Doenças da conformação protéica - Dr. Omar Lupi da Rosa Santos

Doenças da Conformação
Protéica
Omar Lupi da Rosa Santos
Afiliações
INSTITUCIONAIS
Mestre e Doutor em Dermatologia (UFRJ)
Pós-Doutorado em Imunodermatologia
(University of Texas Medical Branch)
Professor Livre-Docente em Dermatologia
(Uni-Rio)
Professor dos Cursos de Pós-Graduação
em Dermatologia da Uni-Rio e PGRJ; e de
Imunologia (UFRJ)
Presidente da Sociedade Brasileira de
Dermatologia (SBD)
Scrapie, 1720
Scrapie
• Scrapie é um quadro
neurológico descrito em
ovelhas
da
Inglaterra,
França e Alemanha desde
o início do século XVIII.
• Ovelhas acometidas passam
a
esfregar
sua
pelagem contra árvores ou
cercas como se sentissem
prurido, dando a doença o
nome 'scrapie'. Em francês
é conhecido como 'La
tremblante', devido aos
tremores e ataxia.
• Trata-se de encefalopatia
espongiosiforme segundo
Hadlow (1953).
CJD e variantes, 1920
Kuru, 1956
Encefalopatias Espongiosiformes
em Humanos
• Grupo de doenças fatais e progressivas caracterizadas
por degeneração espongiosiforme e depósitos amilóides
no cerebelo. Conhecidas desde 1920 pelos trabalhos de
Creutzfeldt e Jakob (CJD)
• Variantes clínicas: Sd de Alper, Sd de GerstmannSträussler-Scheinker (GSS) e Sd insônia progressiva
fatal.
• Doença neurológica fatal e progressiva na tribo Fore de
Papua Nova Guiné com evolução para tremores,
espasmos e catatonia. Conhecida desde 1955 como
kuru (“morte sorridente”) foi correlacionada ao
canibalismo e dizimou a população feminina da tribo.
• Em todas o mesmo substrato patológico de degeneração
espongiosiforme cerebral.
Os trabalhos de Carleton Gajdusek
na elucidação do kuru são uma das
mais brilhantes páginas da ciência
moderna dando a ele o Prêmio Nobel
de Medicina de 1976.
Chronic Wasting
Disease, 1978
Chronic Wasting Disease (CWD)
• Cervídeos colocados em cativeiro com ovelhas com quadro
de scrapie começaram a desenvolver alteraçãoes
neurológicas (Colorado/USA – 1978).
• Acredita-se que alguns deles possam ter voltado à vida
selvagem depois deste período e introduzido o quadro para
os animais em liberdade previamente sadios.
• Nos últimos 30 anos a doença observada em cervídeos,
conhecida como chronic wasting disease, se espalhou por 7
estados americanos e 2 canadenses Há 3 casos de CJD
investigados pelo CDC em caçadores da região que podem
estar ligados ao consumo de carne dos cervídeos.
• Estima-se hoje o acometimento de 100.000 cervídeos em
liberdade no meio-oeste americano sem que as formas de
contágio estejam esclarecidas.
Doença da Vaca Louca/
BSE, 1986
Doença da Vaca Louca/BSE
Milhares de vacas começaram a adoecer no Reino
Unido a partir de 1985, apresentando encefalopatia espongiosiforme e presença cerebral de prions.
Estudos demonstraram que a causa foi o uso de
proteína animal adicionada na dieta para aumentar
a produção de leite
BSE (bovine spongiform
encephalopathy ou “mad-cow disease”).
nvCJD, 1996
Stephen Churchill: 19761995
Se
Seguiram-se outro 106 casos nos próximos anos (1995/2001)
sendo 103 no Reino Unido .......
O que revelou a patologia cerebral?
• Todas as avaliações histopatológicas revelaram
espongiose cerebral muito agressivas, semelhantes
aos casos de kuru.
• Os pacientes afetados são jovens do Reino Unido.
• A doença foi denominada de “nova variante da
doença de Creutzfeldt-Jakob”ou nvCJD.
Outra diferença importante:
Epidemiologia
• Os casos de CJD atingem 1 milhão por ano!
• CJD é randômica em todos os lugares do mundo
No entanto, a nova doença
praticamente só ocorre no Reino
Unido !!
Até hoje praticamente
todos os 107 casos
(95/2002) concentram-se no Reino
Unido (103 casos),
com apenas 1 caso
na França e outro
em Hong-Kong
(100% letal em 15
meses).
A New Variant Creutzfeldt-Jakob
Disease in the UK
R.G. Will, J.W. Ironside, M. Zeidler, S.N. Cousens,
K. Estibeiro, A Alperovitch, S. Poster, M. Pocchiari,
A. Hofman, P.G. Smith
-Western General Hospital, Edinburgh;
Department of Epidemiology and Population
Science, London; London School of Hygiene
and Tropical Medicine, London.
-CJD Surveillance Unit
Lancet Vol. 347, 1996
A análise das amostras
cerebrais pela técnica de
Western-blot…
CJD
nvCJD
BSE
Coolinge at al. Nature 383,
October 24,1996
Transmissions to mice indicate that
‘new variant’ CJD (nvCJD) is
caused by the BSE agent
Moira Bruce, R.G. Will, C.J. Bostock, et.al.
-Institute for Animal Health, Edinburgh UK
-National CJD Surveillance Unit, Western
General Hospital, Edinburgh
-Department of Epidemiology and Population
Science, London School of Hygiene and
Tropical Medicine
Nature Vol. 389,
October 2, 1997
PRODUTOS DE ORIGEM BOVINA
Acidos Graxos
Orgaos Bovinos
Hormonios
Outros
GORDURA
goma mascar
gordura cozinha
PLACENTA
cremes cosmiatricos
Soro fetal bovino
Insulina e glucagon
heparina bovina
OSSOS
refino acucar
implante odonto
Ac GRAXOS
DIVERSOS
plasticos, sabao
SANGUE
Soro bezerros
fertilizantes
tripsina bovina
p/cultura celulas
GLICERINA
prod. dieteticos
xaropes, veiculo creme/pomada
INTESTINO
categute
COLAGENO
implantes
O mundo é um lugar bastante
perigoso de se habitar…
QUEBRANDO O DOGMA
CENTRAL – A HIPÓTESE PRION
Omar Lupi da Rosa Santos
A Hipótese Prion
• Durante anos se procurou um vírus
de ação lenta ou partícula subviral
(virino, plasmídeo) que explicasse o
quadro. No entanto, sempre foi
impossível encontrar qualquer traço
de ácido nucléico (RNAou DNA)
• Em 1967, J Griffiths propôs que proteínas sozinhas poderiam gerar o
quadro sem Ác. nucleicos,
contrariando o “Dogma Básico da
Biologia Moderna: DNA
RNA
Proteínas”.
• Stanley Prusiner, em 1982, cunhou o
nome PRIONS para “proteinaceus
infectious proteins”, caracterizando
um agente infeccioso e transmissível
destituído de ácidos nucleicos.
Tratamento Efeito DNA
Protease
Fenol
Dietilpirocarb
onato (DEP)
Nuclease
RUV (+psoralênicos)
Íons Zinco
Hidroxilamina
Efeito Ptnas
Efeito Prions
Comparação entre Vírus e Prions
Características
Vírus
UVC+Radiação
ionizante
230nm
Inativado
Água Sanitária
pH 10-12 por 30’
Inativado
Ativo
Hidróxido Sódio
[1M] por 30’
Inativado
Ativo
Calor
3600C por 1hora
Inativo
Ativo
Exposição ao
Meio Ambiente
CNTPs fora do
hospedeiro
Minutos-horas
>2 anos
Formaldeído
Inativado
Ativo
Óxido de
Etileno
Inativado
Ativo
Aldeídos
Inativado
Aumenta a
resistência dos
prion ao calor
25-200nm
10pm (1/100)
Tamanho
1nm = 103pm
Prion
Ativo
O isolamento dos Prions
O isolamento da proteína priônica (PrP) de
casos de kuru e CJD também foi obtida no
cérebro de ovelhas apresentando “scrapie”.
Depois se observou que diversos animais
tambem produziam PrP (ratos, hamster,
felinos, gado, etc.
Hoje se sabe que a PrP é uma proteína normal de 30KD, importante
na sinalização transmembrana. É
codificada pelo gene 20p12.3, no
braço curto do cromossoma 20.
PrP celular (PrPc)
PrP scrapie (PrPSc)
FORMA NORMAL FORMA PATOLÓGICA
c
PrP
PrPc
Predominância de Cadeia Alfa
Solúvel em Água
Susceptível à Protease
Localizada na Membrana Celular
sc
PrP
PrPsc
Predominância de Cadeia Beta
Insolúvel em Água
Resistente à Protease
Localização Citoplasmática
PrPsc PrPsc
“Semeadura”
c
PrPsc
c
c sc
PrPPrP
PrP
sc
PrP c PrP
sc
PrPsc PrP
c
PrP
PrP
sc
PrPcPrPscc
PrP
PrP
sc
sc
PrP PrP
PrPsc PrPsc
PrPsc
PrPc
PrPsc
PrPsc PrPsc
PrPsc
PrPsc
PrPsc PrPsc
PrPsc
PrPsc PrPsc
sc sc PrPsc
PrP
PrP
PrPsc PrPsc sc
PrP
PrPsc
Epidemiologia das Doenças
Priônicas
• Mutação Patognomônica no gene PrP
• ~15% do total das Doenças Priônicas em Humanos: 10% CJD, todos os casos de GSS e FFI
• Mas 85% dos casos CJD são casos esporádicos
devido a uma mutação no gene PrP
• Mecanismo: Instabilidade termodinâmica do
PrPC?
• Cerca de 5% dos casos de CJD são iatrogênicos
Transmissão Iatrogênica dos
Prions
• Eletrodos
usados
na
realiza-ção de EEG em
pacientes com CJD, foram
esterilizados
com
formaldeído e álcool e reutilizados, transmitindo a
doença (Goldfarb LG, Annu
Rev Med 1995).
• Transplantes de córnea e
implantes de dura mater
oriundos de pacientes com
CJD transmitiram a doença
em 110 pacientes (Brown
P, Dev Biol Stand 1993)
• A causa mais comum de CJD
iatrogênico foi o uso inadvertido
de hormônio de crescimento
humano oriundo de cadáveres
contaminados (130 casos).
• Quatro casos de CJD após o
uso
de
hormônio
ganadotrópico humano na
Australia (Collinge J, Annu Rev
Neurosci 2001
• CJD
após
o
uso
de
instrumentos neurocirúrgicos
contaminados
em
14
pacientes (Bernouilli C, et al.
Lancet 1997)
PRIONS NA
DERMATOLOGIA
Prof. Dr. Omar Lupi
Texas Medical Center 2001/2002
Prions na Dermatologia
Pammer et al (Am J Pathol 1999; 153 (5): 1353-8) –
Observaram que a pele normal e aquela afetada por
dermatoses diversas (psoríase, ec-zemas e úlceras)
expressam a PrP em grande quantidade sendo, portanto, uma
porta de entrada em potencial para os prions.
Linfócitos e cél. Langerhans (SALT) são os prováveis agentes
propagadores da PrPSc da pele para o SNC, em cobaias.
Considerando a ineficiência das formas habituais de
esterilização na destruição dos prions e o fato de que formas
mais efetivas envolveriam técnicas destrutivas para material
de origem biológica, devemos considerar que alguns produtos
e procedimentos dermatológicos envolvem um risco real de
disseminação das moléstias priônicas nos seres humanos
(Lupi O. J Am Acad Dermatol 2002;46:790-3.).
J Am Acad Dermatol 2002; 46: 790-793
Outros Produtos
Dermatológicos com Risco
Potencial
Colágeno Humano Injetável Derivado de
Bancos de Doação (Dermolagen™,
DermaPlant™, Cymetra™, Alloderm™,
Fascian™) – as empresas devem aplicar
os mesmos procedimentos cuidadosos
utilizados nos bancos de sangue (Carruthers J
& Carruthers A. Arch Dermatol, May 2002).
Toxina Botulínica (Botox™, Dysport™, Myobloc™)
contém albumina humana para estabilizar a molécula
da neurotoxina, impedindo que esta se aglomere nas
paredes do frasco. A albumina utilizada tem como
origem um grupo de doadores humanos monitorados
pelo FDA (Carruthers, 2002).
Um Padrão para Laboratórios no
Mundo Inteiro
• A esterilização é essencial para o
cultivo de células in vitro. O
processo de esterilização se baseia
na autoclavagem, envolvendo altas
temperaturas e pressão. Os meios
de cultura utilizados nas culturas de
células não podem ser esterilizados
deste modo pois são compostos
por aminoácidos, vitaminas, sais
inorgânicos, glicose e plasma,
sendo este último a fonte dos
fatores de crescimento e hormônios.
Laboratórios adicionam soro fetal
bovino (FBS) e soro de bezerros
recém-natos (NCS) a todos os
meios de cultura de células.
VETORES PRIÔNICOS
O scrapie é endêmico na Europa há 200 anos. Muito pouco
se sabe sobre as suas rotas naturais de transmissão. A
transmissão horizontal já foi sugerida para explicar a
disseminação do scrapie para animais sadios (Parsonson
IM, 1996).
Há situações nas quais a doença afeta todo um rebanho
que nunca apresentou nenhum animal doente ou ocorre
em fazendas repopuladas (Schonberger L, 1998).
Rebanhos ovinos sadios passam subitamente a
desenvolver sinais de scrapie se colocados próximos a
pastos com animais infectados, sugerindo que ocorre
transmissão horizontal nas fazendas.
Tais achados tem levado à sugestão, por vários autores,
de que um reservatório natural pode estar presente nestes
locais (Post K et al, Lancet 1999 and Wisniewski H, Lancet
1996).
Int J Dermatol, 42 (6):425-9, 2003.
Post et al alimentaram 16 larvas de
Sarcophaga carnaria, com 2mg de
material derivado de tecido cerebral
de hamster infectado com scrapie ou
cérebros
sadios
usados
como
controle.
A cada 2 dias, larvas e pupas foram
analisadas quanto a presença de
PrPSc. Foi possível detectar a
isoforma anormal em todas as larvas
alimentadas com o material contaminado e em nenhum do grupo
controle.
Dez dias após terem sido alimentadas
com tecido cerebral contaminado, seis
pupas foram dadas como alimento
para 4 hamsters. Dois desenvolveram
sinais clínicos de scrapie após 215
dias e 3 foram positivos para PrPSc.
De outros 8 hamsters alimentados
com larvas infectadas, 5 morreram de
scrapie.
Larva de
Mosca
Post et al (Lancet 1999; 122:
199-204)
Ciclo de Vida da Oestrus Ovis em
Ovelhas
Erosão do osso cribiforme e das estruturas
ósseas nasais
MIÍASE OCULAR
Larva de Oestrus ovis
J Europ Acad Dermatol Venereol,
20 (9): 1037-45, 2006.
Hypoderma bovis é a causa
mais comum de miíase no gado.
A lar-va migra pelo tecido
subcutâneo em direção ao canal
espinhal e gordura epidural (sítio
invernal).
Hypoderma
Bovis
Kelelioglu (J Neurosurg, 1989)
descreveu casos de miíase
cere-bral em humanos causadas
pelo Hypoderma bovis. O
mesmo agente está associado
com miíase cerebral e craniana,
assim como pode perfurar a
esclera para produzir dano
ocular grave (“fly-blown eye”).
Omar MS et al. Ann Trop Med
Parasitol 1988).
A
infestação
decorre
da
implantação acidental dos ovos
na conjuntiva após tempestades
de areia ou outro tipo de trauma.
www.cvm.missouri.edu
MIÍASE OCULAR
Larva de Hypoderma bovis
MIÍASE OCULAR
Larva de Hypoderma bovis
Medical Hypotheses, 65: 47-54, 2005.
Novas Rotas Para as Infecções
Por Prions
Scott e cols (Vet Microbiol
1993; 34 (4): 305-9) confirmaram a possibilidade da
transmissão do scrapie para
camundongos por instilação
de homogenado
cerebral
infectado por prions na
conjuntiva
de
animais
sadios. Dano retiniano é
também um achado comum
entre
os
camundongos
infectados pelo scrapie,
reforçando a importância
desta rota na etiopatogenia
de alguns casos de infecção
por prions.
Sistema
stema Digestivo dos Insetos
Intestino
proximal
Intestino
distal
Digestive sys
Intestino
médio
O tubo digestivo dos insetos tem a extremidadde bucal e uma distal, próxima à cauda do inseto. É dividido em 3 partes distintas,
conhecidas como intestinos proximal, médio e distal. A pesquisa
atualmente está centrada em determinar qual das partes do intestino é crítica na contaminação e se o pH influencia no processo.
Amiloidoses – A Nova
Conexão
Omar Lupi da Rosa Santos
Estrutura Amilóide:
Composição identificada:
Heparan
Sulfato de glicosaminoglicanos
Sulfato de proteoglicanos
Associação
não covalente
Componente amilóide sérico P (SAP):
glicoproteína plásmática não-fibrilar =
amilóide sérico P
Ptnas
Familiares
Pentaxânicas
Classificação:
Adquiridas;
Hereditárias;
Sistêmicas:
- Neoplásicas
- Inflamatórias
- Genética
- Iatrogênica
Localizadas ou limitadas a derminados
órgãos:
- Associadas ao envelhecimento
- Diabetes Mellitus tipo II
AMILOIDOSE SISTÊMICA
AMILOIDOSE MONOCLONAL DE
IMUNOGLOBULINAS DE CADEIA LEVE (AL)
• Complicação de 15% dos casos de gamopatias
monoclonais (pp/ o mieloma múltiplo)
• Fibrilas compostas por cadeias leves de
imunoglobulinas monoclonais (proteína AL).
• Geralmente > 40 anos (média 65 a), H>M.
• Diagnóstico frequentemente tardio porque os
sintomas são inespecíficos.
AMILOIDOSE SISTÊMICA
AMILOIDOSE MONOCLONAL DE
IMUNOGLOBULINAS DE CADEIA LEVE (AL)
• A apresentação clínica de sintomas de Sd do
túnel do carpo (>25%), macroglossia (10% dos
pacientes e causa disfagia dolorosa), lesões
mucocutâneas específicas (>40%), hepatomegalia (50%), esplenomegalia (10%) e edema com
cacifo (secundário a s. nefrótica ou ICC, ambas
presentes em 30%) podem ser indicativos para o
médico de displasia plasmocitária subjacente.
Depósito Amilóide ao Redor de Vasos
A
Adenina
T
Timina
CCitosinG
a
Pares de base
do DNA
A=T
C=G
G
DNA + RNA mensageiro
RNAm
Membrana Nuclear
RNAm no citoplasma
Rna-m
RNAm
RNAt +
Aminoácido
Nova Proteína =
Sequência de
Aminoácidos
NA DÉCADA DE 90 CONSTATOU-SE QUE A FUNÇÃO DE UMA PROTEÍNA NÃO
ESTÁ APENAS RELACIONADA COM SUA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS MAS
MUITO COM A FORMA COM QUE A PROTEÍNA SE DOBRA ESPACIALMENTE!
Amiloidoses Cutâneas
AMILOIDOSE CUTÂNEA LOCALIZADA PRIMÁRIA
• Compreende três formas: maculosa; papulosa (líquen
amilóide) e nodular.
• As fibrilas nas formas maculosa e papulosa não ligam
anticorpos à proteína AA ou pré-albumina (transretina).
• Já a amiloidose nodular pode ser considerada similar ao
plasmocitoma extramedular, pois apresenta fibrilas do
tipo imunoglobulinas AL, parecendo desenvolver-se
como resultado de uma produção local de cadeias leves
aberrantes, produzidas por uma expansão clonal de
plasmócitos.
Int J Dermatol 2008; 47: 1225-1231
Doenças de Conformação Protéica
• Amiloidoses
Sistêmicas
• Amiloidoses
Cutâneas
• Doença de Alzheimer
• Doença de Parkinson
• Doença de
Huntington
• Esclerose Lateral
Amiotrófica
• Diabetes mellitus do
tipo II
• Doença de
Creutkfeldt-Jakob
• Doenças causadas
por prions (kuru,
doença da vaca
louca, etc.)
A Tentativa de Entender Melhor o
Acúmulo Intracelular do Amilóide...
Permitiu descobrir que tão importante quanto a
seqüência de aminoácidos da proteína é a forma
como elas se dobram no citoplasma das células.
Reconhecer quais são os fatores que influenciam
neste processo: pH, temperatura, trauma
Gerou a descoberta de novas organelas celulares
(proteossomos) e substâncias envolvidas neste
processo (Hsp, caspases, chaperones, etc.)
Possibilidades
Pós-síntese
Protéica
Controlado pela
própria sequência de
aminoácidos e pelos
fatores ambientais
Proteassomos, Hsp, Chaperones e
outros nomes pouco amistosos…
São os mecanismos de defesa das
células contra proteínas mal
dobradas
Localizam e marcam proteínas defeituosas
(mal dobradas);
Destroem as proteínas que se dobram
erradamente (misfolding);
Redobram (refolding) as proteínas que
podem ser recuperadas
Excretam da célula os restos destas proteínas defeituosas
Este Conhecimento Abriu Novas
Perspectivas Terapêuticas...
PLoS Biol. 2007 Oct 2;5 (10): 268
Algumas perguntas que faltam ser
respondidas sobre amiloidose e
prions:
1. Somente as amiloidoses e os prions são, ao
mesmo tempo, doenças herdadas e
transmitidas. Como isto pode ser explicado?
2. Será que as amiloidoses podem ser
transmitidas com os prions?
3. Como explicar que a amiloidogênese se
pareça tanto com a forma de replicação de um
vírus?
Amiloidose Sistêmica Hereditária
4) Transtirretina = + freqúente
- Ptna que transporta a tiroxina
- Polineuropatia Amilóde Familiar
( neuropatia periférica e autonômica)
- Portugal: substituição da Val por
Met na posição 30
- Dinamarca: substituição da
Leu por Met na posição 111 =
cardiopatia grave
Polineuropatia que começa por volta dos 47 anos nos MMSSs, fraqueza muscular
generalizada aos 49 anos e restrição à cadeira de rodas por volta dos 51 anos.
Incontinência de todos os esfíncteres, incluindo a pupila.
Medical Hypotheses, 67: 1027-33, 2006.
Algumas perguntas que faltam ser
respondidas sobre amiloidose e
prions:
1.
Somente as amiloidoses e os prions são, ao
mesmo tempo, doenças herdadas e transmitidas =
prions e amilóides parecem seguir um padrão de
transmissão de informação analógico (proteíco) e
não digital (DNA/RNA)
2. Será que as amiloidoses podem ser transmitidas
com os prions?
3. Como explicar que a amiloidogênese se pareça
tanto com a forma de replicação de um vírus?
Uma Descoberta Desconcertante...
PNAS, 2002, 99 (10): 6979-6984.
Transmissão de Amiloidose
Sistêmica de forma Experimental
• Amiloidose AA hepática foi induzida em roedores após a
injeção de AgNO3 (Pras M e cols. J Clin Invest, 1968).
• Material do fígado com amiloidose foi retirado e
centrifugado. Depois foi injetado EV em 16 roedores e
dado por via oral, por 15 dias, a outro grupo de 9
animais.
• Todos os que receberam a injeção EV e 8 em 9 dos
expostos por VO desenvolveram amiloidose hepática no
período de 16 dias.
• O grupo controle, tratado da mesma forma mas com
extrato de fígado de animais sadios, não desenvolveu
amiloidose em nenhum caso.
Lundmark et al. PNAS, 2002, 99 (10): 6979-6984.
Lupi O, Peryassu MA. Prions 2007; 1 (4): 1-5.
Algumas perguntas que faltam ser
respondidas sobre amiloidose e
prions:
1.
Somente as amiloidoses e os prions são, ao mesmo
tempo, doenças herdadas e transmitidas = prions e
amilóides parecem seguir um padrão de transmissão de informação analógico (proteíco) e não digital
(DNA/RNA).
2. Será que as amiloidoses podem ser transmitidas com
os prions? Sim, já foi realizado algumas vezes
3. Como explicar que a amiloidogênese se pareça
tanto com a forma de replicação de um vírus?
?
Virus Self-assembly
Omar Lupi, Paula Dadalti, Eduardo Cruz, Clyde Goodheart
Editorial Convidado com Prof. Clyde Goodheart. Medical Hypothesis 2007; 69: 724-30
Uma droga anti-Hipertensiva de
Ação Central (Agonista de
Receptores α2-Adrenérgicos)...
PLoS One 2008; 3 (4): 1981.
Duas Drogas (Guanabenzeno e
Tacrina) com Ação anti-Prion...
PLoS One 2008; 3 (5): 2174.