Aminoglicosídeos e penicilinas: avaliação da sinergia "in vitro"

AMOUNI MOHMOUD MOURAD
AMINOGLICOSÍDEOS E PENICILINAS: AVALIAÇÃO DA
SINERGIA “IN VITRO” PARA Enterococcus sp
Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação
da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de
Doutora em Ciências da Saúde.
SÃO PAULO
2012
AMOUNI MOHMOUD MOURAD
AMINOGLICOSÍDEOS E PENICILINAS: AVALIAÇÃO DA
SINERGIA “IN VITRO” PARA Enterococcus sp
Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação
da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de
Doutora em Ciências da Saúde
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Eitan Naaman Berezin
Coorientação: Profª Dra Suely Mitoi Ykko Ueda
SÃO PAULO
2012
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Mourad, Amouni Mohmoud
Aminoglicosídeos e penicilinas: avaliação da sinergia “in vitro” para
enterococcus sp./ Amouni Mohmoud Mourad. São Paulo, 2012.
Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Eitan Naaman Berezin
Co-Orientador: Suely Mitoi Ykko Ueda
1. Aminoglicosídeos 2. Penicilinas 3. Enterococcus sp 4.
Sinergismo farmacológico
BC-FCMSCSP/65-12
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu esposo, Mohamad, e meu filho, Youssef,
pelo amor, paciência e compreensão me apoiando e incentivando
nessa fase tão importante da minha vida.
Dedicatória
AGRADECIMENTOS
Na tese de doutorado, tive a oportunidade de constatar que para realizála, apesar de ser processo individual que um doutorando está destinado, esse
trabalho reuniu contribuições de várias pessoas. Portanto este trabalho não teria
sido possível sem a ajuda de muitas pessoas às quais agradeço o apoio dado.
Agradeço primeiramente a DEUS, que iluminou meu caminho me dando
saúde e condições para realização desse trabalho.
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e à
Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, por todo apoio.
Inicio com meu mais profundo e sincero agradecimento a todas as pessoas
que contribuíram para a concretização desta tese.
Meus sinceros e profundos agradecimentos pela imensa colaboração da
banca do Exame de Qualificação bem como pela participação dos membros da
banca examinadora da defesa.
Meu agradecimento a Profa. Dra. Lycia Mara Jenne Mimica, da Faculdade
de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, Departamento de Ciências
Patológicas, que acreditou em mim aceitando-me como sua orientanda,
possibilitando meu ingresso no programa de doutorado.
À Profa. Dra. Suely M. Y. Ueda, que me apresentou o Programa de
Doutorado da FMSCSP me indicando para a Dra. Lycia e aceitou ser minha
Coorientadora, não existem palavras capazes de expressar minha imensa
gratidão pela confiança, empenho e principalmente por entender e permitir que
eu concilie o doutorado com minha vida profissional, me atendendo sempre que
precisei acompanhando o meu trabalho passo a passo, demonstrando ser uma
grande amiga.
Agradeço ao Prof. Dr. Eitan Naaman Berezin, por ter assumido minha
orientação, com o trabalho já em andamento, quando minha orientadora
precisou se ausentar.
Agradecimentos
Agradecimento a equipe do Laboratório da Disciplina de Microbiologia do
Departamento de Ciências Patológicas da Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP), em especial para técnica e amiga Suzethe,
que teve uma dedicação impar aos meus experimentos
Agradecimento especial ao suporte dado pela Secretaria da Pós-Graduação
composta por profissionais de extrema competência, que fazem seu trabalho
com responsabilidade, atenção e um carinho que faz o diferencial num setor tão
importante para nós pós-graduandos, milhões de obrigadas para Mirtes, Sonia e
Daniel.
Ao Prof. Dr. Roberto Rodrigues Ribeiro, pela atenção, preocupação,
amizade e compreensão nos momentos que precisei me ausentar para cumprir
meus compromissos do Doutorado, e pelas palavras de incentivo sempre que
percebia meu desânimo.
À Diretoria do CRF-SP, que em 2011 entenderam a necessidade de me
licenciar do CRF-SP Dra. Raquel Cristina Rizzi, Dr. Pedro Menegasso, Dra.
Margarete
Akemi
Kishi,
Dr.
Marcelo
Polacow,
meu
reconhecimento
e
agradecimento.
A Prof. Dra. Yoshimi I. Imoto, pela sua paciência incondicional e sua
compreensão nos momentos que precisei me ausentar do curso de Farmácia do
Mackenzie demonstrando ser uma grande amiga.
A
amiga
Profa.
Margarete
Akemi
Kishi,
por
todo
seu
carinho
e
disponibilidade em me ajudar a qualquer momento e que certamente teve um
papel decisivo na finalização dos meus créditos no programa do doutorado.
A minha amiga irmã Dra. Solange Brícola, pelo incentivo, apoio e pela
ajuda em todo momentos desse trabalho, que mesmo quando muito atribulada e
passando por uma fase de tristeza imensurável não me faltou por nenhum
momento, não tenho palavras para expressar meu reconhecimento pela sua
dedicação.
A minha aluna, orientanda e amiga Bruna Kogici, minha “fiel escudeira”
por toda sua dedicação.
Agradecimentos
Aos meus colegas de trabalho do CRF-SP e do Mackenzie, pela torcida para
que eu alcance meu objetivo, que embora não esteja citando os nomes de cada
um para não ser injusta e esquecer o nome de alguém e saliento que, graças à
Deus, são muitos e podem ter certeza que cada palavra, cada gesto de apoio
estão na minha memória e no meu coração.
A minha adorável família, sem a qual jamais conseguiria chegar onde
estou. A Minha querida mãe Khadige, cuja presença é fundamental para seguir
meus objetivos, pois sofre os meus sofrimentos e se realiza com minhas
realizações,
Meu querido pai Mohamad, que fisicamente não está mais entre nós, mas
que permeia cada momento de minha vida; “saudades”.
Minha amada irmã que na realidade é mais do que irmã, é minha
companheira e cúmplice de todos os momentos, certamente sem a racionalidade,
praticidade e inteligência dela eu teria muitas dificuldades em toda minha vida,
pois ela sempre tem a palavra certa no momento certo, minha balança do
equilíbrio meu alicerce.
Aos meus irmãos Salim, Saad, Said e Caled, minhas cunhadas Eptisam,
Salua, Abir e Cida, meus sobrinhos Riyemi, Rhaifa, Mohamad, Juliane, Amini,
Nasser e Mayra, pelo carinho e amizade.
Ao meu querido filho, minha verdadeira razão de vida, certamente sem
seu amor, dedicação apoio não estaria aqui escrevendo essa tese, você é minha
inspiração, meu orgulho, meu incentivo, meu amor por você não tem limite; sua
bondade incondicional, sua alegria e empenho em qualquer projeto que você
engaje é um exemplo a ser seguido, meu querido filho, na minha vida você se
equipara ao ar que respiro. Meu eterno amor para você Youssef.
Chegou o momento de agradecer a pessoa que possibilitou toda minha
trajetória profissional, que sem o menor egoísmo apoiou todos meus passos, me
incentivando nos momentos de cansaço e fraqueza, me consolando nos
momentos de tristeza, comemorando minhas alegrias e vitórias, meu querido
esposo um verdadeiro companheiro de todos os momentos. Te amo Mohamad.
Agradecimentos
A experiência não é o que acontece a um homem.
É o que um homem faz com o que lhe acontece.
(Thomas Jefferson)
Citação
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC
American Type Culture Collection
CBM
Concentração Bactericida mínima
CDC
Center for Disease Control and Prevention
CIF
Coeficiente de Inibição Fracionada
CIM
Concentração Inibitória Mínima
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
CSF
Líquido cerebrospinal
EI
Endocardite infecciosa
ESBL
β-lactamases de espectro ampliado
EV/IV
Endovenosa ou intravenosa (IV)
FCMSCSP Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
IM
Intramuscular
ICC
Insuficiência cardíaca congestiva
OMS
Organização Mundial da Saúde
R
Resistente
RNAm
Ácido ribonucléico mensageiro
S
Sensível
Μg
Micrograma
SIRS
Síndrome da resposta inflamatória sistêmica
TSB
Caldo Triptona de Soja ou Tryptic Soy Broth
UFC/mL
Unidades formadoras de colônia por mililitro
UNICEF
United Nations International Children's Emergency FundFundo Internacional de Emergência das Nações Unidas para
a Infância
VRE
Enterecoccus resistente à vancomicina
Abreviaturas e Símbolos
Abreviaturas e Símbolos
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ...............................................................................................
1
1.1- Justificativa .....................................................................................................
3
1.2- Pneumonia .....................................................................................................
3
1.3- Endocardite.....................................................................................................
4
1.4- Sepse..............................................................................................................
5
1.5- Meningite.........................................................................................................
6
1.6- Enterococcus sp.....................................................................................
7
1.7- Tratamento......................................................................................................
8
1.8- Mecanismos de Ação......................................................................................
10
1.8.1- Aminoglicosídeos.........................................................................................
11
1.8.1.1- Gentamicina .............................................................................................
14
1.8.2- β- lactâmicos................................................................................................
14
1.9- Sinergismo e antagonismo de ação dos antimicrobianos...............................
16
1.10- Associação....................................................................................................
17
1.11- Resistência bacteriana..................................................................................
18
1.12- Resistência aos antimicrobianos na Endocardite..........................................
18
2.
OBJETIVOS....................................................................................................
20
2.1- Objetivo geral. ................................................................................................
21
2.2- Objetivos específicos......................................................................................
21
3.
21
1.
MATERIAL E MÉTODO..................................................................................
3.1- Local e período de estudo..............................................................................
22
3.2- Comitê de ética...............................................................................................
22
3.3- Delineamento de estudo.................................................................................
22
3.4- Linha de pesquisa...........................................................................................
23
3.5- Método............................................................................................................
23
3.5.1- Avaliação Microbiológica..............................................................................
23
3.5.2- Prova para a determinação da atividade bactericida...................................
24
3.5.3- Concentração bactericida mínima (CBM)....................................................
25
3.5.4- Prova para a combinação de antimicrobianos.............................................
25
3.5.4.1- Ensaio do tabuleiro - Checkerboard Method.............................................
26
3.5.4.2- Ensaio do tabuleiro - Checkerboard modificado......................................
28
3.5.4.3- Leitura dos resultados...............................................................................
31
3.5.4.4- Determinação do Coeficiente de Inibição Fracionada (CIF).....................
32
Sumário
3.5.4.5- Interpretação dos resultados.....................................................................
33
3.5.5- Análise Estatística........................................................................................
33
3.5.6- Levantamento bibliográfico..........................................................................
34
4.
RESULTADOS...............................................................................................
35
4.1- Cultura de células de Enterococcus sp isoladas no laboratório da disciplina
de Microbiologia do Departamento de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo (FCMSCSP) em caldo (meio TSB) com concentrações decrescentes de
ampicilina (0,2; 0,1; 0,05 e 0,025mg/mL)...............................................................
36
4.2- Atividade bactericida da ampicilina após culturas em meio Mueller-Hinton..
36
4.3- Cultura de Enterococcus sp isoladas no Laboratório da Disciplina de
Microbiologia do Departamento de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo (FCMSCSP) em caldo (meio TSB) com concentrações decrescentes de
gentamicina (0,2; 0,1; 0,05 e 0,025 mg/mL)...........................................................
37
4.4- Atividade bactericida da gentamicina após cultura em meio Mueller-Hinton.
37
4.5- Associação de ampicilina e gentamicina, nas mesmas proporções e em
doses decrescentes (0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125 mg/mL)........................................
38
4.6- Atividade bactericida da associação de ampicilina e gentamicina após
cultura em meio Mueller-Hinton..............................................................................
38
4.7- Inibição e crescimento bacteriano com relação ao número de tubos com
concentrações decrescentes de ampicilina e gentamicina (adicionada após
intervalos de 5 minutos) (0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125 mg/mL)..................................
39
4.8- Atividade bactericida da associação de ampicilina e gentamicina
(adicionada após intervalo de 5 minutos) após cultura em meio Mueller- Hinton
39
4.9- Comparação da ação bactericida e bacteriostática da penicilina ..................
40
4.10- Comparação da ação bactericida e bacteriostática da gentamicina............
40
4.11- Comparação da ação bactericida e ação bacteriostática da associação
entre ampicilina + gentamicina...............................................................................
41
4.12- Comparação da ação bactericida e ação bacteriostática da associação
entre ampicilina + gentamicina, com intervalo de 5 min.........................................
41
5.
DISCUSSÃO...................................................................................................
42
6.
CONCLUSÃO.................................................................................................
48
7.
ANEXOS.........................................................................................................
50
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................
56
FONTES CONSULTADAS....................................................................................
61
RESUMO................................................................................................................
63
ABSTRACT ..........................................................................................................
65
LISTAS E APÊNDICE...........................................................................................
67
Sumário
1. INTRODUÇÃO
2
A utilização de antimicrobianos é um recurso de extrema importância no
ambiente hospitalar, principalmente nos centros ou unidades de terapia intensiva,
porém, como em qualquer classe medicamentosa, não podemos minimizar o
problema que pode ser gerado em consequência de interações medicamentosas,
nem sempre benéficas ou maléficas.
Interação medicamentosa é um fenômeno clínico em que os efeitos de um
fármaco são alterados pela presença de outro fármaco, fitoterápico, alimento,
bebida ou outros agentes. A incidência de reações adversas causadas por
interações medicamentosas é sempre uma condição a ser esclarecida(1).
Sinergismo é um fenômeno farmacológico obtido a partir da associação de
dois ou mais medicamentos, cuja resultante é maior do que simples soma dos
efeitos isolados de cada um deles(2).
Além dos riscos decorrentes de interações entre medicamentos com
medicamentos podem ocorrer também interações entre os medicamentos com
alimentos, tendo em vista que alguns alimentos interferem consideravelmente em
alguns mecanismos na absorção de alguns antibióticos como é o caso da
tetraciclina com leite e derivados gerando complexação, que nos reporta a um alerta
referente ao uso inadequado de antibióticos que tem despertado grande
preocupação em relação a resistência antimicrobiana que pode em algumas
condições ser decorrente de interações medicamentosas(2).
Considerando que a resistência bacteriana é preocupação mundial, sendo
objeto das atuais publicações sobre antimicrobianos, os antibióticos constituem os
principais medicamentos que influenciam não apenas o paciente em tratamento,
mas todo ecossistema onde ele está inserido, com importantes repercussões(3).
O uso de mais do que um medicamento no tratamento de doenças
infecciosas é um tema controverso. A terapia combinada é utilizada empiricamente
no tratamento de infecções graves, quando um só antimicrobiano não é suficiente
para cobrir todos os possíveis patógenos envolvidos na infecção. Isso ocorre em
alguns tipos de pneumonia, sepse, endocardite e meningite(4).
Introdução
3
1.1- Justificativa
A realização desse trabalho se deve ao fato das infecções bacterianas
demonstrarem ser cada vez mais difíceis de tratar sendo que uma das possíveis
causas de falha terapêutica pode ser uma provável interação medicamentosa entre
os antibióticos, a partir dessa preocupação achamos interessante fazer um confronto
de experimentos “in vitro” baseado no disposto na literatura sobre inativação química
dos aminoglicosídeos e penicilinas, quando administrados conjuntamente versus
prática clínica que consolida o sinergismo entre esses antibióticos(4).
Baseado na importância de estabelecer protocolos de tratamentos com
antimicrobianos para minimização de falhas terapêuticas no uso de associações de
antibióticos, a nossa intenção nesse trabalho foi avaliar a viabilidade de
disponibilizar um método rápido e simples de identificação de possíveis interações
medicamentosas nas diversas doses disponíveis.
As endocardites que são de difícil tratamento, a administração de
aminoglicosideos e penicilinas são realizadas conjuntamente visando aumentar o
potencial terapêutico induzindo sinergismo de ação entre as drogas.
Portanto os experimentos são avaliados de acordo com a resposta obtida nas
diversas concentrações propostas e a partir dos resultados que refletem o efeito de
sinergismo ou antagonismo e o efeito bactericida ou bacteriostático, de acordo com
a dose da associação dos antibióticos utilizados, pode-se definir um suporte
laboratorial para orientação das doses desses medicamentos e do efeito esperado
“in vitro”, porém “in vivo” a avaliação será clínica.
1.2- Pneumonia
A pneumonia nosocomial é a pneumonia mais comum em unidades de terapia
intensiva, sendo a ventilação mecânica um fator fortemente associado ao seu
desenvolvimento(5).
Introdução
4
A pneumonia nosocomial ou comunitária é de grande interesse para estudos
referentes a opções medicamentosas, porém para o adequado tratamento é de
suma importância a identificação do agente etiológico da pneumonia, sabendo-se
que a população vulnerável para o desenvolvimentos da mesma são as crianças, a
partir daí vale ressaltar que as infecções respiratórias agudas representam uma
causa mundialmente importante de morbidade e mortalidade na infância,
particularmente nos países em desenvolvimento. As infecções graves do trato
respiratório inferior, principalmente as que acometem a faixa etária inferior aos cinco
anos de idade, são as maiores determinantes dessa mortalidade. Uma estatística
preocupante é a incidência anual de pneumonias em crianças menores de cinco
anos, que é de 30 a 40 casos a cada 1.000 na Europa e na América do Norte. Nos
países em desenvolvimento, as pneumonias na infância não são apenas mais
comuns, mas também são mais graves, causando maior mortalidade(6).
Assunto preocupante são os dados da Organização Mundial da Saúde (OMS)
os quais mostram que, na última década, cerca de um terço da mortalidade mundial
em crianças (4 a 5 milhões de óbitos anuais) foi causada por infecções respiratórias
agudas. O Fundo para as Nações Unidas para a Infância (UNICEF) estima que mais
de três milhões de crianças morrem de pneumonia a cada ano, predominantemente
nos países em desenvolvimento(6).
1.3- Endocardite
A endocardite infecciosa se trata de uma doença provocada por uma infecção
microbiana na superfície endotelial valvar, podendo desencadear uma rotura de
valva e embolia séptica com suas consequências.
Endocardite é uma doença caracterizada por inflamação ou infecção da
superfície interna do coração (endocárdio). Endocardite comumente afeta as
válvulas cardíacas, mas também podem envolver áreas não valvular ou dispositivos
mecânicos que são implantados no coração, tais como válvulas cardíacas artificiais,
pacemakers, ou desfibriladores implantáveis(7).
Introdução
5
A endocardite representa então uma doença com um perfil variável e
dinâmico, com mudanças profundas nos últimos anos. A preocupação em obter o
máximo de conhecimento sobre esta doença tem crescido ultimamente e a
participação da ecocardiografia, sempre associada à clínica, se torna cada vez mais
essencial para seu diagnóstico. Atualmente para obter resultados mais fidedignos ao
diagnóstico do paciente os aparelhos atuais tem uma melhor acurácia. (8).
A população susceptível a risco da Endocardite Infecciosa consiste em
pacientes com problemas de saúde associado a infecções (adquiridas durante a
hospitalização ou após procedimentos invasivos decorrentes de complicações
diversas), pacientes idosos com prótese valvular e pacientes submetidos a
hemodiálise, pacientes imunodeprimidos (9).
1.4- Sepse
A sepse é uma condição clínica complexa causada pela resposta inflamatória
sistêmica descontrolada do indivíduo, de origem infecciosa, caracterizada por
manifestações múltiplas, e que pode determinar disfunção ou falência de um ou
mais órgãos ou mesmo a sua morte(10).
O choque séptico é uma doença na qual, como resultado da sepse, a tensão
arterial baixa a um nível tal que pode pôr a vida em perigo(11) e é uma das causas de
morte cada vez mais frequente em unidades de terapia intensiva do mundo todo,
tendo os seguintes fatores contribuintes para o seu surgimento: a crescente
população de idosos [maior que sessenta e cinco (65) anos]; a maior sobrevida de
diversas doenças debilitantes; o emprego mais frequente de técnicas invasivas
(cateteres vesicais, tubos endotraqueais, cateteres intravasculares); o cuidado de
maior número de pacientes imunossuprimidos e as infecções hospitalares(12).
O tratamento inicial adequado dos estados de choque é de importância capital
para minimizar a incidência de disfunção de múltiplos órgãos e morte. As variáveis
fisiológicas frequentemente utilizadas na fase inicial da ressuscitação incluem a
pressão arterial, frequência cardíaca e débito urinário(13).
Introdução
6
O diagnóstico da síndrome séptica é clinico baseado nas alterações que
constituem a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS). Foi definida em
1991, pelo American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine
Consensus Conference Committee, como um conjunto de pelo menos duas das
seguintes manifestações: a) febre ou hipotermia; b) taquicardia; c) taquipneia; d)
leucocitose ou leucopenia. É condição aguda ocasionada pela liberação sistêmica
de mediadores inflamatórios e ativação generalizada do endotélio, gerando quebra
da homeostase com comprometimento e disfunção de órgãos distantes do foco
primário. Reflete o grau de estresse orgânico associado a diversas condições
clínicas como: trauma, queimaduras, pancreatite aguda grave, intervenção cirúrgica,
terapia transfusional e infecção. Quando a SIRS é secundária à infecção, o
diagnóstico é sepse. A sepse é considerada grave quando há pelo menos uma
disfunção orgânica associada e, se persistir hipotensão apesar da administração
hídrica vigorosa, trata-se de choque séptico(14).
1.5- Meningite
Processo inflamatório das meninges, membranas que envolvem o cérebro. A
meningite pode ser causada por diversos agentes infecciosos, como bactérias, vírus
e fungos, dentre outros, e agentes não infecciosos (Secretaria da Saúde do Estado
de Goiás, 2012)(15).
A identificação da meningite pode ocorrer através da tríade de sintomas: dor
de cabeça, rigidez do pescoço e sensibilidade excessiva a luz. É difícil de ser
identificada em crianças pequenas, portanto outras características devem ser
investigadas(16).
Pode servir como alerta para identificar a meningite bacteriana os sintomas
mais comuns em crianças e adultos como febre, dor de cabeça e sensibilidade a
luz(17).
Introdução
7
Porém para os adultos é comum manifestação de rigidez no pescoço, febre e
alterações mentais que estão entre os sinais e sintomas mais comumente
reportados em adultos com meningite bacteriana(18).
Os sintomas são um indicativo para se pesquisar mais detalhadamente a
instalação dessa doença tendo em vista que a meningite bacteriana pode ser fatal
sem o tratamento. O sucesso do mesmo depende do diagnóstico preciso e do
tratamento com antibióticos precocemente. Salienta-se que alguns fatores como
infecções por HIV, má nutrição e resistência bateriana dificultam o tratamento da
meningite bacteriana(19).
O diagnóstico pode ser obtido através de Exames de sangue como contagem
total de leucócitos e concentração de eletrólitos são parâmetros limitados para o
diagnóstico da meningite bacteriana. A contagem total de leucócitos na circulação
periférica está geralmente aumentada devido a neutrofilia, mas pode estar reduzida
no caso de infecções graves. A glicemia também deve ser verificada para auxiliar na
interpretação dos resultados da análise do Fluido Cerebro Espinhal(18).
Os resultados das culturas de sangue necessitam de ao menos 24 horas para
se tornarem disponíveis, portanto, não pode contribuir para a estratégia inicial de
diagnóstico. No entanto, os resultados do teste podem ser úteis, especialmente
quando o Fluido Cerebro Espinhal não foi obtido antes do início do tratamento com
antibióticos e quando terapia empírica demonstrou falhas(19). Além dessas
determinações seria importante utilizar um critério de diferenciaçao da meningite
viral e bacteriana utilizando o critério quimiocitológico.
1.6- Enterococcus spp
Enterococcus sp, anteriormente descritos com Streptococcus do grupo D de
Lancefield: existem 12 espécies no gênero enterococos, no entanto apenas dois são
mais importantes para a endocardite. Enterococcus faecalis são responsáveis por
85% e Enterococcus faecium são responsáveis por 10% de todos os casos de
endocardite por enterococos. Fazem parte da microbiota intestinal e são possíveis
Introdução
8
causas de infecção do trato urinário. São responsáveis de uma forma geral, 15% de
todos os casos de endocardite em valva nativa e também 15% dos casos de
endocardite em valva protética(20).
E. faecalis e E. faecium são membros naturais da microbiota digestiva em
humanos, variando em concentração bacteriana (102 a 108/g de conteúdo digestivo)
de indivíduo para indivíduo e ao longo do trato gastrointestinal(21).
Os enterococos são amplamente distribuídos na natureza, fazendo parte da
microbiota humana, em especial no trato gastrointestinal, bem como em indivíduos
normais podem ser isolados em outras localizações como a pele, canais biliares,
secreções de orofaringe e vagina(22).
Enterococos não são particularmente virulentos quando comparados com
outros microorganismos da microbiota intestinal(23,24). Entretanto, sua capacidade de
causar doenças em pacientes imunocomprometidos, recém-nascidos e idosos
hospitalizados tem levado ao reconhecimento de sua importância na etiologia de
infecções hospitalares, entre as quais urinárias, bacteremias, endocardites e
septicemias neonatais(25,26).
1.7- Tratamento
O tratamento ótimo exige o sinergismo das penicilinas associadas ao
aminoglicosídeos, é uma associação que se demonstrou sinérgica contra algumas
cepas susceptíveis de enterococos tendo em vista que são bactérias resistentes as
cefalosporinas, oxacilina e aos aminoglicosídeos de forma isolada. Algumas cepas
são altamente resistentes, mesmo as penicilinas e a vancomicina(20).
A terapia antibacteriana depende da ação de um fármaco em matar ou
impedir o crescimento de bactérias sem prejudicar o hospedeiro(27); por esse motivo
essa propriedade recebe o nome de toxicidade seletiva(28).
Portanto, quando se emprega o tratamento antimicrobiano, como no caso da
antibioticoterapia, deve-se considerar os fatores cruciais para a quimioterapia
Introdução
9
antibacteriana que consistem na concentração inibitória mínima (CIM) e na
concentração bactericida mínima (CBM) do fármaco contra determinado microorganismo. A CIM para determinado sistema de cultura refere-se à menor
concentração da droga capaz de inibir o crescimento bacteriano. A CBM refere-se à
menor concentração da droga capaz de matar pelo menos 99,9 por cento dos microorganismos em cultura(27).
É de suma importância que, na escolha de um agente antimicrobiano, seja
considerado se o seu uso está realmente indicado. A ação reflexa de associar a
febre a infecções tratáveis e de prescrever uma terapia antimicrobiana sem
avaliação mais minuciosa é irracional e potencialmente perigosa(29).
Para minimizar o uso irracional de antibióticos a abordagem aconselhada
consiste em estabelecer um diagnóstico etiológico direto pelo isolamento do agente
bacteriano ou pela caracterização indireta pela pesquisa de antígenos ou de
anticorpos contra provável agente infeccioso. Caso isso não seja possível devido a
urgência
da
situação,
convém
obter
amostras
apropriadas
para
exame
bacteriológico, efetuar uma estimativa clinicamente baseada no micro-organismo
responsável e iniciar o tratamento com o antibiótico “supostamente melhor”(27).
Muitos antibióticos possuem efeito pós-antibiótico, ou seja, continuam
exercendo efeito antimicrobiano após o declínio de suas concentrações plasmáticas
para valores inferiores à CIM. Quase todos os antibióticos possuem um efeito pósantibiótico contra micro-organismos Gram-positivos, porém os aminoglicosídeos
também exibem efeito pós-antibiótico contra micro-organismos Gram-negativos; isso
significa que para as infecções causadas por micro-organismos Gram-negativos, os
aminoglicosídeos são eficazes quando administrados apenas uma vez ao dia,
reduzindo, dessa maneira, o risco de efeitos adversos; por outro lado, os antibióticos
β-lactâmicos precisam ser administrados a cada quatro ou seis horas para manter
concentrações plasmáticas acima da CIM durante a maior parte possível do intervalo
entre as doses(27).
Os antibióticos são utilizados de três maneiras gerais: terapia empírica,
definitiva e preventiva ou profilática. Quando utilizado como terapia empírica ou
inicial, o antibiótico deve proporcionar uma cobertura contra a maioria dos patógenos
Introdução
10
prováveis, visto que os micro-organismos infectantes ainda não foram identificados.
Pode-se utilizar uma terapia de combinação ou, de preferência, um tratamento com
um único agente de amplo espectro. Entretanto, uma vez identificado o microorganismo infectante, deve-se instituir a terapia antimicrobiana definitiva, com um
agente de espectro estreito e baixa toxicidade para completar o tratamento(29).
A escolha do antibiótico adequado depende de diversos fatores, dentre eles: o
espectro da atividade bacteriana, a resistência bacteriana, a farmacocinética, os
efeitos adversos e interações farmacológicas, evidências clínicas da eficácia do
fármaco, sinergismo com outros antibióticos (terapia de combinação) e a capacidade
de atingir o tecido infectado em concentração apropriada(27).
As combinações de antibióticos podem produzir um efeito antibacteriano
maior do que a soma das suas atividades independentes, fenômeno conhecido
como sinergismo(30).
1.8- Mecanismos de Ação
Os agentes antibacterianos, quando testados “in vitro”, são bactericidas (isto
é, matam bactérias) ou bacteriostáticos (isto é, interrompem o seu crescimento).
Alguns fármacos são bactericidas contra determinados micro-organismos, porém
bacteriostáticos contra outros(27).
Para que uma droga seja considerada bactericida é necessário que a mesma
tenha acesso a célula-alvo e que provoque alterações irreversivelmente letais na
bactéria(28).
Para um composto químico ser um agente antimicrobiano ideal, ele deve ser
capaz de destruir ou inibir muitas espécies de micro-organismos patogênicos, de
preferência o maior número de espécies diferentes. A inibição dos micro-organismos
deve ser de maneira que evite o desenvolvimento de formas resistentes, não
produzir efeitos colaterais indesejáveis no paciente, não eliminar os microorganismos do microbioma normal e ser solúvel nos fluidos corporais(31).
Introdução
11
Antibióticos biostáticos, por sua vez, modulam negativamente a atividade de
síntese de proteínas ou de ácidos nucleicos, o que mantém a célula do microorganismo numa dada fase do ciclo celular com o impedimento de que a mesma
prossiga a divisão celular e seja conduzida a senescência(28).
Os mecanismos de ação dos antimicrobianos podem ser divididos em quatro
grupos: antibióticos que atuam sobre a parede celular, antibióticos que atuam sobre
a membrana citoplasmática, antibióticos que atuam sobre a síntese dos ácidos
nucléicos e antibióticos que atuam na síntese de proteínas(28).
1.8.1- Aminoglicosídeos
O grupo dos aminoglicosídeos inclui dentre outros a gentamicina, a
tobramicina, a amicacina, a netilmicina, a canamicina, a estreptomicina e a
neomicina(29). Nesta classe são incluídos tanto os antibióticos aminoglicosídeos que
são formados por grupamentos aminos ligados a glicosídeos quanto outros que
contêm grupamentos de ciclitol ou aminociclitol e não de aminoaçúcar (como os
aminoglicosídicos). São geralmente substâncias básicas, capazes de formar sais
cristalinos e hidrossolúveis, como cloridratos e sulfatos. Os aminoglicosídeos são
preparados na forma de sulfatos(32). Consistem em dois ou mais aminoaçúcares
unidos por ligação glicosídica ao núcleo de hexose, que habitualmente se encontra
numa posição central. Essas moléculas tratam-se de policátions, cuja polaridade é
responsável, em parte, pelas propriedades farmacocinéticas compartilhadas por
todos os membros desse grupo(29), vide figura 1.
Introdução
12
Figura 1- Estrutura Molecular da Gentamicina(2).
Os aminoglicosídeos são usados basicamente para tratar infecções causadas
por bactérias aeróbias Gram-negativas; interferem na síntese proteica em microorganismos sensíveis.
Os aminoglicosídeos difundem-se através dos canais aquosos formados por
proteínas do tipo porina na membrana externa das bactérias Gram-negativas e,
desse modo, penetram o espaço periplasmático(28).
O mecanismo de ação dos aminoglicosídeos consiste em uma fase
dependente de energia, na qual o transporte dos aminoglicosídeos através da
membrana citoplasmática depende de um potencial elétrico. Essa fase 1 limita a
velocidade e pode ser inibida por cátions bivalentes, pela hiperosmolaridade, por
redução do pH e por condições anaeróbias(29).
A fase II, dependente de energia, ainda é pouco compreendida, mas acreditase estar ligada à ruptura da estrutura da membrana citoplasmática. Essa
desorganização progressiva do envelope celular, bem como de outros processos
celulares vitais, pode ajudar a explicar a ação letal dos aminoglicosídeos. Uma vez
no interior da célula, os aminoglicosídeos ligam-se a polissomas e interferem na
síntese de proteínas ao induzir leituras incorretas e interrupção prematura da
tradução do RNAm (ácido ribonucleico mensageiro)(29).
O principal local intracelular de ação dos aminoglicosídeos é a subunidade
30S dos ribossomos, que consiste em 21 proteínas e uma única molécula 16S de
Introdução
13
RNA (ácido ribonucleico). Os aminoglicosídeos rompem o ciclo normal de função
ribossômica ao interferir, pelo menos em parte, na iniciação da síntese de proteínas,
levando ao acúmulo de complexos de iniciação anormais(29).
A gentamicina é indicada para o tratamento de infecções causadas por
Estreptococcus do grupo viridans, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella
sp, Enterobacter sp, Proteus sp e Pseudomonas aeruginosa, nas infecções graves,
como por exemplo, septicemia aguda, pielonefrite aguda, pneumonia, infecção do
trato biliar, infecção do trato urinário e endocardite (27).
A dose intramuscular ou intravenosa típica recomendada de sulfato de
gentamicina para adultos de 3 a 5mg/kg/dia, sendo 33% administrado a cada oito
horas quando se utiliza um sistema de múltiplas doses diárias. A dose única diária é
de 5 a 7mg/kg, administrada durante 30 a 60 minutos para pacientes com função
renal normal. Pode ser necessário utilizar o limite superior dessa faixa posológica
para obter níveis terapêuticos em pacientes com traumatismo ou queimaduras, com
choque séptico e outros cuja depuração do fármaco é mais rápida ou cujo volume de
distribuição é maior do que o normal. As concentrações plasmáticas máximas variam
de 4 a 10µg/mL (dose: 1,7 mg/kg, a cada 8h) e de 16 a 24µg/mL (dose: 5,1 mg/kg,
1vez/dia). Embora não se tenha estabelecido exatamente qual a concentração
plasmática tóxica, as concentrações mínimas que continuamente ultrapassam
2µg/mL têm sido associadas à toxicidade(29).
Dentre os principais efeitos adversos dos aminoglicosídeos, pode-se citar a
ototoxicidade, pois atua sob as funções mediadas pelo oitavo nervo craniano,
causando perda de audição e vertigem, além de necrose nos túbulos renais,
produzindo diminuição da função glomerular. Sua toxicidade pode ser explicada pela
afinidade dos aminoglicosídeos pelas células renais e sensoriais do ouvido
interno(33). Estudos realizados em animais e em seres humanos documentaram a
ocorrência de um acúmulo progressivo desses fármacos na perilinfa e na endolinfa
da orelha interna(29). A ototoxicidade é, em grande parte, irreversível e resulta da
destruição progressiva das células sensoriais, vestibulares ou cocleares que são
altamente sensíveis à lesão causada pelos aminoglicosídeos(29).
Introdução
14
Como a incidência de nefrotoxicidade e de ototoxicidade está relacionada
com a concentração com que o aminoglicosídeos se acumula, é de suma
importância reduzir a dose de manutenção desses fármacos em pacientes como
comprometimento da função renal(29).
1.8.1.1- Gentamicina
A gentamicina caracteriza-se por atividade sinérgica com as penicilinas,
cefalosporinas e polimixinas e antagonismo com as tetraciclinas e com o
cloranfenicol. Atua sobre Gram-positivos, Gram-negativos e micobactérias. Não é
droga eletiva para o tratamento de infecções por Gram-positivos, por causa da
existência de antibióticos mais específicos, mas tem atividade sobre estreptococo,
estafilococo e pneumococo.
Sua principal indicação é contra bacilos Gram-negativos, especialmente
enterobactérias e P. aeruginosa, sendo pequena sua atividade contra cocos Gramnegativos (meningococos, gonococos). Não age contra anaeróbios.
Indicações adicionais: combinada às penicilinas de ação antipseudomonas,
para o tratamento de infecções graves causadas por P. aeruginosa, em outra
localização que não o trato urinário, como bacteremia, endocardite e para o
tratamento inicial de otite externa maligna(20).
1.8.2- β - lactâmicos
As penicilinas formam, ao lado das cefalosporinas, dos monobactâmicos e
das carbapenemas, o grupo dos antibióticos β-lactâmicos clássicos(31) caracterizado
por três aspectos estruturais em comum: estrutura β-lactâmica condensada,
carboxila livre e um ou mais grupos amino convenientemente substituídos na cadeia
lateral(32).
Algumas penicilinas são sintetizadas integralmente pelos fungos do gênero
Penicillium, como as penicilinas G e V; outras são sintetizadas a partir do ácido 6Introdução
15
amino-penicilânico,
modificado
(31)
previamente
produzido
pelo
fungo
e
posteriormente
.
As penicilinas semi sintéticas apresentam vantagens sobre as naturais e são
mais prontamente absorvidas e mais estáveis(31).
Figura 2 - Estrutura Molecular da Ampicilina(32).
As penicilinas são pós cristalinos brancos ou ligeiramente amarelados de
natureza fortemente dextrorrotatória conforme figura 2. A maioria das penicilinas é
empregada na forma de sais de sódio, potássio ou outros, todos hidrossolúveis(32).
Os antibióticos β-lactâmicos atuam no nível da parede celular, interferindo na
síntese da camada de peptídeoglicanos, na etapa que se passa externamente à
membrana citoplasmática na qual estão presentes proteínas fixadoras de penicilinas
(Protein Binding Penicilin ou PBP) participantes da terceira etapa desta síntese. A
função de cada uma dessas proteínas é conhecida e sabe-se que podem funcionar
como transglicosidases, transpeptidases e carboxipeptidases. Os antibióticos βlactâmicos interferem na síntese do peptídeoglicano através de vários mecanismos e
estes não são idênticos, entretanto, não obstante a existência de vários mecanismos
de ação, todos os antibióticos β-lactâmicos bloqueiam a etapa final da síntese da
camada de peptídeoglicano, o que quase sempre resulta na morte da bactéria,
quando esta se encontra na fase de divisão(31).
Introdução
16
1.9- Sinergismo e antagonismo de ação dos antimicrobianos
Sabendo-se que o sinergismo e o antagonismo dos antimicrobianos podem
levar a prejuízos farmacoterapêuticos, a importância desse estudo é a indicação da
terapia de associação mais eficaz, diminuindo o risco de algum tipo de interação
entre
os
medicamentos
que
inviabilize
a
resposta
terapêutica
esperada,
considerando que muitas associações de antibióticos são realmente prejudiciais
como o caso de penicilinas e aminoglicosídeos que quando associados geram
neutralização química (2).
Devido a conflitos quando na literatura se fala em neutralização química
decorrente da associação de aminoglicosídeos e penicilinas, e o sucesso da
associação de alguns aminoglicosídeos e alguns penicilínicos na prática clínica,
decidimos realizar o trabalho para avaliar a duas correntes existentes na literatura.
Assim iremos contribuir com os diversos protocolos para o tratamento das infecções
onde são associadas várias drogas para o tratamento dos pacientes e que muitas
vezes ao invés de auxiliar na cura e dar segurança ao prescritor para o tratamento
da infecção do paciente podem estar aumentando a quantidade de efeitos adversos
ou para a falha terapêutica por um provável mecanismo de interação farmacológica
antagônica, salientando que os resultados demonstrados refletem dados “in vitro” e
não “in vivo” (30).
Os dados laboratoriais obtidos no estudo proposto contribuem para
elucidação do paradoxo terapêutico entre resultados in vitro com a prática clínica,
visando uma administração melhor dos medicamentos e contribuindo para o uso
racional de antibióticos e prevenção da indução de resistência bacteriana na
população, bem como disponibilizar um método prático e simples da avaliação de
sinergismo ou antagonismo da ação dos antibióticos.
Introdução
17
1.10- Associação
Os aminoglicosídeos nunca devem ser misturados na mesma solução com
penicilinas, visto que a penicilina inativa em grau significativo o aminoglicosídeos(29).
Para o tratamento da endocardite por Enterococcus sp, o tratamento empírico
preconizado pelos manuais de cardiologia em endocardite infecciosa (EI):
• Penicilina Cristalina 18 a 30 x 106 U/ 24h EV em infusão continua ou de 4/4 horas
+ Gentamicina 1mg/Kg 8/8h por 4 a 6 semanas.
• Alternativa: Ampicilina 12g/24h divididas em seis doses de 4 /4h + Gentamicina na
mesma dose.
• Nos casos de alergia a penicilina, a cefalosporina não é substituto eficaz. Deve
ser feito então Vancomicina 30mg/kg a cada 24h, divididas em duas doses com
dose máxima de 2g/dia + Gentamicina na mesma dose descrita por 4 a 6
semanas 1mg/kg 8/8h.
• Gentamicina pode ser substituída por Estreptomicina 9,5mg/kg IM ou IV 12/12h,
caso o organismo seja sensível(20).
A combinação de dois ou mais antibióticos pode ser necessária para:
a) avaliar o tratamento das infecções mistas nas quais nem todos os microorganismos tem a mesma susceptibilidade aos antimicrobianos;
b) prevenção ou retardo do desenvolvimento de resistência bacteriana a um
antibiótico;
c) possibilidade da utilização de doses não tóxicas de dois antibacterianos quando
são necessárias doses tóxicas de apenas um deles;
d) quando a terapêutica combinada pode ser mais eficaz contra um micro-organismo
do que a monoterapia(43).
Introdução
18
1.11- Resistência bacteriana
Um assunto de suma importância é a resistência de bactérias aos antibióticos
disponíveis e clinicamente se tornou um problema de saúde pública em todo
mundo(34).
Apesar de muito utilizados, nem sempre os antibióticos são empregados
corretamente. Considerar que o uso desses medicamentos não se limita à escolha
do medicamento, mas a outros aspectos, como dose diária, via de administração,
intervalo entre as doses e tempo de duração do tratamento pode-se concluir que a
falha na observação de qualquer dessas etapas no tratamento com antimicrobianos
pode ser um causador de resistência bacteriana(35).
Devido ao uso irracional de antimicrobianos e a administração empírica,
vários problemas de resistência microbiana surgiram como um novo desafio para a
terapêutica, causando elevados índices de mortalidade. Dentre os grupos de microorganismos relacionados a infecções resistentes destacam-se: Staphylococcus
aureus resistente à meticilina e Staphylococcus aureus resistente à vancomicina,
Enterococcus sp resistentes a diferentes classes de antimicrobianos, Streptococcus
pneumoniae
resistente
à
penicilina,
Klebsiella
pneumoniae
resistente
a
carbapenemase, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanii resistentes
aos carbapenêmicos e ainda as enterobactérias produtoras de β-lactamases de
espectro ampliado.
1.12- Resistência aos antimicrobianos na Endocardite
Quando se fala em resistência bacteriana, constituindo-se em um grande
desafio, destaca-se o gênero Enterococcus sp que representa um grupo de
bactérias complexo, com uma importância elevada ao nível da sua interação com os
seres humanos(36). Enterococcus sp são frequentes no trato intestinal de animais de
sangue quente.
Introdução
19
Os aumentos significativos de bactérias com múltiplas resistências a
antibióticos observadas em vários sistemas aquáticos podem ter um grande impacto
ao nível da saúde humana, uma vez que as infecções provocadas por estes
organismos são usualmente difíceis de tratar sem o recurso da medicação(36).
A relevância das infecções enterococicas deve-se especialmente ao seu nível
elevado de resistências intrínsecas e adquiridas a antibióticos, especificamente, as
infecções nosocomiais com cepas multirresistentes(37).
Introdução
20
2. OBJETIVOS
21
2.1- Objetivo geral
Verificar a ação antimicrobiana isolada e simultânea, “in vitro” da gentamicina
e da ampicilina sobre as cepas de Enterococcus sp.
2.2- Objetivos específicos
1- Obtenção da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração
bactericida mínima (CBM), isoladamente e em associação, da gentamicina e da
ampicilina nas cepas Enterococcus sp.
2- Obtenção do Coeficiente de Inibição Fracionada (CIF) da associação entre
gentamicina e da ampicilina nas cepas Enterococcus sp.
Objetivos
22
3. MATERIAL E MÉTODO
23
3.1- Local e período de estudo
Este trabalho foi realizado no período de fevereiro 2011 a março de 2012 no
Laboratório da Disciplina de Microbiologia do Departamento de Ciências Patológicas
da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP) e no
Laboratório de Ciências Farmacêuticas - CCBS da Universidade Presbiteriana
Mackenzie – UPM.
Os testes microbiológicos foram realizados no Laboratório da Disciplina de
Microbiologia do Departamento de Ciências Patológicas da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo.
A determinação do CIF foi feito no Laboratório de Ciências Farmacêuticas CCBS da Universidade Presbiteriana Mackenzie – UPM.
3.2- Comitê de ética
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê Científico do Departamento de
Ciências Patológicas da FCMSCSP (Apêndice I), sendo desnecessária a elaboração
e aplicação do TCLE (Termo de Consentimento Livre Esclarecido) por não ser
realizado estudos nos seres humanos.
3.3- Delineamento de estudo
Este trabalho consiste na realização de uma pesquisa experimental de caráter
prospectivo sobre associação de antibióticos.
Casuística e Método
24
3.4- Linha de pesquisa
Resistência bacteriana.
3.5- Método
Foram utilizadas 50 cepas de Enterococcus sp armazenadas na bacterioteca
do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Patologia da Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP). Foi utilizado um
inóculo de 0,5 da escala de Mc Farland, ou seja, 1,5 x 108 UFC/mL (unidades
formadoras de colônia por mL) para a realização dos testes.
Os frascos utilizados contendo ampicilina sódica, pó liofilizado 1g, da marca
Nova Farma, nº de lote: 0090448 e validade junho de 2013, foram obtidos no
comércio local.
Utilizamos frascos contendo gentamicina 40mg/mL, ampola contendo 1mL, da
marca Schering–Plough, nº de lote 107 e validade julho de 2014, também obtidos no
comercio local.
De acordo com as boas práticas e procedimentos operacionais padrão
(POP’s) todos os materiais utilizados apresentavam-se dentro do prazo de validade
bem como os equipamentos apresentavam-se calibrados e validados conforme
normas e padrões para utilização.
3.5.1- Avaliação Microbiológica
Foram
utilizadas
50
cepas
de
Enterococcus
sp,
determinando
as
concentrações inibitórias mínimas (CIM) da ampicilina e gentamicina isoladamente,
bem como determinado as CIM da associação dos dois antibióticos.
Casuística e Método
25
3.5.2- Prova para a determinação da atividade bactericida
As indicações para a determinação da atividade bactericida são restritas as
infecções graves, comprometimento dos mecanismos de defesa do hospedeiro ou
infecções localizadas em um local de difícil acesso para o antibiótico, como é o caso
das osteomielites, meningites e septicemias em pacientes neutropênicos(38).
Para os Enterococcus sp tratados somente com penicilina há uma grande
discrepância entre as concentrações inibitórias e letais e é devido a este fato que a
adição de um outro antibiótico, no caso um aminoglicosídeo, se faz necessária para
o sucesso do tratamento. Este fenômeno é comum para os enterococos. E o
reconhecimento destas cepas é de vital importância para o sucesso terapêutico(40).
Outro fenômeno onde ocorre a indicação da realização da determinação da
atividade bactericida é a tolerância. Este fenômeno ocorre nos estafilococos e nos
enterococos onde são encontradas discrepâncias entre a CIM e CBM(39).
O
termo
tolerância
tem
sido
utilizado
quando
combinações
entre
antimicrobianos e micro-organismos produzem inibição sobre o crescimento das
bactérias, mas não a eliminação dos patógenos. Ocorre principalmente com
antibióticos beta-lactâmicos e bactérias Gram positivas. A definição operacional de
cepa tolerante refere se a um isolado para o qual o ponto final da CBM representa
cinco ou mais diluições maiores que a CIM, com uma relação CBM/CIM > 32, após
24h de incubação(40).
A tolerância pode estar relacionada com o fenômeno paradoxal ou de Eagle,
onde o aumento da concentração do antibiótico resulta em menor morte do
patógeno, ao contrário do aumento esperado da atividade bactericida(41).
O fenômeno de persistência ocorre quando uma pequena fração de células
resistentes persiste mesmo quando a atividade bactericida é alcançada. As cepas de
enterococos podem expressar o fenômeno paradoxal, tolerância, ambos ou nenhum.
Este fato faz com que as infecções graves causadas pelos enterococos devam ser
tratadas com o uso combinado de beta-lactâmicos e aminoglicosídeos(42).
Casuística e Método
26
3.5.3- Concentração bactericida mínima (CBM)
É a menor concentração de um fármaco, expressa em µg/mL que produz a
morte de 99,9% das células bacterianas avaliadas. Utilizamos uma série com seis
tubos de determinação de CIM e placas de Agar Muller-Hinton no qual foram feitos
subcultivos. Concentrações decrescentes de antibiótico foram colocadas nos tubos
de número dois a cinco, inoculadas com Enterococcus sp na escala 0,5 de
MacFarland, 1,5 x 108 UFC/mL e incubadas por 24h. Após 24h observou-se o
crescimento das bactérias através da observação da turvação nos tubos(39).
O tubo n° 1 só continha antibióticos, controle negativo, e o tubo n° 6 só
continha bactérias, controle positivo. Foram realizados subcultivos de todos os tubos
em meio de Agar Muller-Hinton e avaliado o desenvolvimento das colônias. A placa
onde houve uma redução de 99,9% do inóculo foi considerada a correspondente a
CBM e o tubo onde não houve a turvação, foi considerada como sendo a CIM.
3.5.4- Prova para a combinação de antimicrobianos
A combinação de dois ou mais antibióticos pode ser necessária para
avaliação de tratamento das infecções mistas, prevenção de eventos de resistência
bacteriana, adequação de doses menores na associação para evitar doses tóxicas
numa monoterapia.
Há quatro tipos de interações que podem ser observadas neste ensaio:
1) Autônoma ou indiferente: o resultado com duas drogas é igual ao obtido apenas
com aquela mais eficaz.
2) Antagônica: o resultado com duas drogas é significativamente pior do que a
melhor resposta individual.
3) Aditiva: o resultado com duas drogas é igual a ação combinada de cada uma
utilizada separadamente.
4) Sinérgica: o resultado com duas drogas é significativamente melhor do que a
resposta aditiva(44).
Casuística e Método
27
A ação sinérgica é observada em situações onde:
a) os antibióticos atuam em sequência ou em diferentes níveis para inibir a síntese
da parede bacteriana ou bloquear o metabolismo bacteriano;
b) a captação dos aminoglicosídeos pelas células bacterianas é aumentada pelos
antibióticos beta-lactâmicos;
c) quando um membro da combinação inibe a atividade da beta-lactamase
bacteriana(45).
A penicilina facilita a entrada do aminoglicosídeo na célula bacteriana. O
efeito sinérgico depende da sensibilidade da bactéria a quantidades crescentes de
aminoglicosídeos. Muitas espécies de enterococos possuem enzimas que inativam
os aminoglicosídeos sendo a gentamicina menos susceptível a inativação. As provas
de sinergia são difíceis, trabalhosas e pouco práticas(39).
3.5.4.1- Ensaio do tabuleiro – “Checkerboard method”
O termo "checkerboard" refere-se ao padrão (de tubos, ou poços, micropoços
ou ágar chapas) formado por várias diluições dos dois antimicrobianos a serem
testados, em concentrações iguais, acima e abaixo de suas CIMs contra os
organismos testados(46).
Esse método utiliza concentrações decrescentes para cada antimicrobiano
ampicilina e gentamicina.
Também está incluída uma linha (ou coluna) de tubos ou poços para cada
droga isoladamente. Assim, o tabuleiro de xadrez composto de colunas em que cada
tubo contém a mesma quantidade de antibiótico (fármaco A) sendo diluídos ao longo
do eixo X e filas no qual cada tubo, contém a mesma quantidade do fármaco
(fármaco B) a ser diluído sobre o eixo Y. O resultado é que cada quadrado do
tabuleiro, que representa um tubo ou poço, contém uma combinação única dos dois
Casuística e Método
28
fármacos testados. As diluições dos antimicrobianos testados são normalmente
realizadas em caldo Tryptic Soy Broth (TSB), de modo que o consumo do fármaco,
contendo soluções, podem ser misturadas com o consumo médio do fármaco livre
para produzir a concentração final designada no diagrama(46).
As concentrações iniciais de ampicilina e gentamicina utilizadas para o estudo
foram de 0,4 mg/mL. Foram utilizados tubos de ensaio com capacidade para 10 mL
e colocados 8 mL de antibiótico com concentração inicial de 0,4 mg/mL no tubo de
número um. Nos tubos de número dois a dez foram colocados 4 mL de solução
salina para a diluição dos antibióticos. Pipetou-se 4 mL da solução contida no tubo
um para o tubo dois, agitando-se o mesmo para que tivéssemos a diluição da droga
pela metade de maneira homogênea. O mesmo procedimento foi realizado para os
tubos de três a dez. Do tubo dez foram desprezados 4 mL da solução final. Todos os
tubos da série de diluição dos antibióticos tinham um volume final de 4 mL Os tubos
com ampicilina foram nomeados de A a F e os tubos com gentamicina de um a seis,
vide Quadro 1.
Quadro 1- Diluição dos antimicrobianos utilizados no teste de associação dos
antimicrobianos em doses seriadas decrescentes.
Amostra
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Concentração
1/1
1/2
¼
1/8
1/16
1/32
Ampicilina (A)
A
B
C
D
E
F
Gentamicina (G)
1
2
3
4
5
6
No método do tabuleiro de xadrez foi utilizada uma série contendo 36 tubos.
Foram colocados nos tubos de n° um ao n° seis (tanto horizontal quanto
verticalmente), 500µL de caldo contendo 1,5 x 108 UFC/mL de Enterococcus sp. Em
cada tubo foram colocados 250µL do antibiótico ampicilina 0,4 mg/mL (nos tubos de
A a F) ou gentamicina (nos tubos de 1 a 6) conforme esquema mostrado nos
quadros 1 e 2. O volume final de cada tubo foi de 1 mL. Após 24h e 48h de
incubação a 37±2ºC em estufa, foi feita a homogeneização do conteúdo dos tubos e
observou-se a turvação, que representa o crescimento dos micro-organismos. Esta
turvação foi classificada em intensidade que variou de 0 até quatro cruzes(4+),
Casuística e Método
29
conforme ilustrado no Quadro 2. Nesta etapa foram observadas as CIM dos
antibióticos (46).
Quadro 2 - Esquema de realização do tabuleiro.
Tubo A1
Tubo A2
Tubo A3
Tubo A4
Tubo A5
Tubo A6
Tubo B1
Tubo B2
Tubo B3
Tubo B4
Tubo B5
Tubo B6
Tubo C1
Tubo C2
Tubo C3
Tubo C4
Tubo C5
Tubo C6
Tubo D1
Tubo D2
Tubo D3
Tubo D4
Tubo D5
Tubo D6
Tubo E1
Tubo E2
Tubo E3
Tubo E4
Tubo E5
Tubo E6
Tubo F1
Tubo F2
Tubo F3
Tubo F4
Tubo F5
Tubo F6
Após a avaliação do crescimento bacteriano, foram realizados subcultivos em
placas de Agar Muller-Hinton que foram incubadas em estufa a 37±2ºC durante 24h
para avaliar a CBM.
3.5.4.2- Ensaio do tabuleiro – “Checkerboard” modificado
No método do checkerboard modificado foi utilizada uma série contendo seis
tubos. Foram colocados 500µL de caldo contendo 1,5 x 108 UFC/mL de
Enterococcus sp nos tubos de dois a seis, sendo que o último tubo, de número seis,
foi considerado o controle positivo.
Para o preparo das diluições para esse ensaio seguiu-se a seguinte
metodologia:
•
Ampicilina: No tubo um, adicionou-se 1 mL de solução de ampicilina na
concentração de 0,4 mg/mL. Pipetou-se 500µL dessa solução para o tubo dois
e este foi homogeneizado. O procedimento foi realizado subsequentemente até
o tubo número cinco, do qual se desprezou 500µL de solução.
•
Gentamicina: No tubo um, adicionou-se 1 mL de solução de gentamicina na
concentração de 0,4 mg/mL. Pipetou-se 500µL dessa solução para o tubo dois
Casuística e Método
30
e este foi homogeneizado. O procedimento foi realizado subsequentemente até
o tubo número cinco, do qual se desprezou 500µL de solução.
•
Associação de Ampicilina e Gentamicina: foram colocados 500µL de solução de
ampicilina a 0,4 mg/mL e 500µL de gentamicina a 0,4 mg/mL no tubo um.
Pipetou-se 500µL da solução do tubo um e transferiu-se para o tubo dois que foi
homogeneizado. O procedimento foi realizado subsequentemente até o tubo
número cinco do qual se desprezou 500µL da solução final.
•
Associação de Ampicilina e Gentamicina com intervalo de cinco minutos: foram
colocados 500µL de solução de ampicilina a 0,4 mg/mL no tubo um e aguardouse um período de cinco minutos para adição de 500µL de gentamicina a 0,4
mg/mL. Pipetou-se 500µL da solução do tubo um e transferiu-se para o tubo dois
que foi homogeneizado. O procedimento foi realizado subsequentemente até o
tubo número cinco do qual se desprezou 500µL da solução final.
Todos os tubos da série tiveram um volume final de 500µL. Após 24h e 48h
de incubação a 37±2ºC em estufa foi feita a homogeneização e observada a
turvação, que representa o crescimento dos micro-organismos. Esta turvação foi
classificada em intensidades que variaram de zero até 4+, conforme ilustrado no
Quadro 3.
Foram considerados como:
a) Controle negativo (CN): tubo n° um, que só continha antibiótico;
b) Controle positivo (CP): tubo n° seis, que só continha as bactérias.
Quadro 3 - Diluição dos antimicrobianos utilizados no teste de associação dos
antimicrobianos em doses seriadas decrescentes.
Amostra
Concentração
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
Zero
Ampicilina (A)
Gentamicina (G)
A+G
A5G
Casuística e Método
31
Figura 3 - Foto de tubos com concentrações
decrescentes de Ampicilina.
Figura 41 -Foto
tubos
com
concentrações
Figura
Fotodede
tubos
com
concentrações
decrescentes
de
Gentamicina.
decrescentes de Gentamicina.
Figura
- Foto
tubos
concentrações
Figura 35Foto
de de
tubos
comcom
concentrações
decrescentes
associação
Ampicilina
decrescentes dadaassociação
de de
Ampicilina
e e
Gentamicina.
Gentamicina.
Figura 2 Foto de tubos com concentrações
decrescentesdada
associação
de Ampicilina
e
decrescentes
associação
de Ampicilina
e
Gentamicina
com
intervalo
de
5
minutos
entre
Gentamicina com intervalo de 5 minutos entre
umadroga
drogae eoutra.
outra.
uma
Figura 6 - Foto de tubos com concentrações
Fotos dos ensaios realizados com cepas de enterococos do Laboratório da disciplina de Microbiologia
do Departamento de Ciências Patológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo.
3.5.4.3- Leitura dos resultados
Para obtenção dos resultados verificou-se os tubos e registraram-se as
menores concentrações dos medicamentos que inibiram o crescimento bacteriano
pela ausência de turvação. A leitura ocorreu após 24h e 48h e observada a turvação
para posterior realização do subcultivo em placas de Agar Muller-Hinton.
O teste de diluição em caldo de cultura foi utilizado para a determinação da
CIM e da CBM. A CIM mede a inibição do crescimento, que é somente uma das
Casuística e Método
32
várias formas de ação dos antimicrobianos na célula de bactérias, enquanto a CBM
indica se as células que tiveram o crescimento inibido foram mortas ou não(47).
A semeadura é utilizada para avaliar a concentração bactericida mínima e
sinergismo de ação. Após 24 horas de incubação dos tubos nos quais foram
realizadas as diluições seriadas para determinação da CIM, foi realizada a
semeadura por esgotamento em placas com meio de cultura Ágar Mueller-Hinton
devidamente estéreis com o auxílio de alça bacteriológica calibrada. As placas foram
incubadas a uma temperatura de 37°C e após 48 horas verificou-se o crescimento
bacteriano.
Figura 7 - Foto de cultura de bactérias em meio Mueller-Hinton após
48 horas de incubação a 37° C.
Ensaio com cepas de Enterococcus sp isoladas no laboratório da
disciplina de Microbiologia do Departamento de Ciências
Patológicas da Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP)
3.5.4.4- Determinação do Coeficiente de Inibição Fracionada (CIF)
A partir das CIM obtidas nos experimentos anteriores, tanto na utilização de
antibióticos isolados quanto associados, realizou-se o seguinte cálculo para
determinação do CIF(48):
CIF= (A/CIM de A) + (B/CIM de B)
Sendo que:
Casuística e Método
33
A: CIM da ampicilina quando associada a gentamicina.
B: CIM da gentamicina quando associada a ampicilina.
Esse é um dos métodos utilizados para testar a atividade antimicrobiana de
combinações de fármaco, para tanto emprega diluições duplas seriadas de
antibióticos em caldo inoculado com um número padrão do microrganismo testado,
com disposição em tabuleiro, permitindo a avaliação simultânea de um grande
número
de
concentrações
do
antibiótico
em
diferentes
proporções.
As
concentrações de cada fármaco, isoladamente e em combinação, que impedem a de
crescimento visível são determinadas depois de um período de incubação de 18 a
24 horas. O sinergismo é definido pela inibição do crescimento por uma combinação
de fármacos em concentrações menores ou iguais a 25% da CIM de cada um
atuando isoladamente. Isso significa que um fármaco está afetando microrganismo
de modo que este se torne mais sensível ao efeito inibitório do outro. Se for
necessária metade da concentração inibitória de cada fármaco para produzir
inibição, o resultado é denominado aditivo [índice de concentração inibitória
fracionada (CIF)=1], sugerindo que os dois estão atuando de modo independente.
Se houver necessidade de mais de metade da CIM de cada um para produzir o
efeito inibitório, os fármacos são considerados antagonistas (índice do CIF >1).
Quando são testados para uma variedade de concentrações proporcionais, como na
técnica de disposição em tabuleiro, é possível construir um isobolograma. O
sinergismo é demonstrado por uma curva côncava, o efeito aditivo por uma reta, e o
antagonismo por uma curva convexa. Como o ponto final consiste na inibição do
crescimento, e não em destruição do microrganismo, o sinergismo por esse método
pode não indicar um aumento do efeito bactericida(29).
3.5.4.5- Interpretação dos resultados
Após a realização dos testes para avaliação do crescimento dos enterococos
com concentrações diferenciadas dos antimicrobianos ampicilina e gentamicina mais
associação dos mesmos antimicrobianos foi feita observação da turvação dos tubos
e foram classificados em ausência de crescimento (-) e presença de crescimento (+),
Casuística e Método
34
através de técnica padronizada atendendo os critérios de controle de qualidade onde
a mesma técnica que possui nível superior e faz essa técnica há mais de vinte anos
fez todas as leituras para evitar leituras diferenciadas.
O último tubo que não foi visualizado o crescimento indica a concentração
inibitória mínima (CIM).
Após a leitura 24 horas foi feita a semeadura em placas para avaliar a
viabilidade dos micro-organismos com possibilidade de identificar a concentração
que resultou em ações bactericidas ou bacteriostáticas.
3.5.5- Análise Estatística
Os dados foram expressos por média e erro padrão e foram comparados
usando análise de variância simples de um fator “ANOVA” seguido pelo teste
Bonferroni.
Os valores encontrados com p< 0,05 foram considerados significantes.
O programa utilizado foi Statistica, Versão 10, Série 1010.
Para maior robustez dos resultados também foi utilizado o teste não
paramétrico o Qui-quadrado na comparação das variáveis de cada experimento.
3.5.6- Levantamento bibliográfico
O levantamento da literatura foi realizado nas bases de dados Medline, Lilacs,
Google e Cochrane. Os descritores utilizados foram: Enterococcus sp, resistência
bacteriana, sinergismo e antagonismo, endocardite.
Casuística e Método
35
Casuística e Método
36
4. RESULTADOS
37
A análise dos resultados das cepas de Enterococcus sp frente os antibióticos
testados mostraram os seguintes resultados, que serão apresentados nas
figuras a seguir:
4.1- Cultura de células de Enterococcus sp isoladas no laboratório da
disciplina de Microbiologia do Departamento de Ciências Patológicas da
Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP) em caldo (meio TSB) com
concentrações decrescentes de ampicilina (0,2; 0,1; 0,05 e 0,025mg/mL).
Figura 8 - Inibição e crescimento bacteriano com relação ao número de tubos com
concentrações decrescentes de ampicilina (0,2; 0,1; 0,05 e 0,025 mg/mL).
4.2- Atividade bactericida da ampicilina após culturas em meio Mueller-Hinton
Figura 9 - Atividade bactericida da ampicilina após culturas em meio Mueller-Hinton.
Resultados
38
4.3- Cultura de Enterococcus sp isoladas no Laboratório da Disciplina de
Microbiologia do Departamento de Ciências Patológicas da Santa Casa de
São Paulo
(FCMSCSP) em caldo (meio TSB) com concentrações
decrescentes de gentamicina (0,2; 0,1; 0,05 e 0,025 mg/mL).
Figura 10 - Inibição e crescimento bacteriano com relação ao número de tubos com
concentrações decrescentes de gentamicina (0,2; 0,1; 0,05 e 0,025 mg/mL).
4.4- Atividade bactericida da gentamicina após cultura em meio Mueller-Hinton
Resultados
39
Figura 11 - Atividade bactericida da gentamicina após cultura em meio Mueller–Hinton.
4.5- Associação de ampicilina e gentamicina, nas mesmas proporções e em
doses decrescentes (0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125 mg/mL)
Figura 12 - Inibição e crescimento bacteriano com relação ao número de tubos com
concentrações decrescentes de ampicilina e gentamicina (0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125mg/mL).
4.6- Atividade bactericida da associação de ampicilina e gentamicina após
cultura em meio Mueller-Hinton
Resultados
40
Figura 13 - Atividade bactericida da associação de ampicilina e gentamicina após cultura
em meio Mueller-Hinton.
4.7- Inibição e crescimento bacteriano com relação ao número de tubos com
concentrações decrescentes de ampicilina e gentamicina (adicionada
após intervalos de 5 minutos) (0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125 mg/mL)
Figura 14 - Inibição e crescimento bacteriano com relação ao número de tubos com
concentrações decrescentes de ampicilina e gentamicina (adicionada após intervalos de 5
minutos) (0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125 mg/mL).
4.8- Atividade bactericida da associação de ampicilina e gentamicina
(adicionada após intervalo de 5 minutos) após cultura em meio MuellerHinton
Resultados
41
Figura 15 - Atividade bactericida da associação de ampicilina e gentamicina (adicionada
após intervalo de 5 minutos) após cultura em meio Mueller-Hinton.
4.9- Comparação da ação bactericida e bacteriostática da penicilina
Figura 16 - Avaliação da ação bactericida e ação bacteriostática da ampicilina nas
diferentes concentrações testadas (mg/mL) em 48 cepas de Enterococcus sp. A análise
estatística da efetividade nas diferentes concentrações mostrou p<0,001.
4.10- Comparação da ação bactericida e bacteriostática da gentamicina
Figura 17 - Avaliação da ação bactericida e ação bacteriostática da gentamicina nas
diferentes concentrações testadas (mg/mL) em 48 cepas de Enterococcus sp. A análise
Resultados
42
estatística da efetividade nas diferentes concentrações mostrou p<0,001.
4.11- Comparação da ação bactericida e ação bacteriostática da associação
entre ampicilina + gentamicina
Figura 18 - Avaliação da ação bactericida e ação bacteriostática da associação entre
ampicilina + gentamicina nas diferentes concentrações testadas (mg/mL) em 48 cepas de
Enterococcus sp. A análise estatística da efetividade nas diferentes concentrações mostrou
p<0,001.
4.12- Comparação da ação bactericida e ação bacteriostática da associação
entre ampicilina + gentamicina, com intervalo de 5 min
Resultados
43
Figura 19 - Avaliação da ação bactericida e ação bacteriostática da associação entre
ampicilina + gentamicina, com intervalo de 5 min, nas diferentes concentrações testadas
(mg/mL) em 48 cepas de Enterococcus sp. A análise estatística da efetividade das
diferentes concentrações mostrou p<0,001.
Resultados
44
5. DISCUSSÃO
45
Baseado na importância de estabelecer e racionalizar protocolos de
tratamentos com antimicrobianos para minimização de falhas terapêuticas no uso de
associações de antibióticos, através da determinação da concentração dos dois
antibióticos determinando o sinergismo ou antagonismo a possibilidade de
disponibilizar um método rápido e simples de identificação de possíveis interações
medicamentosas nas diversas doses disponíveis, atendendo assim ao preconizado
pela RDC 20/2011, da ANVISA, que estabelece o controle rigoroso na prescrição de
antibióticos para reduzir a falha terapêutica(49).
Ao analisarmos os gráficos descritos nos resultados observamos que
diferentes concentrações nas associações podem levar ao sinergismo e outras
concentrações podem gerar antagonismo, “in vitro” que sugere a necessidade sob a
ótica da prática clínica continuidade ou não do tratamento utilizando essa
associação.
Portanto, através dos resultados demonstrados nos gráficos pudemos
observar as seguintes condições:
No experimento ampicilina isolada (Fig. 8) referente a cultura de células em
caldo (meio TSB) com concentrações decrescentes de ampicilina (0,2; 0,1; 0,05 e
0,025 mg/mL) demonstrou que as menores concentrações do antibiótico: 0,1; 0,05 e
0,025 mg/mL apresentaram inibição do crescimento bacteriano em 38, 35 e 34
tubos, respectivamente. Enquanto a maior concentração, 0,2 mg/mL, apresentou
inibição bacteriana em 47 tubos, ou seja, houve inibição em 94% das amostras com
p<0,001, o que nos reporta que uma concentração mais diluída da ampicilina não
deve ser indicada pois pode levar a um risco de resistência bacteriana, portanto
demonstrou certa suscetibilidade a ampicilina numa concentração maior, conforme
já relatado no artigo “Suscetibilidade antimicrobiana entre amostras de Enterococcus
sp isoladas no Hospital Universitário de Santa Maria” que encontrou em seu estudo
uma resistência de apenas10% dos enterococos à ampicilina(50).
Já na Figura 9 podemos observar que a cultura de células em meio Mueller
Hinton após o cultivo em caldo demonstrou que concentrações maiores de
ampicilina apresentam maior capacidade bactericida, no entanto, concentrações
menores do antibiótico não apresentaram boa atividade bactericida, o resultado
Discussão
46
obtido no nosso experimento demonstrou uma inibição de crescimento em 60% na
concentração 0,2mg/mL das amostras testadas, já nas concentrações menores
como 0,1, 0,05, 0,025 mg/mL tivemos uma inibição de crescimento menor 28%,
20%, 16% respectivamente.
Na Figura 10 a cultura de bactérias em caldo (meio TSB) com concentrações
decrescentes de gentamicina (0,2; 0,1; 0,05 e 0,025 mg/mL) demonstrou que
concentrações menores de antibiótico não apresentam grande eficácia na inibição
do crescimento bacteriano, ou seja, a semeadura em caldo (meio TSB) o
experimento com a gentamicina isolada teve um comportamento similar ao da
ampicilina apresentando inibição em 68% das amostras com p<0,001, uma ação
menos efetiva que a ampicilina que nessa concentração (0,2 mg/mL) demonstrou
uma inibição de 94%.
Na Figura 11 foi possível demonstrar que a maior atividade bactericida da
gentamicina apresentou-se com a dose de 0,2 mg/mL, enquanto as demais diluições
apresentaram atividade bactericida muito semelhantes e extremamente diminuídas
comparadas a concentração de 0,2 mg/mL. Nesse gráfico após semeadura dos
caldos em meio Mueller Hinton que mostra a cultura de 48 horas nota-se que a
inibição também diminuiu em relação ao visualizado em 24 horas, ou seja, a
efetividade foi para 58%.
Na Figura 12 a avaliação foi relacionada a associação de ampicilina e
gentamicina, nas mesmas proporções e em doses decrescentes (0,1; 0,05; 0,025 e
0,0125 mg/mL), mostrou melhora da atividade quando comparada a ampicilina
isolada, a inibição do crescimento atingiu 92% das amostras com p<0,001 após 24
horas menor do que a inibição constatada com a ampicilina isolada (94%), porém
vale ressaltar que a concentração maior teve melhor resultado que as concentrações
menores utilizadas no experimento.
Na Figura 13, referente a semeadura dos caldos em meio Mueller Hinton
observou-se que na concentração maior houve melhor efetividade quando
comparada as concentrações menores demonstrando uma inibição em 62%, no
entanto se comparada com a leitura realizada nas 24 horas anteriores percebe-se
que com o passar do tempo a efetividade diminui tendo em vista que antes desse
Discussão
47
período a resposta era de 92%, sugerindo que é de suma importância que o
tratamento seja iniciado o mais rápido possível, além disso, o que chamou a atenção
é que só na maior concentração houve uma resposta maior de inibição do
crescimento bacteriano, que nas concentrações decrescentes predominou o
crescimento em relação a inibição.
Na Figura 14, a associação de ampicilina e gentamicina (adicionada após
intervalo de 5 minutos) em concentrações decrescentes (0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125
mg/mL) e em mesmas proporções demonstrou que houve inibição maior em todas
as concentrações testadas, porém a maior inibição prevaleceu na maior
concentração testada.
Nesta associação simultânea constatou-se que a ação bactericida se deu na
concentração de 0,1 mg/mL de cada antibiótico, já nas demais concentrações 0,05,
0,025, 0,0125 (mg/ml) respectivamente a ação predominante foi a bacteriostática.
Na Figura 15 observou-se a atividade bactericida da associação de ampicilina
e gentamicina (adicionada após intervalo de 5 minutos) após cultura em meio
Mueller Hinton, demonstrando que a ação efetiva só ocorreu na concentração maior
utilizada e que nas demais não foi observada uma ação bactericida, e essa ação foi
cada vez menor de acordo com a diluição da concentração da associação ampicilina
e gentamicina.
Baseado nas determinações do CBM e CIM, conseguimos visualizar as
diferentes concentrações que resultaram nas ações bactericidas e bacteriostáticas
da associação da ampicilina e gentamicina com diferença de 5 minutos.
A CBM foi determinada como a menor dose que visualmente apresentou
inibição de crescimento e que na subcultura também não apresentou crescimento
bactéria.
Com base na CIM é possível determinar o nível de atividade de atividade
bacteriostática, enquanto a CBM consiste na concentração mais baixa de
antimicrobiano que mata 99.9% da população - atividade bactericida(22).
Discussão
48
No caso demonstrado na Figura 16, tivemos melhor resposta bactericida
quando a associação da ampicilina adicionada de gentamicina após 5 minutos na
concentração 0,1mg/mL, que foi constatada em 36 tubos e nos outros 14 tubos a
ação foi bacteriostática, porém nas demais doses 0,05; 0,025 e 0,0125 (mg/mL)
respectivamente as respostas bactericidas foram menores e a melhor resposta
bacteriostática foi na menor dose de associação.
Ao avaliarmos os dois gráficos representados pelas Figuras 13 e 15
constatamos que não houve muita diferença entre a associação simultânea e a
associação com intervalo de cinco minutos de ampicilina e gentamicina.
A CIM da Ampicilina isolada quando comparada a CIM da associação de
Ampicilina e Gentamicina, com e sem o intervalo de cinco minutos entre as doses,
não se observou variação significativa (p<0,05) na CIM, ou seja, a dose necessária
para inibir o crescimento bacteriano manteve-se a mesma.
A CIM da Gentamicina isolada quando comparada a CIM da associação de
Ampicilina e Gentamicina, com e sem o intervalo de cinco minutos entre as doses,
observou-se variação significativa (p<0,001) na CIM, ou seja, a dose necessária de
gentamicina, para inibir o crescimento bacteriano quando as drogas são associadas,
é menor.
Quando comparadas as associações dos antibacterianos com e sem o
intervalo de cinco minutos, as concentrações inibitórias mínimas não apresentam
diferença significativa (p<0,05).
Ao avaliarmos o comportamento das ações verificamos que em todas as
condições testadas a resposta é tempo dependente o que nos leva a grande
preocupação de uma intervenção mais breve possível e que é de suma importância
a avaliação de um método laboratorial para determinação da combinação de
antibióticos, com vistas a uma comercialização mais criteriosa gerando maior
segurança ao paciente.
Embora em todos os experimentos realizados constatou-se alteração nas
respostas com os antibióticos testados, percebemos que não houve melhora na
Discussão
49
resposta com a associação superior ao uso isolado principalmente da penicilina isso
vem ao encontro ao descrito por Brunton et al (2010) que expressa que os
aminoglicosídeos nunca devem ser misturados na mesma solução com penicilinas,
visto que a penicilina inativa em grau significativo o aminoglicosídeos(29).
O nosso estudo ratifica o indicado por Horner et al (2005)(50) que esclarece
que a terapia antimicrobiana para as infecções causadas por Enterococcus é
complicada porque a maioria dos antibióticos não tem efeito bactericida em
concentrações clinicamente relevantes. Dessa forma, as infecções enterococicas
sistêmicas, como endocardites, são comumente tratadas com um agente que atue
na parede celular (um β-lactâmico, como a ampicilina, ou um glicopeptídeo, como a
vancomicina) e um aminoglicosídeo (usualmente gentamicina ou estreptomicina).
Esses agentes atuam sinergicamente para promover a ação bactericida. Entretanto
a resistência aos aminoglicosídeos, à ampicilina, à penicilina e à vancomicina tem se
tornado um importante problema, contribuindo para a redução das opções de
tratamento. Essa resistência pode ser confirmada através dos nossos resultados que
indicaram melhor resposta quando utilizada a ampicilina isoladamente (50).
Discussão
50
6. CONCLUSÃO
51
Após análise dos resultados dos experimentos in vitro constatou-se que em
todas as condições testadas a resposta aos antibióticos é tempo dependente,
direcionando a necessidade de intervenção mais breve possível para possibilitar
melhor resposta na antibioticoterapia. É de suma importância que um método mais
rápido e prático da determinação das concentrações exatas dos antibióticos a serem
administrados seja realizado, principalmente quando associados, visando obter
melhor resposta clínica com o menor comprometimento renal e hepático possível. A
determinação da melhor concentração dos antibióticos principalmente quando
associados tem a finalidade de obter a melhor resposta clínica. A determinação do
CIM, CBM e CIF são ferramentas poderosas para nortear estratégias para
prevenção de resistência bacteriana através do uso racional de antibióticos. Um
alerta importante deflagrado pelo trabalho relaciona-se ao fato da prática clínica
indicar um sinergismo clássico entre aminoglicosídeos e beta lactâmicos, porém “in
vitro” observamos os seguintes resultados: a) sinergismo em 10% das amostras; b)
indiferença em 54% das amostras; e c) antagonismo em 32% das amostras o que
pode indicar uma possível falha terapêutica em 32% da associação destes
medicamentos.
Conclusão
52
7. ANEXOS
53
ANEXO I
Exemplo de Tabelas representativas dos resultados das culturas de bactérias
Sendo que:
CN: Controle Negativo
S: Sensível
CP: Controle Positivo
R: Resistente
BT: Bacteriostática
BC: Bactericida
Cepas de enterococos isolados na bacteriotaca do Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Bactéria: 444
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Ampicilina (A)
CN
S
S
S
S
CP
Gentamicina (G)
CN
S
BT
R
R
R
CP
A+G
CN
S
S
S
S
CP
A5G
CN
S
S
S
S
CP
Tubo 4
S
BC
Tubo 5
Tubo 6
S
CP
S
R
CP
R
R
CP
R
R
CP
Bactéria: 88
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Ampicilina (A)
CN
S
S
Gentamicina (G)
CN
A+G
CN
A5G
CN
S
BC
S
BC
S
S
BT
S
BT
S
BC
BT
Bactéria: ATCC B
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Ampicilina (A)
CN
R
R
R
R
CP
Gentamicina (G)
CN
R
R
R
R
CP
A+G
CN
R
R
R
R
CP
A5G
CN
R
R
R
R
CP
Anexos
54
Bactéria: ATCC A
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Ampicilina (A)
CN
S
S
S
S
CP
Gentamicina (G)
CN
S
S
S
S
CP
A+G
CN
S
S
S
S
CP
A5G
CN
S
S
S
S
CP
Anexos
55
ANEXO II
Exemplo do Quadro representativo das concentrações (em mg/mL) referentes
a CIM
Sendo que:
A+G (Amp) – concentração de ampicilina quando associada a gentamicina.
A+G (Genta) – concentração de gentamicina quando associada a ampicilina.
A5G (Amp) - concentração de ampicilina quando associada a gentamicina após
intervalo de cinco minutos.
A5G (Genta) - concentração de gentamicina quando associada a ampicilina após
intervalo de cinco minutos.
Cepas de enterococos isolados na bacteriotaca do Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
A+G
A+G
A5G
A5G
(Amp)
(Genta)
(Amp)
(Genta)
0.2000
0.0125
0.0125
0.0125
0.0125
0.563
0.0250
0.1000
0.10000
0.1000
0.1000
0.1000
5.000
0.2000
0.2000
0.05000
0.05000
0.05000
0.05000
0.500
Bactéria
Ampicilina
Gentamicina
272
0.0250
785
12018750VR
CIF
Anexos
56
ANEXO III
Exemplo do Quadro comparativo entre o valor do CIF e o resultado da
combinação dos antibióticos
Cepas de enterococos isolados na bacterioteca do Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Cepa Enterococcus sp
CIF
Ação
272
0.563
Sinergismo
785
5.000
Antagonismo
88
2.500
Antagonismo
259
2.000
Antagonismo
927CRR
0.125
Sinergismo
Anexos
57
ANEXO IV
Exemplo do Quadro comparativo das CIM e CBM
Cepas de enterococos isolados na bacteriotaca do Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Cepa
Ampicilina
Gentamicina
Amp+Genta
A5G
n°
(mg/mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
88
0.05
0.025
0.2
0.1
0.1
0.05
0.1
0.05
223
0.05
0.05
0.2
0.2
0.05
0.0125
0.05
0.0125
138
0.2
0.025
0.2
0.2
0.0125
0.0125
0.0125
0.0125
606
0.2
0.025
0.2
0.2
0.1
0.0125
0.05
0.0125
Anexos
58
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Fontes consultadas
65
RESUMO
66
Mourad AM. Aminoglicosídeos e penicilinas: avaliação da sinergia “in vitro” para
Enterococcus sp. Tese (Doutorado); 2012
Este trabalho avaliou a ação antimicrobiana isolada e simultânea, “in vitro” da
gentamicina e da ampicilina sobre as cepas de Enterococcus sp através da
obtenção da concentração inibitória mínima (CIM), concentração bactericida mínima
(CBM) isoladamente e em associação, da gentamicina e da ampicilina, bem como
determinou o coeficiente de inibição fracionada (CIF), para constatar a ocorrência
de sinergismo ou antagonismo de ação nas diversas cepas testadas e utilizou a
técnica do tabuleiro de xadrez. Como resultado dos experimentos verificamos que
em todas as condições testadas a resposta foi tempo dependente, e constatamos
alterações nas respostas com os antibióticos testados, e que não houve melhora
superior na resposta com a associação ampicilina e gentamicina quando comparada
ao uso isolado da ampicilina cuja atividade na inibição do crescimento bacteriano foi
de 94% enquanto na associação da penicilina e gentamicina a inibição foi um pouco
menor 92%, a CIM da Ampicilina isolada quando comparada a CIM da associação
de Ampicilina e Gentamicina, com e sem o intervalo de 5 minutos entre as doses,
não se observou variação significativa na CIM, já na comparação com o uso da
gentamicina isolada e gentamicina associada a penicilina notou-se melhor resposta
na associação, pois a CIM da Gentamicina isolada quando comparada a CIM da
associação de Ampicilina e Gentamicina, com e sem o intervalo de 5 minutos entre
as doses, observou-se variação significativa (p<0,001) na CIM. Portanto após
análise dos resultados conclui-se que existe uma real importância na determinação
das concentrações exatas dos antibióticos principalmente quando associados com a
finalidade de obter melhor resposta clínica utilizando a determinação do CIM, CBM
e o CIF que são ferramentas poderosas para nortear estratégias para prevenção de
resistência bacteriana através do uso racional de antibióticos.
Palavras
chave:
Interações
medicamentosas,
Sinergismo,
Antagonismo,
Enterococcus, Checkerboard.
Resumo
67
ABSTRACT
68
Mourad AM. Aminoglycosides and penicillins: evaluation of synergy "in vitro" for
Enterococcus sp. Doctor Thesis, 2012.
This study evaluated the isolated and simultaneous antimicrobial activity "in vitro" of
ampicillin and gentamicin on strains of Enterococcus sp by obtaining the minimum
inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) alone and
in combination of gentamicin and of ampicillin, as well as determined the coefficient
of fractional inhibition (CFI), to establish the occurrence of synergism or antagonism
of action in the different strains tested and used the technique of chessboard. As a
result of the experiments it was verified that in all tested conditions the response was
time dependent, and it was found changes in the responses to the antibiotics tested,
and that there was no superior improvement in the response with the combination of
ampicillin and gentamicin compared to the isolated use of ampicillin whose activity in
bacterial growth inhibition was 94%, whereas in combination of penicillin and
gentamicin was slightly less inhibited 92%, the MIC of ampicillin alone as compared
to the MIC of ampicillin and gentamicin associated with and without 5 minutes
interval between doses, there was no significant variation in MIC, however in the
comparison to the use of gentamicin alone and gentamicin combined with penicillin it
was noticed a better response in the association as the MIC of gentamicin alone
when compared to the MIC of ampicillin and gentamicin association, with or without
the 5 minutes interval between doses, there was significant variation (p <0.001) in
MIC. So after analyzing the results it is concluded that there is real importance in
determining the exact antibiotic concentrations especially when associated with the
purpose of obtaining better clinical response using the determination of MIC, MBC
and CIF which are powerful tools to guide strategies to prevent bacterial resistance
through the rational use of antibiotics.
Keywords: Drug interactions, Synergism, Antagonism, Enterococcus, Checkerboard
Abstract
69
LISTAS E APÊNDICE
70
APENDICE I
APROVAÇÃO DO CONSELHO CIENTÍFICO
Listas e Apêndice
71
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
Listas e Apêndice
72
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Estrutura Molecular da Gentamicina...................................................
12
Figura 2 - Estrutura Molecular da Ampicilina....................................................
15
Figura 3 - Foto de tubos com concentrações decrescentes de Ampicilina.........
30
Figura 4 - Foto de tubos com concentrações decrescentes de Gentamicina.....
30
Figura 5 - Foto de tubos com concentrações decrescentes da associação de
Ampicilina e Gentamicina....................................................................................... 30
Figura 6 - Foto de tubos com concentrações decrescentes da associação de
Ampicilina e Gentamicina com intervalo de 5 minutos entre uma droga e outra..
30
Figura 7 - Foto de cultura de bactérias em meio Mueller- Hinton após 48 horas
de incubação a 37° C.............................................................................................
31
Figura 8 - Inibição e crescimento bacteriano com relação ao número de tubos
com concentrações decrescentes de ampicilina (0,2; 0,1; 0,05 e 0,025 mg/mL).. 36
Figura 9 - Atividade bactericida da ampicilina após culturas em meio MuellerHinton...................................................................................................................... 36
Figura 10 - Inibição e crescimento bacteriano com relação ao número de tubos
com concentrações decrescentes de gentamicina (0,2; 0,1; 0,05 e 0,025
mg/mL).................................................................................................................... 37
Figura 11 - Atividade bactericida da gentamicina após cultura em meio Mueller–
Hinton...................................................................................................................... 37
Figura 12 - Inibição e crescimento bacteriano com relação ao número de tubos
com concentrações decrescentes de ampicilina e gentamicina (0,1; 0,05; 0,025
e 0,0125mg/mL)...................................................................................................... 38
Figura 13 - Atividade bactericida da associação de ampicilina e gentamicina
após cultura em meio Mueller-Hinton.....................................................................
38
Figura 14 - Inibição e crescimento bacteriano com relação ao número de tubos
com concentrações decrescentes de ampicilina e gentamicina (adicionada após
intervalos de 5 minutos) (0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125 mg/mL).................................. 39
Figura 15 - Atividade bactericida da associação de ampicilina e gentamicina
(adicionada após intervalo de 5 minutos) após cultura em meio Mueller-Hinton.
39
Figura 16 - Avaliação da ação bactericida e ação bacteriostática da ampicilina
nas diferentes concentrações testadas (mg/mL) em 48 cepas de Enterococcus
sp. A análise estatística da efetividade nas diferentes concentrações mostrou
p<0,001................................................................................................................... 40
Listas e Apêndice
73
Figura 17 - Avaliação da ação bactericida e ação bacteriostática da
gentamicina nas diferentes concentrações testadas (mg/mL) em 48 cepas de
Enterococcus sp. A análise estatística da efetividade nas diferentes
concentrações mostrou p<0,001............................................................................ 40
Figura 18 - Avaliação da ação bactericida e ação bacteriostática da associação
entre ampicilina + gentamicina nas diferentes concentrações testadas (mg/mL)
em 48 cepas de Enterococcus sp. A análise estatística da efetividade nas
diferentes concentrações mostrou p<0,001............................................................ 41
Figura 19 - Avaliação da ação bactericida e ação bacteriostática da associação
entre ampicilina + gentamicina, com intervalo de 5 min, nas diferentes
concentrações testadas (mg/mL) em 48 cepas de Enterococcus sp. A análise
estatística da efetividade das diferentes concentrações mostrou p<0,001........... 42
Listas e Apêndice
74
LISTA DE QUADROS
Quadro 4- Diluição dos antimicrobianos utilizados no teste de associação dos
antimicrobianos em doses seriadas decrescentes...............................................
27
Quadro 5 - Esquema de realização do tabuleiro..................................................
28
Quadro 6 - Diluição dos antimicrobianos utilizados no teste de associação dos
antimicrobianos em doses seriadas decrescentes...............................................
30
Listas e Apêndice