genética molecular

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SUMÁ
SUMÁRIO
•História da Genética Molecular;
•Organização e estrutura dos genomas;
GENÉTICA MOLECULAR
•DNA e RNA
•Dogma Central
9Replicação
9Transcrição
9Tradução
Daniel Macedo de Melo Jorge
[email protected]
O QUE É GENÉ
GENÉTICA?
• É o estudo dos genes e de sua transmissão para as
gerações futuras.
•Genes e genomas;
•Técnicas Genética Molecular
9PCR
9Sequenciamento
9EST
O QUE É GENÉ
GENÉTICA?
Escala Comparativa
Terra
Célula
País
Cromossomo
• É dividida em:
- Genética Clássica Æ Mendel (1856 – 1865)
“unidade fundamental da hereditariedade”
- Genética Moderna Æ Watson e Crick (1953)
“pedaço de DNA que codifica uma proteína”
Estado
Fragmento
cromossômico
Município
Gene
Pessoas
Acontecimentos na gené
genética
e genômica
Bases de
pares
Acontecimentos na gené
genética
e genômica
Acontecimentos na gené
genética
e genômica
Ácido desoxirribonuclé
desoxirribonucléico - DNA
A estrutura do DNA
A dupla hé
hélice de DNA
•DNA é o material genético
•Estrutura regular (difração de Raio-X)
•Fitas complementares de nucleotídeos
•Dupla hélice
•DNA associado a proteínas
A estrutura do DNA
•Nucleotídeo:
- Açúcar: pentose, desoxirribose
- Fosfato
- Bases nitrogenadas:
- Purina: Adenina guanina
- Pirimidina: citosina timina
- Pareamento
- Ligadas por pontes de hidrogênio
•Ligações fosfodiester
•Quantidade de A = quantidade de T
•Quantidade de G = quantidade de C
Nucleotí
Nucleotídeo – A unidade de
construç
construção do DNA
Desoxirribose:
o açú
car do DNA
açúcar
Bases nitrogenadas
Purinas
Pirimidinas
Principais Tipos de RNA
•RNA mensageiro (mRNA): contém a informação genética
para a seqüência de aminoácidos das proteínas
Ácido ribonuclé
ribonucléico - RNA
•RNA transportador (tRNA): identifica e transporta os
aminoácidos até o ribossomo
•RNA ribossômico (rRNA): constituinte dos ribossomos
Ribonucleotí
Ribonucleotídeo – O bloco
de construç
construção do RNA
RNA: um ácido nuclé
nucléico com
estrutura quí
química diferente do DNA
Dogma Central da Biologia
Molecular
DNA x RNA
DNA
RNA
Desoxirribose
Ribose
A; G; C; T
A; G; C; U
Dupla fita
Fita simples; dobrada
Armazena informações
Transporta
informações; funções
estrutural e catalítica
Molécula grande
Replicação
Transcrição
Transcrição
Reversa
Replicação de
RNA
Tradução
Molécula pequena
Proteína
Replicaç
Replicação
Regras bá
básicas do processo de
replicaç
replicação do DNA
•Processo semiconservativo
•Início da replicação
•É o processo na qual o
DNA é duplicado, a partir
da fita molde.
- Origem
•Movimento da forquilha de replicação
- Unidirecional ou bidirecional
•Direção da replicação
- 5’ Æ 3’
•Semidescontinuidade da replicação
Enzimas que participam da
replicaç
replicação
•DNA Polimerase
•SSB (Single Strand Binding Protein)
•Primase
•Helicases (DnaB)
•Topoisomerases
•DNA ligase
Replicaç
Replicação
Transcriç
Transcrição
Caracterí
Características da transcriç
transcrição
•É o processo pelo qual uma molécula de RNA é
sintetizada a partir da informação contida na
sequência de nucleotídeos de uma molécula de
DNA de fita dupla
•RNA é imediatamente liberado do DNA
•Produção simultânea de muitas cópias a partir
do mesmo gene
- Gene com 1.500pb
•Transcrição = 50 segundos
•15 RNA-polimerase/gene
•1 hora = milhares de transcritos
Transcriç
Transcrição
Transcriç
Transcrição
DNA fita codificadora
DNA fita molde
RNA transcrito
Processamento do mRNA
Íntrons e Éxons
introns
exons
Processamento do transcrito primário
Excisão dos exons
União dos exons
•Íntron – região não-codificante de um
gene, transcrita na mólecula de RNA, mas
removida pelo processamento do RNA
- 80 a 10.000 nucleotídeos
•Éxon – Seguimento de um gene formado
por uma seqüência de nucleotídeos que
serão representados no RNA
•Processamento: processo de remoção de
íntrons e junção de éxons no RNA
mensageiro de eucariotos
Traduç
Tradução
Traduç
Tradução
•Processo na qual uma seqüência de
mRNA é convertido em uma proteína.
Código Gené
Genético
Código Gené
Genético
Características do código genético
•Tríplice: 3 bases = códon codificam um aa
• Conceito:
São as instruções para sintetizar
moléculas protéicas e estão inscritas em
código nas moléculas de DNA dos
organismos vivos.
•Degenerado ou redundante: um mesmo aminoácido pode ser
codificado por vários códons diferentes
•Não é ambíguo: cada códon é corresponde a somente um
aminoácido
•Com sentido: Start códon a um stop códon;
•Universal: o mesmo para todos seres vivos
•Utilização preferencial de codons: codon usage
Código Gené
Genético
Trincas do Código Genético
• Cada trinca de nucleotídeo do DNA corresponde a um aa na
proteína.
• A combinação das 4 letras genéticas TACG, 3 a 3, permite
obter 64 trincas diferentes.
• 61 correspondem a aminoácidos e 3 correspondem a códons
de terminação; UAA, UAG e UGA.
Código Gené
Genético
Traduç
Tradução
Resumo da traduç
tradução
DNA fita codificadora
DNA fita molde
RNA transcrito
Arg-Tyr-Ser-Val
Proteína traduzida
Os Genomas
DNA
DNA ou
ou RNA
RNA
Vírus
Células
DNA
DNA ee RNA
RNA
Os Genomas
Fita
Fita simples
simples
Fita
Fita Dupla
Dupla
Organismos Procarióticos: Bactérias
Cromossomo
Plasmídeo
Procarióticas
Procarióticas
Eucarióticas
Eucarióticas
Cromossomo
Cromossomo
Cromossomo
Cromossomo
Plasmídios
Plasmídios
Mitocôndrias
Mitocôndrias
Cloroplastos
Cloroplastos
Os Genomas
• Cromossomo + Plasmídeos
• O genoma da E. coli
- 4.639 kb
- 2.400 genes
Os Plasmí
Plasmídios
“Elemento genético, extra-cromossômico, capaz
de replicar independente do cromossomo”
- Dupla fita de DNA; Circular
- 1 – 100(+) Kb; < 1/20 do cromossomo
• Diferentes dos vírus
- Não causam danos às células
- 80% da molécula de DNA
- 1.897 genes codificantes de proteínas
- Não são formas extracelulares
• Diferentes do cromossomo
- Não contém genes essenciais
O Genoma Humano
23 cromossomos
31.000 genes
O Genoma dos Organismos
Eucarió
Eucarióticos
O Genoma Humano
3.000 milhões de bases
O Genoma dos Eucarió
Eucarióticos
Família
• O genoma nuclear:
- E. coli: 2.400 genes; 1.897 codificam proteínas
Célula
- Saccharomyces cerevisiae: 6.600 genes; 5.800
codificam proteínas Exemplos utilização
- Humanos: 100.000 genes, codificam proteínas;
genes > (+ íntrons)
Genoma
nuclear
Genoma mitocondrial
O Genoma dos Eucarió
Eucarióticos
•Genoma humano:
• Genoma humano
- Éxons
-Íntrons
Compactaç
Compactação do DNA em
Cromossomos
70%
- 23 cromossomos - 1 metro
- ½ DNA + ½ Proteínas
- DNA repetitivo (não essencial ?)
- 30%
- Não codifica
- Não transcreve
- Repetidas muitas vezes
•Proteínas
- RNA polimerase, DNA polimerase, reguladoras, Histonas
•Cromatina
- DNA-Proteína Æ Compactação do DNA
Reaç
Reação em Cadeia da
Polimerase - PCR
Técnicas de Gené
Genética
Molecular
•1983: Kary Mullis
•PCR
•1985: 1º artigo
•Sequenciamento
•Processo patenteado em
1989 por Cetus Corporation
& Hoffman-LaRoche
•EST
•1993: Nobel da Química
PCR
PCR
•É difícil exagerar o impacto da PCR na Biologia Molecular
•Grande quantidade de DNA em pouco tempo.
•Baixo custo
•A amostra de DNA não necessita de estar altamente
purificada
•Simplificou e democratizou as técnicas de Biologia
Molecular
•PCR pode amplificar uma única molécula de DNA / RNA
•O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de
restrição, sequenciado ou clonado.
O que é necessá
necessário?
Mg2+
Termocicladores
DNA
polimerase
dCTP
dNTPs
dGTP
dTTP
dATP
•Possibilitou extender a Biologia Molecular para disciplinas
nunca pensadas como Ecologia, Direito, Arqueologia,
Economia, etc.
Iniciadores
Em solução tampão de PCR, H2O ultra-filtrada (pH 7,0)
e óleo mineral.
Mecanismo
Desnaturaç
Desnaturação
• Divide-se em 3 passos principais, que se repetem por
25 a 35 ciclos:
- Desnaturação
•Processo no qual ocorre a separação da
fita dupla de DNA por meio da elevação da
temperatura.
- Hibridação
- Extensão
• A quantidade de DNA final segue
uma função exponencial, onde:
N=N0.2n
•N: número final de cadeias de DNA
•N0: número inicial de DNA molde (template)
www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/PCRcurso.pdf
•n: número de repetições do ciclo
Hibridaç
Hibridação
•A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante
alguns minutos.
•Os iniciadores hibridam com as seqüências
complementares do Molde.
Sequenciamento
Reação de
Sequenciamento
Molde
Taq
polimerase
Primer
Deoxinucleotídeos
Dideoxinucleotídeos
•As amostras são aquecidas a 94-96 ºC
durante um a vários minutos.
Extensão
• Eleva-se a temperatura a 72ºC durante 2 minutos.
• O DNA polimerase atua junto dos iniciadores
que hibridaram, começando a duplicação da
cadeia e recrutando no meio os nucleótidos
complementares disponíveis.
Sequenciamento
•Método didesoxi conhecido também como de
terminadores de cadeia ou de Sanger
Polimerizaç
Polimerização de DNA
Polimerizaç
Polimerização de DNA
G
T
T
C
C
C
T
T
A
G
A G T
T
C A
A
C
T
A
T
C
C A
G
G
G T
A T
G
A C CC
C A
G
T
5’
3’
G
A
ATGCTTC
|||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
5’
T
T
G
A
A GA T T
C
C
A
C
AC T
T
G
G T
G
A T
G AC
G
A C C
C A
G
T
5’
3’
G
A
ATGCTTCTG
ATGCTTCTG
||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
C
3’
C
3’
5’
Polimerizaç
Polimerização de DNA
T C
T
C
T T
G
C AA A
T
G T
A
T
A
T
C
C A
GG
G
G T
AGT
C
A C CC
TC A G
5’
3’
G
A
ATGCTTC
|||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
C
Polimerizaç
Polimerização de DNA
C
T
T
5’
C
T
A
G C
T
A T T TT C T AC
T G
C CA
G
A GC
T
G
A
G T
C A
G
T A G
C A
A C
GC
5’
3’
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCT
|||||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
Polimerizaç
Polimerização de DNA
5’
Polimerizaç
Polimerização de DNA
A
C
T
TT C
A
C CA C A
G T
G A
A C CC
AAT G C
T
GC T
T
C A GT A G
T
G
G G
3’
A
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCT
|||||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
5’
3’
T GAA
A
T
T T T
G
T
GA G C
C
T
T C T AA
GT G
C C
GC A T
C G CA
AC
CC
5’
3’
ATGCTTCTGGCAGA
T
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
G
T
5’
3’
5’
Polimerizaç
Polimerização de DNA
Polimerizaç
Polimerização de DNA
A
CC
T GAA
T T T
G
A
G
C
T
T C T AA G A G C
GT G
T
A
G
T
CA
C G C
C C
AC
5’
3’
ATGCTTCTGGCAGA
T
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
A
T
3’
5’
Seqü
Seqüenciamento de DNA
ATGCTTCT
ATGCTTCT
ATGCTTCT
ATGCTTCTG
ATGCTTCTG
G
ATGCTTCTGG
ATGCTTCTGG
C
ATGCTTCTGGC
ATGCTTCTGGC
A
ATGCTTCTGGCA
ATGCTTCTGGCA
G
ATGCTTCTGGCAG
ATGCTTCTGGCAG
A
ATGCTTCTGGCAGA
ATGCTTCTGGCAGA
T
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGAT
C
ATGCTTCTGGCAGATC
ATGCTTCTGGCAGATC
T
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCT
G
ATGCTTCTGGCAGATCTG
ATGCTTCTGGCAGATCTG
A
ATGCTTCTGGCAGATCTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGA
A
ATGCTTCTGGCAGATCTGAA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAA
C
ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC
A
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA
G
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG
T
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
TGGCAGATCTGAACAGTG
G
ATGCTTC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG
T
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
T
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
A
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA
C
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC
T
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
G
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG
A
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA
T
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
A
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA
T
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
T
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
G
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG
C
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC
T
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
T
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
T
T GAA CC
T
A
T
T
G
C A
GT
T
G G C
T C T AA C G
T
G
T C
GC A
C
CA
AC
G
5’
3’
ATGCTTCTGGCAGA
T
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
5’
Gel de sequenciamento de DNA
G A T C
Sequenciadores
Seqüenciamento parcial de
transcritos
Seqü
Seqüenciamento parcial de
transcritos
O que são ESTs?
EST= Expressed Sequence Tag
cDNA
REGIÃO CODIFICADORA
(Etiquetas de Seqüências Expressas)
ATG
STOP
intron
exon
s
s
AAAAA
TTTTTT
EST 5’
5’
Processamento do transcrito
primário
Excisão dos exons
EST 3’
3’
AAAAA
TTTTTT
EST 5’
5’
EST 3’
3’
União dos exons
EST 5’
5’
AAAAA
TTTTTT
EST 3’
3’
Seqü
Seqüenciamento parcial de
transcritos
AAAA
TTTTT
EST 5’
5’
“Cluster”
de ESTs ou
de “reads”
EST 3’
3’
AAAA
TTTTT
EST 5’
5’
AAAA
TTTTT
EST 5’
5’
AAAA
TTTTT
EST 5’
5’
Seqüência
“consenso”
AAAA
TTTTT
Agradecimentos
• Ao Prof. Dr. Sergio Lifschitz.
• Ao comitê organizador do BSB e ao
comitê do IWGD.
• A todos os presentes.
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