Clique e confira a apostila do I Curso de Inverno do Hospital de

Comissão Organizadora
Monitoria
Adriana Cruvinel Carloni, MSc
Caroline Domingues Rogeri
Aline Oliveira da Rocha
Danielle Pessoa Pereira, MSc
Ana Carolina de C. Peters, PhD
Estela Maria Silva
Ana Carolina Laus, PhD
Fernanda Franco Munari
André van Helvoolt Lengert, MSc
Isana Rodrigues Silva
Anna Luiza Silva Almeida Vicente
Julia Maria Saraiva Duarte
Giovanna Barbarini Longato, PhD
Maraísa Cristina da Costa
Fernanda de Paula Cury
Rhafaela Lima Causin
Larissa Russo Veloso e Silva
Simone Jacovaci Colleta, MSc
Lídia M. Rebolho B. Arantes, PhD
Weder Pereira de Menezes, MSc
Maicon Fernando Zanon, MSc
Matias Eliseo Melendez, PhD
Marcela Nunes Rosa, MSc
Maressa Ferreira, PhD
Nathália Cristina Campanella
Paula Silva Felício
Tatiane Honda Morais
Vânia Sammarino Mariano, PhD
Viviane Aline Oliveira S. Saito, PhD
Palestrantes
Adriana Cruvinel Carloni, MSc (Vírus e Câncer)
Ana Carolina de Carvalho, PhD (Controle da Expressão Gênica)
Ana Carolina Laus, PhD (Alterações Genéticas e Citogenéticas no Câncer)
Cristovam Scapulatempo Neto, PhD (Biobanco)
Daniel Onofre Vidal, PhD (A Influência das Alterações Epigenéticas nos
Tumores de Infância)
Denise Guimarães Peixoto, PhD (Vias Moleculares da Carcinogênese
Colorretal)
Edenir Inêz Palmero, PhD (Identificação do Câncer Hereditário: Um desafio a
ser superado)
Henrique César Santejo Silveira, PhD (A Influência do Ambiente Ocupacional
na Carcinogênese)
José Humberto G. Tavares Fregnani, PhD
Rastreamento no Câncer de Colo do Útero)
(Novas
Perspectivas
de
Lidia Maria Rebolho Batista Arantes, PhD (Marcadores Moleculares e Novas
Terapias em Tumores de Cabeça e Pescoço)
Luiz Fernando Lopes, PhD (Genética Molecular na Clínica Pediátrica)
Márcia Maria Chiquitelli Marques Silveira, PhD (Role of MicroRNA Deregulation
in Breast Cancer Onset and Progression)
Matias Eliseo Melendez, PhD (Clonagem Molecular e Terapia Gênica)
Maressa Ferreira Neto, PhD (Alterações Genéticas e Citogenéticas no Câncer)
Nathália Cristina Campanella (Biomarcadores no Câncer)
Raul Torrieri, MSc (Bioinformática na Oncologia)
Rui Manuel Reis, PhD (Molecular Profile of Brain Tumors/ Introdução à
Carcinogênese)
Vânia Sammartino Mariano, Phd (Tumores Induzidos por Papilomavírus
Humano/ Imunologia em Câncer)
Vinicius de Lima Vazquez, PhD (Oportunidades de pesquisa em melanomas no
Hospital de Câncer de Barretos)
Mini Curso 1
Extração de DNA, Eletroforese e PCR
Preceptores: André Lengert, Anna Luiza Vicente, Nathália Cristina
Campanella e Vânia Sammartino Mariano
Esta aula objetiva mostrar ao aluno quais materiais biológicos são
frequentemente utilizados para extração de DNA na área oncológica; alguns
métodos de extração que estão disponíveis e como avaliar a eficiência do
processo.
Materiais biológicos para extração de DNA
- Principalmente: células de cultura, sangue e biópsias/peças fixadas em
formalina e incluídas em parafina.
- Sangue: deve ser coletado em tubo contendo o anticoagulante EDTA;
Para separação do material: centrifugar a 3.500 rpm por 10 minutos a 4°C
Plasma e buffy coat (enriquecido de células mononucleares) com hemácias
Extração de DNA: será feita a partir do buffy coat e consequente lise das
hemácias*
- Parafina: antes de qualquer procedimento, as lâminas devem ser
desparafinizadas*
Lâmina guia corada por Hematoxilina-Eosina (HE): demarcação da área
tumoral de interesse
Fazer macrodissecção da área demarcada utilizando uma agulha e
depositando material em um tubo do tipo eppendorf contendo tampão de lise
celular.
Material pronto para extração por kit comercial ou por fenol-clorofórmio.
Extração de DNA
- Fenol-clorofórmio-etanol: em desuso, há contaminação com proteína, método
econômico
Formação de fases:
Aquosa:
Orgânica:
Utilização de etanol para precipitar material genético.
- Kits comerciais: utilizam colunas com sílica para fazer a separação do
material genético.
Os protocolos variam para cada marca, mas seguem as fases:
Lise celular
Precipitação de material genético com etanol
Aplicação do lisado em coluna de sílica
Lavagem do material genético e eluição do DNA contido na
membrana.
- Análise da extração e congelamento a -20°C até utilização.
Quantificação do DNA extraído
- Pode ser realizada por espectrofotometria ou fluorescência (Qubit TMLife
Technologies)
- Espectrometria:
Valores das razões (próximos de 2,0):
- 260/280
- 260/230
- Fluorescência
Anexos
1) PROTOCOLO – EXTRAÇÃO DE TECIDO PARAFINADO
 Volume inicial: 2 a 4 cortes de 10 µ de tecido parafinado cortado em
lâmina histológica
 Kit QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN):
 Volume de DNA: 30 µL
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Desparafinizar a lâmina: 20 minutos estufa (80 a 85°)
Banho xilol I: 5 minutos
Banho xilol II: 5 minutos
Banho etanol 100%: 1 minuto
Banho etanol 70%: 1 minuto
Banho etanol 50%: 1 minuto
Banho água miliQ: 1 minuto
Raspagem da área tumoral com agulha (18G x 1 ½) utilizando a
lâmina de HE como molde para localizar a área tumoral
demarcada pelo patologista
9. Lavagem da agulha em tubo eppendorf contento 80 µL de tampão
ATL e 1 µL de RNA Carrier (concentração de 1µg/ µL)
10.Adicionar 15 µL de proteinase K (QIAGEN)
11.Homogenizar por pipetagem
12.Incubar overnight á 56°C/ 700 rpm
13.Vortex/ 10 segundos
14.Breve centrifugação (8.000 rpm/ 1 minuto)
15.Adicionar 15 µL de proteinase K
16.Homogenizar por pipetagem
17.Incubar á 56°C/ 700 rpm/ pelo menos 1 hora
18.Vortex/ 10 segundos
19.Breve centrifugação (8.000 rpm/ 1 minuto)
20.Incubar a 98°C/ 600 rpm/ 20 minutos
21.Breve centrifugação (8.000 rpm/ 1 minuto)
22.Resfriar a temperatura ambiente (± 5 minutos)
23.Adicionar 110 µL de tampão AL
24.Vortex/ 10 segundos
25.Adicionar 110 µL de etanol 100%
26.Vortex/ 10 segundos
27.Incubar 5 minutos a temperatura ambiente
28.Breve centrifugação (8.000 rpm/ 1 minuto)
29.Transferir 300 µL da mistura para QIAamp Mini Spin Column,
previamente identificado
30.Breve centrifugação (8.000 rpm/ 1 minuto)
31.Descartar o tubo coletor
32.Colocar a coluna em um novo tubo coletor
33.Adicionar 500 µL de AW1
34.Breve centrifugação (8.000 rpm/ 1 minuto)
35.Descartar o tubo coletor
36.Adicionar 500 µL de AW2
37.Centrifugar a 14.000 rpm/ 1 minuto
38.Descartar o tubo coletor
39.Colocar a coluna em um novo tubo coletor
40.Centrifugar a 14.000 rpm/ 3 minutos
41.Descartar o tubo coletor
42.Colocar a coluna em um microtubo de 1,5 ml, previamente
identificado
43.Adicionar 30 µL de água ultra pura (DNAse/ RNAse free, IDT)
44.Incubar por 5 minutos
45.Centrifugar a 8.000 rpm/ 1 minuto
46.Centrifugar a 14.000 rpm/ 1 minuto
47.Descartar a coluna
48.Quantificar 1 µL de DNA no NanoDrop
49.Anotar os valores 260/280, 260/230 e a quantidade do DNA em
ng/ µL
50.Diluir o DNA em 50ng/ µL (*) em um novo microtubo de 1,5 ml,
previamente identificado com o ID e concetração
51.Armazenar, tanto a solução estoque em -20°C e a solução de uso
a -4°C
(*) Seguir o seguinte cálculo:
50ng (diluição de uso) x 20 µL (volume total da diluição do DNA)
Quantidade do DNA em ng/ µL
= x µL DNA da solução estoque, completar para 20 µL de água
ultra pura (DNAse/ RNAse free)
2) PROTOCOLO – EXTRAÇÃO DE BUFFY-COAT (material enriquecido
de mononucleares)
 Preparação da solução de lise
Reagentes:
Cloreto de amônio – 10X: 1 litro de água miliQ + 77,04g de cloreto de
amônio
Bicarbonato de amônio – 1X: 1 litro de água miliQ + 0,7g de
bicarbonato de amônio
Preparo da solução: em 810 mL de água destilada, adicionar 90 mL de
cloreto de amônio 10X e 100 mL de bicarbonato de amônio 1X
 Preparação de PBS 10X
Reagentes:
80g NaCl
2g KCl
2,4g KH2PO4
17,8g Na2HPO2 – H2O ou 14,4g Na2HPO4
Preparo da solução: completar com água destilada para 1L e acertar
pH para 7,4. Autoclavar em seguida e fazer diluição para a concentração
de uso (1x).
1. Adicionar 12 ml da solução de lise para tubo falcon 15 ml,
previamente identificado
2. Transferir todo o buffy coat armazenado para falcon 15 ml
3. Vortex (o suficiente para o material se homogenizar com a
solução)
4. Incubar no gelo por 20 minutos; com 10 minutos vortexar
novamente
5. Centrifugar a 3.500 rpm/ 4°C/ 10 minutos
6. Descartar o sobrenadante
7. Breve centrifugação (spin)
8. Colocar as amostras no gelo
9. Retirar o restante do sobrenadante
10.Adicionar 200 µL PBS 1X no falcon 15 ml
11.Homogenizar o material
12.Transferir todo material para eppendorf 1,5 ml, previamente
identificado e com tampão ATL e 1 µL de RNA Carrier
13.Adicionar 10 µL de proteinase K (QIAGEN)
14.Adicionar 100 µL de tampão AL
15.Vortex/ 15 segundos
16.Incubar á 56°C/ 20 minutos/ 600 rpm
17.Breve centrifugação (8000 rpm/ 1 minuto)
18.Adicionar 50 µL de etanol (96% - 100%)
19.Vortex/ 15 segundos
20.Incubar a temperatura ambiente por 3 minutos
21.Breve centrifugação (8.000 rpm/ 1 minuto)
22.Transferir todo o material lisado para QIAamp MinElute Column,
previamente identificado
23.Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
24.Breve centrifugação (8.000 rpm/ 1 minuto)
25.Descartar o tubo coletor e colocar a coluna em um novo tubo
coletor
26.Adicionar 500 µL de tampão AW1
27.Breve centrifugação (8.000 rpm/ 1 minuto)
28.Descartar o tubo coletor, e colocar a coluna em um novo tubo
coletor
29.Adicionar 500 µL de tampão AW2
30.Breve centrifugação (8.000 rpm/ 1 minuto)
31.Descartar o tubo coletor, colocar a coluna em um novo tubo
coletor
32.Centrifugar a 14.000 rpm/ 3 minutos
33.Colocar a coluna em tubo eppendorf 1,5 ml, previamente
identificado
34.Adicionar 60 µL de água ultra pura (DNAse/ RNAse free, IDT) no
centro da membrana
35.Incubar a temperatura ambiente por no mínimo 3 minutos
36.Centrifugar a 14. 000 rpm/ 1 minuto
37.Descartar a coluna
38.Quantificar 1 µL de DNA no Nano Drop
39.Anotar os valores 260/ 280, 260/ 230 e a quantidade do DNA em
ng/ µL
40.Diluir o DNA em 50ng/ µL (*) em um novo microtubo de 1,5 ml,
previamente identificado com o ID e concetração
41.Armazenar, tanto a solução estoque em -20°C e a solução de uso
a -4°C
(*) Seguir o seguinte cálculo:
50ng (diluição de uso) x 20 µL (volume total da diluição do DNA)
Quantidade do DNA em ng/ µL
= x µL DNA da solução estoque, completar para 20 µL de água
ultra pura (DNAse/ RNAse free)
Roteiro de aula prática - PCR
Iniciando o estudo de um gene de interesse. Por onde começar?
 Acesso a bancos de dados para obter as sequências de interesse e
definição da região a ser analisada (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/;
http://www.ensembl.org/index.html);
 Desenho e discussão dos parâmetros ideais de primers
(http://bioinfo.ut.ee/primer3/; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/);
 Análise da qualidade e avaliação de estruturas secundárias de primers
utilizando
softwares
disponíveis
(http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/);
 Alinhamento de primers no genoma utilizando Blat e Blast. Quais as
diferenças
de
cada
ferramenta
e
qual
utilizar?
(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat;
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi);
 Desenho de sondas e discussão dos parâmetros ideais a serem
utilizados;
 Definição de protocolo inicial para PCR e discussão de estratégias para
obter sucesso na reação.
Roteiro de Aula Prática – Eletroforese em Gel de Agarose
Objetivos: Realizar um protocolo padrão de eletroforese;
Aprender a analisar o gel;
Aprender a reconhecer os tipos mais comuns de problemas.
Protocolo de gel de agarose 1,5%:
1. Colocar um pente no berço;
2. Em uma balança de precisão pesar 1,5 g de agarose em um becker ou
erlenmeyer;
3. Adicionar 100 mL de tampão TAE;
4. Levar ao microoondas o tempo suficiente para a mistura ficar
homogênea (em torno de 3 minutos);
5. Esfriar o gel na água;
6. Despejar o gel sobre o berço e estourar bolhas caso houver;
7. Esperar em torno de 30 minutos a polimerização do gel.
Protocolo de eletroforese
1. Colocar o berço na cuba de modo que o tampão cubra todo o gel;
2. Adicionar 2 µL de loading em 5 µL de produto de PCR;
3. Aplicar todo o volume no gel;
4. Adicionar 2 µL de loading em 5 µL de ladder;
5. Aplicar todo o volume no gel;
6. Correr a 100V por 40 minutos.
Mini Curso 2
Cultura Celular e Citogenética
Aula prática – Cultura de Células Estabelecidas
Preceptores: Adriana Cruvinel Carloni, Giovanna Longato, Marcela Nunes
Rosa, Viviane Saito, Weder Menezes.
Monitores: Larissa Russo e Tatiane Honda Morais.
Nota: Para desenvolvimento da aula prática, os alunos deverão estar
devidamente paramentados (uso obrigatório) de acordo com as normas de
higiene e proteção individual. Os equipamentos, juntamente com toda a
estrutura serão apresentados aos alunos antes das atividades realizadas na
sala.
Atividade 1: Noções de esterilização e preparo do material de trabalho.
-
Utilização de um fluxo laminar (Biosegurança) e estufa.
- Manipulação dos utensílios (ponteiras, canisters, bomba de vácuo e plástico)
e tratamento de resíduos.
Atividade 2: Observação de culturas celulares ao microscópio de luz
invertida
-
Reconhecimento do equipamento: Microscopia de luz invertida.
- Observação das características celulares;
cultura aderente
cultura em suspensão
Atividade 3: Dissociação celular (Tripsinização)
- Método de dissociação celular por tripsina:
a) Em uma garrafa T25, contendo uma cultura celular, aspirar todo o meio com
a ajuda do aspirador acoplado a uma ponteira pasteur de vidro estéril.
b) Em seguida adicionar cuidadosamente 1000µL de DPBS para lavar os
resíduos celulares ou mesmo células mortas, aspirar o conteúdo novamente
com auxílio da bomba a vácuo acoplado a pipeta pasteur.
c) Colocar 500µL de tripsina na garrafa cuidadosamente.
d) Incubar a 37º C por 5 minutos.
e) Verificar ao microscópio a morfologia das células, quanto à dissociação do
fundo da placa.
f) Após tripsinização, inativar o efeito da tripsina com 4 mL de meio (DMEM)
contendo 10% de SFB (soro fetal bovino).
g) Colocar a suspensão de células em um tubo falcon de 15 mL.
Atividade 4: Contagem das células
-
Contagem das células viáveis com Trypan Blue.
a) Retirar cuidadosamente 10 µL da suspensão celular e colocar em um
microtubo.
b) Adicionar o mesmo volume de Trypan Blue, homogeneizar cuidadosamente.
c) Aplicar nos campos de leitura da lâmina de contagem e proceder a
contagem no contador automático.
Atividade 5: Contagem das células
- Semeadura (Plaqueamento) das células.
a) Neste experimento iremos utilizar placas de fundo chato com 96 poços. Será
necessário semear 5000 células em cada poço da placa como descrito no
esquema abaixo.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
5000 celulas em cada poço
Cálculo para preencher os 32 poços selecionados
b) Observar a morfologia e distribuição das células nos poços da placa em
seguida incubá-las a 37º C em estufa suplementada com 5% de CO2.
Atividade 6: Exposição das linhagens celulares à compostos/agentes
citotóxicos e revelação por MTS.
- Após 12 horas da semeadura das células, as mesmas devem ser expostas ao
agente (candidato) citotóxico.
a) As placas contendo os agentes serão repassadas aos alunos (preparadas
anteriormente).
b) Aspirar cuidadosamente o meio de cada poço com auxílio da bomba de
vácuo acoplada a uma pasteur de vidro.
c) Em seguida preparar o meio de cultura DMEM, juntamente com o MTS
(10%).
d) Aplicar 100 µL em todos os poços da placa de cultura com auxílio da pipeta.
e) Incubar por no mínimo 45 minutos.
f) Fazer a leitura no espectrofotômetro (VARIOSKAN) em comprimento de onda
de 490 nM.
Aula prática – Citogenética
Preceptores: Maressa Ferreira e Maicon Zanon. Monitora: Simone Jacovaci e
Julia Maria Saraiva Duarte
Aula Teórica: Noções de Citogenética clássica e molecular no
diagnóstico.
Aula Prática: Noções básicas de prática, análise e interpretação de banda
GTG e hibridização in situ fluorescente
Protocolo de bandeamento GTG
1. As amostras devem ser encaminhadas em seringa (lavada com
Heparina 0.1 ml). Transferir o conteúdo da seringa para um tubo cônico
de 15 mL, homogeneizar cuidadosamente a amostra;
2. Identificar as garrafas com o RH do paciente, data, hora cultura
semeada e tempo cultura;
3. Homogeneizar e levar as garrafas para serem mantidas em incubadora
de CO² a 5%. As garrafas devem ser divididas em 2 tempos de cultivo:
cultura de 48h e 72h.
4. Deve ser adicionada 55µL de Colcemid nas garrafas 2 horas antes de
completar-se o tempo de cultivo (a cultura deve permanecer na
incubadora por 1h50 até começar o processo de colheita);
Retirada das Culturas:
5. Transferir o conteúdo das garrafas de cultura para tubos cônicos de 15
ml previamente identificados;
6. Centrifugar os tubos a 1500 rpm por 10 minutos;
7. Hipotonizar em KCL;
8. Centrifugar os tubos a 1500 rpm por 10 minutos, retirar o sobrenadante;
9. Fixar (fixador 3:1 / metanol:ácido acético).
10. Repetir a fixação mais duas vezes
Apllied Spectral Imaging BAND View (Análise e interpretação)
Hibridização in situ fluorescente
Primeiro dia

Desparafinizar os cortes histológicos em xilol; 3 banhos de 10 minutos
cada, Temperatura Ambiente (TA)

Desidratar em álcool absoluto;

Deixar as lâminas em solução 0.2N HCL;

Pré-tratamento em Citrato 10mM (pH 6.4)- (80° C) em banho-maria;

Realizar a digestão enzimática com Pepsina (tempo variável em
decorrência do subtipo do tecido).

Lavar em água destilada, 1 banho de 10 minutos, TA

Desidratação em álcool, 75%, 80%, 100% por 2 minutos cada

Aplicação da sonda: incubação no Hibridizador para Denaturação e
Hibridização (tempo e temperatura é variável dependendo da indicação
do fornecedor da sonda
Segundo dia
Solução 1 – Etapa Pós-hibridação

Lavar em solução 2 x SSC;

Secagem das lâminas, TA

Aplicar 8 DAPI, montar com lamínula
Mini Curso 3
Clonagem e Epigenética
Preceptores: Ana Carolina de Carvalho e Lidia Rebolho Arantes
Nota: Para desenvolvimento da aula prática, os alunos deverão estar
devidamente paramentados (uso obrigatório) de acordo com as normas de
higiene e proteção individual. Os equipamentos, juntamente com toda a
estrutura serão apresentados aos alunos antes atividades realizadas na sala.
Atividade 1: Aula teórica
- Metilação do DNA: Princípios e Aplicações
Atividade 2: Aula Prática
- ANÁLISE DO PERFIL DE METILAÇÃO DE DNA:
a) Tratamento com Bissulfito de Sódio:
O DNA extraído será submetido a um tratamento com bissulfito de sódio,
o qual envolve a deaminação das bases citosinas não metiladas convertendoas em uracilas, enquanto as citosinas metiladas são protegidas do processo e
mantêm-se conservadas.
Mil nanogramas do DNA de cada uma das amostras serão submetidas
ao tratamento com bissulfito de sódio, com o EpitTect Bisulfite Kit (Qiagen),
segundo especificações do fabricante.
b) Métodos de Análise:
b. 1) MSP (Methylation Specific PCR):
 2 reações de PCR por gene
 Primers para a situação metilada
 Primers para a situação não metilada
 Análise qualitativa
1) Montar a reação de PCR:
Pré-Mix
Água
Buffer 10X
MgCl2 (25 mM)
dNTPs (10 mM)
Primer Forward
Primer Reverso
Taq Comum
Volume Final
DNA tratado
1x
10x (µL)
16,05
120,5
2,5
25
1,5
15
0,5
5
1,6
16
1,6
16
0,25
2,5
24
1
2) Programar o termociclador:
94˚C
94˚C
61ºC
72ºC
72ºC
4ºC
5 min.
30 seg.
45 seg. x 35
45 seg.
7 min.
∞
3) Após o fim da reação, analisar os produtos da PCR por eletroforese.
b. 2) QMSP-PCR (Quantitative Methylation Specific PCR):


2 reações de PCR por amostra
 Primers para a situação metilada (gene)
 Primers gene referência (região sem CpG mas
com C)
Curva Standard: permite quantificação relativa
1) Montar a reação de PCR:
REAGENTE
Água
Tampão Home-made
dNTP
10 mM
10X
Primer Forward 100 uM
Primer Reverse 100 uM
Rox Reference Dye
Sonda 100 uM
Taq Platinum
TOTAL
DNA tratado
1X
13,56
2,00
0,40
0,24
0,24
0,40
0,04
0,12
17,0
3,0
Gene (10)
135,6
20
4
2,4
2,4
4
0,4
1,2
Placa ACTB e Gene
A
B
C
D
E
F
G
H
1
P1
X
2
P2
X
3
P2
X
4
P3
Y
5
P3
Y
6
P4
Y
7
P4
Z
8
P5
Z
9
P5
Z
10
P6
W
11
P6
W
P1
X
P2
X
P2
X
P3
Y
P3
Y
P4
Y
P4
Z
P5
Z
P5
Z
P6
W
P6
W
2) Colocar no equipamento.
3) Após o fim da reação, analisar o resultado com o software SDS 2.4 (Life
Technologies).
b. 3) Pirosequenciamento:


1 reação de PCR por amostra
 Primers para a situação não-metilada (região
sem CpG mas com C)
Análise por sequenciamento durante a síntese da fita
complementar
1) Montar a reação de PCR:
Mix
Água
Master Mix Qiagen
Primer Forward
Primer Reverse
Volume Final
DNA tratado
1x (µL)
10,5
12,5
0,5
0,5
24
1
10x (µL)
105
125
5
5
12
W
W
2) Programar o termociclador:
95˚C
94˚C
55ºC
72ºC
72ºC
4ºC
14:30
30min.
seg.
30 seg. x 40
30 seg.
10:00
min.∞min.
3) Após o fim da reação, analisar os produtos da PCR por eletroforese.
4) Reação de Pirosequenciamento:
- Hibridização do produto;
- Captura das “beads”;
- Purificação do produto (lavagem em diferentes tampões);
- Imersão das “beads” no primer de sequenciamento;
- Anelamento do primer;
- Corrida no equipamento;
- Análise através do Software Pyromark Q96 (Qiagen).
Atividade 3: Discussão dos Resultados
- Os resultados dos experimentos serão avaliados e discutidos.
Resumos
O Papel de Neurotrofinas e seus Receptores em
Linhagens Celulares de Sarcoma de Ewing
Amanda Rocha
O sarcoma de Ewing é um dos mais agressivos tipos
de câncer pediátrico. Esse tipo de câncer é um tumor
primitivo neuroectodérmico, grupo que inclui ainda
outros tumores pediátricos como o meduloblastoma e
o neuroblastoma. Apesar de avanços significativos
desde o surgimento da quimioterapia, ainda há
necessidade de aumento dos índices de cura, redução
da toxicidade da quimioterapia e redução da
resistência ao tratamento em pacientes com de
sarcoma de Ewing. O desenvolvimento de novas
terapias mais seletivas e eficazes exige uma melhor
compreensão da biologia do sarcoma de Ewing e a
identificação e caracterização dos mecanismos
moleculares e celulares que regulam seu crescimento.
Propomos uma estratégia envolvendo estudos em
células
cultivadas
em
laboratório,
utilizando
ferramentas de biologia molecular e celular,
bioquímica, citopatologia e farmacologia, para
caracterizar alterações biológicas, identificar novos
alvos terapêuticos e descobrir e desenvolver
potenciais terapias inovadoras para o tratamento de
sarcoma de Ewing.
no controle durante o período de exposição e em 0,10
mgL-1. Em 1,00 e 3,40 mgL-1 ocorreu 21,2% de
mortalidade; em 11,40 mg L-1 foi de 15,1%; em 36,40
mg L-1 foi de 78,7; e em 118,00 mg L-1 foi de 100%
dos organismos expostos. A CL 50;7d foi de 3,55 mg
L-1 com limite superior de 4,55 mg L-1 e limite inferior
de 2,40 mg L-1, sendo considerada a mistura como
muito tóxica para este bioindicador. Para a A.
caroliniana não ocorreu padrão de resposta de
mortalidade, com variação entre 5 e 20% nas
concentrações testadas, assim para este bioindicador
a concentração letal 50% foi > 118,0 mg L-1, sendo a
mistura de diuron + hexazinona considerada
praticamente não tóxica. Assim, devido a resposta
sensível a mistura dos herbicidas a L. minor deve ser
empregada em seu biomonitoramento, enquanto que,
a A. caroliniana não deve ser utilizada devido a sua
tolerância ao herbicida.
Palavras-chave:
Ecotoxicologia,
bioindicadores,
diuron, hexazinona
Key-words: Ecotoxicology, bio-indicators, diuron,
hexazinone
Filmes Nanoestruturados de Langmuir e LangmuirBlodgett
Ana Laura Vieira Alves (LEEA/UNIFEB); Isabella Alves
Brunetti (LEEA/UNIFEB); Lorena Regina da Silva
Peres (LEEA/UNIFEB); Claudinei da Cruz (orientador)
Laboratório de Ecotoxicologia e Eficácia de
Agrotóxicos, LEEA, do Centro Universitário da
Fundação Educacional de Barretos, Curso de Ciências
Biológicas.
A. Sakai1, A.P.S. Mesquita2, E.V Castro3, C.C. Lopes2,
A.H. Straus3, L. Caseli1
1Universidade Federal de São Paulo, Instituto de
Ciências Ambientais, Químicas e
Farmacêuticas, Laboratório de Materiais Híbridos,
Diadema, Brasil
2Universidade Federal de São Paulo, Departamento
de Biologia Molecular, Laboratório Carl
Peter von Dietrich, São Paulo, Brasil
3Universidade Federal de São Paulo, Departamento
de Bioquímica, Laboratório de
Imunoquímica de Glicoconjugados, São Paulo, Brasil
e-mail: [email protected]
A aplicação de agrotóxicos na agricultura pode ocorrer
problemas ambientais devido a sua dinâmica
ambiental. Dentre os herbicidas, os mais utilizados
são o diuron e a hexazinona, que podem contaminar
águas subterrâneas e organismos aquáticos. Diante
do exposto, os objetivos deste estudo foi estimar a
toxidade aguda (CL50;7d) da mistura de herbicida
diuron+hexazinona para as macrófitas aquáticas
Lemna minor e Azolla caroliniana, utilizadas como
organismos bioindicadores. As plantas foram
aclimatadas em sala de bioensaio com temperatura
entre 25,0 e 27,0 ºC, iluminação de 1000 lux e
fotoperíodo de 12 horas, por três dias. Após
aclimatação, foram selecionadas quatro colônias com
três frondes de L. minor e cinco plantas de A.
caroliniana que foram transferidas para recipiente de
vidro com capacidade máxima de 100 mL contendo 50
mL de meio de cultivo Hoagland’s, por mais 24 horas.
Após esse período foi adicionado 50 mL de
Hoagland’s contento as seguintes concentrações:
0,10; 1,00; 3,40; 11,40; 36,40; e 118,00 mg L-1 e um
controle (sem adição do produto teste) e três réplicas
cada. Após sete dias de exposição foi a avaliação de
mortalidade. Para a L. minor não ocorreu mortalidade
Filmes de Langmuir podem mimetizar biomembranas
ao se espalhar fosfolipídeos, colesterol, proteínas,
glicoproteínas e outras biomoléculas sobre a interface
ar-água/tampão
formando
monocamadas
automontáveis1–3. Estudos nesse tipo de sistema
reportam a influência da composição lipídica da
membrana plasmática sobre a conformação de
receptores4, consequentemente influenciando as
interações receptor-ligante e as vias de sinalização
bioquímica, o que se relaciona com processos de
desenvolvimento de resistência a drogas que atuam
no membrana plasmática. Um exemplo desse tipo de
droga é o trastuzumab5, que é um anticorpo
monoclonal humanizado utilizado no tratamento
adjuvante e neoadjuvante de casos de câncer de
mama HER-positivo. O presente estudo avalia a
composição lipídica da membrana celular de linhagens
derivadas do endotélio de aorta de coelho (linhagem
controle EC)6, transfectada com o oncogene EJ-ras
(linhagem EJ-ras EC) ou selecionadas quanto ao
comportamento resistente ao anoikis (linhagens Adh1EC e Adh2-EC). Experimentos de HPTLC (high
performance thin layer chromatography) indicam
fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilcolina (PC) como
Avaliação da Toxicidade Aguda da Associação de
Herbicida
Diuron
e
Hexazinona
para
Bioindicadores Neotropicais
fosfolipídeos majoritários e fosfatidilserina (PS) e
fosfatidilinositol (PI) como minoritários, apresentando
pequena flutuação nas concentrações entre as
linhagens. Extratos celulares foram utilizados para
montar e caracterizar as monocamadas. Isotermas de
pressão superficial versus área da cuba (π-A) indicam
a
formação
de
monocamadas
estáveis.
Espectroscopia na região do infravermelho de
absorção-reflexão com modulação da polarização
(PM-IRRAS) indicam a presença de polissacarídeos e
proteínas (bandas em torno de 1740 cm-1, 1550 cm-1
e 1450 cm-1 respectivamente) na monocamada.
Imagens de microscopia no ângulo de Brewster
mostram a presença de microdomínios nas
monocamadas.
As
caracterizações
realizadas
mostraram variações entre as linhagens tumorigênicas
e a linhagem controle. O entendimento da composição
lipídica de células tumorigênicas pode trazer novas
abordagens de estudo sobre as interações receptorligante, influenciando diversos campos como a
oncologia molecular.
1. Brockman, H. Lipid monolayers: why use half a
membrane
to
characterize
protein-membrane
interactions? Curr. Opin. Struct. Biol. 9, 438–43
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cancer. Nat. Clin. Pract. Oncol. 3, 269–280 (2006).
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Resistance Up-Regulates Syndecan-4 Expression in
Endothelial Cells. PLoS One 9, e116001 (2014).
Avaliação
dos
Efeitos
Mutagênicos
e/ou
Antimutagênicos dos Extratos Alcoólico do Suco
de Sisal (EAS) e da Hidrólise Ácida do Sisal (EHA)
pelo Ensaio Cometa
SORROCHE, B.P; SOUZA, E.B.
Testes de genética toxicológica são essenciais para
garantir a segurança de medicamentos candidatos a
entrarem no mercado mundial, permitindo a
identificação de compostos que possam conferir riscos
mutagênicos ou com potencial carcinogênico. O
Ensaio Cometa (EC), recomendado pela ANVISA, é
um bom preconizador para a avaliação toxicológica,
pois é capaz de localizar danos recentes no DNA que
ainda estão sujeitos a reparo, diferentemente do teste
do micronúcleo que localiza danos no DNA já
consolidados. Diversas propriedades terapêuticas têm
sido referidas à Agave sisalana, tais como atividades
antibacteriana,
antifúngica,
anti-inflamatória,
antioxidante e inseticida, devido à presença de
compostos orgânicos em seu suco, entre eles ácido
oxálico, cortisona e saponinas esteroidais. O objetivo
do presente estudo foi avaliar possíveis efeitos
genotóxicos de extratos aquosos do sisal (Agave
sisalana), mediante o Ensaio Cometa. Os extratos
foram obtidos a partir da mucilagem resultante do
desfibramento de folhas de sisal. O Ensaio Cometa foi
realizado em sangue periférico de indivíduos
distribuídos em grupos controles (positivo e negativo)
e experimentais. O grupo controle positivo foi testado
com Ciclofosfamida e o controle negativo sem adição
de substância teste. Os grupos experimentais foram
testados com os Extratos da Hidrólise Ácida do sisal
(EHA) e o Alcoólico do Suco do sisal (EAS). As
lâminas foram analisadas com contagem de 100
nucleoides por indivíduo por tratamento e estes
classificados segundo o score de 0 a 4, de acordo
com o dano no DNA. Os dados foram analisados
estatisticamente pelo software BioEstat 5.0, através de
análise de variância não paramétrica (teste de
Kruskal-Wallis) seguido do teste post hoc de Dunn,
com um nível de significância de 5%. Os resultados
evidenciaram que nas concentrações e condições
testadas, os extratos da hidrólise ácida e alcoólico de
Agave sisalana não apresentaram efeito mutagênico
e/ou genotóxico.
Palavras-Chave: Sisal, Mutagênica, Antimutagênico,
Agave sisalana
Indisulam (E7070) Reduz a Proliferação Celular e
Capacidade Clonogênica de Linhagens de
Glioblastoma Pediátrico
Caio Cesar Damasceno Monção¹, Augusto Faria
Andrade², Pamela Viani de Andrade, Paola Fernanda
Fedatto¹, Silvia Aparecida Teixeira¹, Carlos Alberto
Scrideli¹.
1- Departamento de Pediatria, Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (USP),
SP, Brasil; 2- Departamento de Genética, Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São
Paulo (USP), SP, Brasil.
Introdução: Glioblastoma (GBM) é o tumor mais
agressivo do Sistema Nervoso Central e seu
prognóstico é um dos piores entre todos os tipos de
câncer, apresentando uma implacável progressão
maligna, como difusão e invasão através do cérebro,
recorrência e resistência aos tradicionais tratamentos
como a radio- e quimioterapia. Isso ocorre devido à
alterações genéticas complexas que resultam em alta
instabilidade genômica e heterogeneidade celular.
Tendo isso em vista, novos alvos terapêuticos têm
sido estudados a fim de auxiliar no tratamento dessa
neoplasia. Células de GBM hiperexpressam as
enzimas anidrases carbônicas 9 e 12 (ACs) ligadas à
membrana, uma família de enzimas que regulam
diversos processos fisiológicos e patológicos. Estas
enzimas têm sido associadas à regulação da acidez
do microambiente tumoral e à migração de células
tumorais, favorecendo a aquisição do fenótipo
metastático e a quimioresistência. Esses processos
mostram-se ser revertidos por inibidores específicos
de ACs. O Indisulam (E7070), uma sulfonamida
impermeável à membrana, é uma nova droga em
estudo para o tratamento de câncer, com potente
inibição seletiva das ACs 9 e 12, promovendo a
redução da proliferação e invasão de células
cancerosas, podendo ser um agente de grande
potencial terapêutico. Objetivo: Avaliar os efeitos da
inibição das ACs 9 e 12 pelo Indisulam em linhagens
de GBM pediátrico. Métodos: As linhagens celulares
KNS42 e SF188 foram cultivadas em condições de
normóxia (5% Co2), e tratadas com diferentes
concentrações de Indisulam (8, 16, 32, 64, 128, 256 e
512μM). Após a incubação, foi realizado os ensaios de
proliferação celular com a Resazurina após 24, 48 e
72 horas de tratamento e o ensaio de capacidade
clonogênica, após 48 horas. Resultados: O
tratamento com Indisulam reduziu a proliferação
celular de maneira dose-dependente. A droga também
reduziu a capacidade clonogênica das células, de
maneira tempo e dose-dependentes. Conclusão: Os
resultados apontam para um efeito antitumoral
causado pela inibição das ACs 9 e 12, mostrando que
o Indisulam pode ser um potencial agente terapêutico
no tratamento de GBM pediátrico.
Agência
Financiadora:
FAPESP
(Processo
2014/10908-2).
Avaliação do Sangue Periférico e Análise das
Enzimas de Detoxificação Superóxido Dismutase
(SOD) e Catalase (Cat) E Marcadores Do
Metabolismo
em
Phrynops
Geoffroanus
(Schweigger, 1812) (Testudines: Chelidae).
Camila Zucchini de Souza1; Rodrigo Yamakami
Camilo2; Claudia Regina Bonini Domingos3.
1: Aluna do curso de Ciências Biólogicas – Instituto
Federal de Educação, Ciência e Tecnologia – Campus
Barretos.
2: Professor Doutor do Instituto Federal de Educação,
Ciência e Tecnologia – Campus Barretos.
3: Universidade Estadual Paulista - Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento
de Biologia, Centro de Estudos de Quelônios (CEQ) São José do Rio Preto.
A poluição é hoje um problema que afeta todos os
ambientes, inclusive o de água doce e,
consequentemente, os organismos que nele vivem.
Os quelônios são considerados importantes
bioindicadores
de
contaminação
ambiental,
principalmente por apresentarem uma grande
distribuição geográfica. A espécie
Phrynops
geoffroanus é conhecida pela facilidade de
sobrevivência em águas poluídas, mesmo sendo
considerado ambiente inóspito para os demais
organismos. Esta espécie também é considerada
hipóxia tolerante, pois compõe um grupo de répteis
tolerantes à ambientes anóxico. Vale salientar que são
animais aeróbicos que dependem do oxigênio para
suas funções normais, porém, possuem diversos
mecanismos bioquímicos e fisiológicos que permitem
sua sobrevivência em situações de baixa pressão de
oxigênio. Desta forma, a avaliação de intermediários
metabólicos e da atividade enzimática antioxidante de
espécimes de ambiente contaminado indicam que a
proteção ao dano oxidativo pode contribuir para a
adaptação desta espécie à poluição. Sendo assim,
este estudo busca avaliar a resposta catalítica de
sistemas antioxidantes em P. geoffroanus expostos a
poluentes químicos e orgânicos em condição de
normóxia, hipóxia e reperfusão, com a finalidade de
averiguar se os mecanismos de proteção aos danos
oxidativos gerados pela hipóxia são responsáveis pela
capacidade
de
suporte
destes
animais
à
contaminação ambiental e as alterações de alguns
marcadores do metabolismo intermediário.
Avaliação in vitro da Atividade Citotóxica da
Apitoxina Extraída da Apis Mellifera
Kristiana Cerqueira Mousinho, Elísia Marina Melo de
Araújo, Aldenir Feitosa dos Santos
Introdução: A apitoxina (do latim apis, abelha, e
toxikon, veneno), também conhecido como o veneno
de abelha. É recomendada para uso em casos de
artrite, reumatismo, hipertensão. As células malignas
desafiam a terapêutica que auxiliam na erradicação do
tumor, portanto, faz-se necessário estudo com
moléculas
ativas
que
possam
ampliar
as
possibilidades de desenvolver novos agentes mais
específicos para o tratamento do câncer. A ativação
da apoptose pode ser iniciada de duas diferentes
maneiras: pela via extrínseca (citoplasmática) ou pela
via intrínseca (mitocondrial). Este trabalho visou
avaliar a atividade citotóxica in vitro da apitoxina
extraída da Apis Mellifera, em células tumorais
humanas. Material e Métodos: A apitoxina foi
coletada no apiário localizado em Piaçabuçu-AL. O
teste de citotoxicidade foi realizada em três diferentes
linhagens de células tumorais, glioblastoma (SF-295),
mama (OVCAR-8) e colón (HCT-116), através do
método de estudo do MTT (sal de tetrazolium). As
células foram plaqueadas e incubadas com 50μg/mL
apitoxina teste e padrão (proveniente de Taiwan) em
estufa à 37°C à 5% CO2. 3 horas antes da incubação
por 72 horas foi acrescido o sal de MTT,
posteriormente feito a leitura em espectrofotômetro a
595nm. Os experimentos foram analisados segundo a
média ± desvio padrão da média (DPM). Resultados
e discussão: A amostra padrão apresentou potente
ação citotóxica nas linhagens testadas, enquanto que
a amostra teste apresentou potencial citotóxico
significativo apenas para a linhagem de cólon HCT116, com 89,43% ± 12,96, enquanto que nas células
SF-295 houve diminuição da proliferação celular em
44,10% ± 16,13 e a OVCAR-8, com 57,02% ± 7,31. A
amostra padrão inibiu 100% das células testadas.
Heraldo em 1979, chegou a conclusão de que
estatísticamente o número de pacientes com câncer
entre apicultores era menor do que em não
apicultores, levantando uma suspeita de que o veneno
da abelha pudesse exercer algum efeito citostático no
organismo. Conclusão: Diante dos resultados
apresentados pode-se observar que a apitoxina figura
como um agente promissor para a terapia do câncer.
Referências:
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Soares CP, Silva NS. Análise de citotoxicidade do
veneno da abelha Apis Mellifera em cultura de células
L929. Instituto de Pesquisa IP&D UNIVAP. São José
dos Campos - SP. [acesso 05 de dez 2012] Disponível
em:
http://www.inicepg.univap.br/cd/INIC_2009/anais/arqui
vos/RE_0541_1373_01.pdf
2. Callegari AL, Farias L, Laars E, Trindade JLF.
Apitoxina e suas indicações de uso. UTFPR. Ponta
Grossa.
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growth and survival: application to proliferation and
cytotoxicity assays. In: Journal of immunological
methods, 1983 v.16, p.55–63.
4. Breyer EU. O Veneno das Abelhas. In: Livro
Abelhas e Saúde, Paraná: Uniporto 1983. p.37-42.
Genotipagem
de
Grupos
Sanguíneos
na
Confirmação
de
Casos
Inconclusivos
de
Fenotipagem Eritrocitária de Pacientes Atendidos
no Hemocentro da Unicamp
Vitorino, Francisca Nathália de Luna1; Risso, Mariane
Aparecida1; Bueno, Rosemeire1; Castilho, Lilian
Maria3.
1Centro Universitário Nossa Senhora do Patrocínio,
CEUNSP, Itu, SP. 2Universidade Estadual de
Campinas, UNICAMP, Campinas, SP.
[email protected]
A fenotipagem eritrocitária realizada pela técnica de
hemaglutinação tem sido utilizada como ferramenta
útil na seleção de sangue para as transfusões
sanguíneas, porém apresenta limitações quando
aplicada em casos complexos, como nos pacientes
politransfundidos. Estes pacientes possuem alguma
patologia que afeta principalmente as linhagens
sanguíneas, necessitando de transfusões frequentes
ao longo da vida, e com isso a realização de novas
fenotipagens. A genotipagem vem ocupando um lugar
de grande importância em conjunto com a
hemaglutinação devido a sua eficácia em analisar
diretamente o gene em questão, demonstrando o
código genético do indivíduo. Neste contexto, o
presente trabalho teve como objetivo avaliar os
resultados obtidos da genotipagem de um total de 20
pacientes atendidos no Hemocentro da UNICAMP,
que apresentaram resultados inconclusivos na
fenotipagem, sendo a pesquisa aprovada pelo comitê
de ética sob o número de parecer 68683. Os
resultados indicaram que seis (30%) destes pacientes
possuíam aloanticorpos, onde a maioria era contra o
sistema Rh (anti-e/anti-C/anti-V), demonstrando que a
genotipagem é útil principalmente na identificação de
mutações, onde permitiu encontrar e confirmar
fenótipos nulos (GATA) e parciais (e parcial).
Identificou ainda variantes Rh do gene RHCE
(V/Vs/hrB), além de variantes do sistema de grupo
sanguíneo Duffy (Fyx). O acompanhamento do
processo transfusional desses pacientes, junto ao
setor de compatibilidade do Hospital das Clínicas da
UNICAMP, permitiu identificar o melhor fenótipo a ser
transfundido, assim como as correções de fenótipos
compatíveis, realizadas posteriores à genotipagem.
Desta forma, este estudo demonstrou que a
genotipagem é de grande importância na escolha da
bolsa a ser transfundida, na redução das
aloimunizações e ampliação da disponibilidade de
sangue a ser transfundido, além de evitar novas
aloimunizações em pacientes que já possuem
aloanticorpos. As discrepâncias encontradas entre a
fenotipagem e a genotipagem pode propiciar um
aumento nos doadores disponíveis para o paciente,
assim como a identificação de fenótipos mais raros e
mais fáceis de levar a aloimunização.
Polimorfismo
Brasileiro
MMP-9-1562
C/T
no
Nordeste
J.O. Mágulas1, I.E.G. Pereira1, I.A. Miranda1, G.F.L.
Pereira1, F.K.N. Yoshioka1, G.R. Pinto1, R. Canalle1,
F.J.N. Motta1
1Laboratório de Genética e Biologia Molecular,
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia,
Universidade Federal do Piauí, Parnaíba, PI, Brasil
O Câncer de Próstata (CaP) é uma das neoplasias
mais comuns que acometem homens no mundo
inteiro. Estima-se que em 2014, cerca de 233.000
novos casos tenham sido diagnosticados, juntamente
com 29.480 mortes associadas à doença nos Estados
Unidos (Siegel et.al., 2012). O CaP apresenta etiologia
heterogênea oriunda da associação entre fatores
ambientais e genéticos, sendo a contribuição destes,
responsável por 42% dos casos (Lichtenstein et al.,
2000). Enzimas proteolíticas que degradam matriz
extracelular, as metaloproteinases de matriz (MMPs)
(Sternlicht; Werb 2001), têm importante papel
fisiológico na remodelagem de tecidos (Page-Mc Caw;
Ewald; Werv, 2007) e durante processos inflamatórios
(Parks; Wilson;López-Boado, 2004), porém a
expressão e atuação aumentas das MMPs são
notórias em muitos processos patológicos, incluindo o
câncer (Wood et al, 1997; Matsumara et. al., 2005;
Morgia et al., 2005). As MMPs são fundamentais à
invasão tumoral e metástase (Demers et al., 2005). A
atividade elevada de MMPs tipo 9 (MMP-9) promove a
progressão do CaP não apenas por meio da
metástase acentuada, portanto, a investigação do
gene codificante é de suma importância. O SNP MMP9-1562C/T está relacionado à alterações na
transcrição dessas enzimas. Este estudo casocontrole teve como objetivo analisar a prevalência do
polimorfismo
MMP-9-1562C/T
em
população
miscigenada do Nordeste Brasileiro e avaliar a
associação deste com parâmetros citopatológicos da
doença. Compuseram este estudo 100 pacientes com
CaP e 100 pacientes-controle do estado do Piauí.
Amostras de tecido de carcinoma prostático e de
sangue periférico foram utilizadas para extração de
DNA dos pacientes e controles, respectivamente. O
polimorfismo foi analisado em gel de poliacrilamida
(8%) com coloração por nitrato de prata após técnica
de PCR-RFLP. Os resultados apontaram população
em equilíbrio de Hardy-Weinberg para o loci estudado.
Observaram-se maoires frequências do genótipo CC
(84%) e do alelo (92%) entre os controles, e maior
prevalência de CT+TT (20%) e do alelo T (11%) entre
os casos, no entanto, sem significância estatística.
Não houve evidências de associações da variante
polimórfica com CaP e parâmetros citopatológicos da
doença. Os resultados reforçam a necessidade de
estudos adicionais que incluam outras variantes
polimórficas funcionais em MMP-9 para entender o
papel destas alterações genéticas no CaP e suas
prováveis contribuições para a cliníca e terapêutica.
Referências
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In
situ
hybridization
studies
of
metalloproteinases 2 and 9 and TIMP-1 and TIMP-2
expression in human prostate cancer. Clin. Exp.
Metastasis. 15: 246-258
tratamentos disponíveis, a sobrevida de pacientes
portadores de glioblastoma continua sendo muito
baixa. Assim, se faz necessário a identificação de
novas drogas. A 7-epiclusianona é uma benzofenona
tetraprenilada isolada do extrato hexânico do epicarpo
da espécie Garcinia brasiliensis. Esse composto
apresenta um largo espectro de atividade biológica
incluindo propriedades anti-inflamatória, antisséptica,
antiparasitária e antimicrobiana, entretanto, pouco se
sabe sobre seu potencial efeito antineoplásico. O
presente
estudo
visou
avaliar
a
atividade
antiproliferativa da 7-epi em linhagens de
glioblastoma. Dessa forma, as linhagens celulares
U251 e U138 foram cultivadas em meio DMEM
suplementado com 10% de soro bovino fetal e
tratadas com diferentes concentrações do composto
(10 μM, 20 μM, 30 μM e 40 μM) para realização dos
diferentes ensaios: ensaio de viabilidade celular,
capacidade de formação de colônias e de morte
celular. O tratamento in vitro reduziu significativamente
a viabilidade celular das duas linhagens celulares de
glioblastoma testadas em relação às controles, na
forma dose dependente (IC50 após 48 horas, 23 ±
0,32 μM para U251 e 18,52 ± 0,50 μM para U138),
mais significativamente foi a redução da capacidade
de formação de colônias, que demonstraram efeitos a
longo prazo mesmo após a remoção do fármaco.
Somado a isso, o tratamento com a 7-epiclusianona
também aumentou as taxas de morte celular de 18,8%
para U251 e 21,8% para U138 a dinâmica do ciclo
celular, compatível com a diminuição das células em
divisão. Em conclusão, a 7-epi-clusianona possui
importante atividade antiproliferativa in vitro contra
células cancerígenas derivadas de glioblastoma.
Portanto, os resultados sugerem um efeito potencial
da 7-epiclusianona contra o glioblastoma, merecendo
novas investigações sobre o mecanismo de ação do
composto estudado e sua efetividade como agente
quimioterápico.
O presente trabalho foi realizado com apoio dos
órgãos de fomento e pesquisa: FAPEMIG, Fapesp,
CAPES e CNPq,
7-EPI-CLUSIANONA, a Benzofenona Derivada Da
Garcinia Brasiliensis, Apresenta Efeito PróApotótico Em Células De Glioblastoma
Avaliação do perfil de expressão do miR-10b* em
osteosarcoma e sua participação na regulação de
genes associados a progressão do ciclo celular,
PLK1 e BUB1 (" Mir-10b* expression profile rating
in osteosarcoma and their participation in the
regulation of genes associated with cell cycle
progression, PLK1 and BUB1”)
Leilane Salesa, Graziella Ribeiro de Sousaa*, Julia
Alejandra Pezukb, Maria Sol
Brassescob, Carlos Alberto Scridelib, Luiz Gonzaga
Toneb, Marcelo Henrique dos
SantosC, Marisa Iontaa, Jaqueline Carvalho de
Oliveira.
*[email protected]
a Universidade Federal de Alfenas, Alfenas, MG
b Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Ribeirão
Preto, SP
c Instituto de Química,Universidade Federal de
Viçosa, Viçosa, MG
Palavras-chave:
7-epi-clusianona,
glioblastoma,
proliferação, apoptose
O Glioblastoma é um dos tumores mais agressivos do
sistema nervoso central e está entre as neoplasias de
pior prognóstico. Mesmo com os avanços dos
Guilherme Vargas Ribeiro Ferrari de Oliveira, Profa
Dra María Sol Brassesco Annichini
Ribeirão Preto
O osteosarcoma (OS) É a neoplasia óssea pediátrica
maligna
mais
comum,
sendo
encontrado
principalmente na metáfise dos ossos longos. As
opções de tratamento atuais incluem a cirurgia,
quimioterapia adjuvante e neoadjuvante, e a
radioterapia. A maioria, se não todos os OS,
apresentam aberrações cromossômicas numéricas e
estruturais, resultando em cariótipos complexos e
desbalanceados. Sendo consenso geral que a
progressão do tumor ocorre de acordo com um
esquema de acumulo gradual de anomalias genéticas
e que a instabilidade genômica é maior em formas
mais agressivas, em OS pode ser responsável pela
extensiva aneuploidia encontrada no tumor, podendo
estar relacionada com proteínas reguladoras do ciclo
celular ou componentes do SAC (Checkpoint do fuso
mitótico) . Diversos miRNA são apontados como
reguladores de vias do ciclo celular e que controlam a
mitose. Dentre estes recentemente foi descrito o
miR10b*, encontrado hipoexpresso no câncer de
mama e atuando sobre proteínas como a PLK1, que
faz parte de um grupo de proteínas que que cooperam
com as CDKs (quinases dependentes de ciclina) no
controle da evolução do ciclo celular, e a BUB1, que
medeia a atuação do SAC (checkpoint do fuso
mitótico) , e é essencial para que diversas proteínas
tenham um recrutamento eficiente aos cinetócoros
ligados, incluindo BUBR1, Cenp-E, e SGO1. Estudos
demonstraram a hiperexpressão de PLK1 e BUB1 em
diversos tumores, incluindo OS. De forma que o
presente projeto pretende analisar o perfil de
expressão do miR10b* em amostras de pacientes
acometidos com esse tumor, explanar sua
participação na regulação epigenética de PLK1 e
BUB1 visando um papel nos processos que que levam
a instabilidade citogenética desta neoplasia.
Osteosarcoma (OS) is the most common malignant
bone tumor and is mainly found in the metaphysis of
long bones. Current treatment options include surgery,
adjuvant and neoadjuvant chemotherapy and
radiotherapy. Most, if not all OS, present numerical
and structural chromosome aberrations, resulting in
complex and unbalanced karyotypes. As a general
consensus tumor progression occurs according to a
gradual accumulation scheme of genetic abnormalities
and that genomic instability is greater in more
aggressive forms, in OS, that instability may be
responsible for the extensive aneuploidy found in this
tumor, possibly due to deregulated SAC proteins or
cell cycle components. Data shows that several
miRNAs act as regulators of the cell cycle pathways
that control mitosis. Among these, miR10b *was
recently described as hypoexpressed in breast cancer
and acting on proteins such as PLK1, which is part of a
group of proteins that cooperate with Cdk’s (cyclin
dependent kinases) to control cell cycle progression,
and BUB1, which mediates the efficient recruitment of
proteins to the kinetochores, including BubR1, CENPE, and SGO1. Several studies have shown
overexpression of PLK1 and BUB1 as tumorigenic in
cancer. So this project aims to analyze the miR10b *
expression profiles in osteosarcoma samples and its
participation regulating PLK1 and BUB1 searching for
a role in processes that lead to cytogenetic instability
in this neoplasm.
Avaliação do Sistema Serotoninergico Sobre as
Respostas Cardiovasculares e Euroendócrinas do
Núcleo Paraventricular do Hipotalámo em Condições
Basais e Induzidas pela Expansão Isotônica do
Volume Extracelular
SEMIONATTO, I. F.; ALVES, A. C.; CAPITTELI, C. S.;
CHRIGUER, R. S. Disciplina de Fisiologia do
Departamento
de
Bioquímica,
Fisiologia/ICBN/UFTM.
Farmacologia
e
Introdução: Expansão de volume extracelular (EVEC)
promove alterações da atividade parassimpática e
simpática para o coração e vasos sanguíneos e
neuroendócrinos, quais podem ser moduladas por vias
serotoninérgicas.
Metodologia:
Foram
realizados
registros da pressão arterial e frequência cardíaca (FC)
em ratos Wistar machos antes e após receberem
microinjeções bilaterais no núcleo paraventricular do
hipotálamo (NPV) de salina ou agonista serotoninérgico
(DOI) seguida de EVEC. Resultados: Não foram
observadas diferenças significantes no grupo controle
entre os valores de pressão arterial média (PAM), FC e
relação simpático-vagal (LF/HF) obtidos no período basal,
após microinjeção com salina e esta seguida de EVEC
isotônica. Por outro lado, quando os animais são tratados
com DOI ocorre aumento, significativo, em relação ao
grupo controle, PAM basal (105,65±1,00 vs 100,83±2,82)
e na PAM induzida por EVEC (114,41±3,51 vs 101,34 ±
1,99) como também, na FC basal (399,40±11,22 vs
354,14±10,44) e induzida por EVEC (421,02±19,38 vs
356,35±6,51). Discussão: O estudo mostrou que a
indução de EVEC isotônica não promoveu alterações nas
variáveis PAM, FC e LF/HF. Porém, os animais que
receberam microinjeção de DOI seguida de EVEC,
apresentaram aumento significativo das variáveis,
sugerindo que a serotonina exerça uma neuromodulação
em nível do NPV e esta promova uma inibição na
resposta barorreflexa frente à EVEC, mostrando o
envolvimento serotoninérgico na neuromodulação em
nível do NPV na resposta reflexa vagal em ratos
normotensos.
Expressão do Cd10 e Tra-1-60 no Carcinoma
Espinocelular
de
Boca:
Uma
Correlação
Clínicopatológica
Jade Silva Kozlowski de Oliveira, Eneida Franco
Vencio
Dentre os diversos tipos de câncer, o bucal representa
de 3 a 5% do total de neoplasias malignas, sendo que
o Carcinoma Espinocelular representa 95% destas
lesões e apresenta elevada taxa de morbimortalidade.
Tem sido descrita a expressão de marcadores
tumorais que auxiliam no prognóstico em vários tipos
de câncer. Este estudo tem como objetivo avaliar a
expressão do CD10 e TRA-1-60, especificamente,
como indicadores de invasão e metástase, fazendo
uma correlação com os aspectos clínicos e
histopatológicos dessas lesões. Será realizada uma
análise imunohistoquímica e biomolecular por meio de
PCR em 93 amostras de carcinoma espinocelular de
boca. O resultado esperado é a identificação de
expressão destes marcadores em relação às
particularidades clínicopatológicas, a fim de colaborar
no diagnóstico dessa neoplasia e trazer benefícios no
prognóstico dos pacientes e consequente redução da
morbimortalidade.
Avaliação do Potencial Genotóxico e Cancerígeno
do Uso de Membranas Regeneradoras de Tecido
Através do Teste de Micronúcleo em Sangue
Periférico de Camundongos.
Souza, Jonas P.1(IC); Cunha, Anderson F.1(O);
Malavazi, I1(CO).
[email protected]
1Departamento de Genética e Evolução, Universidade
Federal de São Carlos.
Jennifer Thalita Targino dos Santos
Biomateriais são materiais artificiais desenvolvidos
para uso em áreas de saúde com desígnio de suprir a
matéria viva cuja função foi perdida. Inclui qualquer
substância sintética ou natural que pode ser
empregada como tratamento para substitutivo total ou
parcial de qualquer tecido, órgão ou organismo.
Dentre as características primordiais desses materiais
estão a biocompatibilidade com o tecido, atoxidade,
pouco peso e baixo custo. Os mais requisitados no
mercado atual são os polímeros e os cerâmicos, pois,
podem tanto substituir o tecido vivo sem função como
também impulsionar o crescimento de um novo tecido.
As membranas regeneradoras de tecidos, um
biomaterial, são transparentes e extremamente finas,
altamente flexíveis, não adesivas, que se adaptam
facilmente ao ferimento, considerado como substituto
da pele humana, Entretanto, seu uso não deve ser
feito de forma não controlada, pois se deve levar em
conta o fato comum da presença de compostos de
ação citotóxica ou genotóxica entre os constituintes da
membrana e faz-se necessário o conhecimento de tais
potenciais para uma utilização racional do uso deste
biomaterial. O teste de micronúcleo é amplamente
utilizado com a finalidade de testar o potencial
genotóxico de substâncias, sendo tecnicamente
simples, pode ser conduzido em menor tempo e
possui um resultado menos subjetivo. Neste trabalho,
foi empregada a avaliação da genotoxicidade da
membrana regeneradora de tecido, quantificando seu
potencial cancerígeno. Para o desenvolvimento do
teste
de
micronúcleo
foram
utilizados
10
camundongos da espécie Mus musculus (Swiss
albino) com aproximadamente 25g de peso corpóreo,
Divididos cinco animais para cada grupo de
tratamento. Sendo um grupo controle negativo e um
grupo com a amostra da membrana reticulada. Todos
os animais foram submetidos à administração via
intramuscular do anestésico Quetamina associada ao
relaxante muscular Dopaser (0,1mL). Em seguida,
realizado a tosa no dorso do animal, e uma incisão de
aproximadamente 0,5cm para a aplicação da
membrana. Após a colocação do biomaterial a incisão
foi suturada. Para o controle negativo, o processo foi o
mesmo, porém sem o emprego da membrana no
procedimento. Para análise citológica, foram feitas
coletas de 30, 48 horas e 30 dias, após os animais
serem submetidos ao tratamento. As lâminas foram
preparadas com o esfregaço de uma gota do sangue
coletado em seringa heparinizada, através de punção
na veia caudal. Fixadas com metanol e coradas com
Gimsa. Os resultados mostram que a amostra não foi
capaz de induzir danos estatisticamente significativos
ao DNA.
Análise da Dinâmica de Sucessão de Linhagens de
Leveduras em Dornas de Fermentação Durante a
Safra de Produção de Etanol
A Produção de etanol no Brasil nas usinas de álcool
ocorre através da fermentação do caldo de cana ou
melaço (sub produto da produção de açúcar),
realizado pela via fermentativa da levedura
Saccharomyces cerevisiae que deve ocorrer entre 30
e 35°C. Para manter esta temperatura é necessário a
instalação de sistemas de resfriamento que tem um
custo bastante elevado. Por esse motivo, seria
interessante se a fermentação ocorresse a altas
temperaturas, porque assim, haveria uma redução no
custo da produção do etanol, pela não utilização dos
resfriadores e diminuição da competição por linhagens
de leveduras e bactérias invasoras que não se
desenvolveriam nessas temperaturas. À vista disso,
linhagens selvagens mais robustas poderiam ser
selecionadas e melhoradas de modo a produzir o
máximo de etanol em temperaturas e concentrações
de etanol elevadas, e serem utilizadas como cepas de
partida no processo de fermentação. Com isso, este
projeto tem por objetivo principal isolar e identificar por
análises moleculares, a dinâmica de sucessão de
linhagens da levedura S. cerevisiae nas dornas
durante o processo de produção industrial de álcool e,
assim, avaliar o potencial de resistirem a estresses de
temperatura e álcool para maximizar a produção de
etanol visando uma maior produtividade. Durante a
safra de 2014, foram retiradas amostras do processo
fermentativo da Usina São Luis em Ourinhos-SP, para
identificar a dinâmica de sucessão nestas dornas.
Para isto, a mistura de leveduras coletada foi
inoculada em meio de cultura sólido WLN (Wallerstein
Laboratory Nutrient) e YEPD (Extrato de levedura 1%,
Peptona 2% e Dextrose 2%), sendo as colônias
diferenciadas por morfologia após o crescimento.
Além
disto,
15
colônias
foram
coletadas
aleatoriamente para as análises de genotipagem que
diferencia linhagens selvagens das industriais
atualmente utilizadas. Para isso, o DNA destas
colônias foi extraído, e genotipado utilizando um kit de
genotipagem desenvolvido para este propósito. Os
resultados foram comparados com os perfis genéticos
das linhagens industriais e as que apresentam um
padrão distinto foram consideradas linhagens
selvagens (ou derivadas). Até o momento isolamos 13
linhagens consideradas como selvagens e em uma
primeira análise observamos que duas linhagens
muito prevalentes, provavelmente derivaram da
industrial CAT-1 (previamente inoculada no início da
safra) e que estas deram origem a uma outra que se
mostrou prevalente na coleta posterior. Nossos dados
iniciais sugerem que a dinâmica nas dornas pode
ocorrer tanto por inserção de novas linhagens quanto
pela derivação por recombinação homóloga, processo
muito comum em S. cerevisiae, durante o processo
fermentativo. Estas linhagens estão sendo testadas
quanto a termotolerância e etanol resistência para
aplicação em processo industrial visando reduzir
custos e aumentar a produção.
Influência da Dislipidemia no Surgimento
Agravamento de Cardiopatias na População.
e
Lais Machado De Jesus
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS),
dos 50 milhões de óbitos registrados nas últimas
décadas, as doenças cardiovasculares foram
responsáveis por 30% das causas. Através desses
valores verifica-se que há grande necessidade da
identificação de etiologia, sintomas, fatores de risco,
prevenção e tratamento das cardiopatias, e também a
influência da dislipidemia para o aparecimento ou
agravamento destas patologias. (SIMÃO, 2013.) As
cardiopatias, assim como as demais enfermidades,
são determinadas pela multicausalidade; a genética e
o estilo de vida são fatores considerados para a
incidência destas doenças. (SOCESP) Segundo a
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) a
dislipidemia é definida como distúrbio que altera os
níveis séricos dos lipídeos (gorduras); as alterações
do perfil lipídico podem incluir colesterol total alto,
triglicerídeos (TG) altos, colesterol de lipoproteína de
alta densidade baixo (HDL-c) e níveis elevados de
colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-c).
Em consequência, a dislipidemia é considerada como
um dos principais determinantes da ocorrência de
doenças cardiovasculares (DCV) e cerebrovasculares,
dentre elas aterosclerose (espessamento e perda da
elasticidade das paredes das artérias), infarto agudo
do miocárdio, doença isquêmica do coração
(diminuição da irrigação sanguínea no coração) e AVC
(derrame). De acordo com o tipo de alteração dos
níveis séricos de lipídeos, a dislipidemia é classificada
como:
hipercolesterolêmica
isolada,
hipertrigliceridemia isolada, hiperlipidêmica mista e
HDL-C baixo. (BRASIL, 2011) Tendo em vista a
importância do conhecimento sobre a doença e por
ser fator influenciador nas cardiopatias, foi realizada
pesquisa bibliográfica em livros, sites e artigos
acadêmicos com o propósito de levantar produções
científicas que apresentem a dislipidemia como fator
de risco significativo para as cardiopatias, a influência
de alguns alimentos para o aumento dos níveis de
lipídios no sangue, os alimentos funcionais e a terapia
nutricional a favor da diminuição desses níveis
elevados. Também foi realizada uma pesquisa
epidemiológica em hospitais da cidade de BarretosSP, com o objetivo de observar a relação de
indivíduos que possuem doenças cardiovasculares e
que apresentem taxa elevada de gordura no sangue.
Efeito da suplementação de ácido α-lipóico sobre
parâmetros do estresse oxidativo dos tecidos
musculares esquelético e cardíaco pós exercício
exaustivo em camundongos treinados.
WOLF,
L.S.¹;
MORAES,
S.M.²;PORTARI, G.V.³
R.C.M.²;
MERINO,
1 – Graduação em Nutrição, Instituto de Ciências da
Saúde – UFTM
2 – Mestrado em Educação Física, Departamento de
Ciências do Esporte - UFTM
3 – Professor Adjunto, Departamento de Nutrição UFTM
Introdução: A realização de exercícios físicos de alta
intensidade ou exaustivo associados ao metabolismo
energético acelerado pode gerar estresse oxidativo e
danos como lesões, fadiga crônica, overtrainig e
capacidade vasodilatadora prejudicada, parcialmente
em razão da elevada síntese de Espécies Reativas de
Oxigênio (EROs) nos tecidos. A possibilidade de
ocorrer lesão oxidativa durante o exercício aeróbio nos
tecidos depende do equilíbrio entre a geração dos
EROs e eficácia dos mecanismos antioxidantes.
Enquanto alguns estudos demonstram o efeito positivo
da suplementação com antioxidantes sobre o estresse
oxidativo e lesões celulares decorrentes de exercícios
físicos exaustivos outros demonstram efeitos
negativos da suplementação de antioxidantes na
adaptação ao exercício crônico. Portanto, faz-se
necessário esclarecer os efeitos da suplementação
com antioxidantes, no caso de nosso trabalho o ácido
α-lipóico. Objetivos: Avaliar os efeitos da
suplementação
de
ácido
α-lipóico
sobre
biomarcadores de estresse oxidativo nos músculos
esquelético e cardíaco de camundongos treinados no
pós-exercício exaustivo. Métodos: No trabalho,
aprovado pela CEUA/UFTM (nº219/12), foram
utilizados
60
camundongos
Swiss
machos,
peso≅25g/idade≅50 dias. O treinamento consistiu em
6 semanas de natação, em que o último dia
correspondeu à uma sessão exaustiva com
sobrecarga de 10% do peso corporal preso à calda do
animal. Os animais do grupo Suplementado
receberam 100mg/kg/dia de ácido α-lipóico, enquanto
os do grupo Controle receberam placebo. A eutanásia
se deu em 3 diferentes momentos, Basal (animais em
repouso), 0 e 4h pós-exaustão. As dosagens de
biomarcadores de estresse oxidativo foram realizadas
(determinação das substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico – SRATB e sulfidrila não protéico –
GSH). Resultados: As dosagens de biomarcadores
de estresse oxidativo foram realizadas obtendo-se
uma diminuição simultânea das concentrações de
GSH após 4h de exercício exaustivo (PLA–
basal=283,2±51,7;
0h
pós=
343,5±49,2;
4h
pós=391,3±57,0/ SUP- basal=316,0±71,7; 0h pós=
399,7±68,2;
4h
pós=342,9±43,2),
no
grupo
Suplementado sugerindo o consumo destes em prol
da redução da peroxidação lipídica, percebida pela
redução das SRATB no mesmo grupo e período do
protocolo experimental. (PLA– basal=9,9±1,9; 0h pós=
4,7±1,2; 4h pós=7,1±0,5/ SUP- basal=7,3±1,4; 0h
pós= 4,1±1,2; 4h pós=4,4±0,9). Já no tecido cardíaco,
houve um aumento significativo das SRATB no grupo
basal suplementado (PLA– basal=0,16±0,07; 0h pós=
0,13±0,03; 4h pós=0,20±0,06/ SUP- basal=0,51±0,15;
0h pós= 0,19±0,05; 4h pós=0,21±0,03). Sugere-se que
esse aumento seja devido a um maior estresse do
tecido cardíaco que no músculo durante uma atividade
aeróbia exaustiva, ocorrendo uma maior ação dos tióis
nesse tecido. Assim, as concentrações de GSH
aumentaram de forma gradativa do controle para o
suplementado, no entanto, houve um aumento
drástico do GSH após 4h do exercíco exaustivo no
grupo Suplementado (PLA– basal=23,22±19,48; 0h
pós= 72,28±25,09; 4h pós=95,98±37,86/ SUP-
basal=264,40±150,11; 0h pós= 403,65±193,92; 4h
pós=792,70±364,73), provavelmente decorrente de
uma possível compensação aos altos niveis de
SRATB
no
pré
exercício.
Conclusão:
A
suplementação com ácido α-lipóico resultou em uma
proteção contra o estresse oxidativo provocado pelo
exercício exaustivo, no entanto, comportamentos
diferentes entre os dois tecidos foram verificados.
Palavras-chave: exercício exaustivo, estresse
oxidativo, ácidoα-lipóico, EROs, suplementação,
antioxidante.
Apoio Financeiro: FAPEMIG/CAPES
Estudo das Regiões Ultra Conservadas
Leucemia Linfóide Aguda da Criança e
Adolescente
na
do
KODAMA, M. H.1; SOUSA, G. R.1; SALES, L.1;
IONTA, M.1; OLIVEIRA, J. C.1.
*[email protected]
1Grupo de Pesquisa: Bases Moleculares Envolvidas
na Atividade Antitumoral de Compostos Naturais e
Sintéticos, Instituto de Ciências da Natureza, UNIFALMG.
Palavras-chave: Leucemia Linfóide Aguda, Regiões
Ultra Conservadas Transcritas, Desregulação, Câncer.
Conhecimento dos Alunos do Ensino Fundamental
Participantes
do
Pibid/Ciências
sobre
o
Papilomavírus Humano: Um Estudo Transversal
em Uberaba-MG
BARBOSA, Luciana Maria de Oliveira; PEREIRA,
Fernando Lourenço
A infecção por papilomavírus humano (HPV) é a
doença sexualmente transmissível mais frequente na
população, e quando não tratada, pode causar muitos
malefícios,
inclusive
a
possibilidade
do
desenvolvimento de alterações nas células, podendo
evoluir para algumas doenças. Geralmente há
alterações nas células do colo do útero,
principalmente em mulheres infectadas por vírus
oncogênico. Atualmente a vacina bivalente tem sido
indicada para meninas e mulheres acima de 9 anos,
sendo esta uma medida preventiva adotada por
países que utilizam a vacinação em programas
nacionais de imunização, porém nem sempre há
conhecimento dos alunos e dos seus familiares sobre
os métodos preventivos sobre o HPV e o câncer do
colo de útero, neste sentido o presente estudo teve
por objetivo verificar o conhecimento dos alunos em
relação ao papilomavírus humano, dando enfoque na
prevenção, transmissão e associação ao câncer do
colo de útero. A pesquisa foi realizada na Escola
Estadual Horizonta Lemos na cidade de Uberaba/MG.
Foi aplicado um questionário para 25 alunos do ensino
fundamental, participante das oficinas do Programa
Institucional de Bolsas de Iniciação à Docência
(PIBID), sendo 60% homens e 40% mulheres. Ao
avaliar o conhecimento dos alunos sobre a principal
medida preventiva do HPV, 60% responderam
incorretamente,
quanto
a
transmissão
96%
responderam corretamente, e quando questionados
sobre a associação do HPV e o câncer do colo de
útero 60% apresentou conhecimento sobre essa
questão. Assim o estudo verificou que os alunos
demonstraram conhecimento primário em relação ao
HPV, e apresentaram pouco conhecimento quanto a
prevenção, sendo necessário um trabalho mais
aprofundado sobre métodos preventivos de HPV e
câncer do colo de útero com os alunos e seus
familiares, uma vez que a escola configura como fonte
de informação, e partir de trabalhos informativos, é
possível buscar uma diminuição na proliferação do
vírus e consequentemente de doenças relacionadas
ao mesmo, principalmente o câncer do colo de útero.
Introdução: A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é uma
neoplasia de células hematopoiéticas caracterizada
pela proliferação e acúmulo de blastos na medula
óssea. Apesar de todo avanço no tratamento, ainda 20
a 30% dos pacientes sofrem recaída e as causas
dessa falha permanecem desconhecidas. É de grande
importância, portanto, a identificação de novos genes
que possam estar associados às características
biológicas e à resposta ao tratamento da LLA com o
intuito de identificar possíveis marcadores moleculares
de suscetibilidade e prognóstico. Recentemente, a
análise de expressão de RNAs não codificantes tem
se mostrado uma abordagem promissora e
grandemente informativa, principalmente através da
investigação
dos
microRNAs,
entretanto,
pouquíssimos estudos tem buscado alterações de
expressão de outras classes de RNAs não
codificantes, entre esses, as regiões ultra conservadas
transcritas (T-UCRs). Em 2007, um trabalho precursor
sobre o tema, identificou o perfil de expressão das TUCRs característico à leucemia linfóide crônica (LLC)
e aos carcinomas hepatocelular e coloretal.
Posteriormente, a desregulação de alguns UCRs
também foi descrita em neuroblastoma pediátrico, e
em outros tumores, porém, na LLA não foi encontrado
nenhum trabalho que analisa o perfil de expressão de
qualquer UCR. Visto a grande heterogeneidade dessa
patologia e a necessidade de busca alternativa de
novos marcadores, o objetivo do presente trabalho é
analisar a expressão de alguns T-UCRs em amostras
de linhagens celulares de LLA. Metodologia: O
presente trabalho visou fazer a análise da expressão
da expressão das UCRs em linhagens de LLA. Porém,
anteriormente a análise de expressão, foram feitas as
curvas de calibração de cada primer (Uc112, Uc160,
Uc122, Uc316, Uc145, Uc252, Uc198, Uc396, Uc399
e Uc262), a fim de mensurar suas respectivas
eficiências (que deve estar em 100% ou próximo). As
curvas foram construídas a partir de cinco diluições
seriadas, cujo fator de diluição foi de 1:2. Para a
análise de expressão gênica, obteve-se os RNAs das
linhagens, seguida da síntese de cDNA através do kit
SuperScript, incluindo o teste RT menos, onde o
material extraído (RNA total) é submetido à
amplificação afim de garantir que a amostra encontrase livre de DNA contaminante.
A análise da
expressão gênica foi feita através do método de
quantificação relativa por PCR em Tempo Real no
aparelho ABI PRISMTM 7500® (Applied Biosystems,
Foster City, CA, EUA). Como controle endógeno foram
utilizadas as expressões dos genes GUS e HPRT, e a
quantificação obtida pela fórmula 2-ΔΔCt, utilizando
uma amostra de linfócitos saudáveis como calibrador.
Resultados e discussão: Na análise de eficiência de
cada primer, a partir da curva de calibração, obteve-se
uma eficiência de 105,69% para o primer Uc112 e
107,06% para o primer Uc160, o que nos mostra que
os primers apresentam eficiência de amplificação
próxima de 100% e podem ser comparados com os
endógenos (GUS e HPRT) previamente testados.
Outros primers que também tiveram uma eficiência
próxima a 100% foram: Uc122, Uc316 e Uc252, cuja
análise de expressão gênica ainda está em
andamento. Para o primer Uc399 não houve
expressão, mostrando que talvez o gene relacionado
não seja expresso em linhagens de LLA. Os outros
primers (Uc145, Uc198, Uc396 e Uc262) não tiveram
sua eficiência dentro dos parâmetros determinados,
porém serão refeitas as suas curvas de calibração
para comprovar os níveis de eficiência. Na análise de
expressão, os resultados obtidos até o momento
sugerem que há diferenças na expressão de UCRs
em linhagens de LLA das duas regiões analisadas. A
região Uc112 foi encontrada hiperexpressa na
linhagem REH e a região delimitada pelo primer
Uc160 foi encontrada hipoexpressa nas linhagens
REH e 697. Conclusões: Esse é o primeiro indício
que as linhagens de LLA possam apresentar
expressão diferenciada das UCRs, justificando o
aprofundamento dessas pesquisas, que poderão
direcionar a identificação de marcadores moleculares
de resistência a drogas que subsidiem a alocação de
pacientes nos grupos de risco, bem como ajudar no
entendimento da fisiopatologia da LLA, auxiliando na
pesquisa por novos alvos terapêuticos.
Apoio Financeiro: O presente trabalho foi realizado
com o apoio do CNPq (bolsa de iniciação científica de
SOUSA, G.R.) e FAPEMIG (bolsa de iniciação
científica de KODAMA, M.H e auxílio financeiro).
Aplicação de Sensores Nanomecânicos para a
Detecção de Câncer
Mariana A. de Andrade1, Nadja K. L. Wiziack1,2, Lívia
F. Rodrigues1, Matias E. Melendez2, Cristovan
Scapulatempo Neto2, Andre L. Carvalho2, Oswaldo N.
Oliveira Jr.3, Fabio L. Leite1
1. Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) Campus Sorocaba, SP,Brasil.
2. Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular Hospital de Câncer de Barretos, SP, Brasil.
estágio inicial. Dessa forma, a aplicação de sensores
nanomecânicos, mostra-se como uma ferramenta
promissora para a o diagnóstico prévio de doenças
por meio de seus de biomarcadores. Tais sensores
são baseados no tratamento químico e biológico das
superfícies de microalavancas, que através do
estresse tensional das superfícies, gerado por
interações moleculares, produzem um sinal mecânico
detectado por meio da Microscopia de Força Atômica
(AFM). Desse modo, nosso projeto fundamenta-se no
desenvolvimento de um biossensor a partir das
microalavancas de AFM, visando à detecção do
biomarcador p53. Este marcador trata-se de uma
fosfoproteína nuclear que modula a ativação ou
inativação de genes distintos, sendo originada a partir
da expressão do gene TP53. A ativação de p53
começa através de uma série de mecanismos e regula
um grande número de genes que controlam funções
celulares como ciclo celular, reparo do DNA,
senescência e apoptose. A ativação do p53 conduz
freqüentemente a apoptose enquanto a sua inativação
facilita a progressão do tumor. A inativação de
mutações do gene p53 ocorre em mais de 50% dos
cânceres. Tendo em vista a presença da p53 em
diferentes tipos de câncer, bem como na saliva de
pacientes de câncer de cabeça e pescoço, estão
sendo realizadas análises em vitro afim de que seja
avaliada a eficiência do biossensor para a detecção
desse marcador. Nosso sensor foi construído a partir
da funcionalização e imobilização da superfície das
microalavancas de AFM, tendo como resposta o sinal
mecânico de deflexão das microalavancas com base
na interação antígeno-anticorpo. Para detecção do
biomarcador (antígeno) estão sendo utilizados os
anticorpos anti-human monoclonal p53, além das
amostras de linhagens celulares p53+ e p53-.
Pretende-se também, em trabalhos futuros de nosso
grupo, avaliar o potencial de sensores de AFM para
amostras de DNA e miRNA. Dessa forma, o objetivo
geral desse trabalho trata-se de empregar uma nova
técnica de sensoriamento de biomarcadores de câncer
baseada na deflexão de microalavancas de AFM
oriundas da interação específica antígeno-anticorpo.
Tal sensoriamento é caracterizado por sua alta
sensibilidade e especificidade, podendo ser uma
técnica promissora para o diagnóstico precoce de
câncer.
PREVALÊNCIA DO VÍRUS HPV NO CÂNCER DE
COLO UTERINO
Majevski, Mayara N.1
Orientadora: Silva, Juliana O.M.²
1
3. Instituto de Física de São Carlos da Universidade
de São Paulo (USP) - Campus São CarlosSP, Brasil.
Autor para correspondência: [email protected]
No âmbito atual, a ciência visa promover diversas
técnicas de diagnósticos clínicos não invasivos a fim
de que sejam detectadas doenças distintas em seu
Aluna de graduação em Enfermagem das Faculdades
Pequeno Príncipe.
²Docente e Mestranda do curso de graduação em
Enfermagem das Faculdades Pequeno Príncipe.
Introdução: O câncer de colo uterino é o tipo mais
comum nos países em desenvolvimento e a principal
causa
de
morte
por
câncer
entre
as
mulheres.Evidências epidemiológicas consistentes
descrevem o papilomavírus humano (HPV) como
causa necessária para a ocorrência do câncer
cervical. Contudo, apesar da infecção pelo HPV ser a
mais
comum
das
doenças
sexualmente
transmissíveis, apenas uma pequena parcela das
mulheres infectadas pelo vírus desenvolve o câncer, o
que demonstra que apenas a presença do HPV
parece ser insuficiente para o desenvolvimento do
câncer cervical. Já foram identificados cofatores na
gênese do câncer de colo do útero que se somam à
infecção viral tais como, fatores comportamentais,
relacionada ao hospedeiro e relacionada ao vírus.
Objetivos:Desvelar a influência do vírus HPV no
câncer de colo uterino, através da sua genética no
processo
de
carcinogênese.
Método:Revisão
Integrativa com base nas etapas propostas por
Mendes, Silveira e Galvão (2008), com busca de
artigosrealizada na Biblioteca Virtual em Saúde(BVS),
no período de 2010a 2013, utilizando as palavras
chave:neoplasia genética, neoplasia HPV. Foram
capturados07artigos com base nos critérios de
inclusão estabelecidos: somente artigos, idioma
português, relacionados ao tema, desconsiderando os
nãosdisponíveis
online
e
redundantes.
Resultados:Em média transcorrem de 12 a 15 anos
entre o momento da infecção por HPV e o
desenvolvimento do câncer cervical, o que reforça o
padrão de múltiplos estágios no processo de
carcinogênese.Oscofatores na gênese do câncer de
colo
uterinosão
relacionados
aos
fatores
comportamentais (Tabagismo, uso de hormônios
exógenos), relacionados ao hospedeiro (idade,
resposta
imune,
predisposição
genética)
e
relacionados ao vírus (tipo, variante, carga viral e
interação com o genoma). O Papiloma Vírus Humano
pode silenciar a ativação de genes, diminuindo a
defesa do hospedeiro e assim favorecendo a infecção
persistente, além disso, oncoproteínas virais podem
ter a capacidade de modular, direta ou indiretamente o
processo de metilação, silenciando os genes celulares
que poderiam interferir no desenvolvimento tumoral.
Conclusões:Esse estudo demonstra que somente o
HPVnão é responsável pelo surgimento do câncer de
colo uterino, outros fatores comportamentais,
características sociais e genéticas do individuo podem
influenciar no desencadeamento da doença.É
importante ressaltar que a utilização de medidas
preventivas, podemfavorecer o auto cuidado das
mulheres e reduzir o índice de infecção por doenças
sexualmente transmissíveis, sendo de extrema valia,
realizar um serviço de orientação e promoção de
saúde.
Descritores: Neoplasia genética, Neoplasia HPV
Referências:LODI, C.T.C, et al. Metilação genética,
neoplasia intraepitelial cervical e câncer do colo
uterino. FEMINA, 2012.JÚNIOR, S.F.L, et al.
Prevalência dos genótipos do papilomavirus humano:
comparação entre três métodos de detecção em
pacientes de Pernambuco, Brasil.Revista Brasileira
de Ginecologia e Obstetrícia, 2011.FERRAZ, L.C,
SANTOS, A.B, DISCACCIATI, M.G. Ciclo celular, HPV
e evolução da neoplasia intraepitelial cervical: seleção
de marcadores biológicos.Revista do Instituto de
Ciências da Saúde, 2012.
Falhas no Diagnóstico e Diagnóstico Tardio de
Carcinoma Espinocelular de Boca: Relato de
Casos Clínicos
(2014 – Atual)
Autores: Mayara santos de Castro. Marina Lara de
Carli. João Adolfo Costa Hanemann*.
*Currículo
Lattes
do
http://lattes.cnpq.br/3909180953451579
orientador:
O carcinoma espinocelular (CEC) é uma neoplasia
epitelial invasiva com
diferentes graus de
diferenciação e propensão a desenvolver metástases;
corresponde a mais de 90% das malignidades orais e,
apesar dos avanços relacionados à prevenção, ao
diagnóstico precoce e ao tratamento, ainda possui
altas taxas de incidência e de mortalidade globais,
sendo considerado, assim, um problema de saúde
pública. Geralmente acomete o gênero masculino
(relação homem-mulher de 2:1), na quinta e na sexta
décadas de vida, tabagistas e etilistas. Quando
acomete pacientes jovens, não tabagistas e não
etilistas, relaciona-se à predisposição genética e à
ação de agentes biológicos, como o HPV. Pode estar
associado ou ser precedido por lesões potencialmente
malignas. Em estágios iniciais, apresenta-se
clinicamente
como
uma
lesão
leucoplásica,
eritroplásica ou eritroleucoplásica; em estágios
avançados, geralmente, é uma lesão endofítica,
ulceroinfiltrativa com bordas elevadas e endurecidas
ou exofítica, ulcerovegetante. Evidencia-se que a
lesão
fundamental
clássica
do
carcinoma
espinocelular de boca é a úlcera, crônica e nãocicatrizante. Entretanto, outras patologias também
podem ser associadas à presença clínica de uma
lesão oral ulcerada, como doenças infecciosas,
inflamatórias, fúngicas profundas, além de lesões
traumáticas, o que permite associá-lo a vários
diagnósticos diferenciais. Considerando os crescentes
relatos de lesões orais neoplásicas malignas
diagnosticadas e tratadas erroneamente por
cirurgiões-dentistas, este trabalho visa enfatizar as
características
clínicas,
epidemiológicas
e
histopatológicas do carcinoma espinocelular, bem
como identificar os diagnósticos incorretos mais
frequentes, a fim de possibilitar o diagnóstico precoce
e reduzir fatores que possam atrasá-lo. Para isso, será
realizado uma pesquisa bibliográfica, revisando a
literatura atual por meio de artigos, teses, dissertações
e livros de autores relevantes que abordam sobre o
CEC oral. Também serão realizados relatos de casos
clínicos de CEC de boca que foram previamente
tratados como outras patologias. Os atendimentos aos
pacientes ocorrerão no Departamento de Clínica e
Cirurgia, Clínica de Estomatologia, Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal de Alfenas UNIFAL-MG. Espera-se identificar os diagnósticos e
tratamentos incorretos mais frequentes estabelecidos
ao carcinoma espinocelular de boca, bem como
destacar a importância do cirurgião-dentista na
realização do diagnóstico precoce, possibilitando um
prognóstico favorável e reduzindo as taxas de
mortalidade e morbidade dos pacientes.
OBSERVAÇÃO:
Este
trabalho
já
apresenta
conclusões parciais; ainda não foi terminado pois
novos pacientes serão atendidos.
Conhecimento
de
Gestantes
Acerca
da
Importância da Saúde Bucal e Intervenções
Odontológicas Durante a Gravidez
Autores: Mayara Santos de Castro. Daniela Coêlho
de Lima. Leandro Araújo Fernandes.
O tratamento odontológico muitas vezes é evitado ou
adiado no período gestacional. O presente estudo
avaliou a autopercepção das gestantes quanto a
importância da saúde bucal, bem como às
intervenções odontológicas na gestação. Foi aplicado
um questionário semi-estruturado, nos serviços
públicos de saúde da cidade de Alfenas/MG, a 473
gestantes com a faixa etária média de 25,2 anos,
sendo a maioria casada (45,1%) e com ensino médio
completo (36,6%). Os resultados obtidos mostraram
que 62,7% não haviam procurado por tratamento
odontológico durante a respectiva gestação, embora
92% o considerasse importante. Durante as consultas
de pré-natal, apenas 43,3% afirmaram ser alertadas
pelos médicos sobre a importância da própria saúde
bucal e a do bebê. Dentre as entrevistadas, 44%
acreditam ser mais susceptíveis à perderem os dentes
por estarem grávidas; 55,8% acham que os dentes
ficam mais fracos por esse motivo e 50,8% afirmam
não existir relação entre a saúde bucal da mãe com a
do filho. A maioria (58,7%) considera a escovação o
método preventivo anticárie mais eficaz e 92,6%
julgam poder ajudar seu bebê a não ter cárie. Dos
itens relacionados ao tratamento odontológico, as
grávidas associam o exame radiográfico (56%), a
anestesia local (54,1%) e a prescrição medicamentosa
(40%) aos fatores que podem comprometer a saúde
do embrião/feto. Dessa forma, observou-se que as
gestantes apresentam lacunas no conhecimento sobre
a própria saúde bucal e a do bebê, além de
apresentarem estigmas quanto às intervenções
odontológicas neste período. Medidas preventivas e
educativas devem ser implantadas a fim de erradicar
ou minimizar tais desconhecimentos e crenças.
Adenoma Pleomórfico em Fundo de Vestíbulo
Autores: Mayara Santos de Castro, Marina Lara de
Carli, Alessandro Antônio Costa Pereira , Felipe
Fornias Sperandio, João Adolfo Costa Hanemann
Disciplina
de
Estomatologia,
Faculdade
de
Odontologia, Universidade Federal de Alfenas
(UNIFAL-MG), Alfenas-MG.
Paciente do gênero masculino, 34 anos de idade,
leucoderma, foi encaminhado à Clínica de
Estomatologia da UNIFAL-MG, para avaliação e
tratamento de lesão assintomática em maxila direita.
Durante a anamnese, o paciente relatou que a lesão
surgiu há aproximadamente 6 anos e a mesma
apresentou um discreto aumento de volume nesse
período. No exame físico extrabucal, não foram
observadas alterações significativas. À oroscopia,
constatou-se a presença de um nódulo submucoso de
consistência firme, móvel, recoberto por mucosa
íntegra e normocorada localizado no fundo de
vestíbulo superior direito estendendo-se da região do
dente 14 ao 16. As hipóteses diagnósticas foram de
neoplasia mesenquimal benigna e neoplasia benigna
de glândula salivar. Realizou-se a excisão cirúrgica da
lesão e os cortes microscópicos revelaram epitélio
glandular em proliferação e formando estruturas
ductais e espaços císticos, de tamanhos variados e
preenchidos parcialmente por material eosinofílico,
sugestivo de muco e às vezes basofílico, além de
queratina.
Notam-se
células
mioepiteliais
plasmocitoides e redondas em um estroma
colagenizado, com discreto infiltrado inflamatório
mononuclear, vasos sanguíneos dilatados e algumas
áreas condroides. O paciente encontra-se em
proservação em nossa clínica e, 3 meses após o
tratamento, encontra-se sem sinais de recidiva da
lesão.
Palavras-chave: Adenoma Pleomorfo.
Salivares Menores. Patologia Bucal
Glândulas
Avaliação do Estresse Oxidativo em Ratos sob
Enriquecimento Ambiental com Musicoterapia
Nathália Martinez
INTRODUÇÃO:
A
musicoterapia
como
enriquecimento ambiental tem sido utilizada por
produzir efeitos de ordem psicológica e fisiológica,
minimizando o estresse, mantendo o equilíbrio
emocional, diminuindo a ansiedade, equilibrando
alterações na frequência cardíaca, pressão arterial,
entre outros. O excesso de espécies reativas de
oxigênio (EROS) é responsável por causar
peroxidação lipídica e mutagênese, processos que se
resumem no estresse oxidativo. OBJETIVO: Dessa
forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o nível de
estresse oxidativo mensurado bioquimicamente pela
quantificação do Malondealdeído (MDA), e a avaliação
da atividade antioxidante total em equivalência ao
Trolox (TEAC) do soro de ratas fêmeas Wistar
expostas ou não à musicoterapia. RESULTADOS:
Nossos resultados demonstraram aumento do
estresse oxidativo nos animais expostos a
musicoterapia quando comparados ao controle
(p>0,05). No entanto, com relação ao TEAC os
animais expostos a musicoterapia demonstraram
maior poder antioxidante, quando comparado ao
controle (p<0,05) o que pode ser justificado como
resposta ao evento que estes animais foram
submetidos. CONCLUSÕES: Em conclusão, o
presente estudo aponta que, o aumento do estresse
oxidativo nos animais expostos à musicoterapia, foi
superado pelo aumento da capacidade antioxidante,
quando comparados ao controle. Assim os resultados
obtidos nesse estudo fornecem indícios da eficácia da
musicoterapia como agente terapêutico no estresse
oxidativo.
Palavras-chave: Ratas Wistar; Estresse oxidativo;
Musicoterapia
Metabolômica e Imageamento 2d de Tecidos
Tumorais Cerebral por Espectrometria de Massas
Via Desorption Electrospray Ionization (Desi-Ms).
Pedro H. V.,1* Nicolas V. S.,1 Izilda A. C.,2 Marcos N.
E.1
1 Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas
– UNICAMP;
2 Centro Infantil de Investigações Hematológicas Dr
Domingos A Boldrini
A espectrometria de massas (MS) engloba diversas
metodologias sendo que as técnicas de Matrix
Assisted Lazer Desorption-Ionization – Time of Flight
(MALDI-TOF) e Desorpotion Electrospray Ionization
(DESI) se destaca dentro da Patologia através de uma
nova aplicação, o imageamento bidimencional
denominado por Mass Spectrometry imaging (MSI).1
Esta aplicação tem quebrado a barreira entre a
Patologia, Química Analítica e Biologia Molecular uma
vez que analisa tecidos intactos, preservando a
informação quanto à distribuição das biomoléculas.
Adicionalmente elimina alguns passos no preparo das
amostras, como homogeneização e separação,
proporcionando uma economia de tempo e reagentes
para tais procedimentos. Além disso, MALDI-MSI e
DESI-MSI, não necessita de reagentes alvo-específico
na maioria de suas análises, como os anticorpos na
técnica de imunohistoquímica.2 O MSI estuda a
composição biomolecular através do espectro de
massa/carga de cada área de um corte histológico, a
comparação entre os perfis de diferentes amostras
permite identificar diferenças que podem levar ao
descobrimento de novos eventos moleculares da
doença.3 Por DESI foram realizados estudos relatando
diferenças em tumores de cérebro, rim, células
germinativas, bexiga e relatado um biomarcador em
câncer de próstata. Recentemente foi introduzidos
para DESI o uso de combinações de solventes
baseadas em dimetilformamida (DMF), as quais se
comprovaram não-destrutivas em relação à morfologia
dos tecidos analisados.4 Os cortes histológicos
submetidos à análise por MSI podem posteriormente
ser submetidos à coloração por hematoxilina/eosina
(H&E) para analise integrada proteômica-morfológica.
Portanto nosso estudo se baseia na análise
bidimencional por DESI-MSI de tecido cerebral infantil,
afim de identificar biomarcadores lipídicos e assim
poder definir as margens tumorais, auxiliando o
patologista e sua avaliação, uma vez que nem sempre
a diferenciação entre tipos e grau de tumores é
facilmente
realizada.
Figura 1: DESI-MSI de um corte histológico 14 μm de
tumor cerebral (PNET) com bordas de tecido
saudável. As imagens a), b) c) e d) corresponde ao
MSI dos íons m/z 834,189, m/z 598,518; m/z 326,590
e m/z 330,619 respectivamente, onde A corresponde
ao tecido saudável e B tumoral.
Na Figura 1 podemos ver a diferenciação entre o
tecido tumoral e o saudável, pela distribuição espacial
de determinados lipídios, esses biomarcadores podem
ser específicos ou mesmo suas intensidades relativas
ser alteradas devido a atividade tumoral. Esses
resultados preliminares mostram a potencialidade
desta técnica em tecido tumoral infantil assim como
em outros estudos já reportados em adultos. Outros
estudos para diferenciação entre casos de difícil
análise patológica estão sendo realisados.
1
a) E.H. Seeley, K. Schwamborn, R.M. Caprioli.
Imaging of intact tissue sections: moving beyond the
microscope. J Biol Chem. 286, 25459. b) R.G. Cooks,
N.E. Manicke, A.L. Dill, D.R. Ifa, L.S. Eberlin, A.B.
Costa, H. Wang, G. Huang, Z. Ouyang. New ionization
methods and miniature mass spectrometers for
biomedicine: DESI imaging for cancer diagnostics and
paper spray ionization for therapeutic drug monitoring.
Faraday Discuss. 149, 247.c) L.S. Eberlin, C.R.
Ferreira, A.L. Dill, D.R. Ifa, R.G. Cooks. Desorption
electrospray ionization mass spectrometry for lipid
characterization and biological tissue imaging. Biochim
Biophys Acta.
2
K. Schwamborn, R.M. Caprioli. Molecular imaging by
mass
spectrometry--looking
beyond
classical
histology. Nat Rev Cancer. 10, 639.
3
L. S. Eberlin, R. J. Tobshirani, J. Zhang, T. A.
Longacre, G. J. Berry, D. B. Bingham, J. A. Norton, R.
N. Zare, G. A. Poultsides. Molecular assessment of
surdical-resection margins of gastric cancer by massspectrometry imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
2014.
4
N.Y. Agar, H.W. Yang, R.S. Carroll, P.M. Black, J.N.
Agar. Matrix solution fixation: histology-compatible
tissue preparation for MALDI mass spectrometry
imaging. Anal Chem. 2007, 79, 7416.
Análise da Sobrevida em Pacientes Portadores de
Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço
RAFAEL PEREIRA DE SOUZA
UNIVERSIDADE
NOVE
DE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DA
CURSO DE BIOMEDICINA
JULHO,
SAÚDE,
O câncer de cabeça e pescoço é o quinto tipo de
câncer mais comum e a taxa de sobrevida não tem
mudado nos últimos anos. Muitos estudos tem
mostrado a eficácia dos tratamentos terapêuticos
sobre o câncer de cabeça e pescoço, mas poucos têm
examinado a sobrevida global no que diz respeito às
bases de dados. O objetivo deste estudo é investigar
os aspectos epidemiológicos dos tumores de cabeça e
pescoço, em centro de referência oncológico
localizado na cidade de São Paulo, com o propósito
de analisar os valores de sobrevidade desses
pacientes em relação aos relatados na literatura.
Analysis Of Survival In Patients With Head and
Neck Squamous-Cell Carcinoma
The head and neck cancer is the fifth most common
cancer and the survival rate has not changed in recent
years. Many studies have shown the efficacy of
therapeutic treatments on cancer of the head and
neck, but few have examined overall survival with
regard to databases. The aim of this study is to
investigate the epidemiological aspects of tumors of
the head and neck oncology referral center located in
the city of São Paulo, with the purpose of analyzing the
values sobrevidade these patients compared to those
reported in the literature.
2. INTRODUÇÃO
O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
(CECP) apresenta nos dias atuais um grande
problema de saúde pública mundial. Atualmente é o 5º
tipo de câncer mais comum, sendo uma das principais
causas de morbidade e mortalidade em todo mundo. A
sobrevida dos pacientes de cinco anos após o
diagnóstico ainda é baixa, apesar dos esforços
realizados em pesquisa e do progresso nas
estratégias de detecção e terapia. Os principais
fatores de risco para o carcinoma epidermóide de
cabeça e pescoço (CECP) são o tabagismo e o
consumo de bebidas alcoólicas (Hashibe et al., 2009).
Existem evidências de um aumento de risco para os
fumantes na ordem de três a quatro vezes para câncer
da cavidade oral e faringe e dez vezes para câncer de
laringe (Vineis et al., 2004). O risco conferido pelo
álcool também é significativo e o consumo de 50
gramas por dia traduz-se no aumento de
aproximadamente três vezes o risco de câncer de
cavidade oral e faringe e cerca de duas vezes o risco
de câncer de laringe. Juntos, tabaco e álcool são
responsáveis por aproximadamente 51% dos tumores
de cabeça e pescoço nos Estados Unidos, 84% na
Europa e 83% na América Latina (Hashibe et al.,
2009). O consumo combinado entre o cigarro e a
bebida torna o risco ainda maior do que seus efeitos
individuais. Outros fatores de risco são descritos na
literatura, tais como: baixa ingestão de frutas e
vegetais (Boeing et al., 2006; Sapkota et al., 2008) e
infecção por HPV para câncer na orofaringe que
recentemente foi obsevado e está associada a várias
características da doença e tem influência nas taxas
de recorrência e sobrevida (IARC, 2007). Outros
possíveis fatores de risco incluem tabagismo
involuntário (Lee et al., 2008). Mesmo com grandes
esforços e tratamentos multimodais, as taxas de
sobrevida e tempo livre de doença continuam ainda
baixos. O presente estudo tem o objetivo de comparar
os valores de sobrevidade dos pacientes do Instituto
do Câncer Arnaldo Vieira de Carvalho em relação aos
relatados na literatura.
Análise do Potencial Citogenotóxico do Óleo
Essencial de Rosmarinus Officinalis L. no Sistema
Allium Cepa
Rosinete Ferreira1, Nárcia M. F. Nunes2, Dhyôvanna
C. C. Beirão3, e Elisângela C. A. De Oliveira4.
1,2
Discentes do Curso de Licenciatura em Ciências
Biológicas da Universidade Federal do Piauí. [email protected], 3 Discente de Pósgraduação em Morfologia e Genética da Universidade
Federal de São Paulo, 4 Docente do Curso de
Ciências Biológicas da Universidade Federal do Piauí.
A espécie Rosmarinus officinalis L. comumente
conhecida como alecrim, é bastante apreciada pelas
suas propriedades terapêuticas, destacando-se à sua
atividade antioxidante, ação como analgésico,
antirreumático e diurético. Uma das preocupações
atuais da toxicologia genética é a exposição às
substâncias potencialmente perigosas que oferecem
riscos a célula e ao material genético. Neste contexto,
a avaliação genotoxicológica de produtos naturais se
faz necessária, a fim de reduzir ou controlar a
exposição humana a substâncias tóxicas ao DNA.
Portanto o objetivo deste trabalho foi avaliar o
potencial citotóxico e genotóxico do óleo essencial de
Rosmarinus officinalis L. através do bioensaio Allium
cepa. A metodologia de Allium cepa empregada foi
proposta por Guerra e Souzas (2002) com algumas
modificações, e as concentrações utilizadas foram de
750 μg/ml, 243 μg/ml, 81 μg/ml e 27 μg/ml do extrato
da espécie R. officinalis e o testes estatísticos
utilizados foram T Student e Análise de variância
(ANOVA) com valores de p<0,05. Foram analisadas
5.000 células em cada concentração e também para o
controle negativo. Para a análise de citotoxidade foi
calculado o IM (índice mitótico) em que se obteve os
seguintes resultados: Em controle negativo o IM foi de
54,4%; nas concentrações de 750 μg/ml, 243μg/ml, 81
μg/ml, 27% μg/ml o IM foi respectivamente de 5,08%;
7,73%; 7,80% e 8,14%. O óleo essencial da espécie
R. officinalis foi citotóxica em todas as concentrações
testadas, evidenciado pelo aumento ou diminuição do
IM em relação ao controle negativo. Houve ainda
positividade quanto as análises genotóxicas detectado
pelo aparecimento das aberrações cromossômicas
como atrasos, perdas e fragmentos cromossômicos,
dentre outros. Não foi observada a formação de
micronúcleo em nenhuma concentração testada, logo
não pode ser inferido o potencial mutagênico da
espécie. Tomados em conjunto, os resultados obtidos
para a análise do óleo essencial de Rosmarinus
officinalis L. sobre o sistema de Allium cepa apontam
um forte potencial citogenotóxico, porém não
mutagênico do composto, pelo menos no ensaio e
concentrações aqui utilizadas.
Análise Molecular do Polimorfismo rs17782313 do
gene MC4R em indivíduos com Obesidade Infantil.
Identificação de desintegrinas da peçonha de
Bothrops moojeni e influência no processo de
adesão de macrófagos
Samira Spineli
Laboratório de Genética Molecular Humana da
Disciplina de Genética ICBN/UFTM.
Introdução: O índice de obesidade precoce entre
crianças e adolescentes tem aumentado em vários
países onde os maus costumes alimentares e o
sedentarismo prevalecem. Essas características criam
um ambiente obesogênico oportuno para que doenças
de herança multifatorial como a obesidade possam ser
desencadeadas. Dessa forma, a obesidade leva a
manifestação de outras doenças crônicas que podem
gerar complicações ainda maiores na idade adulta.
Dentre
essas
doenças
estão
as
doenças
cardiovasculares, hipertensão, diabetes tipo 2, artrites,
doenças pulmonares e das vias aéreas, apnéia do
sono e alguns tipos de cânceres. Com o avanço da
biologia molecular e de estudos genéticos como o
GWAS, alguns genes candidatos para a obesidade
estão sendo estudados em várias populações. Dentre
esses genes, o MC4R (Receptor de melanocortina-4)
é um forte candidato para obesidade infantil. Esse
receptor faz parte da família dos receptores de
melanocortina e é acoplado a uma proteína G. No
hipotálamo atua na via da leptina-melanocortina e
quando ativado diminui a ingestão de alimentos e
aumenta o gasto energético atuando, dessa forma, na
termogênese. Assim, alguns polimorfismos desse
gene podem levar a disfunções no receptor, alterando
a regulação dessa via e a sensação de saciedade.
Material e Métodos: O estudo foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da UFTM (Protocolo
CEP/UFTM nº1975/2011). O Grupo de estudo (E) foi
composto por 56 pacientes, com média de idade de
11,6 anos (± 2,9), com fenótipo de obesidade infantil
ou sobrepeso, de famílias não relacionadas,
encaminhados pela Disciplina de Endocrinologia e
Metabologia do ICS-UFTM. O grupo controle (C) foi
composto por 57 indivíduos, com média de idade de
14,9 anos (±9,80) que não apresentaram obesidade
infantil e adulta. O DNA genômico dos participantes foi
extraído do sangue periférico pela técnica do fenolclorofómio e, posteriormente, analisado por PCRRFLP. A digestão enzimática foi realizada pela enzima
de restrição BclI e os fragmentos visualizados em gel
de poliacrilamida 15%. Resultados: Não houve
significância estatística entre os grupos investigados
(χ2= 0,796, p= 0,6714). Na regressão logística,
considerando a presença do alelo C e o valor de IMC
entre o grupo de estudo e o controle, a presença do
alelo C não foi estatisticamente significativa (χ2= 1,12,
p= 0,5685; OR= 0,6470; IC=95%). O poder estatístico
da amostra foi de 95% Conclusão: O presente estudo
não mostrou associação do polimorfismo rs17782313
do gene MC4R com obesidade infantil. Os grupos de
estudo e controle encontram-se em Equilíbrio de
Hardy-Weinberg. Não houve associação da presença
do alelo C e o aumento do IMC.
Vanessa Silva Miranda¹, Rafael Destro Rosa Tiveron²,
Renato Ventresqui Oliveira¹, Tony de Paiva Paulino¹,
Rodrigo Magrin de Andrade¹
¹Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba,
MG, Brasil
²Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII,
Barretos, SP, Brasil
As peçonhas das serpentes botrópicas são
constituídas por complexas formas proteicas que
causam vários efeitos biológicos como edema,
hemorragia e incoagulabilidade sanguínea. Estes
efeitos podem ser atribuídos as metaloproteinases da
peçonha de serpentes (SVMPs), um grupo de
moléculas caracterizado pela estruturação dos seus
domínios proteicos, o processamento proteolítico das
SVMPs produz um grupo de polipeptídios, que
possuem um domínio desintegrina, capaz de
associarem-se as integrinas de membrana. Este
trabalho teve como objetivo fracionar a peçonha bruta
(PB) de Bothrops moojeni, identificar a presença de
desintegrinas nas frações proteicas obtidas, e avaliar
sua ação sobre o processo de adesão de macrófagos.
A PB foi fracionada em gel de filtração utilizando
tampão bicarbonato de amônio 0,03 M pH 7,8. A
dosagem de proteínas das frações (Moo1, Moo2,
Moo3, Moo4 e Moo5) foi realizada pelo método do
microbiureto. Um padrão de proteínas (67 a 1,3 kDa)
foi utilizado para identificar a faixa de massas
moleculares das proteínas das frações, a análise do
perfil cromatográfico indicou a presença de peptídeos
na fração Moo4 (≈ 6 kDa), possivelmente
caracterizados como desintegrinas. O teste de adesão
foi realizado com macrófagos obtidos do peritônio de
camundongos C57BL/6J na presença de colágeno I e
fibrinogênio,
os
valores
de
adesão
foram
determinados pela avaliação da viabilidade celular. A
análise estatística do teste de adesão indicou
diferença significativa entre todos os grupos
(P<0.0001), nos grupos tratados com a fração Moo4
somente na presença do fibrinogênio observou-se
uma diminuição na adesão dos macrófagos, indicando
que as desintegrinas presentes nesta fração
interagem com a integrina de ligação ao fibrinogênio,
possivelmente do tipo αIIbβ3, impedindo a adesão dos
macrófagos. Nossos resultados mostram que o
fracionamento da PB em gel de filtração é viável na
obtenção de frações proteicas que contenham
desintegrinas, e que estas interferem no processo de
adesão de macrófagos mediado por fibrinogênio.