PI 8807888 A

e
e
e
REPÚBLICA FEDERATI
•
Ministério da Justiça..
Instituto Nacional da Propriedadebdustrié
C) Prioridade unionista:
12/02/88 US 155.264
The United States of America as
C) Depositante:
Represented by the Secretary, U.S. Departament of
Commerce (US)
e
e
Inventar(es): Mark Christopher Jenkins; John Barton
Dame; Michael David Ruff; Hyun Soon lillehoj; Harry
Dele Danforth (US)
Procurador: Dannemann, Siemsen, Bigler & Ipanema
Moreira.
C) Data do depósito: 23/11/88
( a6i Pedido internacional: PCT/US88/04172 de 23/11/88
e
Publicação internacional: W089/07650 de 24/08/89
0
Data da publicação:
C) Int C14: C12N 15/11,
PI 8807888 A
20/11190
(RPI 1042)
C12N 15/70, C12P 21/00, A61K
39/00, C07K 13/00
e
Título:
e
Resumo:
"Genes clonadoe codificando antígenos de coccidlose aviária que
Induzem uma resposta mediada por células e método de
produção doe mesmos"
' São apresentadas seqüências de DNA que codificam malsinas
antigênicas, métodos para identificação dessas seqüências de DNA
e antígenos codificados por essas seqüências de DNA. A primeiro
. etapa do método é fornecer uma multiplicidade de seqüências de
DNA. Esses seqüências são, então, inseridas em vetores de
expressão de DNA para formar vetores de expressão recombinentes.
Os vetores de expressão são inseridos em hospedeiros adequados
• para formar transformentes que expressam es seqüências de DNA.
Os transformantes são, então, contactados com anticorpos dirigidos
contra antígenos de Eimeria para identificar transformantes
contendo seqüências de DNA que codificam antígenos de Eimeria.
Esses antígenos são, então, produzidos a partir das seqüências de
DNA identificadas como codificadoras dos antígenos. Os antígenos
assim produzidos são contactados com células brancas ungiriam
que efetuem uma resposta imune mediada por célula, assas saloias
brancas sangüíneas sendo sensibilizadas para uma praieiro
antigênica de Eimeria, para, dessa forma, identificar seqüências de
DNA que codificam antígenos que induzem uma resposta imune
mediada por células à coccidlose aviária. As seqüências de DNA
da presente invenção compreendem genes clonados ou seus
fragmentos que codificam, na expressão, uma proteína antigênice
que ativa células brancas sangüíneas que efetuam uma resposta
imune mediada por células, esses células brancas sangüíneas sendo
sensibilizadas para uma proteína antlgênica de Eimeria.
Pedido tal como depositado (PCT).
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para
"GENES .CLONADOS
CODIFICANDO ANTÍGENOS DE COCCIDIOSE
AVI4RIA QUE INDUZEM UMA RESPOSTA MEDIADA POR CÉLULAS E
MÉTODO DE PRODU010 DOS MESMOS".
5
Fundamentos da Invencgo
A coccidiose,
uma desordem intestinal de aves
domésticas, causa uma variedade de problema no hospedeiro
infectado. Esses problemas variam de baixas razões de
conversão de alimentos em infecções leves à morte aguda em
10
infecções mais graves. Estima-se
que
a doença custe aos
produtores de aves grelhadas norte-americanos 300 milhões
de dólares por ano, devido, em parte, aos ganhos de peso
não realizados, perda da pigmentação da pele e baixa
utilização do alimento e, em parte, ao custo dos
15 medicamentos anta-coccidlose.
A
coccidiose
é
causada
Eiggelg.
pertencentes ao gênero
têm um ciclo de vida complicado,
por protozoarios
Os elementos desse gênero
que consiste tanto em
estágios assexuados e zexuados. O ciclo é iniciado quando
20 as
aves
ingerem
oocistos
associados a material fecal).
esporozoítos assexuados
trato digestivo da ave.
esporulados
(geralmente
Esses oocistos contêm
invasivos,
que são liberados no
Os esporozoítos
invadem células
epiteliais e se desenvolvem em estruturas multinucleadas,
••••
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•• •••• ..
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• • • • • •
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GD
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••
- 2 -
chamadas de esquizontes. Cada esquizonte amadurece e libera inúmeras estruturas assexuadas invasivas, conhecidas
como merozoítos, no trato digestivo da ave, onde eles, por
sua vez, invadem outras células epiteliais. O estágio
5 sexuado do ciclo de vida da coccidiose é iniciado quando
os merozoítos se diferenciam em gametócitos. Os estágios
de desenvolvimento assexuado e/ou sexuado produzem as
lesões patológicas no trato digestivo características da
coccidiose. Os gametócitos, então, se fundem e os
10 produtos de fertilização, chamados de oocistos, são liberados nas fezes. A formação de aocistos completa o ciclo
de vida do parasita.
Infecçães por protozoários do género
Eimeria
podem ser aliviadas, e até prevenidas, pela administração
15. de Agentes anti-coccidiose. Entretanto, surgem cepas resistentes ao medicamento a uma taxa freqüente e o custo do
desenvolvimento de agentes anti-coccidiose é relativamente
alto. Galinhas podem ser vacinadas contra a doença por
infecção com cepas vivas atenuadas de Elbeela ou com mate20 rial parasitário não vivo.
doença
apreciável
com
Entretanto, há um efeito de
a primeira abordagem e uma
quantidade proibitiva de material
seria necessária
tornar a segunda útil em grande escala.
para
Além disso, a
proteção com a segunda está longe de ser completa.
Uma
25 solução alternativa seria produzir, por engenharia
genética, os antígenos protetores de parasitas Eleeria.
Uma vez desenvolvidos, os imunógenos poderia, ser
produzidos em um sistema de cultura procaricitico ou
••
• • • • • -• •—•
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China o•
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••
- 3 -
eucarigtico,
em um suprimento
ilimitado, e usados para
vacinar galinhas contra a doença subseqüente.
As respostas imunes são mediadas por dois mecanismos efetuadores diferentes. Um mecanismo, que envolve
5 a produção de anticorpos pelo tecido linf6ide, é chamado
de "imunidade humoral". O outro, que envolve a ativação
de células sanguíneas brancas, como linfácitos T previamente sensibilizados ao imuntigeno, é chamado de
"imunidade mediada por células". Veja
10
etc/co5eno...12
Iffigunglegyl_Bagig
(J. Bellanti segunda edição, 1985).
A publicação do pedido PCT número WO 8ó/00528,
de Anderson et al., intitulado "Cloned Gene and Piethod for
Making and Using the Game", apresenta genes clonados que
codificam proteínas antiggnicas de espécies de
gimerle.
O
15 procedimento ensinado por esse pedido para a triagem de
células transformadas, para identificar essas seqUgncias
de DNA, envolve o uso de anti-soro de galinha polivalente
obtido com galinhas previamente infectadas com
tenella.
Veja
Id.
Eimeria
em 9, 41/43 e 44. D anti-soro de
20 galinha, entretanto,
só' reflete a resposta imune humoral
da ave ao antígeno ao qual a ave foi exposta e não reflete
a resposta imune mediada por células da ave. Portanto, a
patente de Anderson ensina como obter seqUgnclas de DNA
que codificam a produção de antígenos que evocam uma
25 respostam . imune humoral. Embora uma importante
contribuição para a técnica, Anderson não se refere a se
esses mesmos antígenos evocam uma resposta imune mediada
por células e, se não, como esses antígenos poderiam ser
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e
leme
e,
- 4 -
obtidos.
contribuição relativa da
Nem se refere à
resposta imune mediada por células e da resposta imune
humoral à resposta imune integrada de aves à coccidiose
aviária.
5
Portanto, um objeto da presente invenção é
apresentar um meio para a produção de seqüências de
DNA
que codifiquem antígenos que evocam uma resposta imune mediada por células à coccidiose aviária.
Um
objeto adicional
importante da presente
10 invenção .é apresentar um meio para identificação de
seqüências de ONA que codifiquem antígenos
que evocam uma
resposta imune mediada por células à coccidiose aviária e
que, de outra forma, não possam ser identificados por
procedimentos da técnica anterior.
15
Um outro objeto
da
apresentar genes clamados
que
presente
invenção
é
codificam antígenos da
superfície celular do esporozoito ou merozuíto de
particularmente antígenos de superfície celular de
Elmecia,
El/leria
acecuullna.
.20
Ainda outro objeto da presente invenção
é
apresentar células hospedeiras transformadas que produzem
antígenos que evocam uma resposta imune mediada por
células è coccidiose aviária.
Ainda
outros
objetos da presente invenção são
25 apresentar métodos e vacinas utilizáveis na proteção de
aves contra a coccidiose aviária.
Sumário da Invenção
A presente
invenção, em um primeiro aspecto,
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•
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45.
Ge .
- 5 -
envolve um metodo para a obtenção de seqüências de DNA
desejadas. D método envolve, inicialmente, o provimento
de uma multiplicidade de seqüências de DNA de
Elpedig
(basicamente fornecidas como uma biblioteca de DNA
5 geniimico ou de DNA complementa•).
Essas
seqüências
são,
então, inseridas em vetores de expressão de DNA, para formar vetores
de expressão
recombinantes.
A seguir,
vetores de expressão recombinantes são inseridos
hospedeiros
adequados para formar transformantes
os
em
que
10 expressam as seqüências de DNA. Esses transformantes são,
então, triados com (isto é, contactados com) anticorpos
dirigidos contra antígenos da superfície celular de
Eirecia,
para
identificar
transformantes
contendo
seqüências de DNA que codificam antígenos da superfície
Elegeis.
15 celular de
superfície celular de
Depois disso, os antígenos da
Eimecia
são produzidos a partir das
seqüências de DNA identificadas como codificadoras desses
antígenos. Esses antígenos da superfície celular da
Eliecla
São, então, contactados com células
brancas
20 sangüíneas que tenham sido sensibilizadas à proteína
antigênica de
sanguíneas
células
giraria
(especificamente, células brancas
que efetuam
da ave)
a resposta
imune
mediada por
para, dessa forma, identificar seqüências
de DNA que codifiquem antígenos que induzem uma resposta
25
imune mediada por células à coccidiose aviária.
Descobriu-se inesperadamente que, seguindo-se 0
procedimento acima, podem-se obter seqüências de DNA que
codificam proteínas antigênicas utilizáveis como vacinas
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O lefe Ge
•••
- 6 -
Para a coccidiose aviária, que não podiam ser obtidas por
processos anteriores de identificação de seqüências. As
seqüências de DNA fornecidas pelo procedimento acima, que
não são fornecidas pelos procedimentos da técnica ante5 rior, são identificadas por contactarão de antígenos da
flectia
superfície celular de
produzidos pelo procedimento
acima descrito com soros imunes colhidos em aves infectadas por
Eigeria.
Os antigenos não reconhecidos pelos
soros imunes são codificados por seqüências de DNA que não
10 teria]
sido
identificadas por procedimentos da técnica
anterior.
Um segundo aspecto da presente invenção são os
Produtos que podem
ser produzidos pelos procedimentos
acima. Esses produtos são seqUênciais de DNA que
15
compreendem um gene clonadn
ou seu fragmento que ativa
células brancas sanguíneas que efetuam uma resposta imune
mediada
por
células, essas células brancas sanyüineas
sendo sensibilizadas para uma proteina antigériica de
almeria. Os
antigenos
são, de preferência, dirigidos com-
20 tra antígenos da superfície celular de
Eimeria,
antígenos de superfície celular de esporozoito de
ou de merozoíto de
Eliecia.
como
(lamela
Um grupo de seqüências de DNA
da presente invenção codifica proteínas antigénicas não
reconhecidas pelos soros imunes colhidos de aves infec25 tadas com
Elemcia.
Vetores de expressão recombinantes também são
aqui apresentados. Esses vetores compreendem um vetor de
expressão com um promotor e uma seqüência de DNA conforme
• •• • ••• • ••••
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•• •• •• •• •• e
•• • ••• • •• • • Ge •
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•••• ••
•• ••••
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•
• ••
• • •••• • •
••
- 7 -
acima descrita inserida no vetor, a jusante do promotor e
operativamente associada a ele. As células transformadas
aqui apresentadas, utilizáveis para a preparção de
antígenos, compreendem uma célula hospedeira e um vetor de
5 expressão. de DNA recombinante conforme acima descrito,
contido dentro da célula hospedeira. O promotor do vetor
de expressão é selecionado para ser operacional na célula
hospedeira.
Um outro aspecto da presente invenção são os
10 antígenos produzidos pelas células hospedeiras transformadas, esses antígenos
senda discutidos na parte
acima.
Esses antígenos compreendem proteínas ou seus fragmentos
que ativam células brancas sanguíneas, essas células
brancas sangüíneas efetuando uma resposta imune mediada
15 por células e essas células brancas sanguíneas sendo
senbilizadas para uma poroteína antig@nica de
Eirecla.
Métodos e vacinas utilizáveis para a proteção de
aves contra infecção por coccidiose aviária também são
aqui apresentados.
20 uma ave
de um
O método compreende a administração a
antígeno conforme acima descrito, em uma
quantidade eficaz para imunizar a ave contra coccidiose
aviária. As vacinas são compostas por esses antígenos, em
uma quantidade eficaz para imunizar uma ave contra a
coccidiose aviária,
em
combinação
com
um
veiculo
25 farmaceuticamente aceitável. O termo "imunizar", conforme
aqui usado, significa qualquer nível de proteção que seja
de algum benefício em uma população de aves,
de menor mortalidade, menores contagens
quer na forma
de
lesões,
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- 8 -
melhores razões de conversão da alimentação ou redução de
qualquer efeito prejudicial da coccidiose aviária, a
despeito de se a proteção é parcial ou completa.
DEFINICSES.
Os seguintes termas são aqui empregados:
5
Clonagem
A seleção e propagação de (a) material
genérico
de um único Indivíduo, (h) um vetar contendo um gene ou
fragmento de gene ou (c) um único organismo contendo um
10 desses genes ou fragmentos de gene.
Vetor de Clonagem
Um plasm(dio, vírus, retrovírus, hacteridfago ou
seqUência de ácido nucléico que seja capaz de se replicar
em uma célula hospedeira, caracterizado por um ou um
15 pequeno número de sítios de reconhecimento de endonuclease
de restrição, onde a seqüência possa ser cortada de
maneira predeterminada, e que contenha um marcador
adequado para uso na identificação de células transformadas, por exemplo, resistência à tetraciclina ou
20 resistência à ampicilina. Um vetor de clonagem pode ou
não possuir as características necessárias para operar
como vetor de expressão.
Códon
Uma seqUência
de
DNA de três nucleatidios (um
25 tripleto) que codifica (através do mRNA) um aminoácido, um
sinal da partida da tradução ou um sinal de término da
tradução.
Por exemplo, os tripletos de nucleotídios TTA,
TTO, CTT, CTC, CTA e CTS codificam e ardina ácido
leucina
• • • • •• .•• ..
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•• •••••••
• •• • • • ••••••
• • • • • •• •
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••••
- 9 -
("Leu"), TAD,
TAA e
TGA são sinais de parada da tradução e
ATC é um sinal de partida da tradução.
SeqUancia de DMA
Uma série linear de nucleatídias conectados en5 tre si por ligaç'des fasfodiéster entre os carbonos 3' e 5'
de pentoses adjacentes.
Expressão'
O processo sofrido por um gene estrutural para
A expressão requer tanto a
produzir .um polipeptidia.
10
transcrição do DNA, quanto a tradução do RMA.
Vetar de Expressão
Um plasmidio, vírus, retrovirus, bacteriófago ou
seqifincia de ácido nucleíco que seja capaz de se replicar
em uma
célula hospedeira, caracterizado por um sitio de
15 reconhecimento de endonuclease de restrição, onde
a
seqUência pode ser cortada de maneira predeterminada para
a inserção de uma seqUé'ncia de DNA heterólogo.
Um vetor
de expressão tem um promotor posicionado a montante do
sítio onde a seqüência é cortada para a inserção da
20 seqUância de DNA heterOlogo,
o sitio de reconhecimento
sendo selecionado para que o promotor
rativamente associado a seqUincia de
esteja
ope-
DNA heterálogo.
Proteína de fusão
Uma
proteína
produzida
quando dois genes
25 heterólogos ou seus fragmentos que codificam duas
proteínas diferentes não encontradas na natureza, fundidas
entre si são
fundidos entre si em um vetar de expressão.
Para que a proteina de fusão corresponda às proteínas se-
••••
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• • • •
• •••
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•••• • •• •
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• • • • • •
••
•
•
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• • • • •
•• •• • •••• •••• ••••
• • • •
- 10 -
paradas, as seqüências de DNA separadas têm de ser fundidas entre si em uma armação de leitura de tradução
correta.
Sonora
Todo o DNA
5
de
un organismo.
Inclui,
entre
outras coisas, os genes estruturais que codificam os
polipeptídios da substáncia, assim como seqüências operadora, promotora e de ligação e interação com ribossomas,
incluindo seqUências como as seqüências de Shine-Dalgarno.
10
DNA Heterólogo
Uma seqüência de DNA inserida dentro ou conectada a outra seqüência de DNA que codifica polipeptídios
não codificados na natureza pela seqüência de DNA à qual
está unida.
15
Nutleotidlo
'Unidade monomérica de DNA ou RNA consistindo em
uma fração açúcar (pentose), um fosfato e uma base
beteracíclica nitrogenada.
A base é alinhada à fração
açúcar mediante o carbono glicosidico
20
pentose)
e essa
combinação
(carbono 1' da
de base e açúcar é
nucleosidio. A base caracteriza o nucleotídio.
um
As quatro
bases do DNA são a adenina ("A"), guanina ("G"), citosina
("C") e timina ("T"). As quatro bases do
RNA são A, G, C
e uracila ("U").
25
Vaga ou Bacteribfago
Vírus
bacteriano,
muitos dos quais
seqüências de DNA encapsidadas em um
mento
incluem
invólucro ou revesti-
protéico ("caps(dio"). Em um organismo unicelular,
• • • •• • • SI COO •CO• I
•
5, • •
II • •
41 ... • •
•
•
•
• • • • • • • • • • •• • ••
Mu
II
OU
4114~
II
um fago pode ser introduzido por um processo chamado de
transfecção.
Plasmidia
Seqüência de DNA de fita dupla não cromossomina,
5
compreendendo
um "répZicon" intacto
plasmídio em uma célula hospedeira.
colocado
dentro
de
um
para rep]icar o
Quando o plasmídio é
organismo
unicelular,
as
caracteri:sticas desse organismo podem ser alteradas ou
transformadas como resultado do DNA do plasmidio.
10
exemplo
Por
um plasmídio portador do gene da resistência á
tetraciclina (Tet R ) transforma uma célula previamente
sensivel à tetraciclina em uma resistente a ela. Uma
célula transformada por um plasmidio é chamada de "transformante".
15
Polipeptidio
Uma série linear de aminoacidos conectados entre
si por ligaçges peptidicas entre os grupos alfa-amino e
carhóxi de aminoácidos adjacentes.
Promotor
20
Uma
seqüência de DNA dentro de uma seqüência de
DNA maior, que define um sítio ao qual a RNA polimerase
pode se ligar e iniciar a transcrição.
Armação de Leitura
O agrupamento de códons durante a tradução de
25
mRNA em seqüências de aminoácidos. Durante a tradução, a
armação de leitura apropriada tem de ser mantida. Por
exemplo, a seqüência de DNA GCTGGTTGTAAG pode ser
traduzida através do mRNA em três armações de leitura,
OCO PC MIE I& 00
SI
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• •
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• •
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41
• Mi
MI
• IP
• •
•
Me
Is 11
III
- 12 -
cada
fornecendo
uma
uma
diferente
seqUência
de
aminoácidós:
•GCT GGT TOT AAG
- Ala-Sly-Cys-Lys
CTO OTT GOTA AG - Leu-Val-Val
SC TSO TTG TAA A - Trp-Leu-(Parada)
5
Molécula de DNA Recombinante
Uma seqUância de DNA híbrido compreendendo pelo
menos duas seqüência de DNA, a primeira seqüência nor malmente não sendo encontrada na natureza fundida à se10 gunda.
Sítio de Ligação Ribossomal
Uma seqüência de nucleotídíos de mRNA, codificada por uma seqüência de DNA, à qual os ribossomas se
ligam para poder iniciar a tradução. Um sítio de ligação
15 ribossomal é necessário para ocorrer uma tradução eficiente.
A seqüência
ligação ribossomal
de
DNA
que codifica o sitio de
está posicionada em uma seqUencia de
DNA maior a jusante de um promotor e a montante de uma
seqüência de partida da tradução.
Seqüências de Shine-
20 Dalgarno são sítios de'ligação ribossomal procariiiticos.
Mon de Partida
Também chamado de códon de
iniciação, é o
primeiro trípleto do mRNA a ser traduzido durante a
síntese de.proteinas ou peptídios e imediatamente precede
25 o gene estrutural que está sendo traduzido. D códon de
Partida normalmente é o AUG;. mas, às vezes, também pode
ser o SUS.
Gene Estrutural
••
••••• ••
••
•• ••• • -,
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IP•
••
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••
•
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•
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• • • •
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••
••
•
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e
- 13 -
Uma seqüência de DNA que codifica, através de
seu RNA de molde ou mensageiro ("mRNA"), uma seqüência de
aminoácidos característica de um polipeptídio especifico
que seja um constituinte integral de uma organela celular
5 (como uma membrana celular).
Transcrição
O
processa de produção de mRNA
a
partir de um
gene estrutural.
Tradução
10
O processo de produção de um polipeptidio a partir de mRNA.
Descrição Detalhada da Invenção
Na
da presente
prática
Eimecia
espécie de protozoário do gênero
15 empregada.
Essas incluem
e
qualquer
Pode
ser
Eimecia_acerywlina, Ea_mimati,
Es____necateiN. Es
Es_mliii • Ea_ecaccou,
tonina, EA_Arlineiti
invenção,
Es_tenella.
Esses protozoários são
conhecidos e disponíveis para aqueles versados na tecnica,
pois a coccidiose aviária é encontrada em fazendas de aves
20 domésticas por todo o mundo.
Wisber,
Murray,
Veja, por exemplo, M.
Belec.____Biechem.__Eacaãltol., 21:7 (1986);
P.
et al., publicação de pedido de patente européia
número 0.223.710; R.
Schenkel, et al., pedido de patente
européia número de série 0.135.073.
é particularmente
25 preferida para a prática da presente invenção a
E,
acemilina.
A presente invenção pode ser praticada com
qualquer ave suscetível à coccidiose aviária,
incluindo
....
• • •.. • • CO • • •
. 110 .. • •
• • • • • •
•• • • •• • • •• •• • • •
*DO
.. OD .. .. ,D
•
•• • • • •
• • • •De•
- 14 -
perus, patos, gançvs, codornas, perdizes e
galinhas,
faisães. .Uma ave particularmente preferida para a prática
da presente invenção é a galinha.
Pode-se gerar uma multiplicidade de seqüências
5 de DNA, obtidas de uma espécie de
ninei&
para uso na
prática da presente invenção, por técnicas convencionais.
Uma abordagem é a adigestão do DNA genâmica de uma espécie
de
Elrecla,
com a finalidade básica sendo a preparação de
uma biblioteca de DNA genilmico. Veja, genericamente, R.
10 Old e
S,
Primrose,
erInclRles_of__Geoe__ManiewlaIlan,
102-109 (terceira edição, 1985).
Uma abordagem mais
preferível é isolar o mRNA de uma espécie de
EiMeria
e
gerar seqüências de cDNA com ele, com a finalidade básica
sendo a preparação de uma biblioteca de cDNA.
15 genericamente, R. Old e S.
Primrose,
Maniatis, E. Fritsch e J. Sambrook,
LabgraIpem_Banual,
sueca
Veja,
em 109-111; T.
floleculac_CluninsI_A
187-246 (1982). Seqüências de DNA em
uma biblioteca de cDNA não contêm introns, pois estes
foram removidos pela união do mRNA do qual as seqüências
20
de
cDNA são preparadas. Se as seqüências de DNA tiverem
de se expressar em um hospedeiro bacteriano, elas devem
ser, de preferência, seqüências de cDNA, pois íntrons
eucarióticos não são unidos por bactérias.
Podem-se empregar varias combinaçães de vetor25 hospedeiro na prática da presente invenção. As células
hospedeiras podem ser
células procariáticas
ou
eucariáticas e, quando as células hospedeiras são células
bacterianas, elas podem ser bactérias gram negativas ou
.. •
• ..
•
• •
•
Me Ge
• • •
• Gi G@• •Gee• •
el ••• •• ee No •
•
• •@O • ••
ei
AIPO
•
• • .. •
De
e, •8, •6. e• ••
We e.
- 15 -
gram
positivas.
Eschecichla_cell
Hospedeiros utilizáveis
(incluindo, por exemplo,
incluem a
EA_C011
X1776,
Ea_call X2282, E.—C1211 H6101 e EA-C1211 MRCI), espécies de
Seleunella
(incluindo, por exemplo,
5 celeridade
e
Bacillue_sektille,
S.
Eseinumenas
espécies de
SA___-digiblIO),
(incluindo, por exemplo,
S.—InhIMMCIMM2
E,__acemeinesa
leveduras e outros fungos (por exemplo,
Saccharomyces cerevisiae), células vegetais, como células
vegetais
em
cultura
(incluindo, por exemplo, tanto
10 angiospermas, quanto gimnospermas) e células animais, como
células animais em cultura.
Os vetores usados na prática
da
presente
invenção são selecionados para serem operacional: como
vetores de clonagem ou vetores de expressão na célula
15 hospedeira
exemplo,
selecionada.
bacteriáfagos,
híbridos.
Os vetores podem ser, por
plasmídios,
vírus
ou
Vetores utilizáveis em
plasmídios (por exemplo, pSC101,
Co1E1,
P8R324, pBR325, PAT153, pUC-6 e
seus
incluem
RSF2124, pBR322,
pUC-8),
bacteriófago
20 lambda, cosmídios, fasmídios e colifagos filamentosos.
espécie de
Galmonella
As
podem ser transformadas, por
exemplo, com plasmídios, como pJC217, pORD001 e pBRD026.
Vetores utilizáveis em bactérias gram negativas geralmente
incluem plasmídios de grupos de incompatibilidade P, U ou
25 W,
que tgm amplas gamas de hospedeiros (por exemplo,
RP4 e RSF1010) e Transposons, como TnT. O
efflaille,
Sa,
Bacana
uma bactérica gram positiva, pode ser transfor-
mada com plasmídio de
$. a acecce
(por exemplo, pC194,
O DOO e. e.DO
e**
e•
Come
me e* e* e*
*G
Ok
O 41
O
DO
DD • O
•
•
*Dane
▪
DD
DD
DD
O DOO DO
DO
,D
•
DO
DD
DO
•DO
11 OD
O
O 41
• •
ID
ee
DO
DO
- 16 -
Vetores de hospedeiro
p8a0501, p118110 e pT127).
pE194,
levedura
incluem plasmídios de
integração de levedura
(como pYeLeu 10), plaseídio epissomais de
levedura
(como
pJDB219 e pJDB248), plasmídios de replicação em levedura
5 (que contém uma seqüência de replicação autónoma, ou
nacs". derivaua de um cromossoma de levedura) e plasmídios
de centrgmero de levedura (que contém centrgmeros
funcionais em levedura).
Vetores de células vegetais
incluem Oeminivírus, Caulimovírus (como CaMV, CERV, DaMV,
10 FMB,
tendo
MMV,• CVBFV e ThIV) e Astobaclecum_Aldefaciens
plasmídios Ti.
con-
Vetores de células de mamíferos
incluem vírus (como o 9V40), retrovírus e adenovirus.
específico,
Dentro de cada vetor
podem-se
selecionar varios sítios para inserção da seqüência de DNA
15
isolada. Esses sitias normalmente sio designados pela enzima ou endonuclease da restrição que os corta.
Por
exempla, no p8R322, o sítio Pst I está localizado no
gene
para a penicilinase,
que codificam os
entre os trípletos de nucleotídios
aminoácidos 181 e
182
proteína
da
20 penicilinase.
O sítio particular escolhido para inserção do
fragmentO de DNA selecionado no vetor para formar um vetor
recombinante é determinado por vários fatores. Esses
incluem a tamanho e a estrutura do polipeptídio a ser
25 expressado, suscetibilidade do polipeptídio desejado à
degradação
enzimática
hospedeira
e
características
pelos
contaminação
de
componentes
por
suas
da
célula
proteínas,
expressão, como localização dos códons
GOGO GD .. .. OCO
CO CO CO
COO .. •CO
G@ CG Co l.
•
CD
DO •
•
..
00
O
GO
. •
GOGO
.
G
OGO O C O
•DOC• •
ODOC DO
CG
GD
G
GO
GO
GD
••
- 17 -
de partida•e parada e outros fatores reconhecidos
por
aqueles versados na técnica. Nenhum desses fatores
sozinho controla absolutamente a escolha do sitio de
inserção para um polipeptidio particular. Ao invés, a
5 sitio escolhido reflete um equilíbrio desses fatores e nem
todos os sítios podem ser igualmente eficazes para uma
dada proteína.
Seqüências de DNA de
Eigerla podem ser inseridas
no vetor desejado por técnicas conhecidas. Entretanto, se
10 o vetor tiver de servir como vetor de expressão, o vetar
deve ter um promotor e a seqüência de DNA deve ser inserida na vetor a jusante do promotor e estar
operacionalmente associada a ele.
O vetor deve ser
selecionado para ter um promotor operacional na célula
15 hospedeira na qual o vetur deve ser inserido (isto é, o
promotor deve ser reconhecido pela RNA polimerase da
célula hospedeira). Além disso, o vetar deve ser uma
região
que codifique um sítio de
ligação a ribossoma
posicionado entre o promotor e o sitio no qual
a seqüência
20 de DNA é Inserida, para estar operativamente associado á
seqüência de DNA de
Eimeria
uma vez inserida (de
preferência, em uma armação de leitura de tradução correta
com ela).. O vetor deve ser selecionado para fornecer uma
região que codifique um sítio de ligação ribossomal
25 reconhecido pelos riobossomas da célula hospedeira na qual
o
vetar deve ser inserido.
Por exemplo,
se a
célula
hospedeira tiver de ser uma célula p•oca•riótica, como
cpli,
EA
então, a região que codifica um sitio de ligação
••••
•• • • •• • • • ••••• • •• • • •• • • •• •
•• • • ••
• • • •• • •I. •• • • •• • • •• • • •• •
••••
• •• • • •• • • •• • ••
• •• • • • • •• •
- 18 -
ribossomal pode codificar uma seqüência de Shine•Dalgarno.
Um método
preferido para a realização da pre-
sente invenção é com vetores que produzem
fusão.
uma proteína de
Esses vetores incluem, em ordem, de montante para
5 jusante, um promotor, uma região que codifica o sítio de
ligação ribossomal, um códon de partida da tradução, uma
seqüência que codifica uma primeira proteína ou seu fragmento, imediatamente após o códon de partida de tradução,
e um sítio no qual a segunda seqlãncia de DNA de
10 inserida. A seqUância de DNA de
Eimerig
Elmeria é
(que codifica uma
proteína ou seu fragmento diferente da primeira seqUéncia
de DNA, .por exemplo, beta-galactosidase) é inserida no
vetar para ser unida diretamente à primeira seqUéncia e
está em
15 ela.
uma armação
de leitura de tradução correta com
A primeira e a segunda sequência de DNA codificam,
juntos, uma proteína de fusão.
Na presente
invençáo,
células hospedeiras trans-
formadas são triadas com anticorpos (monoclonais ou
policlonais) dirigidos contra antigenos de superficies ce20 lular de
Eirecla
antes da etapa de triagem para ativação
de células brancas sangüíneas.
Os procedimentos da técnica anterior empregam
soros imune colhidos em aves infectadas com
Linda.
Esses soros não são dirigidos especificamente para os
25 antígenos da superfície celular. Na presente invenção,
empregam-se anticorpos policlonais colhidos de um animal
ao qual se tenham administrada antígenos de superfície celular de
Elrecla
desnaturados. Alternativamente, podem-se
IMO 56 ••Ge• MI Nb
ell
••
• • •G
GIG
G
• '.
• h
• •
5
e
GO
GO •
h
•
G•
OO
04
•
• I
GO
4 •
GOG
• G
q.
•
fel
OS
4 •
G
Of
Mi
ile
lides SC
GO
GO
G
CG
•0
04
- 19 -
empregar anticorpos monoclonais dirigidos contra antígenos
específicos da superfície celular de
Um
desenvolvimento
Eigern.
único
aqui
apresentado
envolve o uso de anticorpos monoclonais dirigidos para o
5J
corpo
refrátil de
Elmegelm.
Através do uso desses
anticorpos, identificam-se seqüâncias de DNA que codificam
uma proteína do corpo refrátil ou seu fragmento.
Essas
seqüências de DNA também podem ser empregadas na prática
da presente invenção.
Anticorpos
10
dirigidos
superfície ce]ulu]ar de
Eligtla
P.
Augustine,
Veja, por exemplo,
Gene, 32:89 (1985);
Eowliew___Scis,
da
podem ser obtidos por
procedimentos conhecidos na técnica.
Timmins, J. 6., et ah,
antígenos
contra
62:2145
15 genericamente G. Kohler e C. Milstein,
N. Danforth e
(1983);
veja
Naturg, 254:495
(1975). Esses anticorpos podem ser de qualquer origem,
mas são, de preferência, anticorpos de coelhos ou murinos
(camundongos ou ratos). Eles podem sor de qualquer classe
de imunoglobulina, incluindo 196, IgA, IgD, IgE e IgA. é
20 preferível a I96, como a 1961, 1962, 1963 e 1964.
Para triagem contra células brancas sangüíneas,
os antígenos codificados pela seqüência de DNA de
interesse podem ser produzidos por qualquer meio convencional. Pode ser expressada pelo mesmo vetar e célula
25 hospedeira em que foi originalmente clonada, transferida
para um hospedeiro diferente para expressão
ou transferida
para um vetor e hospedeiro diferentes para expressão. O
produto de expressão antigânica é, então, extraído da cul-
• • • • ••
..• • • •• • ••••• • •• ..• .. ..• .. •
•• .. •• •• •• • •• •• • • • •• • • •• •• • •• •
• • •• • • • • e • • • ••
•••• ••
••
•
••
••
••
••••
..
- 20 -
tura de células hospedeiras e usado na etapa de triagem
com células brancas sangüíneas.
Células
brancas sangüíneas utilizáveis para
prática da presente
invenção
incluem qualquer célula
5 branca sangüínea que efetue uma resposta imune mediada por
células, em oposição à humoral. Essas células incluem,
por exemplo, Granulúcitos (como Basófilos e mastócitos,
Eosinófilos e neutrófilos), Linfiicitos T, Macrófagos,
células K é células NK.
As células brancas sanguíneas
10 devem ser células brancas sangüineas sensibilizadas para
um antigeno de Eimerla.
para a
São particularmente preferidos
prática da presente invenção os linfócitos T. Os
procedimentos para a determinação se essas celular são
ativadas por um antigeno são conhecidos por aqueles ver15 sados na técnica ou ficarão claros para aqueles versados
na técnica através da presente exposição e incluem tanto
testes
in_Ylice,
quanto in_ulye. Por exemplo, o antígeno
poderia ser topicamente aplicado a um sujeito sensibilizado para glmenja e a região à qual o antígeno foi apli20 cado examinada quanto a uma reação de pápula e rubor.
Sujeitos adequados para esse teste incluem coelhos, ratos
e camundongos. Alternativamente, o antígeno poderia ser
injetado subcutaneamente
na barbela de uma galinha sensi-
bilizada para Eimecla e a
barbeia da galinha examinada
25 quanto a inchamento. O procedimento mais quantificável e,
portanto, mais preferível é a incubação de células brancas
sanguíneas colhidas de uma ave sensibilizada para
Elmeria
em uma solução aquosa contendo o antígeno. Veja também H.
Geee ..
DO
*Gee ee
..
• e • e • • e •
• •
C
• e •
•
..
De
11
•
•
ee
..
C
• • e • •
. • • D • •
el
• e
De
e •
e
e •
•
Cega De
CD
lee
•
De
DD
ee
- 21 -
Lillehoj, "Immune Response during Coccidiosis in SC and FP
Chickens I. In_lateg assessment of T cell proliferation ta
stage
specific
parasite
Immingemibel., 13:321
antigens,
Vet.___ImmunQl..
(1986); veja também M. Beaven, et
5 al., Ja__EharmA_Exu_Iher., 224:620 (1983); N. Beaven, et
De preferência,
al., CliDA-ChEMA__BCIaa , 37:91 (1972).
obtêm-se células brancas sanguíneas (são removidas de) uma
ave durante a segunda exposição da ave a
Eimeria.
Nesse
momento, as células brancas sanguíneas da ave, que haviam
10 sido
previamente sensibilizadas, estão aumentando
de
número.
Há inúmeras patentes norte-americanas expedidas
disponíveis que apresentam informaçães úteis para aqueles
versados na técnica na prática da presente invenção. A
Murray,
15 patente norte-americana número 4.710.463, de
apresenta vetores de expressão de DNA recombinante, incorporando seqüências de DNA que codificam antígenos do vírus
da Hepatite
8.
A patente norte-americana número
4.601.980, de Boeddel e Heyneker, apresenta a expressão de
20 um
geme
que codifica o horminio do crescimento humano em
um sistema 12811322
Es_coli.
A patente norte-americana
e Ditta,
apresenta
plasmídios RK2 utilizáveis para a clonagem de
genes em
número
4.590.163,
bactéria:.
de
Helinski
grais negativas, como Ea_COli. A patente norte-
25 americana número 4.237.224, de Cohen e Roger, apresenta
métodos para a produção de vetores de expressão de
DNA re-
combinante. A patente norte-americana número 4.332.897,
de Nakano, et al., apresenta
vetores
bacteriófagos
.. ..• .. .. •••• ••• •• ••
•• • • ..
•• •
..• ..• •
•
• •• •• •• •• ••• ••• • •• • ••• • • .. • • .. •
•
• •• • •• • • •• • • •
•••• ••
••
••
••
••••
- 22 -
lambd6ides utilizáveis para a transformação de
Es_coll.
a
patente norte-americana número 4.332.901, de Goldstein,
apresenta um vetor de clonagem bacteri6fago derivado de
P4. A patente
5 Itakura
e
norte-americana
número 4.704.362, de
Riggs, e a patente norte-americana número
4.356.270, de Itakura, apresentam vetores de plasmidio recombinante utilizáveis para a transformação de hospedeiros
microbianos. A patente norte-americana
número 4.273.875,
de Ranis, apresenta um plasmidio designado por pUC6,
10 utilizáveis como vetor de clonagem para a transformação de
hospedeiros microbianos. A patente norte-americana numero
4.349.629, de Carey, et al., apresenta vetores de
plasmidio que empregam o
promotor
trp,
bacteriano
utilizáveis como vetores de expresão de DNA recombinantes.
15 a patente norte-americana número 4.362.817, de reusser,
apresenta o plasmidio pUC1060,
que contem iam promotor de
gene tet, utilizável como vetar de expressão. A patente
norte-americana. número 4.599.308.
apresenta
de Hamer,
et
al.,
vetores de expressão SV40, que podem ser
20 introduzidos em células eucurióticas. As patentes norteamericanas número 4.693,976,
de Schilperoort,
et al.,
se
4.536.475, de Andersori e 4.459.355, de Cello e Olsem,
referem todas
á
transformação de células vegetais com
plasmidio Ti de
iSsegbacteclum_Immefacieos.
As exPosiçlíes
25 de todas as referências de patente norte•americana aqui
citadas devem ser incorporadas por referência.
Nos exemplos abaixo, são apresentadas
três
seqüências de DNA específicas que codificam antígenos da
•••• ••
ror
9.• •••• ••
••
• • • • • • • •• • • • ••
• •
r
•
ta
•• •
•
II
••
••
••
•
• • • • 4 •
•
e
•
•
•
•
•
• •
• •
• • • • • •
••
••
••
•
••
••
- 23 -
superfície celular de
Eimecla.
O clone MA1 é apresentado
na tabela 1, o clone cMZ-8 é apresentado na tabela 2 e o
clone MC17 e apresentado ria tabela 3.
mostradas em
sua orientação 5' para 3'.
As seqüências são
Aqueles versados
5 na técnica podem fazer inúmeros usos dessa informação. Em
primeiro lugar, trabalhando com os mesmas materiais
de
partida de Eilleela_SCREYWliDa, podem reisolar as mesmas
seqüências. Em segundo lugar, podem gerar sondas
oligonucleotídicas
homólogas ás sequências mostradas nas
10 tabelas e isolar seqüências de DNA que se hibridizam às
sondas. Essas sondas têm, de preferência, pelo menos 16,
e mais preferivelmente pelo menos 20, nucleotídios de
comprimento. Consegue-se uma seletividade de ligação
ainda maior com sondas
de 30 nucleotidios ou
mais
de
15 comprimento, mas as vantagens de sondas com comprimentos
muito maiores que esses tendem a ser anuladas pela
desvantagem dos menores rendimentos de sondas mais longas
que podem ser sintetizadas. Em terceiro lugar, em vista
da degeneração conhecida do código genético
(mais de um
20 cidon codifica o mesma aminoácido), eles podem produzir
diferentes seqüências de DNA, que podem codificar, na
expressão, as mesmos polipeptídios codificados para
expressão por qualquer uma das seqüências de DNA p•ecedentes.
25
Os antígenos da presente invenção podem ser administrados por qualquer via conveniente, como subcutânea,
intraperitonial ou intramuscular, na presença de um diluente fisiologicamente aceitável. Os antígenos podem ser
00 CO .. .. 088
• ..
8, •
8,
..
.. .
•
.
•
•
888
•
GOOG•19
880
98
81,
•
..
..
..
.
..
..
..
.888,
8 O
•
8941
e
88
CO
OU
- 24 -
administrados em uma única dose ou em uma pluralidade de
doses. Os antígenos da presente invenção podem ser administrados, caso desejado, em combinação com estabilizadores de vacina ou adjuvantes de vacina.
5 Estabilizadores típicos são, por exemplo, a secarose,
sal
um
de hidrogênio fosfato de metal alcalino, glutamato,
albumina sérica, gelatina ou caseína.
O estabilizador
pode ser um ou mais dos precedentes.
O adjuvante pode
ser, por. exemplo, alúmen ou uma composição contendo um
10 óleo vegetal, monooleato de isomanidio e monoestearato de
alumínio. Os antígenos da presente invenção podem ser
armazenados sob refrigeração ou em forma congelada ou
liofilizada.
Os antígenos podem ser administrados a aves
15 através de vias biológicas. Uma célula hospedeira transformada que expressa uma seqüência de DNA que codifica um
antígeno pode ser administrada a uma ave, de modo que a
célula hospedeira expresse o antígeno na ave. Por
exemplo, um hospedeiro $almonella pode ser administrado
20 por via oral à ave. Alternativamente, o antígeno pode ser
incorporado em um vetor capaz de transformar células de
aves (por exemplo, um retrovírus) e esse vetar administrado à ave, de modo que as próprias células da ave sirvam
como célula hospedeiras para o vetor, expressem o antígeno
25 e apresentem o antígeno ao sujeito. Todas esses
procedimentos são procedimentos para se prepararem e
administrarem antígenos da presente invenção a aves, a fim
de proteger essas aves contra a coccidiose aviária.
GPOO
• 11 .5
PO
CO Offe
GO
•
•
..
O
•
GO
O
O
CO
•
• • • •
. O O
O •
•
CO
OU
•
..
O
11
COO OU
..
•
CO
..
- 25 -
Os exemplos a seguir são apresentados
para
ex-
plicar mais completamente a presente invenção. São apenas
para fins ilustrativos e não devem ser tomados como uma
limitação.
5 Exemplo 1
Extração de RNA de Esporozoítos
Uma mistura de oocistos esporuladas e
esporulados de EIMRCia_aCerYlállOa (total de 2,2 x 10
não
9
) foi
homogeneizada em um triturador Potter•Elvheim, na presença
10 de
tampão
de
extração de
DNA/RNA
(isotiocianato de
guanidina 4 M, B-mercaptoetanol 0,1 M, ácido
etilenodiaminatetraacético 10 mM
(EDTA),
citrato de sódio
5 mM, sarcosina sádica 0,5%). O homogenado foi diluído em
1,6 voltasoes de trifluoroacetato de césio e centrifugado a
15 45.000 rpm durante 16 horas a 20°C.
A banda de RNA foi
removida por punção com agila de seringa do tubo de
centrífuga e foi diluída em 2 volumes de etanol a 100% e
armazenada durante 15 minutos
a -70°C.
O RNA
precipitado
foi peletizado por centrifugação a 10.000 rpm durante 30
20 minutos a 4°C. A pelota de
etanol
RNA foi lavada duas vezes com
a 70% e coletada por centrifugação.
A pelota de
RNA foi secada In_yaggg e, entâo, dissolvida em H20.
solução de
A
RNA foi extraída duas vezes com uma solução a
1:1 de fenol-clorofórmio, duas vezes com clorofórmio e,
25 então,
precipitada durante uma noite com 0,1 volume de
acetato de sódio 3 M e 2,5 volumes de etanol a -20°C. O
RNA
foi coletado por centrifugação, secado
dissolvido em H O.
2
in_macwg
e
••••
••
• • • ••• •• •• •• • ••••..• •• • • .. • • ..
•
•
..
• 99 •• • •• •• • • • .. 99 • • ..
• •• •• • •
•
•••• •• ••• •• • • •• • • • • •• •• ••
- 26 -
Exemplo 2
Extração de RNA de Merozoftos
Merozoftos de
Es_aceemulina
(total de 2,9 x 10 9 )
foram obtidos em galinhas infectadas e purificados com5 forme descrito em Jenkins e Liame,
paraglIol.,
25:155 (1987).
floleG.
—
Biochem.
Os merazortos foram rompidos
por pipetação na presença de tampão de extração de
O isolamento do RNA foi, depois disso, idântico
DNA/RNA.
ao procedimento descrito para o isolamento de RNA de
10 esporozoitos (Seção 1).
Exemplo 3
Seleção de subpopulanes de RNA com Resíduos Poli A
RNA de esporozoitos e merozoitos foram passados
através de uma coluna de celulose oligo-dT
(Pharmacia)
15 para enriquecer o RNA poli A+ (isto é, mRNA).
Uma vez li-
gado,
o RNA poli A+ foi eluído da coluna com H20 desti-
lado, coletado e precipitado com etanol
sódio.
e acetato de
O mRNA foi peletizado por centrifugação, lavado
com etanol a 80%, centrifugado mais uma vez, secado jm_ya=
20
chio e dissolvido em H 2 0.
Exemplo 4
Preparação de Bibliotecas de cDNA de Esporozoftos e
Merozoftos a Partir do Respectivo mRNA de Esporozoftos e
Merozoftos
25
A. Preparação de DNA de bacteriófago lámbda recombinante.
O cDNA foi gerado a partir de RNA poli A+ de
esporozoitos e merozoitos de
técnicas estabelecidas.
E.___ aCermulina
-
usando-se
Veja Dubler e Hoffman, Gene,
Offe ..
..
•••• 419
• le •
f •
1, •
fel
O 11•ei
11
•
•
•
5,
•
Come •
••••••
• GO
CO
•
Gi
9
,11
• •
•
CM ..
Of •
11.
- 27 -
25:263-269 (1983). Resumidamente, a síntese da primeira
fita da, cDNA foi realizada aplicando-se com aliso dT ria
presença de RNAsin, o dNTPS apropriado e
a transcriptase
reversa do Vírus da Leucemia Murina Moloney (MMLV). A
5 síntese de cDNA foi interrompida após 1 hora a 37°C com
EDTA e a mistura de cDNA-RNA foi extraída com fenolclorofórmio e precipitada com etanol e acetato de sódio,
centrifugada, secada
in_yratug e ressuspendida em H20. A
síntese da segunda fita foi realizada na presença de dNTPS
10 e RNase H por DNA polimerese I. Após uma incubação de 1
hora a 15°C, seguida por 1 hora de incubação a 22°C, a
reação foi interrompida e o cDNA de fita dupla foi
extraído
om fenol-clorofórmio, precipitado com etanol e
acetato de amónio, coletado par centrifugação, secado
15
ybUilD
ia
e ressuspendido em Tris 50 mM, pH 7,6, EDTA 1 01,
DTT 5 mM. O cDNA foi metilado com s-adenosil metionina
por EcoRI metilase e as extremidades do cDNA foram polidas
com T4
PNA
clorofórmio,
polimerase I. Após extrações com fenolprecipitação com etanol,
centrifugação e
20 secagem In_yacyo, o cDNA metilado foi acrescido de /isentes EcoRI usando-se T4 DNA ligase e RNA ligase. D cDNA
foi, então, digerido com a enzima de restrição EcoRI durante 1,5 horas a 37°C, para produzir extremidades
compatíveis com EcoRI, interrompido com EDTA, extraído com
25 fenol-clorofórmio, precipitado com etanol, coletado por
centrifugação, secada 10_28CUB, ressuspendido em Tris 10
mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, NaCI 0,4 A e passado por uma
coluna NACS (Bethesda Research Laboratories). 0 cDNA foi
•••• •• GO
••
••
•
•DOI
• GOGO ••
• •••• • • •
• • • •GO • •GO • • •
•
• • • • • • • • • •
991111GO
•• •
•• ••• • • • GeGOGGOO
GO
••
- 28 -
eluído com um tampão de alto sal (NaCI 2 M em TE), precipitado com etanol, coletado par centrifugação, secado ja)
gacgo
e ressuspendido em TE. O cONA foi ligado a DNA de
lambda gtll contendo extremidades EcoRI compatíveis,
5 usando-se T4 DNA ligase a 4°C durante 16 horas.
B. Acondicionamento de DNA de
bacteriófago
lambda recombinante em vírions e transfecção de
E._coll
Y1090. DNA recombinante de cDNA de esporozoito e cDNA de
merozoito-bacteriófago foi acondicionado em vírions intac10 tos usando-se um extrato Packagene, segundo
procedimentos
descritos pelo fabricante (Promega Biotech).
Após o acondicionamento,
bacteridfago
os
usou - se
uma alíquota do
recombinante para transferir células de
EgchgEIChia_coll
da cepa Y1090.
Após a infecção, as
15 células foram plasqueadas em placas de ágar com caldo
Luria (LB), em agarose LB contendo X-gal 0,2X, IPTG 4 mil e
ampicilina e 75 ug/ml. Usando-se essa técnica,
observou-se que mais de 95% dos bacteriófagos eram recombinantes (isto é, continham enxertos de cDNA), conforme
20 julgado pela percentagem de placas brancas
no total de
placas obtidas. Estimou-se que as bibliotecas de cDNA de
esporozaítos e de merozoítos continham 4,1 x 10
6
e 2,4 x
10 6 clones, respectivamente.
Exemplo 5
25
Identificação de Fagos Recombinantes por Triagem de
0211
EA
com soros Imunes de Coelhos que Receberam a
Administração de Fraçães de.Membrana de esporozoítos ou
Rerozottos de E.,_acgegulina
GO GG OU
Ou
•11. •O•O
AO
• OG
GO
OU •
•e• • • u •G
•
I
GA
&• •
e
Ge
AG
•
GO
Os
• G
•• OG e
GO
LU
•
lOGIOGON
GOIDOCG
1115
fb
•
••
GO
II
- 29 -
A. Preparação dos soros imunes.
Para
se triarem
bibliotecas de cONA de bacteriáfagos, soros imunes foram
gerados .por imunização de coelhos com preparaaes de membrana desnaturada de espo•ozoitas ou merozoítos de E.
5
acemilina.
Coelhos individuais foram imunizados por via
intramuscular com membranas de esporozoíto desnaturadas ou
de merozoítos desnaturadas, emulsificadas em Adjuvante de
Freund Completo e reforçados com uma doze idêntica em
Adjuvante de Freund Incompleto (1 ug de proteína de mem10 brama) duas vezes mais, a intervalos de 1 semana. Os
soros imunes foram coletados quando os titulas ELISA antiesporozoito e anti-merozoíto antingiram um patamar e foram
processadas usando-se métodos padronizados. Veja, por
exemplo, Shilgi e Slomick,
15
Cellularr _Immunelesw,
1980).
295-305
111__Selected_fiethods___In
(Michel)
e Shiigi, eds.
antes da triagem das bibliotecas de bacteri6fagos,
os soros imunes foram absorvidos com extrato celular de
Ea_call
Y1090 para remover anticorpos anti - EA__C011.
B.
Imunotriagem de Bacteriófagos Recombinantes.
20 Usaram-se alíquotas (aproximadamente 10
6
clames) das bi-
bliotecas de bacteriófagos SZ e MZ para transfectar
csal
EA
Y1090, que foram plaqueadas conforme descrito na
Seção 48. As placas contendo áreas de fugas em
desenvolvimento
25 nitrocelulose
foram
que
superpostas
por
discos
de
haviam sido embebidas em IPTG 10 mil e
foram incubadas a 37°C durante 4 horas, para induzir a
produção da proteína de fusão galactosidase. Os discos de
nitrocelulose, impregnados com as proteínas de
••••
• • 1.
• • •
ei
CG
• el
O Gi
.. • •
•
CM
OCO
ihe COO 19,
•
•
•
•
..
•
01,
•
O*
GO
44
•
CO ••
CO
- 30 -
contendo a proteína de fusão recombinante, foram removidas, tratados com salina tamponada com fosfato (PDS)
contendo Tween 20 a 0,05% e
OSA a 1X, durante 30 minutos à
temperatura ambiente, para bloquear a ligação de
5 anticorpos não específicos (Ah). Os discos de filtro
foram, então, incubados durante uma noite com uma diluição
al0
2
de soros anti-membrana
de esporozoito ou soros anti-
membrana de merozoito absorvidos, a ligaçâo Ab foi desenvolvida .pelo subseqüente tratamento com 190 anti-coelho
10
(ou anti-camundongo)
biotinilada,
seguido par avidina-
peroxidase. Adicionou-se um substrato (0,5 mg/ml de
4-cloro-1-naftol) e H202 a 0,17.) e as áreas positivas para
cDNA de bacterigfago foram identificadas e removidas das
respectivas placas de cultura com uma pipeta de Pasteur em
15 tampão de diluição de fagos. Foram identificados
cinquenta e cinco clones de espo•ozoíto positivos e 44
clones de merozoito positivos.
Exemplo 6
Subclonagem de Bacteridfagos Selecionados em E._col! Y1090
Uma vez identificados e removidos das respecti-
20
vas placas'
de
cultura,
cada bacteri6fago
positivo no
Exemplo 1 acima foi subclonado por várias rodadas de
plaqueamento, triagem e isolamento, similares às etapas
descritas na Seção 58. Esse procedimento foi repetido até
25
que 100X das áreas de cada clone individual produzissem um
sinal positivo à imunotriagem.
Exemplo 7
Transfer&ncia de Bacterlófagos Selecionados para EA_Coli
•• 91 • • •• •
••
••
••
•
•
Ge
••
••
••
• • ••
e •• • • e ••• •••
•• ••11• ••
11
••
•
e
•
••• e e
•• le• eP
•••• t• •• •• •
•••••
- 31 -
Y1089 e Produção de Proteínas de Fusão com Eles
O
título de cada preparação de bacteriófagos
clonais'preparada no Exemplo 6 acima foi determinado por
infecção de
Es_coll
Y1090 e plaqueamerito em ágar LB con-
5 tendo ampicilina. Alíquotas individuais de uma cultura de
uma noite de Et_C011 Y1089 foram infectadas a uma M.O.I.
Igual a 10 com clones de cDNA de bacteriófagos separados e
cultivadas a 32°C.
Colónias individuais foram colhidas em
placas de microtitulaçgo,
com um desenho de grade, e
10 plaqueadas em réplica em duas placas de cultura ágar
LB-ampicilina.
Uma placa inoculada foi cultivada a 32°C,
a outra 'foi cultivada a 42°C.
Colanias cultivadas à tem-
peratura mais baixa, mas não à mais alta, indicativas de
um estado lisoy@nico, foram isoladas e cultivadas em cul15 tura bruta em caldo LB contendo ampicilina a 32°C. Quando
a
0.D.550 da cultura bruta atingiu 0,4-0,5, a temperatura
foi deslocada para 42°C e mantida nesse nível durante 20
minutos para induzir o ciclo laico. Após um deslocamento
da temperatura para 37°C, a cultura foi induzida com IPTD
20 2 mM durante 1,5 horas. As
E._coll
foram, então, colhidas
por centrifugação a 2.500 rpm durante 15 minutos, a 25°C,
e a pelota de células foi ressuspendida em um volume de
TriE 0,01' M, pH 7,4, MgCl
quimiostatina a 10 ug/ml,
2
5 mM, leupeptina e
e TPCK e TLCK 0,5 mM.
As
E.
25 cal! foram.lisadas por congelamento-descongelamento e rompidas por sonicaçgo durante 20 segundos em gelo.
homogenado foi tratado com 10 ug/ml de DNase e RNase, durante 10 minutos em gelo e, então, centrifugado a 10.000 g
••••gh • CO el IN •
0,91.
•• e• •••
•••
me
CO
II
•
I
•
9411
•• ••• •
•
• •
•
•
411 O
••
OS
COO
el
•
- 32 -
durante 15 minutos a 4°C e o sobreriadante resultante foi
armazenado a -20°C para análises adicionais.
Exemplo 8
Purificação de Proteínas de fusão
5
As
proteínas
de
fusão
beta-galactosidase
produzidas pelos procedimentos descritos no Exemplo
7
acima foram purificadas por cromatografia líquida de alto
desempenho (HPLC), usando-se uma coluna de crivo molecular
GF 250 (Du Pont), após diluição em uréia 6 M
(devido à
insolúvel dos antígenos recombinantes). Frac ióes
10 natureza
de um minuto (0,5 ml/fração) foram coletadas e ensaiadas
quanto à proteína de fusão beta-galactosidase por ELISA.
Os antígenos recombinantes parcialmente purificados foram
dialisados contra várias trocas a 1--1 de DOEM.
15
Exemplo 9
Triagem de Proteínas de fusão Purificadas com Células T
Obtidas em Galinhas Infectadas com E.....aceCYUllos
Linfócitos T imunes foram coletados de linhagens
endogâmicas de galinhas (Hy-Line International Production
20 Center), que haviam sido inoculadas por via oral a 4-8 semanas de idade com 10
aceemmlida
5
oocistos esporulados de
E.
e uma segunda vez com a mesma dose 5 semanas
mais tarde. Os ensaios de proliferação de células T foram
realizados 5-10 dias após a segunda inoculação, conforme
25 descrito por
(1986).
Lillehoj, Wet._Immungla_Immmenatha, 13:321
Resumidamente, lirifócitos esplénicos (3-4 x 10 6 ),
enriquecidos em células T por passagem sobre lã de náilon,
veja Julius, et al.,
Emega_da_Immunal.... 3:645-650 (1973),
Cf
MO
O
• • • • el• .9 •
• ei
.
•CID CCP
Co •
CO
•
@el.
@De
• • • •••
• •• •• •••
Ge
CO
91199
0
9,
0
C
O
.
•
- 33 -
foram co-cultivados com diferentes
concentraçges
de
esporozáítos (1-2 x 10 6 ) ou antígenos recombinantes purificados por HPLC, prepandos no Exemplo 8 acima (50-100
ng)
em placas de microtitulação.
Concariavalina A (Sigma
5 Chemical Co.), como um controle positivo, e frações
idânticas de extratos de lisogânio de lambda gtll purificados por HPLC, como controle negativa, foram incluídas em
cada ensaio. Em todas os ensaios, usaram-se células
esplénicas normais tratadas com mitomicina C (3,4 x 10 4 )
10 como células de apresentação de antígeno. As culturas
foram incubadas durante 3 dias a 41°C em uma atmosfera
umidificada de CO
2
a 5% em ar. As culturas foram pulsadas
18 horas antes da colheita com 1 uCI de
(
3
3
H-dessoxitimidina
H-TdR, New England Nuclear). As culturas foram colhidas
15 usando-se um coletor de células PHD (Cambridye Technology
Inc.) e as quantidades de captação de
3
H-TdR foram
quantificadas em um contador de B-cintilação (Beckman
Instruments, Inc.).
' Das 5-10 proteínas de fusão triadas, aquelas de 20 signadas por cSZ-1 e cMZ-8 se mostraram como as de maior
interesse. Houve um aumento mensurável no nível de
incorporação de
3
H-timidina por linfócitos T SC imunes co-
cultivados com cSZ-1 em comparação com controles de lambda
gt11.
Essa maior resposta era similar quando se usavam
25 células esplénicas SC normais ou células LSCT-RP9 como
fonte de APC. Houve um nível muito maior de ativação de
linfeicitos T SC imunes pelo antígeno CMZ-8 recombinante na
concentração mais alta testada. Essas respostas ao cSZ-1
••
•••• •
•
• • •• •• • • • •• • • •• • • •••
• • ••
• • • • ••
••
•• •
••
••••••
•••••••
• • • •. • • •• • •• • •• • • •• • • •• •
•••• ••
••••
- 34 -
e cMZ-2 parecem ser relevantes para a infecção, pois
células•T de controles normais não infectados exibiram uma
estimulação desprezível na presença de antígenos recombinantes de Ea_aCeneglitia (por exemplo, incorporação de
5
51-I-TdT por células T normais na presença
de antígenos re-
combinantes foi menor que 20% da célula T imunes).
Exemplo 10
Subclongem de cDNA Recombinante em pUC-8, Transformação
de Es____coll JA83 com Ele e Produção de genes Clonados a
10
Partir Deles
CSZ-1 e cMZ-8 foram subclonados em pUC-8 para
facilitar a determinação da organização molecular e sua
seqUgncia de DNA. Produziram-se PreParaçges
bacteriófagos de
15
alto título.
de
Veja, Maniatis, et al.,
(1982), e foram concentradas por centrifugação sobre CsCl.
O DNA de bacteriúfago foi
1982),
preparado
(Maniatis,
et
al.,
digerido com EcoRI para liberar o enxerto de cDNA,
os produtos foram separados por eletroforese em agarase e
o enxerto de cDNA foi isolado por eletroeluição e passagem
20 através de uma coluna NACS. O enxerto de cDNA foi ligado
ao DNA de plasmídio pUC-8, que continha extremidades EcoRi
compatíveis. O DNA de plasmídio recombinante foi usado
para tranformar células de -1M83 competentes usando-se
procedimentos padronizados. Veja, por exemplo, Hanahan,
25 JA__OcileCa__E101., 166:557 (1983).
gerado conforme descrito (Maniatis,
O DNA de plasmídio foi
et
al.,
1982)
enxerto de cDNA isolado conforme acima delineado.
Exemplo 11
e o
•No
•••• ••
•
• ••
G
• •
G •
RI
•
• •
• •
•
•
•
•••
é••le••••••• •
••••
••••
•
•
• •
• •
•
•
•
• •
• •
•
••
••
••
•
••
••
PO/
••
- 35 -
Caracterização do antígeno cSZ-1
Para estudos de marcação e hibridização, o DNA
de plasmídio foi digerido com EcoRI, submetido à
eletroforese em agarose LMP (FMC) e a banda de DNA
5 enxertado foi excisada, colocada em tampão de
eletroforese, em bolsas de diálise, e eletroeluída durante
2 horas a 100 volts. O dialisado foi extraído duas vezes
com fenol, uma vez com fenol-clorofórmio e uma vez com
clorofórmio e o DNA enxertado foi precipitado com etanol e
10 acetato de sódio. O DNA enxertado foi marcado com 10 uCI
de
32
P-alfa dCTP (3.000 uCi/mMol, New Enyland Nuclear)
par tradução de entalhe, Rigby, et al.,
113:237 (1977), usando-se DNase I e DNA polimerase (BRL).
O DNA marcado ofi separado da
32
P-dCTP por passagem sobre
15 uma coluna Sephadex B-50 de 18 cm x 0,4 cm (Pharmacia). O
DNA de esporozoítos e merozoítos de
n_acermulina
foi pu-
rificado conforme descrito por Dame e McCutchan, OpleGa
RIOCIRMA_BACA5111:11^, 8:263 (1983), exceto que se usaram 2
ug/ml de brometo de etídio de CsTFA em vez de CsCI na
20 etapa de centrifugação. O DNA purificado (2 ug) foi digerido com 30 unidades de enzima de restrição EcoRI, EcoRV,
HindIII ou Dral (BRL), submetido à eletroforese em agarose
(FMC)
e transferido para uma membrana Biodyne (Pall)
usando-se procedimentos de "Southern blotting".
25
Southern.
28:503
(1975).
Veja,
Após
a
transferência, o papel Biodyne com manchas de DNA foi
cozido in_gagug a 80°C durante 2 horas, pré-hibridizado
com NaCI 0,5 M, Citrato de Na 0,05 M, pH 7,0 (6x SSC),
em
e
em
..
..
....
..
GO
• .. • • •
.. gle Ge•
Ge
.. . .
O
Ge
Ge
CG
•• • •
• • e ..
• • • e 41 . .
• • • e • •
O 0
dle
.. •
GG .. Ge
•
- 36 -
pirofosfato de tetrassódio e 0,2%, dodecilsulfato de sódio
a 0,2X (SDS) e 50 ug/ml de heparina (Sigma) durante 6 horas a 65°c e hibridizado com 10
32 P,
6
cpm de sonda marcada com
durante 16-20 horas a 65°C. As manchas foram lavadas
5 três vezes com 0,1X SSC, SDS a 0,1%, a 65°C e durante 30
minutos por lavagem, e uma vez com 0,05X SSC, SDS a 0,1Z,
durante mais 30 minutos a 65°C. As manchas foram secadas
ao ar e superpostas com um filme fotográfico (Kodak XAR)
para se visualizarem os padrões de hibridização.
10
Os lisogânicos foram
induzidos com IPTG 2 mM,
conforme descrito por Young e Davis,
egooilc__Eogloggclog,
7 (J. Setlow e A. Hollander, eds. 1985), foram colhidos
por centrifugação (2.500 g) e lisados por congelamentodescongelamento
e
sonicação durante 20 segundos em
15 Tris--HCI 0,01 M, pH 7,4, MgCl_ 0,005 M e
0,5 ug/ml, leupeptina, TLCK
sonicação, os homogenados de
2
quimiostatina
a
0,005 M, TPCK. Após
Ea.soll
contendo a proteína
de fusão foram tratados com 10 ug/ml de RHase e DNase para
destruir os ácidos nucléicos e foram centrifugados a 7.500
20 g durante 15 minutas para peletizar células não rompidas e
material em grandes partículas. As concentrações de
proteínas foram determinadas usando-se a técnica FICA
(Pierce Chemical Co.). As proteínas de fusão betagalactosidase foram purificadas por cromatografia
de
25 imunofinidade em uma coluna de anti-beta-galactosidase,
segundo as técnicas descritas pelo fabricante (Promega
Biotech).
Alíquotas de homogenados de
contendo a
e••• •e
• • • • • • • $• e ••••of
• os •• • • • • • ••• • • •• • • ••
•• • • •• •• •• e• • • • • • e• •1.
• SW% •• •• ele • • •• • •
- 37 -
proteína de fusão foram diluídas em 2X tampão de amostra
(glicerol
a 20%, 2-mercaptetanol a 10%, SDS a 4,6%, Tris
M,
0,125
6,8)
pH
e
corridas
em
um
gel
de
SDS-piliacrilamida a 4% de empilhamento/7,5% de resolução,
5 conforme descrito por Laemmeli.
Natigirst, 22Z:680 (1976).
As proteínas separadas em SDS PAGE foram transferidas para
papel de nitrocelulose (Schleicher
descrito por Towbin, et al.,
26(9):4350 (1980).
e
Schuell), conforme
Eciu.A111._Acad"Sal.ABA,
Apiís "Western blotting",
10 nitrocelulose foi tratado com NaHP0
2
o papel
de
0,01 8, pH 7,3, Natal
0,01 M (PDS) contendo Tween 20 a 0,05% e leite em pé sem
gordura 'a 5% (NFDM). Soros imunes (diluição de 1e0 -2) e
anticorpos monoclonais reativos com beta-galactosidase
(diluição de 2 10
-4
) foram diluídos em PBS-Tween 20•NFDM
15 e usados para sondar manchas Western, conforme descrito
por Jenkips e Dame,
(1987).
Ulec.__Ripabiem.—Egità51t121,,
25:155
Anticorpos policlonais específicos para as
proteínas de fusão beta-galactosidase foram purificados de
soros de coelhos imunes criados para extratos de membranas
20 de esporozoitus e merozoitos de
usando-se
EA—aCerku110a,
os procedimentos descritos. Dzaki, et al.,
Ja_IMffilagla
Betheds, ià2:213 (1986). Esporozoitos (10 8 ) e merozoítos
(10
8
- '10
10
)
superfície com
25 por
de
Ea____8CerYW11118
foram marcados na
125 1, usando-se o método Iodoggnio.
exemplo, Markwell,
alfachem a ,
11(221:4807
Veja,
(1980).
Extratos protéicos de células inteiras foram preparados,
separados
por
SOS-PAGE,
passados
nitrocelulose e sondados com soros
para
papel
de
imunes, usando-se
••
. . •• •••• •• . . ..
• • •• a li •• • • • •• •• •• •
•
• • • •• ••
• • •• •• •• •• •••• ••
•••• ••
.. •• • • •• •
••••
- 38 -
métodos similares aos acima descritos.
As técnicas precedentes revelaram que o enxerto
de cDNA clamado em cS2-1 tinha 1.580 pb de comprimento e
continha um sítio EcoRI interno que divide a seqUencia em
5 um fragmento de 960 pb (superior) e um fragmento de 620 pb
(inferior). Cada um dos dois fragmentos foi subclonado em
pUC-8 e lambda gt11. As respectivas proteínas de fusão
beta-galactasidase em lambda gt11 (superior e inferior)
foram expressadas e imunctriadas com soro de coelho anti10
esporozoíto
de
Proteínas
de
fusão
idânticas furam obtidas com cSZ-1U e, portanto, a proteína
imunorreativa do parasita foi associada ao fragmento
grande de 960 pb. Clames do fragmento menor de 620 pb não
eram imunorreativos. A seqUância de 960 pb do subclone
15 pcS2•1 em pUC-8 foi clivada do vetor por digestão com
EcoRI, separada por eletroforese em agarose, eletroeluída
e marcada com
32
P-dCTP por tradução
de entalhe para uso
como sonda.
A onda cS2-1U hibridizou a uma ou duas grandes
20 bandas em manchas Southern de DNA de n_..aCerYidlied digerido com EcoRI, EcoRV, Hindili ou DraI. Embora apenas os
dados do UNA de esporozoíto e merozoíto digerido com EcoRI
sejam apresentados, a hibridização foi para as mesmas bandas no DNA dos dois estágios do parasita para cada enzima
25 de restrição. Observou-se uma única banda de hibridização
tanto para DNA de EA__aceeMlaina digerido com HindIII,
quanto com DraI, ao passo que duas bandas de intensidades
similares foram vistas para DNA genâmico digerido com
••••
••
••• •• ■ • v•
.•
• 1,1
II
• • •
• •
P•
PC
ore
•
•
••
••
••
•
••
•••
•• I •
•
••
••
•
•
••
••
• ••
•
1, •
•
•
••1• SI
••• •IS
•
••
••
- 39 -
EcoRi e EcoRV. Exceto pelas duas bandas encontradas no
DNA gengmico digerido com EcoRI, esses achados podem ser
explicados pelos dados de mapeamento de restrição. O
enxerto . de DNA em pcSZ-1U contém um único sitio EcoRV e
5 nenhum sitio Oral ou HindIII.
pcSZ-1U
Não está claro porque o
hibridiza com dois fragmentos EcoRI de DNA
gengmico, pois não há nenhum sítio EcoRI presente no
enxerto de DNA.
ú possível que o
gene exista em mais de
uma cópia dentro do genoma ou que a seqüSncia gengmica que
10 dá origem ao mRNA do qual o cDNA de 960 pb foi preparado
seja interrompido por um íntron que contenha sítios EcoRI
e EcoRV.
Lisog .ânios de
Es cull
-
Y1089 contendo o enxerto
cSZ-1 foram tratados com IPTS para induzir a produção da
15 proteína de fusão beta-galactosidase de cSZ-1.
Homogenados contendo a proteína de fusão foram preparados,
separados por SDS-PASE, passados para papel de
nitrocelulose e sondados com McAb de camundongo especifico
para beta-galactosidase e com soros de coelhos criados
20 para extratos de membranas esporozoítos. A proteína de
fusão cSZ-1 parece ter 130 kDa de tamanho. D tamanho das
proteínas
de
fusão produzidas por esse clone indica que
apenas cerca de 30Y do enxerto de 960 pb total
a proteína de parasita.
codifiquem
Similar a outras proteínas de
25 fusão beta-galactosidase, Schoner, et al.,
Blutechoulun,
3:151-154 (1985), a cSZ-1 forma agregados insolúbeis.
Cerca de 50X do antígeno p130 reativo estavam presentes na
pelota após sonicação e centrifugação a 7.500 g. Manchas
•••• ••
..
• • •
• •
•
•
••
••
•
• ••
•
• •
•
•••• ••
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•
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•
•
••
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••
•
•
• •
• •
•
•
•
• •
• •
•
•
..
..
••
- 40 -.
do lisada de proteína de fusão cS2•1 também foram sondadas
com saras de galinhas imunes a E a _ecerstuljna como resultado de uma infecção prévia com esse protozoário. Não
pareceu haver nenhum reconhecimento detectável da proteína
5 de fusgó cSZ--1 pelas soros de galinhas imunes.
Anticorpos reativos com a proteína de fusão
cSZ-1 foram absorvidos e purificados de soros de coelhos
anti-membrana de esporozoítos e usadas para sondar manchas
Western de proteínas de esporozoítos de
10 marcadas com
125
E.___aceemulina
I. Duas bandas de proteínas, uma a Mr
240, a outra a Mr 160, foram reconhecidas como antígenos
homólogos para a proteína de fusão c.92-1. Embora a
marcação com 125 1 detectável seja evidente, nem o antígeno
p240, nem o p160 parece ser a principal proteína da
15 superfície do esporozoito. A imunomarcação de proteínas
de esporozoítos marcadas com 125
1
com soros de camundongos
imunizados com cSZ-1 purificado confirmou que a proteína
de fusão é homóloga a uma região dos antígenos Mr 240 e Mr
160.
20
Exemplo
12
Caracterização
do Antígeno cMZ-8
O clone cMZ-87 foi caracterizado usando-se as
mesmos procedimentos descritos no Exemplo 11 acima.
clone cMZ-8 contém um enxerto de 800 ph de tamanho, que
25 foi liberado pela digestão com EcoRI, purificado de géis
de agarose por eletroeluiçáo e subclonado em plasmídio
pUC8, dando origem ao clone pcMZ-8. O enxerto de DNA do
pcMZ-8 purificado com gel marcada por tradução de entalhe
••••
•• • • • • • •
• • • • • • •
••••
•
CG
Ge
GO
GO • •
eia MOO DG
GO@
• Guelle
Ge
GO
GO
•
•
•ls
Ge
GIG
GO
CG
• - 41 -
e
usadoPara
sondar
manchas Southern de DNA de
espo•ozoítos e merozoítos de Es_aceEMUlina digerido com
enzima de restrição. Um único fragmento de DNA genêmico
de Ea____aCerYulitià (esporozoíto ou merozoíto) se ligou à
5 sonda para cada combinação de enzima de restrição (EcoRI,
EcoRV, HindII1,
DraI),
sugerindo que apenas uma única
cópia da 'seqüência pode estar presente no gerioma.
Similar
aos resultados de hibridização de pcS2-1, não houve
diferença significativa nos padrães de banda entre e DNA
10
de esporozoíto e de merozoíto para cada
produto digerido
por restrição.
As proteínas de fusão de cP17.-8 foram preparadas
como lisadas do respectivo lisoganio de E._coll Y1089, separadas por SDS-PAGE e passadas para
15
n i troce l ul ose , como acima.
As manchas
papel de
foram sondadas com
McAb anti-beta-galactosidase e com soros de
coelhos
criados para extratos de membranas de merozoítos de
acenwlina.
E.
A proteína de fusão cMZ-8 parece ter 145=150
kDa de tamanho.
Estima-se que a parte codificada para o
20 parasita dessa proteína
de fusão beta-galactosidase de 150
kDa tenha cerca de 35 kDa, que é similar ao tamanho estimado com base no comprimento do enxerto de cDNA (800 pb).
Similar á proteína de fusão cSZ-1, pelo menos 507 da
proteína cM2-8 estão presentes como agregados insolúveis.
25 Anticorpos para a proteína cM2-8 foram purificados
anti-soros
de
de coelhos específicos para membranas de
merozoítos e usados para sondar manchas Western
proteínas de merozoíto marcadas com
125
II
• • • •
• • •••• • •
•••
••
GO
de
1. A respectiva
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• • • • • • •
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•
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• es.
•
Ve
• •
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•6
••
- 42 -
proteína da parasita parece ter 230-250 kDa, com um número
considerável de produtos de decomposição e/ou antígenos de
reação cruzada entre Mr 75-230 kDa. O antígeno p230-250 é
uma proteína de superfície, conforme indicado por marcação
5 com
125
1.
Esses resultados foram confirmados por sondagem
de manchas Western de proteínas de merozoitos marcadas com
125 1
com soros de camundongos que haviam sido imunizados
com proteína cMZ-8 beta-galactosidase purificada em
coluna.
10 Exemplo . 13
Imunização de Galinhas com cSZ-1 e cMZ-8
Grupos separados de galinhas Sexsal de uma semana de idade foram imunizados por via intramuscular com
'doses Variáveis de antígenos recombinantes cSZ-1 ou cM2-8
15 ou controles apropriados, reforçados com uma dose idgmtica
uma semana mais tarde e expostos, na semana seguinte, a
10 3
oacistos esporulados de
Eimeria_aceemulina.
Após 5
dias, as galinhas foram sacrificadas e examinadas quanto a
sinais da doença (por exemplo,
avaliação das leeges
20 intestinais). Embora não se encontrasse nenhuma diferença
quanto aos ganhos de peso corporal, houve uma redução significativa (P 0,05) nas avaliações de leses de aves
imunizadas com cSZ-1 e cMZ-8 em comparação com as observadas em grupos de controle.
25 Exemplo
14
Imunização
de
Galinhas
com
cSZ-1 e cMZ-8 e com
Lipopolissacarídio Reduzido
No ensaio de vacinação precedente, notou-se que
lis
.. •••• .. ..• •• • • •• •
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• • • ••
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•
..
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•••• ••
••••
- 43 -
a administração dos antígenos de espororoitos (cSZ--1) e de
merozoíto (01Z-8) recombinantes e de extratos de E._021.1
de controle lambda gt11 tinha um efeito depressor sobre os
ganhos .de peso, em comparação com controles não
5 imunizados. Para se determinar se a endotoxina (isto é,
lipopolissacarídio, LPS) era responsável por esse efeito,
removeu-se uma quantidade substancial (> 50Z) da LPS por
tratamento dos extratos de antígenos com Polimixina B
agarose. Novamente, grupos separados de galinhas Sexsal
10 de uma semana de idade foram imunizadas com doses
variáveis de antígenos recombinantes cSZ-1 ou cMZ-8 contendo LPS ou depletados de LPS ou controles apropriados.
As galinhas foram reforçadas com doses id@nticas duas
vezes depois, uma e duas semanas após a imunização ini15 cial, e expostas, nas semanas seguintes, a 10
Elmecia_aceemulina.
3
oocistos de
Após 5 dias, as galinhas foram sacri-
ficadas e examinadas quanto a sinais da doença. Embora a
remoção do LPS não melhorasse os ganhos de peso antes da
exposição aos oocistos, não houve diferença significativa
20 nos ganhos de peso corporal entre grupos de galinhas que
foram imunizadas com os antígenos recombinantes ou aquelas
que receberam o controle lambda gt11. Entretanto, as
avaliações de lestes nas galinhas que foram imunizadas com
qualquer antígeno recombinante do qual o LPS tenha sido
25 removido. •foram significativamente menores do que as
avaliações de lesões dos controles lambda gt11 ou de
preparações de antígenos recombinantes contendo LPS.
Exemplo 15
• •• ••• • •• • • •• • • •• • •• • •• • •• • • •• • • •• •
•• • • •• • •• •V
• •
•
•••• •• • • •• ••
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•• • • •• • • •• •
•
•• • • •• • • ••
- 44 -
Identificação de Fagos Recombinantes por Triagem de EA
cai! com Anticorpos Monoclonais Específicos para o Estágio
de Esporozoítos de Es_ACernillia
Para se obterem anticorpos monoclonais (McAb)
5 reativos com qualquer estágio do parasita, camundongos
BALB/C foram imunizados por via intravenosa com
10 6
esporozoítos ou merozoítos de Ea_aCeeMiglioa e reforçados
com uma dose idêntica 2 semanas mais tarde. Células
esplênicas de camundongos imunizados foram obtidas 3 dias
10 após a última imunização e fundidas com células de mieloma
P3X
na
presença
de
polietileno glicol,
procedimentos descritos. Veja Zola e Brooks,
usando-se
"Techniques
for the Production and Characterization of Monoclonal
Hybridoma antibodies:, em
15
and_Aaplications.
Umbeidgma_antibodieslAechnismes
1 - 57 (Hurrell, J. G. R., ed. 1978). Re-
sumidamente, os hidridomas foram cultivados em meios
essencial mínimo
de Dulbecco (DMEM) contendo soro bovino
fetal, hipoxanUna, aminopterina e timidina em placas de
microtitulação do fundo liso (Costar) e armazenados a
20 37°C, em um incubador com CO a 5%. Os sobrenadantes de
poços
contendo colónias
de
hibridomas em proliferação
foram ensaiados quanto a anticorpos reativos com
esporozoítos e merozoítos secos de
imunofluorescência
25 estabelecidos.
621111:2145 - 2151
(IFA),
E.__aceemullna
usando-se
por
procedimentos
Danforth e Augustine,
(1983).
Culturas
positivas
foram
subclonadas por limitação da diluição e foram testadas
quanto à produção de uma única classe de
Ig por ensaio
••
••
G.•
• e•
••
••••
G
• •
• •
•
• •
•
• •
• •h
••
Ge
••
d
e• • •
Ga
•
••••••
155•••15
• •
•
•
• •
•
•
• •
e.
• •
• e
Ne
••
•
• e
Ge.
••
•
- 45 -
Wakefield, et al.,
imunoabsorvente ligado à enzima.
Clinica_Chemica_Acia, 123:303 320 (1982).
-
A fusão de células esplénicas de camundongos
hiperimunes a esporozoitos de
E...acecuulina
com células de
5 mieloma resultou na produção de um hibridoma que secretava
IgG
.
2a
Embora nenhuma coloração superficial fosse obser-
vada, o McAb, designado por S
1i
P I A l2 , parece reconhecer
proteína de superfície de 22 kDa marcada com
forme
revelado
por
imunomarcação.
125
1,
a
con-
Experimentos
10 subseqüentes mostraram que esse antígeno de 22 kDa, chamado de p22, está presente na superfície do parasita,
assim como na membrana do corpo refrátil (RB). Embora o
/I
P A
/ 12
não seja especifico para uma espécie, pois tem
reação cruzada com esporozoitos de
é
15 específico para ri estágio de desenvolvimento, pais não
•
observado
nenhum reconhecimento de merozoitos de
foi
E.
aceemulina.
Pagos recombinantes preparados conforme descrito
no Exemplo 4 acima foram Criados com esses anticorpos
20 monoclonais usando-se o procedimento descrito no Exemplo
5(8) acima.
foi
Identificou-se um bacteriófagu positivo,
designado par MAI. Esse bacteri6fago foi subclonado
conforme descrito no Exemplo 6 acima e transferido para
coll
que
E.
Y1089 e uma proteína de fusão foi produzida com ele,
25 conforme descrito no Exemplo 6 acima. A proteína de fusão
foi, então, purificada
conforme
descrito
no Exemplo 8
acima e triada com células T de galinhas infectadas com
acermulina,
E.
conforme descrito no Exemplo 9 acima. A
•••• ..
••
• • • ..• •
•
..
••
• • • •
• • • •
•••• ••
••
•
•
•
•
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•
•
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..• •
..
..
• • • • • •
• ..• • • •
••
••
..
• •
..
..•
- 46 -
resposta a dois níveis de dose diferentes de MA1 foi 4-5
vezes maior (P C 0,05) que a ativação induzida por
quantidades similares de proteína derivada de fraçães
idênticas isoladas de homogenado lambda gt11.
5
Exemplo 16
Caracterização do Antígeno MA1
.
A
de
proteína
fusãa
expressada de MAS foi sondada por
sobrenadarite de
A
5 1112I 12
beta-galactosidase
imunomarcação com
e parece ter cerca de 125 kDa.
10 Essa estimativa Mr foi corroborada pela
imunomarcação de
MA1 com McAb para beta-galactosidase.
clorie MA1 foi subclonado em pUC-8 e usado para
transformar
acima,
JM83, conforme descrito no Exemplo 10
para facilitar a determinação de sua organização
15 molecular e seqUgncia de DNA.
A digestão de pMA1 com EcoRI e a subseqüente
eletroforese em agarose dos produtos revelou um enxerto de
DNA de cerca de 200 pb
de comprimento. A organização mo-
lecular e a expressão dos genes que codificam o antígeno
20 p22 foram examinadas por hibridização de enxerto de DNA de
MA1 marcado com
32 P e manchas Southern de DNA de
esporozoítos de E.__ACREMülirià digerido com enzima de
restrição e manchas Northern de RNA tanto dos estágios
esporozoíto, quanto merozoíto. O gene p22 parece existir
25 tomo uma seqügncia de cópia única ou de baixo número de
cópias, pois foi observada apenas uma única banda de
hibridização com DNA de esporozoíto cortado com EcoRI (31
kpb), DraI (2,4 kpb) ou HindIII (12 kpb). Consistente com
O 0
8,
é • in
•
• 111
• ig O
OCO CO
• •
.
Gel
..
.. 00
•
• • O
•
• •
•
•
•
De
•
• 1"
•
•
•••
• • 4,
De CO
- 47 -
os dados
imunológicos, há a expressão exclusiva
do
antígeno p22 em enxerto de DNA marcado de esporozoítos,
hibridizado apenas a RNA de esporozoítos, e não a RNA de
Observou-se uma grande banda de hibridizacáo
merozoítos.
5 a 500 pb', que está na faixa do tamanho previsto para o
mRNA
(aproximadamente 600 pb), com base no tamanho da
proteína p22.
Exemplo 17
SeqUenciámento do DNA de NA1
10
A seqüência de DNA do enxerto de cDNA de MA1 foi
determinada usando-se a técnica de terminação de cadeia
com didersóxi. Sanger, et ai.,
EnucA_Nat._AcadA_Sci.J.WA,
74:5463 (1977). Obteve-se o enxerto de cDNA purificado de
acordo com o Exemplo 10 acima, que foi ligado a DNA de
15 M13mp18 digerido com EcoRI (BRL) e usado para transfectar
células JM101.
(1983).
Veja Messing, J.,
ffiethudE_EnzymolA, 141:20
Clones M13 recombinantes (colónias em área branca
em caldo Luria contendo X-gal e IPTS) foram colhidos e
usados para gerar DNA vira] de fita única.
20 Sueca.
As reaçães de seqüenciamerito foram efetuadas con-
forme descrito por Williams, et al.,
4g22:138 (1986),
de
35
Veja Messing,
5-dATP
(NEN
Riranabnisues,
com pequenas alterações, usando•se 30 uCi
500 Ci/mMol) e analisando-se em um gel de
seqUenciamenteo de poliacrilamida a 67.. A seqüência com25 pleta do DNA virai recombinante M13 e seu complemento representando as duas fitas do cONa foram determinados e
analisados usando-se o programa de seqUenciamento de DNA
Intellegenetics. Veja • genericamente Friedman, T.,
u4
e*
Ga
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•
• ge *g • e go
•
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• • • 9,
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▪ Co ei • Gil
•
•• •• • •
••
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- 48 -
Intellesanctimul_a__Shoct__Cameãe__In__Nolecular_Alalon
spftwace
(1985)
(Intellegenetics,
Inc.,
Mountairi View,
CA). A seqüência do cDNA do clone MA1, conforme determinada por esses procedimentos, é mostrada na tabela 1
5 abaixo.
Tabela 1
SeqUãncia de DNA e Sequência de Aminoácidos Prevista do
cDNA de Clone MA1
45
GTA GTC GTC GTC GTC GTC GTG GGA AGT TCG ATG CAC GTC GTG GAA
VAIA VAL VAL VAL VAL VAL VAL GLY SER SER MET HIS VAL VAL GLU
90
GTT CGG TGC TTC GGA GTC CGA AGA AGA CCA TCT ACA GAA TCA CGA
VAL ARG SER PHE GLY VAL ARG ARG ARG PRO SER THR GLO SER ARG
135
AGA AGT TCT CCT CTG ACT GTG TCT CCC TGC CTC TAT TCT GTT TTC
ARG SER SER PRO LEU THR LEU SER PRO CYS LEU TYR SER VAI, PHE
180
CTC TGT CTA CTC CCC CCT GTC TCT GTA AGT TTC TGC CTT AAA AGG C
LEU CYC LEU LEU PRO PRO VAL SER VAL SER PHE CYS LEU LYS ARG
- 49 -
••
•• •••• Ga
Noa
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•
• •
• •
e •
•
e•
• •
•
•
ar
•• • •
• •• ••
CM las
GO
@e
G•
•
Ge
seqüenciamento do enxerto pMA1 revelou uma grande
armação de leitura aberta em uma das duas orientaçVes de
seqUância possíveis. As outras quatro armaçVes de leitura
não são consideradas, pois a clonagem no sítio EcoRI do
5 gene lacZ do DNA lambda não destrói a armação de leitura,
mas se destina a codificar uma proteína de fusão betagalactosidase viável. Inesperadamente, descobriu-se que
não havia nenhum códon de panda ou de resíduo poli A
longo presente na seqüência, sugerindo que clonam-se uma
10 região interna do gene que codifica a proteína Mr22. Consistente com os resultados de hibridizaçáo e estudos de
mapeamento prévios, não ocorre nenhum sitio EcoRI, Drai ou
HindIII flentro da seqüência.
Exemplo 18
15 SeqUenciamento de DNA de cMZ-8
A parte 5' do DNA e a parte 3' da seqüência do
enxerto de cDNA cMZ-8 foram determinadas usando-se os
procedimentos descritos no Exemplo 17 acima. Essa
seqüência é mostrada ria tabela 2 abaixo.
•
•••
•• ••
•
• •••
•••
•• • •
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•• • •
• •
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O
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C/3
vista do cDNAdo Clone cMZ- 8
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üênc ia de DNA Parc ia l
o
Tabe la 2
013
1
OPM RUO RUM
Hg UM
NUR gUR
NOM gPR
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OMM LOR
Hg NOM
NUM IMM
1, NOM
64 gUR
OMM gUR
gUR OPM
gUR 8U5
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NUR ORM
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gUR gPIR
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MUM NOM :i g lig NO
8Ug ORM OMM MO NU MU 88
POR OMM lin gU Ug MU UN
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Ge, DD@
• • • • • •
OU
- 51 -
Acredita-se que a fita superior mostrada seja a
fita de codificação e se mostram os aminoácidos previstos
para a fita superior 5'.
e
possível que a seqiiância codi-
fique inversamente ao que é mostrado, caso em que a fita
5 superior ou
ser
inferior poderia
a
seqii@ncia
de
codificação. Entretanto, a grande armação de leitura representada pela fita superior mostrada na tabela 2 sugere
que essa é a fita de codificação mostrada na orientação
apropriada.
10
Exemplo . 19
Caracterização e SeqUenciamento de DNA do cDNA de Clone
MC17
O
cDNA
de clone MC17 foi
identificado e
seqUenciado através do uso de essencialmente os mesmos
15 procedimentos acima descritos.
A
MC17
galactosidase de
é
uma
130 kDa,
proteína
que
foi
de fusão betaidentificada
por
imunotriagem de uma biblioteca de cDNA de esporozoíto de
Eimecia_acermwlioa
20 por S is
com um anticorpo monoclonal designado
ly i . MC17 representa uma parte de uma proteína de
superfície de rnerozoíto de
Ea_aceemulioa
de 58 kDa, con-
forme determinado por imunomarcação de extratos
merozoítos marcados com
S
125
1 com S P A
16 3
de
Esse McAb,
P A , foi preparado usando-se os mesmos procedimentos
I6 3 I -
25 descritos no Exemplo 15 acima. È. da subclasse da IgG e
reconhece apenas merozoítos de
esporozoítos.
Ea_aceemulina
e
não
A sondagem de manchas Northern de RNA de
esporozoítos e merozoítos de
E.,....ãCergUlina
com enxerto de
- 52 -
•••• •• •• • • ••• ••••G ••• • • •Ii • • 1, 5 •
• • • O •• II• •• e • • •• •• ••
•• • • I I •Il is h
•• te
• • • • e •• • •• • • •• • • •• •
enit ••
••
Ge
cDNA de MC17 marcado com 32 P mostrou hibridização apenas
com
ícido
nucléico
desenvolvimento.
derivado do último estágio de
A hibridização dessa sonda a manchas
Southern de DNA de esporozoítos e merozoítos de
5
aceemulina
EA
digerido com enzima de restrição sugere que o
cDNA de MC17 pode estar interrompido por um íntron na
segirencia geniimica. Essa conclusão se baseia na
observação de que mais de uma banda de hibridicação foi
observada com DNA digerido por DraI (14,0 kpb e 2,0 kpb) e
10 EcoRI (23 kpb e 7,6 kpb) e de que nenhum sítio de enzima
de restrição está presente na segiAncia de cDNA. em contraste, a sondagem de DNA de
Es__acgryulina
SamilI produziu
apenas uma banda de hibridização (21 kpb), que pode
refletir a ausgncia desse sitio de restrição no íntron
' 15 proposto.
A seqUgncia de DNA de MC17 é mostrada na tabela
3 abaixo.
'
- 53 -
•• .. ..
••••
•• .. .. ••••
• • • • • • •
• • • • • • • •
• • •• • • .. •• •• • • •••• •..• ••••
• • • • • •
• • • • • •
••
..
••
•••• • .. .. .. •
Tabela 3
Seqüência de DNA e Seqüência de Aminoácidos Prevista do
cDNA do Clone MC17
45
GTA CGT CGT AGC GGC GCC CCG GCG GGG GTC GTC GCG TCG TCG GCA
RIS ALA ALA SER PRO ARG GLY ARG PRO GLN GLN ARG SER SER ARG
90
GTG CCC CGA CTC CCA GGT CTG TGA TGA CCT CCC CTT CGA CGA CGA
HIS GLY ALA GLU GLY PRO ASP THR THR GLY GLY GLU ALA ALA ALA
135
GTT CAA C:T CCT CCT GCT GCA GGC CTT CTA CAC CTA GGC ACC CCC
GLN VAL PRO PRO PRO ALA ALA GLY LEU LEU HIS LEU GLY THR PRO
1FD
TGT TGG TGC TTA CGT TTG CGG TTG ACG ACA ACA ACC CCC GAA ACJ
THR THR THR ASN ALA ASN ALA ASN CYS CYS CYS TRP GLY LEU CYS
-225
AAC CTG ACG GAA GTT TGT GTT AAC TTT ATA CAC GAA CAC GTT TTT
LEU ASP CYS LEU GLN THR GLN LEU LYS TYR VAL LEU VAL GLN
238
TTT TTT TTT TTT C
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8
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•
• 08 O*
em
• G,
• IN
•
..
•
•
5085 08
CID
Ow
08
- 54 -
A seqüência de
DNA do enxerto MC17 revelou um
resíduo poli A longo, sugerindo que clona-se a extremidade
3' do cUNA. Essa seqüência também parece ser composta por
várias hélices alfa antipáticas,
que
foram associadas a
5 sítios de xeconhecimento de linfácitos T. Consistente com
esse achado, há a significativa ativação
in_Mlied de
EA____aceemulina
linfácitos T obtidos de galinhas imunes à
pela proteína de fusão beta•galactosidase codificada pelo
cMZ-8.
10 Exemplo 20
Caracterização do cDNA de Clone MA16
A MA16 é
galactosidase
uma
de 140 küa,
proteína
que
foi
de
fusão
beta-
identificada par
imunotriagem de uma biblioteca de cDNA de merozoítos de
15
acetmulina
E.
com um anticorpo monoclonal da subclasse IgM,
designado por 12-07. Esse anticorpo monoclonal foi preparado usando-se essencialmente os mesmos
critos
procedimentos des-
no Exemplo 15 acima. A MA16 representa uma parte
de uma proteína de superfície de merozoíto de E...aQeCYUlii2i
20 p58/p70, conforme revelado pela imunomarcação de extratos
de merozoítos marcados com
125
1 com 12-07. Esse McAb
apresenta reação cruzada com antígenos de superfície de
esporozoítos de EA__BaeCY1.11112a que são similares, em
tamanho, aos constituintes do merozoíto, conforme revelado
25 pela imunomarcação de esporozoítos marcadas.
A
localização na superfície do antígeno p58/p70 foi corroborada por coloração de imunofluoresc?ncia de esporozoítos e
merozoítos
de EA--ACMCYLULOM com McAb 12-07. A relação da
•••• •4
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••••••
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..
•
••
- 55 -
p58 e p70 entre si é desconhecida.
Exemplo 21
Triagem de Proteínas de fusão com Soros Imunes de Galinhas
Infectadas com Ea_acemilina
5
Uma
a]íquota de cada preparação
fusão (c112-8, cSZ-1, MA1, MC17, MA16)
base
peso,
no
por
eletroforese
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE)
nitrocelulose.
foi
de proteína
de
separada,
com
gel
de
em
e passada para papel
de
As manchas Western furam sondadas com
10 anticorpos monoclonais específicos para a proteína de
fusão
para beta-galactosidase ou com soros imunes de
ou
galinhas infectadas com
Ea__AcerYlailla•
A ligação do
primeiro Ab foi detectada com anti-Ig biotinilada, seguido
por avidina-peroxidase e revelada com 0,5 mg/ml de
15
4-cloro-l-naftal, H 2 0 2 a 0,01%.
Dessas cinco proteínas de fusão, apenas a cMZ-8
foi reconhecida por soros imunes colhidos em galinhas infectadas . por E...--8G2cY141108.
Os exemplos precedentes foram apresentados para
20 ilustrar a
presente invenção. Não devem
ser tomados
como
limitativos, o "âmbito da
invenção sendo definido pelas
reivindicações a seguir.
Equivalentes das reivindicações
devem ser aqui incluídos.
REIVINDICAOES
1
-
Seqüência
de
DNA compreendendo
clonado ou seu fragmento que codifica uma
um gene
proteína
que ativa células brancas sanguíneas que
antigenica
5 efetuam uma resposta imune mediada por células, essas
células brancas sangüíneas sendo sensibilizadas por uma
Eimecia.
proteína antiggnica de
2 - Seqüência de DNA, de
reivindicação
1,
em
acordo
com
a
que as ditas células brancas
10 sangüíneas sSo células T e em que a dita proteína
antiggnica estimula o crescimento das ditas células T.
3 SeqUgncia de DNA, de acordo com a
reivindicação 1, em que a dita proteína antiggnica se liga
a um anticorpo dirigido contra um antígeno de superfície
15 celular de um esporozoito de
• 4
Elmecia.
Seqüência
de DNA, de acordo com a
reivindicação 1, em que a dita proteína antigânica se liga
a um anticorpo dirigido contra um antígeno de superfície
celular de um merozoíto de Eimecia.
20
5
SeqUgncia
de DNA, de acordo com a
reivindScação 1, em çue a dita proteína antigânica não é
reconhetida par soros imunes colhidos de aves infectadas
com a dita espécie de
6
-
Limada.
Seqüência de DNA, de
acordo
com
a
- 2
reivindicação 1, em que a dita espécie de
Elmetia é
Elmetia_acemilina.
7 -
DNA
Seqüência de
compreendendo um gene
clonado ou seu fragmento que codifica uma
proteína
5 antigênica que estimula o crescimento de células T de
aves, essas células T sendo sensibilizadas a uma proteína
da superfície celular de um esperozoíto ou merozoíto de
Eimaria_acerwulina,
sendo
DNA
a dita seqüência de
selecionada na classe que consiste de:
(a) clone cDNA cMZ-8:
10
(b) seqüências de
DNA que hibridizam a uma sonda
oligonoctileotídica homóloga a um segmento de cMZ-8, a dita
sonda oligonucleotídica compreendendo pelo menos 16
nucleotídios, e
DNA
(c) seqüências de
15
que
codificam,
na
expressão, um polipeptidio codificado na expressão por
qualquer uma das seqüências de DNA precedentes.
8 clonado
Seqüência
de
DNA
compreendendo
um
gene
ou seu fragmento que codifica uma proteína
20 antigênica que estimula o crescimento de células T de
aves, essas células T sendo sensibilizadas para uma
proteína da superfície circular de um esporozoíto ou
merozoito de
Eimerik_acemillna,
a dita seqüência de DNA
sendo selecionada na classe que consiste
25
de:
(a) clone cDNA MAl;
(b) seqüências de DNA
que hibridizam a
oligonuleotídica homóloga a um segmento de
MA1,
uma sonda
a dita
sonda oligonucleotídica compreendendo pelo menos 16
- 3 -
nucleoticlios; e
(c) seqüência de
DNA que na expressão, codifica
um polipeptídio codificado na expressão por qualquer uma
das seqüências de
5
DNA precedentes.
DNA
.9 - Seqüência de
compreendendo um gene
clonado ou seu fragmento que codifica uma
proteína
antigênica que estimula o crescimento de células T de
aves, essas células T sendo sensibilizadas para uma
proteína de superfície celular de um esporozoíto ou
10 merozoíto de
Eimeria_acecMbi1ica,
seqüência de
a dita
DNA
sendo selecionada na classe que consiste de:(a) clone cONA
MC17;
(h) seqüências de DNA que hibridizam a uma sonda
oligonuleotídica homóloga a um segmento de MC17, a dita
15 sonda oligonucleotídica compreendendo pelo
menos
16
nucletídios, e
. (c)
seqüências
de
DNA
que codificam,
na
expressão, um polipeptídio codificado na expressão por
qualquer uma das seqüências de
20
DNA precedentes.
10 - Vetor de expressão de
DNA recombinante,
compreendendo um vetor de expressão com um promotor e uma
seqüência de DNA
inserida no dito vetor a jusante do dito
promotor e operativamente associado a ele,
seqüência de
em que
a dita
DNA compreende um gene clonado ou seu frag -
25 mento que codifica uma proteína antigênica que ativa as
células
brancas sangUíneas que efetuam uma resposta imune
mediada tor células, essas células brancas sangUíneas
sendo sensibilizadas para uma proteína antigênica de
- 4 -
Eimecia.
11 - Vetor de expressão de DNA recombinante, de
acordo com a reivindicação 10, em que o dito vetor de
expressão é selecionado na classe que consiste de
5
bacteriófagos, plasmídios, vírus ou seus híbridos.
12 - Vetor de expressão de DNA recombinante, de
acordo com a reivindicação 11, em que o dita vetor de
expressão é o bacteriáfago lambda.
13 - Vetor de expressão de DNA recombinante, de
10 acordo com a reivindicação 10, compreendendo adicionalmente uma região que codifica um sítio de ligação à
ribossoma, em que a dita região está posicionada entre o
dito promotor e o dito sítio onde a dita seqüência de DNA
é inserida.
15
14 - Vetar de expressão de DNA recombinante, de
acordo com a reivindicação 13, em que a dita região que
codifica um sítio de ligação à ribossoma compreende uma
seqüência de Shine-Dalgarno.
15 - Vetor de expressão de DNA recombinante, de
20 acordo
com
a reivindicação 13, compreendendo adi-
cionalmente uma segunda seqUência de DNA unida à dita
primeira seqüência
de DNA, em uma armação de leitura de
tradução carreta com esta, em que a dita seqüência de
DNA
codifica a produção de uma proteína ou seu fragmento dife25 rente da codificada pela dita primeira seqüência de DNA,
pelo que as ditas primeira e segunda seqüências de DNA
codificam juntas a produção de uma proteína de fusão.
16 - Vetor de expressão de DNA recombinante, de
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51. .
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wie
as
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se
lem •e
acordo com a reivindicação 15, em que a dita segunda
seqij@ncia de DNA codifica a produção de beta-galactosidase
ou seu fragmento.
.17 - Célula transformada, compreendendo uma
5 célula hoSpedeira e um vetor de expressão de DNA recombinante contido dentro da dita célula hospedeira, o dito
vetor de expressão de DNA recombinante compreendendo um
vetor de' expressão com um promotor operacional na dita
célula
10
hospedeira e uma seqüência de DNA
sítio no
dito
vetor a
jusante
rativamente associado a ele, em que
DNA
inserida em um
do dito promotor e opea
dita seqU'éncia
de
compreende um gene clonado ou seu fragmento que codi-
fica uma proteína antig@nica que ativa células brancas
sanguíneas que efetuam uma resposta imune mediada por
15 células, essas células brancas sanguíneas sendo sensibilizadas para uma proteína antiggnica de uma espécie de
Çimeela.
ia - Célula transformada, de acordo com a
reivindicação 17, em que a dita célula hospedeira é uma
20 célula eucarlótica.
19 - Célula transformada, de acordo com a
reivindicação 17, em
que a dita célula hospedeira é uma
célula procariética.
20 - Célula transformada, de acordo com a
25 reivindicação 19, em que a dita célula transformada é uma
célula bacteriana.
'
21 - Célula transformada, de acordo com a
reivindicação 20, em que a dita célula bacteriana é
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Eacherichla_cult.
22 - Antígeno compreendendo uma proteína ou seu
fragmento expresso pela célula transformada de acordo com
a reivindicação 17, essa proteína ativando células brancas
5 sangUíneas que efetuam uma resposta imune mediada por
células, essas células brancas sangUíneas sendo sensibilizadas para uma proteína antigênica de
Eimerla.
23 - Método de proteção de uma ave contra
infecção
por
coccidiose
10 administração à dita ave
aviária,
compreendendo
de um antígeno de acordo' com
a
a
reivindicação 22, em uma quantidade eficaz para imunizar a
dita ave contra a coccidiase aviária.
24 - Vacina utilizável para a proteção de aves
contra coccidiose aviária, compreendendo um antígeno de
15 acordo com a reivindicação 22, em uma quantidade eficaz
para imunizar uma ave contra coccidiase aviária, em
combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
25 - Método de identificação de seqüências de
DNA que codificam proteínas antigênicas utilizáveis como
20 vacinas
para
coccidiose
aviária,'
o
dito
método
compreendendo:
(a)
seqüências de
(b)
a formação
DNA
de
de
uma
multiplicidade
de
Elmecia;
a inserção das seqüências de DNA em vetores
25 de expressão de DNA para formar vetores de expressão recombinantes;
(c) a inserção dos vetores de expressão recombinantes em hospedeiros adequados para formar transformantes
•
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que expressam as seqUiâncias de DNA>
(d)
o contato dos transformantes com anticorpos.
dirigidos contra antígenos da superfície celular
Eleeria•
para
identificar
transformantes
de
contendo
5 seqüências de DNA que codificam antígenos da superfície
celular de
Eimecia;
(e)
lar de
Elmecia
a produção de antígenos de superfície celua partir das seqüências de DNA identifi-
cadas como codificadoras dos
10
ditos antígenos, e
então,
(f) o contato dos antígenos da superfície celular de
Eluda
com células brancas sangüíneas que efetuam
uma resposta imune mediada por células, essas células
brancas sangUíneas sendo sensibilizadas para uma proteína
antigânica de
Elmecia,
para, dessa forma, identificar
15 seqiiâncias de DNA que codificam antígenos que induzem uma
resposta imune mediada por células para a coccidiose
aviária.
26 - Método, de acordo com a reivindicação 25,
em que as ditas células brancas sangUíneas compreendem
20 células T.
27 - Método, de acordo com a reivindicação 25,
em que, o dito vetor de expressão é um vetor de expressão
de bacte•iófago lambda e a dita célula hospedeira é uma
célula hospedeira de
25
28 -
Ea_coli.
Seqiiância de DNA tlonado produzida pelo
processo da reivindicação 25,
a dita seqiiância de DNA
compreendendo um gene cloriado ou seu fragmento que codifica uma proteína antigânica que ativa células brancas
•• •••..• •••• •••• ••••• ••• • •••• •• ••
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• ••• • • •
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sangüíneas que efetuam uma resposta imune mediada por
células, essas célulass brancas sanguíneas sendo sensibilizadas para
uma proteína antigenica de Eimecia•
29 - Vetor de expressão de DNA recombinante,
5 compreendendo um vetar de expressão tendo um promotor e a
seqUgncia
de DNA de acordo com a reivindicacáo 28 inserida
no dito vetor, a jusante do dito promotor e operativamente
associada a ele.
30 - Célula transformada, compreendendo uma
10 célula hospedeira e o vetar de expressão de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 29, contido dentro da
dita célula hospedeira, em que o dito promotor do vetor de
expressão é operacional na dita célula hospedeira.
31 - Antígeno compreendendo uma proteína ou seu
15 fragmento expressado pela célula transformada de acordo
com a reivindicação 30, essa proteína ativando células
brancas sanguíneas
que efetuam uma resposta imune mediada
por células, essas células brancas sanguíneas sendo sensibilizadas para uma proteína antiggncia de
20
32 -
Método
Elmecla•
de Proteção de una ave contra
Infecção por coccidiose aviária, compreendendo a
admnistração à dita ave da antígeno de acordo com a
reivindicação 31, em uma quantidade eficaz para imunizar a
dita ave contra coccidiose aviária.
25
33 - Vacina utilizável para a proteção de aves
contra coccidiose aviária, compreendendo o antígeno de
acordo com a reivindicação 31, em uma quantidade eficaz
para
imunizar uma
ave contra coccidiose aviária, em
- 9 -
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combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
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RESUMO
Patente de Invenção: "GENES CLONADOS CODIFICANDO ANTÍGENOS
DE COCCIDIOSE AVIARIA QUE INDUZEM UMA RESPOSTA MEDIADA POR
CéLULAS E MÉTODO DE PRODUCX0 DOS MESMOS".
5
São apresentadas seqüências de DNA que codificam
proteínas antigênicas, métodos para identificação dessas
seqüências de DNA e antígenos codificados por essas
seqüências de DNA.
A primeira etapa do método é fornecer uma
10 multiplicidade de seqüências de DNA. Essas seqüências
são,
então, inseridas em vetores de expressão de DNA para
formar vetores de expressão recomhinantes. Os vetores de
expressão são inseridos em hospedeiros adequados para formar transformantes que expressam as seqüências de DNA. Os
15 transformantes são, então, contactados com anticorpos dirigidos contra antígenos de
Eimeria
Para identificar
transformantes contendo seqüências de DNA que codificam
antígenos de
Eimeria.
Esses. antígenos são, então,
produzidos a partir das seqüências de DNA identificadas
20 como codificadoras dos antígenos. Os antígenos assim
produzidos são contactados com células brancas sangüíneas
que efetuam uma resposta imune mediada por célula, essas
células brancas sangüíneas sendo sensibilizadas para uma
proteína antigênica de Elmefia, para, dessa forma, identi-
- 2
1.4.
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••• •• •• Me •
ficar seqüências de DNA que codificam antígenos que
InduzeM uma resposta imune mediada por células à
coccidiose aviária.
As seqüências de DNA da presente
invenção
5 compreendem genes clonados ou seus fragmentos que
codificam, na expressão, uma proteína antigênica que ativa
células brancas sangUíneas que efetuam uma resposta imune
mediada por células, essas células brancas sangUíneas
sendo sensibilizadas para uma proteína antigênica de .
10
Eimecia
Novo quadro reivindicatório (total de 34 reivindicações), acompanhado de carta explicativa dirigida
à WIPO em resposta ao Primeiro Parecer Técnico acima men
cionado.
ESCRITÓRIO NORTE-AMERICANO DE MARCAS E PATENTES PERANTE
A AUTORIDADE EXAMINADORA PRELIMINAR INTERNACIONAL NORTE
-AMERICANA (IPEA/US)
Referente ao Pedido Internacional dos
ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA, representado pelo
SECRETARIO DO DEPARTAMENTO NORTE-AMERICANO DE COMÉRCIO
Pedido n9 PCT/US88/04172
Ref: IPEA/US
Data de depósito Internacional: 23 novembro de 1988
Examinador: J. Ellis
Para: GENES CLONADOS CODIFICANDO ANTÍGENOS PARA COCCI
DIOSE AVIARIA QUE INDUZEM UMA RESPOSTA MEDIADA POR CÉ
LULAS E MÉTODO DE PRODUÇA0 DOS MESMOS
RESPOSTA AO PARECER ESCRITO
Box PCT
Diretor de Marcas e Patentes
Washington, D.C. 20231
Senhores:
Em resposta ao primeiro parecer escrito da IPEA/US,
postado em 28 de agosto de 1989, o requerente, por seu procurador e representante abaixo assinado, responde por este
ao primbiro parecer escrito nos seguintes termos:
EMENDA
São anexadas páginas substitutas 45-51. Deve-se notar que
as páginas substitutas não diferem apenas quanto às palavras, mas também em estilo, de modo que não existe uma cor
respondência direta entre as linhas das páginas substituidas e as folhas substitutas.
As alterações substitutas 45-51 diferem das reivindicações
originais nos seguintes termos:
• ....
••
: • • :
:•..• : •••
- 2 9
.°
se**
'Dó
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1.••
• •
Ge
Na reivindicação 1, linhas 2 e 3, "ou seja fragmento"•foi removido;
na linha 4, --seletivamente-- foi inserido depois
de "ativa";
ha linha 6, --de uma espécie de Eimeria --foi inserido'depois de "proteína".
Na reivindicação 7, linhas 1 e 2, "ou seu fragmento"
foi removido;
na linha 3, --seletivamente-- foi inserido depois
de "ativa";
na linha 5, "esporozoíto ou" foi removido;
na linha 6, "classe" foi mudado para --grupo--;
na linha 9, -- que codifica atividade estimuladora
de células T -- foi inserido após "cMZ-8";
nas linhas 13 e 14, "das sequências de DNA precedentes"
foi mudado para -- sequência dentro do âmbito definido por
(a) e (b) acima --.
Na reivindicação 8, linhas 15 e 16, "ou seu fragmento"
foi removido;
na linha 17, --seletivamente -- foi inserido depois
de "estimula";
na. linha 19, "ou merozolto" foi removido;
na. linha 20, "classe" foi mudado para -- grupo --;
na linha 23, que codifica atividade estimuladora de
células T -- foi inserido após"MA1";
nas linhas 27 e 28, "das sequências de DNA precedentes"
foi mudado para -- sequência dentro do âmbito definido por
(a) e (b) acima --.
Na reivindicação 9, linhas 29 e 30, "ou seu
fragmento"foi removido;
na linha 31, -- seletivamente -- foi inserido
após "estimula"
na linha 2 (página 47), "esporozoito ou" foi
removido,
na linha 3, "classe" foi mudado para --grupo --;
na'linha 6, -- que codifica atividade estimuladora
de células T -- foi inserido após "MC17";
nas linhas 10 e 11, "das sequências de DNA precedentes" foi mudado para -- sequência dentro do âmbito
definido por (a) e (b) acima --.
Na reivindicação 10, linha 14, -- primeiro -- foi
inserido antes de "DNA";
nas linhas 16 e 17, "ou seu fragmento" foi removido;
na linha 17, -- seletivamente -- foi inserido
após"ativa".
Na reivindicação 15, linha 13, " de tradução" foi
removido.
Na reivindicação 17, linha 1 (página 49), "ou seu
fragmento" foi removido.
na linha 2, -- seletivamente -- foi inserido após
"ativa".
Na reivindicação 28, linha 8, "ou seu fragmento"
foi removido;
na linha 9, -- seletivamente -- foi inserido após
"ativa"
A reivindicação 34 foi acrescentada.
A INVENÇÃO
Para resumir as principais emendas, a reivindicação 1 foi reescrita para proporcionar base antecedente
nas reivindicações 5 e 7 para a expressão "espécie de
Eimeria". A expressão "ou seu fragmento" foi removida
das reivindicações 1, 7-10, 17 e 20. As reivindicações
7-9 foram alteradas para definir mais claramente o
segmento homólogo no parágrafo (b). Na reivindicação 10,
a base antecedente foi fornecida para a"primeira sequen-:
cia de DNA" citada na reivindicação 15. As reivindicações
também foram emendadas para citar que a presente proteína
antigénica ativa seletivamente as células brancas sangüíneas sensibilizadas. O suporte para essa limitação é encontrado na página 15 do relatório, que expõe a triagem
dos antígenos contra "células brancas sangüíneas que efetuam uma resposta imune mediada por células, em oposi
ção à humoral" (linhas 16-18). A reivindicação 34 referente ao clone MA16 foi acrescentada para fazer um paralelo com as reivindicações 7-9.
A presente invenção se refere a sequências de DNA
que codificam antígenos coccídicos que ativam linfócitos
T isolados de galinhas imunes a Eimeria, a um método para
identificação das sequências, a vetores contendo as sequências e a células transformadas com os vetores. Os
antígenos coccidicos codificados pelas sequências e produzidos pelas células transformadas são utilizáveis como
vacinas contra a coccidiose aviária:
O método da invenção envolve a formação de uma bi
blioteca de sequências de DNA de Eimeria, a inserção das
sequências em vetores de expressão para formar vetores
de expressão recombiantes, a transformação de células hos
pedeiras com os vetores recombinantes para formar transfor
mantes que expressam as sequências de DNA, a contactação
dos transformantes com anticorpos dirigidos contra antígenos da superfície celular de Eimeria para identificar
- 5
os transformantes contendo sequências de DNA que codificam antígenos da superfície celular de Eimeria, a produção dos antígenos a partir das sequências identificadas
e, finalmente o contato dos antígenos com células brancas
sangüíneas que são sensibilizadas para uma proteína anti
genica de Eimeria, para, dessa forma, identificar sequências de DNA que codificam antígenos que induzem uma resposta imune mediada por células para a coccidiose aviária.
A base para essa estratégia é que as células T, e
não os anticorpos séricos, parecem ser criticas para a
proteção contra Eimeria. Após uma única infecçãO cocc/dica, as 'galinhas conteriam um subconjunto de linfócitos T
circulantes específicos para certos antígenos coccídicos.
Com uma Segunda infecçãO desafiante coma mesma
espécie de Eimeria, as células T específicas para o anti
gano são ativadas para destruir esses parasitas. O nroce
dimento acima delineado selecionará apenas as sequências
de DNA e antígenos codificados que promovem a proliferação das células T apropriadas.
ARGUMENTOS
As reivindicações 1-21 e 25-31 são declaradas como
não apresentando etapa inventiva de acordo com o Artigo
33(3) do PCT, por serem Obvias com relação a Clarke et
al., Anderson et al ou Schenkel et al.
Clarke et al apresenta bibliotecas de genes clonados
que clonam para antígenos de Eimeria tenella. Os genes que
clonam para os antígenos são identificados por triagem das
bibliotecas com soro de galinhas imunizadas por infecção.
O soro da galinha reflete apenas a resposta humoral da
galinha ao antígeno e não a resposta mediada por células.
Na medida que o braço efetuador predominante do sistema
imune na resistência ã coccidiose não é humoral, mas, ao
invés, celular, a abordagem de Clarke et al não levaria
uma pessoa ordinariamente versada na técnica à concepção
inventiva dos requerentes.
- 6 -
Anderson et al apresentam genes clonados que codificam
proteínas antigênicas de espécias de Eimeria. Os genes
que codificam os antígenos são identificados por triagem de célulaá transformadas com antissoro de galinha
polivalente, obtido de galinhas previamente infectadas
com Eimeria tenella. O antissoro de galinha reflete
apenas a resposta imune humoralc3agalinha ao antígeno e não
a resposta mediada por células. Na medida que o braço
efetuador predominante do sistema imune na resistência
coccidiose não é humoral, mas, ao invés, celular, a
abordagem de Anderson não levaria uma pessoa ordinariamente versada na técnica à concepção inventiva dos requerentes.
SPhenkel et al produzem anticorpos monoclonais
para E. tenella e usam os anticorpos para identificar
antígenos isolados de extratos de esporozoitos e merozoí
tos de E. tenella isolados. O anticorpo apresenta reação cruzada com merozoltos e esporozoitos de E. tenella,
assim como com esporozoitos de quatro outras espécies de
Eimeria. A proteção contra coccidiose é específica para
a espécie. Consequentemente, é improvável que o antígeno
identificado pelo anticorpo de Schenkel seja protetor.
Não se apresenta nenhum dado. Além disso, os antígenos
de Schenkel não se mostram capazes de ativar seletivamente
células brancas sanguíneas que efetuam uma resposta imune
mediada por células.
As reivindicações 23, 24, 32 e 33 são declaradas
como não apresentando etapa inventiva de acordo com o
Artigo 33(3) do PCT, também por serem óbvias com relação
a Anderson et al e Schenkel et al. Com base nas observações acima, fica claro que a presente invenção se distin
gue dessas referências. Assim, não seria óbvio para o téc
nico utilizar genes clonados, conforme aqui reivindicado,
como vacina para prevenção e tratamento de coccidiose.
O conjunto da técnica citado pelo Examinador é incapaz de ensinar ou sugerir a triagem de antígenos da
superfície celular de Eimeria com células brancas sanguíneas sensiblizadas. Além disso, a técnica é incapaz de
- 7 -
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•• •••• CPI •II• •• ••
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apreciar o significado dessa etapa. Seria apenas pela
reconstrução com base na exposição dos requerentes que
uma pessoa ordinariamente versada na técnica poderia
chegar'ã invenção reivindicada.
As deficiências da técnica anterior para ensinar
ou sugerir o ponto de novidade da invenção reivindicada foram discutidas.
Pelas razões acima declaradas, as reivindicações
1-34 são consideradas em condições para a concessão.
Caso alguma taxa requerida, o Diretor está autorizado A debitar a Conta Corrente 06-1358
Atenciosamente
FLEIT, JACOBSON, COHN,
PRICE, HOLMAN & STERN
por
(ass)
J.C. Holman
Reg. n9 22.769
400 7th St., N.W.
Washington, D.C. 20004-2201
(202) 638-6666
Doc. Q-2674PC
Anexo:
Páginas subtitutas 45-51
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IN THE UNITED STATES PATENT AND TRADEMARK OFFICE
BEFORE THE UNITED STATES INTERNATIONAL PRELIMINARY
EXAMINING AUTHORITY (IPEA/US)
In Re International Application of
THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by
THE SECRETARY, U.S. DEPARTMENT OF COMMERCE
Application No. PCT/US88/04172
Attn. IPEA/US
International Filing Date: 23 November 1988
Examiner: J. Ellis
For: CLONED GENES CODING FOR AVIAN COCCIDIOSIS
ÃNTIGENS WHICH INDUCE A CELL-MEDIATED
RESPONSE AND METHOD OF PRODUCING THE SAME
RESPONSE TO THE WRITTEN OPINION
Box PCT
Commissioner of Patents & Trademarks
Washington, D.C. 20231
Sir:
In response to the first written opinion by the
IPEA/US mailed 28 August 1989, applicant, by his undersigned
attorney and representative, hereby responds to the first
written opinion as follows:
AMENDMENT
Replacement pages 45-51 are attached hereto.
It
should be noted that the replacement pages differ not only in
wording, but in type style so that there is not a one-to-one
correspondence between the lines of the replacement pages and
the substitute sheets.
Replacement changes 45-51 differ from the original
claims as follows:
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In Claim 1, at lines 2 and 3, "or fragment thereof"
has been deleted;
at line 4, --selectively-- has been
inserted before "activates";
at line 6, --of an Eimeria species-- has
been inserted after "protein".
.In Claim 7, at lines 1 and 2, "or fragment thereof"
has been deleted;
at line 3, --selectively-- has been
inserted before "activates";
at line 5, "sporozoite or" has been
deleted;
at line 6, "class" has been changed to
--group--;
at line 9, --which encodes T cellstimulating activity-- has been inserted after "cMZ-8;
at lines 13 and 14, "of the foregoing DNA
sequences" has been changed to --sequence within the scope
defined by (a) and (b), above--.
In Claim 8, at lines 15 and 16, "or fragment thereof"
has been deleted;
at line 17, --seleCtively-- has been
inserted before "stimulates";
at line 19, "or merozoite" has been
deleted;
at line 20, "class" has been changed to
--group--;
at line 23, --which encodes T cellstimulating activity-- has been inserted after "MA1";
at lines 27 and 28, "of the foregoing DNA
sequences" has been changed to --sequence within the scope
defined by (a) and (b), above--.
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er
• ff•
em 114.•, Nee
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G
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In olaia 9, at lines 29 and 30, "or fragment thereof"
has been deleted;
at line 31, --selectively-- has been
inserted before "stimulates";
at line 2 (page 47), "sporozoite or" has
been deleted;
at line 3, "class" has been changed to
--group--;
at line 6, --which encodes T cellstimulating activity-- has been inserted after "MC17";
at lines 10 and 11, "of the foregoing DNA
sequences" has been changed to --sequence within the scope
defined by (a) and (b), above--.
In Claim 10, at line 14, --first-- has been inserted
before "DNA"; '
at lines 16 and 17, "or fragment thereof"
has been deleted;
at line 17, --selectively-- has been
inserted before "activates".
In Claim 15, at line 13, "translational" has been
deleted.
In Claim 17, at line 1 (page -49), "or fragment
thereof" has been deleted;
at line 2, --selectively-- has been
inserted before "activates".
In Claim 28, at line 8, "or fragment thereof" has been
deleted;
at line 9, --selectively-- has been
inserted before "activates".
•
-4--
•
•• • • •• •
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•
••
Claim 34 has been added.
THE INVENTION
To summarize the primary amendments, Claim 1 has been
rewritten to provide antecedent basis in Claims 5 and 7 for
the expression "Eimeria species". The expression "or fragment
thereof" has been deleted from Claims 1, 7-10, 17 and 20.
Claims 7-9 have been amended to more clearly define the
homologous segment in paragraph (b). In Claim 10, antecedent
basis has been provided for "first DNA sequence" recited in
Claim 15. The claims have also been amended to recite that
the subject antigenic protein selectively activates the
sensitized white blood cells. Support for this limitation is
found on page 15 of the specification which discloses
screening the antigens against "white blood cells which effect
a cell-mediated, as opposed to humoral, imune response"
(lines 16-18). Claim 34 drawn to the MA1G clone has been
added to parallel Claims 7-9.
The present invention relates to DNA sequences which
code for coccidial antigens that activate T lymphocytes
isolated from Eimeria-immune chickens, a method for
identifying the sequences, vectors containing the sequences,
and cells transformed with the vectors. The coccidial
antigens encoded by the sequences and produced by the
transforied cells are useful as vaccines against avian
coccidiosis.
The method of the invention involves providing a
library of Eimeria DNA sequences, inserting the sequences into
expressidn vectors to form recombinant expression vectors,
transforming host cells with the recombinant vectors to form
transformants which express the DNA sequences, contacting the
transformants with antibodies directed against Eimeria cell
surface antigens to identify transformants containing DNA
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96
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sequences which code for Eimeria cell surface antigens,
producing the antigens from the identified sequences, and,
finally, contacting the antigens with white blood cells which
are sensitized to an antigenic Eimeria protein to thereby
identify DNA sequences which code for antigens that induce a
cell-mediated immune response to avian coccidiosis.
The basis for this strategy is that the T cells, and
not the serum antibodies, appear to be critical to protection
against Eimeria. After a single coccidial infection, chickens
would contain a subset of circulating T lymphocytes that are
specific for certain coccidial antigens. Upon a second
challenge infection with the same Eimeria species, the
antigen-specific T cells are activated to destroy these
parasites. The procedure outiined above will select for only
those DNA sequences and encoded antigens which will promote
a proliferation of the appropriate T cells.
ARGUMENTS
• Claims 1-21 and 25-31 are stated to lack an inventive
step under PCT Article 33(3) as being obvious over Clarke et
al or Anderson et al or Schenkel et al.
Clarke et al disclose libraries of cloned genes which
cione for antigens of Eimeria tenella. Genes which clone for
the antigens are identified by screening the libraries with
serum from chickens immunizedby infection. The chicken serum
reflects oniy the chicken's humoral response to the antigen,
and not the cell-mediated response. Insofar as the
predominant effector arm of the imune system in resistance
to coccidiosis is not humoral, but rather cellular, the
approach of Clark et al would not lead the person of ordinary
skill in the art to the inventive concept of the applicants.
Anderson et al disclose cloned genes which code for
antigenic proteins of Eimeria species. Genes which code for
the antigens are identified by screening transformed cells
-6-
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with polyvalent chicken antiserum obtained from chickens
previously infected with Eimeria tenella. The chicken
antiserum reflects only the chicken's humoral imune response
to the antigen, and not the cell-mediated response. Insofar
as the predominant effector arm of the imune system in
resistance to coccidiosis is not humoral, but rather cellular,
the approach of Anderson would not lead the person of ordinary
skill in the.art to the inventive concept of the applicants.
Schenkel et al produces monoclonal antibody to Es
tenella and uses the antibodies to identify antigens isolated
from E. tenella sporozoite and merozoite extracts. The
antibody is shown to be cross-reactive with merozoites and
sporozoites of E. tenella as well as with sporozoites from
four other Eimeria species. Protection against coccidiosis
is species-specific. Therefore, it is unlikely that the
antigen identified by Schenkel's antibody is protective. No
data is given. Moreover, Schenkel's antigens are not shown
to selectively activate white blood cells which effect a cellmediated imune response.
Claims 23, 24, 32 and 33 are stated to lack an
inventive step under PCT Article 33(3) as being further
obvious over Anderson et al and Schenkel et al. Based on the
above remarks, it is apparent that the present invention
distinguishes over these references. Thus, it would not be
obvious to the artisan to utilize cloned genes as claimed
herein as vaccine for prevention and treatment of coccidiosis.
The collective body of art cited by the Examiner fails
to teach or suggest screening Eimeria cell surface antigens
with the sensitized white blood cells. Moreover, the art
fails to appreciate the significance of this step. It would
only be by hindsight reconstruction of the applicants'
disclosure that a person of ordinary skill in the art could
arrive at the claimed invention.
••
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-7-
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The deficiencies of the prior art in teaching or
suggesting the point of novelty of the claimed invention have
been discussed.
For the reasons stated above, Claims 1-34 are
considered to be in condition for allowance.
Should any fees be required, the Commissioner is
authorized to charge Deposit Account 06-1358.
Respectfully submitted,
FLEIT, JACOBSON, COHN, PRICE,
HOLMAN & STERN
By
400 7th St., N.W.
Washington, D.C. 20004-2201
(202) 638-6666
Atty. Dkt. Q-2674PC
Attachment:
Replacement pages 45-51
L--J.1 C. Ho man
. No. 22,769
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De
REIVINDICAOES
1 - Seqüência de DNA compreendendo um gene
clonado que codifica uma proteína antigênica que ativa
seletivamente células brancas sanguíneas que efetuam uma
5 resposta imune mediada por células, essas células brancas
sanguíneas sendo sensibilizadas para uma proteína
antigênica de uma espécie de EIMECIa.
2 - Seqüência de DNA, de
reivindicação
1,
em
acordo
com
a
que as ditas células brancas
10 sanguíneas são células T e em que a dita proteína
antigênica estimula o crescimento das ditas células T.
3 Seqüência de DNA, de acordo com a
reivindicação 1, em que a dita proteína antigênica se liga
a um anticorpo dirigido contra um antígeno da superfície
15 celular. de um esporozoíto de ELMECIA.
4
Seqüência
de DNA, de acordo com a
revindicação 1, em que a dita proteína antigênica se liga
a um anticorpo dirigido contra um antígeno da superfície
celular de merozoíto de
20
Eimecia.
5 - Seqüência de DNA, de
acordo
com
a
reivindicação 1, em que a dita proteína antigênica não é
reconhecida por soros imunes colhidos em aves infectadas
com a dita espécie de
6
Elmecia.
Seqüência
de DNA, de acordo com a
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go
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88
- 2 -
reivindicação 1, em que a dita espécie de
Eimecia
é
Eimecia_aaermulina.
DNA
7 - Seqüência de
compreendendo um gene
clonada que codifica uma proteína antigênica que estimula
5 seletivamente o crescimento de células T de aves, essas
célula T sendo sensibilizadas para uma proteína da
superfície celular de um merozoito de EiNerla_aLernilina,
a dita seqüência de DNA sendo selecionada no grupo que
consiste de:
(a) clone cDNA cf12-8:
10
(b) seqüências de DNA que hibridizam a uma sonda
oligonticleotídica homóloga a um segmento de cMZ -8
que co-
difica atividade estimuladora de células T, a dita sonda
oligonucleotídica
compreendendo
pelo
menos
16
15 nucleotídios, e
(c)
DNA
seqüências de
que
codificam,
na
expressão, um polipeptídio codificado na expressão por
qualquer seqüência dentro do âmbito definido por (a) e (b)
acima. •
20
8 - Seqüência de
DNA
compreendendo um gene
clonado que coidifica urna proteína antigênica que estimula
seletivamente o crescimento de células T de aves, essas
células T sendo sensibilizadas para uma proteína da
superfície celular de um esporozoíto de EIMeelb
25 aGeMalina, a dita seqüência de
DNA sendo selecionada no
grupo que consiste de:
(a) clone cONA MA1:
(b) seqüências de DNA
que hibridizam a uma sonda
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oligonucleotídica homóloga a um segmento de
MA1
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419
que codi-
fica atividade estimuladora de células T, a dita sonda
oligonucleotídica
compreendendo pelo menos
16
nucleot(dlos, e
(c)
5
DNA
de
seqüências
que codificam, na
expressão, um polipeptídio codificado na expressão por
qualquer seqüência dentro do âmbito definido por (a) e (b)
acima.
9 - Seqüência de
DNA
compreendendo um gene
10 clonadaque codifica uma proteína antigânica que estimula
seletivamente o crescimento de células T de aves, essas
células T sendo sensibilizadas para uma proteína da
superfície celular de um merozoíto de
Eimeela_agermulina,
a dita seqüência de DNA sendo selecionada no grupo que
15 consiste de:
(a) clone cDNA MC17;
(b) seqüências de DNA que hibridizam a uma sonda
oligonucleotídica homóloga a um segmento de MC17 que codifica atividade estimuladora de células T, a dita sonda
20 oligonucleotídica
compreendendo
pelo
menos
16
nucleotídios:. e •
(c)seqüências
de
DNA
que
codificam,
na.
expressão, um polipeptid ■ o codificado na expressão por
qualquer seqüência dentro do âmbito definido por (a) e (b)
25
acima.
10 - Vetor de expressão de
DNA recombinante,
compreendendo um vetor de expressão com um promotor e uma
primeir'a seqüência de
DNA
inserida no dito vetor a jusante
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do dito promotor e operativamente associado a ele, em que
a dita seqUância de DNA compreende um gene clonado que codifica uma proteína antigância que ativa seletivamente
células brancas sanguíneas que efetuam uma resposta imune
5 mediada por células, essas células brancas sanguíneas
sendo sensibilizadas para uma proteína antigânica de
Eimeela.
11 - Vetar de expressão de
DNA
recombinante, de
acordo com a reivindicação 10, em que o dita vetar de
10 expressão
é
selecionado na classe que consiste. de
bacteri‘fagos, plasmidlos, vírus ou seus híbridos.
12 - Vetor de expressão de DNA recombinante, de
acordo com a reivindicação 11, em que o dito vetor de
expressão é o bacteri6fago lambda.
15
. 13 - Vetor de expressão de
acordo
com
DNA recombinante, de
a reivindicação 10, compreendendo adi-
cionalmente uma região que codifica um sítio de ligação a
ribossoma, em que a dita região está posicionada entre o
dito proáotor e a dito sítio, onde a dita seqUância de DNA
20 é inserida.
14 - Vetor de expressão de DNA recombinante, de
acordo com a reivindicação 13, em que a dita região que
codifica um sítio de ligação a ribossoma compreende uma
seqUância de Shine-Dalgarno.
25
15 - Vetor de expressão de
acordo com a reivindicação
13,
DNA recombinante, de
compreendendo
cionalmente uma segunda seqUgncia de
primeira seqUência de
DNA,
adi-
DNA unida ã dita
em armação de leitura correta
•••
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com esta, em que a dita segunda seqüência
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de DNA codifica
a produção de uma proteína ou seu fragmento diferente da
codificada pela dita
primeira iseqUancia de DNA,
pelo que
DNA codificam
as ditas primeira e segunda seqüências de
5 juntas a . produção de uma proteína de fusão.
16 - Vetor de expressão de DNA recombinante, de
acordo com a reivindicação 15, em que a dita segunda
seqüência de
DNA codifica a produção de beta-galactosidase
ou seu fragmento.
10
17 - Célula transformada, compreendendo uma
célula hospedeira e um vetor de expressão de
DNA recombi-
nante contido dentro da dita célula hospedeira, o dito
vetor de expressão de
DNA recombinante compreendendo um
vetor de expressão com um promotor operacional na dita
15 célula hospedeira, e uma seqüência de
DNA
inserida em um
sítio no dito vetor a jusante do dito promotor e operativamente associado a ele, em que a dita seqUgncia de
DNA compreeende um gene clonado que codifica uma proteína
•
antiggnica
que
seletivamente células brancas
ativa
20 sangüíneas que efetuam uma resposta imune mediada por
células, essas células brancas sangüíneas sendo sensibilizadas para uma proteína antiggnica de uma espécie de
Ficaria.
18
-
Célula transformada, de acordo com a
25 reivindicação 17, em que a dita célula hospedeira é uma
célula eucariótica.
19 - Célula transformada, de
acorda com a
reivindicação 17, em que a dita célula hospedeira é uma
••••
• • •
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• •
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•
- 6 -
célula prOcarifitica.
20 - Célula transformada, de acordo com a
reivindicação 19, em que a dita célula transformada é uma
célula bacteriana.
5
21 - Célula transformada, de acordo com a
reivindicação 20, em que a dita célula bacteriana é
Escherichia_cull.
22 - Antígeno compreendendo uma proteína ou seu
fragmento expressado pela célula tranformada de acordo com
10 a reivindicação 17, essa proteína ativando células brancas
sanguíneas que efetuam uma resposta imune mediada por
células, essas células brancas sangüíneas sendo sensibilizadas para uma proteína antigênica de Eimecia
23 - Método de proteção de aves contra infecção
15 por coccidiose aviária, compreendendo a administração à
dita ave de um antígeno de acordo com a reivindicação 22,
em uma quantidade eficaz para imunizar a dita ave contra
coccidiose aviária.
24 - Vacina utilizável para a proteção de aves
20 contra coccidiose aviária, compreendendo um antígeno de
acordo com a reivindicação 22, em uma quantidade eficaz
para imunizar uma ave contra coccidiose aviária, em
combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
25 - Método de identificação de seqUgnclas de
25 DNA
que
codificam proteínas antiggnicas utilizáveis
como
vacinas para coccidiose aviária, o dito método
compreendendo:
(a)
a formação de
uma
multiplicidade
de
- 7 -
seqUgncias de DNA de
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Is
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Eimecia;
(b) a inserção das seqUincias de DNA em vetores
de expr'essão de DNA para formar vetores de expressão recombir.mte;
(c) a inserção dos vetores de expressão recombi-
5
nantes :em hospedeiras adequadas para forma transformantes
que expressam as seqUgnclas de DNA;
(d) o contato dos transformantes com anticorpos
dirigidos
10
Eimecia
contra antígenos da superfície celular de
para Indetificar tranformantes contendo seqUencias
de DNA que codificam antígenos da superfície celular de
Elmeciv .
(e)
lar de
Eimecia
a produção de antígenos da superfície celu a partir das seqüências de DNA identifi-
15 cadas como codificadoras dos ditos antígenos, e então,
(f)
lar de
Eimecia
o contato dos antígenos da superfície celucom células brancas sangüíneas que efetuam
uma resposta imune mediada por células, essas células
brancas sangUíneas senda sensibilizadas para uma proteína
20 antiggnica de
Eimecia,
para, dessa forma, identificar
seqüencias de DNA que codificam antígenos que induzem uma
resposta : imune mediada por células para coccidiose
aviária.
26 - Método, de acordo com a reivindicação 25,
25 em que a@ ditas células brancas sangUíneas compreendem
células T.
27 - Método, de acordo com a reivindicação 25,
em que o dita vetor de expressão é um vetor de expressão
- 8 -
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bacterigfgo lambda e a dita célula hospedeira é uma
célula hospedeira
n_cell.
28 - SeqUencia de DNA clonado produzida pelo
processo' de acordo com a reivindicação 25, a
dita
5 seqUgncia de DNA compreendendo um gene clonado que codifica uma proteína antiggnica que ativa seletivamente
células brancas sangUíneas que efetuam uma resposta imune
mediada por células, essas células brancas sangUíneas
sendo sensibilizadas para uma proteína antiggnica de
10
CIM@Pli.
29 -
Vetor de expressão de DNA recombinante,
compreendendo um vetar de expressão tendo um promotor e a
seqUgncia de DNA de acorda cum a reivindicação 28 inserida
no dito vetar, a jusante do dito promotor e operativamente
15 associada a ele.
30 - Célula transformada, compreendendo uma
célula hospedeira e o vetor de expressão de
DNA recombi-
nante de acordo com a reivindicação 29 contido dentro da
dita célula hospedeira, em
que o dito promotor do vetar de
20 expressão é operacional na dita
célula hospedeira.
31 - Antígeno compreendendo uma proteína ou se
fragmento expressado pela célula transformada de acordo
com a reivindicação 30, essa proteína ativando células
brancas sangUíneas que efetuam uma resposta imuni mediada
25 por células, essas células brancas sangUíneas sendo sensibilizadas para uma proteína antiggnica de
Elmeela.
32 - Método de proteção de uma ave contra
infecção
por
coccidiose
aviária,
compreendendo
a
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- 9 -
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611
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administração à dita ave do antígeno
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96
OS
de acordo com a
dita ave contra coccidiose aviária.
33 - Vacina utilizável para a proteção de aves
5 contra coccidiose aviária, compreendendo o antígeno de
acordo com a reivindicação 31, em uma quantidade eficaz
para imunizar a ave contra coccidiose aviária, em
combinação com um veículo farmaceuticamemte aceitável.
34 - Seqüência de DNA compreendendo um gene
10 clonado'que codifica uma proteinna antigênica que estimula
seletivamente o crescimento de células T de aves, essas
células T sendo sensibilizadas para uma proteínas da
superfície celular de merozoitos de EimECia-ACREYUlina, a
dita seqüência de DNA selecionada no grupo que consiste
15 em:
(a) clone cONA MA16: .
(b) seqüências de DNA que hibridizam a uma sonda
oligonucleotídica homóloga a um segmento de MA16 que codifica atividade estimuladora de células T, a dita sonda
compreendendo
pelo
menos
16
nucleotídios, e
(c)
seqüências de DNA
que
codificam,
na
expressão, um polipeptídio codificado na expressão por
qualquer seqüência dentro do âmbito definido por (a) e (b)
25 acima.
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441
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reivindicação 31, em uma quantidade eficaz para imunizar a
20 oligonucleotídica
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