Pró-Reitoria Acadêmica Escola de Saúde e Medicina Programa de

Pró-Reitoria Acadêmica
Escola de Saúde e Medicina
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências
Genômicas e Biotecnologia
ANÁLISE DO METAGENOMA VIRAL DE AMOSTRAS DE
FEZES HUMANAS DO DISTRITO FEDERAL
Autor: Rayane Nogueira dos Santos
Orientador: Prof. ª Dr.ª Cristine Chaves Barreto
Coorientador: Prof.ª Dr.ª Paula Andréia Silva
Brasília - DF
2015
RAYANE NOGUEIRA DOS SANTOS
ANÁLISE DO METAGENOMA VIRAL DE AMOSTRAS DE FEZES HUMANAS DO
DISTRITO FEDERAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós –
Graduação Stricto Sensu em Ciências
Genômicas e Biotecnologia da Universidade
Católica de Brasília, como requisito parcial
para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Genômicas e Biotecnologia.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Cristine Chaves
Barreto.
Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Paula Andréia Silva.
Brasília
2015
S237a
Santos, Rayane Nogueira dos.
Análise do metagenoma viral de amostras de fezes humanas do
Distrito Federal. / Rayane Nogueira dos Santos – 2015.
46 f.; il.: 30 cm
Dissertação (Mestrado) – Universidade Católica de Brasília, 2015.
Orientação: Profa. Dra. Cristine Chaves Barreto
Coorientação: Profa. Dra. Paula Andréia Silva
1. Biotecnologia. 2. Metagenoma viral. 3. Viroma. 4. Patógenos virais. I.
Barreto, Cristine Chaves, orient. II. Título.
CDU 606
Dissertação de autoria de Rayane Nogueira dos Santos, intitulada “ANÁLISE DO
METAGENOMA VIRAL DE AMOSTRAS DE FEZES HUMANAS DO DISTRITO
FEDERAL” apresentada como requisito parcial para obtenção de grau de mestre em Ciências
Genômicas, em 27/03/2015, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
_______________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Cristine Chaves Barreto
Orientadora
(Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia – UCB)
_______________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Paula Andréia Silva
Coorientadora
(Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia – UCB)
_______________________________________________________
Prof.º Dr.º Robert Edward Pogue
Membro Interno
(Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia – UCB)
_______________________________________________________
Prof.º Dr.º Tatsuya Nagata
Membro Externo
(Biologia Celular – UnB)
____________________________________________________
Prof.º Dr.º Fernando Lucas de Melo
Suplente
(Biologia Celular – UnB)
Brasília
2015
Dedico este trabalho aos meus pais, irmão,
marido e toda família por todo amor,
carinho e apoio demonstrado e aos meus
amigos pelas palavras de incentivo!
RESUMO
SANTOS, Rayane Nogueira dos. Análise do metagenoma viral de amostras de fezes
humanas do distrito federal. 2015. 46 folhas. Mestrado em Ciências Genômicas e
Biotecnologia – Universidade Católica de Brasília, 2015.
A gastroenterite aguda, especialmente em países em desenvolvimento, é uma
importante causa de mortalidade e morbidade, que atinge pessoas de todas as classes sociais.
O conhecimento do agente etiológico nestas infecções auxilia a escolha da estratégia de
tratamento, como também direciona estudos epidemiológicos para medidas de controle e
prevenção de doença, como o desenvolvimento de vacinas e testes diagnósticos. Abordagens
metagenômicas possibilitam a detecção de sequências virais, para determinar a população
viral presente nas fezes. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o viroma de fezes
humanas em 4 grupos distintos, sendo composto por amostras fecais diarreicas de crianças,
diarreicas de adultos, não diarreicas de adultos e de imunocomprometidos, identificando
prováveis patógenos envolvidos nos quadros de gastroenterite. O método de execução da
metagenômica viral consistiu na semi-purificação, extração de RNA e DNA, amplificação do
RNA e DNA, construção da biblioteca, sequenciamento e análises dos dados por
bioinformática. Na análise do primeiro grupo houve detecção de bacteriófagos, astrovírus e
torque teno vírus; no segundo grupo foram identificados, entre outros, bacteriófagos,
adenovírus e torque teno vírus; no terceiro grupo vírus da família Circoviridae e de
bacteriófagos; no quarto grupo adenovírus, torque teno vírus, gyrovirus e papilomavírus
humano. Esses resultados enfatizam o que tem se identificado na literatura e fornece
evidência de que a metagenômica viral tem facilitado os avanços no campo da virologia,
sendo esta, uma técnica sensível para a detecção de vírus que não podem ser identificados por
cultura tradicional.
Palavra – chave: Metagenoma viral. Viroma. Patógenos virais.
ABSTRACT
Acute gastroenteritis, especially in developing countries, is a major cause of mortality
and morbidity, which affects people of all social classes. The knowledge of etiological agent
assists the choice of a treatment strategy, but also directs epidemiological studies for control
measures and disease prevention, as the development of vaccines and diagnostic tests.
Metagenomic approaches enable the detection of viral sequences to determine the virus
population present in the stool. The objective of this study was to evaluate the viroma of
human feces in 4 distinct groups, consisting of diarrheal stool samples from children,
diarrheal from adults, no diarrhea from adults and immunocompromised, identifying likely
pathogens involved in cases of gastroenteritis. The viral metagenomic execution method
consists of the semi-purification, extraction of RNA and DNA, amplification of RNA and
DNA, library construction, sequencing and analysis of the data by bioinformatics. In the
analysis of the first group were detecting bacteriophages, astrovirus and torque teno virus; in
the second group were identified, among others, bacteriophages, adenoviruses and torque teno
virus; the third group of viruses Circoviridae family and bacteriophages; in the fourth group
adenovirus, torque teno virus, gyrovirus and human papillomavirus. These results emphasize
what has been identified in the literature and provides evidence that viral metagenomics has
facilitated advances in the field of virology, for being a sensitive technique for the detection
of viruses which can not be identified by traditional culture.
Keyword: Viral Metagenome. Virome. Viral pathogens.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Comparação entre genoma, pan-genoma e metagenoma..........................................13
Figura 2. Método geral de execução da metagenômica viral....................................................15
Figura 3. Análise de qualidade das amostras realizada no Bioanalyser: A) Biblioteca de cDNA
(fragmentos de cerca de 470 pares de bases); B) Biblioteca de amplificação de DNA
(fragmentos de cerca de 550 pares de bases)............................................................................29
Figura 4. Relação entre as frequências e os tamanhos dos contigs nos 4 grupos. Grupo1- com
amostras diarreicas de crianças; Grupo 2- com amostras diarreicas de adultos; Grupo 3- com
amostras não diarreicas de adultos; Grupo 4- com amostras de indivíduos HIV+...................31
Figura 5. Relação dos contigs com/sem correspondência com o banco de dados viral. A)
Grupo com amostras diarreicas de crianças; B) Grupo com amostras diarreicas de adultos; C)
Grupo com amostras não diarreicas de adultos; D) Grupo com amostras de indivíduos
HIV+.........................................................................................................................................32
Figura 6. Distribuição dos contigs classificados em nível taxonômico de família, nos
diferentes grupos estudados: Grupo1- com amostras diarreicas de crianças; Grupo 2- com
amostras diarreicas de adultos; Grupo 3- com amostras não diarreicas de adultos; Grupo 4com amostras de indivíduos HIV+............................................................................................33
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sequenciamento obtido em número de pares de bases e reads por amostra –
experimento piloto....................................................................................................................30
Tabela 2. Sequenciamento obtido em número de pares de bases e reads por amostra.............30
Tabela 3. Avaliação dos contigs para cada amostra..................................................................31
Tabela 4. Número de espécies nos quatro grupos....................................................................34
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 10
2.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 11
2.1- MICROBIOTA HUMANA ....................................................................................................... 11
2.2- GASTROENTERITES VIRAIS ................................................................................................ 12
2.3- METAGENÔMICA ................................................................................................................... 13
2.4- SEQUENCIAMENTO DE ALTO DESEMPENHO ................................................................. 16
2.5- BIOINFORMÁTICA ................................................................................................................. 17
2.6- O VIROMA ............................................................................................................................... 18
2.7- BACTERIÓFAGOS E VIROMA HUMANO ........................................................................... 21
3.
JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 23
4.
OBJETIVOS .................................................................................................................... 24
4.1- OBJETIVO GERAL: ................................................................................................................. 24
4.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ................................................................................................... 24
5.
METODOLOGIA ........................................................................................................... 25
5.1- AMOSTRAGEM ....................................................................................................................... 25
5.2- SEMI- PURIFICAÇÃO ............................................................................................................. 26
5.3- EXTRAÇÃO E AMPLIFICAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO (RNA e DNA) .................. 26
5.4- BIBLIOTECA E SEQUENCIAMENTO................................................................................... 26
5.5- ALINHAMENTO ...................................................................................................................... 27
6.
RESULTADOS ................................................................................................................ 29
6.1- EXPERIMENTO PILOTO ........................................................................................................ 29
6.2- COMPARAÇÃO ENTRE OS GRUPOS DO ESTUDO ........................................................... 30
7.
DISCUSSÃO .................................................................................................................... 35
8.
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ............................................................................ 40
9.
REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 41
10
1. INTRODUÇÃO
A diarréia é um importante problema de saúde pública em todo o mundo, sendo que
em até 40% dos casos, agentes etiológicos como bactérias, vírus e protozoários não são
identificados. Estima-se que na maioria destes casos os vírus sejam os agentes causais dessas
infecções. A detecção destes agentes é realizada tradicionalmente por isolamento em meio de
cultura celular, mas, no entanto, muitos vírus não são cultiváveis.
As primeiras análises metagenômicas de uma comunidade viral, do viroma, de fezes
humanas foi realizada por Breitbart et al (2003), e as informações adquiridas foi que a maioria
das sequências era desconhecida, e os vírus identificados eram bacteriófagos, principalmente
da família Siphoviridae. Estudos posteriores, como os de Reyes et al, (2010), Minot et al,
(2011) e Kim et al, (2011), enfatizaram estes dados, pois, a maioria das sequências não
tinham correspondência com vírus presentes nos banco de dados, e que a comunidade viral
era composta, principalmente, por bacteriófagos.
Métodos mais recentes como a metagenômica possibilitam a detecção de sequências
genômicas virais e tem superado as principais limitações clássicas para a detecção viral.
Assim, as abordagens metagenômicas têm o potencial para identificar e explorar a diversidade
viral presente nas fezes, além de avaliar se estes agentes desempenham um papel causal na
diarréia humana. Dessa forma, compreender o viroma, ou seja, a diversidade viral da
microbiota requer uma análise profunda de sua composição, e compreender a estrutura
populacional da microbiota intestinal em humanos trará implicações importantes para a saúde
humana.
Nesse sentido, este estudo realizou o metagenoma a partir de fezes de 12 indivíduos
que foram divididos em 4 grupos, com o intuito de compreender o viroma de cada um deles.
No grupo de pacientes imunodeprimidos, como os portadores de HIV, a análise
metagenômica pode identificar agentes que não seriam facilmente encontrados em pacientes
com imunidade normal; no grupo de indivíduos adultos e no grupo de crianças com quadros
gastroentéricos há a possibilidade de se identificar patógenos entéricos, causadores de
diarréia; já no grupo de adultos saudáveis há a possibilidade de identificar vírus que
participam da microbiota normal dos indivíduos.
11
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- MICROBIOTA HUMANA
O ser humano durante a gestação é essencialmente estéril, mas, após o nascimento,
cada superfície do corpo, incluindo a pele, boca e intestino são colonizados por uma enorme
variedade de microrganismos. No corpo humano existem aproximadamente 100 trilhões de
microrganismos habitando a superfície interna e externa. O conjunto de todas essas
comunidades forma a microbiota humana, que varia muito nas mais diversas regiões do nosso
corpo, dependendo de condições como umidade, pH, temperatura e nutrientes disponíveis.
Nas regiões mais úmidas e quentes encontram-se uma maior concentração de
microrganismos, enquanto que nas regiões mais secas, existe uma quantidade menor delas
(MORGAN et al, 2012, RIBEIRO et al, 2014).
A maior parte dos esforços sobre a microbiota foi inicialmente centrado sobre os
agentes patogênicos humanos, tais como as bactérias. O campo da bacteriologia já está em
desenvolvimento há muitos anos, assim, estudos em larga escala, com o gene 16S RNA
ribossomal revelou a predominância de dois filos bacterianos, no trato gastrointestinal, o
Firmicutes e Bacterioides, e que constituem em mais de 90% das categorias filogenéticas
conhecidas, em seguida são os filos Proteobacteria, Actinobacteria e Fusobacteria. No
entanto, ainda são necessários mais estudos a respeito da diversidade de vírus no microbioma
humano (Qin et al, 2010).
O trato respiratório humano, por exemplo, entra em contato com milhões de partículas
em suspensão a cada dia, incluindo os vírus, e pouco se sabe sobre a microbiota das vias
aéreas superiores e inferiores. Em outros locais, como no intestino, a diversidade dos vírus e
seu papel na manutenção e adaptação da microbiota também continuam obscuros (WILLNER
et al, 2009; REYES et al, 2010). Assim, compreender o papel dessas populações, dita como
“viroma humano” requer uma compreensão muito mais profunda de sua composição e
interação com outros seres vivos (MINOT et al, 2013). Estas comunidades microbianas são
de vital importância para a saúde, e o seu estudo leva a um melhor conhecimento da sua
dinâmica complexa, que ainda pode conduzir ao desenvolvimento de novas formas de
diagnóstico e até mesmo de tratamento de certas patologias. (RIBEIRO et al, 2014).
Antigamente a maioria dos estudos ignorava a população viral do intestino, e isso
ocorre porque se pensava que o viroma era menos importante para a saúde e imunidade, até
mesmo pela quantidade mínima que se encontra. A partir dos estudos sobre a diversidade
viral, foi visto que a maioria dos vírus identificados são os bacteriófagos, uma vez que se sabe
12
que os bacteriófagos afetam apenas as bactérias. No entanto, a comunidade científica está
começando a perceber que os vírus presentes podem ser importantes para a saúde humana, ou
seja, da forma com que manipulam a microbiota e por meio da interação com o sistema imune
do hospedeiro (HUNTER, 2013).
2.2- GASTROENTERITES VIRAIS
A gastroenterite aguda é uma doença de ocorrência universal, que atinge pessoas de
todas as classes sociais. É uma síndrome clínica caracterizada por alterações no volume e
consistência das fezes, mas comumente associada com a liquidez das fezes e aumento no
número de evacuações. É frequentemente acompanhada de outros sintomas como vômito,
febre e cólica abdominal, podendo até apresentar muco e sangue (SILVA et al, 2004). São as
principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, numa estimativa de quase
1,5 milhões de mortes anuais de crianças até 5 anos. No Brasil, a diarréia aguda tem relação
direta às condições de vida e saúde dos indivíduos, por exemplo, saneamento básico e
desnutrição (BRASIL, 2010; Paz et al, 2012).
O diagnóstico para essas infecções é complexo, devido a grande variedade de agentes
patogênicos, que podem apresentar os mesmos sintomas clínicos. Estima-se que, em média,
40% dos casos de diarréia são de etiologia desconhecida (NAKAMURA et al, 2009;
FINKBEINER et al, 2009). Apesar dos avanços no campo do diagnóstico, muitas síndromes
não têm sido associadas com um agente causal, embora tenham sido utilizados extensos testes
de diagnóstico convencionais (CASTRIGNANO et al, 2013). Os mais frequentes agentes
etiológicos relacionados com quadros diarreicos são os vírus (rotavírus, norovírus, astrovírus
e adenovírus), seguidos das bactérias e parasitas (FINKBEINER et al, 2009).
Doenças
diarreicas
também
apresentam
importância
em
indivíduos
imunocomprometidos, uma vez que o organismo diminui sua capacidade natural de defesa
contra qualquer antígeno e assim, os vírus podem estar se replicando com maior facilidade
nesses indivíduos (BRASIL, 2014).
A gastroenterite aguda, a infecção respiratória aguda e a encefalite infecciosa, juntas,
tem uma média de 30 % de casos onde não se tem um agente etiológico identificado, embora
extensos testes de diagnóstico tenham sido utilizados, assim, muitos destes agentes podem ser
vírus ainda não identificados (CASTRIGNANO et al, 2013). A dificuldade em identificar
esses patógenos pode levar a um tratamento clínico indevido, permitindo a administração
equivocada de medicamentos (BIBBY, 2013).
13
Em meados da década de 2000, duas vacinas para rotavírus se tornaram disponíveis,
uma vacina monovalente RV e outra pentavalente. Ambas as vacinas são recomendadas pela
Organização Mundial de Saúde, sendo utilizadas em vários países. Estudos têm demonstrado
uma redução significativa de hospitalização e mortalidade devido à gastroenterite por
rotavírus. O Brasil foi um dos primeiros países a introduzir a vacinação universal contra
Rotavírus A, Rotarix®, que foi fornecido gratuitamente pelo sistema de saúde pública desde
março de 2006. O número de casos positivos para rotavírus diminuiu substancialmente desde
então, enquanto outros patógenos agora são relatados com mais frequência (RABONI et al,
2014).
Existem cerca de 200 espécies de patógenos virais humanos reconhecidos e outras
espécies continuam a ser descobertas a uma taxa de quase duas por ano. Alguns vírus têm o
potencial de se transformar rapidamente, como, por exemplo, na epidemia de gripe aviária e
suína. (BIBBY, 2013).
2.3- METAGENÔMICA
O termo genoma, criado em 1920, por Hans Winkler, designa toda a informação
hereditária de um organismo que está codificada no seu DNA (ou, em alguns vírus, no RNA),
isto inclui também as sequências não codificadoras. O pan - genoma compreende a análise
dos conjuntos de genes de todas as estirpes de uma espécie. Já o metagenoma, por definição, é
o conjunto de genomas isolados a partir de uma amostra (Figura 1) (CATANHO et al, 2010;
HANDELSMAN et al, 1998).
Figura 1: Comparação entre genoma, pan-genoma e metagenoma.
Fonte: Nature Reviews Microbiology/ AOP, publicado online em 13/05/2008.
14
Os vírus são microrganismos que contribuem para os ciclos de vida de organismos
celulares, pois, influenciam nos ciclos biogeoquímicos e impulsionam a evolução microbiana
no solo, no oceano e nos seres vivos (ROHWER et al, 2009). No entanto, o estudo da
ecologia viral e a compreensão da diversidade de vírus em ambientes naturais tem sido
limitado, devido às dificuldades de cultura viral aliado à falta de genes evolutivamente
conservados, tal como o gene do RNA ribossomal 16S em procariotos, compartilhado por
todas as bactérias e archaea (KIM et al, 2013; KLINGENBERG et al, 2013; LORENZI et al,
2011; WOMMACK et al, 2012).
Por métodos tradicionais, os agentes virais são detectados por isolamento através de
cultura celular, em que as monocamadas de células apresentam os efeitos citopáticos, ou por
meio de testes de neutralização de anticorpos. No entanto, muitos tipos virais não são
cultiváveis, assim, a identificação viral e os métodos de diagnóstico tradicionais de pesquisa
são limitados, impossibilitando uma visão completa da diversidade viral. No decorrer das
últimas décadas, métodos enzimáticos e moleculares, tais como ensaio imunoenzimático
(ELISA) e PCR foram utilizados para detectar e estudar os vírus não cultiváveis (BIBBY,
2013).
Considerando que a compreensão da ecologia viral das amostras é importante para a
virologia clínica e diagnóstica e que existe a limitação técnica para detecção viral, métodos
como a metagenômica tem sido utilizados para aumentar o conhecimento a cerca de
comunidades virais em vários ambientes naturais (KIM et al, 2013; PALLEN, 2014), pois,
essas abordagens possibilitam a detecção de sequências genômicas de muitos vírus, até então
desconhecidos em amostras humanas. Assim, atualmente a metagenômica viral é uma técnica
poderosa e sensível para a detecção de vírus, e tem superado as principais limitações clássicas
para a detecção viral, pois, como explicado anteriormente, os ácidos nucleicos virais podem
ser acessados sem a necessidade do isolamento dos vírus. O interesse na metagenômica viral é
também na capacidade para confirmar a presença de vírus patogênicos conhecidos, mesmo
com concentrações baixas (KIM et al, 2013; FANCELLO et al, 2012).
O método geral de execução da metagenômica viral pode ser realizado com a semipurificação de partículas virais, extração de DNA e RNA viral, obtenção de cDNA (DNA
complementar) utilizando transcriptase reversa para vírus com genoma de RNA, amplificação
de DNA e cDNA, fragmentação dos ácidos nucléicos para construção da biblioteca,
sequenciamento e análise dos dados gerados (Figura 2) (BIBBY, 2013).
15
Figura 2: Método geral de execução da metagenômica viral.
Semi-purificação
de partículas
virais
Extração de RNA
e DNA
Amplificação de
RNA e DNA
Construção da
biblioteca
Sequenciamento
Análises dos
dados por
bioinformática
A etapa inicial do metagenoma viral é a semi - purificação de partículas virais, feitos
basicamente por filtrações, seguida de centrifugações (BIBBY, 2013). Assim, para que a
extração de ácidos nucleicos de vírus seja mais eficiente, a utilização da filtragem feita por
filtros de 0,45 e/ou 0,22 µm se torna necessária, para eliminar a contaminação por células
hospedeiras e por outros microrganismos, pois, partículas virais, em geral, são menores do
que os organismos eucarióticos. Uma contaminação resultaria no sequenciamento também
desses genomas maiores, se transformando numa ''máscara'' nas sequências virais que por
competição poderiam subestimá-las. Outro ponto relevante na execução da metagenômica é a
amplificação dos ácidos nucleicos antes do sequenciamento, pois, a extração viral resulta
numa pequena quantidade de ácidos nucleicos, assim, a amplificação pode facilitar a detecção
dos vírus nas amostras (FANCELLO et al, 2012). No entanto, esse procedimento impede
análises a cerca da carga viral presente na amostra (KIM et al, 2013).
16
2.4- SEQUENCIAMENTO DE ALTO DESEMPENHO
A etapa de sequenciamento pode ser realizada por diversas plataformas, sendo as
novas tecnologias denominadas de sequenciamento de nova geração (NGS), comercializadas
a partir de 2005. Essas novas tecnologias promovem o sequenciamento de DNA gerando
milhões de pares de bases em um único ciclo. Dentre as novas plataformas de
sequenciamento, duas já possuem ampla utilização em todo o mundo: a plataforma 454 FLX
da Roche e a Illumina, sendo que a plataforma Illumina gera maior quantidade de dados
sequenciados do que o 454 da Roche (CARVALHO et al, 2010).
A plataforma Roche 454 inicia sua execução com a construção de uma biblioteca, com
sequências de fragmentos de DNA de fita única com adaptadores. Os fragmentos se ligam a
esferas, a seguir ocorre amplificação nessas esferas por PCR em emulsão, a fim de aumentar a
intensidade do sinal. O ideal é que durante esse processo um único fragmento seja anexado a
cada grânulo, formando grupos uniformes em cada esfera. As esferas são depositadas sobre
uma matriz de poços, de modo que cada poço contenha uma única esfera. Após essas etapas
preparatórias, o sequenciamento começa utilizando o método de pirosequenciamento. Em
cada ciclo, uma única espécie de nucleotídeo é adicionada. Nos poços onde os nucleotídeos
foram incorporados ocorre a liberação de pirofosfato e depois há a presença de uma luz que é
detectada utilizando um sensor, identificando qual tipo de nucleotídeo foi incorporado aos
fragmentos (LEDERGERBER et al, 2010).
A plataforma Illumina é baseada na montagem de uma única biblioteca de DNA, por
fragmentação aleatória das amostras de DNA. Após a adição de adaptadores universais nos
fragmentos, estes, são espalhados em uma lâmina (conhecida como “flow cell”) com 8
linhas/pistas (conhecida como “lane”) imobilizadas em vidro. Após a amplificação por ponte
é gerado um grande número de moldes idênticos sobre a superfície do vidro (conhecido como
formação de “clusters”). Em cada ciclo, um único nucleotídeo marcado por fluorescência é
incorporado a cada cadeia complementar. Após a incorporação, o marcador fluorescente é
detectado e é gerada uma imagem, e os ciclos seguintes ocorrem da mesma forma
(LEDERGERBER et al, 2010).
Os sequenciamentos de nova geração são técnicas relativamente recentes, e o custo
elevado é um importante fator limitante, apesar de hoje terem custos menores quando
comparados com os dos primeiros sequenciamentos (CAPOBIANCHI et al, 2012).
17
2.5- BIOINFORMÁTICA
As tecnologias estão passando por uma evolução rápida e as ferramentas da
bioinformática devem ser atualizadas constantemente, para acomodar o grande volume de
dados que estão sendo obtidos (PETROSINO et al, 2009). Os recentes avanços nas
tecnologias de sequenciamento produziram uma verdadeira revolução, e possibilita novas
perspectivas para aplicações de diagnóstico e pesquisa, devido à alta quantidade de dados
gerados. (CAPOBIANCHI et al, 2012). Ou seja, estudos metagenômicos se tornaram mais
acessíveis para a comunidade científica, o que resulta num crescimento exponencial na
quantidade de dados de sequenciamento disponíveis, sendo necessária a criação de
ferramentas computacionais altamente eficientes e especializadas para lidar com esses
conjuntos de dados massivos (LORENZI et al, 2011)
A bioinformática analisa os dados gerados após a liberação dos resultados pelo
sequenciamento, e nos fornece informações para que sejam tiradas as conclusões a cerca da
população viral. Essa etapa consiste na utilização de técnicas computacionais e matemáticas
relacionadas ao conhecimento químico, físico e biológico para processar suas informações a
respeito de genes, proteínas, enzimas, bem como alinhamento de sequências e montagem de
árvores filogenéticas. Consiste ainda, numa ciência muito dinâmica e novos programas estão
continuamente sendo criados para gerir os novos dados de NGS (FANCELLO et al, 2012).
No sequenciamento há a produção de sequências curtas, denominadas de “reads”, mas
por poder tornar as buscas mais difíceis, talvez, seja necessária a montagem prévia de
sequências mais longas, que são formadas a partir da sobreposição dos reads, denominadas de
“contigs” e então são alinhadas com genomas ou genes de referência, geralmente depositados
nos bancos de dados como, por exemplo, no GenBank do site do NCBI (National Center for
Biotechnology Information) (BIBBY, 2013).
Em particular, os vírus geralmente não são bem representados por bancos de dados
atuais, pois faltam muitas informações sobre diversos vírus, o que torna difícil obter
estimativas realistas da abundância correspondente. Considerando a imensa diversidade e a
variação de genomas, os vírus são notoriamente sub-representados nos bancos de dados
(KLINGENBERG et al, 2013). Dessa forma, a análise dos dados dos metagenomas utilizando
a bioinformática é um dos aspectos mais desafiadores, pois, são gerados de um milhão a um
bilhão de reads em plataformas de sequenciamento de alto desempenho. A maior parte das
sequências é “não atribuída”, ou seja, sequências em que não houve alinhamento com as
sequências já adicionadas a banco de dados, e são frequentemente consideradas como
18
"sequências lixo", devido à falta de bancos de dados virais adequados para sua caracterização,
o que pode dificultar a determinação da diversidade viral em diversas amostras (KIM et al,
2013).
2.6- O VIROMA
A análise do viroma tem diversas aplicações, uma delas é a detecção e resposta a
surtos de patógenos virais. Esta metodologia tem sido utilizada com sucesso em surtos de
gripe causada pelo vírus influenza, determinando rapidamente o tipo viral circulante. Essas
identificações permitem tanto a aplicação da terapêutica bem como de prevenção contra
possíveis epidemias, como o desenvolvimento de imunização.
Outra aplicação possível por metagenômica viral é o diagnóstico clínico, pois, há a
possibilidade de detecção de diversos patógenos. Em muitos casos, os diagnósticos clínicos de
infecções virais são feitos em cultura e em testes de diagnóstico, mas para alguns patógenos
estes testes podem ser insuficientes ou inconclusivos. Atualmente, a execução do
metagenômica ainda é de alto custo para uso rotineiro, que requer significativos apoios
técnicos e especialistas em bioinformática, mas, com a evolução das tecnologias talvez isso
seja possível no futuro (PALLEN, 2014).
A primeira contribuição para a avaliação do viroma humano por metagenômica foi
feita em 2003 por Breitbart et al. A comunidade de vírus de DNA, associado ao intestino
humano foi estudada utilizando - se o sequenciamento pelo método de Sanger. Nesse trabalho
foi utilizada a metodologia conhecida como shotgun, (onde todo o DNA analisado é
fragmentado em milhões de pequenos pedaços) dos vírus presentes nas fezes de um adulto
saudável. Entre as sequências virais identificadas, a maioria era composta por bacteriófagos e
59% das sequências geradas era desconhecida (BREITBART et al, 2003).
Observações semelhantes também foram relatadas por dois estudos sobre o viroma do
intestino humano, com sequenciamento por 454 GS FLX (pirosequenciamento) em que a
percentagem de sequências desconhecidas foi de 81% e 98%, respectivamente, e os
bacteriófagos foram dominantes nas comunidades virais estudadas (REYES et al, 2010;
MINOT et al, 2011).
No estudo de Kim et al, (2011), as análises de sequências virais apresentaram as
percentagens de 72,8 a 93,7 % de sequências classificadas como desconhecidas, ou seja,
sequências pertencentes a vírus não foram identificados. Os resultados deste estudo são
semelhantes aos dos recentes estudos dos metagenomas virais, mostrando que
19
aproximadamente 40 a 50%, ou, ocasionalmente, até 90 % das sequências virais das amostras
são descaracterizadas (KIM et al, 2011). Assim, em diversos estudos utilizando a
metagenômica por shotgun para analisar comunidades virais, o resultado é que a maioria das
sequências virais não apresenta similaridade significativa com sequências conhecidas
(WOMMACK et al, 2012), que pode ocorrer pela dificuldade de obtenção das sequências
pelos bancos de dados, que poderá ser solucionado a medida que mais estudos são realizados,
mais vírus são identificados e depositados nos bancos de dados.
No estudo de Nakamura et al foi identificado norovírus e coronavírus, por
metagenômica viral, com sequenciamento por pirosequenciamento em amostras de fezes
humanas (NAKAMURA et al, 2009). No estudo de Kapoor et al utilizando também a
metagenômica viral identificou-se uma nova espécie de parvovírus nas fezes humanas, cuja
relação filogenética mais próxima é o bocavírus humano (HBoV) sendo denominado de
HBoV2 (KAPOOR et al, 2010).
No Brasil, o grupo Adolf Lutz utilizou a metagenômica viral com uma amostra
armazenada desde 2003. Antes do estudo foi observado que, alguns vírus patogênicos das
plantas poderiam ser altamente abundantes nas fezes humanas, essa era a suspeita para a
amostra, mas, ao invés de descobrir um vírus de planta, foram identificados dois novos
genomas com características de circovírus. No entanto, esse é até o momento o único trabalho
com viroma de amostras brasileiras (CASTRIGNANO et al, 2013).
Um dos maiores causadores de gastroenterites são os astrovírus humanos, estes, foram
descritos pela primeira vez por Appleton e Higgins em 1975, durante um surto de diarréia
aguda em uma maternidade na Inglaterra e foram denominados pela sua forma de astros de 5
a 6 pontas, vistos por microscopia eletrônica (STEWIEN et al, 1991). Os astrovírus humanos
(HAstVs) são vírus de RNA não envelopado com simetria icosaédrica. Eles são classificados
em oito sorotipos (HAstVs 1-8), que são divididos em quatro subtipos (1A, 1B, 1C e 1D),
com aproximadamente 6.800 nucleotídeos e apresenta uma cauda poliadenilada (Poli A) na
sua extremidade 3’(VICTORIA et al, 2007; SANTOS et al, 2005).
A transmissão ocorre por contatos íntimos com pessoas infectadas, pela água e
alimentos contaminados ou, provavelmente, por fômites consequentes da rota fecal-oral. O
período de incubação observado em infecções por astrovírus varia de um a quatro dias. A
enfermidade causada pelos vírus tende a ser leve e auto limitada e geralmente não resulta em
significativo quadro de desidratação ou na necessidade de hospitalização (SANTOS et al,
2005).
20
Estes vírus são enteropatógenos de distribuição mundial e epidemias de diarréia
associada a eles já foram relatadas em escolas e creches. A sazonalidade das infecções
atribuídas a astrovírus parece variar de acordo com a região geográfica. Estudos realizados na
Europa, Austrália e Argentina mostraram que há um aumento na incidência da infecção viral
durante os meses mais frios do ano, enquanto em alguns países como Egito e México, a
maioria das infecções pelo agente viral ocorre durante a época mais quente do ano. No Brasil,
mais especificamente na cidade de Goiânia, as infecções relacionadas com este agente
ocorrem, predominantemente, durante os meses de setembro a março, período no qual se
observam os maiores índices pluviométricos nesta localidade (SANTOS et al, 2005).
Outro agente etiológico das gastroenterites são os adenovírus humanos. O primeiro
adenovírus humano foi isolado em 1953, a partir de adenóides humanos e caracterizado de
forma independente por dois grupos de pesquisadores. Infecções por HAdV afetam pacientes
a nível mundial e em todos os grupos etários e são facilmente transmissíveis e além de
diarréia aguda, os adenovírus podem causar outras doenças, tais como, doenças respiratórias,
conjuntivite e cistite hemorrágica. Estes vírus pertencem à família Adenoviridae, são não
envelopados, mas com nucleocapsídeo que contém o genoma de DNA de cadeia dupla linear,
que geralmente varia de 26 a 45 kb. A família Adenoviridae é dividida em cinco gêneros:
Atadenovirus, Siadenovirus, Mastadenovírus, Aviadenovirus e Ichtadenovirus Estas divisões
são baseados nas espécies hospedeiras e a composição do DNA (ROBINSON et al, 2011).
Através das análises das sequências, foi demonstrado que os genomas de todos os adenovírus
humanos têm organização genética semelhante (JONES et al, 2007). Até o ano de 2014 já
foram descritos mais de 60 tipos, agrupados em sete espécies, de A a G. O padrão de doença
dos adenovírus varia de acordo com a espécie. Os adenovírus da espécie F, dos tipos 40 e 41,
foram associados com gastroenterite e eles são referidos como adenovírus entéricos. Outras
espécies, como A (tipos 12, 18 e 31), C (tipos 1, 2 e 5) e D (tipos 28, 29, 30, 32, 37, 43-46)
também já foram associados como causadores de diarréia (MOYO et al, 2014).
Pesquisas contínuas são essenciais para o desenvolvimento e aperfeiçoamento na
identificação de patógenos virais por metagenômica (BIBBY, 2013; KRISTENSEN et al,
2009). É esperada cada vez mais a realização de projetos que utilizam análises de sequências,
a partir de amostras purificadas por metagenoma, pois, irá contribuir com o acréscimo de
sequências nos bancos de dados (KLINGENBERG et al, 2013).
21
2.7- BACTERIÓFAGOS E VIROMA HUMANO
Embora os vírus humanos estejam geralmente associados com patógenos de
gastroenterites e outras doenças agudas, os bacteriófagos intestinais têm papéis significativos
na diversidade genética do ecossistema intestinal por predação em seus hospedeiros
bacterianos. Além disso, os bacteriófagos podem impedir a colonização por bactérias
patogênicas e eliminar algumas cepas probióticas benéficas, ou introduzir novas
características fenotípicas, como a resistência a antibióticos e a capacidade de produzir
toxinas (PÉREZ-BROCAL et al, 2013). Assim, enquanto muitos vírus em seres humanos são
identificados com base na sua patogenicidade, agora há uma vasta comunidade viral no corpo
humano que não causa doença no homem, identificados até agora no viroma humano como
bacteriófagos (ABELES et al, 2014). Os bacteriófagos foram descobertos por Ernest Hanking
(1896) e Frederick Twort (1915), que descreveram sua atividade antibacteriana (WITHEY et
al, 2005).
Os bacteriófagos são vírus que infectam bactérias, estimados em 1013 a 1015 a
preencher o corpo humano. Eles são cerca de 50 vezes menores que as bactérias e estão
presentes no solo, na água, e nos alimentos. Existem os fagos virulentos e temperados, que se
diferem no seu modo de ação. O primeiro passo é a adsorção das partículas de fago com a
parede da célula bacteriana, por interações específicas entre as proteínas de superfície virais e
os receptores da célula hospedeira. Após a entrada na célula bacteriana, os fagos virulentos se
replicam rapidamente para sintetizar proteínas dentro da célula hospedeira, finalmente, os
novos fagos escapam pela ruptura da parede celular, que resulta na morte da célula. Em
contraste, os fagos temperados integram o seu material genético no genoma da célula
hospedeira, que é replicado juntamente com o genoma da célula hospedeira. Somente os fagos
temperados participam de transferências horizontais entre as populações bacterianas (LYCHATAIN, 2014).
A maioria dos fagos presentes no intestino humano são temperados e podem introduzir
novos genes e alterar fenótipos, assim, esses bacteriófagos podem ter um papel importante na
formação e regulação de comunidades bacterianas em humanos. Essa mesma característica
dos bacteriófagos temperados, ou seja, transferência horizontal de genes pode representar um
potencial alvo terapêutico, para evitar infecções com bactérias multirresistentes. Genes de
resistência a antibióticos já foram encontrados em bacteriófagos, em pacientes com fibrose
cística. (FANCELLO et al, 2012).
22
A enorme diversidade torna a análise das comunidades virais humana altamente
complexa, e essa diversidade na comunidade de bacteriófagos em seres humanos está ligada à
diversidade de seus hospedeiros celulares e também à sua rápida evolução e transferência
horizontal de genes. Os estudos estão apenas começando a ser capaz de estudar comunidades
virais humanas em larga escala, principalmente pelo resultado dos avanços recentes e
contínuos nas tecnologias de sequenciamento e análises de bioinformática. (ABELES et al,
2014).
23
3. JUSTIFICATIVA
As análises sobre a diversidade da microbiota humana estão bem avançadas no campo
da bacteriologia, mas, muito tem a se conhecer a respeito da diversidade viral e assim,
impulsionar estudos dos metagenomas virais.
Apesar dos importantes avanços na prevenção e controle das doenças infecciosas, as
doenças diarréicas agudas, ainda continuam sendo um dos principais problemas de saúde
pública e um grande desafio às autoridades sanitárias. O conhecimento do agente etiológico
nestas infecções é importante não apenas para a escolha da estratégia de tratamento, mas
também é crucial para direcionar estudos epidemiológicos, auxiliando nas medidas de
controle e prevenção da doença, como o desenvolvimento de vacinas e testes diagnósticos.
Assim, a metagenômica proporciona a identificação dos vírus presentes no intestino, podendo
ampliar o conhecimento sobre a microbiota e as interações patógeno-hospedeiro. Sabendo-se
que a microbiota humana pode ser dependente de diversos fatores geográficos, uma
investigação metagenômica trará informações sobre o viroma intestinal de indivíduos
brasileiros.
24
4. OBJETIVOS
4.1- OBJETIVO GERAL:
Avaliar o viroma presente nas fezes em 4 grupos distintos, para analisar as correlações
dentro e entre os viromas e os prováveis patógenos envolvidos nos quadros de gastroenterites.
4.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
- Sequenciar o genoma dos vírus presentes em amostras fecais diarréicas e não diarréicas
provenientes de indivíduos brasileiros.
- Comparar o resultado do sequenciamento com sequências depositadas em banco de dados
genômicos.
- Identificar os vírus presentes nos 4 grupos, com ferramentas da bioinformática.
25
5. METODOLOGIA
Para avaliar a metodologia foi realizado um experimento piloto, com uma amostra de
um indivíduo sadio e sem diarréia. A mesma metodologia foi utilizada com as 12 amostras
incluídas no projeto.
5.1- AMOSTRAGEM
A escolha da amostragem de um estudo é uma etapa fundamental para alcançar os
resultados esperados, assim, a estratégia do presente trabalho é analisar amostras diarreicas e
não diarreicas provenientes de crianças e de adultos que não tiveram um agente etiológico da
doença definido. Foram incluídas também amostras fecais de indivíduos com sistema imune
suprimido, pois nesses casos existe a possibilidade de identificar vírus que infectam esse
perfil, mas que seria de difícil detecção em indivíduos sadios.
Para determinar o número amostral foi feito um estudo na literatura de trabalhos
metagenômicos, pelo site do NCI, na base de dados do PubMed. Observou-se que o número
de amostras incluídas em uma corrida de sequenciamento varia 1 a 24. Assim, considerando o
recurso financeiro disponível, foi determinada uma amostragem composta por 12 amostras
divididas em quatro grupos detalhados a seguir:
- três amostras diarreicas “in natura” de crianças, com os seguintes critérios de inclusão: faixa
etária de 2 a 12 anos com quadro gastroentérico. Sendo cada amostra de uma criança
diferente;
- três amostras diarreicas “in natura” de adultos, com os seguintes critérios de inclusão: faixa
etária acima de 18 anos com quadro gastroentérico. Sendo cada amostra de um adulto
diferente;
- três amostras não-diarreicas “in natura” de adultos, assintomáticos para quadro
gastroentérico, com os seguintes critérios de inclusão: faixa etária acima de 18 anos sem
sintoma gastroentérico. Sendo cada amostra de um adulto diferente;
- três amostras “in natura” de indivíduos portadores do vírus HIV, com os seguintes critérios
de inclusão: contagem de CD4+< 200 linfócitos/mm3 (de acordo com o critério de
imunodepressão definido pelo Ministério da Saúde), independente tanto de estarem em terapia
anti retroviral como de estarem com quadro gastroentérico. Sendo cada amostra de um adulto
diferente.
26
As amostras das crianças com diarréia e de adultos com e sem diarréia foram coletadas
no Laboratório Sabin (sede – Brasília Shopping), pela parceria feita com a UCB
(Universidade Católica de Brasília). Já as amostras dos pacientes com o sistema imune
suprimido foram coletadas no Centro de Saúde N° 01 (Hospital Dia- W3 sul).
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa sob o número
01348312.0.0000.0029.
5.2- SEMI- PURIFICAÇÃO
Para a separação das partículas virais dos outros microrganismos e células do
hospedeiro foram diluídas 500mg de fezes em 3 mL de tampão PBS (tampão fosfato salino) e
as suspensões foram centrifugadas a 9.700xg por 10 minutos e os sobrenadantes colhidos.
Para a filtração do sobrenadante foram utilizados os filtros de poros de 0,45 e 0,22 µm de
diâmetro (Millipore). Em seguida, foi feita a ultracentrifugação com colchão de sacarose 20%
a 111.132xg por 2 horas e 30 minutos.
5.3- EXTRAÇÃO E AMPLIFICAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO (RNA e DNA)
O pellet resultante da ultracentrifugação foi extraído utilizando o kit comercial
PureLink® Viral RNA/DNA Mini Kit (Invitrogen) conforme instruções do fabricante. Nesse
momento foram separadas duas alíquotas, uma para análise de DNA e outra para RNA. A
alíquota de RNA foi submetida a uma reação para obtenção do cDNA, utilizando primer
randômico e seguindo as recomendações do fabricante da enzima transcriptase reversa
(Invitrogen).
Para aumentar a quantidade de material genético o DNA (direto da extração) e o
cDNA foram amplificados utilizando Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (GE
Healthcare) conforme instruções do fabricante.
5.4- BIBLIOTECA E SEQUENCIAMENTO
Após a amplificação foi feita a construção da biblioteca no laboratório da UCB
utilizando o kit TruSeqTM DNA Sample Preparation V2, 0063om a adição de 2 indexes, em
seguida a biblioteca foi enviada para a Macrogen, empresa coreana de sequenciamento, para
27
sequenciar um total de aproximadamente 5 GB utilizando a plataforma Illumina HiSeq2000,
paired end, com fragmentos de 100 pb (2x100).
Já com as 12 amostras incluídas no projeto, a construção das 4 bibliotecas foram
realizadas pela empresa Macrogen, assim como, a execução do sequenciamento, para
sequenciar um total de aproximadamente 40 Gb (uma lane completa) utilizando a plataforma
Illumina HiSeq 2000, paired end, com fragmentos de 100 pb.
5.5- ALINHAMENTO
Para realizar o alinhamento das sequências do experimento piloto foi necessária a
construção de um banco de dados viral, pela base de dados Taxonomy pelo site do NCBI
(Taxonomy ID: 10239), sendo salvo todos os nucleotídeos virais no formata Fasta.Um arquivo
no formato Fasta contém sequências de nucleotídeos de DNA, em um formato simples, o que
torna as sequências fáceis de analisar. Cada sequência tem uma linha de cabeçalho com
informações sobre a sequência, como por exemplo, um identificador, seguido por uma ou
mais linhas com as bases de DNA que foram lidas.
O envio das sequências das amostras foi em formato FastQ, pela Macrogen. O formato
FastQ é um arquivo similar ao Fasta, porém possui informações sobre a qualidade do
sequenciamento daquela sequência.E em seguida essas sequências foram confrontadas com o
banco de dados viral criado, como descrito anteriormente.
O alinhamento foi realizado na linha de comando do sistema linux, utilizando o
Bowtie, que é um alinhador de reads curtos, ou seja, de 35 a 100 pb. Primeiramente deve-se
construir os índices de referência do arquivo de referência, com o seguinte comando “bowtiebuild –f sequence_fasta.fasta sequence_fasta”, sendo que o comando “-f” indica que este é o
arquivo de referência, e “sequence_fasta” o nome dado à minha referência. Para iniciar o
alinhamento deve-se utilizar o seguinte comando “bowtie –S –n 2 sequence_fasta
Meta1_1_1.fastq Meta1_1_1.sam”, sendo que o comando “–S” indica que o arquivo terá saída
no formato SAM (Sequence Alignment/Map), que é um formato de texto, e “-n” a quantidade
máxima de mismatches permitos (troca de nucleotídeos numa determinada posição, quando se
compara a sequência de referência com a de interesse). Tanto o alinhamento da amostra de
cDNA (Meta1_1_1) quanto a de DNA (Meta1_2_1) foi realizado da maneira descrita
anteriormente, sendo que, a indexação da referência só é realizada um vez.
Ao término do alinhamento foi convertido o arquivo SAM em um arquivo BAM (que
é versão binária do arquivo SAM) utilizando o seguinte comando “samtools view -bS
28
Meta1_1_1.sam > Meta1_1_1.bam”, em que “-bS” significa que o arquivo de entrada está no
formato SAM e que o arquivo de saída foi no formato BAM. Em seguida, utilizando o
comando “samtools flagstat Meta1_1_1.bam” foi gerado um relatório sobre esse arquivo,
resultando nos identificadores das sequências alinhadas e a quantidade de reads alinhados em
cada identificador. Esses identificadores foram copiados e colados, sem utilizar o quantitativo
dos reads, em um editor de texto, como por exemplo, o word. Para recuperar e descrever o
que significa cada identicador, o Batch Entrez do site NCBI foi utilizado, assim, no campo
“database” deve-se escolher “nucleotide”, já que toda a análise foi feita utilizando as bases de
dados dos nucleotídeos, e no campo “file” deve-se selecionar o documento de texto que foi
salvo, com isso, abrirá uma nova página no site do NCBI, que descreverá o organismo
correspondente para cada identificador. Assim, o próximo passo é correlacionar a quantidade
de reads para cada identificador.
Para as 4 bibliotecas sequenciadas, o software CLC genomics workbench 7 (CLC Bio,
Aarhus, Denmark) foi utilizado para realizar trimming (retirada de sequências ambíguas,
repetitivas e sem qualidade) das sequências e montagem dos contigs (conjunto de
sobreposição de segmentos de DNA que, juntos, representam uma região consenso de DNA)
para otimizar as análises, feitos a partir dos reads enviados do sequenciamento, montados
com tamanhos mínimos de 500 pb.
Para as análises posteriores, o servidor web METAVIR foi utilizado, pois, auxilia a
análise de um ou de vários metagenomas virais (viromas) a partir de sequências
metagenômicas (reads brutos ou contigs já montados), sendo que, a composição taxonômica é
calculada a partir de uma comparação com o BLAST e o RefSeq de genomas completos com
sequências de proteínas, a partir da base de dados do NCBI, utilizando BLASTp.
Primeiramente foi necessário se registrar e em seguida foi feito o upload dos contigs já
montados (ROUX et al, 2014).
29
6. RESULTADOS
6.1 - EXPERIMENTO PILOTO
Após a etapa de amplificação a alíquota de cDNA apresentou concentração de 65,1
ng/µL e a de DNA apresentou 26,8 ng/µL.
A biblioteca de cDNA foi construída com fragmentos de cerca de 470 pares de bases
(Figura 3A), numa concentração de 40,9 ng/µL e a biblioteca de DNA com fragmentos de
cerca de 550 pares de bases (Figura 3B), com concentração de 9,52 ng/µL. A).
Figura 3: Análise de qualidade das amostras realizada no Bioanalyser: A) Biblioteca de cDNA (fragmentos de
cerca de 470 pares de bases); B) Biblioteca de amplificação de DNA (fragmentos de cerca de 550 pares de
bases).
A)
B)
30
A amostra de cDNA que resultou em 25.032.073 reads (tabela 1), obteve um total de
8.548 reads alinhados com as sequências obtidas pelo banco de dados viral, ou seja, 0,03% de
reads foram alinhados com sequências virais. Já a amostra de DNA que resultou em
4.459.552 reads obteve 131 alinhamentos com sequências virais.
Tabela 1. Sequenciamento obtido em número de pares de bases e reads por amostra – experimento piloto.
Amostras
Total de bases
Reads (100pb)
cDNA
DNA
5.056.478.746
900.855.966
25.032.073
4.459.552
Com a amostra de DNA o número de alinhamentos não foi significativo para a análise.
Já com a amostra de cDNA houve um número maior de alinhamentos com bacteriófagos,
sendo de 3.707 reads do total de 8.548 reads; seguido dos alinhamentos com baculovírus, que
resultaram em 2891 reads. Os reads restantes foram alinhados sem significância, ou seja,
poucos reads se correlacionavam com os organismos, sendo que, a maioria destes tinham
apenas 1 read alinhado para um identificador, ou seja, para um organismo. Foi observado que
nas amostras de DNA e cDNA não foram identificados patógenos virais entéricos.
6.2- COMPARAÇÃO ENTRE OS GRUPOS DO ESTUDO
Após a análise do experimento piloto, as 12 amostras foram executadas como já
descrito e os 4 grupos foram sequenciados, resultando em pouco mais de 40 Gb (Tabela 2):
Tabela 2. Sequenciamento obtido em número de pares de bases e reads por amostra.
Amostras
Crianças - amostras diarreicas
Adultos - amostras diarreicas
Adultos – amostras não diarreicas
Adultos HIV +
Total de bases
11.998.666.478
14.319.049.770
12.813.684.564
11.143.802.074
Total de Reads (100pb)
118.798.678
141.772.770
126.868.164
110.334.674
31
A quantidade de contigs obtidos foi diferente para cada tipo de amostra, sendo que a
biblioteca 1, amostras diarreicas de crianças, apresentou o maior número de contigs, sendo
51.703, já a biblioteca 2, amostras diarreicas de adultos, apresentou o menor número de
contigs, sendo 6.152 (Tabela 3).
Tabela 3. Avaliação dos contigs para cada amostra.
Amostras
Crianças – amostras diarreicas
Adultos – amostras diarreicas
Adultos – amostras não diarreicas
Adultos HIV +
Nº de Contigs
29.855
6.152
51.703
17.071
Mínimo de
sequência (nt)
465
483
500
500
Máximo de
sequência (nt)
428.276
112.694
250.730
168.151
Contigs de tamanhos de 400 e 1.000 nucleotídeos foram os mais frequentes nos 4
grupos, ou seja, mais de 50% de todos os contigs obtidos estão nessa faixa de tamanho.
Enquanto que contigs com tamanhos maiores de 9.500 nucleotídeos representam de 3,01 a
6,3% da frequência dos contigs obtidos (Figura 4).
Figura 4 – Relação entre as frequências e os tamanhos dos contigs nos 4 grupos. Grupo 1- com amostras
diarreicas de crianças; Grupo 2- com amostras diarreicas de adultos; Grupo 3- com amostras não diarreicas de
adultos; Grupo 4- com amostras de indivíduos HIV+.
50
40
30
Grupo 1
20
Grupo 2
10
0
Grupo 3
400 - 999
1000 - 1499
1500 - 1999
2000 - 2499
2500 - 2999
3000 - 3499
3500 - 3999
4000 - 4499
4500 - 4999
5000 - 5499
5500 - 5999
6000 - 6499
6500 - 6999
7000 - 7499
7500 - 7999
8000- 8499
8500 - 8999
9000 - 9499
9500 - 428.276
Frequência dos contigs
60
Tamanho dos contigs
Grupo 4
32
A relação dos contigs com e sem correspondência com o banco de dados viral mostra
que menos de 30% dos contigs em cada grupo de estudo apresentou correspondência com
sequências do banco de dados (Figura 5).
Figura 5- Relação dos contigs com/sem correspondência com o banco de dados viral. A) Grupo com amostras
diarreicas de crianças; B) Grupo com amostras diarreicas de adultos; C) Grupo com amostras não diarreicas de
adultos; D) Grupo com amostras de indivíduos HIV+.
A)
B)
8.300
(28%)
4.479
(27%)
21.555
(72%)
C)
1.673
(73%)
D)
4.196
(25%)
10.290
(20%)
41.413
(80%)
12.875
(75%)
As espécies virais estão agrupadas nas suas famílias, para cada grupo do estudo
(Figura 6; Tabela 4), e em destaque estão os vírus humanos. O grupo com amostras diarreicas
de adultos (grupo 2) foi o que obteve o menor número de espécies, que foi de 462 espécies, já
o grupo com amostras não diarreicas de adultos (grupo 3) apresentou o maior número de
espécies, sendo de 969. O número de famílias identificadas foi de 15 para o grupo 1, 18 para o
grupo 2, 25 para o grupo 3 e 22 para o grupo 4.
33
Figura 6 – Distribuição dos contigs classificados em nível taxonômico de família, nos diferentes grupos
estudados: Grupo1- com amostras diarreicas de crianças; Grupo 2- com amostras diarreicas de adultos; Grupo 3com amostras não diarreicas de adultos; Grupo 4- com amostras de indivíduos HIV+.
1200
Unclassified
Tectiviridae
Nimaviridae
Rodiviridae
1000
Hytrosaviridae
Endornaviridae
Nudiviridae
Asfarviridae
Ascoviridae
Plasmaviridae
800
Rudiviridae
Lipothrixviridae
Potyviridae
Polydnaviridae
Bicaudaviridae
Caulimoviridae
600
Marseilleviridae
Inoviridae
Iridoviridae
Phycodnaviridae
Baculoviridae
Microviridae
400
Podoviridae
Siphoviridae
Myoviridae
Poxviridae
Picobirnaviridae
Retroviridae
200
Circoviridae
Anelloviridae
Papillomaviridae
Adenoviridae
Astroviridae
0
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
34
Tabela 4. Número de espécies para cada família viral nos quatro grupos. Grupo1- com amostras diarreicas de
crianças; Grupo 2- com amostras diarreicas de adultos; Grupo 3- com amostras não diarreicas de adultos; Grupo
4- com amostras de indivíduos HIV+.
Astroviridae
Adenoviridae
Papillomaviridae
Anelloviridae
Circoviridae
Retroviridae
Picobirnaviridae
Poxviridae
Myoviridae
Siphoviridae
Podoviridae
Microviridae
Baculoviridae
Phycodnaviridae
Iridoviridae
Inoviridae
Marseilleviridae
Caulimoviridae
Bicaudaviridae
Polydnaviridae
Potyviridae
Lipothrixviridae
Rudiviridae
Plasmaviridae
Ascoviridae
Asfarviridae
Nudiviridae
Endornaviridae
Hytrosaviridae
Rodiviridae
Nimaviridae
Tectiviridae
Unclassified
Total
Grupo 1
1
0
0
8
0
0
0
16
222
352
78
5
0
16
11
16
0
0
0
0
2
0
0
1
1
1
0
0
0
0
0
1
142
874
Grupo 2
0
2
0
5
0
0
0
6
126
164
44
8
0
16
3
10
3
0
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
0
68
462
Grupo 3
0
0
0
0
1
2
2
18
223
385
95
9
29
16
14
15
3
3
3
3
2
2
2
1
1
1
1
1
1
0
0
0
136
969
Grupo 4
0
2
10
7
2
0
1
13
186
295
73
9
0
16
6
9
2
0
8
0
2
2
0
0
1
1
1
0
1
0
0
0
101
748
35
7. DISCUSSÃO
O objetivo desse estudo foi avaliar o viroma de amostras fecais humanas de 12
indivíduos brasileiros divididos em quatro grupos (Grupo 1: 3 amostras fecais diarreicas de
crianças; Grupo 2: 3 amostras fecais diarreicas de adultos; Grupo 3: 3 amostras fecais não
diarreicas de adulto; Grupo 4: 3 amostras fecais de imunocomprometidos), e assim, identificar
vírus presentes na microbiota intestinal, tanto vírus participantes da microbiota normal,
quanto potenciais vírus causadores de doenças diarreicas.
Mais de 20 diferentes tipos de vírus têm sido identificados como agentes etiológicos
das gastroenterites agudas, mas os principais vírus associados com a diarréia em crianças
podem ser divididos em quatro famílias diferentes: Reoviridae, Caliciviridae, Astroviridae e
Adenoviridae (RABONI et al, 2014).
No experimento piloto, a ausência de vírus humanos pode ser explicado pela raridade
de sequências de vírus eucarióticos em amostras de viromas de intestino de indivíduos
saudáveis, assim como no estudo de Minot et al (2013), em que foi analisado o viroma de um
indivíduo saudável, e nenhum vírus humano foi identificado durante o estudo (MINOT et al,
2013). Já a identificação de baculovírus nas amostras é resultado de contaminação, ocorrida
no momento da ultracentrifugação, visto que, no laboratório de Biologia Celular da UnB
muitos experimentos utilizam os baculovírus, sendo assim, é importante evitar e eliminar
focos de contaminações, para que não mascare outras sequências e que diminua o viés do
estudo. Assim, a realização desse experimento piloto foi uma etapa importante para
padronização dos experimentos e detecção de possíveis ajustes na metodologia.
A diversidade viral foi avaliada nos 4 grupos distintos. Com a grande quantidade de
reads gerados no sequenciamento, ou seja, pouco mais de cem mil reads em cada biblioteca,
foi necessária a montagem de contigs no software CLC genomics workbench 7, como citado
no artigo de Smits et al (2014), com uma das ferramentas de montagem disponíveis.
A quantidade gerada de contigs foi bem diversa em cada grupo, variando de 6.152
contigs (no grupo 2 - amostras diarreicas de adultos) a 51.703 contigs (no grupo 3 – amostras
não diarreicas de adultos). A frequência dos contigs montados em cada faixa de tamanho foi
semelhante em todos os grupos, o que indica uma boa proporcionalidade entre os grupos, e
que mais de 50% dos contigs, em todos os grupos, apresentaram tamanhos entre 400 e 999
nucleotídeos. A proporcionalidade também foi mantida na relação dos contigs com e sem
correspondência com o banco de dados viral, em que todos os grupos apresentaram
correspondência em torno de 20%, ou seja, variando de 20% (grupo 3) a 28% (grupo 1), já as
36
sequências sem correspondência variaram de 72% (grupo 1) a 80% (grupo 3). Como descrito
por Breitbart et al (2003), a maioria das sequências geradas foram desconhecidas (59%) e
entre as sequências virais identificadas, a maioria era composta por bacteriófagos
(BREITBART et al, 2003, SMITS et al, 2014).
Os vírus possuem alta diversidade genética, o que limita a probabilidade de se
identificar vírus não conhecidos. Uma maneira de se analisar é com a utilização do BLASTx
ou BLASTp, ao invés de BLASTn, pois, as mutações sinônimas são ignoradas na etapa de
tradução, tornando assim, este método mais sensível para a recuperação de vírus conhecidos,
e foi desta forma que as sequências foram analisadas(FANCELLO et al, 2012).
Na análise do primeiro grupo em questão (crianças com amostras diarreicas) não
houve detecção de rotavírus, mas sim, bacteriófagos, astrovírus e torque teno. O torque teno
vírus (TTV), assim como adenovírus, enterovírus, rotavírus e astrovírus são agentes
excretados nas fezes. Este vírus está atualmente classificado na família Anelloviridae,
podendo infectar muitas espécies de vertebrados, incluindo humanos. Até o momento, no
entanto, não há consenso sobre o papel da infecção pelo TTV (VECCHIA et al, 2012). Os
TTVs são caracterizados por uma elevada prevalência na população em geral e o possível
envolvimento desses vírus em patologias humanas tem sido debatido desde sua descoberta.
Certamente, é improvável que seja patogênico por ser um vírus quase onipresente. Estudos
têm mostrado que as partículas variam de 30 a 50 nm, mas há poucos estudos que
investigaram a estrutura e função. O componente mais bem estudado dos TTVs é o seu
genoma, que consiste numa molécula de DNA circular, cadeia simples, polaridade negativa,
com uma região rica em GC de 117 nucleotídeos (89% - 90,6%), sendo que, o tamanho do
genoma varia de 3,6 a 3,9 kb (SPANDOLE et al, 2015).
A identificação de astrovírus no grupo com amostras de crianças era esperada, pois,
em um dos primeiros estudos que relataram a ocorrência de casos de diarréia aguda foi
associada a astrovírus, realizado por Stewien et al, (1991), no qual observaram 3% de
positividade em amostras fecais provenientes de 67 crianças hospitalizadas, residentes na
cidade de São Paulo. Um estudo realizado no Rio de Janeiro, em 2004, mostrou uma
prevalência de 14% de astrovírus nas amostras coletadas de crianças hospitalizadas com
gastroenterite aguda (VICTORIA et al. 2007). No estudo de Alam et al (2015) foi descrito
que as astroviroses normalmente infectam crianças com idades abaixo de três anos, com uma
taxa de prevalência que varia de 10% a 30%. Estes dados enfatizam a importância dos
37
astrovírus, sendo estes, os grandes responsáveis por causar gastroenterites em diversas
crianças (ALAM et al, 2015).
No segundo grupo, composto de adultos com amostras diarreicas, foi identificado
bacteriófagos, adenovírus e torque teno vírus. Os torque teno vírus, como já descrito, possuem
prevalência elevada em toda população, podendo ser identificado em qualquer indivíduo. Os
adenovírus humano (HAdV) provocam diarréia aguda esporadicamente, bem como surtos.
No terceiro grupo, com amostras não diarreicas de adultos, houve a detecção da
família Circoviridae, mas, não foi possível identificar a espécie presente. Como esperado,
houve a identificação de bacteriófagos, já que os indivíduos se apresentavam sadios e
assintomáticos.
Para investigar a origem e a evolução do viroma no intestino humano, o grupo de
Minot et al (2013) analisou a comunidade viral de um único indivíduo adulto e sadio por 2
anos e 6 meses, por métodos de sequenciamento, assim, as amostras de fezes (n = 24) foram
coletadas de um homem saudável em 16 pontos no tempo, distribuídos por 884 dias. Foram
identificadas as seguintes famílias: Microviridae, Podoviridae, Myoviridae e Siphoviridae,
ressaltando a enorme variação de bacteriófagos. Microviridae predominou, mas essa
predominância pode ser uma consequência da amplificação favorecida por Φ29 polimerase
em pequenos genomas circulares, e aproximadamente 80% dos tipos de bacteriófagos
persistiram durante todo o período do estudo, indicando estabilidade global em longo prazo e
nenhum dos contigs foi correlacionado a vírus que infectam as células eucariotas (MINOT et
al, 2013) Assim como no trabalho em questão, grupo com amostras não diarreicas de adultos,
não houve identificação de vírus humanos, pois, a raridade de sequências de vírus eucarióticos
é típica em amostras de intestino de indivíduos saudáveis, indicando o tamanho enorme das
populações de bacteriófagos do intestino.
No quarto grupo, composto por amostras de indivíduos HIV+ foram identificados
adenovírus, torque teno vírus, gyrovirus e papilomavírus humano. Os torque teno e os
adenovírus já foram comentados anteriormente. Mas, os adenovírus também têm sido
associados com infecções persistentes tanto em indivíduos imunocompetentes quanto em
indivíduos imunocomprometidos, e estão sendo cada vez mais reconhecidos como causa de
infecções em hospedeiros imunocomprometidos, incluindo os pacientes HIV+ e estas
infecções tem o potencial de causar doença disseminada fatal, podendo agravar ainda mais o
quadro clínico do indivíduo (MOYO et al, 2014).
38
A presença de gyrovírus foi identificada no estudo em questão como também por
Minot et al (2013), onde foi caracterizado na família Circoviridae e gênero Circovirus, com
tamanhos pequenos de genoma (~2.3 kb) e que recentemente foi correlacionado a infectar os
seres humanos (MINOT et al, 2013). E desde 2011 outras espécies virais tem sido encontrada
em soros e tecidos de galinhas, fezes humanas, e pele humana (GIA et al, 2013). No estudo de
Chu et al (2013), foi detectado gyrovirus (GyV4) em pele de galinha e nas fezes humanas,
mas a epidemiologia e o papel patogênico do vírus em humanos e em frangos requer uma
investigação mais aprofundada, e estudos futuros devem investigar se esses gyrovírus estão se
replicando em seres humanos (CHU et al, 2013).
Os papilomavírus (PVs) são uma grande família de vírus que infectam os epitélios da
mucosa e da pele dos vertebrados, incluindo os seres humanos (HPV). A doença varia desde
lesões benignas, como verrugas comuns, até carcinomas malignos do colo do útero, vulva,
vagina, pênis e ânus. Em todo o mundo, as infecções por HPV têm sido associados a vários
tipos de câncer, incluindo pulmão, mama, ovário, próstata, bexiga, uretra e câncer de cólon
retal, embora os dados entre os vírus e o câncer ainda sejam controversos. O estudo de Di
Bonito et al (2015) foi o primeiro a investigar a presença de HPV em amostras fecais de
pacientes hospitalizados, com sinais clínicos de diarréia, de etiologia desconhecida, utilizando
reação em cadeia da polimerase (PCR), e das 103 amostras, 13 (12,6%) foram positivas para
HPV, demonstrando a possibilidade de identificar HPV nas fezes. (DI BONITO et al, 2015).
Tanto no experimento piloto, quanto na comparação entre os quatro grupos se observa
a grande presença de fagos, o que enfatiza a abundância dessas populações presentes no
intestino, comprovando que, a maioria das sequências identificadas é de bacteriófagos.
Nos quatro grupos do estudo, as mesmas famílias identificadas por Minot et al (2013),
também foram detectadas, sendo estas as famílias com mais diversidade de espécies de
bacteriófagos, mas, a família predominante em todos os quatro grupos foi a Siphoviridae,
diferentemente do que foi encontrado por Minot el al (2013), em que a família predominante
foi a Microviridae (MINOT et al, 2013).
No estudo de revisão de Abeles et al (2014) foi observado que o foco dos estudos até
agora em viromas do intestino humano, tem classificado vírus de DNA de cadeia dupla na
ordem Caudovirales (incluindo as famílias Podoviridae, Siphoviridae, e Myoviridae) ou vírus
de DNA de cadeia simples, nas famílias Microviridae e Inoviridae (ABELES et al, 2014).
Assim como no presente trabalho, essas 5 famílias estiveram presentes em maioria nos quatro
grupos.
39
O grupo com amostras diarreicas de adultos (grupo 2) foi o que obteve o menor
número de espécies, que foi de 462, já o grupo com amostras não diarreicas de adultos (grupo
3) apresentou o maior número de espécies, sendo de 969, assim, esses números podem ter
influência direta da quantidade de contigs, ou seja, o grupo 2 apresentou o menor número, e o
grupo 3 o maior número de contigs. Assim, o grupo com maior riqueza de espécies foi o de
adultos sadios, e essa relação pode ser explicada por estarem saudáveis, já os outros três
grupos obtiveram uma menor riqueza, sendo que estes estavam envolvidos com alguma
patologia, que pode afetar diretamente os microrganismos presentes na microbiota intestinal.
No geral, as famílias virais nos quatro grupos apresentaram alto grau de semelhança entre as
comunidades de fagos (Figura 6 e Tabela 4), que pode ser causado pela sazonalidade da
região do Distrito Federal (DF), mas, mais estudos detalhados são necessários para confirmar
essa informação.
O presente estudo do metagenoma viral humano em quatro grupos distintos, adicionou
resultados importantes, que positiva e enfatiza o que se tem identificado na literatura, tanto
com relação a vírus patógenos, quanto a bacteriófagos. As proporções de sequências sem
correspondência a sequências virais também foram condizentes, quando comparados com
outros estudos. As abordagens metagenômicas podem conter viés, pois, diferentes
metodologias são realizadas por diversos grupos de estudo, e cada grupo escolhe os melhores
passos para se chegar ao objetivo proposto. Por ser ainda uma proposta nova, alguns desafios
devem ser enfrentados, como por exemplo, obtenção e manipulação das amostras,
funcionalidade de reagentes, equipamentos e escolha das ferramentas de análises.
40
8. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
O presente estudo fornece uma evidência adicional a respeito do viroma intestinal
humano, e enfatiza a ideia de que o surgimento da metagenômica viral tem facilitado os
avanços em virologia, e tem permitido a compreensão da ecologia viral de uma variedade de
tipos de amostras. Atualmente, a metagenômica viral é uma técnica sensível para a detecção
de vírus que não podem ser identificados por cultura tradicional, mas, podem produzir erros
técnicos, com a amplificação, por exemplo, e fazer sub-estimativas, pois, os bancos de dados
públicos virais são muito limitados, o que pode dificultar a determinação da diversidade viral.
Muitos dos vírus em humanos são bacteriófagos, como identificado em todos os
grupos desse trabalho e também por Breitbart et al, (2003), Reyes et al, (2010) e Minot et al
(2011). Os dados apresentados no estudo afirmam tanto a presença de astrovírus em amostras
de crianças, quanto de adenovírus em amostras de adultos com gastroenterite e
imunocomprometidos. O grupo de pacientes imunocomprometidos obteve o maior número de
espécies para vírus humanos, inferindo que, a situação em que o organismo se encontra pode
estar
intimamente
relacionada
com
o
aumento
da
probabilidade
de
infecção,
consequentemente da identificação de patógenos.
Muitas sequências foram geradas, consequentemente, muitos dados. Com isso, no
futuro é possível analisar as sequências que não apresentaram correspondências com vírus,
para que se tenha uma visão completa de toda a microbiota presente em cada grupo, além de
estudos de filogenia para os vírus humanos identificados. Há ainda a possibilidade de se
identificar vírus novos, pois, até o momento, a análise foi qualitativa, ou seja, análise da
presença ou ausência dos vírus. A maioria dos estudos tem sido descritivo, assim, ainda há
muito a aprender sobre a interação entre espécies na microbiota e também entre o hospedeiro
e os microrganismos que habitam.
O estudo contribuiu para avaliar o viroma intestinal humano e dessa forma abrir
caminhos para novos estudos, para que se compreenda cada vez mais a ecologia viral e que
possa ser uma ferramenta para conhecimento de mais vírus patógenos, possibilitando
consequentemente a produção de kits diagnósticos acessíveis, além melhorar da vigilância de
patógenos virais na saúde pública.
41
9. REFERÊNCIAS
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