Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa

Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento
JOÃO RAFAEL SILVÉRIO
EFEITO ANTIEDEMATOGÊNICO DO EXTRATO HIDROALCÓOLICO DE Heliconia
rostrata FRENTE AO VENENO DE Bothrops jararaca.
São José dos Campos, SP
2016
JOÃO RAFAEL SILVÉRIO
EFEITO ANTIEDEMATOGÊNICO DO EXTRATO HIDROALCÓOLICO DE Heliconia
rostrata FRENTE AO VENENO DE Bothrops jararaca.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Ciências Biológicas da
Universidade do Vale do Paraíba como
complementação dos créditos necessários para
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Biológicas.
Orientadore (s) Profa. Dra. Walderez Moreira Joaquim
Profa. Dra. Andreza Ribeiro Simione
São José dos Campos, SP
2016
FICHA CATALOGRÁFICA
JOÃO RAFAEL SIVÉRIO
EFEITO ANTIEDMATOGÊNICO DO EXTRATO HIDROALCÓOLICO DE Heliconia
rostrata FRENTE AO VENENO DE Bothrops jararaca.
Orientadores:
Profa. Dra. Andreza Ribeiro Simioni (orientadora)
Profa. Dra. Walderez Moreira Joaquim (co-orientadora)
Banca examinadora:
Profa. Dra. Andreza Ribeiro Simioni
Prof. Dr. Prof. Dr. Luiz Elidio Gregório
Prof. Dr. Newton Soares da Silva
Prof. Dr. Milton Beltrame Junior
(orientadora)
(UNIFESP)
(UNIVAP)
(suplente)
Prof. Dr. Leandro José Raniero
Diretor do IP&D - UNIVAP
São José dos Campos, 30 de setembro de 2016. (Data da defesa)
DEDICATÓRIA
Obrigado Deus, por estar lado a lado do início ao fim desta batalha, agradeço
intensamente a meus pais JB Silvério e Cleide EJ Silvério, irmão, Ederson Rubens
Silvério, amiga Raissa da Costa Furtado. Ninguém recebeu mais carinho e apoio,
como o que vocês têm me dado. Obrigado por acreditarem.
Aos meus, professores (Renato Farina Menegon, Luiz Prudêncio Santos, Marco
Antônio de Oliveira, Luciana Barros Sant’Anna, Newton Soares da Silva, Luís
Elidio Gregório, Airton Abrahão Martin, Juliana Guerra, e José Carlos Cogo, por
estarem sempre presentes e dispostos e me ajudar.
Aos meus orientadores, Dra. Profa. Andreza Ribeiro Simioni e Dra. Profa.
Walderez Moreira Joaquim, pelos ensinamentos e confiança total depositada em
minha pessoa assim como a paciência e carinho no qual, sem eles, não teria
concluído o curso de mestrado.
´´Veras que um filho seu não foge a luta´´
AGRADECIMENTOS
À Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior – CAPES,
pela bolsa de estudos concedida.
À Universidade do Vale do Paraíba - UNIVAP e todos seus professores, pela
oportunidade de ensino e aprendizado.
À banca examinadora da qualificação, pelas sugestões e críticas que
contribuíram para o enriquecimento do trabalho.
RESUMO
O gênero Heliconia (Heliconiaceae), tem distribuição em países da Ásia e América
tropical. Quarenta das 250 espécies conhecidas de Heliconia ocorrem na Mata
Atlântica e Amazônia. Neste estudo, objetivou-se verificar a atividade
antiedematogênica do extrato hidroalcóolico de Heliconia rostrata Ruiz & Pav. de
plantas cultivadas em diferentes intensidades luminosas. As plantas foram cultivadas
em T1 (50% sombreamento) e T2 (Pleno Sol 100% luz). Através de parametros
fisico-quimicos foi realizada a padronização do extrato hidroalcóolico (70%) e (95%)
de H.rostrata de plantas mantidas em T2 utilizando-se três métodos extrativos
Soxhlet (ES), Maceração (EM) e Ultrasom (US). Para DR (Densidade Relativa) do
extrato de H.rostrata obteve-se os valores de entre 0,998 a 1,011 e RS (Resíduo
Seco) obteve-se os valores entre 22,3% a 66,5%. Verificou-se a diferença entre o
teor alcóolico (70%) e (95%), porém, não significativa entre os métodos. A injeção
intraplantar do extrato hidroalcóolico método ES de Heliconia rostrata (100 g) préincubado com veneno de Bothrops jararaca (3 g) obtiveram-se redução máxima do
edema a partir dos 120 min. Atraves da obtenção do extrato hidroalcoolico de
H.rostrata (70%) de plantas cultivadas em (T2) e do extrato hidroalcoolico de
H.rostrata (95%) de plantas cultivadas em (T1) e (T2) método (ES) reduzio
significamente o edema de pata em camundongos frente a ação do veneno de B.
jararaca. Os resultados histológicos e quantitativos demonstraram que o extrato
hidroalcóolico de H.rostrata possui compostos ativos com atividade anti-inflamatória
capazes de reduzir os danos musculares provocados pelo veneno de B. Jararaca.
Palavras chaves: Heliconia rostrata Ruiz & Pav. Extrato Hidroalcóolico. Bothrops
jararaca. Edema de Pata. Inflamação.
ANTIEDEMATOGENIC EFFECT OF THE HYDROALCOHOLIC EXTRACT FROM
Heliconia rostrata AGAINST THE VENOM OF Bothrops jararaca
ABSTRACT
The Heliconia genus (Heliconiaceae) is present in countries of the Asia and tropical
America. In South America (Brazil, Colombia, Peru and Bolivia) and in some Central
America countries (Mexico and Costa Rica) this plant is traditionally used by healers
and in Asia, for centuries is used in the Ayurvedic medicine. Of the 250 known
species of Heliconia, 40 species are found in the Atlantic Forest and Amazon. This
study aimed verify the antiedematogenic activity of a hydroalcoholic extract from H.
rostrata extract, from plants cultivated under different luminosity intensity, front of the
action of the B. jararaca venom. The plants were grown in T1 (50% light) and T2
(100% light). Through physical and chemical parameters it was made a patterning of
the H. rostrata hydroalcoholic extract (70%) and (95%) of plants maintained in T2
using three methods of extraction the Soxhlet (ES), Maceration (EM) and ultrasound
(US). The test of relative density (RD) of the extract reveal values between 0,998 and
1,011 and the dry residue test (DR) reveal values between 22,3% and 66,5%. It was
found difference in the alcoholic strength (70%) and (90%), however the methods of
ES, EM and US did not present significant difference. In the test of antiedematogenic
activity of the hydroalcoholic extract of the H. rostrata rhizome (100 µg/paw)
extracted by the ES method diluted in B. jararaca venom (3µg/paw) there was
obtained reduction of edema 120 minutes after the injection. The histological and
quantitative results demonstrated that the H. rostrata hydroalcoholic extract possess
bioactive compounds with anti-inflammatory activity capable of reduce the muscular
damages triggered by the B. jararaca venom.
Keywords: Heliconia rostrata Ruiz & Pav., hydroalcoholic extract, Bothrops jararaca,
Paw edema, inflammation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ordem Zingiberaceae e suas famílias....................................................... 18
Figura 2 - Características morfológicas Heliconia sp ................................................ 20
Figura 3 - Heliconia rostrata, detalhes da inflorescência. .......................................... 20
Figura 4 - Influência do Teor de Metabólitos Secundários ........................................ 23
Figura 5 - Rota dos Metabólitos primários e vias dos Metabólitos Secundários ....... 24
Figura 6 - Estrutura química dos Flavonoides ........................................................... 25
Figura 7 - Reações no tecido e os 5 sinais clássicos causadores do processo
inflamatórios .............................................................................................................. 28
Figura 8 - Processo inflamatório, migração de agentes químicos, células
leucocitárias e matriz extracelular demonstrando o edema ...................................... 29
Figura 9 - Heliconia rostrata em tela com interceptação de 50% de luz
(sombreamento). ....................................................................................................... 33
Figura 10 - A) Obtenção do extrato do rizoma de H. rostrata pelo método Soxhlet
completo; ................................................................................................................... 35
Figura 11 - Obtenção do extrato do rizoma de H. rostrata pelo método ultrassom
completo. ................................................................................................................... 37
Figura 12 - Extração do veneno de B. jararaca (Serpentário – CEN)........................ 38
Figura 13 - Mensuração da pata ............................................................................... 41
Figura 14 - Cinética edematogênica induzido pelo veneno de B. jararaca. Os dados
representam a média ± E.P.M. de 8 animais com *p≤0,05 do grupo controle e
veneno(ANOVA)........................................................................................................ 45
Figura 15 - Cinética antiedematogênica pelo extrato hidroalcóolico 95% de H.
rostrata de plantas mantidas em sombreamento 50% e pleno sol frente ao veneno
de B. jararaca. Os pontos representam a média±E.P.M. (*p≤0,05) em relação ao
grupo controle. .......................................................................................................... 48
Figura 16 - Cinética antiedematogênica pelo extrato hidroalcóolico 70% de H.
rostrata de plantas mantidas em pleno sol frente ao veneno de B. jararaca. Os
pontos representam a média ± E.P.M. (* p<0,05). em relação ao Grupo Controle. .. 48
Figura 17 - (A) Grupo controle, Solução Salina (50 µl).
A – Plano longitudinal
mostrando as fibras musculares integras com (ponta da seta); núcleos periféricos(N)
com suas estriações (corpo da seta); integridade da membrana celular (seta).
Coloração (H/E). Aumento: 200x. (B) Grupo veneno, B. jararaca (3 µg). B – Secção
longitudinal do músculo plantar; Aumento: 400x. Área de edema (AE) com
espaçamento das fibras esqueléticas; ruptura das fibras musculares da membrana
(Circulo), alterações típicas de mionecrose. Coloração (H/E). (C – D) Grupo T1
Sombra 95%, extrato de H. rostrata (100 µg) incubado com veneno de B. jararaca (3
µg). C – Secção transversal do músculo plantar; Redução do infiltrado inflamatório
(IF) periferia nuclear (N) e fibras mais espessas do Espaçamento entre as Fibras
(EF). Coloração (H/E). Aumento: 200x. D – Secção longitudinal do músculo plantar;
Aumento: 200x. Espaçamento entre as Fibras e suas estrias (EF) Coloração (H/E).
(E – F) Grupo T2 Pleno Sol 95% extrato de H. rostrata (100 µg) incubado com
veneno de B. jararaca (3 µg). E – Secção transversal do músculo plantar, Área de
edema (AE); Aumento: 200x . Infiltrado Inflamatório (IF) ruptura de membrana e
espaçamento entre as fibras (EF). Coloração (H/E). F – Secção longitudinal do
músculo plantar; Aumento: 200x. infiltrado inflamatório (IF) e Espaçamento entre as
fibras (EF). Coloração (H/E). (G-H) Grupo T3 Pleno Sol 70% extrato de H. rostrata
(100 µg) incubado com veneno de B. jararaca (3 µg). G – Secção transversal do
músculo plantar; periferia Nuclear (N) e fibras mais espessas do espaçamento entre
as fibras (E.F). Coloração (H/E). Aumento: 200x; H – Secção longitudinal do músculo
plantar; Aumento: 200x; Espaçamento entre as Fibras e suas estrias (EF); redução
do infiltrado inflamatório (IF) Coloração (H/E). .......................................................... 50
TABELAS
Tabela 1 - Métodos de Extração para obtenção do extrato hidroalcóolico do rizoma
de Heliconia rostrata submetidas aos tratamentos T1 = 50% de luz (sombra) e T2 =
100% luz (pleno sol) processados............................................................................. 34
Tabela 2 - Parâmetros físicos dos extratos obtidos pelos métodos (ES), (EM) e (US)
nas proporções hidroalcóolicas de 70 e 95% do tratamento T2 (100% luz). ............. 44
Tabela 3 - Para a determinação da atividade edematogênica realizou-se nos tempos
0, 15, 30, 60, 120, 180 e 360 minutos em patas de camundongos, a letra x
(confirma) o tratamento realizado. Para cada tratamento, utilizou-se (100µg/pata) do
extrato hidroalcóolico de H. rostrata obtido pelo método extrativo ES (Soxhlet), teor
alcóolico (70%) e (95%). O teste edematogênico foi realizado com veneno de B.
jararaca (3µg/pata). ................................................................................................... 45
Tabela 4 - Resultados obtidos do teste antiedematogênico no tempo de 120, 180 e
360 minutos do extrato hidroalcóolico do rizoma H. rostrata de plantas cultivadas em
T1 (50% Sombreamento) teor alcóolico (95%) e T2 (Pleno Sol) teor alcóolico (95%) e
(70%). ........................................................................................................................ 47
Lista de abreviaturas e siglas
AE – área de edema
A. zerumbet - Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.S. Sm. (Zingiberaceae) (folhas)
ANOVA - Análise de variância
B. jararaca - Bothrops jararaca
CEN - Centro de Estudos da Natureza
DDR – Determinação da Densidade Relativa
DRS – Determinação do Resíduo Seco
EF – Espaçamento entre fibras
EM – Extração Maceração
EPM – Erro Padrão da Média
ES – Extração Soxhlet
H.caribaea – Heliconia caribaea
H.psittacorum- Heliconia psittacorum
H.rostrata - Heliconia rostrata
H.subululata machu pichu – Heliconia subululata machu pichu
H/E – Hematoxilina e Eosina
IF – Infiltrado Inflamatório
IP&D - Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
M.O - Microscópio
mg - Miligramas
mL - Mililitros
N – núcleos periféricos
rpm - Rotações por minuto
RS – resíduo seco
T1 – plantas cultivadas em pleno sol (100% luz) de luz
T2 – plantas cultivadas em sombreamento com 50% de luz (sombra)
UAD - Ultrassom Assistida por Dissolução
US – Extração Ultrassom
μg - Micrograma
μg/ml - micrograma/mililitro
μL – Microlitros
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14
2 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 17
2.1 Objetivo Específico ........................................................................................... 17
3 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 18
3.1 Heliconia ............................................................................................................ 18
3.1.2 Descrição Botânica Heliconia sp. ................................................................. 19
3.2 Constituintes Químicos Heliconia sp. ............................................................. 21
3.3 Metabólitos Secundários .................................................................................. 22
3.4 Epidemiologia .................................................................................................... 25
3.5 Envenenamento Botrópico ............................................................................... 26
3.5.1 Fisiopatologia do Envenenamento Botrópico ............................................. 27
3.6 Edema de Pata ................................................................................................... 30
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 31
4.1 Identificação do Material Botânico .................................................................. 31
4.2 Cultivo e Obtenção dos Rizomas ..................................................................... 31
4.3 Obtenção dos Extratos ..................................................................................... 33
4.3.1 Extração Soxhlet (ES) .................................................................................... 34
4.3.2 Extração Maceração (EM) .............................................................................. 35
4.3.3 Extração Ultrassom (US) ............................................................................... 36
4.4 Determinação do Resíduo Seco (DRS) ............................................................ 37
4.5 Determinação da Densidade Relativa (DDR) ................................................... 37
4.6 Veneno ............................................................................................................... 38
4.7 Animais
e Grupos Experimentais .............................................................. 39
4.8 Atividade Edematogênica ................................................................................. 40
4.9 Processamento Histológico ............................................................................. 41
4.10 Análise Estatística ........................................................................................... 42
5.1 Determinação da Densidade Relativa (DDR) e Determinação do Resíduo
Seco (DRS) ............................................................................................................... 43
5.2 Ação Edematogênica do Veneno de Bothrops jararaca ................................ 44
5.2.1 Ação Antiedematogênica do Extrato Hidroalcoólico do Rizoma de H.
rostrata ..................................................................................................................... 46
5.3 Alterações Histopatológicas ............................................................................ 49
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 52
6.1 Cultivo de Heliconia rostrata a Pleno Sol e a 50% de Sombreamento ......... 52
6.2 Comparações dos Métodos Extrativos a Partir de Parametros FísicoQuimicos do Extrato Hidroalcóolico de Heliconia rostrata ................................. 53
6.3 Ação Edematogênica do Veneno de Bothrops jararaca ................................ 55
6.3.1 Ação Antiedematogênica do Extrato Hidroalcoólico de Heliconia rostrata
.................................................................................................................................. 55
7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 58
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 59
ANEXO – COMITÊ DE ÉTICA .................................................................................. 66
14
1 INTRODUÇÃO
Estima-se que aproximadamente 2,5 milhões de acidentes ofídicos ocorram
anualmente em todo o mundo (BRASIL, 2014). Dados no Ministério da Saúde
(BRASIL, 2014) relatam cerca de 25.302 acidentes, decorridos no ano de 2014.
A maioria destes acidentes deve-se às serpentes dos gêneros Bothrops
(jararacas) e Crotalus (cascavel). Sendo as Bothrops responsáveis por cerca de 80 a
90% das notificações registradas e mostram 0,6% de letalidade nos casos tratados
(RIBEIRO; ALBUQUERQUE; CAMPOS, 2004; PEREAÑEZ et al., 2008; OLIVEIRA;
BRITO; MORAES, 2010; D’AGOSTINI; CHAGAS; BELTRAME, 2011). O veneno de
B. jararaca, causa inflamação no local da picada, a antipeçonha neutraliza os efeitos
sistêmicos provocados pelo envenenamento, porém neutraliza parcialmente os
efeitos locais (RIBEIRO; ALBUQUERQUE; CAMPOS, 2004).
A peçonha de serpentes do gênero Bothrops (jararacas) caracterizam pela
ação local, onde ocorre a formação ativa do edema, eritema, equimose, bolhas,
necrose na região da picada, e sistemicamente, alteração da coagulação sanguínea
e sangramento (TOKARNIA; JÜRGEN; BARBOSA, 2014).
De origem neotropical, Heliconia ssp. pertencem à família Heliconiaceae e a
ordem Zingiberales, conhecida popularmente como bico de papagaio ou bananinha
(CASTRO, 1995).
Jérez (2007) Heliconia sp. possui valor ornamental e atualmente vem
ganhando espaço entre a população devido ao seu potencial medicinal. Os extratos
da Família Heliconiaceae e demais gêneros da ordem Zingiberaceae, são
caracterizados por possuírem atividades biológicas essenciais para neutralização do
veneno de serpentes (PEREAÑEZ et al., 2008; ESTRADA et al., 2009; CHEN;
CHANG, 2008). Estudos relatam seu uso para diversas enfermidades, tais como,
ação antirreumática, antimicrobiana, anti-edema, emoliente, constipação, contra
úlceras externas, diurético, auxilio nas contrações uterina, queimadura e
expectorante (PANCHAROENI; PRAWAT; TUNTIWACHWUTTIKUL, 2000; NÚÑEZ
et al., 2004; TENE; MALAGÓN; FINZI, 2007; GOMES et al., 2010; JÉREZ, 2007;
COLLAÇO et al., 2010; PEREAÑEZ et al., 2010).
15
As plantas da Ordem Zingiberaceae que se desenvolvem em condições de
sombreamento apresentam taxas fotossintéticas mais baixas do que as cultivadas
em áreas abertas, a pleno sol (LARCHER, 2004).
Ao longo da evolução, as plantas sofreram adaptações fisiológicas e
morfológicas determinadas pela ação de fatores naturais para sua sobrevivência, à
intensidade luminosa e a alocação de compostos bioativo em uma planta
influenciará no seu desenvolvimento que serão expressos bioquimicamente
(LEMOS, 2011).
Os fatores externos, de acordo com Chavasco et al. (2014) podem influenciar
na produção de metabólitos secundários tais como, disponibilidade de nutrientes,
interações com pragas, ciclo circadiano, sazonalidade, vida pós-colheita e umidade
(CHAVASCO et al., 2014).
Lima et al (2016) em recentes estudos comparando diferentes intensidades
luminosas em Heliconia ssp. verificou que em Heliconia bihai cv. Lobster Claw Two
em pleno sol (100% luminosidade) e sombreamento (30%, 40% e 50%
luminosidade) houve a redução no teor de carboidrato nas folhas de plantas
mantidas em sombreamento e maiores valores nas plantas cultivadas a pleno sol.
Para a obtenção do sombreamento, o excesso de luminosidade pode ser
controlado através do uso de diversos tipos de material, sendo que as telas de
sombreamento com especificações diversas têm sido as mais utilizadas na prática,
visando a diminuição da intensidade de luz incidente (KAMPF, 2000).
As plantas da família Heliconiaceae mantidas em ambiente de sombra
apresentam desenvolvimento mais lento (PANCHAROENI, 2000). Heliconia sp. tem
preferência por habitats sombreados ou semi-sombreado (BERRY; KRESS, 1991),
entretanto durante seu desenvolvimento, prefere ambientes a pleno sol (100%
luminosidade) ou áreas onde a maior parte do dia estará iluminado por luz solar
(RODRÍGUEZ, 2013).
Existem estudos etnobotânicos atuais que comprovam o uso de heliconia
para o envenenamento botrópico, porém para H. rostrata não há poucos estudos
(NÚÑEZ et al., 2004). De acordo com a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância
Sanitária), ‘‘As plantas medicinais são aquelas capazes de aliviar ou curar
enfermidades e têm tradição de uso como remédio em uma população ou
comunidade’’ (AGÊNCIA..., 2016). Entretanto, a OMS (Organização Mundial de
Saúde), incentiva países em desenvolvimento a resgatar e validar cientificamente o
16
conhecimento botânico tradicional a respeito do uso de plantas medicinais na
atenção básica a saúde. Considerando que o soro é o único tratamento, que protege
contra os efeitos sistêmicos e não locais do envenenamento botrópico, existe a
necessidade da realização de estudos alternativos tais como, o uso de plantas com
potencial medicinal para ser coadjuvante no tratamento dos efeitos locais causado
pela ação do veneno e a terapia a laser de baixa intensidade.
17
2 OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do extrato hidroalcóolico do
rizoma de Heliconia rostrata Ruiz & Pav. obtido pelo método Soxhlet (ES70%) e
(ES95%) sobre o edema de pata em camundongos e efeitos locais promovidos pelo
veneno de Bothrops jararaca.
2.1 Objetivo Específico
1) avaliar parâmetros físico-químicos, DDR e DRS, do extrato hidroalcóolico 70-95%
de H.rostrata obtido por diferentes métodos de extração: Soxhlet, Maceração e
Ultrassom.
2) analisar a ação do extrato hidroalcóolico de H. rostrata obtidos de plantas
cultivadas em diferentes intensidades luminosa cultivada T1 = 50% de luz (sombra)
e T2 = 100% luz (pleno sol) obtido a partir de diferentes concentrações do solvente
etanol 70% e 95% sobre o edema de pata causado pelo veneno de B. jararaca em
pata de camundongo.
3) avaliar histologicamente e quantitativamente a ação antiedematogênica do extrato
de plantas cultivadas cultivada em T1 = 50% de luz (sombra) e T2 = 100% luz (pleno
sol) obtido pelo método Soxhlet (ES95%) e plantas cultivadas cultivada em T2 =
100% luz (pleno sol) obtido pelo método Soxhlet (ES70%) sobre o edema de pata
em camundongos.
18
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Heliconia
As plantas da ordem Zingiberaceae (Figura 1), têm sido utilizadas
tradicionalmente de forma medicinal na região tropical. Os membros da família
Heliconiaceae têm atraído interesse fitoquímico devido à prática do consumo de
alimentos ao redor do mundo (PANCHAROEN; PRAWAT; TUNTIWACHWUTTIKUL,
2000). Além de apresentarem benefícios farmacêuticos foi relatado um estudo préclínico onde se verificou a presença de atividades biológicas analgésicas o que vem
a reforçar o seu uso na medicina alternativa já tradicional há séculos (LAKHAN;
FORD; TEPPER, 2015; KAUR et al., 2016).
Dentro da ordem Zingiberaceae encontram-se as helicônias, que são plantas
ornamentais da família Heliconiaceae. A classificação taxonômica desta espécie foi
feita por Ruiz López, Hipolito & Pavón e José Antonio (1802), que considerou dentro
da ordem Zingiberaceae, família Heliconiaceae, gênero Heliconia e espécie
Heliconia rostrata (GBIF, 2016).
Figura 1 - Ordem Zingiberaceae e suas famílias
Fonte: Berry e Kress. (1991).
19
Os membros desta família são constituídos por aproximadamente 250
espécies, 40 ocorrem naturalmente nas florestas de Mata Atlântica e na floresta
Amazônica, incluindo nestas H. rostrata (OLIVEIRA et al., 2010). Trata-se de uma
planta de origem neotropical, conhecida pelos nomes vulgares de bico de papagaio
ou bananinha (CASTRO, 1995).
Na América Tropical em países tais como a Colômbia, Equador, México,
Porto Rico (NUÑEZ et al., 2004; PEREAÑEZ et al., 2008; COLLAÇO et al., 2010;
ALARCÓN et al., 2011) bem como na Ásia (Malásia, Filipinas, Índia e Tailândia) as
helicônias tem ocorrência espontânea e vêm ganhando espaço nas pesquisas como
planta com potencial medicinal (TENE; MALAGÓN; FINZI, 2007; GOMES et al.,
2010; ANIMESH; GHOSH; HALDER, 2011; BUNGIHAN, 2012). No Brasil, seu uso
na medicina popular se restringe a região Nordeste (AGRA; FREITAS; BARBOSAFILHO, 2007).
Estudos etnobotânicos relatam seu uso na medicina tradicional por
apresentarem
ação
antirreumáticas,
antimicrobianas,
antiedema,
emoliente,
constipação, contra úlceras externas, diurético, adstringente, auxilio nas contrações
uterinas, queimadura, expectorante e na neutralização dos venenos de ofídicos (DI
STASI; LIMA, 2002; PANCHAROEN; PRAWAT; TUNTIWACHWUTTIKUL, 2000;
NÚÑEZ et al., 2004; TENE; MALAGÓN; FINZI, 2007; PEREAÑEZ et al.,
2008;
GOMES et al., 2010; COLLAÇO et al., 2010; ALARCÓN; MARTINEZ; SALAZAROSPINA, 2011; ANIMESH; GHOSH; HALDER, 2011; BUNGIHAN, 2012).
3.1.2 Descrição Botânica Heliconia sp.
Heliconia são plantas monocotiledôneas, herbáceas e perenes, com rizoma,
ramificado (emite brotos ou haste) e um pseudocaule aéreo, ereto, formado por um
eixo recoberto por bases de folha alternadas (JÉREZ, 2007). As espécies possuem
rizoma subterrâneo comumente usado para propagação do qual se desenvolvem as
gemas florais e os novos pseudocaules como demonstrado na figura 2. O período de
florescimento (figura 3) varia de espécie para espécie e é afetado pelas condições
20
edafoclimáticas. O pico de produção normalmente ocorre no início do verão,
declinando no outono e cessando a floração no inverno (CASTRO, 1995).
Segundo Machado Neto, Jasmim e Ponciano (2011) as helicônias ocupam a
terceira colocação em áreas cultivadas no Brasil (101,8ha) para fins ornamentais,
sendo superadas apenas pelas rosas (426ha) e crisântemos (234ha), entretanto, os
estudos referentes à sua ação medicinal são escassos ou inexistentes para algumas
espécies.
Figura 2 - Características morfológicas Heliconia sp
Fonte: Berry e Kress (1991)
.
Figura 3 - Heliconia rostrata, detalhes da inflorescência.
Fonte: Autor.
21
3.2 Constituintes Químicos Heliconia sp.
O primeiro estudo sobre a composição química sobre a composição química
de Heliconia foi publicada em 1986, entretanto, atualmente o gênero é ainda pouco
explorado quimicamente. A partir da obtenção do extrato de Heliconia angustifolia
Hook e Heliconia aureo Hort (MERCH; DANIEL; SABINS,1986) no teste de
cromatografia foi identificado a presença de compostos fenólicos (flavonas) em
ambos extratos. Pugialli, Kaplan e Gottlieb (1993), através de ensaios do perfil
químico das famílias da Ordem Zingiberaceae, realizou uma análise associando
seus compostos fenólicos com os principais gêneros da ordem e um outro teste feito
através de marcadores quimiossistemáticos verificou que, os flavonoides estavam
associados à família Heliconiaceae. Pelo método de Quantificação do Grau de
Proteção das Hidroxilas Flavonoidicas foi relatada a presença de flavonoides e
alcaloides na família Heliconiacea.
Através da obtenção do extrato das brácteas e folhas de Heliconia caribaea
foi relatada a presença de carboidratos totais, sugerindo que estão relacionados com
a variação sazonal, ou seja, a presença de carboidratos totais coincide com o
período de floração e não há influência no desenvolvimento das brácteas e folhas
(YEE; TISSUE, 2005).
Trabalhos recentes de Estrada et al. (2009) relatam através de avaliações
fitoquímicas preliminares do extrato etanólico dos rizomas de Heliconia ssp., a
presença de metabólitos esteróides ou terpenóides, taninos e cumarinas. Segundo o
autor, em geral o extrato de H. psittacorum apresenta níveis mais elevados de fenóis
totais (ácido tânico) e proteínas quando comparado com o extrato de H. rostrata,
exceto em quantidade de carboidratos, onde o extrato de H. rostrata apresenta
níveis mais elevados.
A partir da obtenção do extrato etanólico do rizoma de H. psittacorum e H.
rostrata foi empregado o teste de quantificação de metabólitos confirmando a
presença de carboidratos totais e proteínas (ESTRADA et al., 2010).
Bungihan (2012) realizando o método de TLC (cromatografia de camada fina)
do extrato metanólico de flores de H. subululata machu pichu identificou a presença
de terpenóides/esteroides, no entanto, realizou-se o teste de Folin Ciocalteu e
confirmou a presença de compostos fenólicos.
22
Pesquisa recentemente conduzida por Chavasco et al. (2014) apresentam o
perfil fitoquímico do extrato hidroalcóolico 70% da haste, flor e folha de Heliconia
rostrata, verificando–se a presença de tanino e saponina.
Sobre o gênero em geral, e sobre H. rostrata em particular, existem poucas
informações a respeito de sua composição química. Estudos fitoquímicos da espécie
relatam como principais classes de metabólitos os compostos fenólicos, carboidratos
totais, proteínas totais, cumarinas, compostos esteroidais, terpenóides, alcaloides e
flavonoides.
3.3 Metabólitos Secundários
Dzialo et al. (2016) descrevem que as substâncias bioativas responsáveis
pelo efeito terapêutico de uma planta são produzidas pelo metabolismo secundário.
Raven, Evert e Eichhorn (2007) relatam que os metabólitos secundários são
importantes para sobrevivência do indivíduo e possuem funções químicas dentro da
planta Lambers e Thijs (1998) sugerem que a produção de compostos finais ou
intermediários de uma planta em uma rota metabólica, difere de espécie para
espécie
tanto
qualitativamente
quanto
quantitativamente.
Os
metabólitos
secundários funcionam como sinais químicos que permitem a planta responder a
estímulos do meio ambiente, ou seja, responde a ecologia da atmosfera em que a
planta vive. Taiz e Zeiger (2004) relacionam os produtos dos metabólitos
secundários com a defesa vegetal e dispersores de frutos, na proteção contra a
radiação ultravioleta ou na redução do crescimento das plantas competidoras
adjacentes. Fumagali et al. (2008) citam os compostos fenólicos, parte do
metabolismo secundário, como os responsáveis na adaptação da planta e ao seu
ambiente além de possuir atividades farmacológicas.
As classes de metabólitos secundários, não atuam isoladamente em um
determinado sistema, ou seja, influem em conjunto praticamente em todas as
classes deste, como por exemplo, a (Figura 4), seu papel no estresse abiótipo
influenciará no desenvolvimento, sazonalidade, índice pluviométrico, temperatura e
altitude entre outros (LAMBERS; THIJS, 1998).
23
Figura 4 - Influência do Teor de Metabólitos Secundários
Fonte: Gobbo-Neto; Lopes. (2007).
Pancharoeni, Prawat e Tuntiwachwuttikul (2000) alega que grande parte das
espécies popularmente utilizadas encontram-se próximas ao estado silvestre,
mantendo forte interação com o ambiente. As influências dos fatores ambientais na
regulação de biossíntese de metabólitos secundários contribuem no aumento da
produção de compostos de interesse científicos nas espécies de vegetais a ser
investigada. Certos grupos taxonômicos variam sua composição metabólica de
acordo com a espécie, inclusive sendo influenciado no momento da coleta (GOBBONETO; LOPES, 2007; PROBST, 2012).
Bungihan (2012) cita o aumento de produtos naturais de estruturas de plantas
ornamentais alegando que podem ser úteis para diversas enfermidades, entretanto,
são
comumente
ignoradas
e
descartadas
após
o
seu
uso
recreativo.
Consequentemente, a idade e o desenvolvimento da planta, bem como dos
diferentes órgãos vegetais, também são de considerável importância e podem
influenciar não só a quantidade total de metabólitos produzidos, mas também as
proporções relativas dos componentes da mistura (OOTANI, 2010).
Investigações recentes revelaram que níveis de radiação UV-B (ultra-violeta
B) são um importante regulador para a planta durante o ciclo do metabolismo
secundário, entende-se que podem provocar alterações distintas durante sua
biossíntese (DZIALO et al., 2016). A correlação estabelecida entre as estações do
ano mostra que os fatores climáticos, em especifico intensidade da radiação solar e
produção de compostos fenólicos, influenciam na produção de compostos fenólicos,
24
flavonoides e taninos, conforme detalhes da rota metabólica dos Metabólitos
Secundários (figura 5).
Figura 5 - Rota dos Metabólitos primários e vias dos Metabólitos Secundários
Fonte: Santos (2015).
Para Herrerias (2009) para a prevenção no tratamento de determinadas
doenças as plantas medicinais são utilizadas com grande relevância por populares
devido a presença de substâncias bioativas. Simões (2007) relata que as plantas
produzem uma variedade de flavonoides que são denominados por compostos
fenólicos, encontram-se em abundância dentre os metabólitos secundários onde é
caracterizado por conter um ou mais núcleos aromáticos capazes de hidrolisarem e
sintetizarem compostos diversificados de grupos fenólicos, portanto, são os mais
importantes na atualidade pela sua representação e utilização. Sua estrutura
molecular na forma de 15 atómos de carbono (C6-C3-C6) ilustrado na figura 6,
contendo dois anéis aromáticos que são pertencentes da classe dos polifenóis e
amplamente dividas em vários tipos: flavonal, flavononas, flavonas, antocianinas e
isoflavonas.
Berry e Kress (1991) citam evidências morfológicas de que a radiação mostra
influência nas características evolutivas das famílias Zingiberales. A intensidade
solar, luminosidade e o horário de coleta, são fatores que influenciam na
concentração e composição de outras classes de metabólitos secundários durante a
25
coleta e preservação do material vegetal (GOBBO-NETO; LOPES, 2007; PROBST,
2012).
Pesquisas recentes apresentam uma gama de variedade de flavonoides com
aproximadamente mais de 9000 membros representantes (CHEN; LO PIERO;
GMITTER JUNIOR, 2015).
Os estudos com flavonoides tem demonstrado uma
ampla gama de ações terapêuticas (HEBER; 2009) em pesquisas laboratoriais
associadas a ações anti-inflamatórias em grande parte dos compostos fenólicos,
sugere-se que ocorre a inibição da via da ciclooxigenase (SIMÕES; 2007).
Na ordem Zingiberales, estudos envolvendo flavonoides têm sido de grande
interesse devido aos seus efeitos biológicos observados in vivo e in vitro.
Apresentam mecanismos antioxidante que ajudam a combater a inflamação. Na
América do Sul (Brasil, Colômbia, Peru e Bolívia) e países da América Central
(México e Costa Rica) a planta é utilizada tradicionalmente por curandeiros, e na
Ásia há séculos, na medicina ayurvédica (CHATURVEDI; CHOWDHARY, 2015).
Figura 6 - Estrutura química dos Flavonoides
Fonte: Heber (2009).
3.4 Epidemiologia
Na América do Sul, o Brasil é o país com maior número de acidentes ofídicos
por ano, nos últimos 12 anos indicou um aumento de 4,1% ao ano em média
ocorrendo cerca de 27 mil casos registrados por ano entre o período de 2001-2012
(GALLARDO CASAS et al., 2012; MOURA; MOURÃO; SANTOS, 2015). Dados no
Ministério da Saúde (BRASIL, 2014), relatam cerca de 25.302 acidentes decorridos
no ano de 2014.
26
A maioria destes acidentes deve-se a serpentes dos gêneros Bothrops
(jararacas) e Crotalus (cascavéis). Sendo as Bothrops responsáveis por cerca de 80
a 90% das notificações registradas com 0,6% de letalidade nos casos tratados
(PEREAÑEZ et al., 2008; OLIVEIRA; BRITO; MORAES, 2010; D’AGOSTINI;
CHAGAS; BELTRAME, 2012). As serpentes pertencentes ao gênero Crotalus são
responsáveis por cerca de 10% dos acidentes ofídicos, com letalidade em torno de
3,3% (RIBEIRO; ALBUQUERQUE; CAMPOS, 2004).
3.5 Envenenamento Botrópico
A administração do soro específico é a terapia mais eficaz e aceita para o
tratamento de pacientes atingidos por ofídios. Em países onde há falta de serviços
médicos à população, muitas vezes, recorre a outros atendimentos populares como,
por exemplo, a medicina alternativa em especifico os curandeiros (PATIL; PATIL;
PATIL, 2012). A ausência do conhecimento de populares e a indisponibilidade de um
antídoto, aumentam os relatos e a ineficácia do tratamento antipeçonha, causando o
agravamento do local atingido (GALLARDO CASA et al., 2012; HAIDAR; EMRAN;
AL MUSLEMANI et al., 2012).
Entende-se que um antipeçonha neutraliza os efeitos sistêmicos provocados
pelo envenenamento, porém neutraliza parcialmente os efeitos locais. Por isso,
existe a necessidade de realizar trabalhos científicos em ofidismo, buscando outros
métodos, tais como o uso de plantas medicinais (COLLAÇO et al., 2010; SOUZA,
2010). Em consequência de alguns fatores tais como, o soro não possuir ação no
local da picada e ocorrer inflamação muscular imediata causada pela ação do
veneno botrópico devem-se buscar formas alternativas e viáveis para minimizar os
efeitos locais causados pela ação do veneno (FONSECA; SILVA; PEREIRA, 2004).
27
3.5.1 Fisiopatologia do Envenenamento Botrópico
A lesão tecidual é definida por Guyton e Hall (2011), como o momento em
que ocorre a degradação celular causada por agentes químicos que são liberados
pelos tecidos danificados, acredita-se, que as substâncias liberadas causem
alterações secundárias nos tecidos lesionados, ou seja, um complexo de alterações.
O processo inflamatório é uma resposta vascular celular e humoral, responsável
pelo processo de defesa dos organismos vivos frente a agentes agressores devido
ao grande número de mecanismos biológicos como, por exemplo, a formação do
edema e a liberação de mediadores químicos, além de outros fatores provenientes
da soma de eventos (WANDERLEY, 2014). Strapazzon (2011) menciona que a
inflamação pode ter uma origem exógena ou endógena, sendo, uma resposta
protetora dos organismos vivos frente a uma agressão muscular (Figura 7). Os
produtos teciduais tais como a histamina, a bradicinina, a serotonina, as
prostaglandinas entre outros responsáveis pelo processo inflamatório, possuem
substâncias que promovem alterações no fluxo e calibre vascular capazes de
lesionaram as células e destruir o tecido em poucas horas (Figura 8).
28
Figura 7 - Reações no tecido e os 5 sinais clássicos causadores do processo inflamatórios
Fonte: Quizlet, 2016
A fisiopatologia do envenenamento varia de indivíduo para indivíduo, mas
principalmente variando entre as diversas espécies de serpentes. O envenenamento
por serpentes do gênero Bothrops pode causar diversas reações, locais ou
sistêmicas. As manifestações locais são evidenciadas logo após a picada com a
presença de dor, sangramento no local da picada, edema, hemorragias, equimose,
abscesso e formação de bolhas podem surgir e dar origem à necrose cutânea.
Outras complicações locais podem surgir como a infecção secundária levando à
amputação do membro ou déficit funcional do mesmo. Manifestações sistêmicas
também podem surgir como gengivorragia, hematúria, hipotensão, distúrbios da
coagulação sanguínea ocasionando incoagulabilidade do sangue, insuficiência renal
aguda e em casos graves o óbito da vítima (BERNARDE, 2009).
29
Figura 8 - Processo inflamatório, migração de agentes químicos, células leucocitárias e matriz extracelular demonstrando o
edema
Fonte: Hehn (2011).
BERNARDE (2009) o acidente botrópico recebe três classificações, que
variam de acordo com a gravidade. Ele pode ser:
- Leve: onde há dor e edema no local pouco intenso ou mesmo ausente; discretas
manifestações hemorrágicas, com ou sem distúrbios de coagulação.
- Moderado: apresentando dor e edema mais evidentes, ultrapassando muitas
vezes o seguimento anatômico picado; pode ser acompanhado ou não de
alterações hemorrágicas locais ou sistêmicas.
- Grave: intensa dor e edema, podendo atingir todo o membro picado,
eventualmente presença de bolhas. Devido ao edema intenso pode ocorrer
isquemia local pela compressão dos feixes vásculo-nervosos. Manifestações
sistêmicas também podem ocorrer como a hipotensão arterial, choque, oligúria e
hemorragias intensas.
30
3.6 Edema de Pata
O conjunto de mudanças teciduais decorrente de um estímulo lesivo, é
denominada inflamação (GUYTON; HALL, 2011). O processo inflamatório é uma
resposta de organismos vivos a estímulos exógenos, como microrganismos,
traumas, substâncias químicas, calor ou ainda responder a estímulos endógenos
(imunológicos, neurológicos), com a finalidade de reconstituir a estrutura e a função
do tecido ou órgão afetado (ROBBINS; COTRAN; KUMAR, 2001). LUSTOSA (2005)
relata que a ‘’inflamação’’ é uma resposta de defesa, que ocorre no tecido conjuntivo
vascularizado, inclusive no plasma e células circulantes, nos vasos sanguíneos e
nos componentes extravasculares do tecido conjuntivo.
A formação do edema é dada pelo acúmulo de líquido no interstício causado
pelo extravasamento do líquido intracelular para o espaço extracelular, este
mecanismo tende a forçar a saída do fluído de vasos e, pelo efeito oposto da
pressão osmótica exercida pelas proteínas plasmáticas, que tendem a reter o fluído
dentro dos vasos (WANDERLEY, 2014). Segundo Barbosa (2003), a formação do
edema está relacionado ao aumento da permeabilidade vascular com o consequente
escape do exsudato rico em proteínas, compreende-se que o edema inflamatório
ocorre de forma localizada e são compostos de água, eletrólitos e proteínas.
O veneno das espécies pertencentes ao gênero Bothrops tem efeito
predominantemente proteolítico, coagulante, hemorrágico, inflamatório, miotóxico e
edematogênico. Sua composição química é variável, refletindo grandes alterações
com efeitos específicos. A formação do edema induzido pelo veneno de B. jararaca
em patas de ratos e camundongos ocorre pela ativação de ciclooxigenases,
fosfolipase A2 e em menor grau pela ativação de receptores adrenérgicos
(BARBOSA,
2003;
LUSTOSA,
2005).
Estudos
demonstram
o
efeito
antiedematogênico por espécies pertencentes ao gênero Heliconia, com significativa
diminuição do edema de pata (NÚÑEZ et al., 2004; PEREAÑEZ et al., 2008;
ESTRADA et al., 2009; ESTRADA et al., 2010).
31
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Identificação do Material Botânico
A identificação da planta Heliconia rostrata foi realizada pela Profa. Dra.
Renata Sccabia, na Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), e a exsicata de
número (HUMC5331) depositada no Herbarium Mogiense (UMC).
4.2 Cultivo e Obtenção dos Rizomas
O cultivo de H. rostrata Ruiz & Pav. foi conduzido na Universidade do Vale do
Paraíba – UNIVAP, São José dos Campos, SP, Brasil, coordenadas 23º12´39.08´´ S
e 45º57´56.13´´ O. De acordo com a classificação climática de Köppen, localizada a
594 m de altitude acima do nível do mar. O clima de São José dos Campos
enquadra-se no tipo Aw (climática pressupõe a predominância de um clima tropical
seco e úmido) invernos secos, chuvas no outono e verão, com valor médio mensal
de precipitação no mês de janeiro de 210,7 mm (SCOFIELD et al., 2002).
Para a propagação de Heliconia rostrata foram utilizadas 20 estacas obtidas a
partir do rizoma retirado da planta matriz, com tamanho entre 15-20 cm e
apresentando hastes com 30 cm de comprimento, em média. Em seguida, com
auxilio de uma tesoura de poda, foram removidas suas raízes e desprezadas a parte
aérea, eliminando sua haste a uma altura de 30 cm acima dos rizomas.
Como tratamento fitossanitário, antes do plantio, as estacas ficaram
mergulhadas em hipoclorito 1% (1:10), por 10 minutos. Após o tratamento, cada
rizoma foi envolvido com papel toalha e acondicionados em saco plástico preto por
um período de 15 dias, em posterior, foram mantidos em ambiente escuro em
temperatura ambiente até a emissão de suas raízes.
Após o enraizamento, os rizomas foram plantados em vasos de polietileno de
12 litros, utilizando-se como substrato inicial vermiculita e areia (1:1). Os vasos
32
foram mantidos em telado que interceptava 50% de luz por um período 30 dias, ou
seja, até a emissão de brotos e folhas (Figura 9).
Após os 30 dias, as plantas foram submetidas a dois tratamentos com
diferentes intensidades luminosas:
T1 = 50% de luz (sombreamento)
T2 = 100% de luz (pleno sol)
O delineamento experimental constou de 10 plantas mantidas em sombrite
que interceptava 50% de luz (T1) e 10 plantas a pleno sol, 100% de luz (T2),
considerando-se cada planta uma repetição. Foram cultivadas 20 plantas em função
da sua utilização na produção de métodos extrativos.

10 plantas, cada uma sendo uma repetição mantidas a 50% de luz.

10 plantas, cada uma sendo uma repetição pleno sol 100% intensidade
luminosa.
As plantas foram irrigadas diariamente de forma manual e realizado controle de
plantas invasoras. Durante o período experimental, foram realizadas duas
adubações em cobertura com substrato constituído de terra vegetal e húmus. O
período do cultivo de H. rostrata foi de 153 dias, após esse período os rizomas foram
coletados para a obtenção do extrato hidroalcóolico.
33
Figura 9 - Heliconia rostrata em tela com interceptação de 50% de luz (sombreamento).
Fonte: Autor
4.3 Obtenção dos Extratos
Em balança de precisão marca: Meller Toledo modelo: AB204, pesou-se 354g
de rizoma de H. rostrata in natura de cada tratamento T1 (50%sombreamento) e T2
(100% luz). O rizoma fresco foi ralado manualmente com auxílio de ralador
doméstico, e colocado em estufa de circulação de ar forçada, a 38ºC por dois dias
até obtenção do peso constante. Os extratos foram obtidos partir de 3 métodos: 1)
Soxhlet (extração a quente), 2) Maceração (extração a frio) e 3) Ultrassom (extração
a quente), utilizando-se como solvente álcool etílico 70% e 95%. Para cada método
de extração foi usado 10 g de massa seca do rizoma de H. rostrata (Tabela 1).
Objetivando-se verificar se havia diferença entre os extratos do rizoma dos
tratamentos T1 = 50% de luz (sombra) e T2 = 100% luz (pleno sol), realizou-se o
teste biológico com o extrato obtido pelo método Soxhlet (ES1) e (ES2). Como não
houve diferença nos resultados do teste in vivo nas diferentes intensidades
luminosas às quais as plantas foram submetidas, optou-se por realizar os testes
físico-químicos utilizando os extratos do rizoma dos tratamentos T2 = 100% luz
(pleno sol), situação de luminosidade a qual se encontrava a planta matriz.
34
Tabela 1 - Métodos de Extração para obtenção do extrato hidroalcóolico do rizoma de Heliconia rostrata submetidas aos
tratamentos T1 = 50% de luz (sombra) e T2 = 100% luz (pleno sol) processados.
Método Extrativo
Soxhlet (ES1)
Soxhlet (ES2)
Maceração (EM1)
Maceração (EM2)
Ultrassom (US1)
Ultrassom (US2)
T1 50% luz
10g
T2 100% luz
Teor Alcóolico
10g
10g
10g
10g
10g
10g
70%
95%
70%
95%
70%
95%
Fonte: Autor.
4.3.1 Extração Soxhlet (ES)
O extrato do rizoma de H. rostrata obtido pelo método de extração utilizandose Soxhlet (ES) foi realizado em parceria com o Laboratório de Síntese Orgânica,
localizado no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D - UNIVAP).
Utilizou-se um total de 10 g da matéria seca do rizoma do tratamento T1 =
50% de luz (sombra) das quais foram extraídas cada amostra com álcool 95% e
outra amostra de 10 g da matéria seca do rizoma do tratamento T2 = 100% luz
(pleno sol) das quais foram extraídas cada amostra com álcool 95% (125 mL) e
álcool 70% (125 mL) (Figura 10).
A cada duas horas de extração o solvente era trocado para evitar saturação
do mesmo. Ao término da extração, o extrato foi concentrado em rotaevaporador
(Büchi) a 40ºC e posteriormente foi liofilizado no Laboratório de Toxinologia,
localizado no Departamento de Farmacologia da Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP).
35
Figura 10 - A) Obtenção do extrato do rizoma de H. rostrata pelo método Soxhlet completo;
B) Sistema de refluxo (contato material vegetal com o solvente).
A
B
Fonte: Autor.
4.3.2 Extração Maceração (EM)
A obtenção do extrato do rizoma de H. rostrata pelo método de maceração foi
realizada em parceria com o Laboratório de Insumos Naturais e Sintéticos – (LINS),
localizado no Departamento de Ciências Exatas e da Terra da Universidade Federal
de São Paulo – UNIFESP Campus Diadema.
Utilizaram-se duas amostras distintas contendo 10g de matéria seca do
rizoma T2 = 100% luz (pleno sol), nas quais foram adicionados de 200 mL com
álcool a 70% e a 95%.
Cada amostra (10g) foi colocada separadamente em um Erlenmeyer, e
adicionado 200 mL do solvente, mantidos em temperatura ambiente (25ºC) durante
sete dias. Os frascos foram envolvidos em papel alumínio para proteção contra luz,
e agitados uma vez ao dia.
36
4.3.3 Extração Ultrassom (US)
A obtenção dos extratos do rizoma de H. rostrata por ultrassom (US), foi
realizada em parceria com o Laboratório de Insumos Naturais e Sintéticos – (LINS),
localizado no Departamento de Ciências Exatas e da Terra da Universidade Federal
de São Paulo – UNIFESP Campus Diadema.
O método ultrassom promove a extração das substâncias da planta,
sedimentação do material em suspensão, e quebra da célula vegetal, além da
rapidez do processamento da amostra e ser de fácil operação (CAVALHEIRO,
2013).
Para o extrato do rizoma das plantas cultivadas em T2 = 100% luz (pleno sol),
obtidos pelo método ultrassom, utilizaram-se duas amostras distintas contendo 10g
de matéria seca do rizoma as quais foram adicionadas amostras de 200 mL com
álcool a 70% e a 95%.
Frascos de Erlenmeyer contendo o material vegetal e o solvente foram
colocados no processador ultrassônico (Vibra - cell VC 505; Sonics and Material Inc.,
Newtown, Conn., U.S.A.) com probe com 5 mm de diâmetro (modelo CV33) com
potência de 500 w e frequência 60 Hz (Figura 11). O tempo total transcorrido de 240
min, porém, apenas 144 min ligado com (ciclos de 3s on e 2s off). A energia total
desprendida foi cerca de 140,000 J, sendo suas temperaturas iniciais na faixa de
27ºC e 60ºC.
37
Figura 11 - Obtenção do extrato do rizoma de H. rostrata pelo método ultrassom completo.
Fonte: Autor.
4.4 Determinação do Resíduo Seco (DRS)
A determinação do resíduo seco dos extratos T2 = 100% luz (pleno sol)
obtidos a partir de cada método de extração: Soxhlet a 70% (ES1), Soxhlet a 95%
(ES2), maceração a 70% (EM1), maceração 95% (EM2), ultrassom 70% (US1) e
ultrassom (US2) foi realizada a partir de uma alíquota de 200 mL de solução e 10 g
do material vegetal, transferido em um Becker de 250 mL previamente tarado, e
submetido à secagem em chapa de aquecimento a 80ºC até obtenção de um
resíduo de coloração amarela observada no fundo do recipiente. Em seguida, as
amostras foram colocadas na estufa a 60ºC por 40 minutos, posteriormente resfriada
em dessecador, e submetida a uma nova pesagem.
4.5 Determinação da Densidade Relativa (DDR)
A determinação do valor da densidade relativa foi obtida em picnômetro
calibrado com soluções de etanol 70% e etanol 95%. Em seguida, os extratos
38
obtidos por cada um dos métodos extrativos empregados foram transferidos para o
mesmo picnômetro, e pesadas com auxilio de balança de precisão, mantendo-se a
mesma temperatura em todas as análises (25ºC). A densidade relativa de cada
extrato foi obtida dividindo-se a massa do extrato analisado pela massa da
respectiva solução extratora (álcool 70% ou álcool 95%), segundo a equação abaixo.
𝐷𝑅 =
(𝑀 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜+𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)− (𝑀 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑣𝑎𝑧𝑖𝑜)
(𝑀 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜+𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜𝑟𝑎)− (𝑀 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑣𝑎𝑧𝑖𝑜)
4.6 Veneno
O veneno bruto foi coletado dos animais de ambos os sexos, em idade adulta
de espécimes de Bothrops jararaca oriundas da região do Vale do Paraíba (SP).
Para a extração do veneno comprimiram-se as glândulas do veneno manualmente.
Durante a extração do veneno, utilizou-se um recipiente de vidro coberto com
plástico parafilme, (Figura 12) para evitar a contaminação do material. Os espécimes
foram mantidos no Serpentário do Centro de Estudos da Natureza – CEN na
Universidade do Vale do Paraíba - UNIVAP, São José dos Campos, SP, Brasil. Após
a coleta, o veneno foi imediatamente colocado em gelo, liofilizado, e mantido em
refrigeração a 4ºC, até a utilização.
Figura 12 - Extração do veneno de B. jararaca (Serpentário – CEN).
Fonte: Autor.
39
4.7 Animais e Grupos Experimentais
Camundongos albinos Mus musculus machos pesando (18-22 g) provindos
de Laboratório (Anilab, Paulinia, SP, Brasil), foram mantidos no Biotério e abrigados
em temperatura controlada (22 a 28ºC) e umidade constante (24ºC – 60%) sob um
ciclo de 12 h claro/escuro onde foram monitorados diariamente recebendo água e
ração ad libitum. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa de Uso
de Animais (CEUA) na Universidade do Vale do Paraíba - UNIVAP sob o número de
protocolo A01/CEUA/2013. Todos os experimentos foram realizados de acordo com
as orientações da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
(SBCAL).
O teste in vivo, foi realizado no Laboratório de Fisiologia e Farmacodinâmica,
localizado no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento – IP&D da Universidade do
Vale do Paraíba – UNIVAP Campus Urbanova. Para a determinação cinética da
atividade edematogênica em cada um dos grupos experimentais, foram utilizados 80
camundongos injetados subcutaneamente no coxim da pata esquerda traseira (pata
experimental) com veneno botrópico, e nos animais do grupo controle foram
injetados apenas 50 µL de solução salina a 0,9%. Com o objetivo de verificar se o
veneno e compostos bioativos estavam presentes, difundindo-se sistemicamente.
Para este estudo, utilizaram-se dois protocolos:
Protocolo 1: para realização do modelo experimental foi utilizado o ES2 (Soxhlet
95%) como tratamento das amostras T1 (50% luz) e T2 (100% luz) empregando o
seguinte protocolo:
a) Controle (n= 8): os animais receberam 50 µl de solução salina a 0,9% estéril;
b) Veneno (n= 8): 3µg de veneno de B. jararaca diluídos em 50 µl solução salina a
0,9% estéril foram incubados a 37ºC em banho-maria por 30 minutos e
posteriormente injetados nos animais;
c) Extrato Sombra 95% (n= 8): em 100 µg (5g/Kg) do extrato de H. rostrata diluídos
em 50 µl solução salina a 0,9% estéril foram incubados a 37ºC em banho-maria por
30 minutos e posteriormente injetados nos animais;
40
d) Extrato Sol 95% (n= 8): em 100 µg (5g/Kg) do extrato de H. rostrata diluídos em
50 µl solução salina a 0,9% estéril foram incubados a 37ºC em banho-maria por 30
minutos e posteriormente injetados nos animais;
e) T1 Sombra 95% (n= 8): em 100 µg (5g/Kg) do extrato de H. rostrata dissolvidos
com 3µg de veneno de B. jararaca diluídos em 50 µl solução salina a 0,9% estéril
foram incubados a 37ºC em banho-maria por 30 minutos e posteriormente injetados
nos animais;
g) T2 Pleno Sol 95% (n= 8): em 100 µg (5g/Kg) do extrato de H. rostrata dissolvidos
com 3µg de veneno de B. jararaca diluídos em 50 µl solução salina a 0,9% estéril
foram incubados a 37ºC em banho-maria por 30 minutos e posteriormente injetados
nos animais;
Protocolo 2: para realização do modelo experimental, foi utilizado o método Soxhlet
ES1 teor alcóolico (70%) como tratamento T2 (100% luz) empregando o seguinte
protocolo:
a) Controle (n= 8): os animais receberam 50 µl de solução salina a 0,9% estéril;
b) Veneno (n= 8): 3µg de veneno de B. jararaca diluídos em 50 µl solução salina a
0,9% estéril foram incubados a 37ºC em banho-maria por 30 minutos e
posteriormente injetados nos animais;
c) Extrato Sol 70% (n= 8): em 100 µg (5g/Kg) do extrato de H. rostrata diluídos em
50 µl solução salina a 0,9% estéril foram incubados a 37ºC em banho-maria por 30
minutos e posteriormente injetados nos animais;
d) T2 Pleno Sol 70% (n= 8): em 100 µg (5g/Kg) do extrato de H. rostrata dissolvidos
com veneno em 50 µl solução salina a 0,9% estéril foram incubados a 37ºC em
banho-maria por 30 minutos e posteriormente injetados nos animais;
4.8 Atividade Edematogênica
Para determinação da atividade edematogênica podal, as patas dos
camundongos foram mensuradas nos tempos de 0 (antes) e 15, 30, 60, 120, 180,
360 minutos após a administração das soluções. O edema foi quantificado utilizando
41
um
paquímetro
digital
ilustrado
(Figura
13)
Mitutuyo
Digimatic
Indicators
(sensibilidade de 0-150 mm). Os resultados foram expressos entre a diferença dos
valores de medida das patas, ou seja, a relação entre o aumento do valor final da
pata injetada com o valor inicial da mesma. Os valores finais foram designados pela
razão entre os valores da pata experimental (esquerda) dos grupos tratados T1, T2 e
T3 e dos grupos controle e veneno, e os dados foram representados em
porcentagem.
Figura 13 - Mensuração da pata
Fonte: Autor.
4.9 Processamento Histológico
Os animais foram anestesiados e eutanasiados de acordo com o protocolo
estabelecido pelo CEUA/UNIVAP, os animais foram sedados com Ketamina injetável
1 mL/Kg i.p. e Xilazina injetável 0,1 mg/Kg i.p. (mistura em partes iguais). Foram
administradas doses concentradas [1,25UI] de Ketamina e Xilazina intraperitonial
para promover a overdose nos animais.
Após o período experimental, o músculo plantar esquerdo foi coletado e
imediatamente fixado em formol tamponado 10% por um período de 24 h. Em
42
seguida as amostras foram submetidas a processo de desidratação em uma série
ascendente de álcool (50%, 70%, 80%, 90%, 100%) e em seguida xilol.
Por fim, foi realizada a impregnação e inclusão do músculo plantar, onde o
material foi mantido em parafina para confecção dos blocos histológicos e em
seguida para o processo de microtomia.
As análises foram feitas através de cortes histológicos transversais e
longitudinais com a espessura de (5 µm) realizados em um micrótomo (American
Optical 820). Os cortes histológicos foram corados com hematoxilina e eosina (H/E)
e analisados.
A microscopia de luz (Leica DM2500), as imagens dos cortes foram
capturadas com auxilio da câmera fotográfica (Leica DFC425) acoplada ao
microscópio. Entretanto, as fotos, foram avaliadas por áreas representativas com
aumento entre 200X e 400X utilizando-se o software LasV3.7 respectivamente. A
escala foi ajustada em pixels, entretanto foi escolhido o ponto de interesse da
imagem, ou seja, foi selecionada toda a imagem ou parte dela e assim inserido na
prancha.
4.10 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada usando-se a média ± erro padrão da média
(EPM). Empregou-se análise de variância (ANOVA – two way) seguida por
comparações múltiplas pelo método T de student. Foi aplicado o teste para
significância, adotado o nível de (p≤0.05), uma vez encontrada diferença
significativa, realizaram-se testes de comparações múltiplas. Para a realização dos
cálculos utilizou-se o programa Microcal™ Origin™ Versão: 5.0.
43
5 RESULTADOS
Para a realização da DDR e DRS, utilizou-se plantas cultivadas em T2 (Pleno
sol) e extrato hidroalcóolico (70%) e (95%) do rizoma de H.rostrata.
Em função de não ter havido diferença estatística no experimento
antiedematogênico do extrato hidroalcóolico (95%) de plantas mantidas em T1 (50%
sombreamento) e T2 (Pleno Sol) conforme resultados apresentados (Tabela 4)
optou-se por realizar o outro experimento antiedematogênico apenas com extrato
hidroalcóolico (70%) de plantas mantidas em T2 (Pleno Sol). Verificou-se que não
houve diferença estatística em ambos os grupos de estudo.
5.1 Determinação da Densidade Relativa (DDR) e Determinação do Resíduo
Seco (DRS)
Objetivando-se comparar a qualidade dos extratos hidroalcóolicos de
H.rostrata, do tratamento T2 (100% luz), foram avaliados os métodos extração
Soxhlet 70%(ES1), Soxhlet 95%(ES2), Maceração 70% (EM1), Maceração 95%
(EM2), Ultrassom 70% (US1) e Ultrassom 95% (US2), por parâmetros físicoquímicos de Densidade Relativa (Tabela 2). Os resultados obtidos evidenciaram que
as amostras possuem densidade relativa (DDR) entre 0,998 a 1,011. Os maiores
valores 1,010 de DR foram obtidos nos métodos ES1, ES2 e US1, menores valores
em EM2 com 0,998 e US2 com 0.999.
Em relação à determinação do resíduo seco (DRS) (Tabela 2), foram
realizados 3 ensaios com os métodos (ES1), (ES2), (EM1), (EM2), (US1) e (US2)
afim de verificar o melhor método extrativo. No método EM1, obteve o maior valor
(66,5 %) quando comparado com EM2 com (22,3%). Constatou-se que houve maior
quantidade de resíduo seco nos extratos obtidos pelos métodos ES1, EM1 e US1
todas contendo teor alcoólico de 70%.
Na comparação dos métodos extrativos ES2 e US2 ambos contendo teor
alcoólico 95%, verificou-se que não houve diferença nos valores do resíduo seco
(26,2 – 25,8%). Constatou-se que o método ultrassom (US) é o método que se
44
destaca por ser um procedimento mais rápido, que resultou em quantidades de
material extraído semelhante ao em Soxhlet (ES), com a vantagem de se evitar
temperaturas elevadas durante o processo.
Os resultados demonstraram a partir de 10 g da planta seca que o método
ES1 teve maior potencial para extrair o resíduo seco (62,44%) quando comparado a
ES2 no qual se obteve menor quantidade de resíduo seco (26,23%). Os resultados
demonstraram que no método ES, as soluções hidroalcóolicas influenciam no
volume final da extração.
De acordo com os três métodos utilizados ES, EM e US, solventes etanol
70% e 95% verificou-se que os maiores teores de resíduo seco foram obtidos
empregando-se etanol a 70%. Neste sentido, uma vez que não foi observada
qualquer diferença significativa na atividade biológica dos extratos a 70% e 95%,
pode-se presumir que quanto menor for o teor de compostos extraídos, maior será a
seletividade do método, visto que nestes casos os componentes diretamente
relacionados à atividade biológica avaliada devem ter sido extraídos em quantidades
semelhantes, ao passo que outros compostos não ativos (contaminantes) não foram
extraídos por aqueles métodos em que se obtiveram menores teores de resíduo
seco.
Tabela 2 - Parâmetros físicos dos extratos obtidos pelos métodos (ES), (EM) e (US) nas proporções hidroalcóolicas de 70 e
95% do tratamento T2 (100% luz).
Material Vegetal
Densidade Relativa
Resíduo Seco (g)
ES1 70%
1,010
624,7
ES2 95%
1,010
262,3
EM1 70%
1,001
665
EM2 95%
0,998
223
US1 70%
1,011
653,3
US2 95%
0,999
258
Fonte: Autor.
5.2 Ação Edematogênica do Veneno de Bothrops jararaca
Para realização do teste edematogênico utilizaram-se os grupos da Tabela 3.
A injeção intraplantar do veneno de B. jararaca promoveu edema, foi rápido e
45
dependente do tempo. O grupo veneno, após a administração da dose do veneno
bruto, mostrou um aumento progressivo e significativo das patas, o pico máximo foi
atingido após 15 min, chegando a (73±9,0%) e aos 120 min (64±6%), até diminuição
gradativa com declínio progressivo no tempo de 360 min atingindo o valor a (45±7%)
(Figura 14). Além do edema de pata, foram observados macroscopicamente outros
aspectos hemorrágicos.
Tabela 3 - Para a determinação da atividade edematogênica realizou-se nos tempos 0, 15, 30, 60, 120, 180 e
360 minutos em patas de camundongos, a letra x (confirma) o tratamento realizado. Para cada tratamento,
utilizou-se (100µg/pata) do extrato hidroalcóolico de H. rostrata obtido pelo método extrativo ES (Soxhlet), teor
alcóolico (70%) e (95%). O teste edematogênico foi realizado com veneno de B. jararaca (3µg/pata).
Grupos e
Tratamentos
Controle
Veneno/B. jararaca
Extrato Sombra
Extrato Sol
T1 Sombra
T2 Pleno Sol
T3 Pleno Sol
Pata Esquerda
(experimental)
50µl NaCl 0,9%
3µg/50µl
100µg/50µl
100µg/50µl
3µg-100µg/50µl
3µg-100µg/50µl
3µg-100µg/50µl
Planta
50% Luz
Planta
100% Luz
Teor alcóolico
70%
X
x
X
X
x
x
x
Teor alcóolico
95%
x
x
x
x
Fonte: Autor.
.
Figura 14 - Cinética edematogênica induzido pelo veneno de B. jararaca. Os dados representam a média ± E.P.M. de 8
animais com *p≤0,05 do grupo controle e veneno(ANOVA).
46
Controle (0,9% salina)
Veneno (3 ug/pata)
100
90
*
80
Edema (%).
70
*
*
*
*
60
*
50
40
30
20
10
0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
Tempo (min).
Fonte: Autor.
O edema foi avaliado por paquímetro digital antes e após a injeção do veneno
(3µg/pata) onde foram expressos como aumento percentual em relação ao controle.
5.2.1 Ação Antiedematogênica do Extrato Hidroalcoólico do Rizoma de H. rostrata
Avaliou-se a ação dos extratos do rizoma pelo método extrativo Soxhlet (ES)
(Tabela 4) frente à ação do veneno de B. jararaca.
Observou-se que houve inibição do processo inflamatório agudo de pata dos
camundongos, ou seja, o infiltrado celular no local do edema quando avaliado
histologicamente e quantativamente, apresentou ser efetivo em todos os extratos
hidroalcóolicos.
De acordo com as Figuras 15 e 16, os extratos hidralcóolicos 70% e 95% do
rizoma H. rostrata (100 µg/pata) frente à ação veneno de B. jararaca (3 µg/pata), a
atividade antiedematogênica máxima, em 360 minutos (Tabela 4), mostrou atividade
47
inibitória significativa do edema para o grupo T1 Sombra 95%, com diminuição do
edema em 18,25%, para o grupo T2 Pleno Sol 95% diminuição do edema em
19,83% e, para o grupo T3 Pleno Sol 70% pelo método (ES) com diminuição do
edema em 23,22%, respectivamente. Os extratos hidroalcóolicos do rizoma de H.
rostrata de plantas cultivadas em diferentes intensidades luminosas com teor
alcóolico 70% e 95% inibiram a atividade edematogênica do veneno de B. jararaca a
partir de 120 minutos. Não houve diferença significativa entre os grupos.
Tabela 4 - Resultados obtidos do teste antiedematogênico no tempo de 120, 180 e 360 minutos do extrato hidroalcóolico do
rizoma H. rostrata de plantas cultivadas em T1 (50% Sombreamento) teor alcóolico (95%) e T2 (Pleno Sol) teor alcóolico
(95%) e (70%).
Tratamentos
T1 Sombra 95%
T2 Pleno Sol 95%
T3 Pleno Sol 70%
Redução do valor da pata experimental (esquerda).
120 minutos
25±7%
36±1%
26±3%
180 minutos
20±4%
28±4%
25±2%
360 minutos
18±25%
19±83%
23±22%
Fonte: Autor.
Como não houve diferença estatística entre as intensidades luminosas no teor
alcóolico (95%), optou-se por não realizar o teste antiedematogênico com teor
alcóolico (70%) de plantas cultivas em T1 (50% Sombreamento).
Em relação à atividade do veneno de B. jararaca frente ao extrato
hidralcóolico de H. rostrata, segundo os resultados em conjunto apresentados no
grupo T1 Sombra 95% (Figura 15), grupo veneno pico significativo do edema
(p≤0,05). No grupo T1 houve proteção e redução do edema em 120 minutos (de
64±6% para 25±7%) e a porcentagem de inibição em 180 minutos (de 52±7% para
20±4 %).
As análises realizadas a partir do efeito do extrato hidralcóolico de H. rostrata
sobre o processo antiedematogênico do grupo T2 Pleno Sol 95% (Figura 15), grupo
veneno pico significativo do edema (p≤0,05). O grupo T2 mostrou ações de proteção
do edema após 120 minutos (de 64±6% para 36±1%) e a porcentagem de inibição
do extrato em 180 minutos (de 52±7% para 28±4%).
As análises feitas a partir do grupo T3 Pleno Sol 70% (Figura 16) do efeito do
extrato sobre o processo antiedematogênico do grupo veneno ocorreu pico
significativo do edema (p≤0,05). No grupo T3 houve ações de proteção do edema
após 120 minutos (de 47±7% para 26±3%) e a porcentagem de inibição do extrato
em 180 minutos (a partir de 40±6% para 25±2%).
48
Figura 15 - Cinética antiedematogênica pelo extrato hidroalcóolico 95% de H. rostrata de plantas mantidas em sombreamento
50% e pleno sol frente ao veneno de B. jararaca. Os pontos representam a média±E.P.M. (*p≤0,05) em relação ao grupo
controle.
Controle (0,9% salina)
Veneno (3ug /pata)
T1 Sombra 95% (3ug-100ug /pata)
T2 Pleno Sol 95% (3 ug-100ug /pata)
100
90
80
*
Edema (%).
70
*
60
50
40
*
*
30
*
*
20
10
0
0
30
60
90
120 150 180 210 240 270 300 330 360
Tempo (min).
Fonte: Autor.
A utilização do extrato (100μg/Kg) e do veneno (3 μg/Kg) promoveu o
aumento percentual da medida na pata do grupo veneno, grupo T1 Sombra 95% e
grupo T2 Pleno Sol 95% em relação ao grupo controle, com significância na
diminuição do edema. Aumento percentual da pata do grupo veneno, grupo T1
Sombra 95% e do grupo T2 Pleno Sol 95% em relação ao grupo controle, teve
significância na diminuição do edema. Cada grupo constou de 8 animais.
Figura 16 - Cinética antiedematogênica pelo extrato hidroalcóolico 70% de H. rostrata de plantas mantidas em pleno sol
frente ao veneno de B. jararaca. Os pontos representam a média ± E.P.M. (* p<0,05). em relação ao Grupo Controle.
49
Controle (0,9% salina)
Veneno (3ug /pata)
T2 Pleno Sol 70% (3ug-100ug /pata)
100
90
80
*
Edema (%).
70
*
60
50
40
*
30
*
20
10
0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
Tempo (min).
Fonte: Autor.
O extrato (100 μg/Kg) e veneno (3 μg/Kg). Observa-se o aumento percentual
do valor da pata do grupo veneno e grupo T3 Pleno Sol 70% em relação ao grupo
controle, com significância na diminuição do edema. Aumento percentual do valor do
grupo veneno e do grupo T2 Pleno Sol 70% em relação ao grupo controle, com
significância na diminuição do edema. Cada grupo constou de 8 animais.
5.3 Alterações Histopatológicas
Durante a captura das imagens utilizando o software (LasV3.7). As imagens
do tecido muscular foram capturadas no M.O (microscópio óptico) e tratadas com o
software Gimp 2.8.
50
Nas Figuras 17 – A, corte histológico longitudinal, grupo controle verificaramse fibras musculares com estriações visíveis e núcleos periféricos com aparência
normal não apresentando infiltrado inflamatório ou edema tecidual.
Nas fotomicrografias das Figuras 17 – B, corte histológico transversal, grupo
veneno, foi observado espaçamento entre as fibras esqueléticas. Constatou-se o
potencial do veneno de B. jararaca evidenciando a separação das fibras e ruptura da
membrana, ou seja, sinais evidentes de resposta inflamatória através da migração
de neutrófilos. Verificou-se também a presença de células leucocitárias.
Na fotomicrografia, corte histológico transversal, grupo T1 Sombra 95%
observou-se a integridade da matriz extracelular. Houve pouco rompimento de fibras
esqueléticas, entretanto, foi verificada a presença de pequenos infiltrados
inflamatórios entre as fibras musculares decorrentes da ação do veneno (Figura 17 –
C). Não foi observado extravasamento do liquido intersticial.
No corte histológico longitudinal (Figura 17 – D), grupo T1 Sombra 95%, é
destacada a integridade da membrana extracelular, suas estriações e seus núcleos
periféricos aparentemente normais, o grupo T1 Sombra 95% foi o tratamento que se
aproximou mais do grupo controle (Figura 17 – A).
No corte histológico transversal, grupo T2 Pleno Sol 95% observa-se
pouquíssimas rupturas entre o espaçamento da membrana extracelular, as células
musculares não se encontravam aderidas devido ao edema (Figura 17 – C). Porém,
diferente do grupo T1 Sombra 95%, corte transversal, as células encontravam-se
aderidas (Figura 17 - E).
No corte histológico longitudinal, grupo T3 Pleno Sol 70%, houve ruptura de
membrana extracelular, espaçamento entre fibras (EF) e presença de pequenos
vasos com infiltrados inflamatórios (IF), aproximando-se do grupo T2 Pleno Sol 95%
(Figura 17 - G e 17 - H) estando presentes células leucocitárias e sinais de
mionecrose.
Figura 17 - (A) Grupo controle, Solução Salina (50 µl). A – Plano longitudinal mostrando as fibras musculares integras com
(ponta da seta); núcleos periféricos(N) com suas estriações (corpo da seta); integridade da membrana celular (seta).
Coloração (H/E). Aumento: 200x. (B) Grupo veneno, B. jararaca (3 µg). B – Secção longitudinal do músculo plantar;
Aumento: 400x. Área de edema (AE) com espaçamento das fibras esqueléticas; ruptura das fibras musculares da membrana
(Circulo), alterações típicas de mionecrose. Coloração (H/E). (C – D) Grupo T1 Sombra 95%, extrato de H. rostrata (100 µg)
incubado com veneno de B. jararaca (3 µg). C – Secção transversal do músculo plantar; Redução do infiltrado inflamatório
(IF) periferia nuclear (N) e fibras mais espessas do Espaçamento entre as Fibras (EF). Coloração (H/E). Aumento: 200x. D –
Secção longitudinal do músculo plantar; Aumento: 200x. Espaçamento entre as Fibras e suas estrias (EF) Coloração (H/E).
(E – F) Grupo T2 Pleno Sol 95% extrato de H. rostrata (100 µg) incubado com veneno de B. jararaca (3 µg). E – Secção
51
transversal do músculo plantar, Área de edema (AE); Aumento: 200x . Infiltrado Inflamatório (IF) ruptura de membrana e
espaçamento entre as fibras (EF). Coloração (H/E). F – Secção longitudinal do músculo plantar; Aumento: 200x. infiltrado
inflamatório (IF) e Espaçamento entre as fibras (EF). Coloração (H/E). (G-H) Grupo T3 Pleno Sol 70% extrato de H. rostrata
(100 µg) incubado com veneno de B. jararaca (3 µg). G – Secção transversal do músculo plantar; periferia Nuclear (N) e
fibras mais espessas do espaçamento entre as fibras (E.F). Coloração (H/E). Aumento: 200x; H – Secção longitudinal do
músculo plantar; Aumento: 200x; Espaçamento entre as Fibras e suas estrias (EF); redução do infiltrado inflamatório (IF)
Coloração (H/E).
Fonte: Autor.
52
6 DISCUSSÃO
6.1 Cultivo de Heliconia rostrata a Pleno Sol e a 50% de Sombreamento
No presente estudo verificou-se a partir dos resultados físicos-químico
(Tabela 2) e teste antiedematogênico, (Tabela 3) que a condição de luminosidade a
que as plantas de H. rostrata foram submetidas parece não ter interferido no rizoma.
Argolo (2009) realizou estudo objetivando verificar a influencia do teor de
luminosidade em Heliconia spp., e constatou que cada espécie de Heliconia
apresenta diferentes necessidades de luminosidade, porém, em geral preferem
pleno sol ou sombreamento parcial.
No presente estudo constatou-se o aumento da área foliar das plantas
cultivadas no tratamento T1 (50% sombreamento). Lima et al., (2016) verificaram
aumento da área foliar de Heliconia bihai cultivadas sob diferentes níveis
sombreamento.
Francisco et al (2013) realizaram estudos com diferentes intensidades
luminosas em Heliconia velloziana, e relatam que a energia acumulada no rizoma
devido a baixa disponibilidade de luz, podem ser compensada para defesa e
desenvolvimento da planta ao longo dos anos. Lee et al., (2000), demonstraram que
algumas plantas submetidas a mudanças nas condições de luz, são capazes de se
adequarem à nova condição luminosa.
Aparentemente a luminosidade parece não ter interferido na biossíntese dos
compostos ativos em função dos resultados obtidos no ensaio biológico in vivo
(Tabela 3).
Francisco et al (2013) relataram que no rizoma de H.velloziana pode conter
componentes bioquímicos para síntese de metabólitos secundários, que são
utilizados para sua defesa.
Lacerda, Enéas Filho e Pinheiro (2007) relatam que os metabólitos
secundários presentes na planta são influenciados pelo tipo de cultivo, fatores
genéticos e condições de luminosidade.
53
6.2 Comparações dos Métodos Extrativos a Partir de Parametros FísicoQuimicos do Extrato Hidroalcóolico de Heliconia rostrata
Através dos ensaios físico-químicos realizados neste estudo com o extrato
hidroalcoólico de H.rostrata podem ser denominados de ‘‘Padronização do Extrato’’,
pois parâmetros físico-químicos do extrato hidroalcoólico de H.rostrata podem ser
comparados com ensaios futuros que serão baseados nestes valores determinados.
A partir da obtenção do extrato hidroalcoólico dos rizomas do tratamento T2
(100% luz) de H.rostrata, constatou-se a DDR (Determinação da Densidade
Relativa) (Tabela 2).
Para DDR (Determinação da Densidade Relativa), obtiveram-se os valores
entre 0,998 a 1,011. O método de extração Soxhlet 70%(ES1), Soxhlet 95% (ES2) e
Ultrassom 70% (US1) possuem valores da DDR superiores (1,010 a 1,011). Para os
extratos com teor alcoólico (95%) exceto Soxhlet 95% (ES1), demonstraram valores
inferiores (0,998 a 0,999) (Tabela 2).
Observou-se que os resultados obtidos da DDR do extrato hidroalcóolico de H
rostrata foram influenciados pelo teor alcóolico (70%) e (95%) e não pelo método
extrativo (ES), (EM) e (US), porém existem poucos estudos referentes a DDR para a
Ordem Zingiberaceae.
Constatou-se que tanto o teor alcóolico (70%) e (95%) foi capaz de selecionar
e extrair seletivamente proteína e açúcar em meio menos aquoso sugere-se que a
diferença obtida entre o mesmo método extrativo (Tabela 2) influenciou na qualidade
e quantidade de partículas dissolvidas do extrato, entretanto para seletividade
recomenda-se o teor alcóolico 95% por extrair pouco açúcar.
Verifica- se que através da DRS (Determinação Resíduo Solido) do extrato
hidroalcóolico (95%) do rizoma de H. rostrata foi seletiva para metabólitos e
compostos bioativos, visto que a água influenciou apenas na quantidade de resíduo
sólido e volume do solvente. Oliveira et al. (2015) relatam que a diferença
quantitativa do rendimento sólido em métodos extrativos hidroalcóolicos é
determinada pelo etanol, por ser uma molécula anfifílica capaz de extrair
substâncias apolares e polares.
Estrada et. al., (2010) através da obtenção do extrato etanólico (96%) de H.
rostrata e H. psittacorum realizaram Análise de Quantificação de Metabólitos e
54
tratamento de Ultrassom Assistida por Dissolução (UAD). Verificaram níveis
elevados de carboidratos e açucares em H. rostrata, constataram-se que o
tratamento por UAD facilita a condução da massa, concentração de metabólitos e
compostos bioativos do extrato no solvente.
Sugere-se que nos métodos extrativos ES, EM e US do extrato hidroalcóolico
de H. rostrata possa conduzir cerca de 400 mg de compostos não ativo, que devem
ser hidrossolúveis e desnecessários. Os compostos mais hidrossolúveis sendo
açucares e proteínas em H. rostrata parecem não estar interferindo na atividade
biológica.
Observou-se no que se refere à Determinação do Resíduo Seco (DRS), que o
extrato foi mais bem diluído no método Maceração 70% (EM1) o qual apresentou
valores de DRS 66,5% e Maceração 95% (EM2), houve menor diluição do extrato,
com valor de DRS 22,3%.
Os resultados de DRS demonstraram que o método Soxhlet 70%(ES1)
(62,44%) teve maior potencial para extrair o resíduo seco quando comparado com
Soxhlet 95%(ES2) (26,23%), no qual obteve-se menor quantidade de resíduo seco.
(Tabela 2).
O método de extração Soxhlet (ES) permite a extração sólido-liquida com
eficiência, pois há renovação constante do solvente e temperatura relativamente alta
que facilita a penetração do solvente no tecido vegetal aumentando o contato de
ambos. Junior (2013) constatou-se a DRS do extrato hidroalcoólico (70%) das folhas
de Alpinia zerumbet (Pers.). (Zingiberaceae), e verificou obtendo valores inferiores a
(11,48%). Na literatura pesquisada, não há estudos referentes ao DRS para gêneros
da família Heliconeaceae, e nem o DRS do rizoma de gêneros de famílias próximas ,
como é o caso das Zingiberaceae.
Na comparação dos métodos extrativos Soxhlet (ES) e Ultrassom (US),
ambas contendo teor alcoólico (95%), verificou-se que não houve diferença nos
valores do resíduo seco (26,2% – 25,8%).
Observa-se que houve diferença estatística no acúmulo de massa
influenciada pelo teor alcóolico (70%) e (95%), porém, não houve diferença
estatística entre os métodos de extração Soxhlet (ES), Maceração (EM) e Ultrassom
(US).
55
6.3 Ação Edematogênica do Veneno de Bothrops jararaca
A atividade do edema de pata induzido pelo veneno bruto de B. jararaca
(Figura 14) revelou um período curto de instalação, o efeito edematogênico máximo
no grupo veneno (3µg/pata) em 15 minutos (73%) após a injeção intraplantar. Os
resultados obtidos neste estudo foram similares aos de Olivo et
al. (2007) que
verificou através da mensuração do edema de pata induzido pelo veneno de B.
jararaca (2,5µg/pata) em camundongos a atividade edematogênica máxima após 15
minutos (65%).
Em virtude do veneno de serpentes do gênero Bothrops sp. induzir inflamação
imediata no local da picada, característica de seu potencial em liberar mediadores
químicos na matriz extracelular responsáveis pela formação do edema (PUZZI et al.,
2008; ZAQUEO et al., 2016).
Cunha e Martins (2012) realizaram levantamento bibliográfico dos principais
compostos químicos do veneno de B. jararaca e constataram presença da
fosfolipase A2 (enzima PLA2) em abundância, prejudicial às fibras musculares e
responsáveis pela resposta inflamatória imediata.
As análises quantitativas do grupo veneno mostraram atividade inflamatória
aguda caracterizada pela ação da enzima PLA2 do veneno. Verificou-se que a ação
edematogênica do veneno de B. jararaca (3µg/pata) leva ao acúmulo e infiltração de
fluídos nas células do mioblasto e leucocitárias responsáveis pela ruptura das fibras
musculares em camundongos.
Os resultados obtidos referentes à histologia (Figuras 15 e 16) do grupo
veneno indicam que houve aumento da permeabilidade vascular e presença de
mionecrose evidenciada pela destruição das fibras e extravasamento do líquido
intersticial, ocasionados pelo veneno de B. jararaca.
6.3.1 Ação Antiedematogênica do Extrato Hidroalcoólico de Heliconia rostrata
56
Foi constatada na literatura a existência à família Heliconiaceae no que se
refere a testes de ação inibitória do veneno de serpentes do gênero Bothrops.
Verificou-se nesse estudo que o extrato hidroalcoólico de H. rostrata obtido pelo
método Soxhlet (ES) nos grupos T1 Sombra 95%, T2 Pleno Sol 95% e T3 Pleno Sol
70% apresentaram ação antiedematogênica em todos os grupos frente à ação do
veneno de B. jararaca. Estudos etnobotânicos da flora Colombiana realizados por
Núñez et al. (2004) confirmaram a ação antiedematogênica do extrato etanólico
96% de Heliconia curtispatha frente à ação do veneno de B. asper em
camundongos.
Sugere-se que o extrato hidroalcoólico do rizoma H. rostrata apresenta
substâncias ativas com potencial inibitório frente à ação do veneno B. jararaca.
ESTRADA et al. (2009) confirmaram através da quantificação de proteínas e
carboidratos do extrato etanólico (96%) do rizoma de H. rostrata a presença de
metabólitos e carboidratos totais responsáveis pela neutralização do veneno de B.
asper. PEREAÑEZ et
al. (2008) citam que as análises proteolíticas do extrato
etanólico (96%) do rizoma de H. curtispatha confirmaram a atividade inibitória do
veneno de B. asper e alta capacidade de degradação proteica. Observou-se que o
extrato de H. rostrata possui um mecanismo de ação desconhecido capaz de
interagir com as toxinas do veneno de B. jararaca. Sugere-se que no extrato
hidroalcoólico de Heliconia rostrata estão presentes elementos capazes de
reconhecer as toxinas do veneno de Bothrops jararaca.
No presente estudo, o teste antiedematogênico dos extratos de H. rostrata foi
capaz de reduzir significamente o edema de pata provocado pela injeção de veneno
de B. jararaca a partir dos 120 minutos (Figuras 15 e 16). Os resultados obtidos nos
testes antiedematogênico do grupo T1 Sombra 95%, grupo T2 Pleno Sol 95% e
grupo T3 Pleno Sol 70% demonstraram que o extrato hidroalcoólico de H. rostrata foi
capaz de reduzir significamente o edema de pata provocado pela injeção intraplantar
do veneno de B. jararaca. Verificou-se a diminuição do edema no tempo de 360
minutos nos grupos T1 Sombra 95% em 18,25%, T2 Pleno Sol 95% em 19,25% e T3
Pleno Sol 70% em 23,22% (Tabela 4). Os resultados apresentados neste trabalho
são similares aos de Nuñez et al. (2004) onde é relatada a ação antiedematogênica
e neutralizante do extrato etanólico (96%) do rizoma de H.curtisphata e Renealmia
alpinia (Zingiberaceae) frente à ação do veneno de B. asper a neutralização do
veneno e a redução do volume das patas em camundongos em 25%. A rápida
57
neutralização caracterizada pelo extrato de H.curtisphata e Renealmia alpinia
(Zingiberaceae) frente à ação do veneno de B. asper não garantiu a diminuição do
edema de pata em curto prazo de tempo.
As análises histopatológicas do grupo T1 Sombra 95%, grupo T2 Pleno Sol
95% e grupo T2 Pleno Sol 70% referentes ao extrato do rizoma H. rostrata foi
responsável por auxiliar no processo de proteção dos filamentos das fibras
musculares frente à ação catalítica provinda de mediadores químicos tais como as
proteases e fosfolipases A2 contidas no veneno de B. jararaca (Figuras 17 e 18).
Estudos atuais feitos por CHAVASCO et al. (2014) através da avaliação do perfil
fitoquímico do extrato hidroalcoólico (70%) da haste e flores de H. rostrata
confirmam presença de flavonoides. MACHADO et al., (2008) mencionam através
de um levantamento bibliográfico o potencial dos flavonoides em auxiliarem e
inibirem a oxidação lipídica. A partir da observação das lâminas histológicas sugerese que a ação dos compostos bioativos do extrato hidroalcoólico de H. rostrata
possam auxiliar na proteção das fibras musculares frente aos danos musculares
provocados pela ação do veneno de B. jararaca em camundongos.
Através das análises quantitativas (Figuras 15 e 16) e histológicas (Figuras 17
e 18), o extrato hidroalcoólico de H. rostrata possui atividade antiedematogênica e
anti-inflamatória capazes de auxiliarem no tratamento do local da picada inibindo as
atividades do veneno de
B. jararaca. Devem ser feitos novos estudos
antiedematogênicos e histológicos com outros métodos extrativos de H. rostrata, tais
como (EM) e (US) para verificar se há diferenças quantitativas e histológicas
oriundas do método extratativo. Os resultados obtidos confirmam o uso empírico de
H. rostrata na medicina popular neotropical para tratamento de vítimas decorrentes
de acidentes ofídicos.
58
7 CONCLUSÕES
Frente aos objetivos propostos e resultados obtidos, conclui-se que:

O extrato hidroalcóolico (95%) do rizoma de H. rostrata de plantas cultivadas
a (50%) de sombreamento, obtido pelo método Soxhlet (ES), mostrou-se
eficiente na atividade antiedematogênica com uma proteção com cerca de
(18%).

Não houve diferença ou interferência no teste antiedematogênico dos extratos
hidroalcóolicos método Soxhlet 70%(ES) e Soxhlet 95%(ES) em ambas
situações fisiológicas de luminosidade, constatando que o teor de resíduo
sólido extraído não influenciou no teste antiedematogênico.

O extrato hidroalcóolico 95% demonstrou-se seletivo para os prováveis
compostos biologicamente ativos que foram igualmente extraídos em ambas
as condições (ES), (EM) e (US), portanto, os extratos realizados com álcool
95% teve um rendimento com melhor qualidade de produto final, porém
manteve a atividade biológica.

A partir dos resultados obtidos in vivo, conclui-se que os extratos
hidroalcóolicos 70% e 95% e as diferentes intensidades luminosa as quais o
cultivo foi submetido, não influenciaram na produção dos compostos
biologicamente ativos.

Através das avaliações quantitativas e histológicas, conclui-se que o extrato
hidroalcóolico de Heliconia rostrata, possui ação antiedematogênica e
proteção nos efeitos locais promovidos pelo veneno de Bothrops jararaca em
pata de camundongos.
59
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ANEXO – COMITÊ DE ÉTICA