TIPAGEM DE CEPAS DE Yersinia pestis DOS FOCOS DO ESTADO

1
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
Departamento de Saúde Coletiva
Mestrado em Saúde Pública
TIPAGEM DE CEPAS DE Yersinia pestis DOS
FOCOS DO ESTADO DO CEARÁ, BRASIL, POR
RFLP-IS100
Ana Carolina de Melo da Silva
Recife, 2004
1
2
ANA CAROLINA DE MELO DA SILVA
TIPAGEM DE CEPAS DE Yersinia pestis DOS FOCOS DO
ESTADO DO CEARÁ, BRASIL, POR RFLP-IS100.
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado em Saúde Pública do Centro
de Pesquisas Aggeu Magalhães da
Fundação Oswaldo Cruz, para obtenção
do Título de Mestre em Saúde Pública,
Área
de
Controle
de
Endemias
e
Métodos de Diagnóstico de Doenças
Infecciosas e Parasitárias.
Orientadora: Dra. Nilma Cintra Leal
Co-Orientadora: Dra. Alzira Maria Paiva de Almeida
Recife/2004
2
3
TIPAGEM DE CEPAS DE Yersinia pestis DOS FOCOS DO
ESTADO DO CEARÁ, BRASIL, POR RFLP-IS100.
ANA CAROLINA DE MELO DA SILVA
Comissão Examinadora
_________________________________________
Dra. Nilma Cintra Leal
CPqAM/FIOCRUZ (Orientadora)
_________________________________________
Dra. Alzira Maria Paiva de Almeida
CPqAM/FIOCRUZ (Co-Orientadora)
_________________________________________
Dra. Constancia Flavia Junqueira Ayres
CPqAM/FIOCRUZ (Membro Interno Titular)
_________________________________________
Dra. Marise Sobreira Bezerra da Silva
UPE (Membro Externo Titular)
_________________________________________
Dra. Tereza Cristina Leal Balbino
CPqAM/FIOCRUZ (Membro Interno Suplente)
_________________________________________
Dr. Valdir Queiroz Balbino
UFPE (Membro Externo Suplente)
Recife, 2004.
3
4
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA
i
AGRADECIMENTOS
ii
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
iii
LISTA DE ABREVIATURAS
v
RESUMO
vi
1. Introdução
01
1.1 Histórico
01
1.2 Situação Atual no Mundo e no Brasil
02
1.3 Ciclo Epidemiológico
03
1.4 Formas Clínicas
03
1.5 Prevenção e Controle
04
1.6 Agente Etiológico
05
1.7 Genoma da Y. pestis
05
1.8 Diagnóstico
07
1.8.1 Clínico
07
1.8.2 Laboratorial
07
1.8.2.1 Bacteriológico
07
1.8.2.2 Sorológico
08
1.8.2.3 Molecular
08
1.9 Epidemiologia Molecular da Y. pestis
09
1.10 Justificativa
11
2. Pergunta-Condutora
12
3. Objetivo
13
3.1 Geral
13
3.2 Específicos
13
4. Procedimentos Metodológicos
4
14
4.1 Desenho de Estudo
14
4.2 Área de Estudo
14
4.3 População de Estudo
14
4.4 Reativação e Caracterização das Cepas
16
4.5 Provas Bioquímicas
16
5
4.6 Fenótipo de Pigmentação
18
4.7 Extração de DNA plasmidial
18
4.8 Extração de DNA total
18
4.9 Marcadores de Virulência
20
4.10 Amplificação da IS100
20
4.11 RFLP-IS100
21
4.11.1 Construção da sonda IS100
21
4.11.2 Clivagem e transferência
21
4.11.3 Hibridização
22
4.11.4 Detecção
22
5. Resultados
24
5.1 Provas Bioquímicas
24
5.2 Fenótipo de Pigmentação
24
5.3 Perfil Plasmidial
24
5.4 Marcadores de Virulência
24
5.5 Amplificação da IS100
25
5.6 RFLP-IS100
25
6. Discussão
36
7. Conclusões
40
8. Referências Bibliográficas
41
ANEXO
ARTIGO
5
48
i
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Janete e Evangelista que sempre
tentaram me entender e me apoiar nos momentos de
angustia e alegria; aos meus irmãos Heloisa e Antônio
pela força e amizade, e ao amor inocente de meu
sobrinho Cássio.
Ao meu marido Wellington que em todos os momentos
me incentivou e me apoiou com todo seu amor e carinho;
e que me deu o maior presente – meu filho em caminho
João Guilherme.
i
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus por toda força e saúde para nunca desisti nos momentos mais difíceis.
A minha família que sempre me apoiou, e me incentivou a lutar por todos os
meus objetivos.
A Dra. Nilma Cintra Leal pelos ensinamentos, ao longo dos quatro anos de
orientação.
A Dra. Alzira Maria Paiva de Almeida pelo apoio nos momentos de
necessidades científicas.
Aos técnicos Issac Martins e Yara Nakasawa e em especial a Silvana Santos
por toda a força na realização e incentivo nos procedimentos metodológicos.
As Dras. Marise Sobreira e Tereza Cristina pelo apoio técnico e Científico, nos
momentos de dúvidas.
Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães por todo o suporte técnico e
científico.
Ao Departamento de Saúde Coletiva do CPqAM, pelos ensinamentos e
formação no mestrado em Saúde Pública.
Aos Professores do Mestrado em Saúde Pública pelos conhecimentos
adquiridos.
Aos colegas mestrandos Marinalda, Érika, Fábio, Erlene Luciana, Salvea,
Odaleia, Geiseane, Cristina, Karina, em especial a amiga Maria Sandra.
As amigas Gerlane, Claúdia e Betânia pelo incentivo e interesse na minha vida
profissional e pessoal.
A todos os colegas do Departamento de Microbiologia do CPqAM.
ii
iii
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Área de Estudo: Estado do Ceará com as áreas de focos de
15
peste.
Figura 2. Variedades Geográficas ou Biovars de Yersinia pestis
17
identificadas com base na fermentação do glicerol e redução do
nitrato.
Figura 3. Crescimento de Yersinia pestis no meio agar Vermelho
19
Congo. A: Colônias pigmentadas, vermelhas (pgm+); B: Colônias nãopigmentadas, brancas (pgm-).
Figura 4. Variedades Geográficas ou Biovars de Yersinia pestis
27
encontradas nas cepas analisadas.
Figura 5. Gel de agarose 0,6% representativo dos perfis plasmidiais
28
das cepas de Y. pestis.
Figura 6. Gel de agarose 1% representativo das amplificações
29
geradas por PCR-Multiplex, com primers direcionados aos genes irp2,
caf1, lcrV e pla das cepas de Y. pestis.
Figura 7. Hibridização da sonda IS100 com fragmentos de DNA total
30
de cepas de Y. pestis gerados pela clivagem com a enzima HindIII.
Figura 8. Representação esquemática dos grupos obtidos pela
31
hibridização da sonda IS100 com DNA total de cepas de Y. pestis
clivado com a enzima HindIII.
Tabela 1. Descrição da População de cepas estudadas segundo a
origem, Área Geográfica, Município, Ano de Isolamento, Amplificação
iii
32
iv
da IS100, perfil plasmidial e genes de virulência.
Tabela 2. Distribuição das cepas estudadas segundo origem, foco,
município, ano de isolamento e resultado da tipagem por RFLP-IS100.
iv
35
v
LISTA DE ABREVIATURAS
BAB – Blood Agar Base
BHI – Brain Heart Infusion
CPqAM – Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz
FUNASA – Fundação Nacional de Saúde
G - Glicerol
IS100 – Insertion Sequence 100
MS – Ministério da Saúde
N - Nitrato
PCR – Polymerises Chain Reaction
PFGE – Pulsed-field Gel Electrophoresis
HA – Hemaglutinação Passiva
RAPD – Random Amplified Polymorphism DNA
RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism
SRP – Serviço de Referência de Peste
SSC – Citrato trissódico
TBE – Tris Borato
UV – Ultravioleta
VNTR – Variable-Number Tandem Repeats
v
vi
RESUMO
As atividades de vigilância da peste promovidas pelo Serviço de
Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde (SVS/MS) têm evidenciado que a
Yersinia pestis, agente causador da peste continua circulando entre os
roedores silvestres nos focos endêmicos do Nordeste do Brasil. Dando
continuidade aos estudos desenvolvidos pelo Serviço de Referência de Peste
(SRP) do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães e motivados pelo recente
interesse nos estudos da Y. pestis devido às ameaças de terrorismo
bacteriológico, cepas de Y. pestis isoladas dos focos de peste do estado do
Ceará e pertencentes à coleção de culturas do SRP, foram analisadas com o
objetivo de verificar diversidade genética entre elas, visando identificar uma
ferramenta útil para reconhecer o surgimento de novos clones ou variantes e
introdução de novas cepas no território brasileiro. Quarenta e três cepas foram
caracterizadas quanto ao conteúdo plasmidial, presença de genes de
virulência, reações de fermentação do glicerol e redução do nitrato. 14 delas
foram analisadas quanto ao polimorfismo dos tamanhos dos fragmentos de
restrição reconhecidos por sonda dirigida à IS100. Trinta e oito cepas se
revelaram glicerol negativo (G-) e nitrato positivo (N+) e se enquadram no biovar
Orientalis. Cinco cepas se revelaram G- e N- que foram consideradas como
variantes atípicas. Todas as cepas produziram colônias pigmentadas no meio
agar Vermelho Congo. 31 cepas amplificaram os quatro genes de virulência
pesquisados; os genes lcrV e irp2 estavam presentes em todas as amostras.
Foram identificados oito perfis de RFLP-IS100 sem associação com a presença
ou ausência de plasmídeos, nem com a variante nitrato negativo, no entanto
possibilitou agrupar cepas originadas de um mesmo município, de diferentes
hospedeiros e diferentes anos. As outras cepas estavam distribuídas em
diferentes perfis, no entanto uma banda comum estava presente em todas as
cepas. Outros estudos são necessários, com cepas de outros focos do Brasil e
de outros países para definir o potencial desta banda como marcador
geográfico em estudos epidemiológicos.
vi
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
A peste é uma doença infecciosa causada pela bactéria Yersinia pestis.
Conhecida desde a Antigüidade, provavelmente originada no Planalto Central
Asiático, é uma das doenças mais antigas e causou grande mortalidade em
diferentes épocas na população humana. Durante a era Cristã, três grandes
pandemias foram bem caracterizadas: a primeira pandemia, denominada Peste
de Justiniano devastou o mundo conhecido entre 542 a 602 d.C. A segunda
pandemia, a Peste Negra, novamente dizimou a população, matando 25
milhões de pessoas apenas na Europa, durante o século XIV. A terceira
pandemia ou pandemia Contemporânea iniciou-se em 1894 e de Hong Kong
dispersou-se por todo o mundo (POLLITZER, 1954).
Segundo Mollaret (1989), a expansão desta pandemia se extinguiu com
a 2a Guerra Mundial, à medida que os antigos navios foram substituídos pelos
modernos navios à prova de ratos. Entretanto, esta pandemia deixou focos
endêmicos em várias partes do mundo.
Em 1894, Alexander Yersin isolou o agente etiológico da peste. O papel
da pulga na transmissão da doença foi descoberto por Louis Simond em 1898
(POLLITZER, 1954).
Durante a última pandemia, a peste penetrou no Brasil, em 1899, pelo
porto de Santos no estado de São Paulo. Inicialmente atingiu várias cidades
litorâneas, de onde foi eliminada através de medidas sanitárias adequadas,
mas focalizou-se entre os roedores silvestres, na área rural, principalmente na
região Nordeste. No estado do Ceará, a peste foi registrada pela primeira vez
1
2
em Fortaleza no ano de 1900, de onde se irradiou e posteriormente se
focalizou em diversas áreas: Serra da Ibiapaba, Serra de Baturité e Chapada
do Araripe (WHO, 1965).
1.2 Situação Atual no Mundo e no Brasil
Apesar dos avanços científicos e tecnológicos, a peste ainda representa
um problema de saúde pública porque persiste em vários focos naturais em
diversos países da África, Ásia e Américas. Enquadra-se entre as doenças de
notificação obrigatória em nível internacional e sujeita à quarentena (classe I do
Regulamento Sanitário Internacional), fazendo-se necessária a vigilância
permanente nas áreas de foco.
Durante os últimos 15 anos 36.876 casos foram notificados em 24
países com 2.847 mortes (WHO, 2003).
Em 2000 foram notificados 2.513 casos de peste humana em 11 países,
com um total de 232 óbitos. Ocorreram na África 2.431 casos sendo 227 fatais,
na Ásia, 57 casos com 5 óbitos e nas Américas 25 casos com todos os
pacientes curados.
Em 2001, 12 países notificaram 2.671 casos, incluindo 175 mortes,
sendo a África o continente mais atingido, com 2.557 casos (94,3% do total dos
casos notificados) e 165 mortes, seguido da Ásia com 102 casos (5,7%) e 10
mortes e Américas com 12 casos (0,4%) curados (WHO, 2003).
No Brasil a incidência de peste humana e a ocorrência de epizootias
declinaram nas áreas de foco; entretanto, atividade residual de peste tem sido
detectada nos animais sentinelas, exigindo vigilância permanente dos focos
2
3
(VIEIRA et al., 1994; VIEIRA; COELHO, 1998; ARAGÃO et al., 2002; FUNASA,
2002).
1.3 Ciclo Epidemiológico
A peste é uma doença infecciosa primariamente de roedores e a
transmissão se dá através das picadas das pulgas infectadas. O homem é
infectado acidentalmente, quando em contato com roedores ou outros animais
e suas pulgas. Carnívoros selvagens e domésticos (raposas, cães e gatos)
também estão envolvidos no ciclo epidemiológico da peste, quando são
picados por pulgas infectadas ou ao devorar roedores infectados (PERRY;
FETHERSTON, 1997).
A transmissão inter-humana pode ocorrer por aerossóis na forma
pneumônica, por acidentes com tecidos e materiais em trabalhos de campo ou
no laboratório, ou na eventualidade da utilização da bactéria como agente de
guerra biológica (PERRY; FETHERSTON, 1997; INGLESBY et al. 2000).
1.4 Formas Clínicas
No homem, a doença pode apresentar-se em três formas clínicas
principais: bubônica, pulmonar e septicêmica (BUTLER et al., 1983).
A peste bubônica é a forma mais comum e caracteriza-se pela presença de
linfadenite regional (bubão) na cadeia que drena a região da picada da pulga
(inguinal ou femural próximo aos membros inferiores e cervical, lombar ou
dorsal quando próxima aos membros superiores), o paciente usualmente
desenvolve sintomas como febre alta, dor de cabeça, calafrios e dores
generalizadas, podendo ter complicações gastrintestinais, como náuseas,
3
4
vômitos e diarréia. Quando diagnosticada precocemente é tratável em
no
mínimo 50% dos casos (BUTLER et al., 1983).
A peste septicêmica geralmente aparece na fase terminal da forma
bubônica não tratada. Clinicamente se confunde com outras septicemias
causadas por outros bacilos Gram-negativos, com calafrios, febre alta,
dispnéia, hemorragias cutâneas e distúrbios gastrintestinais. Quando não
tratada sobrevêm o coma e a morte no fim de 2 a 3 dias (BUTLER et al., 1983).
A peste pneumônica é a forma mais preocupante, pela alta letalidade e
pelo seu alto potencial de contágio. Quando transmitida homem a homem pode
provocar epidemias explosivas. Pode ser primária ou secundária à peste
bubônica ou septicêmica por disseminação hematogênica. O período de
incubação é curto (2 a 3 dias) e o quadro infeccioso é grave, de evolução
rápida, com sinais e sintomas pulmonares discretos. Os doentes apresentam
dor torácica, respiração curta e rápida, cianose e expectoração sanguinolenta
rica em bacilos pestosos (BUTLER et al., 1983).
As três formas da doença respondem bem a antibioticoterapia
apropriada,
reduzindo
significativamente
a
mortalidade.
As
drogas
preconizadas para o tratamento são: estreptomicina, cloranfenicol, tetraciclina e
sulfazidina. Atualmente, as quinolonas vêm sendo utilizadas, especialmente em
casos graves (WHO, 1999).
1.5 Prevenção e Controle
A vigilância nos focos é realizada através da pesquisa da Y. pestis nos
roedores e suas pulgas e na detecção de anticorpos antipestosos circulantes
em animais sentinelas: carnívoros domésticos (cães e gatos) e algumas
4
5
espécies de roedores resistentes à infecção. As medidas de controle abrangem
a notificação dos casos humanos, tratamento adequado dos doentes e
profilaxia dos comunicantes, além da eliminação das pulgas com inseticidas
apropriados e a desratização e anti-ratização, dificultando-se o acesso do
roedor, ao abrigo, alimento e água (VIEIRA; COELHO, 1998; FUNASA, 2002).
1.6 Agente Etiológico
O gênero Yersinia da família Enterobacteriaceae é composto de 11
espécies, das quais três são patógenos humanos (Y. pestis, Y. enterocolitica e
Y. pseudotuberculosis).
O agente etiológico da peste, Y. pestis, é um bacilo Gram-negativo,
imóvel, anaeróbio facultativo, com coloração bipolar (MOLLARET; THALL,
1974). A espécie caracteriza-se por apresentar baixo número de reações
bioquímicas positivas e grande homogeneidade, com um único sorotipo, um
fagotipo e um biotipo. Devignat (1951) identificou três biovars ou variedades
geográficas: Antiqua (G+, N+), Medievalis (G-, N+) e Orientalis (G-, N+) com base
na capacidade das culturas em fermentar o glicerol e converter o nitrato a
nitrito. Cada variedade foi associada à primeira, segunda e terceira pandemia,
respectivamente. Entretanto estes biovars não apresentam diferenças quanto à
virulência ou formas clínicas da doença.
5
6
1.7 Genoma da Y. pestis
A virulência da Y. pestis é codificada em genes plasmidiais e
cromossomais. As cepas típicas de Y. pestis apresentam três plasmídeos
(pYV, pFra, pPst) que codificam importantes fatores de virulência.
O plasmídeo pYV (70 Kb) está presente nas três espécies de yersínias
patogênicas. Codifica a dependência ao cálcio a 37ºC, proteínas antifagocíticas
(Yops), proteínas regulatórias e um sistema de secreção. Estes produtos
permitem sobrevivência e multiplicação da bactéria nos tecidos linfóides dos
hospedeiros (CORNELIS et al., 1998).
O plasmídeo pFra (100Kb) contém o gene caf1 que codifica para a subunidade estruturai da proteína capsular F1 que possui atividade antifagocítica,
e o gene da toxina murina (ymt), envolvida no processo de transmissão pelas
pulgas (LINDLER et al., 1998).
No plasmídeo pPst (9,5 Kb) estão os genes que codificam a bacteriocina
pesticina (pst), uma coagulase e um ativador do plasminogênio (pla), requerido
para o bloqueio do trato digestivo das pulgas e disseminação no sítio da picada
da pulga (SODEINDE; GOGUEN, 1988).
No cromossomo foi descrita uma região de 102 Kb denominada locus
pgm, limitado por duas seqüências de inserção (IS100). Esta região contém um
segmento de aquisição de ferro que é considerada uma ilha de patogenicidade
da Y. pestis (HPI) e um segmento de pigmentação, e é sujeita a extensivas
deleções em seus segmentos, por recombinação entre as IS. No segmento de
aquisição de ferro existe um grupo de genes (irp2, ybt) envolvidos na
biossíntese do sideróforo yersiniabactina. O segmento de pigmentação contém
o locus hms responsável pela capacidade da bactéria desenvolver colônias
6
7
pigmentadas (pgm+) no meio agar Vermelho Congo (BUCHRIESER et al.,
1998).
Várias seqüências de inserção (IS) são encontradas em múltiplas cópias
no genoma da Y. pestis, integradas no cromossomo e/ou nos plasmídeos
(FILIPPOV et al., 1995; SIMONET et al., 1996; HUANG et al., 2002; MOTIN et
al., 2002).
As IS são pequenos segmentos de DNA bacteriano (<2,5 Kb) capazes
de se transportar dentro do cromossomo ou para outro cromossomo, causando
inserções, deleções e recombinações, resultando em mutações silenciosas,
inativação de genes, bloqueio ou inativação do controle da expressão gênica
(MAHILLON; CHANDLER, 1998).
Na cepa CO92 foi descrito um total de 140 cópias das IS, sendo 66 da
IS1541, 44 da IS100, 21 da IS285 e nove da IS1661; a cepa KIM apresentou
uma pequena diferença no número de IS tendo sido encontradas 58 cópias da
IS1541, 35 de IS100, 19 da IS285 e 10 cópias da IS 1661 (PARKHILL et al.,
2001; DENG et al., 2002).
1.8 Diagnóstico
1.8.1 Clínico
O diagnóstico clínico geralmente é baseado nos sintomas dos pacientes
e histórico epidemiológico. A peste bubônica é caracterizada pela presença dos
bubões, febre alta e prostração (BUTLER et al., 1983).
7
8
1.8.2 Laboratorial
O diagnóstico laboratorial é realizado por técnicas bacteriológicas (identificação
e isolamento da bactéria) e/ou sorológicas (detecção de anticorpos
antipestosos). Para análise bacteriológica podem ser utilizadas amostras de
sangue, aspirado de bubão, fluido cefalorraquidiano, secreção brônquica, e
medula óssea (no homem), além de fragmentos de vísceras de roedores e
triturados de pulgas. O diagnóstico sorológico é realizado em soro humano, dos
roedores e outros mamíferos (CHU, 2000).
1.8.2.1 Bacteriológico
Exame Direto
São utilizadas técnicas de coloração que empregam corantes como o azul de
metileno (Azul de Loeffler), corante de Wayson, ou o método de Gram, em
esfregaços de fluído de bubão, líquido céfalorraquidiano (LCR), esputo ou
sangue (no homem), amostras de sangue, medula e vísceras dos roedores
infectados (CHU, 2000).
Cultura
Para isolamento e identificação da Y. pestis, diversas amostras de
material humano ou dos animais são cultivadas em placas de gelose (base de
agar sangue: BAB, Difco) a 28ºC, em pH na faixa de 7,4 a 7,6 por 48 horas. As
colônias da Y. pestis são translúcidas e pequenas. A identificação da bactéria é
confirmada pela sensibilidade ao bacteriófago antipestoso específico. Para o
crescimento da bactéria recomenda-se o brain heart infusion broth (BHI, Difco),
nas mesmas condições de temperatura e pH utilizadas para crescimento em
8
9
meio sólido. A cultura após 24 a 48 horas apresenta um sobrenadante flocular
sem turvação (KARIMI, 1978).
1.8.2.2 Sorológico
A prova de hemaglutinação (HA) é o teste recomendado pela
Organização Mundial de Saúde, utiliza hemácias de carneiro sensibilizadas
com o antígeno capsular F1, da Y. pestis, para detectar anticorpos em soros
humanos, de roedores e de carnívoros (CHU, 2000).
1.8.2.3 Molecular
Como alternativa aos métodos convencionais de diagnóstico da peste,
tem sido utilizada a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) e suas
variações: Nested-PCR, Multiplex-PCR, para detectar a Y. pestis diretamente
em pulgas, fragmentos de vísceras de roedores e em sangue. Na MultiplexPCR, é possível identificar simultaneamente vários genes presentes em
plasmídeos e no cromossomo da Y. pestis em uma mesma reação
(HINNEBUSCH; SCHWAN, 1993; CAMPBELL et al., 1993; NORKINA et al.,
1994; TSUKANO et al., 1996; LEAL; ALMEIDA 1999).
1.9 Epidemiologia Molecular da Y. pestis
A Y. pestis é uma espécie bastante homogênea; possui apenas um
biotipo, um fagotipo e um sorotipo. Entretanto, Devignat (1951) identificou três
biovars ou variedades geográficas que foram associadas a cada uma das três
pandemias. Posteriormente através da análise do polimorfismo de restrição do
rDNA (ribotipagem) foram identificados 20 ribotipos que foram associados aos
9
10
biovars (GUIYOULE et al., 1994; 1997). Foi sugerido que um clone do ribotipo
O (biovar Antiqua: G+, N+) foi responsável pela primeira pandemia de peste;
outra variante do ribotipo O que perdeu a capacidade de reduzir o nitrato, foi
responsável
pela
segunda
pandemia
(biovar
Medievalis:
G+,
N-);
posteriormente outra variante do ribotipo O, o ribotipo B, perdeu a capacidade
de fermentar o glicerol (biovar Orientalis: G-, N+) e causou a terceira pandemia.
Esta hipótese é sustentada pelo perfil de restrição com as enzimas EcoRI e
EcoRV dos dois clones que diferem apenas pela perda de um sítio de restrição
no ribotipo B (GUIYOULE et al., 1994; 1997).
Outros métodos moleculares como a análise da Variabilidade do Número
de Repetições em tandem (VNTR), e Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE)
estão sendo utilizados para tipagem da Y. pestis (KLEVYTSKA et al., 2001;
HUANG et al., 2002).
A análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição reconhecidos por
sondas derivadas das seqüências de inserção (IS) da Y. pestis mostrou-se
eficaz para estudos epidemiológicos e taxonômicos para a tipagem da Y. pestis
(HUANG et al., 2002).
10
11
1.10 Justificativa
A peste está atualmente incluída entre as doenças re-emergentes pela
Organização Mundial de Saúde (OMS), em vista da ocorrência de epidemias
no Zaire, Tanzânia, Índia e Madagascar (WHO, 2003). No Brasil, ainda
persistem vários focos naturais, principalmente na região Nordeste, exigindo
ações permanentes de vigilância e controle. O surgimento de cepas de Y.
pestis multi-drogas resistentes (GALIMAND et al., 1997), e a recente
preocupação com ações de bioterrorismo (INGLESBY et al., 2000) renovaram
o interesse em técnicas de tipagem dos isolados de Y. pestis para
rastreamento de cepas e para determinar a origem dos isolados (HUANG et al.,
2002).
Vários estudos: sensibilidade aos antimicrobianos, perfil protéico, perfil
plasmidial, tipagem por RAPD-PCR, amplificação das regiões espaçadoras
intergênicas 16S-23S (Ribotipagem-PCR) já foram realizados nas cepas
brasileiras de Y. pestis, entretanto nenhuma correlação entre as diferenças
observadas e as características epidemiológicas dos isolados foi encontrada
(HUDSON et al., 1973; 1975; ABATH et al., 1989; LEAL et al., 1996; 1997;
CAVALCANTI et al., 2002; SOBREIRA, 2002).
A análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição reconhecidos
com sondas derivados das seqüências de inserção da Y. pestis (RFLP-IS)
revelou-se promissora para a tipagem e estudos sobre a distribuição geográfica
das cepas (HUANG et al., 2002; MOTIM et al., 2002).
O RFLP-IS poderá contribuir para o conhecimento dos clones existentes
no Brasil, e na identificação de novos clones que surgirem por mutações
espontâneas ou pela introdução de uma nova cepa.
11
12
2. PERGUNTA-CONDUTORA
Qual a variabilidade genética identificada pela sonda de
IS100 em isolados de Yersinia pestis do estado do
Ceará, Brasil?
12
13
3. OBJETIVO
3.1 Objetivo geral
Verificar polimorfismos genéticos e fenotípicos em cepas de Yersinia
pestis, isoladas do estado do Ceará, Brasil.
3.2 Objetivos específicos
Caracterizar o padrão de restrição reconhecido pela sonda IS100 em
isolados de Y. pestis;
Determinar o conteúdo plasmidial, presença de marcadores de
virulência e o fenótipo de pigmentação de cepas de Y. pestis;
Verificar associações entre o perfil determinado pelo RFLP-IS100 e o
perfil plasmidial, os marcadores de virulência e o fenótipo de pigmentação das
cepas de Y. pestis.
Verificar associações entre o perfil determinado pelo RFLP-IS100 e a
origem dos isolados de Y. pestis.
13
14
4. PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS
4.1 Desenho de Estudo
O estudo epidemiológico é descritivo de uma série temporal de casos,
constituída de uma população representada por cepas de bactérias isoladas de
diferentes fontes (humano, roedor, pulga), de diferentes áreas geográficas do
estado do Ceará, em momentos distintos no tempo.
4.2 Área de Estudo
As cepas utilizadas neste estudo são provenientes de focos da Serra da
Ibiapaba e da Serra de Baturité no estado do Ceará (ARAGÃO et al., 2002;
CAVALCANTI et al., 2002) (Figura 1).
4.3 População de Estudo
Foram analisadas 43 cepas de Y. pestis de pacientes (22), roedores (20)
e pulgas (1), isoladas no período de 1971 a 1997, nos focos da Serra da
Ibiapaba (36) e Baturité (7). A tabela 1 mostra a distribuição das cepas pela
origem. Após isolamento as cepas foram estocadas em câmara fria a 4ºC em
camada alta de gelose (BAB) na bacterioteca do Departamento de
Microbiologia do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães da Fundação Oswaldo
Cruz (CPqAM/FIOCRUZ) (ALMEIDA et al., 1985; 1989; LEAL; ALMEIDA,
1999).
14
15
Figura 1. Área de Estudo: Estado do Ceará com as áreas de focos de peste.
15
16
4.4 Reativação e Caracterização das Cepas
As cepas foram reativadas por semeio em caldo (BHI), incubadas a 28ºC
por 48 horas, e em seguida plaqueadas em gelose. Para confirmação da
identificação e pureza as culturas foram testadas quanto à sensibilidade ao
fago antipestoso (KARIMI, 1978). Para extração do DNA total e plasmidial as
cepas foram cultivadas em BHI a 28ºC por 24 horas.
Uma alíquota de cada cultura, representante do isolado estudado foi
conservada em camada alta de gelose a 4ºC e em estoque congelado a -80ºC
em BHI com 25% de glicerol, para estudos futuros.
4.5 Provas Bioquímicas
As provas de fermentação do glicerol e redução do nitrato foram
realizadas segundo Bahmanyar e Cavanaugh (1978). Para verificar a
capacidade de fermentar o glicerol as culturas, crescidas previamente em BHI
a 28ºC por 24 horas, foram inoculadas em caldo (Phenol red broth, Difco)
contendo 1% de glicerol e incubadas a 37ºC por 72 horas. A prova de redução
do nitrato foi realizada semeando as culturas em BHI, em caldo Nutriente
(Difco) contendo nitrato de potássio (KNO3 1%); depois de incubadas a 37ºC
por 72 horas, a reação foi revelada pela adição das soluções A (4g de ácido
sulfanílico em 500ml de ácido acético 5N) e B (2,5g de 1- cloreto de
naphtalamina em 500ml de ácido acético 5N). Como controle foi utilizado a
cepa Y. pestis PKR 684.
16
17
G+
N+
Antiqua
G+
NMedievalis
GN+
Orientalis
Figura 2. Variedades Geográficas ou Biovars de Yersinia pestis identificadas
com base na fermentação do glicerol e redução do nitrato.
17
18
4.6 Fenótipo de Pigmentação
Para determinar o fenótipo da pigmentação (pgm) as culturas foram
plaqueadas no meio ágar Vermelho Congo segundo Bahmanyar e Cavanaugh
(1978), por 72 horas a 28º C. Como controle foi utilizada a cepa Y. pestis EV76
(pgm-).
4.7 Extração de DNA Plasmidial
O DNA plasmidial das cepas foi extraído segundo protocolo descrito por
Leal (1998), a partir de 1000µL de cultura em BHI. O DNA foi submetido à
eletroforese em gel de agarose 0,6%, corado com brometo de etídio e
visualizado em luz ultravioleta (UV). Foi utilizado como controle a Y. pestis
EV76, que possui os três plasmídeos típicos da espécie (9,5; 70; 100Kb).
4.8 Extração de DNA total
O DNA total ou genômico das cepas foi extraído segundo protocolo
descrito por Leal (1998), a partir de 1000µL da cultura, e quantificado por
comparação com DNA do fago λ clivado com a enzima HindIII, em gel de
agarose 1%, corado com brometo de etídio e visualizado em luz ultravioleta.
4.9 Marcadores de Virulência
Para
verificar
a
presença
de
marcadores
de
virulência
mais
característicos em Y. pestis foi empregada a técnica Multiplex-PCR, onde em
uma mesma reação são utilizados quatro pares de primers direcionados aos
genes plasmidiais pla, lcrV e caf1 e ao gene irp2 cromossomal (LEAL;
ALMEIDA, 1999).
18
19
Pgm+
A
Pgm-
B
Figura 3. Crescimento de Yersinia pestis no meio agar Vermelho Congo. A:
Colônias pigmentadas, vermelhas (pgm+); B: Colônias não-pigmentadas,
brancas (pgm-).
19
20
As reações foram preparadas em um volume total de 25µL por tubo
contendo a seguinte mistura: tampão (KCl a 500mM; Tris-HCl (pH 8,4) a
200mM; MgCl2 a 1,5 mM; cada didesoxirribonucleotídeos dATP, dCTP, dGTP
e dTTP a 200 µM (Invitrogen Life Technologies); 20 pmol de cada primer; 1U
da enzima Taq DNA polimerase; 20ng do DNA total.
As amplificações foram realizadas em termociclador (Perkin-Elmer),
programado para 25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 2 minutos a 50ºC, 3 minutos a
72ºC e uma etapa final de 7 minutos a 72ºC. O produto da amplificação foi
analisado, por eletroforese, em gel de agarose a 1% em tampão TBE (Tris
Borato), sob voltagem de 100V, corado em brometo de etídio e visualizado sob
UV. Em cada grupo de amostras analisadas foi incluído um tubo com 20ng de
DNA purificado da cepa Y. pestis P.CE 882, como controle positivo e um tubo
sem DNA como controle negativo.
4.10 Amplificação da IS100
Foram realizados ensaios de amplificação com o DNA de 26 cepas de Y.
pestis (Tabela 1) e um par de primers dirigidos a IS100, descrito por Huang, et
al.
(2002):
IS100-1
(5’GCGCTGGCTGCACGATGTC3’)
e
IS100-2
(5’GCGCTGGCTGCACGATGTC3’).
As reações foram preparadas em um volume total de 25µL nas
condições já descritas.
As amplificações foram realizadas em termociclador (Perkin-Elmer),
programado para 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC, 1 minuto e 30
segundos a 72ºC e uma etapa final de 7 minutos a 72ºC. O produto da
amplificação foi analisado, por eletroforese, em gel de agarose 1% em tampão
20
21
TBE (Tris Borato), sob voltagem de 100V, corado em brometo de etídio e
visualizado sob UV.
4.11 Polimorfismo dos Fragmentos de Restrição reconhecidos pela sonda
IS-100 (RFLP-IS100)
4.11.1 Construção da sonda IS100
A sonda IS100 foi obtida pela amplificação do DNA da cepa Y. pestis
P.CE 05 com os primers IS 100-1 e IS 100-2 descritos por Huang et al. (2002).
A confirmação de que havia sido amplificado o segmento esperado foi obtida
pelo seqüenciamento do segmento amplificado utilizando o Kit Thermo
Sequenase CyTM5 Dye Terminator Cycle Sequencing (Amersham Biosciences)
seguindo protocolo do fornecedor em seqüenciador automático Alf II
(Amersham Biosciences), e a seqüência obtida foi comparada com seqüências
publicadas no Geny Bank www.ncbi.nlm.nih.gov/.
A marcação da sonda foi realizada durante a reação de PCR, conforme
descrito no item 4.10, utilizando a mistura de dNTP marcada com digoxigenina
do Kit digoxigenina-dUTP DIG DNA Labeling and Detection (cat. No. 1093657 Boehringer Mannheim). Após a amplificação, a sonda foi quantificada e titulada
para determinação da concentração a ser utilizada na hibridização.
4.11.2 Clivagem e transferência
Um µg do DNA total de 14 cepas (tabela 2) foi digerido com 1U da
enzima
HindIII
em
tampão
recomendado
pelo
fabricante
(Amersham
Biosciences) por 24 horas a 37ºC. A separação dos fragmentos foi realizada
em gel de agarose 0,8% com 30cm de comprimento em Tampão TBE, sob
21
22
voltagem de 50V por 18 horas. O gel foi corado com brometo de etídio por 30
minutos e fotografado sob UV. O DNA foi transferido para membranas de
náilon pré-tratadas em tampão 20xSSC, segundo Southern (1975), no
VacuGene XL (Pharmacia Biotech). Após a transferência as membranas foram
imersas em 20xSSC por 10 minutos para eliminar a agarose, e expostas à UV
por 10 minutos para fixar o DNA.
4.11.3 Hibridização
As membranas foram pré-hibridizadas em 100mL do tampão de
hibridização “standard” (5xSSC, N-lauroysarcosine, SDS 0,1%, 0,02% de
agente de bloqueio) incubadas por 30 minutos em forno (HybaidTM) a 68ºC. A
hibridização foi realizada em 50mL do tampão de hibridização “standard” e 10µl
da sonda por 16 horas em forno (HybaidTM) a 68ºC.
Após hibridização as membranas foram lavadas, 2 vezes por 5 minutos
a temperatura ambiente no tampão de lavagem 1 (0,1% SDS; 2XSSC) sob
agitação e 2 vezes por 15 minutos em tampão de lavagem 2 (0,1%SDS;
0,1xSSC) a 68ºC sob agitação, para remoção das moléculas da sonda ligadas
inespecíficamente.
4.11.4 Detecção
Depois da hibridização as membranas foram imersas no tampão de
lavagem (ácido maléico, 0,3% Tween 20) por 1 a 5 minutos, incubadas no
tampão de bloqueio por 30 minutos, e com o conjugado anti-DIG-AP
(Boehringer Mannheim) por 30 minutos.
22
23
As membranas foram lavadas 2 vezes por 15 minutos no tampão de
lavagem, e incubadas em solução recém preparada, de substrato cromogênico
(NBT/Xphosphate) (Boehringer Mannheim), por 5 minutos, no escuro evitando
exposição à luz.
A formação do precipitado de cor iniciou-se em poucos minutos e a
reação foi interrompida com água deionizada, quando a intensidade das
bandas foi considerada satisfatória.
23
24
5. RESULTADOS
5.1 Provas Bioquímicas
Trinta e oito cepas se revelaram glicerol negativo (G-) e nitrato positivo
(N+) e se enquadram no biovar Orientalis e cinco cepas se revelaram G- e N(Tabela 1) não sendo enquadradas em nenhuma das três variedades
bioquímicas (Fig.4).
5.2 Fenótipo de Pigmentação
Todas as cepas analisadas produziram colônias pigmentadas. 40 cepas
produziram colônias pigmentadas, vermelhas (pgm+) e 3 cepas produziram
tanto
colônias
pigmentadas,
vermelhas
(pgm+)
quanto
colônias
não
pigmentadas, brancas (pgm-) em diferentes proporções no meio ágar Vermelho
Congo.
5.3 Perfil Plasmidial
As 43 cepas estudadas apresentaram quatro perfis plasmidiais
diferentes. A presença dos três plasmídeos típicos (pFra, pYV e pPst), foi
observada em 30 cepas. Em três cepas foi visualizado os plasmídeos pYV e
pPst, em seis cepas os plasmídio pFra e pYV e em quatro cepas apenas o
plasmídeo pYV foi visualizado (Fig. 5, Tabela 1).
5.4 Marcadores de Virulência
Das 43 cepas analisadas foi observada amplificação dos quatro genes
alvo em 31 cepas. Seis cepas amplificaram apenas os genes irp2, caf1 e lcrV;
quatro cepas amplificaram os genes irp2, lcrV e pla, e duas cepas amplificaram
24
25
apenas os genes lcrV e irp2. A amplificação dos genes irp2 e lcrV foi observada
em todas as 43 cepas analisadas (Fig. 6 , Tabela 1).
5.5 Amplificação da IS100
O DNA de 26 cepas (Tabela 1) foi utilizado em ensaios de PCR com
primers específicos para amplificar a seqüência de inserção IS100. O
fragmento esperado foi amplificado em apenas nove cepas, nas outras 15
cepas nenhuma banda foi visualizada. A cepa P.CE 05 foi escolhida como
referência para os ensaios de tipagem por RFLP–IS100, porque a banda
amplificada sempre se mostrou bastante forte e nítida nas diversas repetições.
5.6 Análise do Polimorfismo dos Fragmentos de Restrição reconhecidos
pela sonda IS100 (RFLP-IS100)
Numerosas bandas foram reconhecidas pela sonda. Na parte superior
do gel as bandas estavam muito próximas e pouco nítidas dificultando a
análise. Na metade inferior as bandas se apresentaram bem nítidas e
separadas e facilmente distinguíveis umas das outras (Fig. 7). Para as análises
foram consideradas
um total de 19 bandas nítidas e bem separadas que
permitiram construir um esquema baseado na presença ou ausência de seis a
nove bandas (Fig. 8).
Dessa maneira foram identificados oito perfis denominados de grupo I a
GVIII (GI a GVIII). O perfil da P.CE 05 usada como referência foi considerado
GI. Quatro outras cepas apresentaram perfis semelhantes ao da cepa de
referência e foram incluídas no mesmo grupo GI. Três cepas apresentaram
outro perfil, semelhante ao do GI com uma banda a mais e foram classificadas
25
26
no GII. As outras seis cepas apresentaram perfis diferentes entre si e foram
classificadas nos grupos GIII a GVIII (Tabela 2).
Das cinco cepas incluídas no GI, quatro foram isoladas em 1979,
originadas da mesma espécie de roedor, Bolomys lasiurus, do mesmo
município, Guaraciaba do Norte, localizado na Serra da Ibiapaba. A outra cepa
foi originada de um lote de pulgas (Pulex irritans) do mesmo município, em
1982.
Três cepas do GII também foram todas do foco da Serra da Ibiapaba,
sendo uma isolada em 1980, originada de B. lasiurus do município de Ipueiras
e as outras duas isoladas em 1982, uma originada de B. lasiurus e a outra de
um paciente do município de Ipu.
26
27
GN+
Orientalis
GNAtípica
Figura 4. Variedades Geográficas ou Biovars de Yersinia pestis encontradas
nas cepas analisadas.
27
28
1
2
3
4
5
pFra
pYV
pPst
Figura 5. Gel de agarose 0,6% representativo dos perfis plasmidiais das cepas
de Y. pestis. Linhas, 1: P.CE 04; 2: P.CE 20; 3: P.CE 11; 4: P.CE 14; 5: EV76.
28
29
M 1
2 3
4
5 6 7 8
pla
lcrV
caf1
irp2
Figura 6. Gel de agarose 1% representativo das amplificações geradas por
PCR-Multiplex, com primers direcionados aos genes irp2, caf1, lcrV e pla das
cepas de Y. pestis. Linha M: 100pb DNA-ladder; 01: P.CE 03; 02: P.CE 04; 03:
P.CE 05; 04: P.CE 06; 05: P.CE 07; 06: P.CE 11; 07: P.CE 13; 08: P.CE 882.
29
30
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
Figura 7. Hibridização da sonda IS100 com fragmentos de DNA de cepas de Y.
pestis gerados pela clivagem do DNA total com a enzima HindIII. Linhas 01:
P.CE 01; 02: P.CE 03; 03: P.CE 04; 04: P.CE 05; 05: P.CE 06; 06: P.CE 07; 07:
P.CE 09; 08: P.CE 11; 09: P.CE 13; 10: P.CE 14; 11: P.CE 17; 12: P.CE 19; 13:
P.CE 20; 14: P.CE 21.
30
31
01
02
03
GI
04
05
06
07
GII
08
09
10
11
GIII
GIV
GV
12
13
GVI GVII GVIII
Figura 8. Representação Esquemática dos grupos obtidos pela hibridização da
sonda IS100 com DNA total de cepas de Y. pestis clivado com a enzima
HindIII. GI. Linhas 01: P.CE 04; 02: P.CE 05; 03: P.CE 06; 04: P.CE 07; 05:
P.CE 14; GII Linhas 06: P.CE 09; 07: P.CE 11; 08: P.CE 21; GIII. Linha 09:
P.CE 13; GIV. Linha 10: P.CE 03; GV. Linha 11: P.CE 19; GVI. Linha 12: P.CE
20; GVII. Linha 13: P.CE 17; GVIII. Linha 14: P.CE 01.
31
14
33
Tabela 1. Distribuição das cepas estudadas segundo a fonte, foco, Município e ano de Isolamento,
Amplificação da IS100, conteúdo plasmidial e genes de virulência.
Cepa
Fonte
Foco
Município
Ano de
Amplificação
Conteúdo plasmidial/Amplificação dos genes
Isolamento
IS100
de virulência
pFra/ caf1
pYV/ lcrV
pPst/ pla
P.Exu 540
Humano
Ibiapaba
São Benedito
1971
NR
+/+
+/+
+/+
P.Exu 554
Humano
Ibiapaba
São Benedito
1971
NR
+/+
+/+
+/+
P.Exu 509
Humano
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1971
NR
-/+
+/+
+/+
P.Exu 527
Humano
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1971
+
-/-
+/+
-/-
P.Exu 541
Humano
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1971
NR
-/+
+/+
-/-
P.Exu 542*
Humano
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1971
+
+/+
+/+
+/+
P.Exu 538
Humano
Ibiapaba
Ipu
1971
+
+/+
+/+
+/+
P.Exu 557
Humano
Ibiapaba
Ipu
1972
NR
+/+
+/+
-/-
P.Exu 558
Humano
Ibiapaba
Ipu
1972
NR
+/+
+/+
+/+
P.Exu 556
Humano
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1972
NR
+/+
+/+
+/+
P.CE 01
Humano
Ibiapaba
Ipu
1978
NR
+/+
+/+
-/-
P.Exu 789
Humano
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1978
NR
+/-
+/+
+/+
P.Exu 804
Humano
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1978
NR
+/+
+/+
+/+
P.Exu 797
Rattus rattus
Ibiapaba
Ipu
1978
NR
+/+
+/+
+/+
P.Exu 792*
Humano
Ibiapaba
Ipu
1978
NR
+/+
+/+
+/+
P.Exu 801
Humano
Ibiapaba
Ipu
1978
+
+/+
+/+
+/+
P.Exu 807*
Humano
Ibiapaba
Ipu
1978
NR
-/+
+/+
+/+
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipu
1979
+
+/+
+/+
+/+
P.CE 03
33
34
Cepa
Fonte
Foco
Município
Ano de
Amplificação
Conteúdo Plasmidial/Amplificação dos genes
Isolamento
IS100
de virulência
pFra/ caf1
PYV/ lcrV
pPst/ pla
P.CE 04
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
+
+/+
+/+
-/+
P.CE 05
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
+
+/+
+/+
+/+
P.CE 06
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
-
+/+
+/+
+/+
P.CE 07
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
-
+/+
+/+
+/+
P.Exu 835
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipueiras
1979
-
+/+
+/+
+/+
P.Exu 833
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
-
+/+
+/+
+/+
P.Exu 842
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
-
+/+
+/+
+/+
P.Exu 809
Humano
Ibiapaba
Ipu
1979
+
+/+
+/+
+/+
P.Exu 861
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipueiras
1980
-
+/-
+/+
+/+
P.CE 09*
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipueiras
1980
-
+/+
+/+
+/+
P.CE 11
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipu
1982
-
-/-
+/+
-/-
P.CE 14
Pulex irritans
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1982
-
+/+
+/+
+/+
P.CE 18
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipueiras
1982
NR
+/-
+/+
+/+
P.CE 19
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipueiras
1982
NR
+/+
+/+
-/-
P.CE 20
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Iboapina
1982
-
-/-
+/+
+/+
P.CE 21
Humano
Ibiapaba
Ipu
1982
-
+/+
+/+
+/+
P.CE 30
Calomys callosus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1986
-
-/+
+/+
-/+
P.CE 882
Humano
Ibiapaba
Ipu
1997
+
+/+
+/+
+/+
P.Exu 795
Humano
Baturité
Aratuba
1978
NR
+/+
+/+
+/+
P.Exu 796
Humano
Baturité
Aratuba
1978
NR
+/+
+/+
+/+
Bolomys lasiurus
Baturité
Aratuba
1982
-
+/+
+/+
+/+
P.CE 17
34
35
Cepa
Fonte
Foco
Município
Ano de
Amplificação
Conteúdo plasmidial/Amplificação dos genes
isolamento
IS100
de virulência
pFra/ caf1
pYV/ lcrV
pPst/ pla
P.CE 24
Rattus rattus
Baturité
Redenção
1982
-
+/+
+/+
-/-
P.CE 13*
Bolomys lasiurus
Baturité
Maranguape
1982
-
+/+
+/+
+/+
P.CE 28
Bolomys lasiurus
Baturité
Mulungú
1983
-
+/+
+/+
+/+
P.CE 25
Humano
Baturité
Aratuba
1983
-
+/+
+/+
-/-
NR: Não Realizada; * Biovar atípico (G-, N-).
35
36
Tabela 2. Distribuição das cepas estudadas segundo origem, foco, município,
ano de isolamento e resultado da tipagem por RFLP-IS100.
Cepa
Fonte
Foco
Município
Ano
RFLP-IS100.
P.CE 01
Humano
Ibiapaba
Ipu
1978
GVIII
P.CE 03
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipu
1979
GIV
P.CE 04
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
GI
P.CE 05
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
GI
P.CE 06
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
GI
P.CE 07
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
GI
P.CE 09*
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipueiras
1980
GII
P.CE 11
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipu
1982
GII
P.CE 14
Pulex irritans
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1982
GI
P.CE 19
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipueiras
1982
GV
P.CE 20
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ibiapina
1982
GVI
P.CE 21
Humano
Ibiapaba
Ipu
1982
GII
P.CE 17
Bolomys lasiurus
Baturité
Aratuba
1982
GVII
P.CE 13*
Bolomys lasiurus
Baturité
Maranguape
1982
GIII
-
-
* Biovar atípico (G , N ).
36
37
6. DISCUSSÃO
A peste está incluída entre as doenças reemergentes pela Organização
Mundial da Saúde devido ao aumento mundial do número de casos humanos;
ocorrência de epidemias em vários países como Perú, India, Madagascar;
surgimento de cepas multidrogas resistentes; e a possibilidade do uso da Y.
pestis em ações de bioterorismo (GALIMAND et al., 1997; INGLESBY et al.,
2000; WHO, 2003). Estes aspectos renovaram o interesse no estudo da Y.
pestis especialmente aplicando técnicas que possibilitem determinar a origem
de uma cepa em uma área sem história de peste ou o surgimento de novos
clones nas áreas endêmicas.
A peste penetrou no Brasil, durante a última pandemia, em 1899, pelo
porto de Santos no estado de São Paulo. Inicialmente atingiu várias cidades
litorâneas, de onde foi eliminada através de medidas sanitárias adequadas,
mas focalizou-se entre os roedores silvestres, na área rural, principalmente na
região Nordeste. No estado do Ceará, a peste foi registrada pela primeira vez
na cidade de Fortaleza no ano de 1900, de onde se irradiou e posteriormente
se fixou em diversas áreas: Serra da Ibiapaba, Serra de Baturité e Chapada do
Araripe (WHO, 1965).
A incidência de peste humana e a ocorrência de epizootias declinaram
nas áreas de foco; entretanto, atividade residual de peste tem sido detectada
nos animais sentinelas, exigindo vigilância permanente dos focos (ARAGÃO et
al., 2002; FUNASA, 2002).
Vários estudos (sensibilidade aos antimicrobianos, perfil protéico, perfil
plasmidial, RAPD-PCR; ribotipagem) foram realizados nas cepas brasileiras de
Y. pestis, no entanto nenhuma correlação pode ser estabelecida entre as
37
38
diferenças encontradas e as características epidemiológicas (HUDSON et al.,
1973; ABATH et al., 1989; GUIYOULE et al., 1994; LEAL et al., 1997; LEAL,
1998; CAVALCANTI et al., 2002; SOBREIRA, 2002).
Esforços estão sendo feitos no sentido de encontrar marcadores
eficientes para detectar mudanças no genoma da Y. pestis que possam ser
associados às características epidemiológicas da peste no Brasil.
No presente estudo os resultados das reações de fermentação do
glicerol e redução do nitrato confirmaram que a maioria das cepas de Y. pestis,
dos focos do estado do Ceará, analisadas pertencem a variedade Orientalis (G, N+) correspondendo à cepa que se supõe ter sido disseminada durante a
última pandemia (DEVIGNAT, 1951). Cinco cepas não se enquadram nessa
variedade porque não fermentam o glicerol nem reduzem o nitrato. Esta
variedade (G-, N-) também não se enquadra nas outras variedades (G+, N+ e
G+, N-) descritas por Devignat (1951) sendo consideradas atípicas. Esta
característica (G-, N-) foi descrita em cepas brasileiras e de outros países
(HUDSON et al., 1973; KARIMI et al., 1974; MOTIN, et al., 2002; SOBREIRA,
2002), não se descartando a possibilidade de ter ocorrido mutação durante a
estocagem das cepas analisadas.
Todas as cepas dos focos do estado do Ceará, analisadas neste estudo,
produziram predominantemente colônias pigmentadas no meio agar Vermelho
Congo, e o gene irp2 foi amplificado em todas as cepas mesmo após repiques
e vários anos de estocagem. A informação para a pigmentação está codificada
em genes localizados no segmento de pigmentação; e o gene irp2 esta
localizado no segmento de aquisição do ferro do locus pgm. Este locus de
cerca
38
de
102
Kb,
limitado
por
duas
IS100, pode sofrer deleções
39
espontaneamente in vitro: por completo ou apenas no segmento de
pigmentação. Almeida et al. (1994) constataram a perda do gene irp2 in vitro
em cepas de Y. pestis brasileiras.
Estudos anteriores sobre o conteúdo plasmidial de cepas brasileiras de
Y. pestis mostraram que a maioria possui os três plasmídeos típicos (pFra,
pYV, pPst); entretanto, foi detectada a ausência de plasmídeos em algumas
cepas e a presença de bandas de DNA adicionais. A ocorrência de bandas de
DNA extra nessas cepas não foi relacionada a nenhuma característica
epidemiológica relevante e posteriormente foi mostrado que as mesmas podem
ter resultado de rearranjos dos plasmídeos típicos (multímeros do pPst, formas
lineares do pYV e do pFra), que ocorreram durante a estocagem, após o
isolamento (LEAL et al., 1997; 2000; CAVALCANTI et al. 2002).
As IS são distribuídas nos três plasmídeos e no cromossomo da Y.
pestis. O genoma da Y. pestis é muito plástico e a perda dos plasmídeos ou de
segmento de DNA cromossomal pode ocorrer in vitro durante a estocagem.
Além disso, as populações das culturas de Y. pestis são muito heterogêneas
(PROTSENKO et al. 1992); diferentes colônias da mesma cultura podem
apresentar conteúdo plasmidial diferente, assim como certos segmentos de
DNA podem estar presentes ou ausentes. Portanto perda de plasmídeos ou de
segmentos do DNA cromossomal poderiam interferir nos resultados da tipagem
por RFLP-IS100. Diante disto foi necessário determinar o perfil plasmidial e a
presença de genes de virulência plasmidiais e cromossomais para estabelecer
eventuais correlações com o resultado da RFLP-IS100. Para o estudo foram
selecionadas as amostras que apresentaram o perfil plasmidial e dos genes de
39
40
virulência mais próximas das cepas típicas de Y. pestis, tendo sido descartado
as variantes que apresentaram perfil atípico.
A tipagem de cepas brasileiras de Y. pestis por RAPD-PCR,
polimorfismo de restrição do rRNA e polimorfismo dos segmentos amplificados
com primers direcionados às regiões espaçadoras intergênicas 16S-23S não
detectou diferenças entre as cepas de Y. pestis estudadas (GUIYOULE et al.,
1994; LEAL, 1998; SOBREIRA, 2002).
Nas reações de PCR com o DNA total de 26 cepas e primers dirigidos a
IS100 da Y. pestis apenas nove cepas amplificaram o segmento esperado.
Este resultado foi surpreendente porque numerosas cópias de IS100 estão
presentes no genoma da Y. pestis (PARKHILL et al., 2001; DENG et al., 2002).
A EV76 que foi usada como controle da PCR com os primers da IS100,
surpreendentemente não amplificou a IS. Tal resultado sugere duas
possibilidades, mutação in vitro no fragmento da IS100, na região de
hibridização do primer ou falha técnica na PCR.
A análise dos fragmentos de restrição reconhecidos pela sonda
direcionada a IS100 possibilitou a identificação de oito perfis denominados GI a
GVIII (Fig. 7). O padrão de hibridização com maior concentração de bandas na
parte superior da membrana e bandas separadas na parte inferior foi
semelhante ao observado por Huang et al. (2002).
Vale salientar a presença de uma banda comum em todas as cepas. A
P. CE 17 isolada em 1982, originada de B. lasiurus do município de Aratuba na
serra de Baturité exibe um perfil totalmente diferente das demais exceto pela
banda comum. Em contrapartida o perfil da outra cepa do foco da serra de
Baturité analisada, P. CE 13, também isolada em 1982, originada de B. lasiurus
40
41
do município de Maranguape é bastante semelhante ao do GII, exceto pela
presença de uma banda.
Das cinco cepas do GI quatro foram isoladas em 1979, originadas da
mesma espécie de roedor, B. lasiurus, do mesmo município, Guaraciaba do
Norte, localizado na Serra da Ibiapaba. A outra cepa foi originada de um lote de
pulgas (P. irritans, a pulga do homem) três anos mais tarde (1982), no mesmo
município, sugerindo a permanência deste clone na região.
41
42
7. CONCLUSÕES
Não foi encontrada correlação entre os perfis de RFLP-IS100 e a
presença ou ausência dos plasmídeos. Não foi possível estabelecer correlação
com as variantes nitrato negativo. O RFLP-IS100 possibilitou o agrupamento de
cepas de um mesmo município do foco da Ibiapaba, originados de diferentes
hospedeiros e anos diferentes. Não foi possível demonstrar qualquer
associação no foco de Baturité uma vez que apenas duas cepas foram
analisadas. As outras cepas foram distribuídas em diferentes perfis, entretanto,
apresentaram a banda comum. Outros estudos são necessários com cepas de
outros focos do Brasil e de outros países para definir o potencial diagnóstico
desta banda como marcador geográfico em estudos epidemiológicos.
42
43
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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49
50
ARTIGO
TIPAGEM DE CEPAS DE Yersinia pestis DOS FOCOS DO ESTADO DO
CEARÁ, BRASIL, POR RFLP-IS100.
A.C. de Melo, A.M.P. de Almeida e N.C. Leal
Departamento de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães FIOCRUZ/MS, Recife (PE), Brasil.
Manuscrito a ser submetido para publicação na revista
Letters in Applied Microbiology
50
MELO, A.C Tipagem de Cepas de Yersinia pestis por RFLP-IS100
1
TIPAGEM DE CEPAS DE Yersinia pestis DOS FOCOS DO ESTADO DO
CEARÁ, BRASIL, POR RFLP-IS100.
A.C. de Melo, A.M.P. de Almeida e N.C. Leal
Departamento de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães FIOCRUZ/MS, Recife (PE), Brasil.
A.C. de Melo, A.M.P. de Almeida e N.C. Leal
Objetivos: Conhecer os clones de Yersinia pestis existentes nos focos do estado
do Ceará, Brasil, identificar um marcador que possibilite a detecção do
surgimento de novos clones ou a introdução de novas cepas.
Métodos e Resultados: As amostras foram caracterizadas quanto ao
polimorfismo dos fragmentos de restrição reconhecidos por sonda dirigida para a
IS100 (RFLP-IS100). Foram identificados oito perfis de RFLP-IS100
denominados GI a GVIII.
Conclusão, Significância e Impacto dos Resultados: Nenhuma correlação foi
encontrada entre os perfis de RFLP-IS100 e a presença ou ausência dos
plasmídeos, nem com as variantes nitrato negativo. A RFLP-IS100 possibilitou o
agrupamento de cepas de um mesmo município originadas de diferentes
hospedeiros e diferentes anos. As outras cepas estavam distribuídas em
diferentes perfis, entretanto, apresentaram uma banda comum. Outros estudos
são necessários com cepas de outros focos do Brasil e de outros países para
definir o potencial diagnóstico desta banda como marcador geográfico em
estudos epidemiológicos.
Correspondência para: Nilma Leal, CPqAM/FIOCRUZ/MS, Campus da UFPE, Cidade
Universitária, 50670-420 Recife (PE), Brasil. (e-mail: [email protected]).
Mestrado em Saúde Pública
MELO, A.C Tipagem de Cepas de Yersinia pestis por RFLP-IS100
2
INTRODUÇÃO
A Yersinia pestis é o agente causador da peste, doença infecciosa dos roedores
usualmente transmitida pelas pulgas, que ocasionalmente podem transmitir a doença a
outros mamíferos e ao homem.
Os registros disponíveis comprovam que a peste foi responsável por elevada
mortalidade em diferentes épocas (Perry e Fetherston, 1997). Atualmente mesmo com a
substancial redução da morbimortalidade continua apresentando grande importância,
acentuada em decorrência do surgimento de cepas resistentes aos antibióticos utilizados
na terapêutica padrão da peste, o que, considerando o seu possível uso na guerra
bacteriológica, a torna uma ameaça à humanidade (Galimand et al. 1997; Inglesby et al.
2000; WHO, 2003).
Pelos métodos fenotípicos de tipagem a Y. pestis se mostra uma espécie muito
homogênea, com apenas um sorotipo, um fagotipo e um biotipo com três biovars:
Antiqua, Medievalis e Orientalis ou Oceanica (Perry e Fetherston, 1997). Os biovars,
definidos pelos resultados das provas de fermentação do glicerol e redução do nitrato,
não se distinguem quanto ao poder patogênico ou a forma clínica da doença, mas têm
uma distribuição geográfica característica sendo por isto considerados variedades
regionais e foram associados a cada uma das pandemias do passado (Devignat, 1951).
Essas informações fenotípicas são insuficientes para rastrear a origem de uma
cepa ou o surgimento de novos clones, por isto vários métodos moleculares estão sendo
utilizados para avaliar semelhanças e diferenças intraespecíficas na Y. pestis. Através da
análise do polimorfismo de restrição do rDNA (ribotipagem) foram identificados 20
ribotipos que foram associados aos biovars (Guiyoule et al. 1994; 1997). A análise do
número variável de repetições em tandem (VNTR), e eletroforese em campo pulsado
(PFGE) estão sendo utilizados para tipagem da Y. pestis (Klevytska et al. 2001; Huang
Mestrado em Saúde Pública
MELO, A.C Tipagem de Cepas de Yersinia pestis por RFLP-IS100
3
et al. 2002) e a análise do polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição
reconhecidos por sondas derivadas das seqüências de inserção (IS) da Y. pestis (RFLPIS) permitiu discernir perfis variados entre cepas de diferentes origens (McDonough et
al. 1997; Huang et al. 2002; Motin et al. 2002).
Neste trabalho foi analisada uma coleção de cepas de Y. pestis dos focos do
estado do Ceará para melhor conhecimento dos clones existentes, identificar um
marcador útil para acompanhar uma possível introdução de novas cepas no território
brasileiro e possibilitar a detecção do surgimento de novos clones.
MATERIAIS E MÉTODOS
Bactérias e condições de cultivo
Foram utilizadas neste estudo 43 cepas de Y. pestis dos focos da Serra da Ibiapaba e
Serra de Baturité, estado do Ceará, isoladas no período de 1971 a 1997 (Almeida et al.
1985; Aragão et al. 2002). Depois de reativadas, as cepas foram cultivadas em caldo
BHI (Brain Heart Infusion Broth, Difco) a 28ºC por 24 a 48 horas para análises
bacteriológicas e moleculares. O fenótipo de pigmentação das culturas foi determinado
por semeio em agar Vermelho Congo segundo recomendações de Bahmanyar e
Cavanaugh (1978). As provas de fermentação do glicerol e redução do nitrato foram
realizados como descrito por Bahmanyar e Cavanaugh (1978). As cepas Y. pestis EV76
e PKR 684 foram utilizadas como controle.
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Extração de DNA plasmidial, total e amplificação de genes de virulência
O DNA plasmidial foi extraído segundo Leal et al. (1997), usando como controle a Y.
pestis EV76 que possui os três plasmídeos prototípicos. O DNA total foi extraído
segundo Maniatis (1982), e quantificado por comparação com DNA do fago λ clivado
com a enzima HindIII.
A presença dos genes plasmidiais pla, lcrV e caf1 e do gene cromossomal irp2
foi determinada por Multiplex-PCR em termociclador (Perkin-Elmer) utilizando DNA
extraído das culturas e primers específicos, conforme descrito por Leal e Almeida
(1999). Em cada grupo de amostras analisadas foi incluído um tubo com DNA
purificado da Y. pestis P.CE 882 (Leal e Almeida, 1999; Aragão et al. 2002; Cavalcanti
et al. 2002), como controle positivo e um tubo sem DNA como controle negativo.
Construção da sonda IS100
Inicialmente foram realizados ensaios de amplificação com o DNA total de 26 cepas e
um par de primers dirigidos a IS100 da Y. pestis descrito por Huang et al. (2002):
IS100-1
(5’GCGCTGGCTGCACGATGTC3’)
e
IS100-2
(5’GCGCTGGCTGCACGATGTC3’). Na Y. pestis P.CE 05 a banda amplificada se
mostrou forte e reprodutível nas sucessivas repetições e esta cepa foi considerada como
referência na tipagem das outras cepas. A confirmação de que havia sido amplificado o
segmento esperado foi obtida pelo seqüenciamento do segmento amplificado utilizando
o Kit Thermo Sequenase CyTM5 Dye Terminator Cycle Sequencing (Amersham
Biosciences) seguindo protocolo do fornecedor em sequenciador automático Alf II
(Amersham Biosciences) e a seqüência obtida foi comparada com seqüências
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publicadas no Geny Bank www.ncbi.nlm.nih.gov/. A marcação da sonda foi realizada
durante reação de PCR, utilizando a mistura de dNTP marcada com digoxigenina do Kit
digoxigenina-dUTP DIG DNA Labeling and Detection (cat. No. 1093657 - Boehringer
Mannheim). A sonda obtida foi quantificada e titulada para determinação da
concentração de uso.
Clivagem, transferência e hibridização
DNA total das 14 culturas (Tabela 1) foi digerido com a enzima HindIII (Amersham
Biosciences) e submetido a eletroforese em gel de agarose 0,8% em Tampão TBE, sob
voltagem de 50V por 18 horas. Os fragmentos de DNA foram transferidos dos géis para
membranas de náilon pré-tratadas em 20 x SSC, usando o sistema VacuGene XL
(Pharmacia Biotech). As pré-hibridizações e hibridizações foram realizadas a 68ºC em
forno (HybaidTM). A reação foi revelada usando o conjugado anti-DIG-AP (Boehringer
Mannheim) e o substrato cromogênico NBT/Xphosphate (Boehringer Mannheim).
RESULTADOS
Fermentação do glicerol e redução do nitrato
Trinta e oito cepas se revelaram glicerol negativo (G-) e nitrato positivo (N+) e se
enquadram no biovar Orientalis. Cinco cepas se revelaram G- e N- não sendo
enquadradas em nenhuma das três variedades bioquímicas.
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Pigmentação no meio agar Vermelho Congo
Todas as cepas analisadas produziram colônias pigmentadas. 40 cepas produziram
colônias pigmentadas, vermelhas (pgm+). Três cepas produziram tanto colônias
pigmentadas, vermelhas (pgm+) quanto colônias não pigmentadas, brancas (pgm-) em
diferentes proporções no meio ágar Vermelho Congo.
Conteúdo plasmidial
As 43 cepas estudadas apresentaram quatro perfis plasmidiais diferentes. A presença
dos três plasmídeos típicos (pFra, pYV e pPst), foi observada em 30 cepas. Em três
cepas foi visualizado os plasmídeos pYV e pPst, em seis cepas os plasmídio pFra e pYV
e em quatro cepas apenas o plasmídeo pYV foi visualizado.
Amplificação de genes de virulência por multiplex-PCR
Foi observada amplificação dos quatro genes alvo em 31 cepas. Seis cepas amplificaram
apenas os genes irp2, caf1 e lcrV; quatro cepas amplificaram os genes irp2, lcrV e pla,
e duas cepas amplificaram apenas os genes lcrV e irp2. A amplificação dos genes irp2 e
lcrV foi observada em todas as 43 cepas analisadas.
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Polimorfismo dos fragmentos de restrição reconhecidos pela sonda IS100 (RFLPIS100)
Numerosas bandas foram reconhecidas em 14 cepas submetidas à hibridização com a
sonda IS100. Para as análises foram consideradas um total de 19 bandas bem
individualizadas (Fig. 1) que possibilitaram a construção de um esquema baseado na
presença ou ausência de seis a nove bandas (Fig. 2). Dessa maneira foram identificados
oito perfis denominados GI a GVIII. O perfil da cepa P. CE 05 usada como referência
foi considerado GI. Quatro outras cepas apresentaram perfil semelhante ao da cepa de
referência e foram incluídas no mesmo grupo (GI). Três cepas apresentaram outro
perfil, semelhante ao do GI, porém com mais uma banda e foram enquadradas no GII.
As outras seis cepas apresentaram cada uma um perfil diferente e foram distribuídas nos
grupos GIII a GVIII. Uma banda estava presente em todas as amostras dos oito grupos
(Fig. 2).
Das cinco cepas incluídas no GI, quatro foram isoladas em 1979, originadas da
mesma espécie de roedor, Bolomys lasiurus, do mesmo município, Guaraciaba do
Norte, localizado na Serra da Ibiapaba. A outra cepa foi originada de um lote de pulgas
(Pulex irritans) do mesmo município, em 1982.
As três cepas do GII também foram todas do foco da Serra da Ibiapaba, sendo
uma isolada em 1980 originada de B. lasiurus do município de Ipueiras e as outras duas
isoladas em 1982, uma originada de B. lasiurus e a outra de um paciente do município
de Ipu.
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DISCUSSÃO
A peste está incluída entre as doenças reemergentes pela Organização Mundial da Saúde
devido ao aumento mundial do número de casos humanos; ocorrência de epidemias em
vários países como Perú, India, Madagascar; surgimento de cepas multidrogas
resistentes; e a possibilidade do uso da Y. pestis em ações de bioterorismo (Galimand et
al. 1997; Inglesby et al. 2000; WHO, 2003). Estes aspectos renovaram o interesse no
estudo da Y. pestis especialmente aplicando técnicas que possibilitem determinar a
origem de uma cepa em uma área sem história de peste ou o surgimento de novos clones
nas áreas endêmicas.
A peste penetrou no Brasil, durante a última pandemia, em 1899, pelo porto de
Santos no estado de São Paulo. Inicialmente atingiu várias cidades litorâneas, de onde
foi eliminada através de medidas sanitárias adequadas, mas focalizou-se entre os
roedores silvestres, na área rural, principalmente na região Nordeste. No estado do
Ceará, a peste foi registrada pela primeira vez na cidade de Fortaleza no ano de 1900, de
onde se irradiou e posteriormente se fixou em diversas áreas: Serra da Ibiapaba, Serra
de Baturité e Chapada do Araripe (WHO, 1965).
A incidência de peste humana e a ocorrência de epizootias declinaram nas áreas
de foco; entretanto, atividade residual de peste tem sido detectada nos animais
sentinelas, exigindo vigilância permanente dos focos (Aragão et al. 2002; FUNASA,
2002).
Vários estudos (sensibilidade aos antimicrobianos, perfil protéico, perfil
plasmidial, RAPD-PCR; ribotipagem) foram realizados nas cepas brasileiras de Y.
pestis, no entanto nenhuma correlação pode ser estabelecida entre as diferenças
encontradas e as características epidemiológicas (Hudson et al. 1973; Abath et al. 1989;
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Guiyoule et al. 1994; Leal et al. 1997; Leal, 1998; Cavalcanti et al. 2002; Sobreira
2002).
Esforços estão sendo feitos no sentido de encontrar marcadores eficientes para
detectar mudanças no genoma da Y. pestis que possam ser associados às características
epidemiológicas da peste no Brasil.
No presente estudo os resultados das reações de fermentação do glicerol e
redução do nitrato confirmaram que a maioria das cepas de Y. pestis, dos focos do
estado do Ceará, analisadas pertencem a variedade Orientalis (G-, N+) correspondendo
ao clone que se supõe ter sido disseminado durante a última pandemia (Devignat, 1951).
Cinco cepas não se enquadram nessa variedade porque não fermentam o glicerol nem
reduzem o nitrato. Esta variedade (G-, N-) também não se enquadra nas outras
variedades (G+, N+ e G+, N-) descritas por Devignat (1951) sendo consideradas atípicas.
Esta característica (G-, N-) foi descrita em cepas brasileiras e de outros países (Hudson
et al. 1973; Karimi et al. 1974; Motin, et al. 2002; Sobreira 2002), não se descartando a
possibilidade de ter ocorrido mutação durante a estocagem das cepas analisadas.
Todas as cepas dos focos do estado do Ceará, analisadas neste estudo,
produziram predominantemente colônias pigmentadas no meio agar Vermelho Congo, e
o gene irp2 foi amplificado em todas as cepas mesmo após repiques e vários anos de
estocagem. A informação para a pigmentação esta codificada em genes localizados no
segmento de pigmentação; e o gene irp2 esta localizado no segmento de aquisição do
ferro do locus pgm. Este locus de cerca de 102 Kb, limitado por duas IS100, pode sofrer
deleções espontaneamente in vitro: por completo ou apenas no segmento de
pigmentação. Almeida et al. (1994) constataram a perda do gene irp2 in vitro em cepas
de Y. pestis brasileiras.
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Estudos anteriores sobre o conteúdo plasmidial de cepas brasileiras de Y. pestis
mostraram que a maioria possui os três plasmídeos típicos (pFra, pYV, pPst);
entretanto, foi detectada a ausência de plasmídeos em algumas cepas e a presença de
bandas de DNA adicionais. A ocorrência de bandas de DNA extra nessas cepas não foi
relacionada a nenhuma característica epidemiológica relevante e posteriormente foi
mostrado que as mesmas podem ter resultado de rearranjos dos plasmídeos típicos
(multímeros do pPst, formas lineares do pYV e do pFra), que ocorreram durante a
estocagem, após o isolamento (Leal et al 1997; 2000; Cavalcanti et al. 2002).
As IS são distribuídas nos três plasmídeos e no cromossomo da Y. pestis. O
genoma da Y. pestis é muito plástico e a perda dos plasmídeos ou de segmento de DNA
cromossomal pode ocorrer in vitro durante a estocagem. Além disso, as populações das
culturas de Y. pestis são muito heterogêneos (Protsenko et al. 1992); diferentes colônias
da mesma cultura podem apresentar conteúdo plasmidial diferente, assim como certos
segmentos de DNA podem estar presentes ou ausentes. Portanto perda de plasmídeos ou
de segmentos do DNA cromossomal poderiam interferir nos resultados da tipagem por
RFLP-IS100. Diante disto foi necessário determinar o perfil plasmidial, presença de
genes de virulência plasmidiais e cromossomais para estabelecer eventuais correlações
com o resultado da RFLP-IS100. Para o estudo foram selecionadas as amostras que
apresentaram o perfil plasmidial e dos genes de virulência mais próximas das cepas
típicas de Y. pestis, tendo sido descartado as variantes que apresentaram perfil atípico.
A tipagem de cepas brasileiras de Y. pestis por RAPD-PCR, polimorfismo de
restrição do rRNA e polimorfismo dos segmentos amplificados com primers
direcionados às regiões espaçadoras intergênicas 16S-23S não detectou diferenças entre
as cepas de Y. pestis estudadas (Guiyoule et al. 1994; Leal, 1998; Sobreira, 2002).
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Nas reações de PCR com o DNA total de 26 cepas e primers dirigidos a IS100
da Y. pestis apenas nove cepas amplificaram o segmento esperado. Este resultado foi
surpreendente porque numerosas cópias de IS100 estão presentes no genoma da Y.
pestis (Parkhill et al. 2001; Deng et al. 2002). A EV76 que foi usada como controle da
PCR com os primers da IS100, surpreendentemente não amplificou a IS. Tal resultado
sugere duas possibilidades, mutação in vitro no fragmento da IS100, na região de
hibridização do primer ou falha técnica da PCR.
A análise dos fragmentos de restrição reconhecidos pela sonda direcionada a
IS100 possibilitou a identificação de oito perfis denominados GI a GVIII (Fig. 2).
Vale salientar a presença de uma banda comum em todas as cepas. A P. CE 17
isolada em 1982, originada de B. lasiurus do município de Aratuba na serra de Baturité
exibe um perfil totalmente diferente das demais exceto pela banda comum. Em
contrapartida, o perfil da outra cepa do foco da serra de Baturité analisada, P. CE 13,
também isolada em 1982, originada de B. lasiurus do município de Maranguape é
bastante semelhante ao do GII, exceto pela presença de uma banda.
Das cinco cepas do GI quatro foram isoladas em 1979, originadas da mesma
espécie de roedor, B. lasiurus, do mesmo município, Guaraciaba do Norte, localizado na
Serra da Ibiapaba (Tabela 1). A outra cepa foi originada de um lote de pulgas (P.
irritans) três anos mais tarde (1982), no mesmo município, sugerindo a permanência
deste clone na região (Tabela 1).
Em conclusão, não foi encontrada correlação entre os perfis de RFLP-IS100 e a
presença ou ausência dos plasmídeos, também não foi possível estabelecer correlação
com as variantes nitrato negativo. No grupo II, uma amostra foi nitrato negativo e duas
foram nitrato positivo, enquanto a amostra do GIII foi negativo. O RFLP-IS100
possibilitou o agrupamento de cepas de um mesmo município do foco da Ibiapaba,
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originados de diferentes hospedeiros e diferentes períodos. Não foi possível demonstrar
qualquer associação no foco de Baturité, uma vez que apenas duas cepas foram
analizadas. As outras cepas foram distribuídas em diferentes perfis, entretanto, todas
apresentaram uma banda comum. Outros estudos são necessários com cepas de outros
focos do Brasil e de outros países para definir o potencial desta banda como marcador
geográfico em estudos epidemiológicos.
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Mestrado em Saúde Pública
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01
02
03
04
Figura 1.
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05
06
07
08
16
09
10
11
12
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GI
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GII
08
17
09
10
11
12
13
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GIII
GIV
GV
GVI GVII GVIII
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Tabela 1. Distribuição das cepas estudadas segundo origem, foco, município, ano de
isolamento e resultado da tipagem por RFLP-IS100.
Cepa
Origem
Foco
Município
Ano
RFLP-IS100.
P.CE 01
Humano
Ibiapaba
Ipu
1978
GVIII
P.CE 03
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipu
1979
GIV
P.CE 04
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
GI
P.CE 05
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
GI
P.CE 06
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
GI
P.CE 07
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1979
GI
P.CE 09*
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipueiras
1980
P.CE 11
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipu
1982
GII
P.CE 14
Pulex irritans
Ibiapaba
Guaraciaba do Norte
1982
GI
P.CE 19
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Ipueiras
1982
GV
P.CE 20
Bolomys lasiurus
Ibiapaba
Iboapina
1982
GVI
P.CE 21
Humano
Ibiapaba
Ipu
1982
GII
P.CE 17
Bolomys lasiurus
Baturité
Aratuba
1982
GVII
P.CE 13*
Bolomys lasiurus
Baturité
Maranguape
1982
GIII
-
-
* Biovar atípico (G , N ).
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GII
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Figura 1. Hibridização da sonda IS100 com fragmentos de DNA de cepas de Y. pestis
gerados pela clivagem com a enzima HindIII. Linhas 01: P.CE 01; 02: P.CE 03; 03:
P.CE 04; 04: P.CE 05; 05: P.CE 06; 06: P.CE 07; 07: P.CE 09; 08: P.CE 11; 09: P.CE
13; 10: P.CE 14; 11: P.CE 17; 12: P.CE 19; 13: P.CE 20; 14: P.CE 21.
Figura 2. Representação Esquemática dos grupos obtidos pela hibridização da sonda
IS100 e DNA de cepas de Y. pestis clivado com a enzima HindIII. GI. Linhas 01: P.CE
04; 02: P.CE 05; 03: P.CE 06; 04: P.CE 07; 05: P.CE 14; GII Linhas 06: P.CE 09; 07:
P.CE 11; 08: P.CE 21; GIII. Linha 09: P.CE 13; GIV. Linha 10: P.CE 03; GV. Linha
11: P.CE 19; GVI. Linha 12: P.CE 20; GVII. Linha 13: P.CE 17; GVIII. Linha 14: P.CE
01.
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