Efeito da hipovolemia na lesão medular traumática

OSMIR DE CASSIA SAMPAIO
Efeito da hipovolemia na lesão medular traumática
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutor em Ciências.
Área de concentração: Ortopedia
Orientador: Prof. Dr. Helton Luiz Aparecido Defino
Coorientadora: Profª. Drª. Elaine Aparecida Del Bel B.
Guimarães
RIBEIRÃO PRETO - SP
2015
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer
meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que
citada a fonte.
Sampaio, Osmir de Cassia
Efeito da hipovolemia na lesão medular traumática.
Ribeirão Preto, 2015.
90 p. : xiii. ; 30 cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Ortopedia.
Orientador: Helton Luiz Aparecido Defino.
1. Traumatismo medular
Hipotensão. 4. Ratos Wistar.
espinal.
2.
Hipovolemia.
3.
Sampaio OC. Efeito da hipovolemia na lesão medular traumática. Tese
apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Aprovado em: ____/____/____
Banca Examinadora
Prof. Dr. ___________________________
Instituição: __________________________________
Julgamento: ________________________
Assinatura:__________________________________
Prof. Dr. ___________________________
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Instituição: __________________________________
Julgamento: ________________________
Assinatura:__________________________________
DEDICATÓRIA
Á Deus, minha referência, minha inspiração, luz que me guia
em todos os momentos da minha vida, e meu pilar de
sustentação.
A minha Amada esposa, Maria da Graça, pelo apoio
incondicional, companheirismo, compreensão nos momentos
de isolamento e tendo que abrir mão da minha pouca
presença objetivando a conclusão deste trabalho, passando
a compartilhar comigo este sonho.
Aos meus amados filhos Felipe, Daniel e Myrela, razão
maior da minha vida, fontes de inspiração e motivação nos
momentos de duvidas e cansaço em função das noites
passadas debruçado sobre o computador realizando este
trabalho.
Aos meus Pais, Orlando (Dominguinho) e Elizabete
(Betinha), pelo exemplo de determinação, amor, cuidado, Fé
cristã e, principalmente, mostrar ao longo da vida que o
limite dos nossos sonhos, somos nós quem determina, onde
quer que estejam serão sempre minha fonte maior de
inspiração e presença diária na minha vida.
Aos meus queridos irmãos Sonia (minha segunda mãe),
Suely, Sandra e Orlando, sempre presentes em minha vida,
torcendo e vibrando ao meu lado. Orion, colega, amigo
companheiro de todos os momentos desde a infância,
durante a faculdade, e por toda minha vida, sempre ao meu
lado.
A minha querida sogra D. Cirene, e ao meu sogro Tonico,
que me acolheram sempre com muito carinho e amor.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao Prof. Helton, pelo exemplo profissional, amizade, paciência, e confiança
creditada a mim, MUITO OBRIGADO!
À Profa. Dra. Elaine, por ter cedido o laboratório onde foram realizados os
experimentos iniciais, que contribuiu significativamente na concepção do desenho
inicial e definição desta tese.
AGRADECIMENTOS
À colega e amiga, Valéria Garcez, pelo companheirismo e cooperação no
inicio e as fases seguintes deste experimento e pela disposição a colaborar sempre
que solicitada, minha eterna gratidão.
À técnica e amiga, Célia Aparecida da Silva, pela ajuda, amizade e
colaboração na aquisição dos animais e disposição sempre que solicitada no
desenho inicial nesta pesquisa.
Ao amigo, Irmão e colega, Prof. Dr. Elias Amorim, pelo apoio, orientação,
amizade e acima de tudo por ser, pessoa humana e profissional exemplar, sempre
pronto a cooperar, aconselhar e contribuir na conclusão deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Orlando Torres, agradeço pela orientação e compartilhar seus
conhecimentos, tendo sido meu orientador no mestrado, sempre presente, um ponto
de apoio de estimulo e de amizade.
Ao amigo, irmão e colega, Prof. Dr. Manuel Faria e Dr. André Faria, pela
amizade, orientação, sugestões neste experimento, auxilio inestimável, sempre
atenciosos e prontos a cooperar com atenção e aconselhamentos.
Aos queridos, Ceres e Roosenvelt, pelo apoio e estímulo, sempre companheiros
mostrando que somos responsáveis pela realização dos nossos sonhos.
Ao Prof. Romão e Antonio Marcos, no acesso ao laboratório no Campus da
UFMA, para realização deste experimento, pelo auxilio e cooperação na execução
do experimento.
Ao Prof. Dr. Silvio Monteiro, pelo auxilio e oportunidade de compartilhar seus
conhecimentos relacionados à estatística do trabalho.
À Profa. Dra. Alana Lislea Sousa, pela atenção, sendo determinante na
condução e finalização deste trabalho, minha eterna gratidão.
Rita de Cássia S. Cossalter, sempre disposta a colaborar no que fosse
necessário, para esclarecer dúvidas e, principalmente pela sua sempre disponibilidade.
RESUMO
Sampaio OC. Efeito da hipovolemia na lesão medular traumática [tese]. São Paulo:
Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto; 2014. 89f.
Objetivo: este estudo tem por objetivo avaliar o efeito da hipovolemia na lesão
medular traumática por contusão em ratos, utilizaram-se a avaliação funcional para
comparar a recuperação neurológicas no decorrer do tempo nos grupos lesão
medular sem hipovolemia e lesão medular com hipovolemia. Métodos: foram
utilizados ratos Wistar, machos, (n = 10 por grupo), distribuídos em dois grupos
experimentais: Laminectomia T9-T10 + contusão medular por queda de peso - 10 g
de peso, 15 cm de altura (grupo controle) e Laminectomia T9-T10+ contusão
medular por queda de peso (10 g de peso e 15 cm de altura) com hipovolemia (20%
da volemiados animais). A avaliação motora foi realizada por meio do teste do
escore combinado de comportamento locomotor dos animais, segundo escala de
Kuhn & Wratahll, e o teste do plano inclinado, no período pré-teste, 1º, 3º, 7º e 14º
dias. Os animais foram sacrificados no 14º dia pós-cirurgia. Resultados: Os animais
submetidos à contusão medular com hipovolemia, quando comparados aos do grupo
controle (contusão medular sem hipovolemia), os dois métodos de avaliação
apresentaram mudanças significativas (p < 0,05) no comportamento locomotor no
decorrer do tempo. Conclusões: nos dois métodos de avaliação, os animais
submetidos à contusão medular com hipovolemia tiveram escore de comportamento
locomotor significativamente menor (p < 0,05) quando comparados ao grupo
controle, assim como apresentaram uma recuperação motora mais lenta. Portanto, a
hipovolemia (20 % da volemia por meio de sangria) pode interferir expressivamente
na recuperação de animais com lesão da medula espinal.
Palavras-chave: Traumatismo medular espinal. Hipovolemia. Hipotensão. Ratos
Wistar.
ABSTRACT
Sampaio OC. Effect of hypovolemia in spinal cord injury [thesis]. São Paulo:
Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto; 2014. 89f.
Purpose: To investigate the effect of hypovolemia on the recovery of rats with spinal
injury. Methods: Twenty male Wistar rats, adults, with individual weight varying
between 260 and 320 g, were randomly divided in two groups: Laminectomia + spine
injury, control group; and Laminectomia + spine injury + hypovolemic. The contusion
was caused by the drop of a 10 g spindle, 15 cm height. The locomotors assessment
of the animals was accomplished by the evaluation test of spinal lesion according to
the scale of Kuhn and Wrathall, and the inclined plane, in the pre-test, 1st, 2nd, 7th,
and 14th day. The animals were sacrificed on the 14th day post lesion. Results:
Animals submitted to spinal cord lesion (SCI) + hypovolemic when compared to the
control group (spinal lesion) showed significant changes in their locomotors behavior
along the experiment. In the functional assessment the SCI + hypovolemic group
showed lower scores and significant (p < 0.05) than the control group. Conclusion: In
both evaluation methods, animals submitted to spinal cord lesion (SCI) +
hypovolemia achieved significantly lower score of locomotor behavior when
compared to the control group and showed a slower motor recovery. Then
hypovolemia (20% volume) significantly interferes in the recovery of animals with
spinal cord injury.
Keywords:
Spine cord injury. Hypovolemia. Hypotension. Rats, Wistar.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Animal sob anestesia colocado sobre a prancha ................................... 42
Figura 2 -
Incisão na pele e subcutâneo da região dorsal do rato .......................... 43
Figura 3 -
Região dorsal incisada estendendo da apófise espinhosa T8-T11 ........ 44
Figura 4 -
Afastador autostático expondo fáscia e músculo paravertebral á
nível de T9-T10 ...................................................................................... 44
Figura 5 -
Exposição das apófises espinhosas e laminas T9-T10 .......................... 45
Figura 6 -
Laminectomia T9-T10 com exposição saco dural e medula
espinal .................................................................................................... 45
Figura 7 -
Exposição da medula espinhal pós com contusão por trauma............... 46
Figura 8 -
Aparelho para contusão da medula espinal ........................................... 47
Figura 9 -
Identificação e exposição da artéria carótida cervical os a)
músculos homohioideo b) esternocleidomastoideo ................................ 48
Figura 10 - Artéria carótida cervical canulada com gelco para sangria .................... 49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Teste de Tukey para a comparação entre as médias do plano
inclinado em relação ao grupo e ao tempo de recuperação ..................... 54
Tabela 2 - Resultado do teste de Mann Whitney e medianas das variáveis da
avaliação funcional dos grupos ................................................................ 61
Tabela 3 - Teste de Kruskall-Wallis e teste de Dunn para avaliação funcional
em relação ao tempo ................................................................................ 62
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Evolução dos valores do teste do plano inclinado nos diferentes
períodos de avaliação. O asterisco (*) indica diferença estatística
(p < 0,05) entre os grupos ...................................................................... 55
Gráfico 2 - Escores da escala motora dos grupos experimentais nos
diferentes períodos de avaliação............................................................ 56
Gráfico 3 - Escores da extensão dos dedos nos grupos experimentais nos
diferentes períodos de avaliação............................................................ 56
Gráfico 4- Escores da retirada em extensão nos grupos experimentais nos
diferentes períodos de avaliação............................................................ 57
Gráfico 5 - Escores da retirada contra a dor nos diferentes períodos de
avaliação. ............................................................................................... 58
Gráfico 6 - Escores da resposta à ventralização nos diferentes períodos de
avaliação ................................................................................................ 58
Gráfico 7 - Escores do ato de agarrar a barra com a pata traseira nos
diferentes períodos de avaliação............................................................ 59
Gráfico 8 - Escore funcional global (somatória dos escores) dos grupos
experimentais nos diferentes períodos de avaliação .............................. 60
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AACD
- Associação de Assistentes de Crianças Deficientes
ANOVA
- Análise de variância
ATP
- Trifosfato de adenosina
BBB
- Basso, Beattie, Bresnahan
BDNF
- Brain-derived neurotrophic factor
BHE
- Barreira hematoencefálica
ERNs
- Espécies reativas de nitrogênio
EROs
- Espécies reativas de oxigênio
FMRP-USP - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo
FSME
- Fluxo de sangue da medula espinal
HT
- Grupo hipotensor
LMcH
- Lesão medular com hipovolemia
LME
- Lesão da medula hspinal
LMsH
- Lesão medular sem hipovolêmia
MAG
- Glicoproteina associado à mielina
MASIS
- Multicenter Animal Spine Injury Study
NAD
- Dinucleotide nicotinamideadenine
NGF
- Nerve growth factor
NSCISC
- National Spinal Cord Injury Statistical Center
NT
- Grupo de normotensos
NYU
- New York University
O2
- Oxigênio
OSU
- Ohio State University
PAM
- Pressão arterial média
PGF2α
- Prostaglandina
PI
- Plano inclinado
SN
- Sistema nervoso
SNC
- Sistema nervoso central
SNP
- Sistema nervoso periférico
TCE
- Trauma cranioencefálico
TRM
- Trauma raquimedular
UEMA
- Universidade Estadual do Maranhão
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 14
1.1 Plasticidade Neuronal ....................................................................................... 15
1.2 Hipovolemia ...................................................................................................... 19
1.3 Fisiopatologia .................................................................................................... 23
1.4 Lesões Traumáticas da Medula Espinal ........................................................... 28
1.5 Métodos de Avaliação Funcional dos Animais após Lesão da Medula
Espinhal............................................................................................................. 36
1.6 Principais Questões Relativas ao Estudo da Lesão da Medula
Espinal .............................................................................................................. 36
1.7 Objetivos ........................................................................................................... 37
1.7.1 Objetivo Geral ............................................................................................... 37
1.7.2 Objetivos Específicos ................................................................................... 37
2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 38
2.1 Material ............................................................................................................. 39
2.1.1 Grupos Experimentais .................................................................................. 40
2.2 Métodos ............................................................................................................ 42
2.2.1 Anestesia ...................................................................................................... 42
2.2.2 Antibioticoterapia Profilática e Analgesia ...................................................... 43
2.2.3 Procedimento Cirúrgico ................................................................................ 43
2.2.4 Aparelho para Lesão Medular por Queda de Peso ...................................... 46
2.2.5 Cateterismo Arterial ...................................................................................... 47
2.2.6 Métodos de Avaliação .................................................................................. 49
2.2.7 Análise Estatística ........................................................................................ 52
3 RESULTADOS ......................................................................................................... 53
3.1 Teste Plano Inclinado ....................................................................................... 54
3.2 Avaliação Funcional .......................................................................................... 55
4 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 63
5 CONCLUSÕES......................................................................................................... 72
REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 74
ANEXO ........................................................................................................................ 88
1 INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO - 15
1.1 Plasticidade Neuronal
O clássico conceito que o sistema nervoso central (SNC) não possuiria
propriedades de se recompor após injúria, foi mudado na virada do século passado
quando os neurofisiologistas ousaram especular sobre a capacidade regenerativa do
SNC, ainda que limitada. Em 1906, Camilo Golgi e Santiago Ramón y Cajal já se
preocupavam com o contraste entre as capacidades regenerativas dos sistemas
nervosos periférico (SNP) e SNC. Cajal realizou experimentos que evidenciaram
pouca resposta regenerativa, e em alguns casos ausente, após a transecção de
axônios do SNC (Ramon, Cajal, 1914 apud Stahnisch, Nitsch, 2002). A partir de
então postulara que a capacidade regenerativa dos neurônios depende muito do seu
microambiente, sendo este um dos principais fatores de diferenciação entre as
capacidades regenerativas do SNC e SNP (Zager, Black, 1988).
O conceito da regeneração limitada dos neurônios no SNC permaneceu até os
anos 80, quando Aguayo et al. (1981) demonstraram uma capacidade regenerativa
considerável dos neurônios centrais desde que condições apropriadas fossem
fornecidas para que o processo de crescimento axonal, uma vez iniciado, pudesse
continuar. Porém esta continuidade não ocorria, a regeneração era transitória e
cessava rapidamente, sem que houvesse um crescimento regenerativo significativo
dos axônios lesados. Vários autores atribuíram esse fracasso na regeneração de
axônios lesados de animais adultos à falta de fatores tróficos imprescindíveis para o
crescimento axonal (Nicholls et al., 1999; Tatagiba et al., 1997; Brösamle et al., 2000).
Os principais obstáculos ao reduzido crescimento dos axônios no sistema
nervoso central parecem estar relacionados à formação de uma cicatriz glial,
formando uma barreira física e química, constituída principalmente pela presença de
proteoglicanas, hiperplasia e hipertrofia de astrócitos que se tornam reativos e
proliferam, a microglia e os precursores dos oligodendrócitos se multiplicam e migram,
e a bainha de mielina se fragmenta lançando moléculas que restringem o crescimento
de fibras nervosas (Koshinaga, Whittemore, 1995; Fawcett, Asher, 1999).
A resposta neuronal à lesão nervosa periférica tem sido objeto de estudo por
mais de um século, e certamente é o melhor exemplo da plasticidade neuronal em
vertebrados adultos (Snider et al., 2002). Os estudos buscam identificar as bases
celulares e moleculares que permitem o restabelecimento de um nervo periférico e
que impedem que o mesmo aconteça dentro da medula espinal, este tem sido um
foco de atenção de muitos grupos de pesquisa.
INTRODUÇÃO - 16
O sistema nervoso (SN), quando submetido à injúria não apresenta resposta
neuronal semelhante, estudos demonstram que o SNP é mais resistente a injuria
que o SNC. O sistema nervoso periférico de um mamífero adulto apresenta grande
capacidade de regeneração, após a lesão os neurônios são capazes de regenerar
refazendo conexões a grandes distâncias, restaurando a função, desde que ocorra o
restabelecimento da sinapse com o alvo (Nicholls et al., 1999; Snider et al., 2002;
Verma et al., 2008). O mesmo não acontece em um axônio lesado na medula
espinal. Esta característica foi evidenciada por meio dos estudos de Cajal,
publicados em seu livro, “Degeneration and regeneration of the rervous system”
(publicado pela primeira vez, em 1928).
Aguayo et al. (1981) realizaram estudos experimentais em ratos e
camundongos, a partir dos resultados obtidos nestas pesquisas preconizaram que o
potencial regenerativo dos neurônios centrais poderia ser expresso somente quando
o “meio” do SNC se tornasse semelhante ao do SNP, constataram a partir de
pesquisas com transplante de segmentos do nervo óptico, contendo exclusivamente
astrócitos e oligodendrócitos, no nervo ciático lesado dos animais, devido não ter
ocorrido crescimento de neurônios nas regiões aonde foram transplantadas células
da glia do SNC. Em outro experimento, transplantaram um segmento autólogo de
nervo ciático, fazendo uma “ponte” entre a medula espinal e o bulbo, no tronco
cerebral. Evidenciaram após algumas semanas o segmento de nervo periférico
transplantado estava bem inervado por axônios provenientes tanto da medula
espinal, como do tronco cerebral. Demonstraram que estes axônios foram capazes
de crescer por toda a extensão do segmento de nervo periférico transplantado, uma
extensão muito maior do que era esperado ocorrer no SNC. Concluíram a partir de
então, que o crescimento de neurônios após lesão era mais dependente do meio
ambiente com o qual ele estava em contato, do que das propriedades intrínsecas
dos neurônios do SNC e do SNP. 50 (Ramon-Cueto et al., 1998).
Levi-Montalcini e Hamburger1 (1951 apud Nicholls et al., 2001) deram
significativa contribuição no entendimento das diferenças plásticas entre o SNC e o
SNP. Na década de 1940 evidenciaram a existência de um fator de crescimento
neuronal, o Nerve Growth Factor (NGF), no SNP, presente tanto durante o
desenvolvimento embrionário, quanto após lesões de células neurais de animais
1
Levi-Montalcini R, Hamburger V. Selective growth stimulating effects of mouse sarcoma on the
sensory and sympathetic nervous system of the chick embryo. J Exp Zool. 1951;116(2):321-61.
INTRODUÇÃO - 17
adultos. Este fator promovia crescimento e brotamento axonal (sprouting) de
neurônios sensitivos e do SN simpático. Uma proteína semelhante foi também
identificada no SNC, por Barde2 (1989 apud Nicholls et al., 2001) o Brain-Derived
Neurotrophic Factor (BDNF), a partir de então outras proteínas foram identificadas
com características comum de promover o crescimento, sendo denominadas de
neurotrofinas (Nicholls et al., 2001). Schwab e Caroni (1988) demonstraram a
presença de fatores capazes de inibir o crescimento neuronal no SNC, os quais,
mesmo na presença de fatores de crescimento, impedem o brotamento neuronal no
SNC após lesão. Entre esses fatores, conhecidos como “Nogos”, encontram-se o NI35/250, fatores relacionados com a mielina (Keirstead et al., 1992 e 1995), a
proteína mielina associada a glicoproteína (MAG) (McKerracher et al., 1994).
Os estudos de Keirstead et al. (1992 e 1995) e Hasan et al. (1993)
identificaram, no desenvolvimento embrionário de pintos, a capacidade de
regeneração após lesão do SNC. Observaram que, antes da formação da mielina e
de oligodendrócitos, o SNC era capaz de regenerar-se, porém perdia esta
propriedade após a mielinização. Aparentemente havia um período crítico transitório
durante o desenvolvimento embrionário, no qual o SNC passava de um estado
permissivo e favorável ao crescimento neuronal, para um estado desfavorável e não
permissivo a esse crescimento. Observaram que quando ocorria retardo do início da
mielinização na fase embrionária ou quando a medula espinal foi desmielinizada
após o nascimento dos pintos, o período permissivo ao crescimento axonal e
regeneração foi prorrogado, confirmando, assim, o papel inibitório da mielina
produzida pelos oligodendrócitos à regeneração axonal no SNC.
Em estudos recentes, Fischer et al. (2001) demonstraram que uma lesão total
do nervo óptico levava à perda irreversível da função visual, característica de uma
lesão no SNC. Todavia, quando a lesão por secção do nervo óptico era associada a
uma lesão do cristalino do olho e a uma reaproximação apropriada das extremidades
do nervo seccionado, havia não só um aumento na sobrevivência das células
ganglionares da retina, mas também um brotamento e crescimento dos axônios
lesados a longas distâncias, atravessando toda a extensão da via visual, chegando
inclusive a fazer conexões com o córtex visual. Os autores atribuíram este sucesso
na regeneração da função visual, à capacidade intrínseca que neurônios maduros
2
Barde YA. Trophic factors and neuronal survival. Neuron. 1989;2(6):1525-34.
INTRODUÇÃO - 18
possuem para fazerem crescer novamente seus axônios lesados, mesmo em um
ambiente não favorável à regeneração. Concluíram, ainda, que os neurônios podem
fazer uso desta capacidade, dependendo do estímulo a que eles sejam submetidos,
no caso, através de fatores tróficos liberados pelo cristalino lesado.
Schnell et al. (1999) realizaram trabalho analisando as respostas inflamatórias
induzidas por lesão traumática no cérebro e na medula espinhal. Tema que na
atualidade tornou-se um tema de investigação ativa. Foram utilizados neste
experimento camundongos, onde compararam a reação tecidual nestas duas
estruturas pertencentes ao SNC. Foi realizado com lesões mecânicas de tamanho
similar envolvendo as substancias branca e cinzenta. Esta avaliação incluiu a análise
quantitativa de neutrófilos, linfócitos e macrófagos activados/microglia, bem como a
ativação de astrócitos, a regulação positiva de moléculas de adesão de células
vasculares (ICAM-1, VCAM-1, PECAM) e a extensão da barreira hematoencefalica
(BHE). Foram analisados nos primeiro, segundo, quarto e sétimo dias, pós-lesão.
Encontraram provas claras de que a resposta inflamatória aguda à lesão traumática
é significativamente maior na medula espinal do que no córtex cerebral. Os números
de ambos os neutrófilos e macrófagos recrutadas para o local da lesão era
significativamente mais elevada na espinal medula do que no cérebro. A área de
certificação desagregação era substancialmente maior na medula espinal e danos
vasculares persistiram por um período mais longo. Este trabalho nos induz a concluir
que o cérebro e a medula espinhal, que embora pertençam a ao sistema nervoso
central, respondem diferentemente à lesão traumática, assim como à medula
espinhal resposta inflamatória à lesão mais elevada, por conseguinte mais
susceptível ao trauma.
Estudos experimentais têm demonstrado que o sistema nervoso adulto, tanto
periférico quanto central, apresenta capacidade de regeneração pós-lesão, se não
total pelo menos parcial. Porém, esta capacidade, é dependente de um complexo
conjunto de fatores, inclusive de neurotransmissores, que podem não só favorecer a
regeneração, mas, podem até mesmo levar a uma degeneração do tecido nervoso,
são objetos de investigação e estudo a identificação daqueles fatores que seriam
lesivos e os fatores que seriam neuroprotetores. Existem evidências de que a
neuroproteção ou a neurotoxidade é multifatorial estando associados a eventos em
cascata ao invés da resultante da ação de um fator único (Nicholls, Saunders, 1996;
Schwab, Bartholdi, 1996).
INTRODUÇÃO - 19
1.2 Hipovolemia
Hipovolemia ou oligoemia é um estado de diminuição do volume sanguíneo,
mais especificamente, a diminuição no volume de plasma sanguíneo, é
caracterizada por perda de fluido do corpo que conduz a um fluxo circulatório
insuficiente. A hipovolemia ocorre quando o volume de sangue em circulação diminui
o que leva ao fornecimento de oxigênio inadequado e privação da perfusão tecidual.
A hipoperfusão tecidual resulta em disfunção de órgãos, danos no tecido
permanente e eventual falência de órgãos (Dwyer, Trask, 2000).
No choque hipovolêmico, a alteração básica é a redução aguda do volume
circulante determinada por hemorragia e/ou sequestro hídrico. Essa alteração é
representada pela diminuição da pré-carga e, consequentemente, uma queda do
retorno venoso e do débito cardíaco, com aumento da resistência vascular periférica.
Essa redução do débito cardíaco é o substrato básico para a redução do fluxo
sanguíneo sistêmico e consequente redução da perfusão tecidual (Clarck, 1992;
Silva et al., 2001; Lichtenberger, 2004).
A hipovolemia e o choque são caracterizados pela inadequação entre oferta e
consumo de oxigênio aos tecidos, em que o ofertado, é insuficiente frente às
necessidades metabólicas locais. A perda sanguínea e os efeitos hemodinâmicos
que se seguem ao trauma são apenas o início da resposta orgânica bastante
complexa. Alfred Blalock descreveu, na década de 1930, os primeiros trabalhos
relativos aos efeitos hemodinâmicos da hipovolemia, porém, somente nos últimos 20
anos, aprofundou-se no conhecimento da resposta inflamatória decorrente dos
efeitos hemodinâmicos iniciais. Na fase inicial, o tempo para controle definitivo do
sangramento e a reposição volêmica adequada podem definir os pacientes que têm
maior chance de sobrevivência (Mock et al., 1998; Rotstein, 2003).
O hipovolêmico é um dos cinco tipos de choque que independentemente da
causa, condiciona um desequilíbrio entre o transporte e as necessidades de oxigênio
(O2) e substratos energéticos, o qual pode gerar sofrimento e morte celulares. A
própria lesão celular induz uma resposta inflamatória que, alterando as
características funcionais e estruturais da microcirculação, agrava ainda mais a
hipoperfusão tecidual. Gera-se assim um ciclo vicioso que, se não for interrompido,
pode levar à falência de múltiplos órgãos e, eventualmente, à morte (Lichtenberger,
2004).
INTRODUÇÃO - 20
Além do choque do hipovolêmico, pode ocorrer choque obstrutivo,
cardiogênico, distributivo e endócrino (Andersson, Vaslef, 1999) tendo como causa
mais comum o trauma. A hipovolemia é frequentemente um componente de todos os
tipos de choque (Franklin, Darovic, 2002). Ainda segundo os autores, este é o tipo
mais frequente de choque, podendo ser subsequente à hemorragia (perda da massa
eritrocitária e de plasma) ou a perda plasmática isolada (como sucede no sequestro
de liquido extravascular, nas perdas pelo trato gastrointestinal e urinário ou nas
perdas insensíveis). A sintomatologia destas duas situações é clinicamente
sobreponível, embora no segundo caso o quadro possa instalar-se de forma mais
insidiosa.
A causa mais comum de choque hipovolêmico é a hemorragia, sendo esta por
perda sanguínea contínua decorrente do trauma. Esta perda sanguínea leva à
diminuição da volemia, podendo determinar o choque hipovolêmico. Inicialmente, o
choque hemorrágico é caracterizado por aumento da resistência vascular sistêmica,
que por sua vez ocorre pelo aumento da atividade adrenérgica, com o intuito de
desviar sangue para órgãos nobres como cérebro, coração, pulmões e rins (Franklin,
Darovic, 2002).
O choque hipovolêmico é caracterizado por hipovolemia relativa e absoluta,
suas etiologias englobam entre outras causas, qualquer tipo de hemorragia, trauma,
coagulopatia, sangramento gastrointestinal ou mesmo rompimento de neoplasias
(Siqueira, Schimidt, 2003; Lichtenberger, 2004).
Como exemplo de hipovolemia relativa, têm-se as perdas por queimaduras,
perdas para um terceiro espaço como a cavidade peritoneal, útero ou área
gastrointestinal (Lichtenberger, 2004).
A hipovolemia absoluta é normalmente consequência de perdas sanguíneas
causadas pelo trauma (Rech, Rodrigues Filho, 2007).
O surgimento de sinais e sintomas relacionados à hipovolemia depende da
quantidade de perda de volume. Os sintomas clínicos manifestam-se a partir da
perda de 10% a 20% do volume total de sangue. De acordo com a literatura a partir
da perda de 10% da volemia, que é considerado o ponto de corte para a perda de
sangue clinicamente relevante, podendo a partir de então determinar instabilidade
hemodinâmica, principalmente se há morbidade pré-existente (Heitz, Horne, 1998).
Um dos primeiros sinais de hipovolemia é a hipotensão (Heitz, Horne, 1998).
O paciente portador de choque caracteriza-se clinicamente, entre outros sinais e
INTRODUÇÃO - 21
sintomas, por alterações sensoriais e do estado de consciência, como confusão
mental, inquietação, ansiedade, combinação de hipotensão com taquicardia,
taquipneia, hipersudorese, sinais de hipoperfusão periférica como palidez, cianose,
extremidades frias e úmidas, atraso de enchimento capilar, também pode queixar-se
de sede, diminuição da produção de urina e as veias jugulares encontrarem planas
(Lippincott Williams & Wilkins, 2005).
Segundo o Comitê de Trauma: Colégio Americano de Cirurgiões (1997), os
sinais e sintomas variam de acordo com a magnitude da perda e, portanto, com a
gravidade da situação. O choque hipovolêmico pode ser classificado em quatro
estágios de acordo com a porcentagem de perda sanguínea:
a) Estágio 1
- Até 15% de perda de volume de sangue (750 mL).
- Compensada pela constrição de leito vascular.
- Pressão arterial mantida.
- Frequência respiratória normal.
- Palidez da pele.
- Estado mental normal a uma ligeira ansiedade.
- Normal de enchimento capilar.
- Débito urinário normal.
b) Estágio 2
- De 15% a 30% de perda do volume de sangue (750-1500 mL).
- O débito cardíaco não pode ser mantido por constrição arterial.
- Taquicardia > 100 bpm.
- Aumento da frequência respiratória.
- Pressão arterial sistólica mantida.
- Aumento da pressão arterial diastólica.
- Narrow pressão de pulso.
- Pele pálida, fria e úmida, devido ao fluxo sanguíneo ser direcionado
para longe para os principais órgãos, tais como: como o coração,
pulmões e cérebro.
- Ligeira ansiedade/restless.
- Atraso de enchimento capilar.
- Produção de urina de 20 a 30 mL/hora.
INTRODUÇÃO - 22
c) Estágio 3
- De 30% a 40% de perda do volume de sangue (1500-2000 mL).
- PA sistólica ≤ 100 mmHg.
- Sinais clássicos de choque hipovolêmico.
- Taquicardia aumentada > 120 bpm.
- taquipneia aumentada > 30 bpm.
- Alteração do estado mental (confusão, ansiedade, agitação).
- Sudorese com pele fria e palidez.
- Atraso de enchimento capilar.
- Produção de urina de cerca de 20 mL/hora.
d) Estágio 4
- Perda do volume de sangue superior a 40% (> 2000 mL).
- Taquicardia extrema (> 140), com pulso fraco.
- Taquipneia pronunciada.
- Diminuição significativa da pressão arterial sistólica ≤ 70 mmHg.
- Nível reduzido de consciência, letargia, coma.
- Pele é suada, legal, e extrema palidez (moribundo).
- Ausência de enchimento capilar.
- Produção de urina insignificante.
A resposta orgânica ao trauma é desencadeada por dois modos diferentes de
agressão. O primeiro é atribuído à lesão tecidual direta. A segunda forma de
agressão é atribuída à perda sanguínea, com hipotensão e hipoperfusão tecidual, e
à hipóxia sistêmica. Outros fatores ainda determinantes para esta segunda agressão
são acidose metabólica e lesão por infecções decorrentes do próprio período de
ressuscitação ou lesão despercebida (Rotstein, 2003).
Várias definições têm sido propostas para a síndrome choque, praticamente
todas a caracterizam como severa insuficiência da perfusão capilar, incapaz de
manter a função normal das células (Raiser, 2000).
INTRODUÇÃO - 23
1.3 Fisiopatologia
Fisiologicamente, a produção de energia na forma de trifosfato de adenosina
(ATP) ocorre a nível celular, sendo o oxigênio elemento necessário para a produção
de energia, e a glicose constitui o componente principal utilizado para a produção de
energia. O metabolismo aeróbio representa o principal processo de combustão do
organismo. Ele produz energia usando oxigênio num processo complexo chamado
de ciclo de Krebs, com produção de 36 ATPs.
No
metabolismo
anaeróbio,
a
produção
de
ATP
é
reduzida
em
aproximadamente 97%. Na glicólise, a glicose é mobilizada em ácido láctico. O
lactato é utilizado para oxidar o dinucleotide nicotinamideadenine (NAD), permitindo
a produção de ATP para continuar. Este processo produz apenas dois ATPs. Todas
as reservas de energia são usadas rapidamente. Quando o oxigênio se esgota, o
lactato se acumula, causando acidose láctica. Acumulação de ácido láctico torna-se
clinicamente evidente como a acidose metabólica e disfunção dos órgãos (Franklin,
Darovic, 2002; Pagana, Pagana, 2006).
O corpo humano reage a hipovolemia e ao choque ativando os principais
sistemas fisiológicos, incluindo o hematológico, cardiovascular, renal, e os sistemas
neuroendócrinos buscando mecanismos compensatórios. Em geral, as diferentes
formas de choque desencadeiam uma série de mecanismos que visam
atenuar/reverter o estado de hipoperfusão e, deste modo, proteger os órgãos da
subsequente disfunção. Esses mecanismos consistem essencialmente numa
ativação neuroendócrina cujo padrão é semelhante ao que ocorre numa situação de
stress. Sendo assim, há participação do sistema adrenérgico como resposta
imediata, seguindo-se a ativação do córtex da suprarrenal com libertação de cortisol
e do sistema renina-angiotensina-aldosterona e a libertação da hormona
antidiurética pelo eixo hipotâlamo-hipofisário.
Uma das primeiras respostas ao choque hipovolêmico é a ativação dos
barorreceptores carotídeo e arco aórtico, enviando um sinal neural ao centro
vasomotor na medula oblonga, resultando em inibição parassimpática do centro
vagal e excitação do sistema simpático, tendo como consequência a vasoconstrição
das veias e arteríolas ao longo do sistema circulatório periférico, aumentando o
trabalho cardíaco e a força de contração do miocárdio (Lichtenberger, 2004), que
provoca uma mudança de fluido entre o compartimento vascular e dos espaços
INTRODUÇÃO - 24
intersticiais determinando inchaço das células endoteliais capilares, comprometendo
significativamente a função capilar devido o estreitamento do lúmen e redução do
fluxo sanguíneo no seu leito. O volume adicionado interfere com a distribuição de
oxigênio às células. As células poderão ser destruídas por enzimas que escapam de
lisozimas. Induzindo mais danos às células. A disfunção orgânica e tecidual será
proporcional ao número e distribuição das células destruídas (Franklin, Darovic,
2002).
No choque hipovolêmico ocorre uma redução do débito cardíaco em
decorrência a diminuição do retorno venoso para o coração como consequência de
uma perda súbita do volume intravascular. Neste momento os mecanismos
compensatórios na tentativa de aumentar o volume de líquidos circulantes ativam o
sistema neuro-hormonal. Se a situação ainda assim persistir, o volume sanguíneo
ainda existente é desviado para os órgãos vitais como cérebro, coração e pulmão,
provocando então uma redução na perfusão de certos órgãos como fígado,
estômago e rins. A consequência última da hipoperfusão é a lesão celular
(sofrimento e/ou morte) e a disfunção orgânica. A lesão celular é diretamente
proporcional a hipóxia (déficit de aporte de O2) que a hipoperfusão provoca. Os
mecanismos
subjacentes
à
lesão
celular
induzida
pela
hipóxia
são
fundamentalmente dois: disfunção mitocondrial (com desaclopamento da fosforilação
oxidativa) e lesão das membranas.
Ao nível celular, a primeira consequência da hipóxia é a redução da formação
de ATP pelas mitocôndrias, da qual resultam efeitos difusos sobre vários sistemas
da célula, em particular, a falência da bomba de Na+ e a estimulação da glicólise
anaeróbia. Por conseguinte, dá-se acumulação intracelular de Na+, perda de K+,
com consequente hiperpolarização da membrana e ganho isosmótico de água
(edema celular). Pela glicólise anaeróbia ocorre formação de produtos ácidos, como
o ácido láctico, os quais reduzem o pH intracelular e esta acidose metabólica,
condicionando
vasodilatação,
é
particularmente
importante
nos
estádios
graves/avançados do choque. Caso não haja a reposição do volume perdido, os
mecanismos compensatórios tornam-se ineficazes provocando então hipoperfusão
celular e incapacidade de manter em níveis normais a oferta de oxigênio celular para
o metabolismo, podendo estabelecer-se lesão irreversível, cujo principal alvo é a
perda de integridade morfofuncional da membrana celular. As possíveis causas
desta disfuncionalidade são a perda de fosfolípidos da membrana (devido à ativação
INTRODUÇÃO - 25
de fosfolipases pelo aumento da [Ca2+] citosólico secundária à sua mobilização a
partir dos reservatórios intracelulares induzida pela isquemia), alterações do
citoesqueleto (pelo edema celular e ativação de proteases induzidas pelo aumento
do cálcio citosólico), os produtos da degradação dos lipídios (resultantes da
degradação de fosfolípidos, com efeito detergente) e a produção de radicais livres de
oxigênio. Estes últimos são moléculas de oxigênio parcialmente reduzidas,
altamente tóxicas e que causam lesão das membranas e outros constituintes
celulares. Sua libertação está aumentada em tecidos isquêmicos após a restauração
do fluxo sanguíneo, originando a chamada lesão de reperfusão. Parecem ser
produzidas principalmente por células inflamatórias que infiltram o local da isquemia
durante a reperfusão. As concentrações séricas de lactato e oxigênio são medidos
em função de corresponder à gravidade do choque (Franklin, Darovic, 2002;
Pagana, Pagana, 2006). Consequentemente, determinará o grau de degradação de
tecidos, da morte celular com necrose e apoptose de células gliais e neuronais em
torno do local da lesão. Todos os mecanismos citados concorrem, em última análise,
para a perda da integridade da membrana. Uma das implicações deste fato é o
influxo de Ca2+, o qual se encontra fortemente relacionado com alterações
responsáveis pela irreversibilidade da lesão celular: envenenamento mitocondrial,
inibição de enzimas celulares e desnaturação proteica.
A morte celular em cada órgão depende de fatores intrínsecos a cada um
deles, como a presença ou ausência de doença crônica pré-existente, uso de
drogas, a idade biológica, características fisiológicas individuais, magnitude de
doença ou lesão subjacente, e o período de tempo de ocorrência dos processos de
choque. O risco de dano é maior naqueles órgãos que possuem as maiores taxas
metabólicas e consumo de oxigênio, tais como o cérebro, coração, fígado e rins
(Franklin, Darovic, 2002).
O catabolismo promove o metabolismo anaeróbico, bem como a glicogenólise
e da lipólise, o que pode resultar em concentrações elevadas de ácidos graxos, de
lactato e hiperglicemia. O aumento da produção de lactato provoca acidose
metabólica, o que determina agravamento a mais no estado de choque (Franklin,
Darovic, 2002).
A reperfusão isquêmica I/R é outro evento na sequência hipóxica, que causa
lesão adicional, pois desencadeia eventos fisiopatológicos complexos determinando
excitotoxicidade, processo inflamatória, produção de radicais livres, as células
INTRODUÇÃO - 26
liberam maior quantidade de óxido nítrico. Estas substâncias determinaram danos
significativos às células, os quais contribuíram para apoptose e morte celular.
(Franklin, Darovic, 2002).
Estudos bioquímico e morfológico e demonstram evidência que a lesão por
reperfusão R/I induz tanto a necrose e apoptose medula espinhal (Kanellopoulos et
al., 1997; Kato et al., 1997; Mackey et al., 1997; Hayashi et al., 1998; Sakurai et al.,
1998; Liang et al., 2003). Esta linha de pesquisa vem ganhando reforço por meio de
inúmeros trabalhos publicados na última década, embora ainda não seja
determinada qual a intensidade de lesão por reperfusão pode influenciar os
mecanismos de morte celular (MacManus, Linnik, 1997; Zipfel et al., 2000). Estudos
experimentais demonstram evidências dos mecanismos da possível relação entre a
gravidade da lesão por reperfusão e morte celular. Lu et al. (2004) realizaram
estudos, os quais demonstraram que a hipotensão hipovolêmica sistêmica teve um
impacto importante sobre a gravidade da lesão por reperfusão na medula espinhal,
induzida pela oclusão da aorta torácica. Neste trabalho os animais submetidos à
hipovolemia por sangria antes da oclusão da aorta mostraram disfunção neurológica
grave e de alta mortalidade. Aqueles animais não sujeitos a hipotensão hipovolêmica
tenderam a apresentar déficits neurológicos mais leves e brandos.
Neste trabalho, Lu et al. (2004), induziram isquemia da medula espinal por
insuflação do balão para ocluir totalmente a aorta torácica, para assim avaliar os
efeitos de hipotensão hipovolêmica induzida, sobre o fluxo de sangue da medula
espinhal (FSME). Foi realizado laminectomia da coluna torácica expondo a duramáter da medula espinal, onde o feixe de laser (fluxometria a Laser) foi dirigido para
a leitura e registro do fluxo de sangue da medula espinhal. No grupo de normotensos
(NT), todos os procedimentos cirúrgicos, foram os mesmos que no grupo HT, exceto
que a oclusão da aorta não foi precedida por sangria. A gravidade da lesão foi
controlada através de registros da pressão arterial carótida do FSME mostrando que
a oclusão da aorta induzia a elevação dramática do PSC, porém determinava e a
queda do FSME, no grupo de NT e grupo hipotensor (HT). No entanto, o grupo HT
demonstrou que SCBF era significativamente menor durante a oclusão da aorta, e
que a elevação foi muito mais lento do que o FSME após a reperfusão, o
desempenho neurológico extremamente fraco e as lesões da medula espinhal foram
caracterizadas por infarto associado com extensa área de morte celular por necrose.
Em contraste, no grupo NT, a lesão por reperfusão isquêmica resultou em menor
INTRODUÇÃO - 27
área de destruição de tecidos associada apoptose com menor extensão, e o
resultado funcional favorável. Demonstrando também correlação histopatológica
onde evidenciou relativa preservação de neurônios motores nos cornos ventrais da
apoptose o que pode ter contribuído para o menor comprometimento funcional no
grupo NT (Griffiths, 1973).
Este estudo destaca a possibilidade na qual a gravidade da lesão pode ser
manipulada por meio do controle da pressão arterial sistêmica, como também, o
papel devastador que a hipotensão hipovolêmica sistêmica é capaz de determinar na
reperfusão isquêmica em decorrência da hipoperfusão mais duradoura e profunda
na medula espinhal, o que resulta em lesão isquêmica mais grave da medula
espinhal, caracterizada por extensa área de necrose e morte neuronal.
O tratamento precoce do choque hipovolêmico oferece poucos problemas
teóricos, mas na prática, existem ainda algumas dúvidas quanto à forma de
tratamento. A substituição de volume ideal, bem como, para que possa ocorrer um
fornecimento adequado de oxigênio aos tecidos é sempre uma dificuldade (Silva
1997).
Grande é o interesse na utilização de fluídos para o tratamento de choque
hemorrágico (Dubick et al., 2006).
Neste momento surge a questão de qual a melhor opção para o tratamento;
uma solução coloide ou cristaloide pode ser escolhida. O uso de fluidos coloides e
cristaloides durante a ressuscitação do paciente em choque pode e tornar um
processo complicado, principalmente quando esta for realizada sem monitoração
cuidadosa, quanto a sistema cardiovascular, bem como quanto à monitoração das
pressões arteriais e venosa (Rudloff, Kirby, 2001).
O conhecimento das alterações fisiológicas que acontecem no choque
hemorrágico é fundamental para a identificação de sua morbimortalidade e para
escolha do tratamento adequado, a fim de melhorar o prognóstico do paciente
(Giesecke, Laurence, 1992; Rocha et al., 1992).
A monitorização dos estados de choque vai depender do local onde se
encontra o paciente, da fase de atendimento e dos recursos disponíveis no momento
(Horton et al., 1984).
INTRODUÇÃO - 28
1.4 Lesões Traumáticas da Medula Espinal
O trauma raquimedular (TRM) com lesão da medula espinal (LME) configura-se
como um grande problema de saúde pública, pois suas consequências podem ser
incapacitantes e devastadoras, devido ao comprometimento neurológico sensitivomotor e aos mecanismos neuronais de controle fisiológicos, sendo o trauma,
atualmente, considerado a principal causa de morte geral no mundo contemporâneo.
O trauma raquimedular é uma condição que afeta todas as comunidades e regiões do
mundo. Prevalece em indivíduos jovens (entre 18 e 35 anos de idade), ocorre,
preferencialmente, no sexo masculino, na proporção de 4:1, determinando assim
consequências socioeconômicas de grande magnitude. Configura-se, portanto, um
grande desafio à comunidade científica, médica, como também ao Estado, em
decorrência do alto custo para o tratamento desta enfermidade. A despeito dos efeitos
debilitantes, redução definitiva da qualidade de vida, enorme custo social, financeiro e
emocional ás vítimas, como também do imenso custo à sociedade, o tratamento
clinico na atualidade oferece ainda modestos benefícios. Acredita-se que isto se deva
ao complexo mecanismo envolvido na lesão medular, como também a inabilidade do
corpo humano de reparar ou regenerar os neurônios. Os estudos mostram ser pouco
efetiva a intervenção farmacológica e cirúrgica no local do trauma (Bracken et al.,
1981; Tator, 2000; Sekhon, Fehlings, 2001; Geisler et al., 2002, Dryden et al., 2003;
Olby, Jeffery, 2003; Devivo, 2012).
A lesão da medula espinal ocorre em cerca de 15% a 20% das fraturas da
coluna vertebral e a incidência desse tipo de lesão apresenta variações nos
diferentes países. Dados estatísticos publicados pelo National Spinal Cord Injury
Statistical Center (NSCISC), em 2010, nos Estados Unidos revelam números
consideráveis de indivíduos acometidos pela lesão medular. Estima-se a ocorrência
de 40 casos de LME por milhão de habitantes, totalizando cerca de 12 mil novos
casos de lesados medulares por ano, sem contabilizar as vítimas que vão a óbito no
local do acidente. Destes, 80,8% são do sexo masculino, 66,2% são brancos e
adultos jovens (com idade média de 35 anos). As causas mais comuns são de
origem traumática: acidente automobilístico (41,3%), seguidos por quedas (27,3%),
atos de violência (principalmente por ferimentos com armas de fogo 15%), esportes
e atividades recreativas (7,9%) (Leucht et al.3, 2009 apud Paula, 2011).
3
Leucht P, Fischer K, Muhr G, Mueller EJ. Epidemiology of traumatic spine fractures. Injury.
2009;40(2):166-72.
INTRODUÇÃO - 29
No Brasil, cerca de 40 casos novos anuais por milhão de habitantes,
perfazendo um total de seis a oito mil casos por ano. Acidentes automobilísticos,
queda de altura, acidente por mergulho em água rasa e ferimentos por arma de fogo
têm sido as principais causas de traumatismo raquimedular. A frequência dos TRM
em decorrência de ferimentos por projéteis de arma de fogo tem aumentado de
modo considerável, refletindo o alto nível de violência nos grandes centros (Barros
Filho et al.,1990; Greve, 1997; Defino, 1999).
Apesar de o Brasil não constar dados estatísticos oficiais, pode se ter uma
estimativa pelos dados da Associação de Assistentes de Crianças Deficientes(AACD),
dados que apontam como as maiores causas de lesão medular no Brasil, os acidentes
de arma de fogo (43,5 %), acidentes automobilísticos (30,5%), quedas de altura
(13%), e mergulho em águas rasas (6,8%) (AACD, 2006).
A lesão da medula espinal é considerada como incapacitante funcional,
devido á interrupção na transmissão da comunicação entre os neurônios corticais e
suas conexões medulares, as quais podem interromper as vias aferentes e eferentes
entre o encéfalo e todas as partes do corpo abaixo do nível da lesão (Rossignol et
al., 2008; Lima et al., 2008).
As lesões ao nível medular provocam acometimentos em diferentes sistemas e
órgãos do corpo humano, sendo mais evidente o comprometimento nos sistemas:
motor, sensorial, urogenital, gastrointestinal e cardiorrespiratório (Marcon, 2006). Além
disso, pode desencadear complicações decorrentes da diminuição da mobilidade e
algumas destas são de caráter progressivo como: úlceras de pressão, espasticidade,
osteoporose, hipotensão postural, contraturas, deformidades, trombose venosa
profunda e dor neuropática, as quais podem agravar o quadro clínico do paciente
(Brito, Battistella, 2004; Baldisserotto et al., 2009; Franzoi et al., 2009).
A partir da segunda Guerra Mundial o prognostico do TRM começou a ser
modificado. Os médicos assistentes às vítimas em campo de batalha observaram que
os soldados acometidos de ferimentos medulares sobreviviam por muito tempo, apesar
das limitações motoras, sensoriais e/ou autonômicas imposta pela lesão. O resultado
destas observações foi a motivação a criação de centros de emergência, protocolos de
atendimento e prevenção, incentivo a pesquisas para melhor compreensão da
fisiopatologia envolvida neste processo, prevenção as complicações e tratamento desta
doença com novas técnicas cirúrgicas, medicamentos e procedimentos de reabilitação.
Entretanto a lesão medular continua sendo um dos maiores desafios da neurologia
(McDonald et al., 1999).
INTRODUÇÃO - 30
O objetivo maior nos últimos anos da comunidade científica voltada a esta
área, visa encontrar novas intervenções terapêuticas que possibilitem prevenir ou
minimizar as sequelas decorrentes do trauma (Taoka, Okajima, 1998; Devivo, 2012).
Os estudos relacionados à lesão da medula espinal possuem duas vertentes.
A fase aguda, e a fase crônica. A fase aguda estende-se do momento da lesão até
48 horas. Esta divisão temporal é arbitrária (De La Torre, 1984).
Após o impacto à medula espinhal, existe um bloqueio total da condução
nervosa devido ao influxo de potássio advindo das células lesadas mecanicamente.
A mudança da quantidade de potássio extracelular e intracelular promove a
despolarização e, consequente, bloqueio da condução (Janssens, 1991; Jeffery,
1995; Olby, Jeferry, 2003).
O trauma medular agudo resulta em lesão por meio de dois mecanismos. A
lesão primária é decorrente da transferência de energia cinética para a medula espinal
imediatamente ao trauma (Defino, 1999) determinando ruptura de axônios, corpos
celulares nervosos e estruturas de suporte (células da glia) assim como da
vascularização (Dolan et al., 1980; Rucker, 1990; Chapman, Anderson, 1994; Bagley et
al.; 1999; Bergman et al., 2000) resultando em interrupção fisiológica e/ou morfológica
dos impulsos nervosos, deterioração funcional e comprometimento a integridade
estrutural da medula espinhal (Shores, 1992; Meintjes et al., 1996; Bergman et al.,
2000; Olby, Jeffery, 2003). Pode estar associado o comprometimento cardíaco e
pulmonar, fatores estes determinantes na oxigenação e perfusão tecidual, que podem
modular a extensão da injuria resultante do stress mecânico. Nessa fase, os
tratamentos vão desde terapia medicamentosa, visando interferir nos efeitos
bioquímicos deletérios, manipulações bioquímicas celulares e moleculares do tecido
nervoso, até a intervenção cirúrgica, tendo como objetivo interromper ou reverter a
progressão das disfunções (Dolan et al., 1980; Tator, 1983; Rucker, 1990).
A contusão e/ou a compressão configuram-se como as principais causas da
lesão primária da medula espinal (Rowland et al., 2008) embora sendo a principal
causa de lesão podendo resultar na morte de neurônios, o efeito deletério mais
importante, ocorre devida a resposta do organismo ao trauma, conhecida como
lesão secundária. Os mecanismos subjacentes a este processo têm sido relatados.
Estes incluem hemorragia e destruição do leito microvascular, repentina mudança na
concentração intracelular do íon Ca+2, excitoxicidade, produção de radicais livres e
inflamação (Shores, 1992; Kornegay, 1998; Lee et al., 2005).
INTRODUÇÃO - 31
Ocorrendo em sequência, a formação de espécies reativas de oxigênio
(EROs) e nitrogênio (ERNs) é caracterizada como o evento mais importante na
patogênese do trauma medular agudo. As espécies reativas são implicadas como
mediadores de danos axonais, pelos níveis locais de radicais livres que aumentam
consideravelmente em condições inflamatórias e esgotam o potencial de defesa
antioxidante no interior das lesões, gerado principalmente por macrófagos ativados e
microglia (van Meeteren et al., 2005; van Horssen et al., 2011).
O ponto final desta cascata destrutiva é muitas vezes a apoptose, que pode
ocorrer por um longo período de tempo após a lesão (Olby, 2010).
Embora não exista evidencias cientificas muito clara dos mecanismos
envolvidos na lesão medular secundária, trata-se de um processo complexo e
dinâmico, que se iniciam minutos após o trauma, estendendo por horas, dias e
semanas, ampliando assim a gravidade da lesão, promovendo reações em cascata,
numa sequência de modificações moleculares e celulares, a patologia secundária;
estende-se da área inicial do trauma em ambas as direções rostral e caudal da
medula espinal, afetando inicialmente a substância cinzenta da medula espinhal,
propagando-se para a substância branca e podendo levar a destruição progressiva do
tecido nervoso (Kraus, 2000), sendo assim, contribuindo para degradação tecidual e
perda funcional. Este processo está relacionado à perda da autorregulação do fluxo
sanguíneo no segmento medular lesionado (Francel et al., 1993) e sua extensão
depende da severidade da lesão inicial, sendo de caráter progressivo (Jeffery, 1995).
Dentre os mecanismos fisiopatológicos envolvidos na lesão medular, os distúrbios
vasculares desempenham papel fundamental no estabelecimento da lesão medular
secundária. Evidencia-se nesta fase: hemorragia, isquemia, danos induzidos pela
reperfusão, distúrbios micro circulatórios e hipotensão sistêmica (Akdemir et al., 1992;
Chapman, Anderson, 1994) e o aumento da concentração de substâncias
vasoconstritoras (como a prostaglandina PGF2α e o tromboxano A2) no segmento
lesado, somado à hipotensão sistêmica que ocorre após o trauma, pode causar o
declínio do fluxo sanguíneo medular, levando à isquemia neuronal (Jerram, Dewey,
1999). Estas substâncias que, além de serem potentes vasoconstritoras, facilitam
fortemente a agregação plaquetária, comprometendo assim a microcirculação
(Rucker, 1990; Coughlan, 1993). O decréscimo da perfusão na área lesada reduz o
suprimento de oxigênio e energia para os neurônios e células da glia, causando dano
à membrana celular, levando ao aumento da sua permeabilidade e consequente
INTRODUÇÃO - 32
penetração de fluidos, componentes sanguíneos e substâncias lesivas aos neurônios
(Kraus, 2000; Olby, Jeferry, 2003).
Logo após lesão concussiva severa, a hemorragia que ocorre na substância
cinzenta também causa decréscimo generalizado no fluxo sanguíneo medular
(Jeffery, 1995). A isquemia decorrente da lesão concussiva afeta, principalmente, a
substância cinzenta da medula espinhal, pois esta parte da medula espinhal, mais
vascularizada, possui maior exigência de oxigênio e glicose quando comparado à
substância branca (Rucker, 1990). As grandes artérias são afetadas, mas
principalmente na microcirculação local, ocorrerão mudanças mais importantes, a
partir da ruptura dos pequenos vasos sanguíneos levando a hemorragia
ocasionando uma falha de autorregulação tendo o glutamato papel determinante na
excitotoxidade (Xu et al., 2005; Charles, 2011). Tem sido reportada a ocorrência de
acentuada redução do fluxo sanguíneo no local imediatamente após a lesão medular
(Senter, Venes, 1978; Tator, Fehlings, 1991). A isquemia torna-se progressivamente
pior durante as primeiras horas, e tem uma relação linear dose-resposta com a
gravidade da lesão (Fehlings et al., 1989; Charles, 2011).
Além disso, a hipotensão sistêmica pode agravar a disfunção da
microcirculação e exacerbar a lesão neuronal (Thuret et al., 2006). Nesta fase, além
das mudanças no fluxo sanguíneo e consequentemente isquemia, evidencia-se
edema, acúmulo de cálcio intracelular, de potássio no espaço extracelular, hidrólise
de fosfolipídeos, formação de radicais livres, liberação de aminoácidos excitatórios
como glutamato e aspartato, além de migração de células inflamatórias, ativação da
microglia e presença de fatores inibitórios (Schwab, Bartholdi, 1996). Desta forma,
ocorrerá alto índice de degradação tecidual resultando em morte celular com
necrose a apoptose das células neurais e gliais em torno do local da lesão
estabelecendo, por fim, mudanças biomecânicas e patológicas que podem causar
deterioração funcional e comprometer a integridade estrutural da medula espinhal
(Shores, 1992; Meintjes et al., 1996; Bergman et al., 2000; Olby, Jeferry, 2003).
Estudos demonstram que pacientes vítimas de lesão medular associada a
outras lesões (politraumas) apresentam déficit neurológico inicial mais severo,
recuperação neurológica pobre, assim como aumento da incidência de mortalidade.
Atribuindo a hipotensão como a principal responsável pela evolução neurológica
menos favorável. Vários trabalhos tem demonstrado a frequente associação de
múltiplos traumas com hipotensão e hipóxia, determinando assim um dano adicional
INTRODUÇÃO - 33
á medular espinal. A medula espinal é mais vulnerável a hipotensão porque ocorre a
perda da autorregulação do fluxo sanguíneo medular imediatamente após a lesão e
isso agrava a isquemia local (Meguro, Tator, 1988; Tator, 2000; Lu et al., 2004).
A medula espinal e o cérebro fazem parte do sistema nervoso central, sua
divisão é didática (Machado, 2006), possuem características morfofuncionais que
permitem a analogia dos fenômenos fisiopatológicos que ocorrem nessas estruturas
(Coughlan, 1993). Desse modo os distúrbios vasculares decorrentes do traumatismo
encefálico poderiam ser extrapolados para a medula espinal. Tem sido demonstrado
que os distúrbios vasculares desempenham importante papel no estabelecimento e
continuidade da lesão secundária do traumatismo craniano (Cambridge, Bagley,
1997), pois estudos demonstram que imediatamente ao trauma, ocorre perda da
autorregulação do fluxo sanguíneo, sendo esta ocorrência, uma das características
determinantes das lesões do sistema nervoso central, e a pressão de perfusão
torna-se diretamente relacionada à pressão arterial sistêmica, que na maioria das
vezes está baixa devido às lesões sistêmicas concomitantes (Olby, 1999).
O cérebro possui reserva limitada de oxigênio nas células e tecidos
neuronais, e são altamente dependentes da oferta de oxigênio via circulatória,
consequentemente sofrerá influência direta da volemia. Em geral sobrevivem até
sete minutos sem oxigênio, após este período, existe grande risco de danos
celulares irreversíveis. A fisiopatologia celular deste processo tem sido investigada
assim como as consequências bioquímicas da baixa oferta de oxigênio e ATP á
células nervosas. As células nervosas, células da glia e o endotélio vascular
cerebral, parecem ter susceptibilidade à baixa da concentração de oxigênio. Estudos
clínicos em humanos têm demonstrado, que pacientes com menor concentração de
oxigênio no cérebro pós-trauma, possuem pior prognostico, isto pode demonstrar
que o cérebro com lesão traumática é mais susceptível á hipóxia que o cérebro
normal, embora esta afirmativa seja baseada apenas em dados epidemiológicos
(Chesnut et al., 1993a; Chesnut, 1997; Erecinska, Silver, 2001).
A lesão traumática no cérebro pode determinar aumento da permeabilidade
vascular cerebral devido uma falha da barreira hematoencefálica, consequentemente,
provocando uma resposta inflamatória (Ronaghi et al., 2010).
Os resultados do Traumatic Coma Data Bank mostram a influência da
hipotensão no momento da admissão hospitalar dos pacientes portadores de lesão
cerebral traumática. Os estudos mostraram a ocorrência de duas vezes mais a
INTRODUÇÃO - 34
mortalidade e um aumento significativo na morbidade, quando comparados com os
pacientes que estavam normotensos. A presença simultânea de hipóxia e
hipotensão à admissão resultaram numa mortalidade de 75%. Sabe-se que a
prevenção ou minimização de hipotensão durante o período agudo e após lesão
traumática do cérebro tiveram maior probabilidade de melhorar os resultados que
qualquer outra manobra terapêutica (Bullock et al., 2003a, 2003b).
A hipotensão deve ser evitada a todo custo, a manutenção da estabilidade
hemodinâmica
é
essencial
para
o
tratamento
do
paciente
com
trauma
cranioencefálico (TCE) grave, já que a lesão cerebral pode levar a perda da
capacidade de autorregulação vascular de modo localizado no sistema nervoso
central, ou sistemicamente. As lesões secundárias ocorrem em horas ou dias após o
trauma inicial e são causadas, principalmente, por mecanismos relacionados à
hipotensão e hipóxia, uma simples aferição de um episódio de hipotensão arterial é
geralmente associada ao dobro da mortalidade e um marcado aumento da
morbidade do TCE (Marmarou et al., 1991; Manley et al., 2001).
Os estudos retrospectivos têm sugerido que a associação entre hipotensão
arterial sistêmica e hipóxia e são determinantes no pior prognóstico na lesão
cerebral traumática. Hipotensão é o fator secundário mais importante no aumento da
morbidade e mortalidade após o TCE, pouco se sabe, entretanto, sobre a frequência
e duração das causas potencialmente evitáveis de lesão cerebral secundária
(Marmarou et al., 1991; Manley et al., 2001).
A busca do entendimento dos eventos bioquímicos, que resultam em necrose
tissular e lesão excitotóxica, tem sido o alvo principal do estudo desta fase da lesão
medular, pois somente por meio da intervenção neste processo obter-se-á êxito
terapêutico para o tratamento das lesões medulares (Thuret et al., 2006).
A segunda é a fase crônica, que pode se estender por dias, semanas, até
meses. Nesta fase o quadro neurológico encontra-se já estabelecido, portanto, a
terapêutica medicamentosa e cirúrgica tem pouco contribuído para reversão das
disfunções neurológicas. Por outro lado, a lesão medular crônica também pode se
referir aos efeitos do trauma meses a anos após a lesão medular aguda (Bergman et
al., 2000), principalmente a desmielinização (Blight, Tuszynski, 2006). Na prática
clínica é difícil classificar as lesões, Pois elas não ocorrem de forma isolada (Thuret
et al., 2006).
INTRODUÇÃO - 35
Os avanços tecnológicos na área de reabilitação, os cuidados médicos, a
prevenção, o controle das infecções secundárias que podem se desenvolver após o
trauma, a capacidade de lidar com todas as complicações da lesão medular
promoveu o aumento da qualidade e sobrevida dos pacientes com este tipo de
lesão, incrementando assim a pesquisa de terapias voltadas para a desmielinização
crônica (Blight, Tuszynski, 2006).
Esta é uma área que tem crescido muito no estudo da lesão medular, pois
está relacionada à regeneração do tecido nervoso central após lesão.
Os transplantes celulares configuram uma alternativa promissora na
recuperação morfofuncional de pacientes vítimas de trauma da medula espinal.
Diversas técnicas buscam a reconstituição do tecido nervoso lesionado, através do
implante de células diferenciadas de tecido do SNC fetal, promovendo o
desenvolvimento de um meio favorável à regeneração tecidual (Jeffery et al., 2001).
Células nervosas da bainha olfatória, encontradas no bulbo e nervo olfatórios,
local de contínuo crescimento celular, utilizadas com o objetivo de promover
regeneração axonal, funcionaram como suporte para a mielinização dos axônios
contribuindo assim na recuperação neurológica de pacientes vítimas de lesão
medular (Jeffery et al., 2001). Outros tipos de células que podem ser transplantadas
são as células de Schwann, visto que a regeneração axonal no sistema nervoso
periférico ocorre mais facilmente devido a particularidades que poderiam ser
aplicadas no sistema nervoso central (Jeffery, Blakemore, 1999).
As células-tronco representam hoje, outro tipo celular promissor, pela sua
capacidade de crescer e se diferenciar em células que compõem os diferentes
tecidos do organismo. São utilizadas em diversos estudos na espécie humana, com
o objetivo de reconstituir a comunicação entre o cérebro e os membros, mas ainda
são necessários muitos anos antes do transplante celular ser considerado uma
possibilidade rotineira de tratamento (Blight, 2000; Jeffery et al., 2001).
INTRODUÇÃO - 36
1.5 Métodos de Avaliação Funcional dos Animais após Lesão da Medula Espinhal
A investigação e estudo dos fatores envolvidos na lesão neuronal traumática,
são determinantes no entendimento dos mecanismos da recuperação funcional,
como também são imprescindíveis os estudos referentes à avaliação detalhada da
recuperação dos animais após a lesão.
As pesquisas convergem para três tipos principais de análise, cada uma delas
envolvendo suas particularidades, e constituídas de vários métodos, tendo como
objetivo comum, o estudo de avaliações pós-lesão do SN: a) a análise funcional ou
comportamental; b) a análise eletro neurofisiológica; e c) a análise histológica
(Jabaley et al., 1976; Dellon, Mackinnon, 1989).
A análise funcional permite o estudo da SN em relação aos aspectos distintos
ou
em
relação
a
aspectos
gerais do
comportamento.
A
análise
eletro
neurofisiológica, permite o estudo da atividade elétrica presente no tecido nervoso,
tanto em relação à frequência, quanto em relação à amplitude dos impulsos gerados,
a qual pode ser interpretada como um índice de funcionalidade celular. A análise
histológica por outro lado, permite o estudo das características morfológicas e
moleculares do tecido normal comparado ao tecido lesado. Em estudos dos
processos degenerativos e regenerativos, envolvidos em lesões do SN, estes três
tipos de avaliação têm sido vastamente utilizados, muitas vezes, porém,
separadamente (Dellon, Mackinnon, 1989).
Os comportamentos funcionais responsáveis pela locomoção envolvem
integração das capacidades sensorial e motora, portanto, a perda de uma dessas,
ou de ambas, resulta em déficits mensuráveis por vários testes comportamentais.
Para uma avaliação completa, devem-se incluir testes de avaliação funcional motora
e/ou sensitiva (Muir, Webb, 2000).
1.6 Principais Questões Relativas ao Estudo da Lesão da Medula Espinal
Existe uma busca constante, através de estudos e pesquisas científicas, com
o objetivo do entendimento dos processos envolvidos na lesão traumática da medula
espinhal, pois eles são determinantes no processo de deficiências permanente. O
estudo dos fenômenos envolvidos na lesão aguda, as reações químicas em cascata
determinado as lesões primárias, secundária e por fim a degeneração axonal e/ou a
INTRODUÇÃO - 37
morte neuronal, têm sido o objetivo maior da comunidade cientifica voltada a esta
área. Os estudos buscam respostas para as seguintes questões.
Quais são os mecanismos celulares e moleculares subsequentes, envolvidos
na lesão primária, que levam à degeneração axonal e/ou à morte celular? Quais os
mecanismos e elementos capazes de desencadear o processo de degeneração
axonal no SNC, e especificamente na medula espinal? Como é possível prevenir ou
interromper a reação em cascata de eventos deletérios ativados pelo evento inicial,
através do bloqueio de moléculas específicas, dessa forma preservando e
protegendo os neurônios? Quais são os mecanismos moleculares que podem ser
mobilizados para determinar a regeneração do tecido nervoso? E ainda, seria
possível transpor este conhecimento á prática clínica, na forma de terapias de
proteção e regeneração neuronal, objetivando a preservação e a restauração da
função neuronal em humanos?
1.7 Objetivos
1.7.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos da hipovolemia sobre a lesão medular traumática em ratos.
1.7.2 Objetivos Específicos
a) Estudar o comportamento motor dos animais nos períodos de pré-teste,
um, três, sete e 14, dias após o procedimento experimental.
b) Analisar as respostas motoras frente à lesão medular nos grupos lesão
medular sem hipovolemia e lesão medular com hipovolemia no período pré-teste,
pré-teste, um, três, sete e 14, dias após o procedimento experimental.
c) Analisar o efeito da hipovolemia na recuperação motora em ratos com
lesão medular.
2 MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL E MÉTODOS - 39
2.1 Material
Neste experimento foram utilizados 20 ratos, machos, Wistar, com peso
variando entre 260 g e 320 g, provenientes do biotério central da Universidade
Federal do Maranhão. Os animais foram trazidos para o laboratório de farmacologia
oito dias antes do início do experimento para adaptação ao novo ambiente. Foram
mantidos em gaiolas contendo quatro animais alimentados com dieta padrão do
biotério e água ad libitum, com temperatura controlada (24 ± 2ºC), com um ciclo de
claro/escuro de 12/12 h, com início às 06h00min. Os experimentos seguiram as
normas do Multicenter Animal Spine Injury Study (MASIS).
Previamente ao início do experimento, os animais foram pesados,
identificados e numerados por meio de um código de marcas nas caudas. Dividiramse aleatoriamente os animais em grupos A e B, ambos com n = 10 e submetidos à
lesão medular por contusão, sendo que no grupo B, após a lesão medular, os
animais foram submetidos à sangria de 20% da sua volemia, seguido de sutura dos
planos anatômicos, durante os dias seguintes os animais foram submetidos à
expressão vesical manual 12/12 h pelo método de Credé diariamente, até o 14º dia.
Procedeu-se avaliação motora no período pré-teste, 24 h, 72 h, no sétimo e 14º dias
da lesão medular.
Adotaram-se os critérios de inclusão e exclusão, estabelecidos e padronizados
por Rodrigues (1999).
Critérios de inclusão:
- Ratos da raça Wistar.
- Machos adultos jovens (~ 8 a 12 semanas de vida).
- Peso entre 260 e 320 gramas.
- Condição geral e motricidade normal.
Critérios de exclusão:
- Óbito imediatamente após lesão, ou durante a sangria.
- Anomalias da coluna vertebral na área a ser lesionada, observada
macroscopicamente.
- Lesão ou ruptura da artéria carótida cervical durante a canalização para
sangria.
MATERIAL E MÉTODOS - 40
- Autofagia ou mutilação entre os animais.
- Movimentação abaixo da lesão medular após recuperação anestésica.
- Lesão da dura-máter com hemorragia subpial no ato operatório.
A pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética da Universidade Estadual do
Maranhão (UEMA), conforme decisão do Centro de Ciências Agrárias Curso de
Medicina Veterinária nº 034/2014 (Anexo A).
2.1.1 Grupos Experimentais
a) Grupo A - Controle - Lesão Medular sem Hipovolêmia (LMsH)
Neste grupo após a anestesia, o animal era posicionado em decúbito ventral
em prancha com coxim, fixado suas patas com fita elástica, submetido á antissepsia
com álcool 70% e povidine tópico. O procedimento foi realizado, a partir de então,
com auxílio de microscópio cirúrgico, com lente de 10x. Incisava-se a pele na linha
média dorsal expondo a coluna vertebral entre T8 e T11, sendo elas identificadas
pela palpação das costelas. Os músculos que se inseriam entre T8 e T12 foram
descolados seguindo-se o afastamento subperiostal do processo espinhoso e lâmina
dos respectivos níveis, colocando-se em seguida um afastador autostático. Os
processos espinhosos e as laminas de T9 e T10 foram removidos com instrumental
minissacabocado preservando a medula espinal. A laminectomia foi suficiente para
acomodar a “cabeça” do impactor. A lesão medular foi feita através do impactor. No
intervalo entre as lesões, a ponta do impactor ficou imersa em solução salina
isotônica e, antes de realizar a nova lesão, foi limpa com álcool á 70%. O impactor
foi centrado entre o fim de T9 e o início de T10. Após a realização da lesão medular
o rato foilevado de volta ao microscópio para certificação da lesão medular
caracterizada pela hemorragia subpial da medula espinal. Em seguida foi realizada
sutura por planos anatômicos. A seguir, o animal foi colocado em local apropriado
para recuperar-se.
b) Grupo B - Lesão Medular com Hipovolêmia (LMcH)
Neste grupo, após a laminectomia da vértebra de T9-T10, lesão medular e
sutura em planos, posicionou-se o animal em decúbito dorsal sob a prancha
cirúrgica, fixando suas patas com auxílio de fitas elásticas. O ato operatório foi
MATERIAL E MÉTODOS - 41
iniciado com a epilação da região cervical anterior, seguido de cervicotomia mediana
anterior, com cerca de 2 cm a 3 cm de extensão, entre a região mandibular e
esternal, iniciando na pele e tecido subcutâneo. Ficando assim expostas as cadeias
linfáticas cervicais anteriores e tecido adiposo, que foram divulsionados. Logo abaixo
deste plano encontraram-se os músculos esternomastóideo e esternohióideo. Com
auxílio de uma pinça era dissecado o plano entre esses músculos, dando a visão ao
feixe carotídeo vásculo nervoso, que compreendia a artéria carótida comum, nervo
vago e nervo glossofaríngeo. Com auxílio de material microcirúrgico e com imagem
magnificada, passou-se um fio de algodão sob o feixe carotídeo vásculo nervoso,
individualizando-o das demais estruturas. O passo seguinte foi separar a artéria
carótida comum da veia e dos nervos. Em seguida, passou-se um fio de algodão sob
a referida artéria individualizando-a das demais estruturas do feixe, expondo a
artéria aproximadamente 2 cm de extensão. Então foram passados dois fios
adicionais sob a artéria, perfazendo três fios, com a seguinte conformação: porção
cranial, intermédia e caudal.
No fio cranial realizou-se uma ligadura verdadeira visando impedir o refluxo
de sangue; o fio caudal foi submetido apenas á tração, com o objetivo de obliterar o
fluxo sanguíneo naquele segmento da artéria, possibilitando assim, que na secção
parcial não ocorresse sangramento excessivo o que colocaria em risco o
procedimento. O fio da porção intermediária foi útil para a fixação do cateter após
sua introdução no lúmen arterial. Em seguida, procedeu-se a introdução do gelco
numero 24 no lúmen arterial, com posterior fixação através de nó confeccionado com
fio intermédio passado anteriormente. Ao atingir-se a hipovolemia desejada,
realizou-se retirada do cateter seguido da ligadura da porção distal da artéria, e
sutura em planos anatômicos. Após o procedimento o animal foi recolocado em local
apropriado para recuperar-se.
MATERIAL E MÉTODOS - 42
2.2 Métodos
2.2.1 Anestesia
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob as condições
assépticas com álcool á 70%, após lavar a região epilada com solução polvidine
tópico. A anestesia foi realizada com associação anestésica de cloridrato de
Ketamina (cristália) na dose de 100 mg/kg de peso corporal e cloridrato de xilazina
(zoovet) na dose de 14 mg/kg de peso corporal aplicado intra-peritonealmente. O
animal foi considerado em plano anestésico adequado quando ocorria perda do
reflexo córneo-palpebral e ausência do reflexo de retirada ao estímulo doloroso
aplicado por apreensão das patas. Em seguida foi colocado em uma prancha de
acrílico, contido pelas quatro patas com fio elástico para evitar mudança da posição
no momento da contusão medular (Figura 1). Foi colocado gase úmida nos olhos
dos animais em função da ausência do reflexo palpebral durante a anestesia.
Figura 1 -
Animal sob anestesia colocado sobre a prancha
MATERIAL E MÉTODOS - 43
2.2.2 Antibioticoterapia Profilática e Analgesia
Durante o procedimento cirúrgico, os animais receberam por via subcutânea
dose única de pentabiótico na dosagem de 24000 UI das penicilinas por kilograma
de peso e banamine (meglumine) na dosagem de 2,5 mg/kg de peso e analgesia
com dipirona 15 mg/kg peso intramuscular.
2.2.3 Procedimento Cirúrgico
Após colocação do microscópio cirúrgico com lente de aumento 10x, foi
realizada incisão da pele e subcutâneo na região dorsal, com extensão de cerca de
4 cm (Figuras 2 e 3) tendo como referência anatômica as costelas de T11 e T12,
assim procedeu-se à identificação dos demais níveis, sobretudo TIX e TX, local da
lesão; seguido da abertura e descolamento da fáscia e musculatura paravertebral, e
colocação de afastador autostático (Figura 4) com exposição das laminas T9-T10
(Figura 5). Realizada a seguir, Laminectomia de T9-T10 com exposição da duramáter preservando saco dural (Figura 6), exposição da medula espinhal pós com
contusão por trauma (Figura 7).
Figura 2 -
Incisão na pele e subcutâneo da região dorsal do rato
MATERIAL E MÉTODOS - 44
Figura 3 -
Região dorsal incisada
espinhosa T8-T11
estendendo
da
apófise
Figura 4 -
Afastador autostático expondo fáscia e músculo
paravertebral á nível de T9-T10
MATERIAL E MÉTODOS - 45
Figura 5 -
Exposição das apófises espinhosas e laminas T9-T10
Figura 6 -
Laminectomia T9-T10 com exposição saco dural e
medula espinal
MATERIAL E MÉTODOS - 46
Figura 7 -
Exposição da medula espinhal pós com contusão por
trauma
2.2.4 Aparelho para Lesão Medular por Queda de Peso
A lesão da medula espinal foi realizada através de um dispositivo
desenvolvido para gerar lesão por queda de peso, tendo sido desenvolvido no
laboratório de neurofisiologia molecular da USP/RP (Souza et al., 2009), segundo a
Figura 8, e constou de um suporte para fixação de um tubo de aço inox com furos
transversais de um em um centímetro, para graduação da altura da qual o peso foi
solto. Por dentro desse tubo, correu uma haste de aço inox, maciço, a qual foi
responsável pela lesão ao ser deixada cair sob a medula espinal exposta. O atrito
entre o tubo e a haste foi desconsiderado. O diâmetro externo da haste utilizada era
de 3 mm em seu corpo e 2 mm em sua extremidade. O peso da haste era de 10 g. O
tubo era posicionado sobre o local da laminectomia e exposição da dura-máter, e, a
medula espinhal foi lesada por meio do impacto da haste que deslizava em queda
livre no interior do tubo de aço a uma altura de 15 cm (Figura 8).
MATERIAL E MÉTODOS - 47
Figura 8 - Aparelho para contusão da medula espinal
Após o procedimento cirúrgico e contusão da medula espinhal foi realizado o
fechamento do músculo e fáscia paravertebral com fio de sutura nylon 4.0 (Ethicon,
Brasil). Os animais foram colocados em câmara aquecida, e a temperatura corporal
foi mantida em aproximadamente 37°C até que estivessem completamente
despertados. Em seguida foram recolocados em suas gaiolas, sendo quatro ratos
por compartimento. No pós-operatório foi incluída massagem vesical e abdominal
durante o período de avaliação funcional (14 dias).
2.2.5 Cateterismo Arterial
Foi realizada heparinização com solução contendo 0,02 mL de heparina,
diluída em soro fisiológico a 0,9% q.s.p. 0,5 mL, tendo sido desta solução,
introduzido 0,2 mL no cateter, 0,2 mL na seringa, e administrado 0,3 mL no animal,
imediatamente à introdução do cateter na artéria carótida.
a) Hipovolemia
Os animais após a contusão medular foram colocados na prancha em posição
dorsal, com contensão das patas com fita elástica e extensão da cabeça e pescoço,
expondo assim a região cervical.
A hipovolemia foi realizada nos animais do grupo B (10 animais)
aleatoriamente selecionados após a produção da lesão da medula espinal. A
MATERIAL E MÉTODOS - 48
hipovolemia foi realizada com o objetivo de simular a hemorragia após a lesão da
medula espinal. A volemia estimada para o rato Wistar, correspondia a 5,4
mL/100g/peso, calculou-se a volemia utilizando parâmetros determinados por Collins
et al. (1969) e Yale e Torhorst (1972). Inicialmente foi retirada 5% da volemia do
animal, e a seguir 2,5% a intervalos de dois minutos até atingir o total estimado de
20% da volemia.
Essa padronização, conforme a literatura teve como objetivo simular uma
lesão hemorrágica, tendo em vista que conforme a queda da pressão arterial media
(PAM) diminui o fluxo de sangramento pela lesão (Hirano et al., 2003).
A artéria carótida foi abordada por meio do acesso cervical anterior de 2 cm a
3 cm entre a região mandibular e a external á direita (Figura 9). A artéria carótida foi
canulada com gelco número 28 para a retirada do sangue (Figura 10). Após a
retirada do volume de sangue que correspondia a 20% da volemia do animal, a
artéria foi ligada na sua porção proximal e distal, e a sutura por planos realizada com
4.0 nylon suture (Ethicon, Brazil). Os animais a seguir foram colocados em câmara
aquecida, e a temperatura corporal foi mantida em aproximadamente 37°C até que
estivessem completamente despertados. Em seguida foi recolocado sem suas
respectivas gaiolas.
Figura 9 -
Identificação e exposição da artéria carótida cervical os
a) músculos homohioideo b) esternocleidomastoideo
MATERIAL E MÉTODOS - 49
Figura 10 - Artéria carótida cervical canulada com gelco para sangria
Nos dias subsequentes ao procedimento cirúrgico, cada animal era
diariamente manipulado com massagem vesical e abdominal, para facilitar a
eliminação de urina e fezes, e sacrificado no 14º dia após avaliação motora.
2.2.6 Métodos de Avaliação
Os efeitos da hipovolemia sobre a lesão experimental traumática da medula
espinal foram avaliados por meio de avaliações comportamentais. Procedeu-se,
neste estudo, a avaliação motora dos animais, aplicando o teste do plano inclinado e
escore combinado de comportamento [avaliação da lesão medular segundo a escala
Kuhn e Wrathall (1998)], nos seguintes intervalos: pré-teste, 24 h, 72 h, sete dias e
14 dias, após a lesão. Este teste foi utilizado em ratos submetidos à lesão medular
experimental.
a) Teste do plano inclinado
O teste do plano inclinado foi desenvolvido por Rivlin e Tator (1977). Este
teste avaliou a capacidade do rato em manter a posição do corpo em uma superfície
que era gradualmente aumentada em ângulos crescentes. Consistiu em colocar o
MATERIAL E MÉTODOS - 50
animal em uma tábua revestida por emborrachado, cuja superfície podia ser
ajustada para permanecer em vários ângulos, e foi estabelecido o maior ângulo no
qual o animal coseguisse manter sua posição por cinco segundos. A capacidade de
os animais manterem-se sobre a tábua em diferentes ângulos foi testada com
intervalos angulares de 10 graus durante cinco segundos, começando desde 10° até
90°. realizados antes da produção da lesão, um, três, sete e 14 dias após a
produção da lesão traumática da medula espinal. Este teste foi utilizado para
avaliação do trauma medular em ratos, e tem como objetivo testar a força do animal
(von Euler et al., 1996) e a integridade do trato medular rubroespinhal e outros não
piramidais após a lesão medular (Fehlings, Tator, 1995).
b) O Teste do escore combinado de comportamento
O teste do escore combinado de comportamento [avaliação da lesão medular
segundo a escala Kuhn e Wrathall (1998)] realizados antes da produção da lesão,
um, três, sete e 14 dias após a produção da lesão traumática da medula espinal.
Esse método de avaliação atribuiu valores para a coordenação da função motora,
extensão dos dedos da pata traseira, retirada em extensão, retirada contra dor,
resposta à ventralização e preensão da barra com a pata traseira (Quadro 1).
MATERIAL E MÉTODOS - 51
Quadro 1 - Adaptação do escore combinado de comportamento utilizado em
ratos submetidos à lesão medular
A) Escala motora: teste de coordenação da função motora.
0 - nenhum movimento com a pata traseira, não suporta o peso do corpo sobre a mesma;
1 - escassos movimentos percebidos na pata, não consegue suportar o peso do corpo sobre
a pata;
2 - frequente e/ou vigoroso movimento em MMII, não suporta o peso;
3 - consegue suportar o peso sobre a pata traseira, podendo dar um ou dois passos;
4 - suporta todo o peso do corpo, consegue dar passos consistentes usando a porção distal
da pata, flexão do quadril mantida;
5 - caminha com leve déficit;
6 - caminha movimentando normalmente todas as articulações da pata traseira.
B) Extensão dos dedos: reflexo de extensão dos dedos da pata traseira quando o animal
é levantado pelo cauda.
0123-
nenhuma extensão;
mínima extensão, dedos flácidos;
normal extensão dos dedos;
hiperextensão com tremores dos dedos ou da pata.
C) Retirada em extensão: reflexo de retirada da pata traseira contra o corpo quando esta
é manualmente estendida.
0123-
sem flexão de retirada, pata traseira flácida;
fraco ou lento movimento contra o corpo;
retirada normal da pata traseira contra o corpo;
hiperflexão da pata traseira com tremores da mesma.
D) Retirada contra dor: reflexo de retirar a pata em direção ao corpo em resposta a um
estímulo aplicado na eminência hipotenar da pata.
0123-
nenhuma resposta da pata apertada;
movimento abrupto da pata, mas sem retirar a pata traseira contra o corpo;
normal, rápida retirada da pata traseira contra o corpo;
hiperflexão da pata traseira, com tremores da mesma.
E) Resposta à ventralização: é o reflexo no qual o animal se endireita, voltando à sua
posição habitual, quando colocado de costas numa superfície lisa.
0123-
animal continua na posição supina;
lento retorno à posição prona, mais de 0,5 segundo;
retorno médio à posição prona;
retorno rápido à posição prona, em 0,5 segundo.
F) Preensão a barra com a pata traseira: reflexo de percepção, em resposta ao contato da
pata traseira com uma barra de pequeno diâmetro.
0123-
não responde ao toque da barra contra a pata;
a pata traseira responde ao toque, mas não consegue agarrá-la;
a pata traseira agarra com sucesso a barra, mas de modo fraco;
a pata traseira agarra fortemente a barra e puxa-a contra seu corpo.
Fonte: Kuhn, Wrathall (1998)
MATERIAL E MÉTODOS - 52
2.2.7 Análise Estatística
Os dados foram analisados pelo programa estatístico SPSS for Windows 17.0
de 2009. A variável dependente do grau de inclinação do plano foi avaliada por meio
do teste de análise de variância (ANOVA), com dois fatores (grupo e tempo) e a
interação entre eles. Depois foi feito aplicado o teste post hoc de Tukey. A variável
avaliação funcional, variável ordinal, foi analisada pelo teste não paramétrico de
Kruskall-Wallis, e a comparação entre os tempos foi feita pelo teste de Dunn. A
avaliação do efeito do grupo foi realizada pelo teste de Mann-Whitney. Em todos os
testes o nível de significância aplicado foi de 5%, (p < 0,05).
3 RESULTADOS
RESULTADOS - 54
3.1 Teste Plano Inclinado
A avaliação por meio do teste do plano inclinado realizada pela análise de
variância (ANOVA) verificou o efeito de dois fatores, ou seja, do grupo (LMsH ou
LMcH), e do tempo de recuperação (um, três, sete e 14 dias) e interação entre eles.
Foi observada diferença estatística (p < 0,05) em relação aos grupos, aos tempos de
recuperação e a interação grupo x tempo. A comparação das médias, duas a duas,
feita pelo teste de Tukey pode ser visualizada na Tabela 1.
O teste do plano inclinado utilizou um parâmetro que fornecia uma variável
numérica relacionada com a atividade funcional dos animais, e foi observada
diferença estatística (p < 0,0001) em todos os períodos de avaliação após a
realização da lesão da medula espinal. Os animais do grupo B, que sofreram
hipovolemia após a lesão da medula espinal, apresentaram força média menor que
os animais do grupo A (LMsH). Na avaliação realizada antes da produção da lesão
medular não foi observado diferença estatística entre os grupos (p = 0,213)
indicando a homogeneidade dos grupos (Tabela 1 e Gráfico 1).
Tabela 1 - Teste de Tukey para a comparação entre as médias do plano
inclinado em relação ao grupo e ao tempo de recuperação
Grupo
0
1
Dias
3
88,3
34,4
42,9
56,9
69,1
A|a
A|e
A|d
A|c
A|b
89,1
28,3
31,3
38,4
51,4
A|a
B|d
B|d
B|c
B|b
0,213
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
7
14
p entre
Tempos
< 0,0001
A (LMsH)
< 0,0001
B (LMcH)
p entre Grupos
A,B
Letras diferentes significa p < 0,05 para grupo
Letras diferentes significa p < 0,05 para o Tempo
Valores do teste do plano inclinado nos dois grupos experimentais nos diferentes períodos de avaliação. O
asterisco indica diferença estatística entre os grupos experimentais
a,b,c,d,e
RESULTADOS - 55
Gráfico 1 - Evolução dos valores do teste do plano inclinado nos diferentes
períodos de avaliação. O asterisco (*) indica diferença estatística (p <
0,05) entre os grupos
3.2 Avaliação Funcional
A avaliação, por meio do escore combinado de comportamento, fornecia
valores para as diferentes funções motoras: escala motora, extensão dos dedos,
retirada em extensão, retirada contra dor, resposta à ventralização e preensão da
barra com a pata traseira, nos diferentes períodos de avaliação: pré-operatório, um,
três, sete e 14 dias antes do procedimento experimental. A somatória dos escores
das diferentes funções motora fornecia a avaliação funcional.
Na avaliação pré-operatória não foi observada diferença estatística dos
parâmetros avaliados nos dois grupos experimentais.
A avaliação da escala motora apresentava escore que variava de 0 (nenhum
movimento da pata traseira) a 6 (capacidade de caminhar com movimento normal de
todos os membros), e foi observada diferença estatística entre os grupos
experimentais a partir da avaliação do terceiro dia após a lesão. Os maiores escores
foram observados no grupo experimental sem hipovolemia, e a diferença estatística
foi observada em todos os períodos de avaliação (Gráfico 2).
RESULTADOS - 56
Gráfico 2 - Escores da escala motora dos grupos experimentais nos
diferentes períodos de avaliação
A avaliação do reflexo de extensão dos dedos, quando o animal era elevado
pela cauda, apresentou, na avaliação do terceiro e sétimo dias, escore
estatisticamente maior no grupo experimental sem hipovolemia após a contusão da
medula espinhal (Gráfico 3).
Gráfico 3 - Escores da extensão dos dedos nos grupos
experimentais nos diferentes períodos de avaliação
RESULTADOS - 57
A avaliação da retirada em extensão apresentou na avaliação do terceiro e
14º dias escore estatisticamente maior no grupo sem hipovolemia após a lesão da
medula espinhal (Gráfico 4).
Gráfico 4-
Escores da retirada em extensão nos grupos
experimentais nos diferentes períodos de avaliação
A avaliação da retirada contra a dor apresentou na avaliação do sétimo e 14º
dias escore estatisticamente maior no grupo sem hipovolemia após a lesão medular
(Gráfico 5).
RESULTADOS - 58
Gráfico 5 - Escores da retirada contra a dor nos diferentes
períodos de avaliação.
A resposta à ventralização apresentou na avaliação do primeiro, terceiro e 14º
dias escore estatisticamente maior no grupo sem hipovolemia após a lesão medular
(Gráfico 6).
Gráfico 6 - Escores da resposta à ventralização nos diferentes
períodos de avaliação
RESULTADOS - 59
A preensão a barra com a pata traseira apresentou na avaliação do terceiro e
sétimo dias escore estatisticamente maior no grupo sem hipovolemia após a lesão
medular (Gráfico 7).
Gráfico 7 - Escores do ato de agarrar a barra com a pata traseira
nos diferentes períodos de avaliação
A avaliação funcional representava a somatória dos escores das diferentes
funções motoras avaliadas, e foi observada diferença estatística em todos os
períodos de observação com escores estatisticamente maiores no grupo sem
hipovolemia após a lesão medular (Gráfico 8).
RESULTADOS - 60
Gráfico 8 - Escore funcional global (somatória dos escores)
experimentais nos diferentes períodos de avaliação
dos
grupos
A comparação da avaliação funcional entre os dois grupos experimentais está
ilustrada na Tabela 2. No período pré-teste não foi observado diferença significativa
(p > 0,05) entre os dois grupos experimentais, indicando que nas condições iniciais
os grupos eram homogêneos. Nos diferentes períodos de avaliação após a produção
da lesão, o grupo experimental com hipovolemia após a lesão traumática da medula
espinhal apresentou escores menores das diferentes funções motoras avaliadas. Foi
observado menor atividade funcional e menores escores de avaliação no grupo
experimental em que a hipovolemia foi induzida após a lesão traumática da medula
espinhal.
RESULTADOS - 61
Tabela 2 - Resultado do teste de Mann Whitney e medianas das variáveis da
avaliação funcional dos grupos
Tempo
(Dia)
0
Grupo
A
B
C
D
E
F
SOMA
LMsH
6
3
3
3
3
3
20
LMcH
6
3
3
3
3
3
20
1,000
0,168
1,000
0,246
0,862
1,000
0,611
LMsH
0
0
0
0
1
0
2
LMcH
0
0
0
0
0
0
1
1,000
0,327
0,162
0,862
0,015
0,036
0,001
LMsH
1
1
1
1
1
1
5
LMcH
0
0
0
0
0
0
1
0,000
0,002
0,243
0,102
0,010
0,096
0,000
LMsH
2
1
1
2
1
2
9
LMcH
1
1
1
1
1
1
7
0,003
0,168
1,000
0,215
0,327
0,028
0,001
LMsH
5
2
2
2
2
2
16
LMcH
3
1
1
1
1
2
9
0,000
0,002
0,001
0,001
0,003
0,031
0,000
p
1
p
3
p
7
p
14
p
Sendo: A = Escala motora; B = Extensão dos dedos; C = Retirada em extensão; D = Retirada contra a dor; E =
Resposta à ventralização; F = Ato de agarrar a barra com a pata traseira; SOMA = Avaliação funcional.
A avaliação funcional em relação ao tempo de avaliação foi realizada por
meio do teste de Kruskall-Wallis e teste de Dunn (Tabela 3) e permitiu observar
diferenças significativas (p < 0,05) nas diversas respostas dos animais nos diversos
tempos de avaliação, indicando a velocidade no progresso da evolução dos animais.
Observa-se que o grupo sem hipovolemia melhora as suas respostas mais
precocemente do que o grupo com hipovolemia.
RESULTADOS - 62
Tabela 3 - Teste de Kruskall-Wallis e teste de Dunn para avaliação funcional
em relação ao tempo
Variável
A
Tempo
0
1
3
7
14
LMsH
6a
0c
1c
2b
5 ab
< 0,0001
LMcH
6a
0c
0c
1b
2.5 ab
< 0,0001
0
1
3
7
14
3a
0c
1b
1b
2a
< 0,0001
3a
0b
0b
1 ab
1a
< 0,0001
0
1
3
7
14
3a
0c
1b
1b
2 ab
< 0,0001
3a
0b
0b
1 ab
1 ab
< 0,0001
0
1
3
7
14
3a
0b
1b
2 ab
2a
< 0,0001b
2.5 a
0b
0b
1 ab
1 ab
< 0,0001
0
1
3
7
14
3a
1b
1b
1 ab
2a
< 0,0001
3a
0b
0b
1 ab
1a
< 0,0001
0
1
3
7
14
3a
0b
1b
2a
2a
< 0,0001
3a
0b
0b
1 ab
2a
< 0,0001
0
1
3
7
14
20 a
2d
5 cd
9 bc
16 ab
< 0,0001
20 a
1b
1b
7 ab
9a
< 0,0001
p
B
p
C
p
D
p
E
p
F
p
Soma
p
a, b, c
Letras diferentes significa p < 0,05 pelo teste de Dunn
4 DISCUSSÃO
DISCUSSÃO - 64
Nossos resultados mostraram que a lesão traumática da medula espinhal
seguida de hipovolemia apresenta efeito negativo sobre a recuperação funcional da
lesão traumática aguda da medula espinhal. Todas as avaliações comportamentais
mostraram redução significativa da atividade funcional no grupo experimental em
que a hipovolemia foi induzida após a lesão da medula espinhal.
Este modelo experimental teve como objetivo simular a hipotensão arterial,
em função de a lesão medular aguda estar associada à hipotensão, e hipovolemia,
assim como sua ocorrência frequentemente, acompanhada de múltiplas lesões
traumáticas. A pressão arterial dos animais não foi monitorizada durante o
experimento, embora uma quantidade significativa de sangue tenha sido retirada
para produzir hipovolemia e determinando assim hipotensão, sendo este modelo de
indução da hipovolemia citado em publicações de estudos experimentais utilizando
ratos (Yale, Torhorst, 1972). Nossos achados corroboram com as evidências clínicas
e experimentais que a hipotensão pode contribuir para agravar a lesão secundária
após a lesão medular aguda (Chesnut et al. 1993a, Cambridge, Bagley, 1997;
Chesnut, 1997).
O tratamento das lesões traumáticas da medula espinhal deve abordar não
somente o segmento vertebral lesado, mas também setores sem ligação morfológica
direta com a coluna e a medula espinhal, mas que apresentam importante papel na
fisiopatologia da sua lesão (Dolan et al., 1980; Franklin, Darovic, 2002; Pagana,
Pagana, 2006). Dentre esses, destaca-se a manutenção da pressão arterial, e esse
tópico não tem sido muito abordado nos estudos experimentais. O fluxo de sangue
da medula espinhal pode ser reduzido por alterações vasculares local e sistêmica,
estendendo assim a lesão secundária (Coughlan, 1993; Charles, 2011). Sob
condições fisiológicas a perfusão da medula espinhal é mantida em níveis
adequados pela pressão arterial sistêmica através de mecanismo de autorregulação
idênticas às que regulam o fluxo sanguíneo cerebral (Chesnut et al, 1993b; Chesnut,
1997). A hipovolemia agrava a redução do fluxo sanguíneo, reduz a concentração de
oxigênio tecidual e determina a perda da autorregulação vascular no sitio da lesão
com consequente alto nível de degradação tecidual que resulta na morte celular com
apoptose da glia e células neuronais em torno do local da lesão (Dolan et al. 1980).
O cérebro possui reserva limitada de oxigênio nas células e tecidos neuronais,
e é altamente dependente da oferta de oxigênio via circulatória, consequentemente
sofrerá influência direta da volemia (Marmarou et al., 1991; Erecinska, Silver, 2001). A
DISCUSSÃO - 65
fisiopatologia celular deste processo tem sido investigada assim como as
consequências bioquímicas da baixa oferta de oxigênio e ATP á células nervosas. As
células nervosas, células da glia e o endotélio vascular cerebral, parecem ter
susceptibilidade à baixa da concentração de oxigênio (Charles, 2011). Estudos
clínicos em humanos têm demonstrado, que pacientes com menor concentração de
oxigênio no cérebro pós-trauma, possuem pior prognostico, isto pode demonstrar que
o cérebro com lesão traumática é mais susceptível à hipóxia que o cérebro normal
(Chesnut et al. 1993b; Erecinska, Silver, 2001; Simard et al., 2012).
A medula espinhal é mais vulnerável a hipotensão porque ocorre a perda da
autorregulação do fluxo sanguíneo medular imediatamente após a lesão e isso
agrava a isquemia local (Manley et al., 2001). A hipotensão sistêmica (pressão
arterial sistólica < 90 mmHg) é frequentemente observada na fase aguda da lesão
medular traumática e tem sido demonstrado estar associado com piores resultados
(Dolan et al., 1980; Chesnut et al., 1993b; Schwab, Bartholdi, 1996; Olby, 1999;
Guerra et al., 1999; Devivo, 2012). A hipotensão deve ser evitada a todo custo,
resultados favoráveis têm sido associados com a gestão hemodinâmica agressiva
destinada a reestabelecer a perfusão da medula espinhal e prevenir danos
neuronais irreversíveis causados por isquemia. A hipotensão arterial é considerada
como sendo um dos cinco mais importantes preditores do prognóstico da lesão que
encerra o pior prognóstico e que pode ser modificado por medidas terapêuticas
(Kuhn, Wrathall, 1998; Guerra et al., 1999; Erecinska, Silver, 2001).
Ao contrário de lesão medular primária, a lesão secundária parece ser
modificável (Chesnut et al., 1993a; Brain Trauma Foundation et al., 2007). As lesões
secundárias ocorrem horas ou dias após o trauma inicial e são causadas
principalmente por mecanismos relacionados à hipotensão e hipóxia (Marmarou et al.,
1991; Simard et al., 2012).
O maior desafio quando se realizam estudos experimentais em animais com
lesão medular é reproduzirem-se os traumas com energias idênticas, determinando
assim lesões padronizadas. Na literatura, evidencia-se certo grau de variabilidade,
apesar dos cuidados técnicos (Panjabi, Wrathall, 1988). Ao longo dos anos, vários
são os métodos experimentais desenvolvidos para simular o tipo de compressão
aguda do trauma medular (Fehlings, Tator, 1988).
Os experimentos são susceptíveis de falhas, podendo prejudicar a simulação
das lesões da medula espinal em humanos. O método de queda de peso somente
DISCUSSÃO - 66
mimetiza o trauma do impacto inicial, negligenciando a força de compressão
persistente. Nos seres humanos vítimas do trauma da medula espinal, em sua
grande maioria, observam-se compressão medular anterior ou circunferencial por
fratura com deslocamento em um sistema vertebral fechado; já nos modelos
experimentais em animais o método de compressão é normalmente posterior e
através de laminectomia aberta. Nos estudos em modelos animais não se evidencia
explicação para o choque neurogênico ou para lesões concomitantes, que produzem
hipóxia sistêmica e hipotensão, fatores que podem agravar a extensão da lesão
resultante em qualquer estresse mecânico. Nos modelos animais, apresentam-se
falhas na simulação dos efeitos do trauma repetitivos, os quais são observados nas
fraturas estáveis da coluna vertebral. E por último, as falhas podem também ser
observadas ao aferirem-se terapêuticas desenvolvidas para modelos animais no
humano, devido às diferenças no metabolismo de drogas nas diferentes espécies
(Amar, Levy, 1999).
Acredita-se que a neuroanatomia, neurofisiologia a resposta inflamatória á
lesão e a desproporcionalidade entre os animais de experimentos e o homem,
influenciem na baixa reprodutibilidade em ensaios clínicos com seres humanos
(Kwon et al., 2004; Bradbury, McMahon, 2004), e o quanto discrepante são os
resultados promissores em regeneração medular em animais de laboratório e a
pouca reprodutibilidade em seres humanos (Basit, 2005).
Muitos pesquisadores estão trabalhando na busca de identificar as diferenças
entre espécies de animais e na definição de seus mecanismos, com intuito de
diminuir o impacto nos resultados experimentais (Thuret et al., 2006), entre eles,
Courtine et al. (2007) que defende a experimentação com primatas não-humanos
geneticamente semelhantes ao homem. Embora haja muito trabalho a ser feito no
refino da consideração ética e financeira dos protocolos experimentais com primatas
não-humanos, os estudos de descoberta de ciência básica e de desenvolvimento, e
de eficácia e segurança continuará a depender em grande parte de modelos
experimentais baseados em roedores da SCI.
Embora existam limitações, a utilização de modelos animais em laboratório
mostra-se eficaz e relevante na simulação das lesões da medula espinal em
humanos. Trabalhos experimentais têm se apoiado em animais de laboratório para o
desenvolvimento de conhecimento sobre os mecanismos de processos vitais na
prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças em seres humanos (Basit, 2005).
DISCUSSÃO - 67
Houve, nas ultimas três décadas, significativo aumento de publicações com
estudos e ensaios experimentais na área de traumatismo raquimedular (Bradbury e
McMahon, 2004, Thuret et al., 2006). A pesquisa em site especializado em
publicações científicas (Medline) na área médica recuperou cerca de vinte mil artigos
relacionados ao tema. Mostrando assim, o crescente entusiasmo e interesse dos
pesquisadores nesta área, pois cada vez mais surgem experimentos sobre
regeneração medular e crescimento neuronal, os quais, na sua maioria apresentam
resultados promissores. São de extrema importância as pesquisas realizadas em
todo o mundo visando o tratamento do trauma medular. O desafio é analisar os
resultados destes estudos e testar a eficácia clínica dos diversos medicamentos, o
que é extremamente difícil. A realização de pesquisa clínica nem sempre fornece
todas as respostas, havendo inclusive resultados conflitantes (Blight, 2000).
No presente trabalho seguiu-se a orientação de consenso na literatura, do uso
de ratos ou camundongos como espécime para estudos experimentais, a utilização
do método de contusão aberta, a utilização dos dispositivos dinâmicos de queda de
pesos, e utilização da avaliação do comportamento funcional (Jakeman et al., 2000).
Neste trabalho a espécie de animal de experimentação foi definida
considerando alguns critérios como a fácil acessibilidade na aquisição, no manejo, a
reprodutividade, a docilidade, o pequeno porte, a fisiologia conhecida e o ciclo
reprodutivo curto (Basit, 2005). Os roedores, ratos (rattus norvegicus), são os
animais mais utilizados em laboratórios de experimentos em todo mundo, atendem
perfeitamente às características mencionadas, além disso, a linhagem de ratos
Wistar, exibe a característica do albinismo, ou seja, homogeneidade da espécie,
atendendo satisfatoriamente aos propósitos desta pesquisa (Andrade et al., 2002).
O número de amostras no presente estudo foi baseado em trabalhos
experimentais com número de amostras de animais semelhantes aos grupos de
estudos e com resultados estatísticos satisfatórios, entre eles, Narazaki et al. (2006)
(n=15), Vialle et al. (2007) (n=10) e Sayer et al. (2006) (n=8).
A via de administração dos fármacos (anestésicos e antiinflamatório)
escolhida neste trabalho foi a intraperitoneal, pois é a mais utilizada em estudos
experimentais, por ser de fácil administração e oferecer menor risco de acidentes ao
pesquisador (Basit, 2005).
Neste trabalho, a laminectomia para exposição cirúrgica da medula espinal do
rato para provocar a lesão medular foi realizada com o auxílio de microscópio óptico,
DISCUSSÃO - 68
foi um procedimento executável e reprodutível pelo treinamento prévio e experiência
adquirida no laboratório de neurofisiologia molecular da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP). Posteriormente,
aperfeiçoado e concluído no laboratório Universidade Federal do Maranhão, São
Luis, MA, Brasil Laboratório de Pesquisa Pós Graduação em Farmacologia.
O modelo de contusão por peso compressivo, utilizado para reproduzir o
trauma medular neste trabalho, foi proposto originalmente em cães por Allen em
1911 (Taoka, Okajima, 1998). Esse modelo mimetiza de maneira representativa o
que ocorre na maioria das lesões espinais em humanos e vem sendo modificado e
aprimorado ao longo do tempo, para adequar-se às necessidades de cada grupo de
pesquisadores em obter determinado padrão de lesão medular (Kwon et al., 2004).
O impactador New York University (NYU), desenvolvido pelo Laboratório de
Neurocirurgia da Universidade de Nova Iorque e descrito por Gruner (1992), é o
mais utilizado para proporcionar esse tipo de contusão medular em ratos.
Devido à inacessibilidade a tal equipamento por parte de alguns centros de
pesquisa, por ser acima de tudo oneroso e à necessidade de reproduzir-se um
trauma medular padronizado, semelhante àquele proporcionado pelo impactador
NYU, com baixo custo e fácil execução, buscam-se mecanismos impactadores
alternativos, como o proposto por Silva et al. (2008). Foi utilizado neste estudo o
aparelho técnico capaz de causar trauma medular e lesão por queda de peso,
visando reproduzir e padronizar áreas danificadas com volume de lesão tecidual
idêntico, e, sobretudo, mimetizando o que ocorre no homem. Este dispositivo foi
desenvolvido no laboratório de neurofisiologia molecular da Universidade de São
Paulo. Este método, além do fato de ser frequentemente preconizado e reprodutível;
isso o torna mais relevante devido sua utilização em estabelecer protocolos de
planos e agentes terapêuticos de procedimentos clínicos. O dispositivo utilizado
neste estudo foi desenvolvido no laboratório de neurofisiologia molecular da
Universidade de São Paulo, por Schiaveto de Souza, Célia Aparecida da Silva e
Elaine Aparecida Del Bel Belluz Guimarães, em 2009.
Neste trabalho optou-se por realizar lesão leve a moderada com altura de 15
cm, pois as severas (50 cm), apresentavam alta mortalidade (Vialle et al., 1999) e,
as leves (12,5 cm) os animais mostravam recuperação locomotora completa em dez
dias (Basso et al., 1996; Rodrigues, 1999), incompatível com o propósito desta
estudo.
DISCUSSÃO - 69
Optou-se, também, neste trabalho pelo cateterismo para indução da
hipovolemia, o cateterismo da artéria carótida cervical à direita pelo fato de sua
oclusão não determinar danos cerebrais devido à presença do polígono arterial de
Willis, possibilitando a sobrevida do animal no pós-operatório (Brito et al., 2001).
Realizou-se neste estudo a sangria de 20% da volemia dos animais. Estudos
demonstram que perda sanguínea a partir de 30% da volemia determina o choque
hipovolêmico, podendo determinar o óbito do animal (Brito et al., 2001). Essa
padronização tem como finalidade simular uma lesão hemorrágica conforma a
literatura, o que é pertinente a este estudo. Objetivando simular a hipovolemia,
No presente estudo foram utilizados apenas testes comportamentais na
avaliação dos resultados. Essa metodologia de avaliação permitiu de modo simples
a observação dos efeitos da hipovolemia na lesão traumática da medula espinhal. O
estudo experimental realizado pode servir como estudo piloto no âmbito desse tema,
e abre a possibilidade de novos estudos com metodologia mais específica e
sofisticada para avaliar a nível vascular, histológico ou molecular os efeitos da
hipovolemia sobre a lesão traumática da medular espinhal.
Os comportamentos funcionais responsáveis pela locomoção envolvem
integração das capacidades sensorial e motora, e a perda de uma ou ambas as
capacidades resulta em déficits que são mensuráveis por meio dos testes
comportamentais. A avaliação completa deve incluir testes de avaliação funcional
motora e/ou sensitiva (De La Torre, 1984; Basso et al., 1995). A escala Basso,
Beattie, Bresnahan (BBB) preconizada pela Ohio State University (OSU), embora
citada com frequência na literatura para avaliação funcional, é abrangente, extensa,
e apresenta grande variação na interpretação, intra e inter observador, mesmo se
repetida várias vezes no mesmo animal (Vialle et al., 1999 e 2002).
Procedeu-se neste estudo a avaliação do comportamento funcional por meio
de dois métodos: teste adaptado do escore combinado de comportamento, utilizado
em ratos submetidos à lesão medular experimental (Kuhn, Wrathall, 1998). Esse
modelo de avaliação motora quantifica de maneira satisfatória a recuperação das
funções motoras (Bao, Liu, 2002); teste do plano inclinado (PI), descrito por Rivlin e
Tator
(1977).
Método
simples,
rápido,
de
fácil
execução
na
avaliação
comportamental, embora não seja um teste que avalie particularidades do
comportamento locomotor dos animais, ou como as tarefas estão sendo executadas
(Muir, Webb, 2000). Esse teste permite detectar discretas alterações que não podem
DISCUSSÃO - 70
ser identificadas facilmente no caminhar, que muitas vezes parece normal em
animais com lesões medulares de pequena intensidade. Alguns trabalhos têm
evidenciado a relação direta entre os resultados do teste do plano inclinado com o
grau de comprometimento histológico da medula espinal após a lesão (Behrmann et
al., 1992; Basso et al., 1996; Bao, Liu, 2002). Os resultados da avaliação motora e
comportamental têm sido correlacionados com os resultados histológicos, e indicam
que a percentagem de tecido medular disponível está estreitamente ligada à
recuperação motora (Meguro, Tator, 1988; Coughlan, 1993; Cambridge, Bagley,
1997; Tatagiba et al., 1997; Olby, 1999; Rossignol et al., 2008).
Encontraram-se na literatura publicações demonstrando diferenças no
prognóstico de pacientes com lesão medular e lesão medular associada a outros
traumas (Meguro, Tator, 1988; Chesnut, 1997). Estudos indicaram que pacientes
com lesão medular associada a outros traumas apresentaram déficit neurológico
mais severo, recuperação neurológica mais pobre, e aumento da mortalidade
quando comparada à lesão medular pura (Meguro, Tator, 1988; Chesnut et al.,
1993a; Chesnut, 1997; Guerra et al., 1999).
Neste trabalho, a avaliação funcional por meio do escore combinado de
comportamento permitiu a comparação dos grupos experimentais por meio de uma
variável ordinal da função motora, Na avaliação após um dia da produção da lesão
da medula espinal a soma das variáveis não apresentava diferença estatística entre
os grupos experimentais. No entanto, as variáveis respostas à ventralização, e ato
de agarrar a barra com a pata traseira apresentaram diferença estatística entre os
dois grupos experimentais com menores escores no grupo B (lesão da medula
espinal com hipovolemia, Após três dias da lesão da medula espinal somente as
variáveis retirada em extensão e retirada contra a dor não apresentavam diferença
entre os grupos experimentais, e os escores do grupo B (lesão da medula espinal
com hipovolemia) eram menores. Após sete dias foi observada a diferença entre os
grupos na soma das variáveis e nas variáveis relacionadas coma escala espinal, foi
observado diferença significativa em todos os escores, com menores valores no
grupo B (lesão medular com hipovolemia).
Neste trabalho a avaliação funcional através do plano inclinado utilizou um
parâmetro que fornecia uma variável numérica relacionada com a atividade funcional
dos animais, em todos os períodos de avaliação após a realização da lesão da
medula espinal. Os animais do grupo B, que sofreram hipovolemia após a lesão da
DISCUSSÃO - 71
medula espinal, apresentaram força média menor que os animais do grupo A (lesão
da medula espinal sem hipovolemia).
Pode-se observar neste trabalho que, embora a análise estatística tenha sido
realizada por variáveis diferentes: ordinais e numéricas, e aplicados testes
paramétricos e não paramétricos para avaliar comportamento motor e grau de
inclinação do plano inclinado, ambos foram claramente sensíveis para mostrar
alterações do comportamento motor ao longo do tempo, apresentando resultados
fortemente correlacionados. Quando se comparou o grupo LMsH e o grupo LMcH
com hipovolemia, observou-se que ambos convergiram para o mesmo resultado, ou
seja, os animais do grupo LMcH com quando comparados com os animais do grupo
controle LMsH apresentaram recuperação motora significativamente menor que 5%
(p < 0,05), e mais lenta no decorrer do tempo.
O modelo experimental que utilizamos foi relativamente simples e tinha o
objetivo de observar a possível correlação da hipovolemia com a lesão traumática da
medula espinal. A partir dos resultados observados, uma grande possibilidade de
novos estudos poderão ser realizados e detalhes como as alterações histológicas
dos tecidos da medula espinal, ou o efeito quantitativo da hipovolemia sobre a lesão
medular poderão ser avaliados com detalhes.
A redução da volemia após a lesão traumática da medula espinhal induziu a
alterações significativas nas funções motoras dos animais e a recuperação motora
foi mais lenta. Esses resultados evidenciam o papel da hipovolemia após a lesão
traumática da medula espinhal, de modo que esse parâmetro deva ser considerado
como medida preventiva para proteção da medula espinhal após a lesão, e evitar a
ampliação da lesão secundária.
5 CONCLUSÃO
CONCLUSÃO - 73
A partir deste estudo pode-se concluir que existe uma correlação entre a
hipovolemia induzida (de 20% da sua volemia), com recuperação motora mais lenta,
e pobre, podendo a hipovolemia interferir expressivamente na recuperação funcional
de animais com lesão da medula espinal.
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ANEXO
ANEXO - 89
Anexo A - Aprovação do Comitê de Ética da Universidade Estadual do
Maranhão
ANEXO - 90
Anexo B - Submissão Spinal Cord