Métodos de Estudo da Célula: Microscopia

MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA
I - MICROSCOPIAS
O QUE QUERO OBSERVAR E PORQUÊ ???
M
I
C
R
O
S
C
O
P
I
A
S
Início (1600):
- Incorporação do microscópio aos estudos anatômicos;
- Desenvolvimento de técnicas de preparo para a visualização
dos materiais biológicos
1663
Robert Hooke
1689
Marcello
Malpighi
1750
1852
(1689)
Introdução da microscopia à medicina
Estudo de capilares
Marcello Malpighi
(1628-1694)
Médicos: Rejeitaram microscopia – inútil
Descrições sobre os capilares eram falsas
Anatomia comparada era irrelevante para medicina
Anatomia humana → só era útil para descrição
Fundamento: Sistema de lentes combinadas, que são colocadas de
forma a ampliarem a imagem do objeto
Interação da luz
com o espécime
Absorção
ou
Refração dos
raios de luz
Criar contrastes entre o objeto e o meio em que envolve
Microscópio
Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia
produção de imagens aumentadas de
objetos não visualizados à olho nú
1) De luz (ML) / óptico (comum)
Modificado (variações) com propósitos especiais
Contraste de fase
Invertido
Polarização
Fluorescência
2) Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons
Microscópio eletrônico de transmissão (MET)
Microscópio eletrônico de varredura (MEV)
Microscópio de luz
comum / campo claro
Componentes:
Fonte luminosa → luz branca
(lâmpada com filamento de
tungstênio)
Sistema de iluminação
Óptica → lentes
ampliação
condensação
Mecânica
Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho
Princípios da formação da imagem ao Microscópio
Imagem II
Image
mI
objeto
F
F
C
Fonte
de luz
condensadora
F
C
objetiva
C
ocular
Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular
O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam
a formação de uma imagem Invertida
Trajeto da luz
Centralização do feixe de luz
“Iluminação de Köhler”
Iluminação perfeita
Menos ocorrência de
aberrações e irregularidades
no trajeto luminoso
Objetiva (s) = próxima ao objeto
Corrige aberrações = ⇑ qualidade da imagem
Tipos: acromática, semi-apocromática, apocromática, planacromática, planapocromática
Imagem macroscópica do objeto
Projeta imagem real e invertida
Aumentos: 4x / 10x / 20x / 40x / 100x (imersão)
Ocular (es) = ⇑ imagem projetada pela objetiva
Aumentos: 10x, 12x
Aumento final
Objetiva
4x = Vermelha
10x = Amarela
40x = Azul claro
100x = Preta / branca
Abertura Numérica
4X
10X
40X
100X
AN = n.senα
AN = 0,12 (4x)
AN = Abertura numérica
AN = 0,34 (10x)
n = Índice de refração do meio de montagem
AN = 0,60 (40x)
sen = Fornecido pelo fabricante da lente
AN = acima de 1 (100x)
A = Ângulo de abertura da objetiva
α = Ângulo correspondente à metade de A
Poder de Resolução X Limite de Resolução
Bom microscópio:
1) Poder de Resolução (PR): “Capacidade de uma lente (ou do próprio
microscópio) em formar imagens com detalhes mínimos”
2) Limite de Resolução (LR): “Menor distância entre 2 pontos
distintos do objeto, que poderão ser individualizados na imagem
final”
> PR < LR
Quanto < o LR de uma lente > o PR do microscópio
ou
Quanto melhor for a capacidade de
individualizar 2 pontos distintos do objeto
(< LR) maior será a definição da imagem
formada no aparelho ( > PR)
Sequência de passos
Leia a etiqueta da lâmina
material / corte / coloração
Examine a lâmina macroscopicamente
pode-se obter muita
informação
Objetiva de menor aumento (panorâmica)
Ajustar área a ser observada, centralizando-a na platina
Iluminação de Köehler
Objetivas de aumentos maiores
Observação: imagem → invertida
Tipos de Microscópios
Microscopia de Luz
Microscopia convencional
Microscopia de contraste de fase
Microscopia de contraste interferencial
Microscopia de campo escuro
Microscopia de polarização
Microscopia de fluorescência
Microscopia confocal a laser
Microscopia eletrônica
Microscopia eletrônica de
transmissão
Microscopia eletrônica de alta
voltagem
Microscopia eletrônica de
varredura
Outros tipos de microscópio
Microscopia de tunelamento quântico
Microscopia de força atômica
Microscopia de Contraste de fase
Princípios da Difração da Luz
Anéis metálicos colocados no caminho da
luz (Zerniké, 1950)
Objetivas de contraste de fase: Ph (Phase)
Retardo óptico
e
Refração da luz
Microscopia de Contraste de fase
2º Anel
1º Anel
Aplicações da Microscopia de Contraste de fase
Análise do material biológico sem coloração prévia:
1. Culturas de células
2. Exames parasitológicos
3. Esfregaços e Raspagens de mucosas (Consultórios)
4. Sangue
5. Protozoários de ambientes aquáticos
6. Algas
7. Bactérias
Sem coloração
Bactérias
Diferenças de índices
de refração
Cultura de células: neurônios
Aplicações da Microscopia de Contraste de fase
Análise do material com coloração prévia
Esfregaço de Sangue
Divisão Celular em Raiz de
Cebola
Microscopia de Contraste Interferencial
Prismas ópticos posicionados no caminho da luz
Microscopia de Contraste Interferencial
Os prismas modificam a fase da onda luminosa
Contraste com o meio em que se encontra o material a ser
analisado
Microscopia de Contraste Interferencial
Microscopia de Normarski
Defasagem dos comprimentos de onda
Gera uma “deformação” na imagem
Princípio
Permite contraste interferencial
Aumentando o relevo das
superfícies do material analisado
Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial
Observação de materiais biológicos sem coloração:
1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices dos parasitos
(taxonomia)
2. Análise de massa seca celular – organização e compactação de material
biológico
3. Monitoramento de culturas celulares
Algas
Escamas
Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial
Cultura Celular: macrófago
Ácaro
Microscopia de Polarização
2 Filtros ou Prismas:
1º Polarizador → Entre a fonte de luz e o condensador
2º Analisador → Entre a objetiva e a ocular
Filtros:
Promovem a seleção de apenas um plano de direção de vibração das
ondas luminosas Plano da luz polarizada (PLP)
Observação:
Microscopia de luz comum → feixe de ondas luminosas → direção de
vibração em todos os planos
Microscopia de Polarização
2º
PLP
1º
Anisotropias Ópticas
Fenômenos de ordem espectral
Dicroísmo
(1 filtro polarizador)
Birrefringência
(2 filtros polarizadores
cruzados perpendiculares)
Microscopia de Polarização
Filtros polarizadores, quando colocados no caminho da luz e
rotacionados a 90o permitem a distinção de macromoléculas ditas
anisotrópicas (birrefingentes ou dicróicas)
Birrefringência
ocorre
Cruzamos perpendicularmente os 2
filtros (polarizador e analisador)
Componentes macromoleculares
Birrefringentes:
Anisotrópicos (brilho colorido ou não)
Outros componentes
Não refringentes:
Isotrópicos
Indistintos em fundo escuro
Material realçado
Aplicações da Microscopia de Polarização
1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados de
agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina
2. Análise de células que apresentem organização interna de suas
macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular esquelética,
espermatozóides (ordem molecular)
3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos arranjos
macromoleculares: tecidos ósseos, cartilagens, dente
4. Análise de componentes cristalinos dos minerais
5. Outros: parede celular; amido.
Aplicações da Microscopia de Polarização
Tecido ósseo
Grãos de Amido
Microscopia de Luz Polarizada
Exemplos:
Birrefringência
pode ser
intensificada
por corantes
Colágeno
- Xylidine Ponceau
- Picro-sirius
Cromatina / Matriz Extracelular
- Azul de toluidina
(ordem e agregação molecular )
Mesentério de rato. Coloração: Picro-sirius
(fibras de colágeno: intensa birrefringência /
brilhante / amarelo)
Aplicações da Microscopia de Polarização
Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada
Tecido ósseo : sistema de Havers ou
ósteon / fibras colágenas
Tecido ósseo: osso esponjoso /
fibras colágenas
Materiais biológicos podem apresentar:
Birrefringência dependendo do grau de agregação de cristalinidade
A observação e a medida das propriedades anisotrópicas (dicroísmo e
birrefringência)
Importantes para:
a) Diagnóstico de patologias
b) Estabelecimento ordem molecular
Fases da vida celular
Microscopia de Campo Escuro
Os microscópios de campo
escuro apresentam um tipo especial
de condensador - inclina a luz de
tal modo que ela não atravessa o
objeto
A luz se dispersa
Apenas os feixes desviados pelo
objeto percorrem o resto do sistema
(objetivas e oculares)
Aplicações da Microscopia de Campo Escuro
É empregada para estudos de pequenos
materiais:
Plâncton
Bactérias
Cristais
Estruturas subcelulares
(fimbrias e flagelos)
plâncton
Grãos de pólen
Microscopia de campo escuro
da bactéria Leptospira spp
fimbrias
Microscopia de Fluorescência
Propriedade física de
algumas substâncias
absorverem a luz, em um
determinado
comprimento de onda, e
emitirem luz com
comprimentos de onda
maiores e níveis
energéticos mais baixos
Microscopia de fluorescência
mostrando uma célula embrionária de
Caenorhabditis elegans em divisão
Fluorescência natural:
Existem componentes celulares ou moleculares naturalmente
fluorescentes
Clorofila
Lignina de parede vegetal
Elastina
Colágeno
A fluorescência visível neste nudibranqueo é
dupla: os pigmentos verdes próprios da lesma
e as algas vermelhas no seu intestino
Algas (clorofila)
Outros componentes:
Se ligam a substâncias fluorescentes → fluorocromos → emitem
brilho contra fundo escuro
DNA - verde
Divisão celular
Alaranjado de acridina
(fluorocromo)
RNA - vermelho
Células meióticas do
testículo de triatomíneos
(barbeiro)
Microscopia de Fluorescência
1. Sistema óptico interage com pouca luz:
Luz de mercúrio de alta pressão
2. Sistemas de filtros requeridos para detectar o brilho do material
contra o fundo negro (a. Filtro de excitação; b. Filtro de barragem)
Fonte de luz → Fótons →
Filtro de excitação (seleciona
os fótons de determinado
comprimento) → Objeto →
Emite luz fluorescente →
Filtro de barragem (luz de
excitação é bloqueada) →
Imagem observada (formada
pela luz que atravessa o
filtro de barragem)
Ocular
b. Filtro de barragem
Fonte
de luz
a. Filtro de excitação
Objetiva
Microscopia de Fluorescência
Aplicações da Microscopia de Fluorescência
Devido a especificidade de cada tipo de filtro e devido ao
desenvolvimento de vários corantes (fluorocromos) →
muitas são as utilizações da microscopia e fluorescência
Fluorocromos:
Alaranjado de acridina
Eosina
DAPI
Rodamina
Fluoresceina
Emitem brilho contra
fundo escuro
Aplicações da Microscopia de Fluorescência
Identificação de compostos naturalmente fluorescentes
Quantificação (Fluorometria): citoquímica normal e patológica
Imunofluorescência: conjugação de anticorpos a fluorocomos
que permite identificação de moléculas específicas
Imunocitoquímica
Hibridação “in situ” (FISH)
Aplicações da Microscopia de Fluorescência
Princípios da formação da imagem ao Microscópio
Sem
coloração
Diferenças
de índices
de refração
Com
coloração
Cores de
interferência
Com coloração
fluorescente
Campo
escuro
Células da mucosa oral
Microscopia confocal a laser
1987 - Disponível mundialmente
O microscópio confocal tem seu
funcionamento baseado nos princípios da
microscopia de fluorescência → Utiliza laser
como fonte de luz
Permite a visualização: materiais
espessos; corpos inteiros sem coloração
prévia (vivos ou pré-fixados)
Reconstrução
do
objeto
tridimensionalmente → Vários planos
focais ou cortes ópticos (programas
computacionais)
Aplicações da Microscopia confocal a laser
1. Todas as possibilidades já descritas para a microscopia de
fluorescência convencional
2. Reconstrução 3-D de organismos microscópicos
3. Aumento de sinais de fluorescência de estruturas subcelulares. Exs:
microtúbulos, miofilamentos, filamentos intermediários e elementos
finos da matriz extracelular
Aplicações da Microscopia confocal a laser
Células em prófase
Células em apoptose:
condrócitos
Aplicações da Microscopia confocal a laser
Protozoário
Macrófago
Aplicações da Microscopia confocal a laser
Divisão celular / Fuso mitótico
Grãos de Pólen
Microscopia eletrônica
Início:
Estudos do comportamento ondulatório dos elétrons
Semelhantes a fótons
num sistema de vácuo
Primeiros experimentos:
Década de 1920 → Busch
(elétrons conduzidos por lentes eletromagnéticas)
1931 → Ruska → Primeiro M.E. → Poder de
resolução: 0,5 nm → 25 mil vezes a capacidade do
olho humano
Ernst August
Friedrich Ruska
(1906-1988)
Principais
diferenças
Microscópio de luz (ML)
Microscópio eletrônico
de transmissão (MET)
Fonte
Luz
(porção inferior)
Elétrons
(porção superior)
Lentes
Vidro
Eletromagnéticas
Lentes de aumento
(principal)
Objetivas e oculares
Eletromagnéticas
Suporte para
amostra
Lâmina de vidro
Grade de metal
(telinha)Cobre ou níquel
Limite de
resolução
0,2 µ
0,0002 µ
Formação da
imagem
Transparência e coloração
Variações de densidade e
contrastação
Microscopia eletrônica
Microscopia de Luz
e
Microscopia Eletrônica
Questões importantes: Ampliação e Resolução
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e
de Varredura (MEV)
O avanço da microscopia eletrônica se deu a partir da descoberta de que
os elétrons tinham comportamento ondulatório semelhante aos fótons de
luz
Microscópio Eletrônico de
Transmissão (MET)
Microscópio Eletrônico de
Varredura (MEV)
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Microscópio eletrônico
de transmissão (MET)
Microscópio eletrônico
de varredura(MEV)
Formação da imagem ao Microscópio eletrônico:
Fonte de elétrons → Caminha por um sistema de lentes eletromagnéticas
(coluna) → Feixe de elétrons → Acelerados → Lente condensadora →
Amostra → Lentes objetivas (primeira imagem aumentada da amostra) →
Lentes intermediarias / projetivas (formação final da imagem) → Imagem
ampliada → Anteparo fluorescente / monitor
Imagem final ao MET
Eletrodensa (escura) → os elétrons encontram elementos como: ferro,
ósmio, chumbo, ouro etc
Eletrolúcida (clara) → os elétrons encontram elementos como:
hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio etc
Observação:
Contrastação do material biológico (maioria eletrolúcidos):
metais pesados
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Coloração negativa:
vírus
Tecido muscular
Células epiteliais
Cílio
Hepátócito:
Complexo de Golgi
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Scanning Electron Microscopy (SEM)
Revela feições topográficas da superfície (detalhes)
Imagens tridimensionais:
- Vermes
- Insetos
- Células livres (animais/vegetais)
- Embriões
- Fragmentos geológicos
Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra
Guelras de
um peixe
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Preparação das amostras
Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio)
Desidratação
Secagem (“ponto crítico”)
Evaporação com ouro na
superfície a ser analisada
Não necessita de contrastação
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Title: “An Army of One"
Category: Photo Microscopy
Photographer: Freder Medina
Microscopia Eletrônica de Alta Voltagem ou Alta Aceleração
Descrição de estruturas subcelulares (µ)
Ex.: Citoesqueleto
Aparelho grande: equivalente a um edifício de três andares
- Alta aceleração eletrônica (500 a 1.000 KV)
- Permite estudos de corte grossos
- Reconstrução tridimensional
Microscopia de Tunelamento Quântico
Década de 1980
Potência visual do olho humano:
1 milhão de vezes (100x a capacidade do MET) = Estrutura atômica
Benning / Rohrer (1986): Prêmio Nobel de Física
Princípio: todos os corpos:
- Características ondulatórias
- Emissão de energia
Microscopia de Tunelamento Quântico
Agulha que dista da superfície da amostra em 1Å (1 milionésimo de mm)
Agulha: percorre a superfície da amostra → corrente elétrica (tunelamento)
Corrente atrai elétrons do material para a agulha → “tunel”
Agulha passa sobre um átomo → corrente ↑
Agulha percorre os espaços entre os átomos → corrente ↓
Esses sinais (↑ e ↓) são transmitidos para o computador → imagens ≈ à
superfície de vales e montanhas
Microscopia de Tunelamento Quântico
Molécula de miosina
Cromossomos
1 milhão de Vezes (100x a capacidade do MET)
=
ESTRUTURA ATÔMICA
Microscopia de Força Atômica
É semelhante ao Microscópio de Tunelamento Quântico
Diferença:
- Presença de microespelho
- Feixe de “laser” sobre a agulha
Menor agressividade à amostra
Detecção de detalhes de superfície
Aplicações:
- Obtenção de imagens em solução
- Sequências de reações químicas ou modificações estruturais ao
longo do tempo
- Estrutura atômica de biomoléculas
Microscopia de Força Atômica
Imagem de uma plaqueta
obtida por microscopia de
força atómica
Imagem de eritrócitos
obtida por microscopia
de força atómica
Brasileiro ganha prêmio internacional para imagens de
microscopia de força atômica
Luciano Paulino da Silva, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, conquistou o segundo lugar na primeira edição do Prêmio
Internacional de Imagens de Microscopia de Força Atômica.
A imagem de autoria do
pesquisador da Embrapa,
que mostra a superfície das
células vermelhas do sangue
depois do tratamento com
peptídeos antibióticos, foi a
única imagem não européia
premiada dentre as mais de
250 inscritas. O prêmio visa
o
reconhecimento
da
importância das imagens de
microscopia para os avanços
da nanotecnologia em todo
o mundo.
Reportagem publicada no dia 10/09/2007
Scanning electron Microscopy – imagem representa um
único cristal de Wurtzite indium nitride (InN) sintetizado
Title: “Formosa Nano-Rose"
Photographer: Dr. Kuei-Hsien Chen
Vencedor do “Science as Art Contest” de 2008
Fim
Planos de cortes
Planos de cortes
Imagem microscópio = bidimensional
Objeto de estudo = tridimensional