Ficha Informativa nº11 Fundamentos de Engª.Genética

FICHA INFORMATIVA Nº11
FUNDAMENTOS DE ENGª.GENÉTICA
Ficha Informativa nº11
Fundamentos de Engª.Genética
“Durante 25 anos, desde 1950 a 1957, a molécula de DNA foi considerada “intocável”. A partir da década de 70 do séc. XX, porém ocorreu uma verdadeira
revolução biotecnológica (…). Abriram a molécula de DNA, extraíram genes, transplantaram-nos para outras células, multiplicaram alguns desses genes milhões e
milhões de vezes e “criaram em tubo de ensaio” seres que não surgiram como resultado de milhões de anos de evolução”
Terra, Universo de Vida, Biologia de 12ºano (Porto Editora)
Escola Secundária da Amadora
Biologia – 12ºano
FICHA INFORMATIVA Nº11
FUNDAMENTOS DE ENGª.GENÉTICA
Como já foi falado em anos anteriores, o material genético, denominado DNA (ácido desoxirribonucleico) está empacotado no núcleo das células
eucariotas sob a forma de cromossomas (existindo ainda uma pequena parte, de forma circular, no interior das mitocôndrias que se encontram
espalhadas no citoplasma) e encontra-se solto no citoplasma nas células procariotas sob a forma de cromossomas e pequenos plasmídeos ambos
circulares.
Este material ao ser descodificado leva à produção de todas as proteínas existentes num determinado organismo (excepto se este tiver de alguma
forma danificado).
Esta síntese é unidireccional, tendo esse processo de passar pela seguinte ordem:
DNA (Transcrição) Æ mRNA (Tradução) Æ Proteínas.
Este processo é muito idêntico nas células procariotas e eucariotas, no entanto, no último caso, o mRNA tem de sofrer maturação/processamento,
onde são retiradas as zonas não codificantes (Intrões) existentes no DNA que foi transcrito (às zonas codificantes dá-se o nome de Exões):
DNA (Transcrição) Æ RNA (Processamento) Æ mRNA (Tradução) Æ Proteínas.
Outra diferença, é o facto da replicação nos procariontes se dar de uma forma contínua (só existe um sítio de iniciação e terminação), enquanto nos
eucariontes se dá de uma forma descontínua (através de pequenas porções, pois existem vários pontos de iniciação e terminação da replicação).
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DE QUE FORMA A ENGENHARIA GENÉTICA VEIO REVOLUCIONAR O NORMAL FUNCIONAMENTO DA SÍNTESE PROTEICA ?
A descoberta de enzimas de restrição foi um dos primeiros passos para a grande revolução que a eng.genética veio a revelar. Estas
Enzimas/Endonucleases de restrição fazem parte de complexos enzimáticos de defesa de algumas bactérias que são infectadas por vírus/bacteriófagos e
que digerem o DNA parasita (de notar que a própria bactéria defende o seu DNA através da acção de outras enzimas – metilases - que adicionam
grupos metil, CH3, ao DNA evitando que as outras enzimas se liguem ao DNA). Este procedimento evita que o DNA viral seja inserido no seu
DNA não permitindo a sua multiplicação e posterior morte da célula hospedeira .
A característica interessante destas enzimas é que elas reconhecem sequências específicas de nucleótidos (zonas de restrição) cortando
especificamente a hélice dupla do DNA nessa sequência. Cada enzima apenas corta uma zona de restrição (ex.: enzima EcoRI- 5’GAATTC3’, e
Hind III – 5’AAGCTT3’).
Outra descoberta relacionada também com o estudo das infecções virais foi a possibilidade de introduzir DNA estranho no interior de
outros organismos, tal como os vírus o faziam. Sob determinadas condições esse DNA recombinante (DNA do organismo receptor mais o DNA do
dador/parasita) sofre replicação e é transmitido às células filhas sempre que a célula se divide.
Uma última conclusão tirada foi que o DNA viral apresenta uma determinada característica que lhe permite ligar-se ao DNA das bactérias,
incorporando-se no seu interior.
Mais tarde, os cientistas aperceberam-se das vantagens da utilização de outros Vectores, como os plasmídeos das próprias bactérias,
recombinados no exterior, e reintroduzidos novamente nas bactérias (através de processos que aumentam a permeabilidade da sua membrana).
Para manipular o material genético, a eng.genética desenvolveu então uma série de técnicas, tais como:
1. Isolamento de ADN
2. Utilização de Enzimas de Restrição/Endonucleases de restrição para cortar pequenos fragmentos de DNA e de Ligases de DNA para ligar
os nucleótidos covalentemente entre fragmentos complementares.
3. Utilização de Vectores, transportadores bacterianos e virais, que permitem a entrada de DNA estranho no interior de um organismo
receptor.
4. Produção de rDNA ( DNA recombinante/recombinado)
4.1. - Produção de cDNA (DNA complementar)
4.2. - Clonagem de genes/cDNA, formando Bibliotecas de genes/cDNA
5. Leitura de Impressões Digitais Genéticas (que permite identificar a paternidade de uma criança, por exemplo)
6. Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR), que permite obter milhares de cópias de DNA em poucos minutos.
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Para produzir uma molécula de rDNA (DNA recombinante) são necessários 3 elementos:
1. Um DNA dador (de uma célula eucariota ou procariota)
2. Um DNA que sirva de vector transportador (DNA Bacteriano – Plasmídeo ou DNA Viral )
3. Uma célula receptora (ou um organismo receptor se for unicelular)
1. ISOLAMENTO
DE
DNA
Para transformar o DNA necessitamos de o extrair da célula em que
se encontra e separá-lo dos outros constituintes celulares (proteínas,
enzimas, mRNA e tRNA).
Separação dos componentes celulares de uma célula eucariota (imagem 89 do
livro adoptado, pág. 213)
Nota – ver imagem 90 do livro adoptado, pág. 214 (Isolamento do DNa
Plasmídico).
O procedimento para retirar o DNA de células eucariotas e
procariotas varia, uma vez que no primeiro caso o núcleo é a única
barreira às enzimas existentes no citoplasma que podem digerir o DNA.
Existem técnicas que permitem inactivar a acção dessas enzimas
existentes no citoplasma (como diminuir a temperatura) e separar os
restantes materiais celulares (DNA, RNA e proteínas). Estes são
separados de acordo com a sua dimensão, densidade e afinidade, através
de centrifugação (e adição de fenol e clorofórmio). O DNA ficará retido
na fase aquosa, mais à superfície, enquanto que os restantes
componentes ficarão precipitados no meio ou no fundo (interface ou
fase orgânica respectivamente). A fase orgânica, contendo as proteínas, é
facilmente retirada, mas ainda resta RNA em suspensão juntamente
com o DNA. Por essa razão adicionam-se enzimas que degradam o
RNA, e fazem-se várias lavagens (ressuspender e precipitar o DNA várias
vezes) para que os vestígios de RNA sejam retirados e tenhamos apenas
DNA no final.
No caso do ADN bacteriano , a extracção também é realizada por
centrifugação (para que o DNA cromossomal seja separado do DNA
plasmídico). Neste caso os plasmídeos ligam-se aos compostos densos,
ou seja, ficam retidos no fundo, fase orgânica).
2. ENZIMAS /ENDONUCLEASES
DE RESTRIÇÃO E LIGASES DO
DNA
O DNA humano apresenta cerca de 300 sequências diferentes de pares de
bases (zonas de restrição), que se repetem entre 300000 e 500000 vezes ao
longo de todo o genoma.
Como já foi referido, as Enzimas de restrição cortam zonas específicas
do DNA. As extremidades resultantes desse corte denominam-se
extremidades coesivas e podem ligar-se por complementaridade a outro
DNA.
Se a mesma enzima for utilizada para cortar a abertura de um vector e
cortar as duas extremidades do DNA, ao ser introduzido nesse vector as
suas extremidades terão exactamente a mesma sequência de bases,
podendo ligar-se por complementaridade umas às outras. Contudo
existe uma falha entre as ligações do esqueleto açúcar-fosfato. Esta falha
pode ser reparada, através de uma enzima reparadora – a ligase do
DNA, que estabelece uma ligação covalente entre os nucleótidos
adjacentes dos dois fragmentos de ADN.
Os vectores são moléculas capazes de transportar um fragmento de DNA
para uma célula, como já foi referido.
3. VECTORES
A ideia de utilizar Plasmídeos (uma pequena molécula de DNA além do
DNA cromossomal da bactéria), passou essencialmente pelas suas
propriedades:
1. Apresentam genes não essenciais para a sobrevivência da bactéria
2. Podem replicar-se independentemente da molécula principal.
3. Apresentam genes com resistência a antibióticos que podem servir
como marcadores, na selecção de bactérias com rDNA plasmídico das que
não apresentam plasmídeos.
4. Apresenta apenas uma zona de restrição para a enzima EcoRI
(5’GAATTC3’)
Normalmente utilizam-se 2 tipos de vectores ou transportadores:
a) DNA plasmídico
b) DNA viral
Para se introduzir este vector novamente no interior da bactéria, é
necessária a presença de CaCl2 e choque térmico para aumentar a
permeabilidade da membrana celular da bactéria, e o Plasmídeo entrar no
seu interior.
É igualmente possível a utilização de bacteriófagos como vectores.
DO RDNA
O procedimento para a construção de rDNA consiste nos seguintes passos:
( DNA
3-TÉCNICA
RECOMBINADO/RECOMBINANTE)
Tal como o nome indica a técnica do DNA recombinado, significa que se
alterou o tipo de informação genética num determinado ADN (neste caso
adicionando um gene extra que se quer clonar).
Nesta técnica, essa recombinação é apenas um processo intermédio para se
poder multiplicar um determinado gene, de modo a produzir-se uma
proteína específica e em grandes quantidades (ex. Insulina, hormona do
crescimento, etc.) , numa célula hospedeira que facilmente se replique
(como um vírus ou uma bactéria).
Produção de Insulina recorrendo à técnica do rDNA.
1. Isolamento do DNA que contém o gene que se quer
clonar e do DNA plasmídico.
(centrifugação em ambos os casos e a baixas temperaturas se
a célula for eucariota, para inibir a acção enzimática).
2. DNA plasmídico+ Enzima de restrição.A
(abertura do Plasmídeo)
3. DNA dador + Enzima de restrição A
(abertura de todas as zonas de restrição)
4. Isolamento do gene que se quer inserir no Plasmídeo.
5. Gene + Plasmídeo + Ligases de DNA.
6. Temos agora um Plasmídeo com rDNA
7. Plasmídeos recombinantes + Bactérias
(Indução do aumento de permeabilidade da bactéria (CaCl3
e choque térmico) para que o Plasmídeo possa entrar na
bactéria).
8. O gene inserido passa a comandar a síntese da proteína desejada
(Nota - os restantes genes do Plasmídeo e do cromossoma primário
continuam a sintetizar as restantes proteínas normalmente).
(DNA
COMPLEMENTAR)
Procedimento da técnica:
O DNA complementar é um DNA sintético, que é produzido no sentido
inverso ao da transcrição (passagem de DNA para mRNA). Como este é
produzido a partir do mRNA, e no caso dos eucariontes, este mRNA já
sofreu maturação perdendo as zonas não codificantes do DNA original
(Intrões), o cDNA sintetizado não vai ser igual ao original, uma vez que
também não vai apresentar Intrões, no entanto a sua comparação DNA e
cDNA permite-nos localizar as regiões codificantes(Exões) e as zonas não
codificantes (Intrões).
Esta característica não prejudica a síntese proteica a partir deste novo
DNA, uma vez que tem a informação necessária para sintetizar as mesmas
proteínas (pois só as regiões codificantes – Exões – é que são relevantes
para esse processo), estando pronto a usar. A grande vantagem é que este
DNA facilita a produção de proteínas de eucariontes nas bactérias, já que
estas não têm mecanismos de maturação do RNA (quando se introduzem
genes de um eucarionte num procarionte que contêm intrões, a sua
transcrição será feita de uma forma ininterrupta, produzindo-se uma
proteína diferente da pretendida).
Mas então como é que podemos reverter o sentido unidireccional da
síntese proteica (ou pelo de parte desta, da transcrição)?
3.1.
CDNA
Mais uma vez, ao estudarem ataques virais, os cientistas aperceberam-se
que certos tipos de vírus – retrovirus - não apresentavam o seu próprio
DNA (ex. HIV). Eles tinham sim, como material genético RNA, e ao
infectarem determinadas células é que sintetizavam o seu DNA a partir de
uma enzima denominada Transcriptase Reversa.
1º Isola-se do citoplasma todos os mRNA funcionais.
2º mRNAs (cadeia simples) + Enzimas Transcriptase Reversa
Æ Forma-se a 1ªcadeia de cDNA complementar ao mRNA
3º Faz-se a degradação do mRNA.
4º Poli A (Iniciador)*+ DNA polimerase
ÆSíntese da 2ªcadeia de DNA complementar
Foi a partir da descoberta desta enzima que os cientistas encontram uma
nova ferramenta para manipular o material genético.
Nota Importante:
* Uma vez que a extremidade do cDNA apresenta uma sequência com várias Timinas
(complementares às extremidades com várias Adeninas do mRNA, como defesa à
degradação enzimática no citoplasma), necessitamos inserir um pedaço de DNA iniciador
(Primer), com uma sequência de várias Adeninas complementares, uma vez que a próxima
enzima a utilizar – DNA polimerase – apenas se consegue ligar ao DNA de cadeia dupla!
Procedimento para a realização de Bibliotecas genómicas:
Å DNA a clonar
3.2. BIBLIOTECAS
DE GENES/CDNA
Å Corte com a
mesma
Endonuclease
Inserção dos fragmentos nos plasmídeos ou DNA viral:
Clonagem:
Bibliotecas de cDNA:
Todos os cDNA que se sintetizam podem ser clonados em bactérias (ou
vírus).
Se fragmentarmos esse cDNA e inserirmos cada segmento numa bactéria,
podemos construir as chamadas bibliotecas de cDNA, pois cada fragmento
fica armazenado na bactéria durante longos períodos de tempo (com as
condições adequadas à sua sobrevivência).
Estes genes estão prontos a usar caso se queira fazer a síntese proteica.
Bibliotecas de genes (DNA):
Se por outro lado quisermos clonar todo o genoma de uma célula
eucariota, mesmo com os genes não activos /não codificantes, basta
utilizar enzimas de restrição, para fragmentar todo o genoma. Os
fragmentos resultantes vão ter tamanhos diferentes, no entanto como
foram cortados pela mesma endonuclease, vão apresentar extremidades
não ligadas, mas complementares entre si.
Neste último caso, não temos interesse em fazer a síntese das proteínas
desses genes, uma vez que como apresentam ainda intrões, vão ser
sintetizadas proteínas diferentes das que esperaríamos se o mRNA tivesse
sofrido maturação/purificação (quando perde os intrões).
Ambos os casos vão ser clonados pela técnica do rDNA.
Após multiplicar esses fragmentos, podemos voltar a retirá-los dos
plasmídeos, usando a mesma enzima de restrição que os cortou
inicialmente, separar os plasmídeos dos fragmentos que clonámos e juntar
os fragmentos entre si com Ligases de DNA de modo a formar de novo
toda o genoma.
6. IMPRESSÕES DIGITAIS GENÉTICAS
Exceptuando os gémeos verdadeiros, cada indivíduo possui o seu próprio
DNA.
Com base neste princípio, foi desenvolvida uma técnica denominada
Impressão Digital Genética ou DNA Fingerprint.
Este método é bastante utilizado nos testes parentais, onde normalmente o
filho apresenta cerca de 50% do seu genoma igual ao do pai e o restante
igual ao da mãe.
Em que é que consiste esta técnica?
1º A partir de uma pequena amostra de material biológico (cabelo,
unhas, ossos, etc.) extrai-se e isola-se o DNA.
2º Utilizam-se enzimas de restrição e o DNA é fragmentado em
segmentos pequenos e de diferentes tamanhos. (o tamanho varia
de indivíduo para indivíduo).
3º Colocam-se estes fragmentos num aparelho que contém gel e
um campo eléctrico (Electroforese), fazendo deslocar esses
segmentos a velocidades e distâncias diferentes.
4º Posteriormente observa-se a distância a que cada fragmento se
localiza (semelhantes a um código de barras).
Também é muito utilizado na investigação criminal para descobrir a qual
dos suspeitos pertencem determinados vestígios de tecido encontrados na
zona do crime. (se forem ligeiramente semelhantes, não pertencem à
mesma pessoa, só se forem 100% iguais).
Nota – Um outro material genético muito utilizado, é o DNA
mitocondrial (apenas proveniente da mãe). Este DNA é muito semelhante
ao dos plasmídeos das bactérias, uma vez que também é uma hélice dupla
circular, e não está ligado à produção de proteínas da célula, apenas da
própria mitocôndria.
7. PCR (REACÇÃO
DE POLIMERIZAÇÃO EM
CADEIA)
Mas afinal como é esse processo?
1º A partir de DNA isolado faz-se aumentar a temperatura
(95ºC), que faz o DNA desnaturar (perder as ligações por
pontes de hidrogénio que fazem ligar as bases
complementares), separando as duas cadeias de DNA.
3’ AAATTTCCCGGGATCA 5’Æ Aumento da
5’ TTTAAAGGGCCCTAGT 3’ temperatura
3’ AAATTTCCCGGGATCA 5’ (desnaturação)
5’ TTTAAAGGGCCCTAGT 3’
2º Adiciona-se 2 oligonucleótidos de iniciação (Primers)
de cerca de 20 nucleótidos, compostos pelas sequências
complementares aos nucleótidos do início de cada uma das
cadeias complementares*(aos 55ºC)
Para trabalhar os genes de um determinado indivíduo necessitamos
de cerca de 1micrograma de material genético .
O que fazer quando só se tem um cabelo ou outro vestígio orgânico ?
Em 1983 descobriu-se uma técnica, a PCR, capaz de replicar várias
copias de DNA em apenas alguns minutos! (Tal como ocorre na
replicação natural mas muito mais lentamente.)
Como este processo ocorre a elevadas temperaturas, além do DNA, a
própria enzima DNA polimerase era afectada. Contudo, surgiu a
ideia de utilizar a mesma enzima, mas de organismos capazes de viver
em locais com temperaturas muito altas, como as bactérias térmófilas
(que vivem nas proximidades de fontes hidrotermais).
A enzima utilizada resiste a todos os ciclos de aquecimento e
arrefecimento e tem como nome Taq polimerase, devido à designação
da espécie da bactéria em que foi extraída (Thermus aquaticus).
3’ AAATTTCCCGGGATCA 5’
5’ TTTAAAGGGCCCTAGT 3’ Å Iniciador1
3’ AAATTTCCCGGGATCA 5’ Å Iniciador2
5’ TTTAAAGGGCCCTAGT 3’
3º Adicionam-se Nucleótidos (T,G,C,A) +Enzima DNA
polimerase (Taq).para sintetizar as cadeias opostas (aos 70ºC)
3’ AAATTTCCCGGGATCA 5’
5’ TTTAAAGGGCCCTAGT 3’
Æ
3’ AAATTTCCCGGGATCA 5’
5’ TTTAAAGGGCCCTAGT 3’
DNA polimerase (-5’Æ3’ )
DNA polimerase ( 3’Å5’ )
3’ AAATTTCCCGGGATCA 5’
Æ
3’ AAATTTCCCGGGATCA 5’
5’ TTTAAAGGGCCCTAGT 3’
5’ TTTAAAGGGCCCTAGT 3’
4º Repetir todos os passos anteriores até obter o nº de
cópias desejado!
*Nota - para inserir os iniciadores certos, os cientistas necessitam
conhecer o início das sequências, para produzirem a sequência de
nucleótidos complementares correcta.