Cardoso, Anne Caroline Andrade [Dissertação, 2015]

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A
PRODUTOS PARA SAÚDE
ANNE CAROLINE ANDRADE CARDOSO
DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS
CONTENDO ÓLEO DE COPAÍBA (Copaifera spp.) E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE CICATRIZANTE IN VIVO
NITERÓI
2015
ANNE CAROLINE ANDRADE CARDOSO
DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS
CONTENDO ÓLEO DE COPAÍBA (Copaifera spp.) E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE CICATRIZANTE IN VIVO
Dissertação apresentada ao Curso de Pósgraduação em Ciências Aplicadas a Produtos
para Saúde da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito à obtenção do título de Mestre.
Orientadora:
Profª Drª Deborah Quintanilha Falcão
Co-Orientadora:
Drª Ana Claudia Fernandes Amaral
Niterói, RJ
2015
C 683
Cardoso, Anne Caroline Andrade.
Desenvolvimento de nanopartículas lipídicas sólidas contendo
óleo de copaíba (Copaifera spp.) e avaliação da atividade cicatrizante
in vivo/ Anne Caroline Andrade Cardoso; orientadora: Deborah
Quintanilha Falcão. ― Niterói, 2015.
85f.
Dissertação (Mestrado) ― Universidade Federal Fluminense,
2015.
1. Nanotecnologia. 2. Óleo de Copaíba. 3. Cicatrização de ferida.
4. Fabaceae. I. Falcão, Deborah Quintanilha. II. Título.
CDD 620.5
ANNE CAROLINE ANDRADE CARDOSO
DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS
CONTENDO ÓLEO DE COPAÍBA (Copaifera spp.) E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE CICATRIZANTE IN VIVO
Dissertação apresentada ao Curso de Pósgraduação em Ciências Aplicadas a Produtos
para Saúde da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito à obtenção do título de Mestre.
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________________________________
Profª Drª Deborah Quintanilha Falcão - UFF
Orientadora
______________________________________________________________________
Profª Drª Alessandra Lifsitch Viçosa – FIOCRUZ
______________________________________________________________________
Profª Drª Priscilla Vanessa Finotelli – UFRJ
______________________________________________________________________
Profª Drª Samanta Cardozo Mourão - UFF
NITERÓI
2015
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me nortear em todas as decisões, pela motivação a buscar sempre
excelência, por me abençoar em todas as etapas, não só do presente trabalho, mas em toda a
minha vida e me dar forças nos momentos difíceis.
Á minha mãe, Cristiane, pela preocupação, pelas orações, pela força, carinho, compreensão e
amizade. Ao meu pai, Cardoso, por sempre acreditar no meu potencial e me ensinar que tudo
é possível com determinação, treino e estudo. À Vandete e Roseane, pelas orações, por todo
amor e cuidado. A Raphael, pela compreensão, companheirismo, e por todo o suporte.
Á minha orientadora e amiga, Prof.ª Dr.ª Deborah Quintanilha Falcão, pela disponibilidade,
conselhos, aprendizado, inspiração e também pelas correções.
Á co-orientadora, Dr.ª Ana Cláudia Fernandes Amaral, pela disponibilização do laboratório e
auxílio.
Á Dr.ª Aline de Souza de Ramos, pelo auxílio de vital importância na realização do
planejamento experimental.
Á todos os amigos de laboratório, em especial à Patricia Alice Knupp Pereira, pela
colaboração nos ensaios.
Á Prof.ª Dr.ª Sabrina Calil pela disponibilização do laboratório e orientação nos ensaios de
regeneração cutânea. Assim como à Paula Avarenga, Thaísa Amorim e Angélica Silveira pela
colaboração na realização dos mesmos.
Ao Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF), em especial à Silvia Albuquerque pelas
análises de ATD e IV.
Ao Laboratório Multiusuário de Caracterização de Materiais (LAMATE) do IQ-UFF, em
especial à Prof.ª Dr.ª Célia Machado Ronconi pela disponibilização do aparelho de
espalhamento dinâmico de luz e potencial zeta (DLS).
À Cooperativa Extrativista dos Produtores Rurais do Vale do Rio IACO (Cooperiaco) e à
Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) pelo fornecimento do óleo de copaíba.
Aos membros da banca examinadora, Prof.ª Dr.ª Alessandra Lifsitch Viçosa, Prof.ª Dr.ª
Priscilla Vanessa Finotelli por terem atendido ao convite.e a Prof.ª Dr.ª Samanta Cardozo
Mourão por ter atendido ao convite e pela revisão.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa
concedida, imprescindível para que o trabalho fosse desenvolvido com a tranquilidade
necessária.
A todos que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
RESUMO
Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) são sistemas de liberação de fármacos promissores e
podem ser simplificadamente descritos como nanoemulsões em que a fase interna consiste em
lipídeos no estado sólido. Esses nanossistemas podem facilmente encapsular produtos de
origem natural como óleos essenciais e fixos. Tendo em vista as inúmeras propriedades
farmacológicas do óleo de copaíba (Copaifera spp.), em destaque a utilização como
cicatrizante de feridas, elaborou-se um planejamento experimental do tipo fatorial fracionado
para o desenvolvimento de NLS contendo este óleo e avaliou-se a atividade cicatrizante in
vivo. Sete formulações foram preparadas utilizando diferentes combinações das variáveis:
tempo de ultrassom, amplitude da potência do ultrassom e razão entre ativo e lipídeo. A
influência das mesmas para determinação da melhor formulação foi investigada frente os
parâmetros de resposta: diâmetro hidrodinâmico médio de partícula (Z-ave) e conteúdo de
óleo encapsulado (CO). A atividade cicatrizante foi avaliada apela aplicação da formulação
(NC), por cinco dias, em lesões cutâneas na região dorsal de camundongos utilizando grupos
comparativos em que foi administrada solução salina fisiológica (S), óleo mineral (OM),
solução de óleo de copaíba (SCT) e NLS sem óleo (N). Somente a razão ativo/lipídeo parece
ter influência sobre o CO, e embora nenhuma das variáveis estudadas tenha relação linear
com o Z-ave, verificou-se que o tempo e a amplitude do ultrassom tem influência negativa e a
quantidade de óleo empregado na formulação tem influência positiva sobre esse parâmetro. A
melhor formulação consistiu na utilização dos maiores valores das variáveis estudadas: 50%
da razão ativo/lipídeo, 10 min de tempo de ultrassom e 50% de amplitude do ultrassom, e
apresentou Z-ave de 208,0 ± 2,10 nm, índice de polidispersidade (IP) de 0,315± 0,012,
potencial zeta (PZ) de –14,1 ± 0,40 mV, CO de 143,31 ± 11,80 mg de óleo/g de NLS e
eficiência de encapsulamento (EE) 62,10 ± 5,12%. Os espectros de infravermelho (IV), a
análise térmica diferencial (ATD) e o perfil de liberação in vitro do óleo, sugerem que o
mesmo foi eficazmente encapsulado sem indicar a presença de óleo adsorvido à superfície da
NLS. Houve uma liberação lenta de 82,60% de óleo em 53,5 h, com a participação dos
mecanismos de difusão e erosão. A formulação manteve as características físicas
mencionadas após 6 meses de armazenamento à 4ºC em frasco de plástico transparente. As
lesões apresentaram aumento de tamanho quando tratadas com óleo de copaíba, mas ao final
do estudo, no décimo quarto dia, não houve diferença estatística entre os grupos. Dessa
maneira foi possível obter uma formulação nanométrica otimizada e estável, com o menor
gasto possível de recursos e tempo.
Palavras-chave: nanotecnologia, nanopartículas lipídicas sólidas, óleo de copaíba, Copaifera
spp. , planejamento experimental, fatorial fracionado, cicatrização.
ABSTRACT
Solid Lipid Nanoparticles (SLN) are promising drug release systems, and may be described in
a simplified manner as nanoemulsions which the internal phase consists of lipid in a solid
state. These nanosystems can easily encapsulate natural products as essential and fixed oils.
Due to the numerous pharmacological properties of Copaiba oil (Copaifera spp.), with
emphasis on the wound healing, a fractional factorial experimental design was elaborated for
the development of SLN containing this oil, and the wound healing activity in vivo was
evaluated. Seven formulations were prepared using different combinations of the variables:
ultrasound time, ultrasound amplitude and oil/lipid ratio. The influence thereof were
investigated in the response parameters, mean hydrodynamic particle diameter (Z-ave) and
content of encapsulated oil (CO) in order to determine the best formulation. The wound
healing activity was evaluated by applying the copaiba loaded SLN (NC) for five days in the
dorsal cutaneous lesions in mice, using comparative groups in which were administered
physiological saline solution (S), mineral oil (MO), copaiba oil solution (SCT) and unloaded
SLN (N). Only the oil/lipid ratio seems to influence the CO, and although none of the studied
variables showed linear relationship with the Z-ave, it was found that the time and amplitude
of ultrasound has a negative influence and the amount of oil used in the formulation has
positive influence on this parameter. The best formulation consisted on the highest values of
the studied variables: 50% oil/lipid ratio, 10 min of ultrasound time, 50% of ultrasound
amplitude and showed Z-ave of 208.0 ± 2.10 nm, polydispersity index (PI) of 0.315 ± 0.012,
zeta potential (ZP) of -14.1 ± 0.40 mV, CO of 143.31 ± 11.80 mg of copaiba oil/g of SLN and
entrapment efficiency (EE) of 62.10 ± 5.12% Infraredspectra (IR), differential thermal
analysis (DTA) and the in vitro oil release profile, suggested that it was effectively
encapsulated with no indication of adsorbed oil on the SLN surface. There was a slow release
of 82.60% of oil in 53,5h, with the participation of diffusion and erosion mechanisms. The
formulation maintained the physical characteristics described after 6 months of storage in a
transparent plastic bottle. Lesions had size increased when treated with copaiba oil,
nevertheless, at the end of the study, on the fourteenth day, there was no statistical difference
between groups. Thereby, it was possible to obtain an optimized and stable nano-formulation,
spending less time and resources as possible .
Keywords: nanotechnology, solid lipid nanoparticles, copaiba oil, copaifera spp.,
experimental design, fractional factorial, wound healing.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO __________________________________________________________ 13
2 EMBASAMENTO TEÓRICO ______________________________________________ 14
2.1 NANOBIOTECNOLOGIA _______________________________________________ 14
2.2 NANOBIOTECNOLOGIA E SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS ______ 15
2.3 NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS _________________________________________ 16
2.3.1 Nanopartículas Lipídicas Sólidas _________________________________________ 16
2.3.1.1 Delineamento da Formulação de Acordo com a Via de Administração __________ 19
2.3.2 Carreadores Lipídicos Nanoestruturados____________________________________ 21
2.3.3 Nanopartículas Conjugadas Fármaco-Lipídeo _______________________________ 23
2.4 NLS E ÓLEOS VEGETAIS _______________________________________________ 23
2.5 ÓLEO DE COPAIBA ____________________________________________________ 24
2.5.1 Reserva Extrativista Chico Mendes ________________________________________ 28
2.5.2 Propriedades biológicas _________________________________________________ 29
2.6 O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO TECIDUAL ____________________________ 34
2.7 PLANEJAMETO ESTATÍSTICO EXPERIMENTAL __________________________ 35
3 OBJETIVO _____________________________________________________________ 37
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ______________________________________________ 37
4 METODOLOGIA ________________________________________________________ 38
4.1 MATERIAIS __________________________________________________________ 38
4.1.1 Matérias-primas e reagentes _____________________________________________ 38
4.1.2 Equipamentos e acessórios ______________________________________________ 38
4.2 MÉTODOS ____________________________________________________________ 39
4.2.1 Desenvolvimento de metodologia analítica para quantificação do óleo de copaíba ___ 39
4.2.1.1 Quantificação do óleo de copaíba para determinação do conteúdo de óleo encapsulado
________________________________________________________________________ 39
4.2.1.2 Quantificação do óleo de copaíba para avaliação do perfil de liberação __________ 39
4.2.2 Desenvolvimento das nanopartículas ______________________________________ 39
4.2.3 Caracterização das nanopartículas _________________________________________ 41
4.2.3.1 Diâmetro hidrodinâmico médio (Z-ave) e potencial Zeta (PZ) _________________ 41
4.2.3.2 Determinação do conteúdo de óleo encapsulado (CO)________________________ 41
4.2.3.3 Espectrometria no infravermelho - transformada de fourier (IV-TF) ____________ 42
4.2.3.4 Análise térmica diferencial (ATD) _______________________________________ 42
4.2.3.5 Determinação do perfil de dissolução in vitro das nanopartículas _______________ 42
4.2.4 Estudo da estabilidade das nanopartículas ___________________________________ 43
4.2.5 Avaliação do efeito das nanopartículas sobre a regeneração cutânea em camundongos 43
4.2.6 Análise estatística _____________________________________________________ 44
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________ 45
5.1 DETERMINAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA QUANTIFICAÇÃO DO
ÓLEO DE COPAÍBA _______________________________________________________ 45
5.2 DESENVOLVIMENTO DAS NANOPARTÍCULAS __________________________ 46
5.2.1 O planejamento estatístico experimental ____________________________________ 49
5.2.1.1 Diâmetro hidrodinâmico médio de partícula _______________________________ 49
5.2.1.2 Conteúdo de óleo encapsulado __________________________________________ 51
5.1.1.3. Ambos os parâmetros de resposta _______________________________________ 53
5.3 CARACTERIZAÇÃO DAS NLS __________________________________________ 56
5.3.1 Infravermelho com transformada de fourier (IV-TF) __________________________ 57
5.3.2 Análise Térmica Diferencial (ATD) _______________________________________ 58
5.3.3 Perfil de dissolução do óleo de copaíba _____________________________________ 60
5.4 ESTUDO DE ESTABILIDADE ___________________________________________ 64
5.5 AVALIAÇÃO DO EFEITO DAS NAPARTÍCULAS SOBRE A REGENERAÇÃO
CUTÂNEA EM CAMUNDONGOS ___________________________________________ 68
6 CONCLUSÕES __________________________________________________________ 74
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ________________________________________ 76
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Ilustrações dos tipos de distribuição do princípio ativo na NLS _______________ 18
Figura 2. Ilustração dos tipos de CLN __________________________________________ 22
Figura 3. Árvore de Copaifera langsdorffii ______________________________________ 25
Figura 4. Extração do óleo de copaíba __________________________________________ 27
Figura 5. Distância entre os trados inseridos para retirada do óleo ____________________ 27
Figura 6. Localização da Reserva Extrativista Chico Mendes ________________________ 29
Figura 7. Curva de calibração do óleo de copaíba diluído em etanol obtida pela média
aritmética da triplicata do experimento por espectrometria no UV, λ=230nm ___________ 48
Figura 8. Curva de calibração do óleo de copaíba diluído no meio de dissolução (etanol 95%
PA, Transcutol®, e água Milli-Q) obtida pela média aritmética da triplicata do experimento
por espectrometria no UV, λ=230nm ___________________________________________ 46
Figura 9. Diâmetro médio de partícula (Z-ave) das NLS contendo óleo de copaíba (NC) e
branco (N) para cada formulação produzida (experimentos) _________________________ 48
Figura 10. Diagrama de pareto dos efeitos normalizados para a variável diâmetro médio de
partícula (Z-ave) __________________________________________________________ 530
Figura 11. Diagrama de pareto dos efeitos normalizados para a variável conteúdo de óleo
encapsulado _____________________________________________________________ 552
Figura 12. Gráfico da distribuição de resíduos para o conteúdo de óleo encapsulado _____ 553
Figura 13. Influência da variável tempo de ultrassom sobre os parâmetros de resposta
diâmetro médio de partícula (Z-ave) e conteúdo de óleo encapsulado (CO) ____________ 565
Figura 14. Influência da variável amplitude de ultrassom sobre os parâmetros de resposta
diâmetro médio de partícula (Z-ave) e conteúdo de óleo encapsulado (CO) _____________ 45
Figura 15. Influência da concentração de óleo de copaíba na formulação (mg de óleo/g de
formulação) sobre os parâmetros de resposta diâmetro médio de partícula (Z-ave, nm) e
conteúdo de óleo encapsulado (CO, mg de óleo/g de NLS) __________________________ 46
Figura 16. Compritol® 888 ATO ______________________________________________ 57
Figura 17. Pluronic® F-68 ___________________________________________________ 57
Figura 18. Espectro de IV-TF do óleo de copaíba (O), NLS branco (N) e NLS contendo óleo
de copaíba (NC) ___________________________________________________________ 58
Figura 19. ATD da NLS branco (N) e da NLS contendo óleo de copaíba (NC) __________ 59
Figura 20. Perfil de liberação in vitro do óleo de copaíba encapsulado em NLS__________ 61
Figura 21. N e NC no dia em que foram produzidas (D0) e após 6 meses (M6) __________ 65
Figura 22. Evolução da contração da ferida nos camundongos após 5 dias de tratamento,
durante 14 dias de experimento. _______________________________________________ 69
Figura 23. Análise morfométrica das lesões cutâneas em camundongos durante os dias 0, 3, 7,
10 e 14 do ensaio. __________________________________________________________ 70
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Variáveis e níveis utilizados no planejamento experimental fatorial fracionado 231
+3______________________________________________________________________ 40
Tabela 2. Combinações das variáveis e níveis estudados ____________________________ 40
Tabela 3. Resultados da distribuição do tamanho de partícula (diâmetro médio - Z-ave e
índice de polidispersidade - IP), potencial Zeta (PZ), conteúdo de óleo encapsulado (CO) e
eficiência de encapsulamento (EE) das NLSs desenvolvidas segundo o planejamento
experimental fatorial fracionado 23-1+3 e relação com as variáveis utilizadas na formulação 47
Tabela 4. Teste ANOVA para os parâmetros de resposta em relação a variável Z-ave. ____ 50
Tabela 5. Teste ANOVA para os parâmetros de resposta em relação a variável conteúdo de
óleo encapsulado___________________________________________________________ 52
Tabela 6. Cinética de liberação in vitro do óleo de copaíba a partir da NLS desenvolvida.
Modelos matemáticos de liberação utilizados, suas respectivas constantes de velocidade de
liberação (k), coeficientes de correlação (R2) e expoente de difusão (n) ________________ 62
Tabela 7. Resultados obtidos no primeiro dia (Dia 0) e no sexto mês (Mês 6) do estudo de
estabilidade quanto ao diâmetro médio de partícula (Z-Ave), índice de polidispersidade (IP),
potencial Zeta (PZ) e eficiência de encapsulamento (EE) para as N e NC (feitas em triplicata)67
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATD
CFL
CG
CG-EM
CIM
CLAE
CLN
Cmax
CO
DLS
EE
eV
IC50
ICMBio
IV
MMP
NLS
NP
N
NC
OECD
IP
rpm
Resex CM
UC
UV
β-CD
t1/2
Z-ave
Análise Térmica Diferencial
Conjugado Fármaco-Lipídeo
Cromatografia com fase gasosa
Cromatografia com fase gasosa acoplada a espectroscopia de
Massas
Concentração Inibitória Mínima
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Carreadores Lipídicos Nanoestruturados
Concentração Máxima
Conteúdo de Óleo Encapsulado
Dynamic Light Scattering
Eficiência de Encapsulamento
elétron-volt
Coeficiente de Inibição de 50% de crescimento das amostras
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade
Infravermelho
Metaloproteinases da Matriz
Nanopartícula Lipídica Sólida
Nanopartícula
Nanopartícula Lipídica Sólida Branco (Sem conteúdo
encapsulado)
Nanopartícula Lipídica Sólida Contendo Óleo de Copaíba
Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico
Índice de Polidispersidade
rotações por minuto
Reserva Extrativista Chico Mendes
Unidades de Conservação
Ultra Violeta
beta-ciclodextrina
Tempo de meia-vida
Diâmetro hidrodinâmico médio
13
1 INTRODUÇÃO
O gênero Copaifera spp. foi amplamente difundido no início do período colonial
Brasileiro, onde o conhecimento adquirido com os índios sobre as propriedades medicinais
possibilitou a sua utilização para as mais diversas mazelas que acometiam os portugueses que
aqui chegavam, e para as quais havia escassez de medicamentos (PIERI; MUSSI; MOREIRA,
2009). Com o tempo, esse conhecimento foi se perdendo ou se tornou restrito a determinadas
áreas do país. No sentido de tentar resgatar a sua utilização, uma vez que apresenta uma
ampla gama de atividades biológicas já cientificamente comprovadas e valorizar o uso das
plantas medicinais nacionais, realizou-se o presente estudo, com a intenção de apresentar uma
roupagem nova, mais sofisticada e com propriedades ampliadas de uma droga secularmente
conhecida e com grande potencial para vir a tornar-se um medicamento fitoterápico inovador.
Diversas técnicas inovadoras exploram as características singulares dos nanossistemas,
ou seja, sistemas produzidos em escala nanométrica, viáveis pela manipulação da matéria, que
podem chegar ao nível atômico e tem aplicações nas mais diversas áreas do conhecimento
como a engenharia, medicina, química, informática, ente outros (SAHOO; PARVEEN;
PANDA, 2007).
Na área farmacêutica, esses nanossistemas podem ser aplicados na obtenção de novas
formas farmacêuticas de liberação controlada e sistemas de vetorização de fármacos (drug
delivery systems) capazes de ampliar a ação dos princípios ativos (PIMENTEL et al., 2007;
SAHOO; PARVEEN; PANDA, 2007). São capazes de oferecer a proteção do fármaco contra
possíveis instabilidades no organismo, promovendo o aumento da eficácia terapêutica; sua
liberação progressiva e controlada; a redução expressiva da toxidade; a possibilidade de
direcionamento a alvos específicos; e diminuição da dose terapêutica e número de
administrações que levam ao consequente aumento da aceitação da terapia pelo paciente
(PIMENTEL et al., 2007).
Dentre os diversos tipos de nanossistemas, foram escolhidas as Nanopartículas
Lipídicas Sólidas (NLS) para o encapsulamento do óleo de copaíba. Este diferenciado sistema
apresenta uma série de características que constituem vantagem sobre os outros já existentes
como os lipossomas e nanopartículas poliméricas, destacando-se dentre elas, a estabilidade e a
biocompatibilidade (ARAUJO et al., 2010).
14
2 EMBASAMENTO TEÓRICO
2.1 NANOBIOTECNOLOGIA
A nanobiotecnologia é a nanotecnologia aplicada ao manuseio de processos
biológicos, ou seja, que ocorrem em moléculas, células e genes gerando inovação
(FAKRUDDIN; HOSSAIN; AFROZ, 2012). Esse conceito está intimamente ligado a
influência da escala nano. Nessa escala ocorrem mudanças nas propriedades dos sistemas que
são diferentes daquelas observadas em tamanhos maiores. Ou ainda, fenômenos que antes
eram mascaradas ou apresentavam menor influência sobre a matéria em escala micro e macro,
passam a predominar na escala nano. Tais forças, como a gravidade, atrito, eletrostática, entre
outras, passam a ter relações diferentes de influência, por exemplo, a força eletrostática que
em escala macro muitas vezes é sobreposta pelas outras forças, em escala nano pode ser
prevalecente (DURAN; MATTOSO; MORAIS, 2006).
Dessa maneira, a nanotecnologia é o conhecimento técnico e científico e/ou as
ferramentas, processos e materiais aplicados à escala nanométrica. Como descrito por
(JAGDALE et al., 2009) “A nanotecnologia é a ciência e tecnologia de manipular com
precisão a estrutura da matéria em nível molecular”1.
Muito foi desenvolvido dentro dessa temática, e uma das linhas em grande evolução é
a produção de novos materiais. Esses podem ser inorgânicos, representados majoritariamente
pelo silício, com grande aplicação na indústria eletrônica e de comunicações; ou orgânicos,
tendo sua utilização muito variada, indo desde dispositivos optoeletrônicos (fotodiodos,
fotoresistores, etc.) até a produção de polímeros e filmes nano estruturados (DURAN;
MATTOSO; MORAIS, 2006).
1
Nanotechnology is the science and technology of precisely manipulating the structure of matter at the
molecular level.
15
2.2 NANOBIOTECNOLOGIA E SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS
A nanobiotecnologia tem sido empregada em uma gama muito variada de atividades,
destacando-se o setor farmacêutico. Com relação à adesão e resposta do paciente, tem-se a
possibilidade de alterar doses, frequência de ingestão e diminuir efeitos adversos, pois tornase possível um maior controle ou melhora em características como solubilidade,
permeabilidade, estabilidade, direcionamento do fármaco ao sítio de ação ou maiores
concentrações nos tecidos de interesse, modificação dos perfis de liberação, entre outros. Sob
o ponto de vista econômico, o emprego dessas novas tecnologias no desenvolvimento de
formas farmacêuticas, apresenta mais uma vantagem para as indústrias que realizam P & D
frente às indústrias de genéricos e a perda de patentes, pois permitem que continuem a lucrar
por mais tempo com as mesmas moléculas (CHAUDHARI, 2012).
Dentro desse contexto se inserem os sistemas de liberação de fármacos ou drug
delivery systems. Esses sistemas interpretam uma série de papéis nos sistemas biológicos. Eles
podem agir acumulando fármacos em seu interior, protegendo-os e aprimorando suas
características farmacocinéticas e dinâmicas; podem prolongar a meia-vida; podem liberá-los
de maneira controlada em relação ao tempo e até mesmo em relação ao local de ação,
diminuindo assim também os efeitos tóxicos e/ou adversos.
Atualmente, sistemas de
liberação de fármacos e nanotecnologia estão interligados. Essa nova tecnologia permitiu a
criação de estruturas, ou mais precisamente, os “nanocarreadores” e dentre as variadas
funções que podem desempenhar, o controle da liberação de fármacos é uma das principais.
Os nanocarreadores tem a capacidade de atravessar o endotélio venoso, as diversas barreiras e
serem captados pelas células de maneira mais fácil (DOMINGO; SAURINA, 2012;
FAKRUDDIN; HOSSAIN; AFROZ, 2012). Alguns exemplos de nanocarreadores são:
Nanopartículas poliméricas, lipossomas, dendrímeros e nanopartículas lipídicas.
As Nanopartículas Poliméricas como o próprio nome indica, são nanocarreadores
formados por polímeros. Os polímeros mais utilizados são o ácido polilático, poliglicólico,
policaprolactona, polianidridos, poliésteres, quitosana, albumina, colágeno e gelatina. De
maneira geral, podem ser produzidas por dispersão dos polímeros pré-formados ou por
polimerização de monômeros. Elas são classificadas como nanocápsulas ou nanoesferas de
acordo com a dispersão do ativo em sua estrutura (DOMINGO; SAURINA, 2012;
VRIGNAUD; BENOIT; SAULNIER, 2011).
16
Os lipossomas são outro tipo de nanocarreadores muito utilizados por sua similaridade
com as membranas celulares. Eles são constituídos por uma ou várias bicamadas
fosfolipídicas e possuem a capacidade de carrear fármacos lipofílicos entre as bicamadas, ou
fármacos hidrofílicos no seu centro (DOMINGO; SAURINA, 2012).
Dendrímeros são estruturas tridimensionais formadas por um núcleo, de onde partem
várias ramificações, formando um polímero com “grupos funcionais terminais” e números de
ramificações definidos. Uma das vantagens é a possibilidade de um alto grau de controle do
peso molecular, normalmente são menores se comparados às outras partículas poliméricas
(MONTANARI et al., 1998).
O uso das nanopartículas magnéticas no campo do diagnóstico; os biossensores, que
permitem a detecção de moléculas em concentrações muito baixas, antecipando diagnósticos
que só poderiam ser dados com um avanço muito maior da doença; o aumento da eficácia de
imunizações pela liberação de antígenos carreados; as melhorias no tratamento do câncer,
pelo acúmulo e direcionamento à células neoplásicas. Todas essas, são algumas das
utilizações no campo de prevenção/diagnóstico/tratamento de doenças. Outros nanossistemas
que tem sido alvo de muitas pesquisas com essa finalidade são as micelas poliméricas, cristais
líquidos, ferrofluidos e pontos quânticos (DOMINGO; SAURINA, 2012; FAKRUDDIN;
HOSSAIN; AFROZ, 2012).
2.3 NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS
As nanopartículas lipídicas são sistemas constituídos por lipídeos no estado sólido.
Esses lipídeos são geralmente considerados seguros, biocompatíveis e biodegradáveis, o que
as confere uma série de vantagens frente aos outros sistemas de liberação de ativos. As
primeiras a serem desenvolvidas foram as Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS), sendo
seguidas pelos Carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) e os conjugados FármacoLipídeo (CFL) (CHAUDHARI, 2012; WISSING; KAYSER; MÜLLER, 2004).
2.3.1 Nanopartículas Lipídicas Sólidas
As nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) podem ser simplificadamente comparadas
com um tipo de emulsão onde a fase interna (normalmente um componente lipídico na fase
líquida (óleo)) é substituído por um lipídio na fase sólida, não só em temperatura ambiente,
17
mas também em temperatura corporal (MÜLLER; RADTKE; WISSING, 2002). As
vantagens da sua utilização são: estabilidade física da nanopartícula (NP) e aumento da
estabilidade do fármaco, protegendo-o contra degradação, principalmente aqueles sensíveis à
luz, oxidação e hidrólise, biocompatibilidade, menor risco de toxidade, pois sua matriz
lipídica é em sua maioria composta por lipídeos fisiológicos, direcionamento a locais
específicos do corpo, não utilização de solventes orgânicos, possibilidade de incorporação de
substâncias hidrofílicas e lipofílicas e de produção em larga escala, entre outros. Tornando-se
assim um sistema muito atrativo no sentido de liberação controlada de fármacos, uma vez que
a mobilidade do ativo num sistema lipídico sólido é consideravelmente menor (MEHNERT;
MÄDER, 2001). Pode-se levantar como desvantagem das NLS a capacidade de
encapsulamento do fármaco que muitas vezes é limitada, a expulsão do mesmo após a
mudança de estado polimórfico dos lipídeos e grande quantidade de água presente na
formulação (WISSING; KAYSER; MÜLLER, 2004).
A via de administração, e os processos de distribuição e enzimáticos influenciam
grandemente o comportamento deste tipo de nanopartícula in vivo. A velocidade dos
processos enzimáticos, por exemplo, depende dos lipídeos e dos tensoativos empregados na
formulação. Já os processos de distribuição dependem do que pode ser adsorvido na partícula
durante a passagem in vivo, do perfil de liberação dos componentes da partícula (se por erosão
da nanopartícula ou difusão do fármaco através dela) e do tamanho da mesma (MEHNERT;
MÄDER, 2001).
A forma como o fármaco está distribuído na NLS e consequentemente seu perfil de
liberação, depende não somente do tamanho de partícula e das características intrínsecas do
ativo como a lipofilicidade, mas principalmente dos fatores relativos a porcentagem de
tensoativos utilizados, temperatura, tipo de matriz lipídica, e ao método de produção. Se o
objetivo for uma boa eficiência de encapsulamento, a utilização de lipídeos complexos com
diversos tamanhos de cadeias favorece a inserção do fármaco entre as mesmas, aumentando a
encapsulamento, além disso, quando a cristalização ocorre, é criada uma matriz mais
desordenada facilitando a inserção das moléculas do ativo entre as imperfeições do cristal
(WISSING; KAYSER; MÜLLER, 2004).
Se a técnica de produção utilizar a homogeneização à quente e grande quantidade de
tensoativos, o aumento da temperatura e da concentração de tensoativos, aumenta a
18
solubilidade do fármaco na fase aquosa. À medida que ocorre o resfriamento da formulação,
ocorre a recristalização do lipídeo e aumenta a tendência do fármaco de se depositar na fase
lipídica. Como essa recristalização se dá à partir do núcleo da partícula para a superfície, com
a progressiva diminuição de temperatura, menores quantidades de fármaco ficarão
solubilizados na água, voltando para o lipídeo. Como o mesmo já iniciou o processo de
recristalização, maiores quantidades de fármaco tenderão a se depositar nas camadas mais
externas e na superfície da NLS, portanto, quanto maior a temperatura e a quantidade de
tensoativo, maiores quantidades de fármaco se depositarão nas camadas mais externas do
lipídeo, levando a um perfil de liberação após a administração onde haverá o efeito burst
release (liberação rápida) de grandes quantidades de fármaco (MÜLLER; MÄDER; GOHLA,
2000).
Este tipo de modelo é descrito como cápsula enriquecida de fármaco ou drug-enriched
shell (Figura 1A). Se sob a mesma técnica de produção, durante o resfriamento, o fármaco
precipitar antes que o lipídeo atinja a temperatura de solidificação, forma-se o modelo
referido como núcleo enriquecido com o fármaco ou drug-enriched core (Figura 1B). Para
uma distribuição mais homogênea dentro na NLS, assim como uma liberação mais uniforme
após a administração, usa-se o método de preparação à frio e deve-se utilizar também um
tensoativo que não solubilize o ativo, levando ao modelo solução sólida ou solid solution
(Figura 1C) que é o fármaco molecularmente disperso na matriz lipídica (MÜLLER;
MÄDER; GOHLA, 2000).
Centro
Predominantemente
lipídico
A
Camadas externas
enriquecidas com
o fármaco
Centro enriquecido
com o fármaco
B
C
Camadas externas
Predominantemente
lipídicas
Fármaco distribuído
uniformemente
na matriz
Figura 1. Ilustrações dos tipos de distribuição do princípio ativo na NLS (Adaptado de
(MÜLLER; MÄDER; GOHLA, 2000)).
19
2.3.1.1 Delineamento da Formulação de Acordo com a Via de Administração
As NLS foram inicialmente desenvolvidas para utilização em vacinas e carreamento de
fármacos antineoplásicos (ÜNER; YENER, 2007) e portanto para a administração parenteral.
Um dos problemas relacionados a esta via de administração é a necessidade de controle
absoluto do tamanho de partícula (SCHÄFER-KORTING; MEHNERT; KORTING, 2007) e
a etapa de esterilização. A autoclavação é a forma mais utilizada, mas pode levar a liquefação
da partícula e um possível rearranjo no modelo de distribuição ativo-lipídeo, mudando as
características do sistema (MÜLLER; MÄDER; GOHLA, 2000). Portanto deve-se escolher
com bastante cuidado o agente emulsificante, para que esse possa apresentar maior resistência
à altas temperaturas sem alterar sua mobilidade e hidrofilicidade em grande extensão.
Outras formas de obtenção de esterilidade são a produção asséptica, filtração e radiação
gama. Na produção asséptica, é necessário ter grande controle das etapas de formulação para
evitar a contaminação, deve-se mencionar também as dificuldades de esterilização e
manutenção dessa característica nas matérias-primas. A filtração requer alta pressão e o
tamanho das NLSs não deve ser maior que 200 nm. A radiação gama pode ser uma alternativa
para formulações que não podem ser esterilizadas à vapor, em contrapartida, por aumentar a
energia molecular, pode levar a degradação dos componentes da formulação. Esta degradação
é favorecida pelo estado líquido dos constituintes (maior mobilidade molecular) e a presença
de oxigênio (MEHNERT; MÄDER, 2001).
Para evitar a remoção pelo fígado, baço, e sistema retículo endotelial, fenômeno que
ocorre com a maioria dos fármacos administrados intravenosamente, pode-se utilizar um
revestimento, como os polímeros de polioxietileno, ou copolímeros de polipropileno, por
exemplo, o Pluronic® F68. Estes polímeros tem a função de aumentar o tempo de circulação e
assim aumentar a atividade ou liberação no local de ação (WISSING; KAYSER; MÜLLER,
2004).
Para administração tópica, parece haver uma predominância da propriedade oclusiva
em comparação com a de aumento da permeabilidade, uma das hipóteses é que ocorra uma
interação entre os lipídios que compõem a pele e os lipídios do sistema (KÜCHLER et al.,
2010). Em ensaios realizados por Kuntsche et al. (2008) observaram-se que a capacidade
oclusiva da nanopartícula formulada no estudo citado superou a capacidade de permeação.
20
Destaca-se a influência de fatores como a solubilidade do fármaco na matriz lipídica e na fase
externa aquosa, a extensão da camada sebácea da pele, e principalmente a natureza dos
lipídeos do sistema. Quanto mais similares forem estes lipídeos aos da pele, maior é a fusão
entre eles, favorecendo o mecanismo passivo de aderência ao estrato córneo em detrimento da
distribuição através das camadas.
Wissing, Lippacher e Muller (2001) utilizaram diferentes formulações para avaliar a
dependência de características das nanopartículas com a propriedade oclusiva e verificaram
que quanto menor o tamanho de partícula, maior a quantidade de formulação aplicada sobre a
pele, maior a cristalinidade do lipídeo e maior a concentração do mesmo na formulação,
ocorre maior a oclusão. Ao comparar micropartículas lipídicas sólidas com NLS, De Vringer
(1999) obteve um grande aumento do coeficiente de oclusão com as NLS. Ao diminuir o
tamanho das partículas, há um aumento do número das mesmas, levando ao aumento da
densidade e portanto ao aumento da oclusão (PARDEIKE; HOMMOSS; MULLER, 2009).
Um dos possíveis mecanismos para que estas formulações favoreçam a permeação do
fármaco, é a hidratação do estrato córneo, que reduz temporariamente o empacotamento dos
corneócitos, aumentando as lacunas entre os mesmos e favorecendo a permeação da
nanopartícula. As características dos tensoativos utilizados e a adição de promotores de
permeação também influenciam esse comportamento (SCHÄFER-KORTING; MEHNERT;
KORTING, 2007). Portanto, o controle dessas variáveis pode levar a uma formulação com a
finalidade oclusiva (levando a uma maior permanência na pele, menor perda de água e
consequentemente maior hidratação), ou de maior permeação, podendo alcançar camadas
mais profundas.
Pode-se administrar na forma oral, tanto a suspensão aquosa com as nanopartículas,
como sob a forma de pellets, comprimidos ou cápsulas (MEHNERT; MÄDER, 2001). Luo et
al. (2011) demonstraram um grande aumento da biodisponibilidade de puerarina (substância
de baixíssima solubilidade em água) incorporada à NLS quando administrada por via oral em
ratos. A concentração máxima (Cmax) foi aumentada de aproximadamente 0,33 ± 0,05 µg/mL,
se comparada com a suspensão (Cmax=0,16 ± 0,06 µg/mL), assim como o tempo de meia-vida
(t1/2) que aumentou de 3,27 ± 0,87 h para 5,6 ± 1,00 h. Também houve melhora da quantidade
de puerarina distribuída para os tecidos, principalmente para os órgãos alvos como cérebro e
coração, sendo observado o aumento da excreção pela urina e diminuição pelas fezes
21
corroborando a proposta de otimização da absorção. Além disso, a quantidade de puerarina
eliminada junto com as fezes nas primeiras 12 h quando encapsulada em NLS, diminuiu em
comparação com a suspensão, e aumentou entre 12-24 h. Uma das hipóteses proposta pelos
autores é que ocorra o fenômeno de bioadesão ao epitélio intestinal, sendo aumentado pelo
uso de lecitinas na formulação.
O uso de polímeros derivados de celulose, etileno glicol, oxietileno, álcool polivinílico,
acetato de polivinila e ésteres do ácido hialurônico, tendem a promover essa adesão. Este
fenômeno de bioadesão pode ocorrer em qualquer mucosa podendo ser explorado em vias de
administração
como
a
nasal,
ocular,
vaginal,
pulmonar,
entre outros
(VASIR;
TAMBWEKAR; GARG, 2003). Outros eventos que podem contribuir para o aumento da
biodisponibilidade de fármacos por via oral são a captação direta da nanopartícula (sendo o
tamanho de partícula o fator preponderante), o aumento da permeabilidade pelo uso de
tensoativos (ex.: aumento da permeabilidade da membrana intestinal ou aumento da afinidade
entre os lipídeos da NLS e da membrana celular intestinal), a diminuição da degradação
(reduzindo a exposição à microflora intestinal e às enzimas) e diminuição do clearance (LI et
al., 2009).
2.3.2 Carreadores Lipídicos Nanoestruturados
Os carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN), segunda geração de nanopartículas
lipídicas, são compostos por uma mistura de lipídios em que uma porcentagem deles se
encontra no estado líquido e, apesar da mistura final se encontrar em estado sólido em
temperatura corporal, ocorre um abaixamento do ponto de fusão. Normalmente a proporção
entre lipídeos sólidos e óleos é de até 70:30. Assim como as NLS, os CLN podem carrear
fármacos e serem utilizados em formulações cosméticas e farmacêuticas orais, parenterais,
tópicas, entre outras (PARDEIKE; HOMMOSS; MULLER, 2009).
Uma das vantagens deste tipo de carreador é que existe a possibilidade de utilizar
menor quantidade de água, apresentam uma maior capacidade de encapsulamento e podem
diminuir o potencial de expulsão do fármaco durante o período de armazenamento. Isso se
deve à sua estrutura cristalina que é mais desorganizada se comparada com as NLS. A mistura
de lipídeos, seus diferentes tamanhos e rearranjos farão com que haja mais espaço para a
22
acomodação do princípio ativo. A liberação do fármaco é influenciada pelo processo de
difusão e de degradação dos lipídeos da matriz (CHAUDHARI, 2012).
O processo de produção é idêntico ao das NLS, sendo mais largamente utilizado a
homogeneização à quente, em que leva-se à temperatura de fusão os lipídios sólidos ou a
mistura entre os lipídeos sólidos e o óleo, dissolve-se o princípio ativo, adiciona-se a fase
aquosa com os tensoativos na mesma temperatura, sob agitação. Após esta primeira fase, a
pré-emulsão obtida passa por um outro processo, podendo ser homogeneização à alta pressão,
sonicação, entre outros, com a finalidade de diminuir o tamanho da gotícula. A nanoemulsão
obtida é então resfriada para formar as nanopartículas (MÜLLER et al., 2007).
De acordo com a quantidade de óleo utilizada os CLN podem assumir 3 diferentes
estruturas: CLN imperfeito (Highly imperfect matrix) (Figura 2A) quando há uma baixa
proporção de óleo, a cristalização ocorre de maneira desordenada com espaço para a inserção
de princípio ativo; CLN múltiplo (Multiple Oil/ Fat/ Water) (Figura 2B) ocorre quando há alta
proporção de óleo, neste tipo, durante o resfriamento, devido a diferença de miscibilidade
entre os lipídeos, ocorre uma precipitação de diminutas gotículas de óleo, formando
nanopartículas múltiplas do tipo óleo/lipídeo/água, a substância pode se localizar tanto no
óleo quanto no lipídeo, mas normalmente há uma preferência pelo primeiro; No CLN amorfo
(non-crystalline amorphous NLC) (Figura 2C) os lipídeos são misturados de uma maneira que
não
haja
formação
de
cristais,
compondo
uma
matriz
sólida
amorfa
(SELVAMUTHUKUMAR; VELMURUGAN, 2012).
Figura 2. Ilustração dos tipos de CLN. A- CLN imperfeito; B- CLN múltiplo C- CLN amorfo
(Adaptado de SELVAMUTHUKUMAR; VELMURUGAN, 2012).
23
2.3.3 Nanopartículas Conjugadas Fármaco-Lipídeo
Os conjugados fármaco-lipídeo (CFL) tem a grande vantagem de permitir o
encapsulamento de uma substância altamente hidrossolúvel em um partícula lipídica, tendo
em vista que esse efeito é muito limitado nas NLS e nos CLN (WISSING; KAYSER;
MÜLLER, 2004). O princípio geral é transformar um ativo hidrossolúvel em sal hidrofóbico,
conjugando-o com ácidos graxos, ou formando ligações covalentes éster ou éter. O fármaco é
então inserido numa nanopartícula como a NLS. Olbrich et al.(2002) obteve sucesso na
nanoencapsulamento de diminazeno, uma substância altamente hidrossolúvel utilizada no
tratamento da tripanossomíase, transformando-o no sal diaceturato e dioletato e por fim
encapsulando em NLS para liberação cerebral.
2.4 NLS E ÓLEOS VEGETAIS
O encapsulamento de óleos vegetais já foi realizado por diversos pesquisadores com as
mais variadas finalidades. Lai et al. (2006; 2007) por exemplo, produziu NLS de óleo
essencial de Artemisia arborescens L. com a finalidade de aumentar a permanência tópica,
diminuir a volatilização para a fabricação de pesticidas naturais e aumentar a atividade
antiviral. As NPs foram preparadas utilizando a técnica de homogeneização à alta pressão e
foram avaliadas quanto ao tamanho, potencial zeta, eficiência de encapsulamento e liberação
do óleo in vitro. O tamanho das partículas das duas formulações produzidas foi adequado, em
média de 223nm e 219nm. O índice de polidispersidade (IP) mostrou uma pequena variação
de tamanho entre as partículas produzidas (0,243) e (0,301) e a eficiência de encapsulamento
foi alta (87% e 92%). Foi observado um aumento muito discreto do tamanho de partícula, e
não houve mudança no potencial zeta após 2 anos de armazenamento à 4°C, sugerindo
estabilidade das formulações. Não foi evidenciada alteração na atividade antiviral das NLS
em comparação com o óleo não encapsulado, no entanto foi observado efeito reservatório do
óleo essencial nas camadas mais superficiais da pele. Quanto a estabilidade, após a
pulverização, no caso da finalidade inseticida, uma das formulações preparadas (utilizando
Compritol® 888 ATO e Miranol Ultra® C32 como tensoativo) se mostrou altamente estável,
mantendo o tamanho de partícula, mesmo após a passagem por altas pressões. Além disso, a
velocidade de evaporação do óleo essencial foi reduzida se comparado com as respectivas
emulsões, sendo uma característica interessante para a aplicação na agricultura, uma vez que
deseja-se a liberação controlada do mesmo.
24
Em outro estudo, Shi et al. (2012), verificou o aumento da eficácia antitumoral de
NLS contendo uma mistura de 1:1 de resina de olíbano, (pertencente ao gênero Boswellia) e
óleo de mirra (pertencente ao gênero Commiphora) por via oral se comparado à mistura não
encapsulada. Esta nova formulação se mostrou como uma melhor alternativa se comparada ao
método utilizado até o momento, o de inclusão dos óleos em beta-ciclodextrinas (β-CD). As
características indicativas de estabilidade da formulação foram analisadas, demonstrando alta
eficiência de encapsulamento e estabilidade, apresentando grande redução na volatilização do
óleo estudado. A atividade antitumoral foi notadamente maior das NLS-óleo em comparação
com o óleo livre e complexado em ciclodextrina, os dois últimos não apresentaram diferenças
significativas entre si, sugerindo que o aumento da solubilidade provocado pela β-CD não
interferiu na atividade, e que as NLS representaram o melhor sistema para liberação da
mistura estudada.
Xie et al. (2011) também demonstraram uma grande redução de toxicidade em NLS
utilizando óleo de rícino hidrogenado para encapsulamento do fármaco tilmicosina, um
antibiótico de uso veterinário que pode levar a sérios problemas cardíacos se administrado por
via parenteral.
2.5 ÓLEO DE COPAIBA
O gênero Copaifera spp. pertence à família das Leguminoseae Juss (cujo nome mais
antigo é Fabaceae Lindley), sub-família Caesalpinoideae Kunth. Existem 72 espécies
descritas, sendo 16 delas encontradas apenas no Brasil. Entre as espécies de copaibeiras ou
“pau-d´óleo”, mais comuns ou mais popularmente conhecidas no Brasil, estão: C. officinalis
L. (norte do Amazonas), C. reticulata Ducke (Pará, Amazonas e Acre), C. multijuga Hayne
(Amazônia), C. confertiflora Bth (Piauí), C. langsdorffii Desf (praticamente todas as regiões
do Brasil), C. coriacea Mart. (Bahia), C. cearensis Huber ex Ducke (Ceará) (JUNIOR;
PINTO, 2002).
As árvores de copaíba (Figura 3) são comumente encontradas na América do Sul e na
África Ocidental, vivem aproximadamente 400 anos e a altura média é de 25-40 m (ARAÚJO
JÚNIOR et al., 2005). Este gênero possui espécies com a casca aromática, fuste reto, cônico
ou cilíndrico, ritidoma fissurado, copa globosa, folhagem densa, predominantemente
deciduifólia, com folhas compostas, pecioladas, penadas, com folíolos alternos ou subopostos,
25
flores pequenas, numerosas, sésseis, alvacentas, hermafroditas, frutos secos, sementes pretas,
ovoides com arilo amarelo rico em lipídeos (AMARAL; SIMÕES; FERREIRA, 2005; PIERI;
MUSSI; MOREIRA, 2009). A identificação da espécie é difícil, sendo feita principalmente
pela análise das flores, verifica-se a pubescência das sépalas, comprimento dos anteros,
condição glaborosa do pistilo, entre outros (JUNIOR; PINTO, 2002).
Figura 3. Árvore de Copaifera langsdorffii (Fonte: PIERI; MUSSI; MOREIRA, 2009).
O óleo de copaíba é um líquido transparente, viscoso e fluido, de sabor amargo com
uma cor entre amarelo até marrom claro dourado (JACKSON; OTÁVIO, 2009a), aromático,
com forte odor de cumarina, sabor azedo e persistente, insolúvel em água e parcialmente
solúvel em álcool (RIGAMONTE-AZEVEDO; WADT; WADT, 2004). É encontrado em
canais secretores esquizógenos distribuídos por toda a planta, sendo mais salientes no tronco.
Acredita-se que o óleo-resina seja produzido em defesa contra micro-organismos e predação
(JUNIOR; PINTO, 2002).
Caracteriza-se por uma parte sólida, resinosa não volátil, formada por ácidos
diterpênicos responsável por 55 a 60% do óleo, e um óleo essencial composto de
sesquiterpenos oxigenados (álcoois) e hidrocarbonetos sesquiterpênicos. Dentre os
26
sesquiterpenos, o ácido copálico foi o único encontrado em todas as 16 amostras estudadas
por Junior, Patitucci e Pinto (1997) provenientes da Amazônia, Rio de Janeiro, Bahia e Minas
Gerais e coletadas em diferentes épocas do ano. Deus, Alves e Arruda (2011) encontraram na
cromatografia com fase gasosa acoplada a espectroscopia de Massas (CG-EM) da fração
volátil do óleo de C. multijuga Hayne os seguintes componentes: α-copaeno (3,29%), βcariofileno (57,29%), trans-α-bergamoteno (5,31%), α-humuleno (9,11%), γ-muuruleno
(1,63%), β-bisaboleno (1,08%), óxido de cariofileno (10,34%). Estevão et al. (2009)
analisando óleo de C. langsdorffii identificou o γ-muuroleno (22,73%), o caureno (6,84%), a
eremofilona (6,77%) e o α-copaeno (5,80%) como os terpenos de maior proporção. Uma
proporção de 45,4% de β-cariofileno e 12,3% de β-bisaboleno foi relatada por Oliveira,
Lameira e Zoghbi (2006).
A extração do óleo difundida como a técnica menos agressiva é realizada pela
introdução de um trado de aproximadamente 2 cm de diâmetro no tronco (Figura 4). Inicia-se
com um furo, podendo chegar a três. O primeiro furo é feito aproximadamente a 1 m da base
da planta, o segundo, 1,5 m acima do primeiro (Figura 5). Todos os buracos devem ser
apropriadamente fechados após a coleta para evitar infestações. Foi verificado que quando o
período de espera para uma segunda extração ocorre de 6 a 14 meses não há danos visíveis na
planta (LEITE, 2004; PIERI; MUSSI; MOREIRA, 2009). A maioria dos métodos utilizados
na extração, embora ainda hoje repletos de misticismo, advém do conhecimento empírico
adquirido por longos anos pelos indígenas. Em relato de 1694 indica-se a coleta em noites de
lua cheia, quando os frutos estão maduros. Faz-se um “golpe até a medula” e assim escorrerá
óleo em quantidade abundante (ROSA2, 1694 apud JUNIOR; PINTO, 2002). Cesar3 (1956)
apud Junior e Pinto (2002) afirma que muitos extrativistas relatam que a arvore dá um longo
suspiro quando é atingida e começa a liberar o óleo. Também relatam que a copa não deve ser
olhada para que a planta não seque e “o óleo volte para terra”. Outros ainda relatam que “sob
a influência da lua cheia de agosto o óleo sobe da terra para a árvore” e essa é a melhor data
para coleta. Dados da literatura confirmam esse relato.
2
3
ROSA, J. F.Tratado Único da Constituição Pestilencial de Pernambuco. Lisboa, 1694. 37p.
CESAR, G.Curiosidades da Nossa Flora. Imprensa Oficial. Recife, 1956. 374p.
27
Figura 4. Extração do óleo de copaíba (Fonte: FUNTAC, 2009).
Figura 5. Distância entre os trados inseridos para retirada do óleo (Fonte: PIERI; MUSSI;
MOREIRA, 2009).
A mistura de óleos de diferentes espécies é comum, assim como adulterações como a
adição de água, etanol, além de impurezas e alterações causadas pela exposição à luz solar,
entre outros. A introdução do plano de manejo possibilitou, além da utilização de técnica mais
apropriada de extração, o controle da origem do produto, local de coleta e planta, evitando-se
a mistura de produtos de diferentes origens (LEITE, 2004).
28
2.5.1 Reserva Extrativista Chico Mendes
A Reserva Extrativista Chico Mendes (Resex CM) escolhida como o local de obtenção
do óleo de copaíba está localizada no Acre, entre os municípios de Assis Brasil, Brasiléia,
Epitaciolândia, Xapuri, Sena Madureira, Capixaba e Rio Branco, ocupando uma área de cerca
de 970.570 hectares (Figura 6). Criada pelo decreto n° 99.144/1990 (SIQUEIRA et al., 2006),
faz parte de uma rede de Unidades de Conservação do Instituto Chico Mendes de
Conservação da Biodiversidade (ICMBio), uma autarquia criada pela Lei 11.516 e vinculada
ao Ministério do Meio Ambiente. A borracha e o óleo de copaíba são suas principais
atividades extrativas (JACKSON; OTÁVIO, 2009a).
A finalidade do ICMBio é executar ações do Sistema Nacional de Unidades de
Conservação (UC) como criar, gerenciar, fiscalizar, proteger, recuperar áreas degradadas e
monitorar o uso público e atividades exploratórias nos locais onde é permitido realizar tal
ação, contribuir para a geração de conhecimento relativo às UCs, entre outros. O Plano de
Manejo é um documento que define a forma como essas ações serão tomadas com base em
estudos das mais diversas finalidades. Esses estudos levam ao entendimento do ecossistema,
da relação homem-ambiente natural, entre outros, buscando um conhecimento amplo sobre a
área em questão e dão embasamento para a construção do Plano de Manejo. Portanto, este
documento faz a divisão da área em zonas e coloca preceitos quanto a utilização dos recursos
naturais. Por exemplo, dependendo da área, haverá uma distinção de intensidade de uso, com
o objetivo de manter os recursos naturais e culturais do local (JACKSON; OTÁVIO, 2009b).
29
Figura 6. Localização da Reserva Extrativista Chico Mendes (FANTINI; CRISÓSTOMO,
2009).
2.5.2 Propriedades biológicas
O óleo de copaíba é utilizado com diferentes propósitos, entre eles: combustível para
iluminação pública, na perfumaria como fixador, secativo na indústria de vernizes, aditivo de
alimentos, na fabricação de cremes, sabonetes, xampus devido às suas propriedades
emolientes, entre outros (PIERI; MUSSI; MOREIRA, 2009). Na medicina tradicional
popular, o óleo de copaíba tem sido utilizado por mais de 500 anos. Existem relatos dos
primeiros exploradores que chegaram ao Brasil sobre sua utilização curativa pelos índios. Seu
uso se tornou tão difundido que em 1677 foi adicionado na Farmacopéia Britânica (JUNIOR;
PINTO, 2002). A cicatrização de feridas é a aplicação medicinal mais difundida. Outros usos
populares
são
para
hemorroidas,
anti-inflamatório
local,
diurético,
expectorante,
antimicrobiano nas afecções de garganta, reumatismo, disenterias, gonorréia, e outras
30
afecções das vias urinárias (LORENZI; MATOS4, 2002 apud MONTES et al., 2009;
JUNIOR; PINTO, 2002).
Alguns estudos descrevem as atividades anti-inflamatória (BASILE et al., 1988),
proteção contra a penetração de cercárias de Schistosoma mansoni (GILBERT et al.,1972), e
antitumoral (OHSAKI et al.,1994).Outros relatam atividade antibacteriana, para S. pyogenes
(PIERI et al., 2010a), Listeria monocytogenes (PIERI et al., 2010b), Escherichia
coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa (MENDONÇA, 2009; HAO et al.,
2011).
Pieri et al. (2012) evidenciaram a inibição do crescimento de Streptococcus mutans em
concentrações acima de 0,78 µl/ml de óleo de C. officinalis em comparação com o mesmo
efeito em 6,25 µl/ml de clorexidina mostrando um bom potencial como agente preventivo de
cáries. Em outro estudo similar, com óleo da mesma espécie de copaibeira também verificouse melhores resultados do óleo em comparação com a solução de clorexidina frente às cepas
bacterianas de S. mutans, S. salivarius, S. pyogenese Enterococcus faecalis (PIERI et al.,
2010a).
Em recente trabalho avaliou-se a atividade antifúngica do óleo de copaíba puro e o
nanopreparado contra as seguintes espécies: Epidermophyton floccosum, Microsporum canis,
Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum e Trichophyton mentagrophytes. Todas se
mostraram sensíveis tanto ao óleo puro quanto ao óleo em nanoformulação. Após os testes de
susceptibilidade foram realizados ensaios para verificar a CIM (Concentração Inibitória
Mínima). A nanoformulação demonstrou o melhor efeito, sendo eficaz em concentrações
inferiores a 10 µg/ml (CUNHA, 2011) e embora o trabalho não mencione qual a formulação
utilizada, destaca-se a importância da nanotecnologia para melhoria na atividade do óleo.
O óleo-resina e o óleo essencial de C. multijuga Hayne foram avaliados contra espécies
de Candida e Aspergillus pelo método de difusão em disco utilizando nitrato de miconazol
como controle positivo e Tween® 80 para solubilização dos óleos. Apesar de haver halos de
4
LORENZI, H.F; MATOS F.J.A. Plantas medicinais do Brasil, nativas e exóticas. 1 ed. São Paulo: Editora
Instituto Plantarum, 2002. 512 p.
31
inibição em todos as amostras, o óleo essencial apresentou halo 20% maior e o óleo-resina
halo 30% menor, que o halo do miconazol, em 8 dias. Após esse período houve novamente
crescimento, conferindo apenas uma atividade fungistática, provavelmente pela volatilização
das substâncias ativas. As espécies que demonstraram ser mais sensíveis foram A. flavus e C.
parapsilosis (DEUS; ALVES; ARRUDA, 2011).
Santos et al. (2008) estudou o comportamento de macrófagos infectados com
Leishmania amazonensis e tratados com óleos de 8 diferentes espécies: C. multijuga Hayne,
C.officinalis, C. reticulata Ducke, C. lucens, C. langsdorffii Desf., C. paupera Dwyer, C.
martii, C. cearensis Huber. O óleo que apresentou menor IC50 foi da C. reticulata Ducke com
valor de 5 µg/ml para promastigotas e 15 µg/ml para amastigotas, o que é um valor grande se
coparado com o IC50 da anfotericina B (0,058 µg/ml para promastigotas e 0,231 µg/ml para
amastigotas). Apesar disso, a citotoxicidade para promastigotas foi 8 vezes maior que para os
macrófagos e 2,3 vezes maior para as amastigotas que para os macrófagos o que sugere sua
utilização como antiparasitário no futuro.
Luz et al. (2011) produziram um sistema nanoestruturado na forma de cristais líquidos
contendo óleo de copaíba como fase oleosa e estabilizados com álcool cetílico etoxilado e
propoxilado para a veiculação tópica de itraconazol, no sentido de avaliar a força bioadesiva,
que está relacionada com a permanência da formulação na pele. O gel de carbopol utilizado
como controle apresentou uma força bioadesiva de 3 a 7 vezes menor que o nanopreparado
contendo o óleo, corroborando a hipótese do maior tempo de permanência e possivelmente
maior eficácia desses sistemas para administração tópica de medicamentos.
No estudo do efeito gastroprotetor do óleo de C. officinallis foram utilizados 4 grupos
de ratos machos. O primeiro grupo recebeu apenas solução fisiológica 2 ml/kg via oral, o
segundo grupo (controle) recebeu somente indometacina 80 mg/kg via intraperitoneal para
induzir danos na mucosa, o terceiro grupo recebeu óleo de copaíba 40 mg/kg via oral e após
60 minutos, 12 horas e 18 horas da administração do óleo, administrou-se indometacina
intraperitoneal e o quarto grupo recebeu uma suspensão de omeprazol (2mg/ml) contendo
bicarbonato (84mg/ml) numa dose de 10mg/kg via oral, seguida de três administrações de
indometacina intraperitoneal aos 60 min, 12h, e 18h. Foi observado 100% de efeito
gastroprotetor contra formação de úlceras com a administração do óleo e 97,8% com
omeprazol (ARROYO et al.; 2009).
32
Durante a avaliação do efeito da utilização tópica do óleo de C. langsdorffii, Vieira et
al. (2008) verificaram que os grupos tratados com o óleo, após uma incisão cirúrgica e
introdução de lamínula de vidro no dorso apresentaram resultados de recuperação celular
prejudicado, com a formação de epitélio, presença de fibroblastos e revascularização
atrasados em comparação com o grupo controle tratado apenas com solução salina, assim
como maior inchaço, quantidade de sangue e permanência das crostas. No entanto, Estevão et
al. (2009) observou uma melhora no processo de neoangiogênese em ratos em que foram
retirados e ressuturados pedaços subdérmicos da região dorsal. Esse processo é importante na
utilização de retalhos cutâneos (transplantes de partes de pele), sendo frequentemente
utilizado um promotor de revascularização, como vasodilatadores e antioxidantes. O ensaio
foi realizado empregando-se uma pomada contendo óleo de C. langsdorffii a 10%, sendo a
base constituída por vaselina sólida e glicerina líquida. Esta pomada foi aplicada durante 8
dias e após esse período foi feita a análise histopatológica. Foram utilizados três grupos
experimentais: Grupo controle sem tratamento, grupo controle tratado com a pomada placebo
e grupo tratado com a pomada contendo o óleo. O grupo tratado com óleo de copaíba
apresentou menor endurecimento da área de necrose, maiores números de vasos sanguíneos
formados e maior concentração de fibroblastos.
Paiva et al. (2002) também observaram aumento da neoangiogênese ao comparar a
contração de ferida em camundongos albinos Wistar após a administração tópica do óleo de
Copaifera langsdorffii veiculado em solução salina contendo Tween® 80 (4%). Os animais
foram tratados 1 vez ao dia por 21 dias. Somente no nono dia houve diferença significativa
entre os grupos, sendo o grupo tratado com maior concentração de óleo de copaíba (4%) o que
apresentou maior retração de ferida (84,05 ± 2,37 %), enquanto que o grupo controle tratado
somente com o veículo apresentou 51,29 ± 9,54 %. A cicatrização total das feridas em todos
os grupos foi observada após 12 dias. Os mesmos tratamentos foram novamente
administrados 2 vezes ao dia por 12 dias, após uma incisão linear de 4 cm e posterior sutura
na região dorsal dos camundongos para verificar a resistência à tração na área. Houve
diferença significativa somente no 5° dia, sendo novamente observado o resultado mais
proeminente após o tratamento com a maior concentração de óleo testada (4%). Esses
resultados corroboram uma afirmação quanto ao aumento da velocidade de cicatrização
relacionada ao óleo.
33
Para avaliar a toxicidade oral foi realizado um estudo utilizando o óleo de C. reticulata
Ducke, extraído de espécies pertencentes ao campo Experimental de Mojú no Pará, entre
setembro de 2003 e agosto de 2004 (OLIVEIRA; LAMEIRA; ZOGHBI, 2006). Foram
utilizadas doses de 300 mg/Kg e 2000mg/kg diluídas em Tween® 80 à 20%. Não foram
observadas morbidade ou mortalidade. Para avaliação da neurotoxidade examinou-se a
atividade motora, sensorial e comportamental após 1 hora da administração do óleo não se
observando mudanças, assim como durante os 14 dias de período de estudo. No décimo
quarto dia os animais foram sacrificados e não foram observadas alterações macroscópicas
nos órgãos internos. Dessa forma, o óleo foi classificado como categoria 5 (baixo risco de
toxicidade aguda, mas que pode ser perigoso para indivíduos vulneráveis dependendo da
situação)
de acordo com o guia 423 da OECD - Organização para Cooperação e
Desenvolvimento Econômico, relacionado à avaliação da toxicidade aguda de substâncias e
permitindo uso racional dos animais de laboratório (OECD, 2002; SACHETTI et al., 2009).
Em amostras de óleo da mesma origem que o estudo anterior, foi realizado outro
estudo nos mesmos moldes, seguindo o guia 414 da OECD para desenvolvimento de estudos
de toxicidade pré-natal, utilizando ratos fêmeas Wistar grávidas. Doses de 0, 500, 1000, e
1250mg/kg por dia do óleo diluído em solução de Tween® 80 a 20% foram administradas do
sexto ao décimo nono dia de gestação. No vigésimo dia de gestação houve a análise dos fetos.
Não foi observado sinal de toxicidade até a dose de 500 mg/kg por dia. Nas doses de 1000 e
1250 mg/kg por dia houve redução na quantidade de alimento ingerida e perda de peso
materna, sendo refletida no menor peso embrionário, mas não houve aumento da mortalidade
embrionária, nem malformações significantes que possam ter relação de causa comprovada
pela administração do óleo
(SACHETTI et al., 2011). Também não foi demonstrada
toxicidade materna ou embriotoxicidade significante no óleo-resina de Copaifera duckei
Dwyer empregado na forma de creme vaginal aplicado em ratos fêmeas Wistar numa dose de
28,6 mg/kg (correspondente a 10 vezes a dose recomendada em humanos), aplicado por 30
dias antes da gravidez e 20 dias após (LIMA et al., 2011). Para avaliar a genotoxicidade, foi
realizado um ensaio com células de fibroblastos de pulmão de hamster cultivadas in vitro e
demonstrou-se que o ácido caurenóico isolado de C. langsdorffii produz danos ao DNA em
concentrações acima de 30 µg/ml (CAVALCANTI et al., 2006).
34
2.6 O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO TECIDUAL
A reparação tecidual após lesão pode ser descrita levando-se em conta os seguintes
estágios: inflamação, reepitelização, remodelagem. (GURTNER et al., 2008)
Inicialmente, há a formação do coágulo, formado por plaquetas dispersas entre as
fibras de fibrina, que previne a perda de sangue pelos vasos que foram danificados,
fornecendo proteção e um meio por onde as células podem migrar. À medida que ocorre a
desgranulação das plaquetas há também a liberação de citocinas e fatores de crescimento que
recrutam as células inflamatórias (principalmente neutrófilos e monócitos circulantes que
saem dos capilares por mudanças no endotélio), fibroblastos e capilares que se acumulam na
borda da lesão e com o tempo começam a migrar para o centro da lesão para fechá-la. Os
leucócitos chegam rapidamente ao local, normalmente após minutos que tenha ocorrido a
lesão e além de ter a função de fagocitar os contaminantes, também são fontes de citocinas
pró-inflamatórias. Se não houver grandes infecções no local, a infiltração de leucócitos cessa
após alguns dias e os mesmos são fagocitados por macrófagos. A função fagocítica é então
passada aos macrófagos que continuamente chegam ao local da lesão por mais tempo, e que
dão seguimento à liberação de citocinas e dos fatores de crescimento iniciada pelos
neutrófilos e plaquetas (MARTIN, 1997).
Começa a ocorrer a multiplicação de queratinócitos, das bordas da lesão e dos
folículos capilares que parmaneceram, para além do corte na lâmina basal e sobre a matriz
provisória e derme saudáveis. Estas células iniciam a digestão da rede de fibrina para poderem
se inserir nesses espaços. A plasmina, principal enzima envolvida nesse processo é derivada
da ativação do plasminogênio, presente no próprio coágulo. Além da plasmina, uma série de
enzimas denominadas metaloproteinases da matriz (MMP) tem a função de quebrar as demais
proteínas da matriz e são reguladas por esses queratinócitos. O final da reepitelização se dá
pela reconstrução da lâmina basal, cujo o início coincide com o final da atividade das MMPs e
por fim, o aporte de fibrilas responsáveis pela adesão da lâmina basal ao tecido conjuntivo
(GURTNER et al., 2008).
.
A remodelagem é auxiliada pelo tecido conjuntivo que participa na contração da ferida
ao unir as bordas da lesão. Inicialmente fibroblastos dérmicos do tecido ao redor da lesão se
multiplicam e migram para o coágulo onde remodelam uma nova matriz rica em colágeno.
35
Uma parte desses fibroblastos se especializa em miofibroblastos, que tem uma capacidade
contrátil similar às células do músculo liso levando a contração da ferida. O tecido nervoso é
altamente sensível aos estímulos liberados após a lesão e ocorre a formação de uma enervação
transitória no local. Considera-se a participação da mesma na regeneração do tecido pela
liberação de neuropeptídeos, entre outros fatores na região. Dessa forma, se dá a reconstrução
do tecido previamente lesionado (MARTIN, 1997).
2.7 PLANEJAMETO ESTATÍSTICO EXPERIMENTAL
A utilização do planejamento estatístico na área da saúde vem crescendo nos últimos
anos, mas ainda encontra-se muito aquém de outras áreas do conhecimento que já
descobriram essa poderosa ferramenta como uma forma de otimizar os experimentos
poupando tempo e custo (RAMOS; LEITE; FIAUX, 2009). Quando se deseja a avaliar a
influência de uma condição experimental (variável ou fator) sobre a resposta final,
normalmente é realizada a mudança de um dos valores (níveis) de uma variável por vez,
sendo esse método denominado de um-efeito-por-vez ("one-variable-at-a-time"), entretanto,
além de levar a um grande número de experimentos, não permite avaliar o efeito combinado
das variáveis e se há interferência entre elas (BEZERRA et al., 2008).
O modelo mais simples de planejamento estatístico é o linear de primeira ordem, que
obedece a seguinte equação: Y= B0 + ∑
k
i=1
BiXi + Ɛ, (com Y= efeito ou parâmetro de resposta
a ser medido após o experimento; B0= é o termo constante; k= número de variáveis, Bi = são
os coeficientes das variáveis Xi; Ɛ= resíduo ou diferença entre o parâmetro real e o calculado).
Neste modelo, normalmente são utilizados dois níveis e não contempla curvatura na superfície
de resposta, nem interação entre as variáveis. O modelo de segunda ordem leva em conta a
k
interação entre as variáveis entre si e pode ser descrito da seguinte forma: Y= B0 + ∑
+ ∑
k
1≤i≤j
i=1
BiXi
BijXiXj + Ɛ, (com Bij=coeficiente das variáveis de interação)e geralmente são
utilizados 3 níveis (BEZERRA et al., 2008).
Os modelos quadráticos, por sua vez, possibilitam a determinação dos pontos
máximos e mínimos e se referem a uma superfície de resposta curva. A equação que os
descrevem é a seguinte: Y= B0 + ∑
k
i=1
BiXi + ∑
k
2
i=1
BiiXi +∑
k
1≤i≤j
BijXiXj + Ɛ, (com
36
Bii=coeficiente do variável ao quadrado). Neste modelo, deve-se utilizar no mínimo dois
níveis (BEZERRA et al., 2008).
Sendo "k" o número de variáveis ou fatores, "n" o número de níveis, e "N" o número
de experimentos resultantes do planejamento, os modelos mais conhecidos são: a) Desenho
fatorial de três níveis (N=3k), engloba um planejamento fatorial completo e se o número de
variáveis for maior que 2 leva a um grande número de experimentos a serem realizados. Por
esse motivo, muitas vezes, para reduzir o número de experimentos, os modelos a seguir são
mais escolhidos. b) No modelo de Box-Behnken (N=2k (k-1)+Cp, com Cp=número de pontos
centrais) procura-se uma diminuição do número de experimentos com a retirada dos pontos
experimentais que não possuem a mesma distância do ponto central. Nesse modelo, todas as
variáveis devem possuir três níveis. c) O planejamento composto central (N= k2+ 2k + Cp)
(BEZERRA et al., 2008) é muito útil quando um planejamento linear anterior foi realizado e
verificou-se a necessidade de adição de mais pontos, geralmente pela presença de curvatura
(RAMOS; LEITE; FIAUX, 2009). Nesse modelo são utilizados 5 níveis (-α, -1, 0, +1, +α, e o
valor de α é dependente do número de variáveis). d) No modelo de Doehlert (N= k 2+ k+ Cp),
os pontos experimentais são equidistantes do ponto central em camadas esféricas
(DOEHLERT, 1970) e a principal característica que o difere dos demais são as variáveis
podem ser estudadas em níveis diferentes umas das outras (BEZERRA et al., 2008).
O planejamento fatorial fracionado (N= nk-p + Cp, com p = fração do experimento
fatorial completo a ser estudada) escolhido para esse estudo, é uma outra forma de diminuir o
número de experimentos de um planejamento fatorial completo (RAMOS; LEITE; FIAUX,
2009).
37
3 OBJETIVO
Desenvolver nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) contendo óleo de copaiba (Copaifera
spp.) e avaliar a atividade cicatrizante em modelo in vivo.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Desenvolver nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) contendo óleo de copaiba segundo um
planejamento experimental;
- Estudar o efeito das variáveis tempo de ultrassom, amplitude da potência do ultrassom e
razão ativo/lipídeo no desenvolvimento de NLS;
- Identificar a melhor formulação em relação aos parâmetros de reposta estudados: conteúdo
de óleo encapsulado e diâmetro hidrodinâmico médio de partícula;
- Caracterizar e avaliar a estabilidade da melhor formulação;
- Estudar o perfil de liberação in vitro do óleo de copaíba a partir da NLS obtida com a
melhor formulação;
- Comparar a atividade do óleo de copaíba encapsulado em NLS com o óleo livre e demais
controles sobre a regeneração cutânea em camundongos.
38
4 METODOLOGIA
4.1 MATERIAIS
4.1.1 Matérias-primas e reagentes

Compritol® 888 ATO - Behenato de Glicerila (mistura de mono, di e triglicerídeos do
ácido behênico) - Brasquim;

Pluronic® F-68 – Poloxamer 188 - Copolímero não iônico em bloco do polioxietileno
e polioxipropileno- Sigma Aldrich;

Óleo de copaíba - Obtido na reserva extrativista Chico Mendes- Cooperico;

Álcool etílico absoluto 95% PA – Vetec;

Transcutol® CG- Etilato de dietilenoglicol- Brasquim;

Óleo Mineral USP- All Chemistry;

Tween® 80 - Polissorbato 80 - La Belle Ativos e Especilidades Químicas;

Solução Salina Fisiológica – Solução de Cloreto de sódio 0,9%- Arboreto;

Kensol® – Solução estéril de cloridrato de xilasina 2% - Konig;

Cetamina – Cloridrato de Cetamina 10% - Agener;
4.1.2 Equipamentos e acessórios

Agitador Mecânico - Fisatom. Modelo: 713D;

Agitador Magnético com Aquecimento - Logen- Modelo: LSH2;

Homogeneizador de Ultrassom: OMNI- Modelo: Sonic Ruptor 250;

Mini centrífuga - Ministar ;

Balança analítica - Gehaka, modelo AG-200;

Vórtex - Fisatom - Modelo: 773;

Liofilizador - Liotop- Modelo: L108;

Espectrofotômetro no UV-Vis - Shimadzu Corporation - Modelo: UV 2600;

Espectrofotômetro de Infravermelho por transformada de Fourier - Shimadzu
Corporation - Modelo IR-Prestige 21;

Zetasizer Nano Series- Malvern Instruments;

Membrana Filtrante - Whatman- Nuclepore Track- Etch Membrane 30 nm;

Phmetro digital - Sensoglass - Modelo: SP1800;
39

Analisador Térmico - Shimadzu Corporation - DTG-60;

Câmera digital acoplada à celular- Modelo moto X-10.0 mega pixels.
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Desenvolvimento de metodologia analítica para quantificação do óleo de copaíba
4.2.1.1 Quantificação do óleo de copaíba para determinação do conteúdo de óleo encapsulado
A quantificação do óleo de copaíba foi realizada pela curva de calibração obtida por
espectrofotometria no UV. Inicialmente foi realizada a varredura de 200 à 400 nm da
solução de óleo de copaíba 1mg/ml em etanol 95% PA para identificação do comprimento de
onda de maior absorbância (230nm). O óleo de copaíba foi então diluído em etanol 95% PA
nas concentrações de 30, 50, 80, 100 e 120 µg/ml e as diluições analisadas em triplicata,
λ=230nm. A curva de calibração obtida representa a média de três ensaios distintos.
4.2.1.2 Quantificação do óleo de copaíba para avaliação do perfil de liberação
A quantificação do óleo de copaíba foi realizada pela curva de calibração obtida por
espectrofotometria no UV. Inicialmente foi realizada a varredura de 200 à 400 nm da
solução de óleo de copaíba 100 µg /ml em meio composto por etanol 95% (3,5% v/v),
Transcutol® (1,5% v/v) e água Milli-Q (qsp) para identificação do comprimento de onda de
maior absorbância (230 nm). O óleo de copaíba foi então diluído no mesmo meio nas
concentrações finais de 10, 30, 50, 80 e 100 µg/ml, a as soluções foram analisadas em
triplicata, λ=230nm . A curva de calibração obtida representa a média de três ensaios
distintos.
4.2.2 Desenvolvimento das nanopartículas
As nanopartículas lipídicas sólidas contendo óleo de copaíba (NC) foram desenvolvidas
segundo a metodologia de homogeneização à quente seguida de ultrasonicação e baixa
temperatura de solidificação seguindo o descrito por Silva et al. (2011) e Hao et al. (2011)
com modificações. O lipídeo (Compritol® 888 ATO) e o óleo de copaíba foram pesados e
colocados em um béquer. Em outro béquer foram pesados a água Milli-Q e o tensoativo
(Pluronic® F68) e ambas as fases aquecidas à 75°C em banho maria. A fase aquosa foi vertida
sobre a oleosa, ainda sob aquecimento em banho maria a 75ºC, sob agitação mecânica à 490
40
rpm por 15 minutos. A nanoemulsão obtida foi então submetida a homogeneização com sonda
de ultrassom. Em seguida, resfriada em banho de gelo por 15 minutos. A suspensão de
nanopartículas foi congelada e seca por liofilização. NLSs sem o óleo de copaíba (N) foram
produzidas seguindo-se o mesmo protocolo e foram utilizadas como branco nos ensaios
subsequentes.
A otimização do processo de formulação das NLSs contendo o óleo de copaíba foi
estudada através de um planejamento experimental fatorial fracionado 2 3-1+3 gerado pelo
programa Statistica v. 6.0 (StatSoft). Foi avaliado o efeito combinado de três variáveis (tempo
de ultrassom, amplitude da potência do ultrassom e a razão de ativo em relação ao lipídeo)
(Tabela 1) por meio do preparo de diferentes formulações (Tabela 2). A porcentagem do
Lipídeo e do tensoativo se mantiveram constantes em todas as formulações sendo
respectivamente 6% e 4% em relação à massa final de 80 g.
Tabela 1. Variáveis e níveis utilizados no planejamento experimental fatorial fracionado 2 3-1
+3.
0
Variáveis
Nível -1
Nível +1
(Ponto Central)
Tempo de ultrassom
5,0
7,5
10
(min)
Amplitude do ultrassom
30
40
50
(%)
Ativo / Lipídeo
10
30
50
(%)
Tabela 2. Combinações das variáveis e níveis estudados.
Tempo de ultrassom
Amplitude do ultrassom
Experimento
(min)
(%)
Ativo / Lipídeo
(%)
1
5,0
30
50
2
10,0
30
10
3
5,0
50
10
4
10,0
50
50
5
7,5
40
30
6
7,5
40
30
7
7,5
40
30
41
Os resultados foram analisados com o auxílio do mesmo programa Statistica v 6.0
(StatSoft) utilizando-se como parâmetros de resposta o conteúdo de óleo encapsulado (CO) e
a diâmetro hidrodinâmico médio de partícula (Z-ave).
A formulação identificada pelo planejamento experimental como sendo a melhor em
relação às variáveis estudadas e às respostas avaliadas, considerando o menor diâmetro
hidrodinâmico médio de partícula (Z-ave) e o maior conteúdo de óleo encapsulado (CO) r foi
repetida em triplicata e as NLSs foram caracterizadas e avaliadas quanto a estabilidade, o
perfil de liberação in vitro e a atividade cicatrizante in vivo.
4.2.3 Caracterização das Nanopartículas
4.2.3.1 Diâmetro hidrodinâmico médio (Z-ave) e potencial Zeta (PZ)
As formulações referentes aos 7 experimentos do planejamento experimental foram
caracterizadas quanto à distribuição e diâmetro hidrodinâmico médio das partículas por
espalhamento dinâmico de luz (DLS – Dynamic Light Scattering) e o potencial Zeta por
mobilidade eletroforética. Ambas as análises foram realizadas utilizando o Zetasizer Nano
Series. As nanopartículas em suspensão (não liofilizadas) foram diluídas em água Milli-Q
(1:25) e colocadas em cubeta específica para a análise em triplicata à 25°C (FERNANDES et
al., 2013).
4.2.3.2 Determinação do conteúdo de óleo encapsulado (CO)
A quantidade de óleo encapsulado foi determinada pelo método de extração em
solvente proposto por Falcão et al. (2011) com modificações. 5 mg das NCs liofilizadas foram
transferidas para três vials tipo eppendorf contendo 1mL de etanol 95% PA e, em seguida,
homogeneizados em vórtex durante 10 min. O material foi centrifugado por 15 min a 6200
rpm. O sobrenadante recuperado com pipeta Pasteur foi transferido para balão volumétrico e
o volume completado com etanol 95% PA. O material foi analisado por espectrofotometria no
UV em 230nm. As extrações foram realizadas em triplicata. O mesmo protocolo foi realizado
com as Ns que foram utilizadas como branco. O conteúdo de óleo de copaíba foi calculado
utilizando a equação obtida com a curva de calibração e expresso em mg de óleo/g de NLS .
A eficiência de encapsulamento (EE) (%) foi calculada segundo a equação a seguir:
42
EE (%) = 100 x (conteúdo determinado de óleo / conteúdo total teórico de óleo)
4.2.3.3 Espectrometria no infravermelho - transformada de fourier (IV-TF)
Para a obtenção do espectro na região do IV das amostras de N, NC referentes à melhor
formulação e do óleo de copaíba puro, foi utilizado o espectrofotômetro por transformada de
Fourier com detector DTGS KBr, separador de feixes de KBr. A análise foi feita por
transmitância a 1% de KBr na região mediana do infravermelho (400 – 4000 cm-1) em
espectrofotômetro de infravermelho por transformada de fourier- modelo IR-Prestige 21.
4.2.3.4 Análise térmica diferencial (ATD)
A análise térmica diferencial das amostras de N e NC referentes à melhor formulação
foi realizada por meio da pesagem de aproximadamente 1,2 mg das nanopartículas liofilizadas
que foram colocadas em cadinho de alumínio de 40 µL e inseridas no analisador térmico
simultâneo termogravimétrico e térmico diferencial (TG/DTA-DSC) DTG-60. O aquecimento
se deu de 25 a 200°C a uma taxa de 10°C/min.
4.2.3.5 Determinação do perfil de dissolução in vitro das nanopartículas
Para a determinação da quantidade de óleo liberada da nanopartícula foi necessário
fazer uma correlação entre as massas da NLS liofilizada e não liofilizada. A NLS preparada
(N e NC) foi então separada em três frascos e pesada quando ainda em suspensão (não
liofilizada) e após a liofilização. Com o conteúdo de óleo obtido pela NC liofilizada e a
relação entre as massas, foi possível determinar o conteúdo total de óleo presente na NLS em
suspensão para utilização nos cálculos de dissolução.
O ensaio de dissolução foi realizado pela introdução de aproximadamente 180mg das
NCs em suspensão (não liofilizadas) em um tubo com tampa tendo uma das extremidades
recoberta por uma membrana filtrante de policarbonato (30nm de poro). Os tubos foram
posicionados verticalmente em recipientes de vidro contendo 15 mL do meio de dissolução
composto por etanol 95% PA (3,5%, v/v), Transcutol® (1,5%, v/v) e água Milli-Q (qsp), pH
5,8. O sistema foi mantido em temperatura constante (37 ± 2 ºC) sob agitação magnética (120
rpm) por 53,5 horas. Em intervalos determinados, uma alíquota de 2,5ml do meio foi retirada
e analisada por espectrofotometria no UV (λ=230nm). O mesmo volume do meio foi
43
recolocado no tubo. A quantificação do óleo de copaíba presente no meio de dissolução foi
realizada utilizando a equação obtida com a curva de calibração. Ns foram utilizadas como
branco. O ensaio foi realizado em triplicata. O pH do meio foi medido no início e ao final do
experimento (ALMEIDA, 2014).
4.2.4 Estudo da estabilidade das nanopartículas
Após a identificação da melhor formulação com o auxílio do planejamento estatístico,
esta foi novamente produzida, em triplicata, e as amostras foram armazenadas em frascos de
plástico, transparente, com tampa de mesmo material na geladeira (temperatura aproximada
de 4ºC). NLS sem a incorporação do óleo (N) foi também refeita e armazenada da mesma
forma. A estabilidade das NLSs foi avaliada quanto ao aspecto visual, eficiência de
encapsulamento, diâmetro hidrodinâmico de partícula e potencial zeta após 6 meses de
estocagem, comparando-se os resultados obtidos após a manipulação.
4.2.5 Avaliação do efeito das nanopartículas sobre a regeneração cutânea em camundongos
Os ensaios sobre a regeneração cutânea foram realizados no Laboratório de
Farmacologia da Faculdade de Farmácia da UFF sob a orientação da Profª Drª Sabrina Calil
Elias. Foram utilizados camundongos adultos suíços albinos (23 ± 4 g) como modelo animal,
que durante todo o experimento receberam água e ração ad libitum e foram mantidos em ciclo
de luz natural, no biotério da Faculdade de Farmácia. A manipulação e os procedimentos com
os animais obedeceram aos princípios da CEUA/UFF (Comissão de Ética no Uso de Animais)
que analisou e aprovou o estudo, pelo parecer nº 603.
Os animais foram divididos nos grupos citados abaixo e efetuou-se a lesão com punch
em todos eles. Os camundongos foram submetidos à anestesia por via intraperitoneal com
Cetamina (112 mg/kg) e Xilasina (7,5 mg/kg). Depois de anestesiados, os animais foram
posicionados em decúbito ventral e tricotomizados. Para a demarcação da pele a ser retirada,
utilizou-se um punch metálico contendo lâmina cortante na sua borda inferior. Este
instrumento remove um segmento circular de pele de 10 mm de diâmetro na região do dorso.
Após a lesão, a ferida foi fotografada a uma distância constante de 11 cm nos dias 0, 3, 7, 10 e
14 para verificar o processo de cicatrização. O cálculo da área da lesão foi realizado por meio
das fotografias, com auxílio do software Image J Pro (gratuito). Os gráficos que auxiliaram a
análise da contração da área da lesão possuem dados referentes às áreas medidas nos dias zero
44
(dia da cirurgia para geração de ferida) consideradas 100% e as áreas medidas nos dias
subsequentes foram calculadas como porcentagem relativa à área inicial (dia zero).
Grupos Experimentais:
Os animais foram divididos em 5 grupos de 4 animais por grupo, recebendo por via
tópica durante 5 dias (com início do tratamento logo após a lesão), uma vez ao dia, os
seguintes tratamentos:
Grupo 1 (S): 100 µL de solução salina fisiológica (0,9%) ;
Grupo 2 (SCT): 100 µL de solução contendo óleo de copaíba (25,0 mg/ml) e Tween®80 (40,0
mg/ml) em solução salina fisiológica (0,9%) ;
Grupo 3 (OM): 100 µL de Óleo Mineral
Grupo 4 (N) : 100µL de suspensão de nanopartículas sem o óleo de copaíba (branco) (N não
liofilizada);
Grupo 5 (NC): 100 µL de suspensão de nanopartículas contendo óleo de copaíba (25,0
mg/ml) (NC não liofilizada);
4.2.6 Análise Estatística
O planejamento experimental e demais ensaios (realizados no mínimo em triplicata)
foram avaliados estatisticamente com o auxílio do programa Statistica versão 6.0 (StatSoft).
No ensaio in vivo de regeneração cutânea a diferença estatística nos experimentos foi avaliada
por meio do teste two-way ANOVA seguida de Bonferroni (comparações múltiplas)
utilizando o programa Graphpad Prism versão 6.0 (demonstrativa). Em todas as análises, as
diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
45
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 DETERMINAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA QUANTIFICAÇÃO DO
ÓLEO DE COPAÍBA
A quantificação por UV mostrou-se um método, prático, rápido e econômico, uma vez
que o possível marcador químico do óleo, o copaeno, encontrava-se indisponível para compra.
Para a obtenção do conteúdo de óleo encapsulado e a quantidade de óleo liberado das
NLSs foi necessário o desenvolvimento de curvas de calibração (Figuras 7 e 8). Observa-se
que as curvas apresentaram uma boa linearidade, com valor do coeficiente de correlação
próximo a 1 em ambas as curvas, R2= 0,999 e R2= 0,995, respectivamente, e os baixos valores
de desvio padrão das triplicatas indicam uma boa reprodutibilidade.
1,4
Absorbância
1,2
1
0,8
0,6
y = 0,0102x - 0,011
R² = 0,9996
0,4
0,2
0
0
50
100
Concentração (µg/ml)
150
Figura 7. Curva de calibração do óleo de copaíba diluído em etanol obtida pela média
aritmética da triplicata do experimento por espectrometria no UV, λ=230nm.
46
0,14
0,12
Absorbância
0,1
0,08
y = 0,0012x + 0,0087
R² = 0,9954
0,06
0,04
0,02
0
0
20
40
60
80
Concentração (µg/ml)
100
120
Figura 8. Curva de calibração do óleo de copaíba diluído no meio de dissolução (etanol 95%
PA, Transcutol®, e água Milli-Q) obtida pela média aritmética da triplicata do experimento
por espectrometria no UV, λ=230nm.
5.2 DESENVOLVIMENTO DAS NANOPARTÍCULAS
O efeito combinado das três variáveis estudadas, tempo de ultrassom, amplitude da
potência do ultrassom e razão ativo/lipídeo foi avaliado utilizando como parâmetros de
resposta o diâmetro hidrodinâmico médio das partículas (Z-ave) e conteúdo de óleo
encapsulado (CO). Na Tabela 3 estão descritos os resultados obtidos de distribuição do
tamanho de partícula (diâmetro médio - Z-ave e índice de polidispersidade – IP), potencial
zeta (PZ), conteúdo de óleo encapsulado (CO) e eficiência de encapsulamento (EE) utilizados
para a caracterização das nanopartículas desenvolvidas segundo o planejamento experimental
empregado. Uma vez que o número de experimentos é reduzido, as triplicatas 5, 6 e 7 são
importantes para obtenção dos intervalos de confiança e para checar a veracidade da aplicação
do modelo linear.
O método espectrofotométrico tem sido bastante utilizado para quantificação de ativos
em nanopartículas (PARDESHI et al., 2013), sendo uma ferramenta mais prática e rápida se
comparada às técnicas como CG e CLAE. Neste estudo foram obtidos bons rendimentos
quanto ao conteúdo de óleo encapsulado (CO), cujos valores variaram de 28,66 ± 1,37 mg/g
(EE= 49,72 ± 2,37 %) para o experimento 2 que utilizou uma concentração de 6 mg de óleo/g
de formulação à CO de 143,31 ± 11,80 mg/g (EE= 62,10 ± 5,12%) para o experimento 4 que
utilizou uma concentração de 30 mg de óleo/g de formulação. As razões de ativo/lipídeo de
10%, 30% e 50% correspondem respectivamente a uma concentração de óleo de 6 mg/g, 18
mg/g e 30 mg de óleo/g de formulação.
47
Tabela 3. Resultados da distribuição do tamanho de partícula (diâmetro médio - Z-ave e índice de polidispersidade - IP), potencial Zeta
(PZ), conteúdo de óleo encapsulado (CO) e eficiência de encapsulamento (EE) das NLSs desenvolvidas segundo o planejamento
experimental fatorial fracionado 23-1+3 e relação com as variáveis utilizadas na formulação.
Tempo
Ultrassom
(min)
Amplitude
Ultrassom
(%)
Razão
Ativo/
lipídeo
(%)
1
5,0
30
50
2
10,0
30
10
3
5,0
50
10
4
10,0
50
50
5, 6, 7
7,5
40
5
7,5
6
7
Experimento
Amostra
Z- ave
IP
(nm)
PZ
CO
(mV)
(mg ativo/g NP)
(%)
EE
N
459,6 ± 12,48
0,343 ± 0,046
-23,1 ± 0,10
-
NC
391,1 ± 11,08
0,495 ± 0,050
-19,1 ± 0,56
133,29 ± 13,42
57,63 ± 5,80
N
315,1 ± 3,19
0,395 ± 0,014
-19,3 ± 0,40
-
-
NC
254,9 ± 3,00
0,447 ± 0,001
-16,7 ± 0,60
28,66 ± 1,37
49,72 ± 2,37
N
262,6 ± 3,56
0,400 ± 0,020
-17,5 ± 0,90
-
-
NC
218,6 ± 2,40
0,410 ± 0,014
-15,7 ± 0,32
29,87 ± 2,40
52,90 ± 4,25
N
220,6 ± 3,48
0,410 ± 0,018
-16,1 ± 0,38
-
-
NC
208,0 ± 2,10
0,315 ± 0,012
-14,1 ± 0,40
143,31 ± 11,80
62,10 ± 5,12
30
N
376,7 ± 5,47
0,417 ± 0,011
-22,4 ± 0,36
-
-
40
30
NC
311,1 ± 3,50
0,446 ± 0,019
-15,2 ± 0,36
87,31 ± 2,88
57,29 ± 1,89
7,5
40
30
NC
319,2 ± 6,92
0,445 ± 0,011
-15,3 ± 0,38
95,03 ± 5,10
61,94 ± 3,32
7,5
40
30
NC
301,3 ± 1,94
0,469 ± 0,015
-16,1 ± 0,59
90,89 ± 3,86
59,58 ± 2,53
*N=Nanopartículas Branco, **NC= Nanopartículas contendo óleo de copaíba
48
Jose e et al. (2014) obtiveram como maior EE 37,21 ± 1,3% para NLS de Compritol®
888 ATO contendo resveratrol. Assim como Gavini et al. (2005) que utilizando o mesmo
lipídeo, conseguiu uma EE de apenas 35% na encapsulação de óleo de junípero. Ghadiri et al.
(2011) calculou uma EE de 39,08% em NLS de ácido esteárico contendo paromicina.
Pardeshi et al. (2013) obteve 64,73 ± 0,34 % no encapsulamento de cloridrato de ropinirol,
valor próximo ao encontrado nesse estudo. Realizando uma análise comparativa a literatura
mencionada, verifica-se que a EE obtida nesse trabalho está acima do comumente obtido para
NLSs, indicando uma potencial viabilidade de uso.
Observa-se em todos os experimentos (Figura 9) que houve uma redução significativa
(p<0,05, teste t student) do diâmetro médio das partículas com o encapsulamento do óleo de
copaíba em comparação com o branco da mesma formulação. Tal efeito deve estar
relacionado à diminuição da organização da matriz lipídica em função da presença de um
ativo lipofílico, diminuindo a tensão superficial e facilitando o rompimento do sistema o que
leva à formação de nanopartículas de tamanho reduzido (ZHAO et al., 2010). Adicionado a
isso, os valores dos índices de polidispersão foram baixos, valores abaixo de 0,5 são
considerados adequados (MULLER; HEINEMANN, 1992).
500
Z-ave NC
Z-ave N
Z-ave (nm)
400
300
200
1
2
3
4
5
6
7
Experimento
Figura 9. Diâmetro médio de partícula (Z-ave) das NLS contendo óleo de copaíba (NC) e
branco (N) para cada formulação produzida (experimentos).
49
Tensoativos não iônicos do tipo poloxamer, quando empregados como estabilizantes
no preparo de nanopartículas tendem a diminuir o valor do PZ em módulo (SCHAFFAZICK
et al., 2003). Apesar de estudos presentes na literatura sugerirem que NLSs produzidas com
tensoativos iônicos e anfóteros apresentam menor tamanho de partícula que aquelas
produzidas com não iônicos (ZHANG; FAN; SMITH, 2009), principalmente devido ao
potencial zeta não alcançar valores absolutos tão altos, pode-se chegar a tamanhos muito
pequenos e à formulações estáveis empregando-se esse tipo de tensoativo. How, Rasedee e
Abbasalipourkabir (2013) utilizando polissorbato 20 obtiveram NLS de diâmetro médio igual
a 61,14 ± 40 nm e PZ de -25,40 ± 1,01 mV. Não havendo mudanças significativas nesses
valores após 7 dias da preparação. As NLS foram consideradas estáveis nesse período de
tempo. De acordo com Mehnert e Mäder (2001) valores de PZ próximos a -25 mV são
característicos de NLS estáveis, com menor probabilidade de geleificação. Valores maiores
que aproximadamente -15 mV aumentam a probabilidade de esse fenômeno ocorrer, o que
leva à conclusão que apesar de não iônicos, tais tensoativos, como o poloxamer utilizado no
presente estudo, podem levar a formulações com boas características, além de, em sua
maioria, serem menos tóxicos e irritantes (REBELLO et al., 2014).
5.2.1 O planejamento estatístico experimental
Foi realizado um estudo fatorial fracionado para avaliar os efeitos das variáveis tempo
de ultrassom, amplitude do ultrassom e a relação ativo/lipídeo sobre os parâmetros diâmetro
hidrodinâmico médio de partícula (Z-ave) e conteúdo de óleo encapsulado (CO) sobre as
NCs.
5.2.1.1 Diâmetro hidrodinâmico médio de partícula
A Tabela 4 apresenta os resultados do teste ANOVA para o primeiro parâmetro de
resposta Z-ave. Analisando-a em conjunto com o diagrama de pareto dos efeitos padronizados
(Figura 10), pode-se observar que a curvatura tem efeito significativo (p<0.05) e, por isso,
também o termo falta de ajuste (p<0.05). Ainda que o modelo linear não tenha sido adequado
para avaliar esse parâmetro de resposta ou que outras variáveis importantes não tenham sido
consideradas, os resultados sugerem que tempo e amplitude tem efeitos relevantes negativos
sobre o diâmetro de partícula, ou seja, o menor diâmetro de partícula está relacionado com
uma maior amplitude do ultrassom e maior tempo de sonicação.
50
Tabela 4. Teste ANOVA para os parâmetros de resposta em relação a variável Z-ave.
ANOVA
SQ*
Tempo
G.L*.
MQ*
F*
p
5391,96
1
5391,96
67,5624
0,014480
12040,67
1
12040,67
150,8719
0,006563
Óleo/Lipídeo
3940,07
1
3940,07
49,3699
0,019660
Falta de Ajuste
3077,27
1
3077,27
38,5588
0,024967
Erro Puro
159,61
2
79,81
SQ Total
24609,60
6
Potência
*SQ= Soma dos Quadrados; G.L.= Graus de Liberdade; MQ=Média dos Quadrados; F= Teste
F
-12,283
Amplitude
-8,21963
Tempo
7,02637
óleo/lipídeo
Curvatura
6,209575
p=0,05
Figura 10. Diagrama de pareto dos efeitos normalizados para a variável diâmetro médio de
partícula (Z-ave).
Patil e Pandit (2007) chegaram à conclusão semelhante em seus experimentos para
avaliar o poder de redução do tamanho de partículas em diferentes aparelhos de cavitação. Os
autores verificaram que empregando sondas de ultrassom, quanto maior a potência, maior a
redução no tamanho, com distribuição mais homogênea em função do aumento no tempo de
sonicação. Ainda nesse estudo, foi descrito que uma baixa concentração de sólidos na
formulação colabora para diminuição do tamanho de partícula. Baseando-se nesses preceitos,
51
pode-se afirmar que o efeito significativo positivo referente à variável razão ativo/lipídeo, (ou
seja, quanto maior esta proporção, maior o tamanho de partícula) não está relacionado à
natureza do óleo, uma vez que ao comparar os pares de N e NC produzidas sob as mesmas
condições foi observada redução no Z-ave. No entanto, ao empregar-se uma maior
concentração de óleo, tem-se um aumento na quantidade de material total presente na NP e,
consequentemente no seu tamanho.
Utilizando o planejamento composto central, Zhang, Fan e Smith (2009) observaram
também que a temperatura e a concentração do lipídeo são fatores que influenciam
significativamente o tamanho da nanopartícula produzida pelo método de difusão de solvente,
enquanto que a concentração do tensoativo e a velocidade de agitação tiveram pouca
influência para este parâmetro. Também pelo método de difusão de solvente seguido de
sonicação, Varshosaz et al. (2010) realizaram um planejamento fatorial fracionado do tipo 2
(4-1)
(resolução IV) para escolher os fatores mais importantes frente ao tamanho de partícula. O
tipo de lipídeo e o volume da fase aquosa apresentaram efeitos significativos frente ao
tamanho de partícula, enquanto que o tipo de tensoativo e a razão de ativo/lipídeo não
apresentaram efeitos significativos, o que corrobora mais uma vez a afirmação de que não é a
relação entre óleo/lipídeo que influencia o tamanho de partícula nesse estudo, e sim a
quantidade total de material presente.
Sendo utilizado o modelo polinomial de primeira ordem do tipo: Y= B0 + B1X1 + B2X2
+ B3X3, onde Y é o parâmetro de resposta (Z-ave) e X1, X2, X3, são respectivamente as
variáveis tempo de ultrassom, amplitude do ultrassom e a razão ativo/lipídeo. A equação que
descreve o comportamento das variáveis estudadas frente ao parâmetro de resposta (Z-ave) é a
seguinte: Y = 286,3 -36,7X1 - 54,8X2 + 31,4X3; com R2= 0,86847.
5.2.1.2 Conteúdo de óleo encapsulado
Após a aplicação do teste ANOVA (Tabela 5) para o segundo parâmetro de resposta
(CO) verifica-se que o termo falta de ajuste não foi significativo (p > 0,05) (Figura 11). Este
termo está claramente relacionado à adequação do modelo ao comportamento do experimento
e, portanto não deve ser significativo (BEZERRA et al., 2008), assim como a curvatura. Desse
modo, o modelo linear pode ser aplicado, obedecendo a seguinte equação: Y= 86,9 +54,5X3;
com R2 = 0,985. A regressão descreve a maior parte da variação pelo experimento, sendo
52
complementada pelos resíduos (erro puro) (BEZERRA et al., 2008). Nesse estudo, 98,5% do
erro é relativo a variabilidade da resposta e que somente 1,5% se deve ao ruído. As variáveis
tempo e potência, não foram significativas, portanto, somente a quantidade de óleo usado na
formulação interfere no CO.
Tabela 5. Teste ANOVA para os parâmetros de resposta em relação a variável conteúdo de
óleo encapsulado.
ANOVA
SQ*
G.L*.
MQ*
F*
p
Tempo
19,40
1
19,40
1,3000
0,372348
Potência
31,53
1
31,53
2,1123
0,283300
11888,63
1
11888,63
796,5191
0,001253
Falta de ajuste
91,21
1
91,21
6,1108
0,132005
Erro Puro
29,85
2
14,93
SQ Total
12060,62
6
Óleo/Lipídeo
*SQ= Soma dos Quadrados; G.L.= Graus de Liberdade; MQ=Média dos Quadrados; F= Teste
F
óleo/lipídeo
Curvatura
28,22267
2,472006
Amplitude
1,453389
Tempo
1,140192
p=0,05
Figura 11. Diagrama de pareto dos efeitos normalizados para a variável conteúdo de óleo
encapsulado.
53
Um bom modelo matemático, ou seja, aquele que representa melhor o comportamento
das variáveis apresenta um resíduo pequeno (BEZERRA et al., 2008). Sabe-se que um dos
pressupostos do teste ANOVA é que a população possua distribuição muito próxima da
normal, portanto a adequação do modelo também pode ser verificada pelos resíduos, que
apresentaram distribuição normal segundo os testes de Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk
(Figura 12) cujo valor de p=0,99954 (alto) indica que a hipótese nula (resíduos com
distribuição normal) não é rejeitada.
Histograma de Resíduos
K-S d=0,10971, p> 0.20; Lilliefors p> 0.20
Shapiro-Wilk W=0,099608, p=0,99954
No. of obs.
2
1
0
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
X <= Category
Boundary
Figura 12. Gráfico da distribuição de resíduos para o conteúdo de óleo encapsulado.
5.1.1.3. Ambos os parâmetros de resposta
A hipótese nula para este estudo é a de que o modelo calculado pelo planejamento
experimental é adequado ao modelo experimental. No primeiro parâmetro de resposta (Z-ave)
não houve essa adequação uma vez que o parâmetro falta de ajuste (Tabela 4) foi significativo
e, portanto, a hipótese nula foi rejeitada. Já no segundo parâmetro de resposta (CO) houve
uma adequação ao modelo experimental, verificada pela não significância do termo falta de
54
ajuste e da curvatura (p>0,05) além da adequação à normalidade pela análise de resíduos.
Sendo assim, a hipótese nula não foi rejeitada e o modelo linear calculado é adequado ao
modelo experimental.
Varshosaz et al. (2010) obtiveram resultados semelhantes em um estudo utilizando o
planejamento composto central com as variáveis independentes significativas: razão
ativo/lipídeo, quantidade de lipídeo e volume de fase aquosa. O percentual de óleo
encapsulado (EE) atendeu a um modelo linear, enquanto que o Z-ave, a um polinômio
quadrático de segunda-ordem. Pardeshi et al. (2013) avaliando a influência da quantidade de
Pluronic® F-68 e de estearilamina em NLS de Dynasan® 114 (Trimiristina) contendo
Cloridrato de Ropinirol também obtiveram uma boa adequação ao modelo linear para a EE e
ao modelo quadrático para o tamanho de partícula. Tais resultados indicam uma tendência de
apresentação dos polinômios de EE e Z-ave em modelos lineares e quadráticos
respectivamente, independente dos fatores escolhidos.
Levando-se em consideração que as variáveis tempo e amplitude do ultrassom tem
efeito negativo sobre o tamanho das NPs (Figura 13 e 14), mas o razão ativo/lipídeo tem
efeito positivo no CO (na Figura 15 essa variável é apresentada como concentração de óleo na
formulação), a condição ótima para a produção de NLS contendo óleo de copaíba dentro do
domínio estudado é o experimento 4 que abrange os níveis superiores do domínio
experimental (máximo de tempo (10min) e maior amplitude (50%) e máxima razão
ativo/lipídeo(50%)) podendo ser verificado pelo seu menor Z-ave e maior CO.
55
Z-ave
CO
500
1
4
5
300
6
150
7
2
3
100
200
CO (mg/g)
Z-ave (nm)
400
200
50
100
0
0
5,0
5.0
7,5
7.5
7.5
10
10
Tempo de Ultrassom (min)
Figura 13. Influência da variável tempo de ultrassom sobre os parâmetros de resposta
diâmetro médio de partícula (Z-ave) e conteúdo de óleo encapsulado (CO).
Z-ave
CO
500
1
4
5
300
6
150
7
2
3
100
200
CO (mg/g)
Z-ave (nm)
400
200
50
100
0
0
30
30
40
40
40
50
50
Amplitude do Ultrassom (%)
Figura 14. Influência da variável amplitude de ultrassom sobre os parâmetros de resposta
diâmetro médio de partícula (Z-ave) e conteúdo de óleo encapsulado (CO).
56
Z-ave
CO
500
200
1
5
300
2
6
4
150
7
3
100
200
CO (mg/g)
Z-ave (nm)
400
50
100
0
0
6
6
18
18
18
30
30
Concentração de óleo de copaíba (mg/g)
Figura 15. Influência da concentração de óleo de copaíba na formulação (mg de óleo/g de
formulação) sobre os parâmetros de resposta diâmetro médio de partícula (Z-ave, nm) e
conteúdo de óleo encapsulado (CO, mg de óleo/g de NLS).
*Concentração de óleo = Massa de óleo em relação à formulação total; CO = Teor de óleo
encapsulado na NC liofilizada.
Os desenhos fatoriais (totais ou fracionados) em dois níveis, ou seja, utilizando dois
valores, são muito úteis para determinar o nível de influência de uma determinada variável no
resultado e fazer uma triagem das principais variáveis para estudos posteriores (BEZERRA et
al., 2008). Em planejamentos de 2 níveis, os pontos centrais avaliam a presença de curvatura,
que para um modelo linear, significa que o mesmo não foi adequado, o que ocorreu com a
análise da resposta tamanho de partícula. Para a resposta CO a curvatura não foi significativa
e o modelo se adequou ao comportamento linear.
5.3 CARACTERIZAÇÃO DAS NLS
Após a determinação do experimento 4 como a melhor formulação segundo os
resultados do planejamento experimental, novas NLSs com óleo (NC) e sem óleo (N) foram
produzidas nas mesmas condições, em triplicata, e caracterizadas. A caracterização de
sistemas particulados é uma etapa fundamental do seu desenvolvimento pois visa confirmar
sua formação através de diferentes técnicas. No presente estudo, a distribuição do diâmetro
médio de partícula (Z-ave), índice de polidispersidade (IP), potencial zeta (PZ) e eficiência de
encapsulamento (EE) foram utilizados na caracterização e no estudo de estabilidade, sendo
57
mencionados em tópico posterior. Também foram empregadas análises físicas, IV-TF e ATD,
além da avaliação do perfil e da cinética de liberação in vitro do óleo.
5.3.1 Infravermelho com transformada de fourier (IV-TF)
Foram caracterizadas por IV-TF as NLS branco (N), NLS com óleo de copaíba (NC) e
o óleo de copaíba puro. Como ambas as moléculas do lipídeo Compritol® 888 ATO (behenato
de glicerila) (Figura 16) e do tensoativo Pluronic® F-68 (poloxamer) (Figura 17) empregados
na preparação das NLSs possuem inúmeros grupamentos metila, observa-se nos espectros de
N e NC forte absorção em 2.986 e 2.848 cm-1 (Figura 18) característica das deformações
axiais de C-H sp3. Em 3.439 cm-1 verifica-se a deformação axial referente ao OH em ligação
de hidrogênio. A deformação axial de C-O pode ser observada em 1.112 cm-1 e em 1.737 cm-1
distingue-se a deformação axial da carbonila do behenato de glicerila.
Figura 16. Compritol® 888 ATO
Figura 17. Pluronic® F-68
Em relação ao óleo de copaíba, observa-se as bandas em 2.926 e 2.868 cm-1 referentes
a deformação axial da ligação C-H sp3. Além disso, pode-se predizer a presença do
grupamento C=O de cetona em 1.697 cm-1 conjugada a uma olefina C=C em 1.643 cm-1.
Não foram observadas diferenças entre os espectros da N e NC que comprovem a
presença do óleo de copaíba pela técnica de espectrometria no infravermelho, o que sugere
que o óleo foi eficientemente encapsulado não ficando aderido à superfície em quantidade que
pudesse ser detectada pelo método, sendo observados apenas os sinais referentes ao material
que compõem a matriz do nanossistema, Compritol® 888 ATO (behenato de glicerila) e
Pluronic® F-68 (poloxamer).
105
58
100
O
Transmitância(%)
95
90
1.643
85
110
80
2.868
75
Transmitância (%)
N
2.926
100
70
Tranmitânicia (%)
1.697
65
90
60
105
4000
3.439
3500
1.737
3000
2500
2.848
2000
1500
2.986 Número de Onda (cm )
100
80
-1
1000
1.112
500
NC
95
70
90
85
60
4000
3.439
3500
80
1.737
3000
2000
1500
1000
500
-1
Número de Onda (cm )
2.848
75
70
4000
2500
1.112
2.986
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Número de Onda (cm )
Figura 18. Espectro de IV-TF do óleo de copaíba (O), NLS branco (N) e NLS contendo óleo
de copaíba (NC).
Além disso, não houve desaparecimento de nenhuma banda da N para NC, o que
também sugere que não houve formação de ligação, ou que as mesmas, se presentes, não são
fortes o suficiente para suprimir as bandas iniciais. Da mesma forma, Amaral (2013) não
pode comprovar a presença do extrato de babaçu no nanosistema produzido, uma vez que as
bandas de referência do extrato que deveria compor o sistema também eram encontrados nos
demais componentes da formulação, indicando que esta técnica sozinha, algumas vezes, não é
eficaz para confirmar a presença de materiais nas NPs, devendo ser aliada à outras técnicas
como o TGA, DSC, entre outros.
5.3.2 Análise Térmica Diferencial (ATD)
As análises térmicas são muito usadas no setor farmacêutico como uma ferramenta de
caracterização de substâncias no estado sólido. Sua importância consiste em verificar as
alterações que podem ocorrer durante a manufatura e armazenamento em função do calor,
59
assim como diferenciação de substâncias puras e misturas, entre muitas outras utilidades
(GIRON, 2012).
No presente estudo, N e NC foram analisadas por ATD e os resultados obtidos podem
ser observados na Figura 19. N apresenta dois picos endotérmicos, o primeiro em 52,68°C
referente à fusão do Pluronic® F-68 e o segundo em 72,56°C referente à fusão do Compritol®
888 ATO. As temperaturas apresentadas estão de acordo com outros estudos em que foi feita
a análise térmica diferencial do lipídeo puro e obtiveram os seguintes pontos de fusão: 72,2°C
(FREITAS; MÜLLER, 1999) e 73,3°C (AMARAL, 2013).
ATD
ATG
mg
ATD de N
ATD de NC
Figura 19. ATD da NLS branco (N) e da NLS contendo óleo de copaíba (NC).
É possível observar na Figura 19 um "alargamento" da base dos picos característico da
presença de mais de uma estrutura polimórfica. Se comparado ao pico do lipídeo puro descrito
na literatura, este alargamento pode estar relacionado à junção de picos menores muito
próximos, referentes às outras formas cristalinas que poderiam ser visualizadas com um
método de maior resolução (FREITAS; MÜLLER, 1999). A taxa de aquecimento do presente
estudo foi de 10°C/min, esta velocidade está intimamente ligada à resolução apresentada no
termograma, quanto menor essa velocidade, maior a capacidade de visualizar eventos muito
próximos um dos outros (GIRON, 2012). Utilizando esse princípio, Freitas e Müller (1999)
com uma taxa de aquecimento de 5ºC/min conseguiram observar “ombros” referentes aos
picos menores, devido a maior separação entre eles.
Ao se comparar os perfis obtidos com a N e NC, através do alargamento dos picos, da
diminuição das temperaturas de fusão (50,09°C e 70,64°C) e da diminuição de entalpia
(visualizada pelo "encolhimento" dos picos) (Figura 19), pode-se sugerir uma maior
desorganização da estrutura matricial e, portanto, presença ainda maior de variadas formas
60
cristalinas, fato resultante do encapsulamento do óleo de copaíba na NLS. Tais resultados
corroboram a formação de NLSs carreadoras do óleo de copaíba pois indicam que sua
presença no interior do sistema leva a uma perturbação na organização cristalina do mesmo,
diminuindo a energia necessária para a fusão dos componentes presentes na NP, reduzindo a
temperatura em que isso ocorre (HOW; RASEDEE; ABBASALIPOURKABIR, 2013).
How, Rasedee e Abbasalipourkabir (2013) também identificaram uma notável diferença
de entalpia de 126,61 J/g entre o lipídeo puro utillizado na formulação (óleo de palma
hidrogenado) e o carreador lipídico nanoestruturado contendo óleo de oliva, além da
diminuição da temperatura de fusão em 4,3°C.
5.3.3 Perfil de dissolução do óleo de copaíba
O óleo de copaíba é bastante lipofílico apresentando-se totalmente insolúvel em água
e, consequentemente, nos meios de dissolução tradicionalmente empregados. Para a seleção
do meio a ser utilizado no ensaio de perfil de liberação in vitro, diferente soluções tampão e
tensoativos foram testados. A presença dos tensoativos no meio, apesar de imprescindível em
casos em que o ativo é muito lipofílico, pode chegar a inviabilizar a análise por
espectrofotometria no UV. O sistema micelar formado tende a atrapalhar a análise, fazendo
com que esta etapa preliminar do ensaio seja crucial para seu sucesso. Dessa forma, o meio de
dissolução que atendeu às necessidades em termos de solubilização do óleo e ausência de
interferência analítica foi então selecionado para o ensaio, sendo composto por etanol 95%
PA (3,5%, v/v), Transcutol® (1,5%, v/v) e água Milli-Q (95%, v/v). Não houve alteração do
pH do meio, que se manteve constante ao final do experimento.
O ensaio de perfil de liberação in vitro foi realizado com a NLS contendo óleo de
copaíba (NC) produzida com a formulação considerada ideal (experimento 4) de acordo com
os resultados obtidos com o planejamento experimental. As NLS sem o óleo (N) foram
utilizadas como branco no ensaio.
Diversos modelos matemáticos pretendem ilustrar o processo de liberação de um
fármaco de sua forma farmacêutica a fim de facilitar sua análise e nos parágrafos seguintes
será discutida a adequabilidade do produto obtido a esses modelos.
O perfil de liberação in vitro do óleo de copaíba encapsulado em NLSs está
61
representado na Figura 20. Analisando-se os resultados não é observado um efeito burst
pronunciado, no entanto, há uma liberação um pouco mais rápida nas primeiras 7,5 hs de
análise em que são liberados 34,90% do óleo. A ausência de liberação inicial pronunciada
corrobora os resultados discutidos anteriormente de análise por IV-TF em que não foi
sugerida a presença de componentes do óleo adsorvida na superfície da NP. O teor máximo de
óleo liberado (82,60%) foi observado após 53,5h de ensaio, fato esse que ajuda a confirmar o
encapsulamento do óleo no sistema nanoparticulado e a eficiência de dissolução foi de 54,81
± 2,52 %.
% de Óleo Liberado
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
Tempo (horas)
Figura 20. Perfil de liberação in vitro do óleo de copaíba encapsulado em NLS.
Observando os resultados como fases isoladas (a primeira fase até 7,5 h e a segunda
fase de 24h até o final do ensaio), apesar dos coeficientes de correlação estarem muito
próximos, verifica-se que o modelo que mais se ajusta é o de Hixson-Crowell para a Fase I
(R2= 0,998) e o de ordem zero para a Fase II (R2= 0,9983), com a liberação de 0,9376% de
óleo por hora. Costa e Lobo (2001) relatam que este é o modelo ideal para um "efeito
farmacológico prolongado" uma vez que são liberadas quantidades iguais do ativo por
variações iguais de tempo.
Após a análise dos dados obtidos com o perfil como um todo e aplicando-os em
diversos modelos matemáticos (Tabela 6) que descrevem diferentes mecanismos de liberação
de fármacos, observa-se pelo maior coeficiente de correlação, que o modelo de Higuchi (R 2=
0,992) é o mais adequado para inferir sobre a cinética demonstrada. Neste modelo, o processo
mais importante é o de difusão, baseado na lei de Fick (determinada substância tende a ir de
um local de maior concentração para um local de menor concentração de acordo com o
gradiente de concentração) e depende da raiz quadrada do tempo (COSTA; LOBO, 2001).
62
Tabela 6. Cinética de liberação in vitro do óleo de copaíba a partir da NLS desenvolvida.
Modelos matemáticos de liberação utilizados, suas respectivas constantes de velocidade de
liberação (k), coeficientes de correlação (R2) e expoente de difusão (n).
Modelos Matemáticos
Ordem Zero
Primeira ordem
Higuchi
Hixson-Crowell
Korsmeyer-Peppas
√
Equação
Variáveis
k0
R2
k1
R2
kHC
R2
kK
Fase I
4,69
0,996
0,322
0,898
16,608 0,980
-0,084
0,998
5,220
Fase II
0,938
0,998
0,014
0,998
11,47
0,997
-0,033
0,995
11,045 0,996 0,506
Perfil Completo
1,44
0,933
0,046
0,694
12,122 0,992
-0,036
0,984
6,069
kH
R2
R2
n
0,994 0,946
0,973
0,69
Jose et al. (2014) ao produzir NLS de Compritol® 888 ATO contendo resveratrol
também utilizaram a detecção por espectofotometria com auxílio de uma curva de calibração,
com sucesso, para quantificar o fármaco liberado e reconheceu o modelo de Higuchi (R 2=
0,967) como mais adequado. O efeito burst que obteve foi mais pronunciado que o do
presente estudo, com aproximadamente 40% de liberação durante as 6 primeiras horas, que
pode ser explicado pela adsorção de moléculas do fármaco na superfície da NP, sendo seguido
por uma liberação sustentada e ao final de 24 h já havia liberado aproximadamente 70% do
fármaco. No presente estudo, a liberação sustentada é mais lenta, sendo necessários
aproximadamente 54 horas para liberação de cerca de 83% de ativo.
A temperatura em que a NP é produzida também pode interferir no seu perfil de
liberação. O emprego de altas temperaturas, como a aplicada nas formulações do presente
estudo, diminui a homogeneidade de distribuição do óleo na matriz lipídica, favorecendo o
modelo drug-enriched Shell (MÜLLER; MÄDER; GOHLA, 2000).
Hu et al. (2006)
verificaram que CLNs produzidos a 70°C apresentavam um perfil bifásico de liberação com
um burst inicial, nas primeiras 8 h, enquanto que as mesmas NPs produzidas a 0°C
apresentaram uma grande diminuição deste efeito e uma redução do coeficiente angular da
reta ajustada ao modelo de Higuchi, o que expressa uma menor taxa de liberação em função
do tempo.
Ainda de acordo com a Tabela 6, é possível observar que a nanopartícula estudada
apresentou um mecanismo de liberação que também pode se adequar facilmente ao modelo de
Hixson-Crowell, uma vez que seu coeficiente de correlação (R2= 0,984) não foi muito menor
que o obtido no modelo de Higuchi. Neste perfil a dissolução depende das mudanças que
ocorrem na superfície da partícula e da agitação, portanto, se mudanças na forma da partícula
63
ocorrerem, também haverão mudanças nos valore das constantes de liberação (HIXON;
CROWELL, 1931).
O mecanismo proposto por Korsmeyer-Peppas também apresentou um bom
coeficiente de correlação (R2= 0,973). Esse modelo é muito utilizado quando não se sabe
exatamente o mecanismo de liberação de determinado fármaco ou quando há grande
influência de mais de um mecanismo. O interessante é verificar o valor de "n", que
corresponde ao expoente da variável tempo na equação. Para esferas com materiais não
intumescíveis como é o caso do Compritol®, quando esse valor é inferior a 0,43 a difusão de
Fick é o principal mecanismo; no caso em questão o valor de "n" se encontra entre 0,43 e 1,00
(n=0,69) o que confere um mecanismo anômalo em que há a participação do processo
Fickiano e não-Fickiano, ou seja, também há a participação da erosão no processo; para
valores de n=1 assume-se uma liberação de ordem zero, ou seja, independente do tempo
(RITGER; PEPPAS, 1987). De acordo com Costa e Lobo (2001), um dos fatores de grande
influência na forma como o fármaco é liberado de sua forma farmacêutica é a solubilidade do
mesmo, se este, não for solúvel no meio, o mecanismo de liberação predominante é a erosão,
ou seja, há a necessidade que o fármaco seja inicialmente liberado das outras moléculas que o
protegem. Neste caso, o meio utilizado garante a solubilização do óleo, mas somente em
concentrações menores que 100 µg/ml, mais um fator que leva a aceitar a participação da
erosão no processo.
Silva et al. (2012) também encontraram coeficientes de correlação muito próximos
para os modelos de Higuchi (0,9789) e Korsmeyer-Peppas (0,9825) em NLS contendo
risperidona e admitiram o último, como o modelo de melhor adequação, tendo valor de
n=0,568 foi considerada a participação de ambos os mecanismos: difusão e erosão para a
liberação do fármaco.
O Compritol® 888 ATO não apresenta boa capacidade de intumescimento. Gambhire
et al., (2007) verificaram que comprimidos produzidos com esse polímero hidrofóbico
liberavam o fármaco hidrossolúvel diltiazem preferencialmente pelo mecanismo de erosão.
Tal afirmação corrobora o mecanismo anômalo encontrado, onde se pode inferir que no
mecanismo inicial de liberação há maior participação da difusão, uma vez que há maior
concentração de óleo nas camadas mais externas da NP e depois há uma maior participação
64
do mecanismo de erosão nas camadas mais internas onde a quantidade de óleo de copaíba é
menor.
É necessário lembrar que os modelos apresentados são deduções matemáticas
simplificadas que em sua maioria levam em consideração somente um fenômeno como
responsável pela liberação do ativo, quando sabe-se que na verdade, vários fenômenos de
origem química e física estão ocorrendo ao mesmo tempo. Essa complexidade faz com que a
descrição por um modelo seja muito difícil tornando-os apenas aproximações da realidade
(COSTA; LOBO, 2001).
5.4 ESTUDO DE ESTABILIDADE
Nanopartículas contendo o óleo de copaíba (NC) ou não (branco) (N) foram refeitas,
em triplicata, empregando-se a formulação ideal segundo o planejamento experimental. As
amostras foram mantidas sob refrigeração e avaliadas quanto aos aspectos visuais,
distribuição de diâmetro de partícula, potencial zeta (NLS em suspensão) e conteúdo de óleo
encapsulado (NLS liofilizadas) no dia em que foram produzidas e após 6 meses de estocagem.
Na figura 21, observa-se a suspensão de SLN no momento em que foram produzidas e nos 6
meses posteriores.
65
N
NC
D0
M6
Figura 21. Suspensão de N e NC no dia em que foram produzidas (D0) e após 6 meses (M6).
Após o período analisado a N manteve o aspecto de uma suspensão homogênea,
fluida, branca, com reflexo azulado. No entanto, as amostras de NC logo após a segunda
semana de armazenamento começaram a apresentar um aspecto gelificado de “géis semisólidos tipo pomada” segundo descrito por Westesen e Siekmann (1997) (semi-solid
ointment-like gels) que se manteve até o sexto mês de observação.
Sabe-se que algumas formulações de NLSs tendem a formar o gel com o tempo, e que
qualquer entrada de energia como temperatura, luz, agitação podem acelerar esse processo
uma vez que promovem o aumento da energia cinética e colisão entre as NPs. Nesse caso,
supõe-se que o óleo de copaíba, com sua alta viscosidade, promova um aumento das forças de
cisalhamento que agem nas NPs. Freitas e Müller (1999) mencionam que esse aumento da
energia cinética pode levar a quebras e danos na camada de tensoativo que se desorganiza,
favorecendo a agregação ou a formação de "pontes" de lipídeo entre as NPs, ou seja, a rede
tipo gel. Além disso, durante a recristalização do lipídeo, as novas formas cristalinas formadas
66
que apresentam configurações distintas podem demonstrar diferentes afinidades com as
moléculas do tensoativo deixando espaços para a formação dessas "pontes". A redistribuição
do estabilizante que ocorre na superfície das NPs recém-formadas se dá de maneira e
velocidades diferentes dependendo de suas características intrínsecas (WESTESEN;
SIEKMANN, 1997). Por exemplo, o LSS (Lauril Sulfato de Sódio) que forma micelas de
baixo peso molecular tem o processo de redistribuição muito mais rápido que o poloxamer.
Devido ao seu alto peso molecular, o poloxamer apresenta mobilidade lenta e não consegue
cobrir as novas superfícies formadas em velocidade suficiente para prevenir o efeito
(MEHNERT; MÄDER, 2001).
Aliado à isso, existe também a influência da concentração de lipídeo, sendo que
quanto maior, mais pronunciada é a formação de gel pois aumenta a probabilidade de colisão
entre as partículas (MEHNERT; MÄDER, 2001). Mehnert e Mäder (2001) observaram a
gelificação em NLS contendo Compritol® e poloxamer na proporção de 10:2. No entanto, na
proporção de 5:2 este efeito não foi observado durante as 2 semanas do experimento. A
proporção utilizada no presente estudo foi de 6:4, ou seja, uma baixa concentração de lipídeo,
porém maior de tensoativo, o que colaborou para a manutenção do aspecto das Ns e mais uma
vez levando a concluir que o óleo de copaíba foi o grande responsável pela gelificação. Uma
ferramenta que poderia ser utilizada para manter a viscosidade inicial da formulação com o
óleo de copaíba é a adição de um co-tensoativo. Westesen e Siekmann (1997) conseguiram
impedir a gelificação de NLS de tripalmitato com diversos tipos de Lipoid (E8, S75, S110)
pela adição de tyloxapol ou glicolato de sódio como co-tensoativos.
Na Tabela 7 estão apresentados os demais parâmetros avaliados no estudo de
estabilidade. Após aplicação do teste ANOVA, não houve diferença significativa (p>0,05)
entre os valores entre o dia 0 e o mês 6 para nenhum dos parâmetros estudados: diâmetro
médio de partícula (Z-ave) (p=0,2222), índice de polidispersidade (IP) (p=0,9227), potencial
zeta (PZ) (p=0,1687) e eficiência de encapsulamento (EE) (p=0,8566)). A ausência de
diferença significativa das características físicas mencionadas durante o tempo de estudo,
indica que mesmo após a geleificação há estabilidade no sistema.
67
Tabela 7. Resultados obtidos no primeiro dia (Dia 0) e no sexto mês (Mês 6) do estudo de
estabilidade quanto ao diâmetro médio de partícula (Z-Ave), índice de polidispersidade (IP),
potencial Zeta (PZ) e eficiência de encapsulamento (EE) para as N e NC (feitas em triplicata).
PZ
Tempo Exp.
Z-ave
IP
EE (%)
(mV)
Dia 0
Mês 6
N
236,5 ± 3,20
0,409 ± 0,021
-22,80 ± 0,95
-
NC
244,43 ± 9,09
0,402 ± 0,027
-14,18 ± 0,86
56,08 ± 3,54
N
252,9 ± 11,41
0,447 ± 0,060
-19,50 ± 0,20
-
NC
245,98 ± 58,01
0,512 ± 0,047
-17,17 ± 2,88
57,42 ± 3,10
Em relação à EE, sendo o ativo um óleo, a incorporação na matriz lipídica reduz a
formação de uma NP altamente cristalina, diminuindo a sua expulsão, dessa forma, mesmo
após 6 meses de armazenamento a quantidade de óleo de copaíba encapsulada não apresentou
alteração significativa.
De acordo com os resultados do perfil de liberação do óleo, sabe-se que a quantidade
de ativo disponível para efeito é modificada após a sua encapsulação, ou seja, a administração
da mesma quantidade de óleo livre e em NLS exibirá comportamento diferente devido a
liberação gradual na segunda opção. Dessa forma, a permanência do ativo encapsulado na NP
é imprescindível para viabilizar o uso da mesma, uma vez que é desejável a manutenção do
comportamento da formulação durante o maior período de tempo possível.
Outro ponto a ser destacado é a presença de componentes voláteis no óleo de copaíba
que possivelmente são protegidos da volatilização pelo encapsulamento em NLS, sendo essa
uma estratégia utilizada por diversos autores, possibilitando a utilização de produtos voláteis
em formulações ou para usos anteriormente inviáveis devido a rápida perda dos ativos. Shi et
al. (2012) verificaram que a maior taxa de evaporação dentre os seis componentes voláteis
escolhidos para análise presentes na mistura de resina de olíbano (Boswellia) e óleo de mirra
(Commiphora) (1:1) encapsulada em NLS foi 44,47%, enquanto que no óleo livre, a menor
taxa de evaporação foi 46,1% durante 6 dias de acompanhamento. Emulsões e NLS contendo
óleo essencial de Artemisia arborescens foram comparadas quanto à evaporação do óleo, e
enquanto a emulsão permitiu a volatilização de 69,56%, a NLS de Compritol® 888 ATO
evaporou somente 37,07% do mesmo em 48 horas de estudo (LAI; WISSING; MULLER,
2006).
68
5.5 AVALIAÇÃO DO EFEITO DAS NAPARTÍCULAS SOBRE A REGENERAÇÃO
CUTÂNEA EM CAMUNDONGOS.
O desempenho in vivo da melhor formulação obtida pelo planejamento experimental
foi avaliado quanto à propriedade cicatrizante em camundongos. Uma vez que o óleo de
copaiba é descrito como sendo benéfico nesse processo (ESTEVÃO et al., 2009;
GIESBRECHT, 2011; PAIVA et al., 2002) planejou-se verificar o desempenho do mesmo
quando encapsulado no nanossistema em comparação com o óleo puro e demais grupos
controle. Os grupos estudados foram os seguintes: (S) Solução salina fisiológica (0,9%);
(SCT) Solução de óleo de copaíba (25,0 mg/ml) e Tween® 80 (40,0 mg/ml) em solução salina
fisiológica (0,9%); (OM) Óleo Mineral ; (N) Nanopartículas Branco em suspensão; (NC):
Nanopartículas contendo óleo de copaíba (25,0 mg/ml) em suspensão. Os tratamentos foram
administrados durante 5 dias, uma vez ao dia e as fotos das lesões foram tiradas nos dias 0, 3,
7, 10 e 14. Para o cálculo da área de lesão, foram utilizados 3 camundongos por grupo.
A verificação da contração da área da lesão é bastante utilizada para analisar o
processo de cicatrização (MIRANDA, 2001; PRATA et al., 1988; SANTOS et al., 2002), por
esse motivo, optou-se por empregar esse estudo preliminar como um indicativo desse
processo. A região dorsal foi escolhida para o ensaio pela menor probabilidade do próprio
camundongo realizar outro trauma na região. A introdução do grupo óleo mineral serve para
estabelecer um parâmetro de comparação em relação à oleosidade. No grupo controle o qual
foi administrada a solução salina fisiológica, avalia-se a possibilidade de interferência em
decorrência do estresse da manipulação. O tratamento com a suspensão de nanopartículas
branco fornece informações sobre a interferência da nanopartícula no resultado. A solução de
óleo de copaíba foi diluída para obtenção de concentração de copaíba igual à administrada ao
grupo NC.
O gráfico representativo do comportamento das lesões durante o tempo de ensaio se
encontra na Figura 22. Após a aplicação do teste two-way ANOVA seguida pelo teste de
comparações múltiplas de Bonferroni para avaliar as diferenças entre os grupos estudados,
foram identificadas diferenças significativas entres os grupos nos dias 3, 7 e 10. No terceiro
dia houve diferença entre o grupo S e NC. No sétimo dia, o grupo que recebeu solução salina
fisiológica (grupo S) apresentou área de ferida significativamente menor que os grupos SCT e
NC. No décimo dia, o grupo NC apresentou área de lesão significativamente maior que os
69
demais grupos, conforme mostra a Figura 23 pela presença da casca, que nos outros grupos já
havia caído. No final do experimento (dia 14), todos os grupos apresentaram similaridade
quanto à área de lesão, não sendo estatisticamente diferentes entre si.
S
C o n t r a ç ã o d a F e r id a
140
SCT
% Á re a d a Le sã o
120
OM
100
N
NC
80
60
40
20
0
0
3
7
10
14
T e m p o ( D ia s )
Figura 22. Evolução da contração da ferida nos camundongos após 5 dias de tratamento,
durante 14 dias de experimento. *(S): Solução salina fisiológica (0,9%); (SCT): Solução de
óleo de copaíba (25,0 mg/ml) e Tween®80 (40,0 mg/ml) em solução salina fisiológica (0,9%);
(OM): Óleo Mineral ; (N) : Nanopartículas Branco; (NC): Nanopartículas contendo óleo de
copaíba (25,0 mg/ml).
70
D0
D3
D7
D10
D14
S
SCT
OM
N
NC
Figura 23. Análise morfométrica das lesões cutâneas em camundongos durante os dias 0, 3, 7,
10 e 14 do ensaio. Os tratamentos foram administrados 1 vez ao dia durante os 5 primeiros
dias. * (S): Solução salina fisiológica (0,9%); (SCT): Solução de óleo de copaíba (25,0
mg/ml) e Tween® 80 (40,0 mg/ml) em Solução salina fisiológica (0,9%); (OM): Óleo Mineral;
(N) : Nanopartículas Branco; (NC): Nanopartículas contendo óleo de copaíba (25,0 mg/ml).
Muitos são os fatores que podem ter levado ao retardo da contração de ferida no grupo
NC, um deles é o ressecamento verificado com a utilização das NLS contendo óleo de
copaíba, se apresentando com um aspecto de creme levemente amarelado que ressecou com o
decorrer dos dias em contato com o ar na superfície da ferida. Svensjö et al. (2000) ao
comparar feridas em suínos tratadas com meio de gel (hidrocolóides), líquido (salina) e seco
71
(gaze) observou que o meio líquido acelerou o processo de cicatrização, tendo 86% dos
ferimentos cicatrizados depois de tratados com solução salina em comparação com 20% do
gel e 0% com o ambiente seco. A natureza líquida dos tratamentos administrados nos grupos
S e N pode estar relacionada com o fato desses grupos terem sido os únicos em que não houve
aumento da área de lesão nos primeiros dias. Diferentemente das NPs contendo óleo de
copaíba, as NPs branco permaneceram como uma suspensão aquosa o que aumentou o teor de
umidade na área da ferida, auxiliando o processo de cicatrização, assim como a solução
fisiológica.
Outros fatores que também interferem no aumento da área da ferida são a própria
mobilidade dos camundongos e a tensão exercida pela pele circundante. Teo e Naylor (1995)
observaram um acréscimo de até 15% de área em lesões na região dorso-lateral de ratos,
independente dos grupos e incluindo o controle, portanto, uma maior agitação do
camundongo pode contribuir para a diferença observada de cicatrização tecidual.
A crosta formada pode ter ocultado uma possível contração da lesão. De acordo com
Eurides et al.(1998) a crosta da lesão é benéfica ao processo de reparação cutânea. A crosta
pode ter ainda mascarado algum processo inflamatório. A inflamação é necessária para a
cicatrização, mas se ocorrer de maneira exacerbada, dificulta a migração de células e pode
levar a um afastamento das bordas da ferida, aumentando a área de lesão (VIEIRA et al.,
2008).
Deve-se levar em conta também possíveis erros durante a demarcação da foto para
cálculo da área de lesão, uma vez que a formulação do grupo (NC) aderiu à pele ao redor da
ferida, tornando as bordas da mesma indefinidas.
Sandri et al. (2013) comprovaram a ausência de toxicidade in vitro de NLSs
produzidas com Compritol® 888 ATO e poloxamer frente a fibroblastos cultivados, ademais,
houve redução do efeito citotóxico de sulfadiazina de prata quando encapsulada nesse tipo de
nanopartícula. O estudo mencionado, juntamente com o comportamento observado do grupo
N dá respaldo à afirmação de que a nanopartícula utilizada não implica efeitos tóxicos que
poderiam prejudicar o processo de reparo tecidual .
De forma similar a esse estudo, Brito (1996) observou um aumento da área de lesão
em camundongos tratados com óleo de Copaifera reticulata, estando relacionado a um maior
72
tecido de granulação, maior vascularização e diminuição de fibras colágenas. A maior
vascularização também foi observada por Estevão et al. (2009), que trabalhando com óleo de
copaíba da espécie Copaifera langsdorffii verificou que o creme contendo 10% desse óleo
melhorou o aspecto de retalhos cutâneos com uma área de necrose mais clara (amarelada),
assim como uma maior vascularização na região dérmica se comparada com os grupos
controle total (sem tratamento) e branco (pomada sem ativo).
Se os achados do tecido de granulação para o grupo NC e/ou SCT forem compatíveis
com os demais estudos contendo óleo de copaíba supracitados e apresentarem um maior
tecido de granulação e neoangiogênese para os grupos mencionados, com densidade de
fibroblastos/ miofibroblastos pequena, tem-se uma menor força de contração, justificando a
visualização da maior área da ferida. Se ainda, a maior área do tecido de granulação estiver
relacionada à uma grande quantidade de colágeno, tem-se uma lentidão na reabsorção do
mesmo e remodelamento. Além disso, uma formação de vasos sanguíneos superior ao usual
pode estar relacionada com uma resposta inflamatória e/ou hipóxia exacerbadas, deixando de
ser benéficas para a cicatrização e levando ao aumento da liberação de mediadores que
propiciarão produção de radicais livres e conseqüente dano celular (TEO; NAYLOR, 1995).
Giesbrecht (2011) observou efeito contrário ao do presente estudo com aumento da
área de lesão para os grupos controle (sem tratamento) e placebo e diminuição da área de
lesão para o grupo que recebeu pomada contendo óleo de copaíba em vaselina (1%, p/p)
diariamente por 30 dias. Ainda assim, o aumento da angiogênese observado nos outros
estudos se manteve com o grupo tratado com a pomada contendo o óleo. Paiva et al. (2002)
verificaram um aumento na porcentagem de retração da ferida de 84,05% nos animais
tratados com óleo do Copaifera langsdorffii em comparação a 51,29% do grupo controle,
assim como aumento da resistência da pele, indicando uma aceleração no processo de
cicatrização, provavelmente relacionada aos diterpenos presentes no óleo.
Diante desses fatos, pode-se dizer que a diferença observada principalmente durante o
sétimo e décimo dias do grupo NC, deve estar mais relacionado ao óleo de copaíba que à
escolha de encapsulamento do mesmo em NLS, uma vez que a presença do óleo alterou as
propriedades físicas da formulação, tornando-a mais viscosa e seca. Adicionado a isso, a NLS
aumentou o tempo de permanência do óleo na ferida: pela própria característica da
formulação que não permitia o escorrimento do óleo, diferente do que ocorreu com o grupo
73
SCT que era líquido; pelo aumento da área de contato produzida pela nanoformulação; e pela
característica de maior aderência ao invés de distribuição entre os tecidos observado para as
NLS quando administrado por via tópica (WISSING; LIPPACHER; MULLER, 2001).
Apesar dos resultados não apresentarem diferenças estatísticas quanto à área de
cicatrização final da ferida, pôde-se observar que os grupos passaram por processos diferentes
durante a regeneração tecidual, sendo os grupos que receberam tratamentos contendo o óleo
de copaíba (SCT e NC) os que apresentaram maior aumento da área da ferida logo após a
lesão inicial (Figura 22). Logo, relaciona-se a presença do óleo como o fator causal para o
comportamento prejudicado quanto ao parâmetro analisado, área de lesão.
Tendo em vista que a nanoformulação intensificou o comportamento in vivo do óleo
de copaíba, possivelmente devido a capacidade de liberar o ativo de maneira prolongada
(LIPPACHER; MULLER, MADER,2001), essa capacidade pode ser utilizada em outras
terapias em que o óleo se mostra benéfico.
A medição da área de superfície fornece proveitosas informações, porém limitadas,
informações tendo em vista que o processo de reparo cutâneo é um fenômeno tridimensional,
complexo e depende de uma série de fatores como multiplicação celular, neovascularização,
migração, produção de colágeno e contração. Assim, para uma conjectura mais concreta
quanto a qualidade do tecido neoformado e, portanto, da cicatrização faz-se necessária uma
análise histológica e microscópica do tecido.
74
6 CONCLUSÕES

Foi possível a obtenção de uma formulação otimizada, com bons resultados dentre os
parâmetros avaliados de diâmetro médio de partícula (208,0 ± 2,10 nm) e conteúdo de
óleo de copaíba/g de NP (143,31 ± 11,80 mg) (EE= 62,10 ± 5,12 %) utilizando um
número reduzido de experimentos empregando-se um planejamento experimental
fatorial fracionado. A melhor formulação consistiu no emprego de ultrassom por 10
min à 50% de amplitude e razão ativo/lipídeo de 50% (30mg de óleo/g de
formulação).

O modelo de planejamento experimental linear do tipo fatorial fracionado se adequou
bem ao parâmetro de resposta conteúdo de óleo encapsulado (CO), levando a uma boa
correlação entre a equação prevista e a real dentro do domínio experimental escolhido.
Para o parâmetro diâmetro médio de partícula foi obtida uma curvatura significativa,
entretanto, ainda foi possível avaliar o comportamento das variáveis estudadas e
escolher os níveis a serem utilizados na melhor formulação.

Levando em consideração que o óleo utilizado apresenta baixíssima solubilidade em
água mesmo com a adição do tensoativo (poloxamer), que a mudança no
comportamento térmico da NC foi pequena, não foi possível observar as bandas
referentes ao óleo no espectro de IV-TF da NC, pode-se inferir que não há óleo de
copaíba aderido à superfície da NP. Entretanto, o mesmo se encontra em quantidades
razoáveis nas camadas mais externas da matriz, devido ao discreto efeito burst
observado no ensaio de perfil de liberação.

Não é possível afirmar que a cinética de liberação do óleo de copaíba se adeque
unicamente a um modelo matemático dentre os estudados. Desta forma, os
mecanismos de difusão do óleo, dissolução e erosão da matriz lipídica, são fatores
relevantes para a liberação do óleo de copaíba da NLS desenvolvida.

Apesar da mudança de aspecto visual da formulação contendo óleo de copaíba, não
houve alteração significativa nos parâmetros avaliados durante os 6 meses de estudo,
distribuição de tamanho, potencial Zeta e EE, sugerindo a estabilidade do produto.

Pela análise morfométrica, não houve diferença entre os grupos estudados quanto à
área final de lesão (Dia 14), mas verificou-se que a presença do óleo de copaíba no
tratamento alterou o processo de cicatrização de forma a aumentar a lesão até o
décimo dia.
75

Propõe-se a realização de um planejamento composto central quanto à variável
diâmetro médio de partícula para adição de mais experimentos que considerariam a
resposta quadrática, visando estabelecer um modelo de maior precisão quanto ao
comportamento dos fatores escolhidos.

Devido a exacerbação da resposta in vivo frente a NC na metodologia empregada, são
necessários novos estudos para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no
processo de cicatrização. Além disso, outras avaliações das atividades biológicas da
formulação proposta devem ser realizadas, tais como a antimicrobiana por exemplo.
76
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