genética molecular
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SUMÁ SUMÁRIO •História da Genética Molecular; •Organização e estrutura dos genomas; GENÉTICA MOLECULAR •DNA e RNA •Dogma Central 9Replicação 9Transcrição 9Tradução Daniel Macedo de Melo Jorge [email protected] O QUE É GENÉ GENÉTICA? • É o estudo dos genes e de sua transmissão para as gerações futuras. •Genes e genomas; •Técnicas Genética Molecular 9PCR 9Sequenciamento 9EST O QUE É GENÉ GENÉTICA? Escala Comparativa Terra Célula País Cromossomo • É dividida em: - Genética Clássica Æ Mendel (1856 – 1865) “unidade fundamental da hereditariedade” - Genética Moderna Æ Watson e Crick (1953) “pedaço de DNA que codifica uma proteína” Estado Fragmento cromossômico Município Gene Pessoas Acontecimentos na gené genética e genômica Bases de pares Acontecimentos na gené genética e genômica Acontecimentos na gené genética e genômica Ácido desoxirribonuclé desoxirribonucléico - DNA A estrutura do DNA A dupla hé hélice de DNA •DNA é o material genético •Estrutura regular (difração de Raio-X) •Fitas complementares de nucleotídeos •Dupla hélice •DNA associado a proteínas A estrutura do DNA •Nucleotídeo: - Açúcar: pentose, desoxirribose - Fosfato - Bases nitrogenadas: - Purina: Adenina guanina - Pirimidina: citosina timina - Pareamento - Ligadas por pontes de hidrogênio •Ligações fosfodiester •Quantidade de A = quantidade de T •Quantidade de G = quantidade de C Nucleotí Nucleotídeo – A unidade de construç construção do DNA Desoxirribose: o açú car do DNA açúcar Bases nitrogenadas Purinas Pirimidinas Principais Tipos de RNA •RNA mensageiro (mRNA): contém a informação genética para a seqüência de aminoácidos das proteínas Ácido ribonuclé ribonucléico - RNA •RNA transportador (tRNA): identifica e transporta os aminoácidos até o ribossomo •RNA ribossômico (rRNA): constituinte dos ribossomos Ribonucleotí Ribonucleotídeo – O bloco de construç construção do RNA RNA: um ácido nuclé nucléico com estrutura quí química diferente do DNA Dogma Central da Biologia Molecular DNA x RNA DNA RNA Desoxirribose Ribose A; G; C; T A; G; C; U Dupla fita Fita simples; dobrada Armazena informações Transporta informações; funções estrutural e catalítica Molécula grande Replicação Transcrição Transcrição Reversa Replicação de RNA Tradução Molécula pequena Proteína Replicaç Replicação Regras bá básicas do processo de replicaç replicação do DNA •Processo semiconservativo •Início da replicação •É o processo na qual o DNA é duplicado, a partir da fita molde. - Origem •Movimento da forquilha de replicação - Unidirecional ou bidirecional •Direção da replicação - 5’ Æ 3’ •Semidescontinuidade da replicação Enzimas que participam da replicaç replicação •DNA Polimerase •SSB (Single Strand Binding Protein) •Primase •Helicases (DnaB) •Topoisomerases •DNA ligase Replicaç Replicação Transcriç Transcrição Caracterí Características da transcriç transcrição •É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA de fita dupla •RNA é imediatamente liberado do DNA •Produção simultânea de muitas cópias a partir do mesmo gene - Gene com 1.500pb •Transcrição = 50 segundos •15 RNA-polimerase/gene •1 hora = milhares de transcritos Transcriç Transcrição Transcriç Transcrição DNA fita codificadora DNA fita molde RNA transcrito Processamento do mRNA Íntrons e Éxons introns exons Processamento do transcrito primário Excisão dos exons União dos exons •Íntron – região não-codificante de um gene, transcrita na mólecula de RNA, mas removida pelo processamento do RNA - 80 a 10.000 nucleotídeos •Éxon – Seguimento de um gene formado por uma seqüência de nucleotídeos que serão representados no RNA •Processamento: processo de remoção de íntrons e junção de éxons no RNA mensageiro de eucariotos Traduç Tradução Traduç Tradução •Processo na qual uma seqüência de mRNA é convertido em uma proteína. Código Gené Genético Código Gené Genético Características do código genético •Tríplice: 3 bases = códon codificam um aa • Conceito: São as instruções para sintetizar moléculas protéicas e estão inscritas em código nas moléculas de DNA dos organismos vivos. •Degenerado ou redundante: um mesmo aminoácido pode ser codificado por vários códons diferentes •Não é ambíguo: cada códon é corresponde a somente um aminoácido •Com sentido: Start códon a um stop códon; •Universal: o mesmo para todos seres vivos •Utilização preferencial de codons: codon usage Código Gené Genético Trincas do Código Genético • Cada trinca de nucleotídeo do DNA corresponde a um aa na proteína. • A combinação das 4 letras genéticas TACG, 3 a 3, permite obter 64 trincas diferentes. • 61 correspondem a aminoácidos e 3 correspondem a códons de terminação; UAA, UAG e UGA. Código Gené Genético Traduç Tradução Resumo da traduç tradução DNA fita codificadora DNA fita molde RNA transcrito Arg-Tyr-Ser-Val Proteína traduzida Os Genomas DNA DNA ou ou RNA RNA Vírus Células DNA DNA ee RNA RNA Os Genomas Fita Fita simples simples Fita Fita Dupla Dupla Organismos Procarióticos: Bactérias Cromossomo Plasmídeo Procarióticas Procarióticas Eucarióticas Eucarióticas Cromossomo Cromossomo Cromossomo Cromossomo Plasmídios Plasmídios Mitocôndrias Mitocôndrias Cloroplastos Cloroplastos Os Genomas • Cromossomo + Plasmídeos • O genoma da E. coli - 4.639 kb - 2.400 genes Os Plasmí Plasmídios “Elemento genético, extra-cromossômico, capaz de replicar independente do cromossomo” - Dupla fita de DNA; Circular - 1 – 100(+) Kb; < 1/20 do cromossomo • Diferentes dos vírus - Não causam danos às células - 80% da molécula de DNA - 1.897 genes codificantes de proteínas - Não são formas extracelulares • Diferentes do cromossomo - Não contém genes essenciais O Genoma Humano 23 cromossomos 31.000 genes O Genoma dos Organismos Eucarió Eucarióticos O Genoma Humano 3.000 milhões de bases O Genoma dos Eucarió Eucarióticos Família • O genoma nuclear: - E. coli: 2.400 genes; 1.897 codificam proteínas Célula - Saccharomyces cerevisiae: 6.600 genes; 5.800 codificam proteínas Exemplos utilização - Humanos: 100.000 genes, codificam proteínas; genes > (+ íntrons) Genoma nuclear Genoma mitocondrial O Genoma dos Eucarió Eucarióticos •Genoma humano: • Genoma humano - Éxons -Íntrons Compactaç Compactação do DNA em Cromossomos 70% - 23 cromossomos - 1 metro - ½ DNA + ½ Proteínas - DNA repetitivo (não essencial ?) - 30% - Não codifica - Não transcreve - Repetidas muitas vezes •Proteínas - RNA polimerase, DNA polimerase, reguladoras, Histonas •Cromatina - DNA-Proteína Æ Compactação do DNA Reaç Reação em Cadeia da Polimerase - PCR Técnicas de Gené Genética Molecular •1983: Kary Mullis •PCR •1985: 1º artigo •Sequenciamento •Processo patenteado em 1989 por Cetus Corporation & Hoffman-LaRoche •EST •1993: Nobel da Química PCR PCR •É difícil exagerar o impacto da PCR na Biologia Molecular •Grande quantidade de DNA em pouco tempo. •Baixo custo •A amostra de DNA não necessita de estar altamente purificada •Simplificou e democratizou as técnicas de Biologia Molecular •PCR pode amplificar uma única molécula de DNA / RNA •O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de restrição, sequenciado ou clonado. O que é necessá necessário? Mg2+ Termocicladores DNA polimerase dCTP dNTPs dGTP dTTP dATP •Possibilitou extender a Biologia Molecular para disciplinas nunca pensadas como Ecologia, Direito, Arqueologia, Economia, etc. Iniciadores Em solução tampão de PCR, H2O ultra-filtrada (pH 7,0) e óleo mineral. Mecanismo Desnaturaç Desnaturação • Divide-se em 3 passos principais, que se repetem por 25 a 35 ciclos: - Desnaturação •Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por meio da elevação da temperatura. - Hibridação - Extensão • A quantidade de DNA final segue uma função exponencial, onde: N=N0.2n •N: número final de cadeias de DNA •N0: número inicial de DNA molde (template) www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/PCRcurso.pdf •n: número de repetições do ciclo Hibridaç Hibridação •A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante alguns minutos. •Os iniciadores hibridam com as seqüências complementares do Molde. Sequenciamento Reação de Sequenciamento Molde Taq polimerase Primer Deoxinucleotídeos Dideoxinucleotídeos •As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante um a vários minutos. Extensão • Eleva-se a temperatura a 72ºC durante 2 minutos. • O DNA polimerase atua junto dos iniciadores que hibridaram, começando a duplicação da cadeia e recrutando no meio os nucleótidos complementares disponíveis. Sequenciamento •Método didesoxi conhecido também como de terminadores de cadeia ou de Sanger Polimerizaç Polimerização de DNA Polimerizaç Polimerização de DNA G T T C C C T T A G A G T T C A A C T A T C C A G G G T A T G A C CC C A G T 5’ 3’ G A ATGCTTC ||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’ T T G A A GA T T C C A C AC T T G G T G A T G AC G A C C C A G T 5’ 3’ G A ATGCTTCTG ATGCTTCTG |||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA C 3’ C 3’ 5’ Polimerizaç Polimerização de DNA T C T C T T G C AA A T G T A T A T C C A GG G G T AGT C A C CC TC A G 5’ 3’ G A ATGCTTC ||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA C Polimerizaç Polimerização de DNA C T T 5’ C T A G C T A T T TT C T AC T G C CA G A GC T G A G T C A G T A G C A A C GC 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCT ||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ Polimerizaç Polimerização de DNA 5’ Polimerizaç Polimerização de DNA A C T TT C A C CA C A G T G A A C CC AAT G C T GC T T C A GT A G T G G G 3’ A ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCT ||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 5’ 3’ T GAA A T T T T G T GA G C C T T C T AA GT G C C GC A T C G CA AC CC 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGA T ATGCTTCTGGCAGAT ||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA G T 5’ 3’ 5’ Polimerizaç Polimerização de DNA Polimerizaç Polimerização de DNA A CC T GAA T T T G A G C T T C T AA G A G C GT G T A G T CA C G C C C AC 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGA T ATGCTTCTGGCAGAT ||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA A T 3’ 5’ Seqü Seqüenciamento de DNA ATGCTTCT ATGCTTCT ATGCTTCT ATGCTTCTG ATGCTTCTG G ATGCTTCTGG ATGCTTCTGG C ATGCTTCTGGC ATGCTTCTGGC A ATGCTTCTGGCA ATGCTTCTGGCA G ATGCTTCTGGCAG ATGCTTCTGGCAG A ATGCTTCTGGCAGA ATGCTTCTGGCAGA T ATGCTTCTGGCAGAT ATGCTTCTGGCAGAT C ATGCTTCTGGCAGATC ATGCTTCTGGCAGATC T ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCT G ATGCTTCTGGCAGATCTG ATGCTTCTGGCAGATCTG A ATGCTTCTGGCAGATCTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGA A ATGCTTCTGGCAGATCTGAA ATGCTTCTGGCAGATCTGAA C ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC A ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA G ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT TGGCAGATCTGAACAGTG G ATGCTTC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT A ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA C ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT G ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG A ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT A ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT G ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG C ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT T ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT T T GAA CC T A T T G C A GT T G G C T C T AA C G T G T C GC A C CA AC G 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGA T ATGCTTCTGGCAGAT ||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’ Gel de sequenciamento de DNA G A T C Sequenciadores Seqüenciamento parcial de transcritos Seqü Seqüenciamento parcial de transcritos O que são ESTs? EST= Expressed Sequence Tag cDNA REGIÃO CODIFICADORA (Etiquetas de Seqüências Expressas) ATG STOP intron exon s s AAAAA TTTTTT EST 5’ 5’ Processamento do transcrito primário Excisão dos exons EST 3’ 3’ AAAAA TTTTTT EST 5’ 5’ EST 3’ 3’ União dos exons EST 5’ 5’ AAAAA TTTTTT EST 3’ 3’ Seqü Seqüenciamento parcial de transcritos AAAA TTTTT EST 5’ 5’ “Cluster” de ESTs ou de “reads” EST 3’ 3’ AAAA TTTTT EST 5’ 5’ AAAA TTTTT EST 5’ 5’ AAAA TTTTT EST 5’ 5’ Seqüência “consenso” AAAA TTTTT Agradecimentos • Ao Prof. Dr. Sergio Lifschitz. • Ao comitê organizador do BSB e ao comitê do IWGD. • A todos os presentes.
