DESENVOLVIMENTO DE UM BIOELETRODO PARA O ESTUDO IN

DESENVOLVIMENTO DE UM BIOELETRODO PARA O ESTUDO
IN VITRO DE CÉLULAS DE CÂNCER DE BOCA
Ferreira, L. F. R.1, Corrêa, C. G.1 e Silva, S. N.1
1
Depto. de Engenharia de Materiais, Centro Federal de Educação Tecnológica de Minas Gerais, Belo
Horizonte (MG), Brasil
E-mail: [email protected]
Resumo.
Este estudo trata da revisão e do desenvolvimento de um novo biomaterial que atue
como bioeletrodo no diagnóstico, e eventualmente no tratamento do câncer de boca. O
princípio de funcionamento desse dispositivo está baseado no uso de biomaterial
conjugado acoplado a um microscópio óptico com sistema de aquisição de imagem
(câmara fotográfica), uma fonte de radio frequência e transdutores para leitura dos
sinais elétricos. A análise é feita em tempo real sobre a superfície do eletrodo imerso em
cultura celular. Este dispositivo visa monitorar a cinética de adesão, distribuição e
proliferação celular comparando os dados com um controle (células normais). O número
de células de câncer de boca aderidas (linhagem CAL27) foi monitorado através da
aplicação de um campo elétrico na faixa de frequência de 10Hz a 100KHz com
amplitude de -50mV a +50mV e à temperatura ambiente. A adesão, distribuição e
proliferação dessas células foram comparadas a das células de controle epiteliais
normais (Het-1A). Foi avaliado o desempenho do bioeletrodo através da avaliação da
proliferação e citotoxidade pelo método MTT (norma ISO NBR-10993-5). A
metodologia em aprimoramento tem seu principal foco na produção do microelétrodo
capacitivo composto por substrato metálico (aço- inox 316L e/ou da liga de titânio) com
revestimento cerâmico (filme de biovidro depositado por sol-gel e de titânia pelo
processo eletroforese). A caracterização do eletrodo foi conduzida por difração de
Raios-X (DRX) e microscopia eletrônica de varredura (MEV), já avaliação biológica foi
realizada por microscopia ótica de luz transmitida (MO) para análise morfológica das
células, juntamente com a voltametria cíclica das células (fontes de tensão alternada) e
ensaios de citotoxidade do bioeletrodo (in vitro). Foram observados: 1) A correlação
dos parâmetros elétricos da voltametria cíclica aplicada in vitro para entender os
comportamentos e diferenciar as atividades das células (adesão, distribuição e
crescimento) do câncer de boca (espera-se poder associar no futuro parâmetros medidos
da impedância elétrica/eletroquímica); 2) No segundo momento, será investigada sua
aplicação como ferramenta auxiliar para as pesquisas do câncer no diagnósticos, e
possível tratamentos, menos invasivos e de baixo custo para o Serviço Único de Saúde
(SUS).
Palavras-chave: microelétrodo; sensor; células cancerígenas.
1.
INTRODUÇÃO
Uma das formas de estabelecer modelos para o entendimento e ou terapêutica
das doenças tumorais e/ou crônicas está associado ao uso de cultura de células aderentes
na superfície dos eletrodos ativos. As técnicas de impedâncias elétrica/eletroquímica
podem avaliar diretamente fenômenos histológicos
de acordo com as atividades eletroquímicas ocorridas na superfície desses eletrodos ou
na superfície do substrato pela mudança da impedância induzida (capacitância ou
resistência). Podem ser utilizados dois métodos: sem placas e em tempo real, que
elimina etapas da preparação de placas comumente utilizadas em outros métodos.
Gieaver e Keese (1984) foram os pioneiros no uso de microelétrodos medindo a
impedância induzida de células aderentes a superfície do eletrodo. Desde então, vem
sendo continuamente aperfeiçoada a técnica chamada de aferição elétrica
célula/substrato. Outros pesquisadores tem também desenvolvido vários métodos de
aferição de impedância baseados em princípios similares por contagem de células e
medindo as atividades de várias células utilizando vários desenhos de
eletrodos/substratos (Ehret et al. 1997;1998; Solly et al..2004; Atienza et al.2006;
Glamann e Hansen 2006; McGuiness 2007).
Recentemente essas técnicas de impedância tem sido aplicadas a um grande
quantidade de estudos biológicos, incluindo célula substrato (Choi et al.2007), adesão e
distribuição celular (Lo et al.1995; Luong et al.2001; Wegner et al.2000), metástases
(Keese et al.2002), transformação celular (Park et al.2009), apoptose (Arndt et al.2004)
e atividades celulares de indução de drogas (Xiao et al.2002;Xiao e
Luong 2003;Klo et al.2008;Linderholm et al.2007).
Além disso, as técnicas de impedância tem sido usadas para investigar
parâmetros relacionados à formação, diferenciação e morfológico célula-célula e célulasubstrato (Giaever e Keese 1991,1993; Lo et al.1999; Burns et al.2000; Kataoka et
al.2002).
Particularmente,nos últimos anos as técnicas de impedância tem ganho especial
atenção no campo do estudo da célula tumorais câncer, sobretudo no desenvolvimento
de drogas mais eficazes, diagnóstico prematuro ou ainda na terapêutica com aplicação
de campos elétricos cíclicos (Solly et al.2004; Chen et al.2008; Lin et al.2009). Os
avanços na tecnologia de micro-fabricação tem tornado possível fabricar dispositivos
para o estudo de impedância de poucas células e até mesmo para um só célula (Han et
al.2006, Han e Frazier 2006; Asphahani et al.2008;Thein et al.2010).
2.
REVISÃO E CONTEXTUALIZAÇÃO.
Os eletrodos microsensores (IME) fabricados por microlitografia são uma das
mais promissoras e convenientes plataformas digitalizáveis de medir as impedâncias em
sistema com uma arquitetura que encontram um grande potencial para aplicação em
medicina, incluindo diagnóstico e procedimentos terapêuticos para detecção de uma
diversidade de biomoléculas (Van Gerwen et al.1988;Laureyn et al.2000; Rahm et
al.2007) e para os comportamentos do monitoramento celular (Ehret et al.1997;1998;
Linderholm et al.2007).
O termo (IMES) tem sido designado para uso em detecção de uma única célula
diâmetros de 1-10micra (Huang e Rubinsky 2001) ou para uma população de células
10-500 micra (Yang et al.2004). Além de ser utilizado em medidas de impedância o
microelétrodo interdigitado tem sido extensamente utilizado para gerador-coletor
eletroquímicamente na detecção de substâncias químicas e biomoléculas (Inasaki e
Morita 1995; Senior et al. 2001; Tomcik et al.2006; Laczka et al.2010).
Esses microeletrodos ou biossensores são de fácil fabricação e de alta
sensibilidade em relação aos eletrodos (sensores) convencionais. No estudo de células
com câncer a adesão celular para matriz extracelular é importante na identificação de
metástase tumoral em estágios bem definidos.
A cultura de células de câncer de boca (OSCC) sobre a superfície do eletrodo e
as medidas de impedância podem comprovar informações importantes sobre o
comportamento/atividades relatadas para adesão celular na superfície do mesmo.
Estão disponíveis no mercado alguns aparelho para medir a impedância em
tempo real (entre eles o RT-CES da ACEA Bioscience, CA/USA), usado para estudar
os comportamentos das células de câncer de boca, esses microelétrodos reconhecem o
potencial eletroquímico das células aderidas, células em processo anômalos de
crescimento/proliferação (acentuada demanda por nutrientes), além de
biomacromoléculas que induzem angiogênese/metástase (expressão de fatores
ativadores e inibidores) ou inibem a apoptose nestas células tumorais.
Também é usada a mesma técnica de impedância de tempo real para distinguir
células de câncer de boca e células epiteliais de boca pelo monitoramento da
impedância baseada no número de células durante a distribuição e a aderência ao
eletrodo e seu potencial típico ao longo do ciclo celular (Yang et al. 2010a).
Os biossensores têm se mostrado bastante úteis nestas aplicações biomédicas.
Neste sentido, o desenvolvimento no país de um sistema de diagnóstico de câncer de
boca tem uma grande importância para pacientes de baixa renda atendidos pelo Serviço
Único de Saúde (SUS). Atualmente existem no mercado farmacêutico biossensores para
o ensaio clínico de vários hemometabólicos, como glicose, colesterol e triglicérides,
testes de gravidez (HCG), dentre outros. Entretanto, os biossensores são ainda de custo
elevado para a população de baixa renda de nosso país. Considerando-se o custo do
aparelho (amplificadores operacionais e filtros eletrônicos) com biossensor
(microelétrodos) para determinação do câncer, no mercado internacional da ordem
centenas de milhares de dólares apenas custo do aparelho (circuito digitalizador de
sinais), enquanto o custo dos microelétrodos é de milhares de dólares. Um biossensor é
formado essencialmente por uma camada depositada sobre um eletrodo em geral
condutor. Uma vez que o filme cerâmico tem grande dificuldade para ser depositado
diretamente sobre os metais, pois esta poderia ser inativada (impedância de contato
devidos defeitos interfaciais metal/cerâmica), novos materiais ou processos são
sintetizados para que possam desempenhar melhor a função de suportes para o
biocatalisador, e ao mesmo tempo mediadores para o transporte de elétrons na interface.
Neste contexto, as pesquisas para o desenvolvimento e a caracterização de materiais
sintéticos que possam vir a fazer parte do desenvolvimento de biossensores específicos
para células de determinados tumores, têm se intensificado nas últimas décadas. O
número de publicações relacionadas ao desenvolvimento de biossensores vem
evoluindo nos últimos 5(cinco) anos.
O número de pessoas que sofrem deste tipo de câncer vem aumentando
significativamente no Brasil e no mundo. A perspectiva é que esse número aumente
ainda mais devido ao desenfreado processo de urbanização e mudanças de hábito
alimentar pelo qual passa nossa sociedade. O alarmante é que no Brasil apenas a metade
dos casos clínicos são diagnosticados numa fase inicial da doença. Como um
diagnóstico precoce é sempre recomendado, a pesquisa para desenvolver sistemas
inteligentes (biossensores) para medida a presença de células ou fatores bioquímicos
relacionados a sua ocorrência na cavidade bocal tem se intensificado, visto que o
método convencional ser demorado e de elevado custo relativamente a um dispositivo
biossensor. Porém, para a população de baixa renda de nosso país a atendida pelo SUS,
o custo , bem como a manutenção de um biossensor, ainda é economicamente inviável.
2.1 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1.1 MATERAIS: Foram utilizados um biomaterial conjugado acoplado a um
microscópio óptico com sistema de aquisição de imagem (câmara fotográfica), uma
fonte de radio frequência na faixa de frequência de 10Hz a 100KHz e transdutores para
leitura dos sinais elétricos com amplitude de -50mV a +50mV. Para construção do
microelétrodo capacitivo foram utilizados placas de dois substratos metálicos: aço- inox
316L e da liga de titânio (Ti6Al4V). Foram produzidos revestimentos (filme cerâmico)
de biovidro através da técnica de sol-gel sobre o aço e um filme de titânia pelo processo
eletroforese sobre a liga de Ti. Os aspectos de produção desses sistemas bem como o
princípio de operação do biossensor/aparelho foram abordados de forma simplificada
neste trabalho, e deverão ser incrementados no futuro.
2.1.2 METODOLOGIA: A caracterização do eletrodo foi conduzida por difração de
Raios-X (DRX) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). A avaliação biológica foi
realizada por ensaios de citotoxidade do microeletrodo (in vitro) e microscopia ótica de
luz transmitida (MO) para análise morfológica das células, juntamente com a
voltametria cíclica das células (fontes de tensão alternada).
O teste de citotoxicidade "in vitro" está classificado na ISO 10993-5 (avaliação
de cultura de células e a toxicidade celular). A citotoxidade é o efeito prejudicial ou
nocivo não desejado induzido pelo biomaterial no sistema da cultura de celulas in vitro.
Uma linhagem celular (Het-1) de tecido conjuntivo normal foi semeada sobre o
microelétrodo e incubadas sendo avaliado sua citotoxicidade. O índice de zona (IZ), que
corresponde à área ou zona clara onde as células não foram coradas pelo sal tetrasólico
(método MTT). As amostras foram testadas em quadruplicatas em placas separadas. O
procedimento foi replicado com o mesmo número de células de câncer de boca aderidas
(linhagem CAL27) sendo ambos monitorado através da aplicação de um campo elétrico
na faixa de frequência de 10Hz a 100KHz com amplitude de -50mV a +50mV e à
temperatura ambiente. A adesão, distribuição e proliferação dessas células foram
comparadas a das células de controle epiteliais normais (Het-1A). A análise
desempenho do microelétrodo foi realizado através da avaliação da proliferação e
citotoxidade.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Entretanto, apenas um único instrumento de medida foi capaz de identificar
todas as células (estimativa do número de células) baseado na variação da impedância
sem a separação dos seus componentes (resistência e capacitância) existentes entre a
membrana citoplasmática (capacitância) e o citosol (resistência ôhmica). Sabe-se que a
adesão celular na superfície do eletrodo poderia induzir uma variação tanto na
resistência como na capacitância (Mamouni e Yang 2011).
A habilidade de monitorar variações em cada componente pode seguir uma
análise detalhada dos comportamentos na superfície do eletrodo/substrato (Wegener et
al.2000). Os microeletrodos acoplados a um aparelhos de emissão e leitura (IMEs) são
usados para o estudo dos comportamentos de células de câncer de boca (OSSC). Esses
IMEs utilizam o principio da espectroscopia de impedância eletroquímica (com e sem
sonda redox [Fe(CN)6] -3/-4), através da voltametria cíclica (Mamouni e Yang 2011), e
são capazes de avaliar a relação entre a impedância medida e os próprios dados dos
circuitos equivalentes indicando mudanças na resistência ou na capacitância durante a
análise de adesão, distribuição e crescimento celular sobre os microelétrodos.
As atividades das células de câncer de boca e as variações obtidas nos seus
componentes (resistência e capacitância) são correlacionadas com a voltametria cíclica.
A pesquisa demonstra que o uso de aproximações eletroquímicas para se entender
comportamento celulares/atividades das células potencializa a diferença entre células
com câncer de boca e as células normais buscando efetivamente a prevenção e
tratamento de câncer de boca (Mamouni e Yang 2011).
Uma carga elétrica provoca a formação de uma região de ação de um campo
elétrico que exerce uma força capaz de ser sentida por outra carga. Os campos elétricos
neste caso foram gerados através de um capacitor (ou condensador) até de um circuito
RC equivalente. Assim estabelece-se entre o microelétrodo/célula(s) um campo elétrico
(E), cujo valor dependerá da diferença de potencial V(ddp) e a distância (d) que separa
segundo a relação V=E.d.(Volt.cm). As linhas de campo se direcionam ao sentido das
cargas positivas para as cargas negativas (normalmente as células apresentam uma carga
liquida positiva na sua membrana). As células vivas são compostas por íons, moléculas
carregadas ou polarizadas e organelas que geram correntes elétricas e campos elétricos
em torno de 0-10K Volts/cm, e monitoramentos celulares cujos campos elétricos podem
chegar à ordem de 10.000 Volts/cm. Na voltametria cíclica são gerados campos
elétricos alternados através de uma fonte de rádio frequência (tensão
V=Vmáx.seno(w.t), onde Vmáx.= tensão máxima, w=frequência angular relacionada a
frequência) .
O resultado desta espectroscopia de impedância eletroquímica é função da
resistência, da capacitância e da indutância em comparação com dados de controles
positivo e negativo. Neste caso considerando-se apenas a oposição que os capacitores
fazem ao fluxo de corrente e teremos a reatância capacitiva que deve ser combinada
com a resistência para encontrar a impedância do sistema com células aderidas,
juntamente com expressão de receptores (vasculogênese/angiogênese) para VEGF e
seus ligantes. A reatância capacitiva é inversamente proporcional a frequência.Como a
fase afeta a impedância se utiliza vetor bidimensional destinado a representar uma onda
em movimento harmônico simples para desenvolver expressões para impedância cuja a
unidade é dada em (Ohms) . O significado da impedância pode ser entendido ao
aplicação da Lei de Ohm onde I=V/Z sendo as unidades I(Ampére),V(Volts) e a
impedância Z (Ohms).
A inibição ou estimulação de processos celulares por biossensores
elétricos/eletroquímicos revela os mecanismos básicos desta interação e tem a sua
aplicação em diferentes alvos como proliferação celular, reações enzimáticas, vias de
morte celular e transporte de membrana. Envolvidas por dupla camada lipídica as
moléculas de proteína intermediam a maioria das funções da membrana, inclusive as
funções de transporte de moléculas específicas para dentro ou para fora da célula. A
membrana celular atua como sensor na recepção de estímulos externos. Os organismos
vivos respondem aos estímulos promovendo mudanças celulares e moleculares
dependentes da duração da exposição, da penetração do tecido e do aquecimento, que se
relaciona à frequência e intensidade do estímulo. As respostas celulares também
dependem do tipo de campo elétrico, tipo de onda e das condições biológicas e do tipo
de células expostas.
Foram verificados efeitos inibitórios do campo elétrico alternado sobre a razão
de crescimento de várias linhagens dos seguintes tumores humanos: melanoma , os
gliomas U-118 e U-87, pulmão H-1299,mama MDA 231, próstata PC3, murinos ou
melanoma B16F1 e os gliomas F98,C-6 e RC-2.
As implicações deste afeto nas células normais/tumorais em divisão são que
enquanto as células endoteliais são quiescentes ou deixadas intactas, um mecanismo de
atraso do processo mitótico e destruição das células ocorrem durante a divisão do
citoplasma (citocinese) na fase M (Mitótica) do ciclo celular.
A aplicação de campo elétrico na forma de pulsos (eletroquimioterapia) é citado
na literatura (Edhemovic et al.2001) como indicação de inibição metástases ou
destruição de tumores, após tratamento quimioterápico, radioterápico e sem
possibilidade de acesso cirúrgico. Nestes estudos é informado que as metástases foram
eliminadas sem efeitos colaterais secundários, mesmo diante da complexidade deste
campo do conhecimento, que normalmente envolve pesquisas interdisciplinares entre o
especialista da área médica e das ciências exatas.
Neste sentido, o custo elevado e a incipiente tecnologia existente em nosso país
referente ao desenvolvimento de biossensores nos motivam a iniciar a pesquisa de um
biossensor para a monitoração do câncer de boca. O princípio de funcionamento de um
biossensor é norteado por vários princípios da eletroquímica, da biologia celular e
molecular.
3. CONCLUSÃO
O número de células de câncer de boca aderidas (linhagem CAL27) foi
monitorado com sucesso pela aplicação de um campo elétrico na faixa de frequência de
10Hz a 100KHz com amplitude de -50mV a +50mV e à temperatura ambiente. A
adesão, distribuição e proliferação dessas células foram comparadas a das células de
controle epiteliais normais (Het-1A), sendo avaliado o desempenho do microelétrodo
através da avaliação da proliferação e citotoxidade (método MTT). Durante a
voltametria cíclica das células foram observados: a relacionação dos parâmetros
elétricos da voltametria cíclica aplicada (espera-se poder associar no futuro parâmetros
medidos da impedância elétrica/eletroquímica) para entender os comportamentos e
diferentes atividades das células (adesão, distribuição e crescimento) do câncer de boca;
Até o momento é possível especular sua aplicação como ferramenta auxiliar para as
pesquisas do câncer no diagnósticos, e também no tratamento pouco invasivo em
paciente do SUS.
AGRADECIMENTOS
Ao CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE MINAS
GERAIS- CEFET MG /DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE MATERIAIS
FAPEMIG – FUNDAÇÃO DE AMPARO A PESQUISA DE MINAS GERAIS e a
CAPES pela bolsa de estudo.
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DEVELOPMENT OF A BIOELECTRODE FOR IN VITRO STUDY
OF MOUTH CANCER CELLS
Ferreira, L. F. R.1, Corrêa, C. G.1 e Silva, S. N.1
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Depto. de Engenharia de Materiais, Centro Federal de Educação Tecnológica de Minas Gerais, Belo
Horizonte (MG), Brasil
E-mail: [email protected]
Abstract. This study is a revision and deals with development of a new biomaterial that acts as
bioelectrode in the diagnosis and possibly treatment of oral cancer. The principle of operation of this
device is based on the use of biomaterial conjugate coupled to an optical microscope imaging system
(camera), a source of radio frequency transducers and for reading electrical signals. The analysis is done
in real time on the surface of the electrode immersed in cell culture. This device aims to monitor the
kinetics of adherence, distribution and cell proliferation comparing the data with a control (normal
cells). The number of oral cancer cells adhered (CAL27) was monitored by applying an electric field in
the frequency range from 10Hz to 100KHz with amplitude of-50mV to +50 mV and at room temperature.
The adherence, distribution and proliferation of these cells were compared to the control normal
epithelial cells (Het-1A). The performance of bioelectrode by assessing the proliferation and cytotoxicity
by MTT assay (NBR-ISO 10993-5). The methodology has its primary focus enhancement in the
production of capacitive microelectrode comprising the metal substrate (stainless steel 316L and / or
titanium alloy) with ceramic coating (bioglass film deposited by sol-gel process and TiO2 by
electrophoresis). The characterization of the electrode was conducted by X-ray diffraction (XRD) and
scanning electron microscopy (SEM), as biological evaluation was performed by transmitted light optical
microscopy (OM) for morphological analysis of cells, together with the cyclic voltammetry of cells
(source of alternating voltage) and test bioelectrode cytotoxicity (in vitro). Were observed: 1) the
relatedness of the electrical parameters of the applied cyclic voltammetry (hopefully in the future be able
to associate the measured parameters of the electrical impedance / electrochemical) to understand the
behaviors and activities of different cells (adherence, distribution and growth) of oral cancer and 2) the
second time, your application will be investigated as an auxiliary tool for research in cancer diagnosis
and possible treatments, less invasive and low cost to the National Health Service (SUS).
Keywords: microelectrode; sensor; cancer cells.