaca-se com relação à ação antibiofilme da emulsão de óleo de rã-touro, a possibilidade de utilizar um sistema capaz de impedir somente o crescimento de biofilmes e assim, impedir o desenvolvimento de infecções, ou ainda, reduzir quadros infecciosos desenvolvidos pelo crescimento de biofilmes microbianos. Adicionalmente, por não apresentarem atividade antimicrobiana relevante, este sistema combateria a infecção por diminuir a formação de biofilmes e provavelmente não induziria 59 resistência microbiana devido a sua inexpressiva atividade de inibição do crescimento dos micro-organismos. É relevante destacar que esta metodologia analisa apenas a formação do biofilme. Sendo assim, não se pode afirmar que os micro-organismos não estão viáveis, somente podendo ser observado a viabilidade se os dados forem comparados com aos valores de CIM obtidos. Porém, sabendo que a redução do biofilme está relacionada com a gravidade da infecção, mesmo que a concentração utilizada para inibir a formação de biofilme seja inferior ao CIM, o sistema exibe uma atividade significativa para tratar indivíduos imunocompetentes sem a necessidade de utilizar um agente antifúngico ou antibacteriano mais potente. 60 6 CONCLUSÕES A partir dos resultados obtidos, pode-se inferir que o processo de metilação utilizado para derivatizar as amostras de óleo de rã-touro e óleo-resina de copaíba a serem analisadas por CG-EM possibilitou a obtenção de melhores cromatogramas, viabilizando a identificação dos compostos presentes nos óleos. Assim, foi possível verificar que o óleo-resina de copaíba apresentou uma predominância de componentes diterpênicos e sesquiterpênicos, enquanto o óleo de rã-touro apresentou uma composição predominante de ácidos graxos da classe ômega. O óleo essencial de copaíba concentra os componentes terpênicos presentes no óleo-resina, assim o óleo essencial apresenta uma maior atividade antimicrobiana quando comparado ao óleo-resina para a maioria das cepas, especialmente frente às bactérias do gênero Staphylococcus e às leveduras do gênero Candida que apresentam baixa sensibilidade aos antifúngicos azólicos utilizados atualmente na terapêutica. Os resultados demonstraram também que o óleo de rã-touro não demonstrou uma significante atividade antimicrobiana. Adicionalmente, foram identificados os principais componentes que exibem atividade antimicrobiana frente às cepas de estudo. Os terpenos α-curcumeno, αhimacaleno, Isotujol e α-fencheno foram identificados na fração antimicrobiana do óleo de copaíba e derivados dos ácidos linoléico, oléico e palmítico foram identificados na fração antimicrobiana do óleo de rã-touro. As emulsões demonstraram CIM semelhantes ou menores que os óleos puros, demonstrando assim, resultados de grande relevância científica, visto que estes sistemas apresentavam apenas 5 % de óleo em sua composição. Foi possível observar não somente a atividade das emulsões a base de óleo de rá-touro, óleo-resina e óleo essencial de copaíba, mas também foi demonstrada uma potencialização desta atividade, tendo em vista as baixas concentrações inibitórias mínimas obtidas. Destaca-se a atividade da emulsão de óleo essencial de copaíba, que exibiu inibição de crescimento significante para a maioria das cepas testadas. As emulsões demonstraram significante poder de inibição da formação de biofilmes. Destaca-se a ação da emulsão de óleo de rã-touro, que mesmo não exibindo potencial ação inibidora do crescimento dos micro-organismos testados, foi capaz de inibir o crescimento de biofilme. 61 Deste modo, baseado na potencial atividade antibiofilme da emulsão de óleo de rã-touro e na expressiva atividade antimicrobiana da emulsão contendo óleo essencial de copaíba, estes sistemas tornam-se alternativas viáveis para futura utilização no tratamento de infeções de pele, especialmente frente a cepas de Staphylococcus e de C. glabrata e C. krusei, que são micro-organismos que vêm exibindo resistência contra muitos antimicrobianos tradicionais utilizados atualmente. 62 7 REFERÊNCIAS AGUSTI-MEJIAS, A., et al. Foliculitis por Pseudomonas aeruginosa tras depilación. Med Clin Barcelona, v.139, n.4, p.184, 2012. ANVISA. FARMACOPÉIA BRASILEIRA. Brasilia, 5 ed., 2010 ARCIOLA, C. R., et al. Biofilm formation in Staphylococcus implant infections. 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Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, Petrópolis, 59010-180, Natal-RN-Brazil. c UFRN, Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO) – Programa de Posgraduacao, 59000-000, Natal-RN-Brazil d Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) – Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas. Rua Alexandre Cazelatto, 999, Vila Betel, Paulínia – SP. e Departamento de Fármacos e Medicamentos, Faculdade de Ciências Farmacêuticas (UNESP), Rodovia Araraquara, Jaú Km 01, 14801-902 Araraquara, SP, Brazil. * Correspondence: Prof. E. S. T. Egito, Rua General Gustavo de Farias 59012-570 Natal/RN - Brazil. Fax: +55 84 3342-9808/ +55 84 3342-9817. E-mail: [email protected] 71 Abstract The aim of this work was to investigate the antimicrobial activity of nanostructured emulsions based on copaiba (Copaifera langsdorffii) resin-oil, copaiba essential oil, and bullfrog (Rana catesbeiana Shaw) oil against fungi and bacteria related to skin diseases. Firstly, the essential oil was extracted from copaiba resin-oil and these oils, along with bullfrog oil, were characterized by gas chromatography combined with mass spectrometry (GC-MS). Secondly, nanostructured emulsion systems were produced and characterized. The antimicrobial susceptibility assay was performed, followed by the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) determination, the bioautography assay, and the antibiofilm determination. Strains of the genera Staphylococcus, Pseudomonas, and Candida were used. The CG-MS analysis was able to identify the components of copaiba resin-oil, copaiba essential oil, and bullfrog oil. The MIC assay in association with the bioautography revealed that some esters of palmitic and oleic acids—α-curcumene, α-himachalene, isothujol, and αfenchene—probably inhibited some strains. The nanostructured emulsions based on copaiba resin-oil and essential oil improved the antimicrobial activity of the pure oils, especially against Staphylococcus and Candida, resistant to azoles. The bullfrog oil nanostructured emulsion showed a lower antimicrobial effect when compared to the copaiba samples. However, bullfrog oil-based nanostructured emulsion showed a significant antibiofilm activity (p < 0.05). Given the significant antimicrobial and antibiofilm activities of the evaluated oils, it may be concluded that nanostructured emulsions based on copaiba and bullfrog oils are promising candidates for the treatment of infections and also may be used to incorporate other antimicrobial drugs. Keywords: Nanostructured emulsion; Copaiba (Copaifera langsdorffii) oil; Bullfrog (Rana catesbeiana) oil; Antimicrobial activity. 72 INTRODUCTION Natural oils have been used in popular medicine as antimicrobial agents for treatment of various infections. 1 Nowadays, due to the substantial number of drugs resistant to microorganisms, these oils and other natural products have become scientifically recognized, encouraging the introduction of new products originated from animal and vegetable sources in the market. products, bullfrog (Rana catesbeiana Shaw) and 2 Among these copaiba (Copaifera langsdorffii) oils are widely used in popular medicine. Copaiba oil is extracted from trees known as Copaibeiras (Copaifera spp.), which are distributed in South America and Africa. 3 The copaiba resin-oil is traditionally used in popular medicine due to its anti-inflammatory and antimicrobial activities, among other pharmacological and cosmetic properties already elucidated in the literature. 4 Phytochemical studies of resin-oil reveal that it contains about 28 diterpenes and 72 sesquiterpenes hydrocarbons. 5 The essential oil extracted from the copaiba resin-oil concentrates the majority of the sesquiterpenes, which are associated with the pharmacological activity of this compound. Therefore, the copaiba essential oil has become a highly demanded product in the pharmaceutical field. 6 The bullfrog oil is biotechnologically extracted from bullfrog adipose tissues, which are usually discarded in the frog farms in the food industry. In this way, it is possible to reuse an animal residue to provide an active oil to treat diseases. 7 Because it belongs to the muscular tissue and skin, the bullfrog oil is rich in polyunsaturated fatty acids such as the omega group, which are pharmacologically relevant for their medicinal use. 8 Additionally, other chemical components from bullfrogs, such as peptides from their stomach, have been studied due to their antimicrobial activity. 9 Because the skin acts as a physical barrier of the human organism, it is constantly exposed to several pathogenic microorganisms through the contact with the external environment. Therefore, this organ may be susceptible to infections. Among the microorganisms that are involved with such infections, gram-positive bacteria of the genus Staphylococcus, gram-negative bacteria such as Pseudomonas aeruginosa, and yeasts belonging to the genus Candida are prevalently found. 10, 11 It is well known that many antimicrobial agents are 73 no longer effective against several microorganisms that may have become resistant to antimicrobial agents. Nevertheless, these microorganisms are still sensitive to natural products. On the other hand, the use of oils in natura leads to low adherence to treatment due to its unpleasant organoleptic characteristics. Natural oils may also not provide desirable pharmacokinetic properties and permeability. Therefore, the delivery systems, such as nanostructured emulsions, are viable systems to improve these characteristics. Nanostructured emulsion systems containing natural oils are suitable alternatives against infectious pathogens because of the synergic effect induced by the antimicrobial activity of the renewable source of oils and the advantages conferred to the nanostructured emulsions. 12 The development of these systems is economically viable and aims to improve the bioavailability, to enhance or modify the release of the oil’s active components, and to improve their organoleptic characteristics. 13 Those emulsified systems may be defined as homogeneous milky systems formed by two phases that are immiscible, in which one phase is dispersed within the other in the form of droplets stabilized by surfactant molecules. 14 The aim of this work was to determine the antimicrobial activity of nanostructured emulsions based on bullfrog and copaiba (resin and essential) oils. Therefore, first, a chemical characterization of the oils used to develop the nanostructured emulsions was performed to identify their antimicrobial compounds. Moreover, the antimicrobial activity of the nanostructured emulsion systems produced through different methods was evaluated. MATERIALS AND METHODS Materials Chemicals The copaiba (Copaifera langsdorffii) resin-oil was purchased from Flores & Ervas (Piracicaba, SP, Brazil). Bullfrog (Rana catesbeiana Shaw) oil was a gift from Asmarana Natural Products (Natal, Brazil). Span 80®, methylene blue dye, glucose, and tetrazolium chloride were purchased from Sigma Aldrich Inc (St Louis, MO, USA). Tween 20®, DMSO, hexane, ethyl acetate, ethanol, and 74 violet crystal were purchased from Vetec Quimica Fina LTDA (Rio de Janeiro, RJ, Brazil). The copaiba essential oil was obtained by hydrodistillation of copaiba resin-oil using a Clevenger apparatus for 4 h at 100 ºC. Brain Heart Infusion (BHI) broth, Sabouraud dextrose agar, Mueller-Hinton agar, and Mueller-Hinton broth came from Himedia (Mumbai, MU, India). Yeast ExtractPeptide-Dextrose (YPD) broth was a gift from MMML (Medical and Molecular Mycology Laboratory), UFRN (Natal, Brazil). All other chemicals were of at least analytical grade. Microorganisms The bacteria strains used in this study were Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. epidermidis ATCC 12228, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, and two clinical strains of each species. The yeasts used during the experiments were Candida albicans ATCC 90027, C. parapsilosis ATCC 22019, C. glabrata ATCC 2001, C. krusei ATCC 6258, C. tropicalis ATCC 13803, and also a clinical strain of each aforementioned tested species. The strains were kindly provided by the MMML, UFRN (Natal, Brazil). The bacteria were maintained in Nutrient broth (Mumbai, MU, India) medium, and the yeasts were maintained in Sabouraud Dextrose broth medium (Mumbai, MU, India) containing 20% glycerol, frozen at -80 ºC until the moment of the experiment. All stored bacteria and yeasts were cultured in BHI agar for 24h and Sabouraud dextrose agar for 48h, both at 37 °C respectively, before the tests. Methods Chemical characterization Gas Chromatography - Mass Spectrometry (GC-MS) analysis of the oils was performed on a Hewlett-Packard 6890 gas chromatograph interfaced to a HP-5975 mass selective detector. The column used was a HP-5MS crosslinked fused silica capillary column (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm). Before the experiments, the bullfrog oil and copaiba resin-oil were methylated using diazomethane aiming to perform the methyl ester’s identification of acid compounds. The work temperatures for the copaiba essential oil were as follows: oven temperature started at 60 °C, isothermal, then heating 3 °C/min to 75 240 °C, and isothermally for 7 minutes at 250 °C. The injector temperature was 220 °C. The following are the conditions for both copaiba resin-oil and bullfrog oil: oven temperature started at 110 °C, isothermal, then, heating 5 °C/min to 280 °C, and isothermally for 26 minutes at 300 °C. The injector temperature was 250 °C. The volume injected for all samples was 1µL. The split ratio was 1:25 and the ionization voltage 70 eV. Helium was the carrier gas at a flow rate of 1 mL/min. The separated components were identified by matching them with the National Institute of Standards and Technology (NIST) mass spectral library data and by comparing their Kovat’s indices with those of authentic components and with published data. The quantitative determination was carried out by peak area integration. Nanostructured emulsion preparation and characterization The three different nanostructure emulsions were prepared containing copaiba resin-oil, copaiba essential oil, and bullfrog oil according to previous studies. 13 The system was produced using the following composition: oil at 5 % (w/w), water at 93 % (w/w), Tween 20® at 1.56 % (w/w), and Span 80® at 0.44 % (w/w). Phase inversion technique (PIT) was used to produce the nanostructured emulsion. 15 The amount of Span® 80 was dispersed in the oil (phase 1) while Tween® 20 was dispersed in the water (phase 2). The phases were heated separately to 70° C and then phase 1 was emulsified into phase 2 by an UltraTurrax® T25 (IKA, Staufen, Germany) homogenization for 10 minutes at 13,000 rpm. Additionally, physicochemical analyses were carried out. pH was measured using a PG-2000 pHmeter (GEHAKA, Morumbi, SP, Brazil) and electrical conductivity measurement was performed using a DM-32 conductivity (Digicrom Analytical, Campo Grande, SP, Brazil). Droplet size, polydispersity, and zeta potential analysis were evaluated by Dynamic Light Scattering (DLS) using a ZetaPlus (Holtsville, NY, USA). All analyses were performed at 25 ± 2 °C. Antimicrobial Susceptibility Assay 76 Bacterial and fungal sensitivity of all strains described above was initially performed using a susceptibility test with Muller-Hinton agar for bacteria and Mueller-Hinton agar + 2 % glucose and 0.5 µg/mL methylene blue dye for yeasts. 16, 17 The inocula were prepared in NaCl 0.9%(w/v) solution and adjusted to the 0.5 McFarland standard. Subsequently, 10 µL of the copaiba resin-oil, copaiba essential oil, bullfrog oil, and the three nanostructured emulsions containing each of these oils were added to the wells. The oils were dispersed in DMSO (1 %(w/w)) for all tests. Chloramphenicol (1.5 mg/mL) and ketoconazole (2.5 mg/mL) were used as synthetic antimicrobial controls for bacteria and yeasts, respectively. Tween 20® at 1.56 %(w/w), Span 80® at 0.44 %(w/w), and DMSO 1 %(w/w) were also tested individually. Assays were carried out in triplicate, three times (n = 9). Broth Microdilution Assay The inocula of microorganisms in NaCl 0.9 %(w/v) solution were adjusted to the 0.5 McFarland standard. They were then used to prepare further dilutions in Mueller-Hinton Broth, containing 0.5 to 2.5 x 103 CFU/mL. A broth microdilution assay with serial dilutions of the samples was performed with sterile Muller-Hinton Broth in a 96-well microplate from 0.0001 to 248.7 mg/mL. 18 Subsequently, 100 µL of each microorganism cell suspension was then added to each well. The plates containing bacteria were incubated for 24 hours at 35 °C while the fungi were incubated for 48 hours at 37 °C in an orbital shaker (TE – 420 Tecnal, Piracicaba, SP, Brazil) at 150 rpm for Minimal Inhibitory Concentration (MIC) determination. Assays were carried out in triplicate. Bioautography Assay The Thin Layer Chromatography (TLC) was developed with copaibaoil/methanol and bullfrog-oil/methanol (2:8) and the hexane/ethyl acetate (9:1) solution as the eluent system. The TLC plates were revealed with vanillinsulphuric acid to observe the chromatographic profile. Subsequently, the TLC plates were reproduced and loaded into culture plates prepared with MuellerHinton agar and the bacterial inoculum adjusted to the McFarland 0.5 standard. For the fungi strains, Mueller-Hinton agar plus 2%(w/w) glucose and 0.5 µg/mL 77 methylene blue dye were used. The inhibition halos were observed using tetrazolium chloride (TTC) and the Retention Factors (Rfs) were calculated after an incubation period of 24 and 48 hours for bacteria and fungi, respectively, at 35 ºC. The silica was removed at the Rf for extraction of the chemical retained compounds. The extraction was performed with ethyl acetate in an ultrasound bath for 20 minutes and filtration. Moreover, the samples were analyzed in GCMS. Assays were carried out in triplicate. Antibiofilm Assay Cell suspensions were prepared according to the microdilution assay. The nanostructured emulsions and the respective oils (99:1(w/w) in DMSO) were added (12.5 % (v/v)) separately in sterile 96-well microliter plates containing sterile Mueller-Hinton Broth and microorganism suspensions, incubated at 35°C for 24 h and 48 h for bacteria and yeasts, respectively, in an orbital shaker at 150 rpm. Then, the supernatants were removed and the wells were washed with sterile water to remove non-adherent cells. The biofilms were stained with crystal violet for 20 minutes. Subsequently, 200 µL of absolute ethanol was added and the optical density (OD) was measured with an ELISA microplate reader (BioTek, µQuant) at 570 nm. 19 Ketoconazole and chloramphenicol were used as control antimicrobial agents according to the antimicrobial screening. Assays were carried out in triplicate. Statistical Analysis The results are presented as the mean ± S.D. Statistical significance between 3 groups was performed by Analysis of Variance (ANOVA) followed by Tukey’s post-test. Student’s t-test was used between 2 unpaired groups. p values less than 0.05 (p < 0.05) were considered significant. RESULTS AND DISCUSSION Chemical characterization Concerning the samples’ characterization, the GC-MS was a useful tool to identify the chemical compounds of the studied oils. The technique showed a 78 required resolution and peak separation, allowing analyzing the compounds individually in comparison with the spectra library and the retention times found in the literature. Prior to the CG-MS analysis, the extraction of copaiba essential oil showed a 10 % and Silveira, 2005. (v/v) 20 yield, which was superior to that reported by Gramosa The CG-MS analyses showed that terpenes have lower retention time in copaiba resin-oil analysis when compared to the same compounds in the copaiba essential oil (Figure 1A and Figure 1B). These characteristic terpene compound peaks can be observed in several studies that analyzed the chemical composition of copaiba oils. 3, 21 Figure 1 The analysis of copaiba resin-oil chromatograms suggests that βbisabolene was the major identified compound (Table 1). Other components, such as β-caryophyllene and α-bermagotene, were also present at high amounts. The residue fraction obtained after extraction of the essential oil showed a lower amount of sesquiterpenes, indicating that these compounds were extracted by hydrodistillation and were concentrated in the essential oil (data not shown). Table 1 The bullfrog oil GC-MS analyses showed separated peaks in which methyl oleate was the ester presented as the most abundant compound. The oleic acid esters were the predominant compounds, followed by esters of palmitic and linoleic acid (Figure 1C). Thus, these three compounds were the predominant monounsaturated, saturated, and polyunsaturated fatty acids, respectively. These results are also in accordance with those observed in the literature concerning the composition of bullfrog oil 7, 22 , which reported different methodologies for bullfrog oil extraction and also indicated the predominance of oleic, linoleic, and palmitic fatty acids (Table 2). Table 2 79 Nanostructured emulsion characterization The systems were macroscopically presented as milky and fluid dispersions. Furthermore, the formulations were not creamy on top. The conductivity (from187.51 µS to 226.20 µS) confirmed the external aqueous phase of the systems. The DLS analysis showed a nanosized droplet size for all nanostructured emulsions of about 200 nm, as well as a low polydispersity. Additionally, pH values were low, ranging from 3.22 to 3.48, probably due to the presence of fatty acids from both oils. The zeta potential was distinct for the three systems, probably because this property is influenced by the chemical composition of the nanostructured emulsion components, especially the oils (Table 3). The bullfrog oil nanostructured emulsion showed the lowest zeta potential (- 11.86 ± 1.99), which could predict low stability. However, all the nanostructured samples remained quite stable over time. Table 3 Antimicrobial Susceptibility Assay The antimicrobial screening performed by the agar diffusion method was performed to investigate whether the tested strains were sensitive to the oils used to produce the nanostructured emulsion systems. The inhibition halos showed that some strains were sensitive to copaiba oils. The resin-oil and the essential oil exhibited an inhibition halo of 6.6 mm and close to 9.0 mm, respectively, against S. aureus (Table 4). This result corroborates the findings of other studies with copaiba oil from other species against S. aureus, including the copaiba oil extracted from Copaifera multijuga, which showed inhibition halos of 7.0 mm against S. aureus. 23 On the other hand, the bullfrog oil showed no significant antibacterial or antifungal activity against all tested strains. However, it is important to emphasize that studies based solely on susceptibility tests using agar diffusion are not conclusive. In some occasions the antimicrobial compounds are not 80 able to migrate through the agar or are present at low concentrations. Therefore, further microbiological assays such as broth microdilution and bioautography would be required to confirm these results. 18 The microbiological behavior of the resin-oil and that of the essential oil revealed in this work were significantly different, probably because of their different chemical compositions. In fact, the essential oil showed an activity of about 50 % more efficient than the resin-oil against S. epidermidis ATCC 12228 and was more effective than the resin-oil for most of the tested strains. This indicates that the highest concentration of sesquiterpenes, such as βcaryophyllene and α-himachalene, provides greater antibacterial and antifungal activity to the essential oil (Table 4). 24 Table 4 Several works found in the literature concerning the antimicrobial activity of C. langsdorffii oil by agar diffusion technique show a different profile of response. In fact, the copaiba oil used in this work presented an inhibition halo that was about 50 % lower for some reference strains. This could be explained by the variability of the methodology or by the variability of the chemical composition of the oil in plants of the same species. Therefore, the evaluation of the chemical composition of the oils is a crucial step in the development of nanostructured emulsions using natural oil products. 25 Concerning the antifungal activity, it must be emphasized that copaiba essential oil has potential activity against reference strains of C. krusei (12.89 ± 6.03) and C. glabrata (13.67 ± 3.42), which are known for possible resistance to azole antifungals widely used for the treatment of superficial infections. On the other hand, strains of C. albicans, C. tropicalis, and C. parapsilosis had full growth and were not sensitive to the essential oil. Therefore, each strain should be tested with the essential oil independently of the genus or species. However, these Candida species are considered less able to develop resistance to synthetic antifungal drugs currently in use. 26 It is important to note that both the DMSO (used to solubilize the oils) and the surfactants (Tween 20® and Span 80®) present no activity when separately 81 used. This finding is relevant to prove that the surfactants would not directly influence the antimicrobial activity of the nanostructured emulsion systems. Broth Microdilution Assay Following the evaluation of the sensitivity of the strains to the oils, a broth microdilution assay was performed with the nanostructured emulsion systems containing copaiba resin-oil, copaiba essential oil, and bullfrog oil. The copaiba oil-based nanostructured emulsions presented lower MIC values when compared to the pure oil samples, specifically for C. glabrata and C. krusei (Table 5). It is important to highlight that, although with only 5% of oil, the nanostructured emulsion systems containing the copaiba resin-oil and the copaiba essential oil showed activity equivalent to or better than that of the pure oil alone (Table 5). Such improvement of activity could be due to the nanostructured emulsion system, in which the oil was dispersed as droplets and which may improve the activity of the compounds, resulting in a better activity of natural oils. 13, 27 This was again demonstrated by the significant decrease (p < 0.05) in the MIC for C. glabrata ATCC 2001 using the emulsion based on the copaiba resin-oil rather than the oil itself. Table 5 However, a paradoxical effect phenomenon for the clinical strain of C. glabrata, which presented inhibition only at low concentrations and cells restarting to grow with higher concentrations of the oil, was observed (results not shown). It was already demonstrated by Chamilos et al. (2007), using a new group of antifungal agents, the echinocandins 28 , that the fungal cells were sensitive to low concentrations of antimicrobial agent, but at higher concentrations the fungal cells grew, probably due to the resistance mechanisms. However, additional studies are necessary to confirm the suggested phenomenon in this study. Since the nanostructured emulsion based on bullfrog oil and the pure oil showed no activity in the susceptibility assay, the MIC was determined only against the ATCC strains in order to confirm the preliminary results. As 82 expected, both the bullfrog oil nanostructured emulsion and the pure oil exhibited MIC values > 228.5 ± 0.0 mg/mL for all tested strains. However, the ineffective activity found for the bullfrog oil compared to the copaiba oils could be due to the choice of the strains used in this study. Therefore, a microbiological activity assay with additional strains would reveal the efficacy of such product and the fatty acids found in its composition, as claimed by the literature 29. Bioautography The bioautography of copaiba resin-oil revealed two different chromatographic zones that caused inhibition on the microorganisms’ growth. The first chromatographic band inhibited P. aeruginosa ATCC 27853 (Rf 0.2) and the second one inhibited the growth of S. aureus ATCC 29213 and S. epidermidis ATCC 12228 (Rf 0.15). The GC-MS analysis showed traces of αcurcumene, α-himachalene, Isothujol, and α-fenchene in the first band, while the second fraction showed α-himachalene (1.46 %) and traces of α-curcumene in its composition (results not shown). Additionally, other terpenes from the copaiba oil have been reported as active compounds by several studies in which the antimicrobial activity of βcaryophyllene, caryophyllene oxide, and copalic acid, usually present in large quantities in the copaiba resin-oils, was investigated. 30 Thus, it may be suggested that the terpenes, identified by the GC-MS after the bioautography method, were probably responsible for the antimicrobial activity of the copaiba oil. However, further studies are required in order to investigate their activity individually. The bioautography of bullfrog oil followed by CG-MS analysis revealed the presence of esters of oleic (48.6 %) and palmitic (0.9 %) acids in the zone related to the inhibition growth of P. aeruginosa ATCC 27853 (Rf 0.6). As it can be seen, the oleic acid was predominant in this oil (results not shown). Issacs et al. (1995) demonstrated that oleic acid and monoglycerides are responsible for the antimicrobial activity in breast milk. 29 Therefore, these fatty acids present in large amounts in the bullfrog oil may be the compound responsible for its antimicrobial activity. It is important to note that although the bioautography 83 results did not corroborate with the antimicrobial screening, it provides the possibility of testing concentrated compounds through chromatographic bands, which provides better sensitivity to the method and highlights the effective antimicrobial activity of the bullfrog oil. Antibiofilm activity The reduction in biofilm formation is an important tool to corroborate the antimicrobial activity because phenotypic changes may occur with microorganisms, making them more invasive than planktonic cells. In most cases, biofilm formation confers greater resistance to antimicrobial molecules and the immune defense of the host. 31 Both copaiba resin-oil and copaiba essential oil were able to provide effective inhibition on the biofilm formation (Figure 2). Additionally, considering most of the strains, the oils themselves and their nanostructured emulsions presented the same profile of inhibition with no significant difference (P > 0.05). However, for S. aureus ATCC 29213 and S. epidermidis ATCC 12228 strains, a significant decrease (p < 0.05) in the biofilm formation was observed for the copaiba essential oil nanostructured emulsion when compared to the pure oil. In contrast, C. krusei CS improved the biofilm formation when cells were grown in the presence of this system and ketoconazole (Figure 2). However, the copaiba essential oil nanostructured emulsion showed a better antibiofilm activity than ketoconazole for C. krusei ATCC 6258. This result may be related to the intrinsic resistance of the C. krusei strains to fluconazole. In fact, because of the similarity among the azole chemical structure, a cross-resistance against these antifungal agents may be possible to appear. 32 Figure 2 The analysis of the biofilm formation for bullfrog oil nanostructured emulsion showed a significant inhibitory activity against most of the yeast strains when compared to the pure oil (Figure 3). It is important to highlight that although bullfrog oil nanostructured emulsion did not present positive results for Pseudomonas aeruginosa ATCC 90027 in the microbial sensitivity assay and in 84 the broth microdilution assay, a significant inhibition of the biofilm formation was observed, suggesting that the bullfrog oil may act on the cells that form the biofilm, impairing either adhesion initial steps or exopolymeric matrix secretion, but not in planktonic cells of P. aeruginosa. Figure 3 Additionally, bullfrog oil nanostructured emulsion inhibited the biofilm formation of most of the tested Candida species. Thus, this system could be used to treat fungal infections triggered by the biofilm formation caused by yeasts of the genus Candida, which are responsible for about 80% of fungal infections in the hospital environment. 33 It is important to highlight that the biofilm formation is related to the severity of the infection. Therefore, its inhibition is a mandatory step to evaluate whether a product has a good antimicrobial activity, even if the concentration used to inhibit biofilm formation is below the MIC. Moreover, the nanostructured emulsion system here evaluated could be a therapeutic choice to treat patients without the use of synthetic antibacterial or antifungal agents. CONCLUSION Copaiba essential oil assembles the majority of sesquiterpenes, identified as main antimicrobial compounds, presented in the copaiba resin-oil while bullfrog oil contains a pool of omega fatty acids. Moreover, copaiba essential oil exhibited better antimicrobial activity than the similar resin-oil, especially against Staphylococcus and Candida species. Bullfrog oil and its nanostructured emulsion, on the other hand, showed no significant antimicrobial sensitivity against the tested strains in some experiments. However, the oleic acid, which was identified as the main antimicrobial compound in this product, exhibited antimicrobial activity against P. aeruginosa. The nanostructured emulsions, even containing only 5% (w/w) of oil in its formulation, showed their importance in preserving and enhancing the antimicrobial activity of copaiba oils. Moreover, the nanostructured emulsion systems were able to improve the antimicrobial activities of the original oils, 85 especially the bullfrog oil nanostructured emulsion, which demonstrated a poor antimicrobial activity. Additionally, this system showed a significant result concerning the biofilm inhibition against Pseudomonas aeruginosa, an important multidrug resistant pathogen responsible for hospital infections in immunocompromised patients. Therefore, given the relevant antimicrobial and antibiofilm activities found for the copaiba essential oil and the bullfrog oil nanostructured emulsions against pathogenic species of bacteria and fungi involved with cutaneous infections, it may be concluded that these formulations are suitable alternatives to develop new medicines for future use in the treatment of infections triggered by several microorganisms. ACKNOWLEDGMENTS The authors thank E. C. G. Santos from LABMULT (UFRN, Natal, Brazil) and M. A. P. Medeiros and W. P. Silva form MMML for providing clinical isolates. This research was supported by CNPq and CAPES, including a master scholarship provided by the latter. The authors are also grateful to Glenn Hawes, M.Ed. English from the University of Georgia, for editing this manuscript. 86 REFERENCES 1. M. Saleem, M. Nazir, M. S. Ali, H. Hussain, Y. S. Lee, N. Riaz and A. Jabbar, Nat. Prod. Rep. 27, 238-254 (2010) 2. P. Cos, A. J. Vlietinck, D. V. Berghe and L. Maes, J. Ethnopharmacol. 106, 290-302 (2006) 3. V. F. Veiga Junior and A. C. Pinto, Quim. Nova. 25, 273-286 (2002) 4. F. A. Pieri, M. C. Mussi and M. A. S. Moreira, Rev. Bras. Plantas Med. 11, 465-472 (2009) 5. V. F. Veiga Junior, L. Zunino, M. L. Patitucci, A. C. Pinto and J. B. Calixto, J. Pharm. Pharmacol. 58, 1405-1410 (2006) 6. J. P. B. Sousa, A. P. S. Brancalion, A. B. Souza, I. C. C. Turatti, S. R. Ambrósio, N. A. J. C. Furtado, N. P. Lopes and J. K. Bastos, J. Pharm. Biomed. Anal. 54, 653659 (2011) 7. V. S. Lopes, T. N. C. Dantas, A. 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RT CO RT CEO (min) (%) (min) (%) δ-elemene 6.90 0.37 21.17 0.63 (+)-cyclosativene 7.52 0.45 22.31 0.67 α-copaene 7.66 0.93 22.76 1.39 β-elemene 7.92 1.44 23.46 2.41 β-caryophyllene 8.57 18.30 24.62 21.68 α-bergamotene 8.74 15.61 25.29 20.53 α-guaiene 8.83 1.17 25.38 0.88 β-farnesene 9.03 1.61 26.11 1.56 α-caryophyllene 9.22 2.80 25.95 2.85 τ-muurolene 9.60 0.82 26.88 0.53 β-cubebene 9.75 4.83 27.06 1.72 β-selinene 9.88 4.34 27.27 6.16 α-selinene - - 27.62 2.31 τ-gurjenene - - 27.78 0.89 β-chamigrene 10.04 5.63 - - β-bisabolene 10.21 24.76 28.24 23.67 β-sesquiphellandrene 10.55 2.44 - - α-curcumene 12.29 0.35 - - α-cedrene 12.85 0.53 - - β-cedrene - - 28.76 1.40 α-himachalene 13.01 1.74 33.39 0.46 Kaurene 20.98 0.39 - - Chemical composition RT (min): Retention time; CO: Copaiba resin-oil; CEO: Copaiba essential oil; (-) Not detected. 89 Table 2 – Percentage of fatty acid esters from bullfrog (Rana catesbeiana Shaw) oil RT BO (min) (%) Methyl palmitoleate 18.25 2.23 Methyl palmitate 18.65 5.87 Methyl linoleate 21.84 4.79 Methyl oleate 21.94 9.26 Glyceryl monooleate 28.22 7.59 Chemical composition RT (min): Retention time; BO: Bullfrog oil. 90 Table 3– Physicochemical characterization of the nanostructured emulsions. pH Conductivity Droplet (µS) Size (nm) Polydispersity Zeta potential COE 3.40 187.51 200 ± 0 0.24 ± 0.01 - 34.37 ± 2.50 CEOE 3.48 226.20 280 ± 1 0.14 ± 0.02 - 27.08 ± 0.89 BOE 3.22 220.30 260 ± 0 0.27 ± 0.01 - 11.86 ± 1.99 COE: Copaiba resin-oil nanostructured emulsion; CEOE: Copaiba essential oil nanostructured emulsion; BOE: Bullfrog oil nanostructured emulsion. 91 Table 4– Microbial sensitivity (Inhibition halos (mm)) of copaiba resin-oil and copaiba essential oil against susceptible strains) Microorganisms CO CEO Ref S. aureus ATCC 29213 6.66 ± 1.32 9.88 ± 2.14 *27.78 ± 2.04 S. epidermidis ATCC 12228 5.44 ± 0.72 14.00 ± 2.39 *35.11 ± 3.68 S. epidermidis CS1 - 11.89 ± 1.96 *27.89 ± 3.14 S. epidermidis CS2 - 13.11 ± 3.14 *24.44 ± 6.34 C. glabrata ATCC 2001 6.33 ± 2.06 12.89 ± 6.03 C. glabrata 15V3C (CS) - 9.88 ± 0.78 C. krusei ATCC 6258 - 13.67 ± 3.42 C. krusei LMM54 (CS) - 13.78 ± 3.23 **28.33 ± 2.50 **28.11 ± 2.08 **24.67 ± 2.87 **24.22 ± 4.35 (-) Exhibited no inhibition halo; CO: Copaiba resin-oil; CEO: Copaiba essential oil; Ref: Antimicrobial synthetic reference; *Chloramphenicol; **Ketoconazole. 92 Table 5– Microdilution Assay Results (MIC) of copaiba oils and nanostructured emulsions (mg/mL) Microorganisms CO COE CEO CEOE S. aureus ATCC 29213 > 234.0 ± 0.0 > 249.7 ± 0.0 55.4 ± 0.0* > 249.3 ± 0.0* S. epidermidis ATCC 12228 > 234.0 ± 0.0 > 249.7 ± 0.0 221.7 ± 0.0 > 249.3 ± 0.0 S. epidermidis CS1 0.0009 ± 0.0** 0.0455 ± 0.022** 221.7 ± 0.0 > 249.3 ± 0.0 S. epidermidis CS2 > 234.0 ± 0.0 > 249.750 ± 0.0 221.7 ± 0.0 > 249.3 ± 0.0 C. glabrata ATCC 2001 > 234.0 ± 0.0* 0.9717 ± 0.00*** 0.1083 ± 0.076*** 15.6 ± 0.0*** C. glabrata 15V3C (CS) 0.0009 ± 0.0 0.0001 ± 0.0 0.1083 ± 0.038*** 0.9736 ± 0.0*** C. krusei ATCC 6258 > 234.0 ± 0.0 > 249.7 ± 0.0 34.7 ± 0.0* 15.6 ± 0.0* C. krusei LMM54 (CS) > 234.0 ± 0.0 > 249.7 ± 0.0 34.7 ± 0.0* 3.9 ± 0.0* CO: Copaiba resin-oil; COE: Copaiba resin-oil nanostructured emulsion; CEO: Copaiba essential oil; CEOE: Copaiba essential oil nanostructured emulsion; MIC = Minimum Inhibitory Concentration. * = p < 0.05; ** = p < 0.01; *** = p < 0.001, when comparing the emulsions with the oils themselves. 93 Figure File Figure 1 – Chromatogram of natural oils. A: Copaiba resin-oil; B: Copaiba essential oil; C: Bullfrog oil. 94 Figure 2 – Percentage of Biofilm growth in the presence of copaiba samples. CO: Copaiba resin-oil; COE: Copaiba resin-oil nanostructured emulsion; CEO: Copaiba essential oil; CEOE: Copaiba essential oil nanostructured emulsion; Ref: Chloramphenicol (bacteria) and Ketoconazole (fungi). 95 Figure 3 – Percentage of Biofilm growth in the presence of bullfrog samples. BO: Bullfrog oil; BOE: Bullfrog oil nanostructured emulsion; Ref: Chloramphenicol (bacteria) and Ketoconazole (fungi). 96 Graphical abstract 97
