Efeitos da Terapia LED de Baixa Potência em Tendinite do Tendão

UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
MÁRCIO PARENTE
Análise do efeito do LED (Light Emitting Diode) de 640nm no
modelo experimental de tendinopatia traumática em ratos
desnutridos.
SÃO PAULO, SP
2012
1
MÁRCIO PARENTE
Análise do efeito do LED (Light Emitting Diode) de 640 nm no
modelo experimental de tendinopatia traumática em ratos
desnutridos.
Dissertação
apresentada
à
Universidade Nove de Julho, para
obtenção do Titulo de Mestre em
Ciências da Reabilitação.
Orientador:
Prof.
Albertini de Carvalho
Dra.
Regiane
2
FICHA CATALOGRÁFICA
Parente, Márcio.
“Análise do efeito do LED (Light Emitting Diode) de 640 nm no modelo
experimental de tendinopatia traumática em ratos desnutridos”. / Márcio Parente.
2012.
100 f.
Dissertação (mestrado) – Universidade Nove de Julho - UNINOVE, São Paulo,
2012. Prof. Dra. Regiane Albertini de Carvalho.
1. Inflamação. 2. Colágeno. 3. LED. 4. Tendinite 5. Citocinas.
I. Carvalho, Regiane Albertini de.
II. Titulo
CDU 615.8
3
4
DEDICATÓRIA
“Mantenha o foco e o alvo de sua vida em Jesus Cristo, pois, este é o melhor e
mais fascinante projeto de vida que se pode ter” (Orlando Bispo de Souza).
As pessoas a quem eu vou dedicar essa obra são: Minha Esposa Zuleide,
companheira, auxiliadora, guerreira, amorosa, são tantas as qualidades, que essa
página não daria expressar todos os meus sentimentos, meus filhos, Gabriel presente
de Deus, garoto que me faz esquecer os problemas, motivo de eu sempre lutar e
conquistar meus objetivos, Samuel mais um varão que Deus me abençoou ainda está
no 7 mês de gestação e creio que virá a este mundo para trazer alegria e louvar a
Cristo; ao Meu Pastor Márcio Fernandes e a Igreja Evangélica Congregacional de
Pedro José Nunes pela paciência e amor dos irmãos em Cristo por mim e pela minha
família.
Ao meu pai Marco um grande profissional de quem sempre me orgulhei,
quantas foram as correções pois sem isso não chegaria a esse patamar. Pai te amo;
mãe talvez faltem palavras para te agradecer o quanto você e especial para mim,
minha mãe Célia que Deus te abençoe, aos meus irmãos Felipe e Adriano pai do meu
sobrinho Kawan por toda a compreensão e amizade, tempos bons quando éramos
crianças, sinto falta dos momentos das alegrias e tristezas que compartilhávamos
juntos pois agora a correria da vida nos distanciou, creio que teremos estes momentos
novamente. Luciana minha irmã, mãe do meu sobrinho Leonardo, tu ès guerreira e
vitoriosa.
Além desses não posso esquecer-me da minha sogra Dulce, pelo pouco que
convivi com ela pude aprender o significado da vida, a entender momentos de alegria
e de tristezas e nestes momentos aprendi que o amor é quem supera as dificuldades.
Dulce minha memórias vão além dessas palavras que Deus a tenha, sentimos
saudades.
Aos meus amigos Edson, Lindiano, Luciano, João Sardinha, Marcelo de Paula,
Adriano Maria, Carlos Cale, Agnelo, Camila, Nadia, Felipe, Andréa, Patrícia, Eduardo,
Alexandre, Douglas, Mariana, Aliny, Juliana, Bianca, Carolina, Michel, Guilherme,
Janete, Priscila, Torres, Ana, Evela, Dora, Fernando.
A todos vocês dedico este projeto!
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me guardar e direcionar nos momentos vivenciados em minha
vida.
Minha Esposa Zuleide pela paciência, compreensão e dedicação, pois os
momentos de ausência foram muitos com minha família.
Aos meus irmãos Congregacionais pelo apoio e ensinamento da Palavra de
Deus.
A minha Orientadora Professora Doutora Regiane Albertini de Carvalho, pelo
respeito, ensino, paciência, compromisso e confiança. Agradeço-te por todos
os momentos em que me orientou, pela pessoa incrível e dedicada que Deus
continue abençoando você e sua família.
Aos meus Professores Paulo de Tarso Camillo de Carvalho, Rodrigo Álvaro
Brandão Lopes Martins e Rodolfo de Paula Vieira. Ao longo dessa
caminhada foram tantos os problemas, mas graças a Deus sempre que
precisei vocês foram atenciosos e presentes para me ajudar. Obrigado!
Aos Professores colaboradores; Andreia Bonsi, José Antonio, Rodrigo Labat,
Ernesto Cesar, Daniele de Fátima, Ana Paula, Raquel Mesquita, Stela Regina,
Sandra Kalil, Kristianne Porta, Cristiane França, Andrey Serra e Kátia De
Angeli.
Aos funcionários do departamento de Pesquisa da Pós-Graduação da
UNINOVE; João Felipe Sardinha Leonardo e Alexandre Santos na
Universidade Nove de Julho e aos funcionários do Laboratório de Investigação
Médica 59 (LIM59); Nilsa Regina Damaceno-Rodrigues e Iris Amorim por
todo o auxilio.
A todos os alunos de Iniciação Científica (IC) que participaram desse projeto
em especial Douglas Rodrigues da Silva, Mariana de Souza Vasconcellos,
Nilce Tamae, Aliny Borges Orle, Juliana Salles, Márcia Tomoya, Anna Cristina,
Evela Aparecida e Bárbara Malachias.
6
RESUMO
O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da LED no processo de
reparação da tendinite do calcâneo em ratos desnutridos. A desnutrição foi
induzida nos animais por uma ração com baixo teor de proteína (6% proteína).
A tendinite foi induzida no tendão calcâneo da pata esquerda por meio de
trauma. Foram utilizados 120 ratos, sendo 60 animais desnutridos (160 ± 20g)
e 60 animais nutridos (300 ± 20g) distribuídos em 8 grupos (n=15/grupo), 4
grupos para animais nutridos CONTNUTRI (controle), TENNUTR (lesão),
LEDNUTR (lesão + LED) e DROGNUTR (lesão + Fármaco), e 4 grupos para
animais desnutridos CONTDESN (controle), TENDESN (lesão), LEDDESN
(lesão + LED) e DROGDESN (lesão + Fármaco), cada grupo conteve três
subgrupos com 3 períodos experimentais (7, 14 e 21 dias). Os grupos definidos
como DROG receberam tratamento com diclofenaco de sódio 1mg/Kg/dia/IP.
Foram realizadas análises histopatológicas para células inflamatórias, teor de
colágeno e imunohistoquímica para TNF-β e IL1-β. Os grupos tratados com
LED apresentaram diminuição nas células inflamatórias, colágeno do tipo III e
IL 1-β e aumento no colágeno do tipo I e TGF-β. Assim conclui-se que a LED
de baixa intensidade, nos parâmetros estudados tem efeito reparador em
processo de tendinopatia (tendinite) traumática.
Palavras-chave: Inflamação, Desnutrição, Tendinite, Colágeno, Citocínas.
7
ABSTRACT
The aim of this study was to investigate the LED effects in the repair process of
the calcaneal tendinitis in malnourished rats. The malnourished was induced by
diets for low protein (6% protein) in animals fed normal chow consumed (22%
protein). Calcaneal tendinitis was induced in the left paw through trauma. A total
of 120 rats, 60 malnourished animals (160 ± 20g) and 60 fed animals (300 ±
20g) distributed in 8 groups (n = 15 per group), 4 groups for CONTNUTRI
nourished animals (control), TENNUTR (injury) LEDNUTR (lesion + LED) and
DROGNUTR (lesion + Drug), and 4 groups for CONTDESN malnourished
animals (control), TENDESN (injury), LEDDESN (lesion + LED) and
DROGDESN (lesion + Drug), each group contained three subgroups 3
experimental periods (7, 14 and 21 days). The groups defined as Drog received
treatment with diclofenac sodium 1mg/Kg/day/IP. Histopathological analyzes
were
performed
for
inflammatory
cells,
collagen
content
and
immunohistochemistry for TGF-β and IL-1-β. For the treated LED groups there
was a decrease in the inflammatory cells, type III collagen and IL 1-β, increased
type I collagen and TGF-β. Thus, it is concluded that the low-intensity LED in
the studied parameters has an effect on repair process tendinopathy
(tendonitis).traumatic.
Keywords: Inflammation, malnutrition, Tendinitis, Collagen, cytokines.
8
Sumário
Dedicatória
4
Agradecimentos
5
Resumo
6
Abstract
7
Sumário
8
Lista de quadros e tabelas
10
Lista de figuras
11
Lista de abreviaturas
11
1. Contextualização
14
1.1
Desnutrição
14
1.2
Tendinopatia
15
1.3
Anatomia do tendão e colágeno
16
1.4
Reparo do tendão
16
1.5
Citocinas no processo inflamatório
18
1.5.1 Interleucina1 Beta (IL1-β)
20
1.5.2 Fator de transformação do crescimento Beta (TGF–β)
21
1.6 Justificativa
23
1.7 LED (Light Emitting Diode) fototerapia de baixa potência
24
2. Objetivo geral
29
2.1 Objetivos específicos
3. Material e métodos
3.1 Protocolo de desnutrição
3.1.1 Dieta para desnutrição
29
29
29
30
3.2 Protocolo para induzir a tendinite
32
3.3 Grupos e Experimentais “in vivo”
32
3.4 Terapias/Tratamento - LED e Fármaco
32
3.5 Eutanásia e coletas das amostras
34
3.6 Processamento das amostras
35
3.6.1 Protocolo para coloração com Hematoxilina e Eosina 36
3.6.2 Coloração com picrossírius red
36
3.6.3 Imunohistoquímica
36
9
3.7 Coleta das imagens e análise
38
3.8 Análise estatística
41
4. Resultados (artigos)
42
5. Considerações finais
88
6. Referências
89
10
Lista de quadros e tabelas
Tabela 1 – Componentes utilizados para formulação da ração hipoprotéica,
comparada as normas para adequação da AIN-93G.
Pag. 30
Tabela 2: Parâmetros do LED (Light Emitting Diode). A densidade de energia
E
P.t
(DE) é dada por DE
ou DE
, cuja unidade é [J/cm2], onde E é a
A
A
energia [Joule], A é a área [cm2], P é a potência [Watt] e t é o tempo
[segundos].
Pag. 33
Tabela 3: Anticorpos utilizados para análise imunohistoquímica
Pag. 37
11
Lista de figuras
FIGURA 1 – Estrutura do tendão, tanto a imagem (a) e (b) demonstram
minuciosamente anatomia do tendão da parte externa até parte interna;
Epitendão e/ou Paratendão (feixe de fibras terciárias), endotendão (feixe de
fibras secundárias (fascículo)), endotendão (feixe de fibras primárias
(subfascículo)), fibras colágenas e fibrilas colágenas.
Pag. 16
FIGURA 2 – Ação das citocinas pode ser local ou sistêmica. Autócrina (ação
sobre a própria célula), parácrina (ação sobre células próximas) e Endócrina
(ação sobre células distantes) Goldsby et al. (2002).
Pag. 19
FIGURA 3 – O TGF-beta ao se ligar ao seu receptor provoca uma cascata de
reações provocando a síntese de proteínas.
Pag. 22
FIGURA 4 – Diversos estudos com a fototerapia de baixa potência.
Pag. 27
FIGURA 5 - Da gestação até eutanásia dos animais foram seis etapas, na 1ª
etapa o período de 21 dias de gestação, a 2ª etapa após o nascimento dos
animais os mesmo tiveram um período de 28 dias para amamentação
(lactação), a 3ª etapa foi induzido à desnutrição, os animais consumiram ração
hipoproteica por um período de no mínimo 32 dias na 4ª etapa foi induzida à
lesão traumática nos animais, nesse período os animais continuaram a receber
ração hipoproteica até o período da eutanásia, na 5ª etapa foi determinado os
períodos experimentais (7, 14 e 21 dias) de tratamento e por último a 6a etapa
que representa eutanásia referente a cada período experimental, os animais
foram eutanasiados sempre após 24hs da última terapia/tratamento). Pag. 30
FIGURA 6 – Aparelho utilizado para induzir a lesão no tendão calcâneo da pata
esquerda dos animais, na imagem (a) demonstra aparelho em descanso,
enquanto imagem (b) demonstra o aparelho com sua massa de 220g a 25cm
do ponto de partida.
Pag. 31
FIGURA 7 – Desenho experimental dos grupos, cada grupo com três
subgrupos totalizando 15 animais
Pag. 32
FIGURA 8 – Aparelho do LED de 640nm utilizado no experimento.
Pag. 34
FIGURA 9 – Retirada do tendão, tenotomia realizada na junção miotendinosa e
ostiotendinosa.
Pag. 35
FIGURA 10 – Software (Image-Pro Plus) utilizado para fotografar as imagens
das laminas em HE e quantificar antígeno para citocinas IL 1 Beta e TGF Beta.
O resultado utilizado para imunohistoquimica foi emitido em estatística
expresso em somatória (Sum) conforme representado na figura.
Pag. 39
FIGURA 11 – Software utilizado para caputurar imagens das lâminas de
imunohistoquimica.
Pag. 39
12
FIGURA 12 – Software (Image J) na função Cell Counter, foi utilizado para
contagem de células inflamatórias e fibroblastos.
Pag. 40
FIGURA 13 – Software (Image J) na função Color Histogram foi utilizado para
quantificar colágeno.
Pag. 40
13
Lista de Abreviaturas
C: Celsius
cm: Centímetro
CONTDESN: Controle desnutrido
CONTNUTRI: Controle nutrido
COX: ciclooxigenase
DROGDESN: Droga (fármaco) desnutrido
DROGNUTR: Droga (fármaco) nutrido
g: grama
H2O: água
HE: Hematoxilina Eosina
Hs: horas
IL1-β: Interleucina1-Beta
IP: Intraperitoneal
J: Joule
Kg: quilo grama
LASER: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
LED: Light Emitting Diode
LEDDESN: Light Emitting Diode desnutrido
LEDNUTR: Light Emitting Diode nutrido
mg: miligrama
mm: milímetro
mW: miliwatt
n: número
nm: nanômetro
pH: peróxido de hidrogênio
RNAm: ácido ribonucléico mensageiro
TENDESN: Tendinite desnutrido
TENNUTR: Tendinite nutrido
TGF-β: Fator de transformação de crescimento Beta
14
1. Contextualização.
1.1 – Desnutrição.
A desnutrição é considerada um problema social e de saúde pública,
devido a sua natureza multicausal. Ocorre quando o organismo não recebe os
nutrientes necessários para o seu metabolismo fisiológico, devido à falta de
alimentos ou problema na absorção, podendo também estar relacionada com
algumas doenças ou às vezes deriva de fatores desconhecidos. Por esse
motivo a desnutrição pode ser observada no contexto familiar, cultural e
socioeconômico, afetando o estilo de vida da criança Frota et al. (2007).
O principal determinante do estado nutricional é a renda per capita, pois
se houver um declínio no crescimento econômico e uma maior taxa de
desemprego, a população irá piorar nutricionalmente Frota et al. (2007). Está
bem estabelecido que a desnutrição em crianças têm efeitos adversos para o
desenvolvimento, ocasionando doenças crônicos degenerativas, redução de
números de células em alguns órgãos, hipertensão Barker et al. (1990),
deficiências na manutenção, reparação tecidual, processo inflamatório e
funções imunológicas Carvalho et al. (2006), doenças coronarianas Barker et
al. (1993), diabetes tipo I e doenças renais Nakamura et al. (2007),
esquizofrenia e aumento de doenças cardiovasculares Susse et al. (2008) e
afeta também as funções fisiológicas e as alterações nas capacidades
metabólicas
musculares.
Estes
alterações
ocorrem
por
ausência
de
aminoácidos, carboidratos, lipídios, sais minerais e vitaminas na dieta, pois
estes são essenciais para diversas sínteses em nosso organismo. Toscano et
al. (2010) e Chaves et al (2003).
Outro ponto importante a se considerar é que atletas e praticantes de
atividade física em quadro de desnutrição estão mais suscetíveis as lesões
constantes, a falta de nutrientes essenciais no organismo deixa o mesmo
vulnerável a qualquer atividade de leve impacto e consumo de energia Chaves
& Mello (2003) e Alves & Mello (2005).
Estudos sobre a desnutrição em ratos apresentam menor peso e
tamanho comparado aos animais normo peso Hegsted & Chang (1967). No
15
estudo de Dobbing (1976) os animais desnutridos apresentaram crises
convulsivas. Em outro estudo quando os animais foram expostos ao quadro de
desnutrição os mesmos apresentaram dificuldade de cicatrização em diversos
tecidos Ferreira (2006).
Segundo Buker & Tsaris (1974) e Carvalho et al. (2006) em seus
respectivos estudos apresentaram redução no numero de fibras colágenas,
além de retardamento na diferenciação das características morfológicas e
processo degenerativo em tecidos.
1.2 – Tendinopatia
A tendinopatia refere-se a qualquer processo mórbido e/ou doença que
afete os tendões. Na literatura encontramos os termos tendinose e tendinite,
estes formam a tendinopatia, sendo que a tendinose se refere aos processos
degenerativos (destrutivos) crônicos progressivos e a tendinite refere-se a
processos inflamatórios (que, por definição, incluem os cinco sinais e sintomas
de inflamação – tumor (inchaço), calor (quente), rubor (vermelho pela dilatação
dos vasos na zona inflamada), dor e impotência funcional) Khan et al. (2000).
A tendinopatia pode ocorrer por traumatismo, excesso por repetições de
movimentos, infecções e desnutrição, estas ocorrências desencadeiam todo
um processo de degeneração, inflamação e até os rompimentos dos tendões.
Dentro destas ocorrências a desnutrição pode ser apontada como importante
causador da tendinopatia, pois impede a manutenção e uma perfeita
regeneração dos tendões, pois é relevante considerar que uma dieta com
ausência de diversos nutrientes essenciais vem a prejudicar a síntese de novas
células e tração (resistência) para uma determinada função Carvalho (2006).
1.3 – Anatomia do tendão e colágeno
Os tendões normais são brancos, brilhantes e possuem uma textura
fibroelástica, são ricos em colágeno do tipo I e menores presença de colágeno
do tipo III, IV,V e VI. Segundo Junqueira e Carneiro (2004) o colágeno é a
16
principal proteína estrutural do corpo e o maior componente da matriz
extracelular do tendão. Os tendões são formados por tecido conjuntivo, fibras
de colágeno que se entrelaçam para permitir as forças geradas pelos
músculos. O colágeno é muito estudado, na literatura é apresentado tipos de
protocolos para verificar o tipo de colágeno, por exemplo, alguns autores
determinaram que o colágeno do tipo I em coloração por Picrossirius Red para
diferenciar o colágeno I do colágeno III Montes & Junqueira (1992).
FIGURA 1 – Estrutura do tendão, tanto a imagem (a) e (b) demonstram minuciosamente
anatomia do tendão da parte externa até parte interna; Epitendão e/ou Paratendão (feixe de
fibras terciárias), endotendão (feixe de fibras secundárias (fascículo)), endotendão (feixe de
fibras primárias (subfascículo)), fibras colágenas e fibrilas colágenas.
Fontes: (a)http://skillbuilders.patientsites.com/mobile/Injuries-Conditions/Ankle/AnkleAnatomy/a~47/article.html (b)http://www.pponline.co.uk/encyc/achilles-tendon-muscle-structureand-injury-rehabilitation-40869. (acesso ao site dia18/12/2012)
1.4 - Reparo do Tendão.
Segundo Chan et al. (1997) o processo de reparo dos tendões é similar
aos processos de reparação que ocorrem com outros tecidos biológicos. Na
ocorrência de um trauma ou lesão no tendão, ocorre às respostas para
reparação
tecidual,
sendo
que
no
estágio
agudo
observa-se
uma
vasoconstrição e instantes depois, ocorre vasodilatação. Essas respostas
atraem células inflamatórias para o local lesionado, estas células são:
17
leucócitos, plaquetas e eritrócitos, a função das células é provocar uma
diminuição do extravasamento de sangue no local. A histamina presente altera
a permeabilidade vascular, essa alteração provoca formação do edema local
Baxter (1994). Fatores de crescimento e citocinas estimulam a migração e
proliferação
dos
fibroblastos,
parcialmente
derivadas
dos
macrófagos
inflamatórios. Segundo Contran, Kumar e Collins (2000) descrevem a formação
do tecido de granulação, os fibroblastos adquirem características estruturais,
funcionais, imunológicas e químicas diferentes dos tecidos fibroblásticos
normais sendo chamados de miofibroblastos.
A regeneração ou renovação dos tendões são praticamente estável, por
ser um tecido pouco vascularizado esta regeneração acaba sendo prejudicado,
em alguns órgãos o processo é um pouco mais rápido. As renovações neste
tecido são iniciadas pela degradação de proteínas por enzimas específicas, as
colagenases. As funções destas enzimas é catabolizar as moléculas em dois
pedaços, assim serão capazes de receber ao ataque de proteases não
específicas Junqueira e Carneiro (2004). Uma arquitetura de um tendão após
sua regeneração poderá ser normal, porém, dificilmente retornará às suas
propriedades mecânicas originais de deslizamento sobre os tecidos vizinhos
Machado (2000).
Uma das modificações bioquímicas da cadeia polipeptídica que ocorre
no organismo é a síntese de colágeno, estas modificações pode ocorrer
alguma falha durante o processo de reparo, as enzimas não trabalham
conforme suas funções assim podendo alterar o processo patológico, por
exemplo, a lenta renovação de colágeno são uma das conseqüências. Jaques
et al. (2006).
Simões et al. (1996), argumentam que o elemento fundamental para o
sucesso da reparação de uma ferida é a organização das fibras de colágeno e
não a quantidade das fibras na lesão. Ressalta-se também a importância dos
primeiros dias para a qualidade do processo de regeneração do tecido
tendinoso, momento em que se ocorrem a proliferação e remodelamento, onde
ocorre o processo de síntese de fibras de colágeno e alinhamento das mesmas
no eixo longitudinal do tendão Dong (2006).
18
Perez et al. (2005), afirmam que a produção de colágeno e regeneração
do tendão é possível avaliar por concentração de hidroxiprolina, pois em
estudos realizados por Reddy e Enwemeka (1996), observou-se que houve
aumento de 14% da síntese de colágeno com a presença de hidroxiprolina.
Diversos fatores como a limitada vascularização, provoca uma
diminuição da oferta nutricional e de oxigênio, isso atrasa a capacidade
regenerativa. Já é demonstrado que quando este tecido é estimulado por meios
biofísicos, o processo de regeneração se dá de forma satisfatória Enwemeka
(1989).
Para uma boa reabilitação funcional do individuo na região calcânea,
uma vasta literatura visa o desenvolvimento de técnicas para tratamento a fim
de melhorar o processo de reparação tendínea. Dessa forma, estudos na área
da engenharia biomédica estão sendo realizados para o desenvolvimento de
equipamentos e técnicas terapêuticas. O ultra-som, eletroterapia, LASER e
recentemente o LED de baixa potência são os mais estudados para
regeneração tecidual.
1.5 Citocinas no processo inflamatório
As ações das citocinas podem ser locais ou sistêmicas. As citocinas
podem agir de três formas, ação autócrina (ação sobre o tipo celular que a
produz), ação parácrina (ação sobre células presentes nas proximidades das
células produtoras da citocina), ação endócrina (agindo sobre células
presentes em outros locais que não os da célula produtora daquela citocina).
(fig.1) As citocinas são proteínas reguladoras de baixo peso molecular ou
glicoproteínas secretadas pelas células sanguíneas brancas e varias outras
células no organismo em resposta a inúmeros estímulos. Os diferentes
estímulos, como agentes infecciosos, tumores, traumas (lesões) ou estresse.
As citocinas atuam na comunicação entre as células, promovendo a indução ou
regulação da resposta imune. Embora diversos tipos celulares possam secretar
citocinas, células T, macrófagos e células dendríticas são as principais fontes
produtoras de citocinas Ansel et al. (2003) e Dong et al (2006).
19
Uma mesma citocina pode ser produzida por mais de um tipo celular,
pode ter diferentes efeitos, dependendo das condições do microambiente
(pleiotropismo), podem exercer a mesma função (redundância), podem
potencializar ou inibir o efeito de outras citocinas (sinergismo ou antagonismo).
A citocinas se liga aos receptores específicos das membranas das
células alvo, degradando as vias de transdução de sinais que, como resultado,
altera a expressão dos genes das células alvo. A suscetibilidade da célula alvo
a uma determinada citocina é determinada pela presença de receptores de
membrana específicos. Em geral, as citocinas e seus receptores exibem alta
afinidade uma para com a outra, com constantes de dissociação variando de
10-10 a 10-12M. por causa desta alta afinidade, as concentrações das citocinas
podem mediar um efeito biológico. Uma determinada citocina pode se ligar aos
receptores na membrana da mesma célula que a secretou, exercendo ação
autócrina; as citocinas podem-se ligar aos receptores em uma célula alvo nas
proximidades da célula produtora, exercendo uma ação parácrina; em poucos
casos, a citocina pode se ligaras células alvo em locais distantes do corpo,
exercendo uma ação endócrina. As citocinas regulam a intensidade e a
duração da resposta imune através da estimulação ou da inibição da ativação,
proliferação e/ou diferenciação de várias células e através da regulação da
secreção dos anticorpos ou de outras citocinas. (Goldsby, 2002).
20
FIGURA 2 – Ação das citocinas pode ser local ou sistêmica. Autócrina (ação
sobre a própria célula), parácrina (ação sobre células próximas) e Endócrina
(ação sobre células distantes) Goldsby et al. (2002).
1.5.1 Interleucina1-Beta (IL1-β)
A IL1-β é secretada por monócitos, macrófagos, células B, células
dendríticas, células endoteliais e outros tipos celulares as células ou tecido alvo
são células TH e células B com sua atividade de ativação coetimuladora e
promover a maturação e a expansão clonal (Goldsby, 2002). A função principal
das IL1-β, é ser mediadora da resposta inflamatória do hospedeiro em traumas,
infecções e outros estímulos inflamatórios. Quando secretada em baixa
concentração, IL1-β atua como um mediador da inflamação local, ela age na
célula endotelial para aumentar a expressão de moléculas de superfície que
medeiam a adesão de leucócitos, tais como ligantes de integrina. Já em altas
concentrações, a IL1-β entra na corrente sanguínea e exerce efeitos
endócrinos causando febre, induzir a síntese de proteínas plasmáticas da fase
aguda pelo fígado e iniciar o desgaste metabólico (caquexia). Na inflamação
articular, as células sinoviais produzem grande quantidade de citocinas,
particularmente citocinas antiinflamatórias como, por exemplo, a IL1-β
Braddock e Quinn (2004). De fato, Xavier et al. (2011) demonstraram que
citocinas como IL1-β é capaz de comprometer a integridade da de tendões em
processos inflamatórios crônicos.
Durante
o
processo
inflamatório, o
metabolismo das células que constituem o tecido lesado sofre importantes
alterações.
A
expressão
de
enzimas
e
a
síntese
de
mediadores
antiinflamatórios se apresentam exacerbadas durante o processo inflamatório
Aigner et al. (1994) e Xavier et al. (2011).
Os efeitos da IL1-β podem ser inibidos in vitro e in vivo através de
inibidores naturais tais como, antagonistas do receptor de IL1-β e receptores
solúveis. Esse tipo de receptor pertence à família dos receptores de citocinas
que não induzem resposta intracelular Fong et al. (1990). Esses mesmos
autores demonstraram que os inibidores de IL1-β são eficazes no tratamento
dos sintomas da inflamação crônica. Além disso, esses resultados corroboram
com aqueles encontrados em pacientes acometidos por doença reumática.
21
Tomados em conjunto, os resultados descritos sugerem fortemente o
envolvimento da IL1-β no desenvolvimento e manutenção do processo
inflamatório, e por isso, o estudo do mecanismo de ação de terapias anti IL1-β
deve ser explorado.
1.5.2 Fator de transformação do crescimento Beta (TGF–β)
Quando instalado a lesão no tendão um quadro de tendinopatia é
iniciado. Nestes casos, a tendinite pode apresentar características de doença
crônica. A presença de células tendíneas junto à reorganização do tecido pode
indicar a presença de fatores de crescimento (TGF-β). Existem 3 isoformas de
TGF-β (b1, b2 e b3), porém seu mecanismo ainda não é bem compreendido.
As 3 isoformas em tendões de coelhos lesionados o TGF-β apresentou uma
aumento durante o processo de reparo e na cirurgia óssea, este aumento foi
percebido 56 dias após a lesão Schnabel et al. (2006).
As três isoformas de TGF-β são caracterizadas da seguinte forma, o b1
são expressos nos vasos sanguíneos e em tecido conjuntivo, na cicatriz,
quelóides e escaras Lee et al. (1999), o b2 é mais expresso em tendões e o b3
em vasos sanguíneos Gold et al. (1997).
O TGF-β é considerado um protagonista na cura de feridas
apresentando outras funções como recrutamento de fibroblastos e macrófagos.
Ele também consegue estimular a mitogenese de tenócitos, a síntese de matriz
extracelular e de colágeno I e III Schnabel et al. (2006).
Para o repara do tendão, atualmente especialistas buscam técnicas que
acelerem o reparo, o processo inflamatório, a dor e também restaurando suas
propriedades mecânicas iniciais Hou et al., (2009). Neste sentido, o TGF-β vem
se destacando pelo seu importante papel na patologia do tendão Rolf et al.,
2001; Neuwirth et al., (2006).
Segundo Chen et al., (2004) o TGF-β também pode ser usado como
terapia para promover o reparo do tendão. Terapias recentes usam injeções de
TGF-β1 no tratamento de tendinites. Foi possível observar o aumento da
expressão de pro colágeno I e III em cultura de células do epitendão e do
endotendão cultivadas separadamente.
22
A formação dos ligamentos transversais de colágeno e a remodelação
da matriz do tendão, o TGF-β é capaz de acelerar, melhorando assim, as
propriedades mecânicas do tendão. Também consegue aumentar a expressão
de colágeno tipo III, nas fases iniciais do reparo tecidual, sendo reduzido após
3 a 4 semanas da lesão, provavelmente pelo aumento da expressão de
colágeno tipo I Hou et al. (2009).
São várias as funções biológicas do fator de crescimento endotelialBeta, é secretado por plaquetas, macrófagos, linfócitos e mastócitos, as células
ou tecido alvo são monócitos, macrófagos, macrófagos ativados, células
epiteliais e endoteliais, linfóides e hematopoiéticas, células B em proliferação.
O TGF–β tem com atividade atrai quimiotaticamente, induzir a proliferação e
aumento da IL1-β e induz a mudança de classe para IgA (Goldsby, 2002).
A principal ação do TGF-β no sistema imune é inibir a proliferação e a
ativação de linfócitos e outros leucócitos. Alguns linfócitos T reguladores
produzem TGF-β, e as mesmas células podem produzir IL-10, que, assim como
TGF-β, possui atividades imunossupressoras. Inibição da proliferação e
diferenciação de linfócitos T e da ativação de macrófagos. Por meio dessas
ações, o TGF-β inibe respostas imunes e inflamatórias.
23
FIGURA 3 – O TGF-beta ao se ligar ao seu receptor provoca uma cascata de
reações
provocando
a
síntese
de
proteínas.
FONTE:
http://home.ccr.cancer.gov/inthejournals/yuspa.asp (acesso ao site dia 18/11/2012)
1.6 Justificativa
Na rotina diária da humanidade a alimentação é fator primordial,
podendo se tornar um problema de saúde pública, uma vez que o seu excesso
ou falta podem causar doenças. Assim, a desnutrição está definida como o
estado nutricional em que ocorre deficiência ou desbalanço de energia,
ausência de proteína e outros nutrientes na dieta causam alterações física,
tecidual, funcional e clínica Lochs et al. (2006). Os efeitos da desnutrição, são
vários estudos que apontam os diversos efeitos da desnutrição na vida adulta,
uma dieta hipoproteíca acarreta em diversos estresses e doenças no
organismo Amaral (2005) e Albuquerque et al. (2007).
A classe baixa, pela falta de nutrição adequada é a mais atingida, sofre
com as diversas doenças que são causadas pela falta dos nutrientes
essenciais. Esta falta de nutrientes provoca o aumento do hormônio do cortisol,
o cortisol é um hormônio catabolico e quando há um aumento deste ocorre
desgaste no organismo e os tendões são muito acometidos, especificamente
nas fibras de colágeno causando a tendinopatia. Indivíduos no quadro de
desnutrição aparentam ter dificuldade de cicatrização e baixa resistência nos
tendões Sawaya (2006).
A tendinopatia conhecida anteriormente como tendinite, uma inflamação
nos tendões, podendo ocorrer de diversas formas, como por exemplo, a má
alimentação ou dieta hipoproteíca, traumas esportivos, acidentes domésticos e
uso crônico de medicamentos Carvalho et al. (2006) e Xavier et al. (2011).
Praticantes de atividade física são os mais prejudicados, se estiverem expostos
no quadro da desnutrição, poderão sofrer, por serem expostos a atividades de
impacto e alto consumo de energia. Quando praticante de atividade física
amador se encontra no quadro de desnutrição é necessário que o mesmo tome
muito cuidado, pois em caso de lesão suas conseqüências podem ser
traumáticas, além do tratamento ser demorado por razão da baixa síntese de
24
células (cicatrização) e baixo metabolismo do sistema imunitário o tecido não
será reconstituído a 100%, tendo menos força de tração e resistência
Casalechi et al. (2009) e Monk et al. (2011). Quando uma pessoa parte para o
tratamento para restaurar o tecido lesionado no caso tendão, seja ele por
trauma, desgaste ou rompimento as indicações para o tratamento são através
de fármacos esteriodais, não esteriodais, injeções, antiinflamatórios e
glicocorticóides.
Hoje, existem evidências científicas, conforme podemos constatar na
FIGURA 2, que a fototerapia de baixa potência é uma estratégia terapêutica
para regeneração e fortalecimento nos tendões calcâneos de ratos após uma
lesão induzida. Dessa forma, observa-se que o LED pode vir a ser um
substituto para algumas terapias de baixa intensidade. Entretanto, para tal se
faz necessário ainda muito estudos para determinar dosimetria, efeito e
mecanismo de ação da terapia com LED Casalechi (2009). O desenvolvimento
desta terapia poderia contribuir nos sistemas de atenção a saúde pública,
reduzindo o processo de reabilitação de pacientes por meio de uma terapia de
baixo custo.
1.7 LED (Light Emitting Diode) fototerapia de baixa potência
São vários os métodos de tratamentos que estão sendo introduzidos
para amenizar e curar as tendinopatias (tendinite e tendinose), a literatura vem
demonstrando um aumento exacerbado de estudos referente à utilização de luz
como terapia Carvalho et al. (2006), Albertini et al. (2007) e Xavier et al. (2011).
Há bem menos tempo de estudo referente a fototerapia de baixa
potência, o LED vem demonstrando resultados positivos no processo
inflamatório tão qual comparados aos estudos com outras fototerapias. Um dos
exemplos de outro modelo da fototerapia de baixa intensidade é o LASER. A
diferença entre as terapias é que o LASER que o laser possui coerência na
emissão de luz, enquanto no LED a ausência de coerência, entretanto, a
coerência da luz do LASER não é responsável pelos efeitos da terapia, pois
esta propriedade se perde nas primeiras camadas de tecido biológico Dall et al.
2009).
25
O LED vem sendo recentemente utilizado e investigado na área
biológica e médica. Na prática fisioterapêutica a radiação LED tem sido usada
para acelerar os processos cicatriciais em estudos experimentais. A emissão
de luz é monocromática, não coerente, o que difere da luz LASER Andrade et
al. (2001). Por serem semicondutores, tendo como característica elétrica
conduzir a corrente elétrica em um único sentido apresenta grande eficiência
na conversão de energia elétrica em óptica, dissipando pouca potência
Medeiros (2001), o LED emite apenas uma pequena banda espectral Kurachi
et al. (2001) e Stahl (2000). Diversos autores relatam que a terapia com LED
em baixa intensidade geram os mesmos efeitos comparados com a LASER de
baixa intensidade Andrade et al. (2001) e Faria (2006) e Dall et al. (2009).
Segundo Karu (2000) o aumento da atividade celular, tanto em divisão
como em síntese, têm sido relacionados ao comprimento de onda do fóton e
com a dose, e não especificamente à fonte de luz. O cromóforo é responsável
pela absorção luminosa, quando ocorre a absorção de fótons por um cromóforo
um estado molecular eletronicamente excitado se estabelece, resultando na
atividade celular.
Segundo Andrade (2001) no mercado os aparelhos LED vêm
conquistando espaço, sendo cada vez mais estudados, tendo em vista a
praticidade e baixo consumo de energia e baixo custo. Existem aparelhos
alimentados com pilhas e baterias, eliminando cabos e aumentando a sua
praticidade ou com suas bases alimentadas por fonte elétrica, além disso, a
variação térmica presente nos aparelhos LED é incapaz de causar maiores
danos mesmo quando o aparelho é usado em tempos prolongados.
Vinck et al. (2003), relatam resultados positivos no processo de
regeneração em fibroblastos de aves, diminuição do número de fibroblastos e
melhora na qualidade da remodelação.
Sheiko, Shikhlyarova e Kurkina (2004), concluíram que a fototerapia, que
inclui a exposição ao LED, potencializou o efeito de um anti-tumor, reduziu
seus efeitos colaterais e preveniu metástases.
Faria (2006) comparou o LED com outra terapia de baixa intensidade
(sem variação de parâmetros) e observou maior eficácia do LED. A
26
regeneração tecidual de tecido tendinoso e organização das fibras colágenas
foi maior com os efeitos do LED comparado a outra terapia.
Trelles, Allones e Mayo (2006) utilizaram a terapia com LED (633nm)
para auxiliar a cicatrização de ferida cutânea, e relatam melhora da dor após a
primeira sessão do tratamento e no décimo quinto dia essas feridas já estavam
completamente reparadas e com mínimo tecido cicatricial quando comparados
ou controle.
Bevilacqua et al. (2007) e Tortamano et al. (2009) descrevem que a
fototerapia com LED de baixa potência pode prevenir cáries, efeito bactericida
e alívio da dor na cicatrização.
Casalechi et al. (2009), demonstraram a efetividade do LED no processo
de regeneração do tendão de Aquiles, com diminuição do número de
fibroblastos e melhora na qualidade da remodelação.
Bastos, Lizarelli e Parizzoto (2009), encontraram efeitos semelhantes na
cicatrização do tendão ao comparar o LED (630nm e 880m) com o LASER
(685nm e 830nm), sendo que os comprimentos de onda infravermelhos
obtiveram resultados mais eficientes.
Araújo (2009) verificou que após a utilização do LED em uma inflamação
óssea houve regeneração positiva comparada ao grupo lesão sem tratamento.
Silva et al. (2011) relatam que o LED apresentou maior ação
antiinflamatória, aumento qualitativo e quantitativo dos fibroblastos e fibras
colágenas.
Alguns
estudos
da
fototerapia
de
baixa
potência
estão
apresentados na figura 4.
Diante do problema da desnutrição na regeneração tecidual, maturação
de tecidos e dos altos índices de estudos sobre a fototerapia de baixa potência
no processo inflamatório, o presente projeto teve como objetivo analisar os
efeitos do LED de baixa potência na regeneração da tendinopatia após um
processo inflamatório induzido em ratos desnutridos e nutridos, se fez por bem
em comparar a terapia abordada com uns dos tratamentos mais convencionais
para o processo inflamatório, sendo os antiinflamatórios não esteróides
(AINEs).
27
Comp.
Fonte/Terapia
de
Modelo
2
(J/cm )
onda
Salate et al.
(2002)
de
Resultado
estudo
estudada
2, 5 e
660
10
Área
Tendão
Ratos
Neovascularização
calcâneo
Aves
Diminuição de
Cultura
fibroblastos
celular
LASER
Vinck et
1,
al.(2003)
570,660
0,53 e
LED
830,930
0,1
Carrinho et al.
(2006)
Aceleração na
685
3 e 10
Ratos
LASER
reparação
Tendão
tendínea
calcâneo
Regeneração e
Faria (2006)
640
4
Ratos
organização nas
Tendão
fibras colágenas
calcâneo
Expressão do
Tendão
RNAm COX
calcâneo
Melhor
Tendão
(2007)
organização das
calcâneo
LASER
fibras colágenas
LED
Albertini et al.
660 e
(2007)
684
4
Ratos
LASER
Arruda et al.
Castro et al.
670
630
(2007)
3
10 e
Ratas
Ratos
140
Na atividade
Hepatócitos
mitocondrial
LED
Bertilini et al.
(2008)
670
LASER
2, 4 e
Ratos
8
Barolet et al.
(2009)
LED
dor
Tendão
e edema
calcâneo
Síntese de
660
4
Humanos
colágeno
Pele
28
Fibroblastos e
Casalechi et al.
Remodelação
Tendão
(2009)
das fibras
calcâneo
LED
de colágenas
Bonatti et al.
Não houve
(2011)
640
470
LED
20
6, 12 e
Ratos
Humanos
18
alteração nos
Pele
fibroblastos
Silva et al.
(2011)
Ação
Tendão
LED
antiinflamatória
calcâneo
Xavier et al
Redução de
(2011)
LED
640
780
4
7,5
Ratos
Ratos
RNAm COX,
Tendão
TNF, IL4 e IL10
calcâneo
FIGURA 4 – Diversos estudos com a fototerapia de baixa intensidade.
29
2. Objetivo geral
O presente trabalho tem como objetivo investigar e comparar ação da
fototerapia LED de baixa potência no comprimento de onda de 640 nm (região
do vermelho) com a do fármaco diclofenaco de sódio na tendinopatia (processo
inflamatório) induzida por trauma mecânico em tendão calcâneo de ratos
desnutridos e nutridos.
2.1. Objetivos específicos;
quantificar Leucócitos em tendões calcâneos;
diferenciar os subtipos de colágeno I e colágeno III e sua maturação
em tendões calcâneos ;
verificar a expressão das citocinas IL1-β e TGF-β em tendões calcâneos;
3. Material e Método.
Os aspectos éticos deste estudo seguiram as premissas da Sociedade
Brasileira de Ciências Animais (SBCAL) de laboratório e foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) nº.
0033/2011.
3.1 – Protocolo de Desnutrição.
O protocolo de desnutrição foi iniciado após o período de lactação (28
dias), os animais passaram a consumir uma ração especial com baixo teor de
proteína (6%) Latorraca et al. (1998), durante os 32 dias subseqüentes Alves,
Voltarelli e Mello, (2005) (fig.5). Após esse período os animais foram
considerados desnutridos.
30
a
1 ETAPA
a
2 ETAPA
GESTAÇÃO LACTAÇÃO
21 DIAS
28 DIAS
a
a
a
a
3 ETAPA
4 ETAPA
5 ETAPA
6 ETAPA
DESNUTRIÇÃO
LESÃO
TRATAMENETO
EUTANÁSIA
32 DIAS
1 DIA
7, 14 e 21 DIAS
1 DIA
FIGURA 5 - Da gestação até eutanásia dos animais foram seis etapas, na 1ª etapa o período de
21 dias de gestação, a 2ª etapa após o nascimento dos animais os mesmos tiveram um período
de 28 dias para amamentação (lactação), a 3ª etapa foi induzido à desnutrição, os animais
consumiram ração hipoproteica por um período de no mínimo 32 dias na 4ª etapa foi induzida à
lesão traumática nos animais, nesse período os animais continuaram a receber ração
hipoproteica até o período da eutanásia, na 5ª etapa foi determinado os períodos experimentais
(7, 14 e 21 dias) de tratamento e por último a 6a etapa que representa eutanásia referente a
cada período experimental, os animais foram eutanasiados sempre após 24hs da última
terapia/tratamento).
3.1.1 – Dieta para desnutrição
A desnutrição foi induzida com dieta semi purificada contendo 6% de
proteína. A quantidade de nutrientes e porções que determinam a formulação
da ração hipoproteica (6%) Latorraca et al. (1998), estão demostrados na
tabela 1, a formulação proposta pelo American Institute of Nutrition (AIN 1993)
para adequar alimentação de roedores nas fases de crescimento, gestação e
lactação peso normal a ser adquido.
Tabela 1 – Componentes utilizados para formulação da ração hipoproteica,
comparada as normas para adequação da AIN-93G.
31
3.2 Protocolo para induzir a Tendinopatia (tendinite).
Todos os cuidados prévios foram tomados para evitar qualquer
desconforto para os animais. Os animais foram previamente anestesiados com
Cloridrato de Ketamina (80-100mg/kg) e Xilazina (40-75mg/kg) Damy et al.
(2010) em seguida os animais foram posicionados em decúbito ventral no
aparelho para a produção de uma contusão controlada na região medial do
tendão de calcâneo da pata esquerda dos animais conforme o protocolo já
estabelecido na literatura por Salate (2005) e já utilizado por Joensen et al.
(2011) (fig. 6). Para lesão foi determinado uma massa de 220g posicionada a
25 cm do tendão do animal, o impacto da mesma possibilitou uma energia
aplicada no tendão de 0,5J. Após os procedimentos descritos acima, os
animais foram mantidos aquecidos até a finalização do efeito anestésico, com o
objetivo de se evitar a morte acidental por hipotermia decorrente da anestesia.
FIGURA 6 – Aparelho utilizado para induzir a lesão no tendão calcâneo da pata
esquerda dos animais, (a) demonstra aparelho em descanso e (b) demonstra o
aparelho com sua massa de 220g a 25 cm do ponto de partida.
3.3 - Grupos experimentais “in vivo”.
Foram utilizados 120 ratos, sendo 60 animais desnutridos (160 ± 20g) e
60 animais nutridos (300 ± 20g), distribuídos em 8 grupos (n=15/grupo), os
grupos foram distribuídos da seguinte forma; 4 grupos para animais nutridos e
4 grupos para animais desnutridos, cada grupo conteve três subgrupos com 3
períodos experimentais de 7, 14 e 21 dias (n=5/grupo) (fig. 7) , sendo:
32
FIGURA 7 – Desenho experimental dos grupos, cada grupo com três
subgrupos totalizando 15 animais.
Os grupos;
-
CONTNUTR (basal nutrido);
-
CONTDESN (basal desnutrido);
-
TENNUTR (tendinite nutrido);
-
TENDESN (tendinite desnutrido);
-
LEDNUTR (tendinite e LED 640 nm em nutrido);
-
LEDDESN (tendinite e LED 640 nm em desnutrido);
-
DROGNUTR (tendinite e diclofenaco 1mg/kg/dia em nutrido);
-
DROGDESN (tendinite e diclofenaco 1mg/kg/dia em desnutrido).
3.4 Terapias/Tratamento - LED e Fármaco
A terapia com LED foi aplicada com os seguintes parâmetros: Densidade
de energia 2,04 J/cm2, comprimento de onda 640 nm, potência 96 mW, área
entregue (Spot) 3,30 cm2, tempo de aplicação 70 segundos (Tabela 2).
33
TABELA 2 - Parâmetros do LED (Light Emitting Diode). A densidade de
E
P.t
energia (DE) é dada por DE
ou DE
, cuja unidade é [J/cm2], onde E é
A
A
2
a energia [Joule], A é a área [cm ], P é a potência [Watt] e t é o tempo
[segundo].
Densidade de energia
Comprimento de onda
Potência
Área entregue (Spot)
Tempo de Aplicação
Técnica
2,04 J/cm2
640 nm
96 mW
3,30 cm2
70 segundos
Contato
O equipamento LED utilizado no estudo foi de modelo artesanal cedido
pela Professora Dra. Stella Regina Zamuner (fig.8). A potência do equipamento
LED foi aferida por meio de um medidor de potência (Model 13 PEM 001/J,
Melles Griot, Netherlands). Para a terapia do LED ser aplicada, os animais
foram posicionados em decúbito ventral e imobilizados manualmente. A pata
traseira esquerda foi imobilizada seguindo-se a aplicação do LED por um
tempo calculado (70s). A aplicação foi pontual e em contato direto com o
tendão calcâneo esquerdo, formando um ângulo de 90º em relação ao tendão.
Para efeito do tratamento os animais foram expostos à radiação LED em dias
alternados, ou seja, com um intervalo de 48 horas entre as aplicações
Casalechi et al. (2009) e Xavier et al (2011).
Os grupos definidos como DROG receberam injeção intraperitoneal (IP)
de diclofenaco de sódio 1mg/Kg/dia no máximo 7 dias conforme posologia do
fármaco. Os animais foram imobilizados em decúbito dorsal e expostos na
região abdominal para aplicação do fármaco, a seringa utilizada para aplicação
foi da marca BD agulha com 8 mm de comprimento e 0,30 de calibre LopesMartins (2006).
34
FIGURA 8 – Aparelho do LED de 640nm utilizado no experimento.
3.5 Eutanásia e coleta das amostras.
Ao termino de cada período experimental (7, 14 e 21 dias), os animais
foram eutanasiados 24hs após a última sessão de terapia (tratamento), isso foi
determinado para padronizar as eutanásias. Os animais foram colocados em
câmara de CO2 por no mínimo 5 minutos para concluir a parada respiratória
Chorilli et al. (2007). Para a retirada dos tendões foram realizadas a tricotomia
e dissecação do tendão calcâneo esquerdo Casalechi et al. (2009) e Damy et
al. (2009). A tenotomia foi realizada na junção miotendinosa e ostiotendinosa
(fig.9), o tendão foi colocado em eppendorf e armazenado em freezer com
temperatura -80° C até a realização das análises.
35
FIGURA 9 – Retirada do tendão, tenotomia realizada na junção miotendinosa
e ostiotendinosa.
3.6 Processamento das amostras
A preparação do material para as análises histológicas foi realizada no
laboratório de histologia da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) e no
laboratório de investigação medica (LIM 59) da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo (FMUSP).
Para o processamento, foram utilizados lâminas de microscopia
lapidadas e para a montagem das lâminas foram feitos cortes congelados em
criostato. Os tendões foram colocados em posição longitudinal e cortados em 7
micra de espessura na temperatura de no mínimo –20° C.
Foram feitos 6 cortes semisseriados de cada tendão e colocados em lâminas
separadas. As lâminas foram separadas da seguinte forma; 2 lâminas coradas
com hematoxilia-eosina (HE), 2 lâminas coradas com picrossírius e 2 lâminas
para imuno-histoquímica, sendo 1 lâmina para IL1-β e 1 lâmina para TGF-β.
36
3.6.1 Protocolo para coloração com Hematoxilina e Eosina
Para a coloração das lâminas com H.E as amostras foram processados
de acordo com o seguinte o protocolo: (5 minutos no álcool 96%, 2 minutos no
70%, 1 minuto na H2O corrente, 40 minutos no picrossírius, 1 minuto H2O
corrente, 1 minuto na Hematoxilina, 1 minuto na H2O corrente, 2 minutos no
álcool 70%, 2 minutos no álcool 96%, 2 minutos no álcool absoluto, 2 minutos
no xilol e montagem da lâmina). Protocolo utilizado do laboratório de
investigação médica – LIM 59 - Biologia celular – sobe responsabilidade da
Profª. Drª. Élia Tamaso Espin Garcia Caldini que utiliza como referencia montes
e Junqueira (1992). Esse protocolo foi adaptado para o tecido pesquisado
nesse projeto.
3.6.2 Protocolo para coloração com picrossírius red
E para coloração em Picrossirius foi utilizado o protocolo (5 minutos no
álcool 96%, 2 minutos no álcool 70%, 1 minuto na H2O corrente, 1 minuto e 30
segundos na Hematoxilina, 1 minuto na H2O corrente, 2 minutos na eosina, 1
minuto na H2O corrente, 2 minutos no 70%, 2 minutos no álcool 96%, 2 minutos
no álcool absoluto, 2 minutos no xilol e montagem da lâmina. Protocolo
utilizado do Laboratório de Investigação Médica – LIM 59 - Biologia celular –
sobe responsabilidade da Profª. Drª. Élia Tamaso Espin Garcia Caldini que
utiliza como referencia Montes e Junqueira (1992). Esse protocolo foi adaptado
para o tecido pesquisado nesse projeto.
3.6.3 – Imunohistoquímica
Os anticorpos contra TGF-β e IL 1-β utilizados para este estudo estão
descritos na tabela 2:
37
Tabela 3 - Anticorpos utilizados no estudo da imunohistoquimica
ANTICORPO
DILUIÇÃO
FABRICANTE
IL 1- β
1/200
SANTA CRUZ
TGF-β
1/500
SANTA CRUZ
Cortes de tecido congelado de tendão de espessura 7 µm foram
colocados em lâminas silanizadas (Sigma Chemical Co; St. Louis, Missouri,
EUA). O processo de fixação foi feito ao colocar as lâminas um banho de
álcool 70° por 5 minutos. Em seguida, foram lavadas em água corrente, água
deionizada e deixadas em tampão fosfato pH 7,4. O bloqueio da peroxidase
endógena presente nas hemácias foi feito com água oxigenada 10v (3%), e
depois de lavado em água corrente, água destilada e tampão fosfato salino
(PBS). O bloqueio das proteínas inespecíficas foi feito com imersão das
lâminas em caseína diluída em tampão fosfato pH 7,4 (Synth, São Paulo,
Brasil) por 5 minutos em temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas
com os anticorpos primários diluídos em 1% de albumina de soro bovino (BSA)
por 1 hora à 37° C e posteriormente incubadas com o anticorpo secundário
ABC kit VECTASTAIN ( Vector Laboratories – USA) por 1 hora à 37° C. O
cromógeno utilizado foi Diaminobenzidina (DAB) (Sigma-Aldrich Chemie,
Steinheim, Alemanha). Posteriormente ocorreu a contra-coloração com
Hematoxilina de Harris (Merck, Darmstadt, Alemanha) para todos os casos.
Após o término do protocolo as lâminas ficaram em repouso por 48hs até
serem encaminhadas para análises. (protocolo lab imunohistoquimica do
departamento de patologia FMUSP sobe a responsabilidade Prof. Dra. Maria
Cláudia Zerbini).
38
3.7 – Coleta das imagens e análise
As lâminas foram fotografadas em 2 campo na área da lesão num
aumento de 1000 vezes para análises celulares (HE), 400 vezes para análise
de colágeno (picrossírius) e 200 vezes para imunohistoquimica. Através de um
microscópio de luz e com filtro polarizador (Nikon) e no software (Image proplus), as imagem foram capturadas com ampliação de 1000x (imersão) e
lâminas coradas com picrossírius com ampliação de 400x (fig. 10).
Para as lâminas de imunohistoquimica foi utilizado o software IC Capture
2.2 (fig. 11). Foi utilizado o software Image J 1.45s (National Institute of Health,
EUA) para contagem de células (na função Cell Counter) em HE e para
quantificação de colágeno em picrossírius (na função Color Histogram) (fig. 12
e fig.13). De acordo com a literatura (Montes & Junqueira, 1992), o colágeno
visto em vermelho sob o microscópio de polarização indica o tipo I, enquanto
visto em verde indica o tipo III. Dessa maneira, foram quantificados os canais
vermelho e verde de cada imagem fotografada sob luz polarizada para inferir
sobre os tipos de colágeno no tecido.
O software utilizado para Avaliação quantitativa da expressão de IL1-β e
TGF-β nos tendões por análise de imagem foi Image-Pro Plus Versão 4.0
(fig.10). As análises foram realizadas em no mínimo 50% da área total de cada
tendão, sendo em todos os animais de cada grupo. Primeiramente foi realizada
a medida da área total a ser avaliada. Em seguida foi estabelecido o padrão de
imuno reatividade (o que é positivo para cada um dos anticorpos, IL1-β e TGFβ), padrão esse utilizado para análise de todas as lâminas. Em seguida, foi
avaliada a área positiva em relação à área total, o que nos permitiu avaliar a
porcentagem de área positiva para cada um dos marcadores estudados (IL1-β
39
e TGF-β). Dessa forma, os resultados foram expressos em % de área de IL1- β
e de TGF-β em relação à área total de cada tendão (fig 10).
FIGURA 10 – Software (Image-Pro Plus) utilizado para fotografar as imagens
das laminas em HE e quantificar antígeno para citocinas IL 1-Beta e TGF-Beta.
O resultado utilizado para imunohistoquimica foi emitido em estatística
expresso em somatória (Sum) conforme representado na figura.
FIGURA 11 – Software utilizado para caputurar imagens das lâminas de
imunohistoquimica.
40
FIGURA 12 – Software (Image J) na função Cell Counter, foi utilizado para
contagem de células inflamatórias e fibroblastos.
FIGURA 13 – Software (Image J) na função Color Histogram foi utilizado para
quantificar colágeno.
41
3.8 Análise estatística
Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. O
teste de D'Agostino & Pearson foi utilizado para verificar a distribuição
Gaussiana dos dados. Os dados foram analisados por meio do teste t Student
ou Mann Whitney para comparações de duas amostras independentes,
respectivamente. Além disso, análise de variância a duas vias (ANOVA)
seguida por Bonferroni foi empregada quando necessária. O teste de Quiquadrado foi empregado em análise de contingência. Nível de significância foi
fixado em p≤0,05.
42
4 – Resultados (artigos)
Artigo 1
Parente M, Vieira RP, Casalechi HL, Kamimura NT, Vasconcellos MS, Aimbire
F, Albertini R. Análise do efeito da fototerapia LED (light emitting diode) em
tendinopatia traumática em ratos. Submetido à Conscientiae Sáude.
43
Análise do efeito da fototerapia LED (light emitting diode) pós
tendinopatia traumática em ratos.
Effect of phototherapy LED (light emitting diode) post traumatic tendinopathy in
rats
Título abreviado: Efeito da fototerapia LED para tendinopatia em ratos.
Short Title: Effect of LED Phototherapy for tendinopathy in rats
Programa de Pós Graduação em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove
de Julho, Rua Vergueiro, 235, CEP 01504-001, São Paulo – SP, Brasil.
Márcio Parente1, Rodolfo de P. Vieira5, Heliodora Leão Casalechi2, Nilce
Tamae Kamimura3, Mariana de Souza Vasconcellos3, Flávio Aimbire4, Regiane
Albertini5
1 - Mestrando do Programa de Pós Graduação em Ciências da Reabilitação,
Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo, Brasil.
2 - Doutoranda do Programa de Pós Graduação em Ciências da Reabilitação,
Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo, Brasil.
3 - Aluna na Graduação da Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São
Paulo, Brasil.
4 - Professor Doutor da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São
Paulo, Brasil.
5 - Professor Doutor do Programa de Pós Graduação em Ciências da
Reabilitação, Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo, Brasil.
Autor Correspondente
Prof. Dra. Regiane Albertini de Carvalho
Programa de Pós Graduação em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove
de Julho, Rua Vergueiro, 235, CEP 01504-001, São Paulo – SP, Brasil.
Fone: +55 (11) 3665-9325
E-mail: [email protected]
44
Análise do efeito da fototerapia LED (Light Emitting Diode) pós
tendinopatia traumática em ratos
Effect of phototherapy LED (light emitting diode) post traumatic tendinopathy in
rats
Efeito da fototerapia LED para tendinopatia em ratos
Effect of LED Phototherapy for tendinopathy in rats
Resumo: A tendinopatia refere-se a qualquer processo mórbido e/ou doença
que afeta os tendões (tendinite e/ou tendinose). Esse estudo teve como
objetivo investigar o efeito da fototerapia (LED 640nm) no processo de
reparação da tendinite no tendão calcâneo em ratos. A tendinite foi induzida no
tendão esquerdo por meio de trauma mecânico. Foram utilizados 40 animais
(300 ± 20g), distribuídos em 4 grupos, (n=5) e com dois sub-grupos com
diferentes períodos experimentais (7 e 21 dias). Os grupos; CONTR
(controle/basal); TEND (lesão sem tratamento); LED (lesão e tratamento com
LED); DROG (lesão e tratamento com fármaco). O grupo definido como DROG
foi tratado com diclofenaco sódico (1mg/Kg/dia). Foram realizadas análises
histopatológicas. A terapia com LED apresentou efeitos antiinflamatórios e de
reparação tecidual.
Descritores: Tendão, tendinite, LED, infamação
Abstract: This study aimed to investigate the effect of phototherapy (LED 640
nm) in the repair process of tendonitis in the Achilles tendon in rats. The
tendinitis was induced in the left paw using a model of mechanical injury. Were
used 40 nourished rats (300± 20g), distributed in 4 groups, (n = 5) and two subgroups with different experimental periods (7 and 21 days). The groups,
CONTR (Control); TEND (injury without treatment); LED (injury and LED
treatment); DROG (injury and pharmacological treatment; sodium diclofenac
1mg/kg/dia). Histopathological analysis were performed. In summary, LED
therapy, resulted in improvement of inflammation and remodeling.
45
Key Words: Tendon, Tendinitis, LED, inflammation.
Introdução
A tendinopatia refere-se a qualquer processo mórbido e/ou doença que afeta
os tendões. Na literatura encontramos os termos tendinose e tendinite, estes
formam a tendinopatia, sendo que a tendinose se refere aos processos
degenerativos (destrutivos) crônicos progressivos e a tendinite referem-se a
processos inflamatórios (que, por definição, incluem os cinco sinais e sintomas
de inflamação – tumor (inchaço), calor (quente), rubor (vermelho pela dilatação
dos vasos na zona inflamada), dor e impotência funcional)1.
A tendinopatia pode ocorrer por traumatismo, excesso por repetições de
movimentos infecções e desnutrição, estas ocorrências desencadeiam todo um
processo de degeneração, inflamação e até os rompimentos dos tendões.
Embora a maioria dos tendões tenha a habilidade de reparação espontânea
após um ferimento, o tecido de cicatrização formado pode impedir que o tendão
execute suas funções normais2. Os tendões saldaveis são brancos, brilhantes
e possuem uma textura fibroelástica, são ricos em colágeno do tipo I e
menores presença de colágeno do tipo III, IV, V e VI. O colágeno é a principal
proteína estrutural do corpo e o maior componente da matriz extracelular do
tendão. Os tendões são formados por tecido conjuntivo, fibras de colágeno que
se entrelaçam para permitir as forças geradas pelos músculos.
Atualmente existem evidências científicas de que fototerapia tem ação
terapêutica5,6,7. Entretanto, estudos com LED (Light Emitting Diode) são mais
escassos15,21,22,23.
Em sua maioria, o tratamento convencional para a tendinite é farmacológico.
Dentre os fármacos mais usados pode-se detacar os antiinflamatórios não
esteroidais, os glicocorticóides e drogas imunossupressoras. Estes fármacos
podem apresentar diversos efeitos colaterais9. Até o momento, não existem
evidências de efeitos colaterais da terapia com LED.
O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos da terapia com LED
(640 nm) de baixa intensidade em modelo de tendinite traumática em ratos.
46
Material e Métodos
Animais
Foram utilizados 40 ratos jovens, machos, da linhagem Wistar (320 ± 20g). Os
aspectos éticos deste estudo seguiram as premissas da Sociedade Brasileira
de Ciências Animais (SBCAL) de laboratório e foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) nº. 0033/2011.
.
Os 40 animais foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos (n=10), e
estão subdividos em 2 tempos de eutanásia 7 e 21 dias, de acordo com a
figura 1. Grupo CONTR (controle)-basal; Grupo TEND (tendinite) - Grupo
submetido à lesão traumática no tendão calcâneo esquerdo, sem nenhum tipo
de tratamento; Grupo LED (terapia com LED) - Grupo submetido à lesão
traumática no tendão calcâneo esquerdo e submetido à terapia com LED;
Grupo DROG (terapia fármaco) - Grupo submetido à lesão traumática no
tendão calcâneo esquerdo, porém submetido ao tratamento com injeção
intraperitoneal do fármaco diclofenaco sódico (1mg/kg/dia), esse tratamento se
iniciou após 12hs após lesão durante 7 dias (conforme posologia do fármaco).
(FIGURA 1)
Indução da Lesão
Os animais submetidos à lesão foram previamente anestesiados com
Cloridrato de Ketamina (80-100mg/kg) e Xilazina (40-75mg/kg)10,11. Em seguida
submetidos à indução da lesão traumática no calcâneo esquerdo, conforme o
protocolo descrito por e Joensen (2011)12 e Salate (2005)13, os animais foram
posicionados em aparelho para produção de uma contusão controlada, foi
determinada massa de 220g posicionada a 25 cm do tendão do animal, o
impacto da mesma possibilitou uma energia aplicada de 0,5J na região medial
do tendão de Aquiles dos animais.
47
Terapia LED
Os animais foram expostos à radiação LED em dias alternados, com intervalo
de 48 horas entre as aplicações, iniciando 12 horas após a indução da lesão e
foram interrompidas de acordo com o tempo de eutanásia (7 ou 21 dias).Os
parâmetros da irradiação estão especificados na tabela 1.
Tratamento Medicamentoso.
Após a 12hs da lesão o grupo determinado Droga inicio o tratamento com
diclofenaco, as demais sessões de aplicação foram realizadas em 24X24 horas
até completarem 7 dias de tratamento (posologia) tratados com fármaco
receberam a aplicação do Diclofenaco Sódico na concentração de 1mg/kg, a
cada 24 horas. A administração do medicamento foi por meio de injeção via
intraperitoneal, por um período de 7 dias14.
Eutanásia
Os animais foram sacrificados em câmara de CO210 12 horas após a última
aplicação da terapia LED ou da administração da última dose de diclofenaco.
Após o sacrifício os tendões foram removidos por dissecação, realizou-se a
primeira incisão na junção miotendínea seguido por uma incisão na junção
osteotendínea, na inserção calcanear. Em seguida, os tendões foram
identificados e armazenados a -80°C.
Analise Histológica
Para a confecção das lâminas foram feitos cortes das amostras congeladas no
criostato. Os tendões foram posicionados longitudinalmente e cortados em 7µm
de espessura em temperatura mínima de -20°C. Para cada amostra
determinou-se dois cortes semisseriados. As lâminas foram coradas com
Hematoxilina e Eosina (HE) e Picrosirius Red. Dois campos da área da lesão de
48
cada lâmina foram fotografados em um aumento de 400 vezes em microscópio
de luz, para análise das amostras coradas em picrossírius se utilizou o
polarizador e posteriormente as fotos foram analisadas com software Image
Pro-Plus.
Resultados
O grupo Tendinite apresentou maior quantidade de células inflamatórias (fig
2b)) e maior desorganização nas fibras colágenas comparado com os demais
grupos (fig.3b)) com relação ao grupo tratado com LED 7 dias (fig. 2c)), nota-se
que a quantidade de células (fig.2c)) e organização das fibras colágenas
(fig.3c) nesses animais são parecido com o grupo Basal (2 a e 3 a)), já o grupo
Fármaco 7 dias (fig. 2d)) que apresentou quantidade de células parecida com
o grupo Tendinite 7 dias (fig.2b)), mas a fibras colágenas (fig. 3d)) demonstram
estarem bem mais alinhadas comparado ao mesmo grupo (fig.3b)).
(FIGURA 2) e (FIGURA 3)
As imagens representativas dos grupos com tempo experimental de 21 dias
estão apresentadas nas figuras 4 e 5. O grupo Tendinite também apresentou
maior quantidades de células (fig4b)) e maior desorganização nas fibras
colágenas (fig. 5b) comparado com os demais grupos. Quanto ao grupo tratado
com LED 21 dias, percebe-se que a quantidade de células (fig.4c)) e
organização das fibras colágenas (fig.5c)) nesses animais também são
parecido com o grupo Basal, diferente para o grupo Fármaco 21 dias que
apresentou quantidade de células parecida com o grupo Tendinite 21 dias
(fig.4d)), mas a fibras colágenas demonstram estarem bem mais alinhadas
comparado ao mesmo grupo (fig.5d)).
(FIGURA 4) e (FIGURA 5)
49
Discussão
Dentre os efeitos da fototerapia sobre os tecidos biológicos, um dos mais
discutidos é sua influência sobre os fibroblastos, na síntese de colágeno,
remodelamento e melhora funcional dos tendões15. Alguns estudos demostram
que há aumento do número de fibroblastos em tecidos tratados com
Fototerapia16,17..
Estudos também atribuem a Laser terapia tem efeito pró-angenico, aumento da
síntese de VEGF (vascular en-dothelial growth factor) e PDGF (platelet-derived
growth factor), melhora na troca de gases e eliminação de catabólitos por meio
dos vasos sanguíneos, facilitando a migração de macrófagos e fibroblastos nos
casos de reparação tecidual18,19. A utilização do LED terapêutico em estudos
mostra resultados semelhantes aos do Laser terapia para reparo tecidual14,20,21.
A semelhança entre os resultados de estudos utilizando Laser com LED, não
deve ser atribuída à coerência da luz, uma vez que esta se perde nas primeiras
camadas dos tecidos biológicos. Mas sim a comprimentos de onda específicos
que
estimulam
os
componentes
da
cadeia
respiratória
mitocondrial
aumentando o metabolismo energético22,23,24.
A utilização da fototerapia de baixa intensidade é relatado em diversos estudos
efeitos benéficos no processo inflamatório, a reparação tecidual, efeito
potencializador, ação antiinflamatória e remodelamento de fibras colágenas23,25.
Por meio de análise histológica o presente estudo demonstrou melhor efeito
antiinflamatório nos grupos tratados com LED, quando comparados aos não
tratados e/ou tratados com fármacos, assim concordando com resultados
apresentados por Casalechi et. al. (2008)21 e Xavier et. al. (2011)23.
Autores mostram com cada vez mais frequência que a terapia com LED tem
efeitos benéficos em processos inflamatórios, concordando com os achados do
presente estudo15,26.A confirmação de resultados positivos atribuídos ao LED
nesse estudo faz com que se tenha a necessidade de mais estudos utilizando
essa fonte de luz.
50
Conclusão
Este estudo nos permite concluir que o LED de baixa intensidade
reduziu o número de células inflamatórias e melhorou o alinhamento das fibras
colágenas.
Agradecimentos
A Fapesp proc. 2011/05890-9, Uninove e LIM 59 (Laboratório de
Investigação Médica), os nossos agradecimentos.
Referências (artigo 1)
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Tabela 1 - Informações LED
Parâmetros
Variáveis
Densidade de Energia
2.04 J/cm2
Comprimento de onda
640 nm
Potência
96 mW
Área determinada (spot)
3,30 cm2
Tempo de aplicação
70 s
Técnica
Contato
54
55
56
Artigo 2
Parente M, Vieira RP, Casalechi HL, Rodrigues NRD, Caldini EG, Santos ABG,
Araruna AC, Rodrigues D, Silva DFT, Serra AJ, Aimbire F, Albertini RC. Análise
do efeito do LED (Light Emitting Diode) de 640 nm no modelo
experimental de tendinopatia traumática em ratos desnutridos. Submetido
a revista Brasileira de Fisioterapia
57
Análise do efeito do LED (Light Emitting Diode) de 640 nm no
modelo experimental de tendinopatia traumática em ratos
desnutridos.
Márcio Parente1, Rodolfo P. Vieira2, Heliodora Leão Casalechi3, Nilsa Regina
Damaceno-Rodrigues8, Elia Garcia Caldini7, Ângela Batista Gomes Santos6,
Ana Carolina Araruna1, Douglas Rodrigues4, Daniela Fátima Teixeira Silva2,
Andrey Jorge Serra2,
Flavio Aimbire5, Regiane Albertini de Carvalho2
1 - Mestrandos do programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação
da Universidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo, Brazil.
[email protected] [email protected]
2 - Professores Doutores do programa de Pós-Graduação em Ciências da
Reabilitação da Universidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo, Brazil.
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
3 - Doutorando do programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação
da Universidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo, Brazil.
[email protected]
4 - Graduando no curso de Biomedicina da Universidade Nove de Julho
(UNINOVE), São Paulo, Brasil. [email protected]
5 - Professor Doutor da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São
Paulo, Brazil. [email protected]
6 - Mestre do Laboratório de Biologia Celular (LIM 59) da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo, Brazil. [email protected]
7 - Chefe do Laboratório de Biologia Celular (LIM 59) da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo, Brazil. [email protected]
8 - Doutora do Laboratório de Biologia Celular (LIM 59) da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo, Brazil. [email protected]
Author for correspondence:
Regiane Albertini de Carvalho, Prof. Ph.D.
Post Graduate Program in Rehabilitation Sciences
Nove de Julho University (UNINOVE)
58
Rua Vergueiro, 235
Postal Code: 01504-001
São Paulo – SP, Brazil
Fone: +55 11 33859222
E-mail: [email protected]
Resumo
O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da fototerapia LED (640nm±20)
no processo inflamatório tendíneo, a tendinopatia (tendinite) foi induzida por
trauma mecânico em tendão de Aquiles de ratos desnutridos e nutridos. Para
tal foram utilizados 120 ratos, machos sendo 60 animais desnutridos (160±20g)
e 60 nutridos (300±20g). A desnutrição foi induzida nos animais por uma ração
com baixo teor de proteína (6% proteína) sendo que os animais nutridos
consumiram ração normal (22% de proteína). Os animais foram divididos em
oito grupos (n=15/grupo): CONTNUTRI e CONTDESN (controle); TENNUTR e
TENDESN (lesão sem tratamento); LEDNUTR e LEDDESN (lesão e tratamento
com LED); DROGNUTR e DROGDESN (lesão e tratamento com diclofenaco
de sódio), cada grupo foi subdivididos em três subgrupos (n=5/grupo) de
acordo com os períodos experimentais para a eutanásia 7, 14 e 21 dias após a
lesão. A tendinite foi induzida no tendão calcâneo da pata esquerda por meio
de trauma mecânico. Os tratamentos com LED e Fármaco iniciaram-se 12
horas após a lesão e o tratamento se repetiu a cada 48hs para LED e 12 hs
para Fármaco. Os tendões foram dissecados, extraídos e encaminhados para
realização das técnicas de histologia para análise de células inflamatórias, teor
de colágenoo e imunohistoquimica para antigenos IL1-β e TGF-β beta. Após o
processamento das amostras, os resultados obtidos demostram que os animais
desnutridos apresentaram maior numero de células inflamatórias e teor de
colágeno III comparado aos grupos nutridos, (p≤0.05). O LED de baixo
potencia teve ações positivas sobre maturação das fibras colágenas e no
processo inflamatório em animais nutridos e desnutridos. Dessa maneira com
os resultados obtidos se concluiu que o LED de baixa potência teve ações
positivas sobre processo inflamatório, diminuição na expressão de IL1-β e
aumento na expressão TGF-β em animais nutridos e desnutridos. A terapia
com fármaco também teve resultados positivos nos animais desnutridos e
nutridos, porém como já descritos na literatura os efeitos indesejáveis que o
mesmo pode causar.
Palavra-Chave: Inflamação, Desnutrição, Tendinite, Colágeno, Citocínas.
59
Introdução
A desnutrição é um tema de grande interesse em todo o mundo, seus
efeitos sobre os diferentes órgãos e sistemas tem sido objeto de inúmeros
estudos, pois está fortemente associada a doenças crônicas, degenerativas,
hipertensão, deficiências na manutenção e reparação tecidual, processos
inflamatórios, funções imunológicas, doenças coronarianas, diabetes tipo I,
doenças renais, doenças cardiovasculares e capacidade metabólica muscular
[1,2,4,5,6,7].
A desnutrição pode acometer a tendinopatia que se refere a qualquer
processo mórbido e/ou doença que afete os tendões. Na literatura encontramos
os termos tendinose e tendinite, estes formam a tendinopatia, sendo que a
tendinose se refere aos processos degenerativos (destrutivos) crônicos
progressivos e a tendinite refere-se a processos inflamatórios (que, por
definição, incluem os cinco sinais e sintomas de inflamação – tumor (inchaço),
calor (quente), rubor (vermelho pela dilatação dos vasos na zona inflamada),
dor e impotência funcional) [2,8] A tendinite, caracterizada pela instalação do
processo inflamatório no tendão, causa diversas reações, pois as células
nucleadas produzem citocinas sinalizando área lesionada e também ajudam na
reparação tecidual. Algumas citocinas têm como função ajudar na síntese de
colágeno, o linfócito T sintetiza o fator de transformação do crescimento beta
(TGF-β) que tem como função a transformação de procolágeno em fibra de
colágeno, o TGF-β também tem com função inibir os macrófagos ativarem
citocinas inflamatórias[3]. Outra citocina presente no processo inflamatório é a
interleucina1-beta (IL1-β), produzida por macrófagos ativados e sua função é
estimular o processo inflamatório [3].
60
O tratamento convencional para a tendinite na sua maioria são os
farmacológicos. Dentre eles se destacam: os antiinflamatórios não esteroidais
(AINEs), os glicocorticóides e as drogas imunossupressoras, esses fármacos
convencionais apresentam diversos efeitos colaterais[14]. Existem evidencias
científicas que o terapia de baixa intensidade é uma estratégia terapêutica
eficaz para a regeneração após uma lesão induzida [6,9,10,11,12,13,22,34].
Entretanto, estudos com LED são mais escassos e ainda necessários para
determinar a dosimetria, efeito e mecanismo de ação da terapia.
Por estes diversos motivos presente trabalho tiveram como objetivo
investigar e comparar do efeito da fototerapia LED de baixa potência no
comprimento de onda de 640 nm (região do vermelho) com fármaco
diclofenaco de sódio em tendinopatia (processo inflamatório) induzida por
trauma mecânico em tendão calcâneo de ratos desnutridos e nutridos. A fim de
especificar o projeto se quantificou células inflamatórias (Leucócitos), analisar a
maturação dos subtipos de colágeno I e colágeno III e verificar a expressão das
citocinas IL-1β e TGF-β;
Materiais e Métodos
Animais - Foram utilizados 120 ratos jovens, machos, da linhagem Wistar,
sendo 60 animais desnutridos (180 ± 20g) e 60 animais nutridos (320 ± 20g).
Os aspectos éticos deste estudo seguiram as premissas da Sociedade
Brasileira de Ciências Animais (SBCAL) de laboratório e foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) nº.
0033/2011.
61
Modelo de desnutrição - A desnutrição dos animais foi iniciada após o
período de amamentação (28 dias). A partir desse período, os animais
passaram a consumir uma ração especial com baixo teor de proteína (6%) [15]
até o dia de eutanásia. Após o período de 32 dias os animais foram
considerados desnutridos [16] e a partir deste período iniciou-se o protocolo
experimental.
Protocolo experimental “in vivo” - Os animais foram aleatoriamente
distribuídos em 8 grupos com 15 animais em cada grupo (fig.1), cada grupo foi
composto por três subgrupos (n=5) (7, 14 e 21 dias). Três períodos diferentes
de tratamento e eutanásia foram determinados para cada grupo, sendo 7, 14 e
21 dias, estes tempos foram determinados após a lesão no tendão calcâneo
dos animais. Os grupos foram determinados da seguinte forma;
- grupo CONTNUTR (controle nutrido);
- grupo CONTDESN (controle desnutrido);
Não houve nenhum protocolo de experimento nestes animais.
- grupo TENNUTR (tendinite nutrido);
- grupo TENDESN (tendinite desnutrido);
Estes grupos foram submetidos à lesão traumática no tendão calcâneo da pata
esquerda e os animais destes grupos não receberam nenhum tipo de
tratamento;
- grupo LEDNUTR (terapia com LED em animais nutrido);
62
- grupo LEDDESN (terapia com LED em animais desnutrido);
Estes grupos também foram submetidos a lesão traumática no calcâneo,
porém foram submetidos a terapia com LED;
- grupo DROGNUTR (terapia fármaco nutrido);
- grupo DROGDESN (terapia fármaco desnutrido);
Estes grupos tiveram o mesmo protocolo de lesão dos demais grupos, porém a
terapia aplicada nestes grupos foi injeção intraperitoneal do fármaco
diclofenaco sódico (1mg/kg/dia) esse tratamento se iniciou após 12hs da lesão
e durante 7 dias conforme posologia do Fármaco.
(FIGURA 1)
Modelo de lesão - Os animais foram previamente anestesiados com Cloridrato
de Ketamina (80- 100mg/kg) e Xilazina (10-15 mg/kg)[17,18] em seguida foram
submetidos à lesão traumática que foi induzida no calcâneo esquerdo dos
animais conforme o protocolo já estabelecido na literatura[19,20]. Para lesão foi
determinado uma massa de 220g posicionada a 25 cm do tendão do animal, o
impacto da mesma possibilitou uma energia aplicada no tendão de 0,5J para
todos os animais que receberam a lesão.
Tratamentos LED e Fármaco – O comprimento de onda utilizado foi no
vermelho (luz), os parâmetros do LED estão apresentados na tabela 1. As
aplicações do LED foram iniciadas após 12hs da lesão e as demais sessões
foram com intervalos de 48 horas. As sessões de aplicação foram
63
interrompidas conforme o tempo de experimento de 7, 14 ou 21 dias após a
lesão. Os grupos definidos como DROG receberam injeção intraperitoneal (IP)
de diclofenaco de sódio no máximo 7 dias conforme posologia do fármaco. Os
animais foram imobilizados em decúbito dorsal e expostos na região abdominal
para aplicação do fármaco, a seringa utilizada para aplicação foi da marca BD
agulha com 8 mm de comprimento e 0,30 de calibre1mg/Kg/dia Lopes-Martins
(2006).
(Tabela 1)
Eutanásia e Coleta das amostras - Os animais foram eutanasiados em
câmara de CO2[21]. Para a retirada dos tendões foi realizado tricotomia e
dissecção do tendão calcâneo esquerdo. A tenotomia foi realizada na junção
miotendinosa e ostiotendinosa, o tendão foi colocado em eppendorf e
armazenado em freezer com temperatura -80° C até a realização das técnicas.
Para padronizar as eutanásias, as mesmas foram realizada sempre após 24hs
da última sessão de tratamento.
Técnicas Histológicas e análise dos dados –. Para a montagem das lâminas
foram feitos cortes congelados em criostato, os tendões foram colocados em
posição longitudinal e cortados em 7 micra de espessura na temperatura de no
mínimo –20° Celsius. Cada amostra (tendão) teve 6 cortes semisseriados e
colocados em lâminas separadas. As lâminas foram separadas da seguinte
forma; 2 lâminas coradas em Hematoxilia-Eosina (HE), 2 lâminas coradas em
Picrossírius e 2 lâminas para Imuno-histoquímica, sendo 1 lâmina (IL1-β) e 1
64
lâmina (TGF-β). Para a coloração da (HE) em corte congelado o tendão passou
pelo seguinte o protocolo; (5’ no álcool 96%, 2’ no 70%, 1’ na H 2O corrente, 40’
no pricrossirius, 1’ H2O corrente, 1’ na Hematoxilina, 1’ na H2O corrente, 2’ no
álcool 70%, 2’ no álcool 96%, 2’ no álcool absoluto, 2’ no xilol e montagem da
lâmina). Para coloração em Picrossirius Red foi utilizado o protocolo (5’ no
álcool 96%, 2’ no álcool 70%, 1’ na H2O corrente, 1’,5” na Hematoxilina, 1’ na
H2O corrente, 2’ na eosina, 1’ na H2O corrente, 2’ no 70%, 2’ no álcool 96%, 2’
no álcool absoluto, 2’ no xilol e montagem da lâmina. As lâminas depois de
coradas foram fotografadas em 2 campos na área da lesão num aumento de
1000 vezes para análises celulares (HE), 400 vezes para análise de colágeno
(Picro) e 200 vezes para imunohistoquimica. Através de um microscópio de luz
e com filtro polarizador (Nikon) e no software pro Capture as imagem foram
capturadas.
Para análise das fotos foi utilizado o software Imaje J para
contagem de células (na função Cell Counter) e para quantificação de colágeno
(na função Color Histogram).
Imunohistoquímica
Os anticorpos contra IL1-β e TGF-β que foram utilizados para este estudo
estão descritos na tabela 2:
(tabela 2)
65
Cortes de tecido congelado de tendão de espessura 7 µm foram colocados em
lâminas silanizadas (Sigma Chemical Co; St. Louis, Missouri, EUA). O
processo de fixação foi feito ao colocar as lâminas um banho de álcool 70° por
5 min. Em seguida, foram lavadas em água corrente, água deionizada e
deixadas em tampão fosfato pH 7,4. O bloqueio da peroxidase endógena
presente nas hemácias foi feito com água oxigenada 10v (3%), e depois de
lavado muito bem em água corrente, água destilada e tampão fosfato salino
(PBS). O bloqueio das proteínas inespecíficas foi feito com imersão das
lâminas em caseína diluída em tampão fosfato pH 7,4 (Synth, São Paulo,
Brasil) por 5 minutos em temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas
com os anticorpos primários diluídos em 1% de albumina de soro bovino (BSA)
por 1 hora à 37° C e posteriormente incubados com o anticorpo secundário
ABC kit VECTASTAIN ( Vector Laboratories – USA) por 1 hora à 37° C. O
cromógeno utilizado foi Diaminobenzidina (DAB) (Sigma-Aldrich Chemie,
Steinheim, Alemanha). Posteriormente ocorreu a contra-coloração com
Hematoxilina de Harris (Merck, Darmstadt, Alemanha) para todos os casos.
Após o termino do protocolo as laminas ficaram em repouso por 48hs até
serem encaminhadas para análises. (protocolo lab imunohistoquimica do
departamento de patologia FMUSP sobe a responsabilidade Prof. Dra. Maria
Cláudia Zerbini). 4 – Coleta das imagens e analise das mesmas. As
lâminas depois de prontas foram fotografadas em 2 campos na área da
lesão num aumento de 1000 vezes para análises celulares (HE), 400
vezes para análise de colágeno (Picrossírius) e 200 vezes para
imunohistoquimica. Através de um microscópio de luz e com filtro
polarizador (Nikon) e no software (Image pro-plus) as imagem foram
capturadas para lâminas coradas em HE com ampliação de 1000x
(imersão) e lâminas coradas com picrossírius com ampliação de 400x.
Para as lâminas de imunohistoquimica foi utilizado o software IC Capture
2.2. Foi utilizado o software Image J 1.45s (National Institute of Health,
EUA) para contagem de células (na função Cell Counter) em HE e para
quantificação de colágeno em picrossírius (na função Color Histogram).
De acordo com a literatura (Montes & Junqueira, 1992), o colágeno visto
66
em vermelho sob o microscópio de polarização indica o tipo I, enquanto
visto em verde indica o tipo III. Dessa maneira, foram quantificados os
canais vermelho e verde de cada imagem fotografada sob luz polarizada
para inferir sobre os tipos de colágeno no tecido. O software utilizado
para Avaliação quantitativa da expressão de IL1- β e TGF-β nos tendões
por análise de imagem foi o Image-Pro Plus Versão 4.0 (fig.9). As
análises foram realizadas em no mínimo 50% da área total de cada
tendão, sendo em dois animais de cada grupo. Primeiramente foi
realizada a medida da área total a ser avaliada. Em seguida foi
estabelecido o padrão de imunoreatividade (o que é positivo para cada
um dos anticorpos, IL1-β e TGF-β), padrão esse utilizado para análise de
todas as lâminas. Em seguida, foi avaliada a área positiva em relação à
área total, o que nos permitiu avaliar a porcentagem de área positiva
para cada um dos marcadores estudados (IL1-β e TGF-β). Dessa forma,
os resultados foram expressos em % de área de IL1- β beta e de TGF-β
em relação à área total de cada tendão.
Descrição da estatística
Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. O
teste de D'Agostino & Pearson foi utilizado para verificar a distribuição
Gaussiana dos dados. Os dados foram analisados por meio do teste t Student
ou Mann Whitney para comparações de duas amostras independentes,
respectivamente. Além disso, análise de variancia a dois fatores (ANOVA)
seguida por Bonferroni foi empregada quando necessária. O teste de Quiquadrado foi empregado em análise de contingência. Nível de significância foi
fixado em p≤0,05.
67
Resultados
As imagens obtidas foram selecionadas aleatoriamente. A figura 2
representa os resultados das imagens capturadas, a imagem (A) possibilitou a
contagem de leucócitos (células positivas), já imagem (B) demonstra
maturação das fibras colágenas, a imagem (C) se observa expressão de
antígeno IL1-β e (D) expressão de antígeno TGF-β.
(Figura 2)
Tanto os animais nutridos e desnutridos apresentaram células positivas
para inflamação ao longo de 7, 14 e 21 dias de acompanhamento. Os
resultados das células positivas nos animais nutridos são apresentados nas
figuras 3 por fotomicrografia e na figura 4 nos gráficos A, B e C apresentam os
resultados dos três períodos experimentais. Para ambos os períodos se
percebeu que os grupos Tendinites apresentaram maior números de células
positivas comparadas aos demais grupos, exceto para o período experimental
de 14 dias que apresentou menor numero de células. Os grupos LED no
período experimental de 7 e 21 dias apresentaram menor número de células
comparado ao grupo Tendinite e maior numero de células comparado ao grupo
Fármaco, já para o período experimenta de 14 dias o grupo LED apresentou
maior numero de células comparado aos demais grupos (fig. 4).
(FIGURA 3)
Os resultados das células positivas nos animais desnutridos também são
apresentados nas figuras 3 por fotomicrografia e na figura 4 nos gráficos D, E e
F que apresentam os resultados dos três períodos experimentais. Os animais
desnutridos do grupo Tendinite dos três períodos experimentais (7, 14 e 21
dias) demonstram maior proporção de células positivas comparadas aos
demais grupos. Somente o grupo LED do período experimental de 7 dias
apresentou menor numero de células comparado ao grupo Fármaco, (figura 3 e
4 gráfico (D)).
68
Os animais do quadro de desnutrição de ambos os períodos
experimentais responderam aos tratamentos aplicados, se nota que os grupos
LED e Fármaco foram efetivos em reduzir a frequência de células positivas
presente na tendinite (fig. 4 (D, E, F)).
(FIGURA 4)
Os animais dos diferentes quadros nutricionais foram comparados nas
condições Controles, Tendinite, tratamento com LED e Fármaco, estão
apresentados na figura 5 (A, B e C) que apresentam resultados dos períodos
experimentais de 7,14 e 21 dias, nota-se que no período experimental de 7 dias
(A) somente os grupos Tendinite, LED e Fármaco apresentaram diferença
estatisticamente significante.
No período experimental de 14 dias (B) os grupos que apresentaram
diferença estatisticamente significante foram; grupo Tendinite desnutrido
e
grupo Fármaco desnutrido que apresentaram maior números de células
positivas comparado aos seus respectivos grupos nutrido. No gráfico C que
representa o tempo experimental de 21 dias, somente os grupos Tendinite,
LED e Fármaco apresentaram diferença estatisticamente significante (p≤0,05)
(fig. 5).
(FIGURA 5)
Comparações dos resultados de Picrossírius para colágeno I de todos os
grupos nutridos x grupos desnutrido foram;
O colágeno do tipo I nos grupos Basais do período experimental de 7
dias e independentemente do estado nutricional apresentaram em alta
quantidade comparado aos demais grupos, não houve diferença entre os
mesmos. O grupo Tendinite e o grupo LED nutrido a proporção de colágeno do
tipo I foi maior comparado ao respectivo grupo Tendinite e LED desnutrido,
essas comparações teve diferença estatisticamente significante (p≤0,05). Os
grupos Fármaco nutrido e grupo Fármaco desnutrido não tiveram diferença.
Houve
diferença
estatisticamente
significante
(p≤0,05)
quando
foram
69
comparados os seguintes grupos do mesmo quadro nutricional (fig. 6 e 7
gráfico (A)).;
- grupo tendinite desnutrido apresentou redução de colágeno I
comparado ao grupo basal desnutrido;
- grupo LED nutrido apresentou redução de colágeno I comparado com
grupo basal e tendinite nutrido;
- grupo LED desnutrido com redução de colágeno I comparado com
grupo basal e tendinite desnutrido;
- grupo Fármaco nutrido com redução de colágeno I comparado com
grupo basal e tendinite nutrido e grupo Fármaco desnutrido com redução
de colágeno I comparado com grupo basal e tendinite desnutrido.
Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 7
gráfico (A)).
Para o período experimental de 14 dias o colágeno do tipo I apresentouse em menor quantidade no grupo Basal nutrido comparado ao grupo Basal
desnutrido e com diferença estatisticamente significante (p≤0,05). Já para o
grupo Tendinite e LED nutrido tiveram um aumento exacerbado comparado ao
respectivo
grupo
Tendinite
e
LED
desnutrido,
essa
diferença
foi
estatisticamente significante (p≤0,05). O grupo Fármaco nutrido apresentou
menor quantidade de colágeno I comparado com o grupo desnutrido, essa
diferença também foi significante (p≤0,05). Também houve diferença
estatisticamente significante (p≤0,05) quando foram comparados os seguintes
grupos do mesmo quadro nutricional. Estes resultados estão apresentados nas
seguintes figuras (fig. 6 e 7 gráfico (B));
- no grupo Tendinite nutrido apresentou maior teor de colágeno I
comprado com o grupo controle nutrido e o grupo Tendinite desnutrido
(já descrito), o grupo Tendinite desnutrido apresento menor porção de
colágeno I comparado ao grupo ao grupo basal desnutrido;
- o grupo LED nutrido apresentou redução de colágeno I comparado com
o grupo Tendinite e com maior porção comparado ao grupo Fármaco
70
nutrido; o grupo LED desnutrido com menor porção de colágeno I
comparado com os demais grupos;
- o grupo Fármaco nutrido comparado com os grupos Controle e
Tendinite;
- o grupo Fármaco desnutrido com redução de colágeno I comparado
com os grupos Controle, Tendinite e com maior porção de colágeno
comparado ao grupo LED desnutrido.
Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 7
gráfico (B)).
Nos grupos experimentais do período de 21 dias, o grupo Basal e
Tendinite nutrido apresentaram maior porção de colágeno tipo I que os grupos
Basal e Tendinite desnutrido, essa diferença é significante (p≤0,05). Diferente
dos grupos Basal e Tendinite, o grupo LED apresentou menor porção de
colágeno I, mas quando comparado com o grupo LED desnutrido. O grupo
Fármaco nutrido apresentou menor teor de colágeno I comparado ao grupo
Fármaco desnutrido e não houve diferença estatisticamente significante (fig. 6
e 7 gráfico (C)).
Os grupos dos diferentes quadros nutricionais foram comparados e
apresentaram diferença estatisticamente significante (p≤0,05), sendo;
- o grupo Tendinite nutrido apresentou maior porção de colágeno I
comprado com o grupo controle e o grupo Tendinite desnutrido também
apresentou maior porção de colágeno I quando comparado ao grupo
basal desnutrido.
- o grupo LED nutrido apresentou redução de colágeno I comparado com
o grupo Basal e Tendinite nutrido e com maior porção comparado ao
grupo Fármaco nutrido; o grupo LED desnutrido apresentou menor
porção de colágeno I comparado com os grupo Basal e Tendinite
demais grupos.
Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 7
gráfico (C)).
(FIGURA 6)
71
(FIGURA 7)
Comparações dos resultados de Picrossírius para colágeno III de todos os
grupos nutridos x grupos desnutrido foram;
O colágeno do tipo III no período experimental de 7 dias foram mais
abundantes no grupos desnutridos. O grupo Basal nutrido apresentou menor
quantidade
comparada
ao
grupo
Basal
desnutrido,
os
mesmo
não
apresentaram diferença estatística significante. O grupo Tendinite nutrido
apresentou menor quantidade de colágeno III comparado ao grupo Tendinite
desnutrido, para esses grupos houve diferença significante (p≤0,05). O
tratamento com LED apresentou nos animais nutridos menor quantidade de
colágeno III comparado nos animais desnutridos, mas essa diferença também
não foi estatisticamente significante. Para os animais nutridos tratados com
Fármaco os mesmo apresentaram menor quantidade de colágenos III
comparado com grupo desnutrido o resultado dessa comparação teve
diferença estatisticamente significante (p≤0,05). Além dos resultados já
apresentados, também houve diferença estatisticamente significante (p≤0,05)
quando foram comparados os seguintes grupos do mesmo quadro nutricional
(fig.6 e 8 gráfico (D));
- grupo Tendinite nutrido apresentou menor quantidade de colágeno III
comparado ao grupo Basal nutrido;
- O grupo LED nutrido apresentou menor quantidade de colágeno III
comparado ao grupo Basal e ao grupo Tendinite desnutrido;
- O grupo LED desnutrido também apresentou menor quantidade de
colágeno III comparado ao grupo Basal, grupo Tendinite a o grupo
Fármaco desnutrido;
- o grupo Fármaco nutrido apresentou menor quantidade de colágeno III
comparado ao grupo Basal e grupo Tendinite nutrido Estes resultados
estão apresentados nas seguintes figuras;
72
Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 8
gráfico (D)).
No período experimental de 14 dias o colágeno do tipo III apresentou em
menor quantidade nos grupos Basal e Tendinite nutrido quando comparado
com o grupo Basal e Tendinite desnutrido, essa diferença foi estatisticamente
significante (p≤0,05). Os grupos que sofreram tratamento LED e Fármaco
nutrido apresentaram maior quantidade de colágeno III comparado aos grupos
LED e Fármaco desnutrido, não houve diferença significante entre os grupos.
Houve
diferença
estatisticamente
significante
(p≤0,05)
quando
foram
comparados os seguintes grupos do mesmo quadro nutricional (fig. 6 e 8
gráfico (E));
- o grupo Tendinite nutrido apresentou maior porção de colágeno III
comprado com o grupo basal e o grupo Tendinite desnutrido também
apresentou maior porção de colágeno III quando comparado ao grupo
basal desnutrido.
- no grupo LED nutrido apresentou menor quantidade de colágeno III
quando comparado ao grupo Basal e Tendinite nutrido e da mesma
forma foi para o grupo LED desnutrido que apresentou menor
quantidade de colágeno III quando comparado com o grupo Basal e
Tendinite desnutrido;
- A quantidade de colágeno III no grupo Fármaco nutrido foi menor
quando comparado ao grupo Basal e Tendinite nutrido e da mesma
forma foi para o grupo Fármaco desnutrido que apresentou menor
quantidade de colágeno III quando comparado com o grupo Basal e
Tendinite desnutrido;
Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 8
gráfico (E)).
No período experimental de 21 dias o colágeno do tipo III apresentou-se
em menor quantidade no grupo Basal e grupo Tendinite nutrido quando
comparado ao grupo Basal e grupo Tendinite desnutrido, essa diferença foi
73
estatisticamente significante (p≤0,05). Os grupos que receberam tratamento
LED e Fármaco nutrido apresentaram maior quantidade de colágeno III
comparado com o grupo LED e grupo Fármaco desnutrido, somente para a
comparação entre os grupos LED houve diferença estatisticamente significante
(p≤0,05) (fig. 6 e 7 gráfico (F)). Os grupos dos diferentes quadros nutricionais
foram comparados e apresentaram diferença estatisticamente significante
(p≤0,05), sendo;
- os animais do grupo nutrido que recebeu lesão e não foi submetido a
nenhum tipo de tratamento teve menor quantidade de colágeno III
comparado com o grupo Basal nutrido;
- os animais do grupo Tendinite desnutrido apresentaram menor
quantidade de colágeno III comparado com o grupo Basal desnutrido;
- o grupo LED nutrido apresentaram menor quantidade de colágeno do
tipo III quando comparado com o grupo Tendinite e o grupo Fármaco
nutrido;
- o grupo LED desnutrido apresentaram menor quantidade de colágeno
do tipo III quando comparado com o grupo Basal e o grupo Tendinite
desnutrido;
- os animais do grupo Fármaco nutrido apresentaram menor quantidade
de colágeno III comparado com o grupo Basal nutrido;
- o grupo Fármaco desnutrido apresentou menor quantidade de
colágeno do tipo III quando comparado com o grupo Basal e o grupo
Tendinite desnutrido;
Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 8 gráfico
(F)).
(FIGURA 8)
Os resultados obtidos para expressão IL1-β do período experimental de
7 dias estão apresentados na figura 9 (A) e figura/gráfico 10. Os grupos
tendinite e fármaco apresentaram maior quantidade na expressão de IL1-β nos
tendões comparados aos grupos Basal e LED, essas diferenças foram
estatisticamente significante (p≤0,05).
74
Os resultados obtidos para IL1-β do período experimental de 14 dias
estão apresentados na figura 9 (B) e figura/gráfico 11. Os grupos tendinite de
ambos os quadro nutricional e o grupo nutrido fármaco apresentaram maior
quantidade na expressão de IL1-β nos tendões comparados aos demais
grupos, essas diferenças foram estatisticamente significante (p≤0,05).
(FIGURA 9)
(FIGURA 10)
(FIGURA 11)
Os resultados obtidos para TGF-β do período experimental de 7 dias
estão apresentados na figura 12 (C) e figura/gráfico 13. Os grupos tendinite e
fármaco apresentaram maior expressão de TGF-β nos tendões comparados
aos grupos Basal e LED, essas diferenças foram estatisticamente significante
(p≤0,05).
Os resultados obtidos para TGF-β do período experimental de 14 dias
estão apresentados na figura 12 (D) e figura/gráfico 14. Os grupos tendinite de
ambos quadro nutricional apresentaram maior quantidade na expressão de
TGF-β nos tendões comparados aos demais grupos, essas diferenças foram
estatisticamente significante (p≤0,05).
(FIGURA 12)
(FIGURA 13)
(FIGURA 14)
Discussão
O baixo consumo de proteína na dieta traz diversos problemas à saúde
[1,2,7], a desnutrição está bem elucidada na literatura, os estudos apontam os
efeitos da desnutrição no processo inflamatório [2,16]. Também esta bem
elucidada as diversas formas para induzir a desnutrição na literatura, dentre
elas foi inspirada para o presente projeto o teor de proteína de 6% [15,16].
75
A desnutrição leva o organismo ao processo degenerativo, conforme
relatado por Susse et al. [7], os tendões são alvo dessa degeneração, isso
implica o processo inflamatório levando aos 5 cinco sintomas da inflamação [2].
O processo inflamatório induzido em tendões é bem apresentado na
literatura. Ao contrario do protocolo utilizado no presente projeto também nos
deparamos com protocolos que utilizam a colagenase, criolesão e a tenotomia
para induzir a lesão em tendões[19,20,34,37].
Um dos efeitos mais discutidos na fototerapia sobre os tecidos biológicos
é a sua influência sobre o fibroblasto, síntese de colágeno, remodelamento de
tendões, melhora funcional e efeito analgésico[22]. Uma vasta literatura
demonstra o aumento da população de fibroblastos com a utilização do LASER
de baixa intensidade[23,24,25,26]. Alguns estudos demonstraram o efeito próangenico da LASER terapia[27,28] também aumento da síntese de VEGF
(vascular en-dothelial growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor),
diminuição da expressão da IL1–β e aumento TGF-β, óxido nitrico e superóxido
dismutase, os vasos sanguíneo melhora a permuta de gases, os catábolitos
são melhor eliminados e os fibroblastos mais os macrófagos migram com maior
facilidade para o reparo tecidual[29,30,31,32]. Os estudos com LED estão
demonstrando resultados semelhantes ao do LASER e outros tipo de terapias
[2,21,33,34,35,36]. A explicação para os resultados semelhantes entre LASER
e LED é que apesar da teoria da fotoquímica, os componentes da cadeia
respiratória são estimulados a comprimentos de onda eletromagnética
específicos, isso faz com que a cadeia respiratória mitocondrial aumente seu
metabolismo energético[36,37,38,39,40].
A pesquisa demonstrou por meio de análise histológica um melhor efeito
antiinflamatório no grupo tratado com LED em relação ao não tratado (grupo
tendinite) tanto nutrido como desnutrido. A questão dos grupos desnutridos já
se era esperado os resultados aqui apresentados, pois pela deficiência da
proteína é fato que o organismo não consegue sintetizar as moléculas
necessárias para regeneração tecidual[2]. Trabalhos na literatura também
relatam que o LED teve maior ação no processo inflamatório quando
comparado a grupos sem tratamento [22,23,34,41].
76
Os resultados apresentados para antígenos IL1-β e TGF-β corroboram
com os resultados apresentados na literatura [37,42]. Em ambos os grupos que
sofreram lesão dos diferentes períodos experimentais demonstraram que a
expressão de IL1- β e TGF-β foram positivos comparados aos demais grupos,
independente do quadro nutricional, então por se tratar de um período agudo
os estudos relatam um alto índice de expressão de IL1-β e TGF-β [3,37,42]. O
aumento dessas citocinas é estudado por alguns autores no processo
inflamatório, pois o aumento da IL1-β é para desencadear o processo
inflamatório enquanto o aumento do TGF-β é para inibir as células que
sintetizam a IL1-β, dessa maneira não agravando o processo inflamatório[3].
Alguns estudos que abordam o processo inflamatório e as terapias de
baixa potencia relatam que a expressão de citocinas ficam presente no tecido
por meses, porem alguns estudos abordam somente período experimental de 7
e 14 dias para verificar o efeito da terapia no processo inflamatório agudo e
semiagudo[36,37,42], isso justifica os períodos experimentais de 7 e 14 dias
abordado nesse estudo.
Os grupos LED demonstraram em ambos os períodos experimentais (7
e 14 dias) resultados satisfatório e semelhantes quando comparados com
estudos relacionados a fototerapia na literatura, ou seja menor expressão da
IL1- β e TGF- β [14,16,19,37,42]. Os grupos nutridos e desnutridos Tendinite do
período experimental de 14 dias apresentaram aumento da expressão de IL1-β,
os grupos nutrido LED, desnutrido LED e somente o grupo desnutrido Fármaco
apresentaram menor expressão e essa diferença foi estatisticamente
significante, exceto o grupo nutrido Fármaco que demonstrou expressão de
IL1-β significativa aumentada. Este resultado merece mais estudos, pois o que
se observa na literatura é a diminuição da expressão do IL1-β quando é
utilizado o diclofenaco no período experimental de 14 dias [37,38].
O tratamento com LED apresentou resultados positivos no processo
inflamatório, dessa forma o estudo corrobora com autores que já relataram a
diminuição
das
citocinas
inflamatórias
e
expressão
de
citocinas
antiinflamatórias [22,34,35,36,37,41,43]. Dessa maneira a investigação do LED
no processo inflamatório vem sendo relatados com efeitos positivos.
77
Conclusão
A terapia LED mesmo em condições de desnutrição teve efeitos
antiinflamatórios e de reparação tecidual. Nesse caminho podemos concluir
que o LED de baixo potencia teve ações positivas sobre maturação das fibras
colágenas e o processo inflamatório em animais nutridos e desnutridos. A
terapia com fármaco também teve resultados positivos nos animais nutridos e
desnutridos, porém como já descritos na literatura os efeitos indesejáveis que o
mesmo pode causar.
Agradecimentos
Fapesp proc. 2011/05890-9, UNINOVE.L e Laboratório de Investigação
Médica (LIM 59), FMUSP.
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FIGURA 1 – Desenho experimental dos animais nutridos e desnutridos, o grupo
basal não recebeu nenhum tipo de experimento, o grupo Tendinite não recebeu
nenhum tratamento, já os grupos LED e Fármaco também foram expostos à
lesão e inicio do tratamento foi 12hs após a lesão, para o grupo LED as
sessões de tratamento foram entre 48hs até eutanásia, para o grupo Fármaco
as sessões de aplicação do fármaco foram entre 12hs até 7 dias, conforme a
81
posologia da droga. Os animais de ambos os grupos foram eutanasiados
conforme os períodos experimentais de 7, 14 e 21 dias.
Tabela 1. Parâmetros do LED (Light Emitting Diode). A densidade de energia
E
P.t
(DE) é dada por DE
ou DE
, cuja unidade é [J/cm2], onde E é a
A
A
energia [Joule], A é a área [cm2], P é a potência [Watt] e t é o tempo [segundo].
Informações LED
Parâmetros
Variáveis
Densidade de Energia
2.04 J/cm2
Comprimento de onda
640 nm
Potência
96 mW
Área determinada (spot)
3,30 cm2
Tempo de aplicação
70 s
Técnica
Contato
Figura 2. Fotomicrografia de tendões de ratos desnutridos. A imagem (A)
possibilitou a contagem de células (1000x), já imagem (B) demonstrou o
alinhamento das fibras colágenas (400x) e a imagem (C) a visualização de
antígeno IL1- β (200x) e (D) a visualização de antígeno TGF- β (200x).
82
Tabela 2 - Anticorpos utilizados no estudo da imunohistoquimica
ANTICORPO
DILUIÇÃO
ORIGEM
TGF BETA
1/500
SANTA CRUZ
IL 1 BETA
1/200
SANTA CRUZ
Figura 3 – Fotomicrografia do tendão de ratos nutridos e desnutridos. As
imagens foram capturadas no aumento de 1000x, as mesmas estão com barra
de escala de 100 micra. As abreviações CI são referentes a Células
leucocitárias e FB são referentes a fibroblasos. As imagens apresentadas
ilustram os três periodos experimentais.
83
Figura 4. Proporção de leucócitos (células positivas) para inflamação nos
grupos nutridos e desnutridos ao longo de 7, 14 e 21 dias de
acompanhamento. O teste de qui-quadrado (4x2) foi aplicado para as
comparações dentro de cada condição nutricional para os respectivos
períodos. Em animais nutridos, a proporção de células positivas para
inflamação foi significativamente elevada somente para o período de 7 dias
(p=0,0005). Entretanto, animais desnutridos apresentaram proporções
significativamente elevadas em relação aos demais grupos para todos os
períodos (p<0,0001). Notável foi à observação que os diferentes tratamentos
foram eficazes em diminuir a presença de células positivas para inflamação.
Figura 5. Proporção de Leucócitos (células positivas) para inflamação do grupo
nutrido comparado ao grupo desnutrido em animais controle, tendinite, LED e
Fármaco, respectivamente. As Figuras A, B e C ilustram resultados de 7, 14 e
21 dias de segmento, respectivamente. O teste de qui-quadrado (tabela 2x2) foi
aplicado para as comparações entre nutridos e desnutridos.
84
FIGURA 6 – Fotomicrografia em 400x do tendão de ratos com coloração em
pricrossírius para quantificação de colágeno I (vermelho) e colágeno III (verde).
Foi determinado barra de escala de 100 µm. As imagens apresentadas de cada
grupo representam todos os períodos experimentais, pois os resultados são
semelhantes. As distribuições dos grupos estão apresentadas conforme
respectivas letras. As imagens A, C, E e G são referentes aos grupos nutridos e
as imagens B, D, F e H são referentes aos grupos desnutridos.
Figura 7. Os gráficos apresentam os resultados da quantificação das fibras
colágenas do tipo I.
Os gráficos A, B e C representam os três períodos
experimentais (7, 14 e 21 dias), para comparação entre os grupos foi
determinado # para os grupos Controle, S para os grupos Tendinite, * para
os grupos droga e quando apresentados o resultado foi estatisticamente
significante (p≤0.05) e NS para não significante. ANOVA duas vias
complementada por Bonferroni foi utilizado para comparações.
Figura 8. Os gráficos apresentam os resultados da quantificação das fibras colágenas do tipo
III. Os gráficos D, E e F também representam os três períodos experimentais (7, 14 e 21 dias),
para comparação entre os grupos foi determinado também foi determinado # para os grupos
Controle, S para os grupos Tendinite, * para os grupos droga e quando apresentados o
resultado foi estatisticamente significante (p≤0.05) e NS para não significante. ANOVA duas
vias complementada por Bonferroni foi utilizado para comparações.
85
FIGURA 9 - Fotomicrografia de imunohistoquimica da expressão de IL1-β dos
tendões de ratos. As imagens foram capturadas no aumento 200x, a barra de
escala determinada foi de 100 micra. Na prancha (A) estão apresentados as
imagens dos animais do período experimental de 7 dias e na prancha (B) estão
apresentados as imagens dos animais do período 14 dias.
FIGURA 10 - Expressão de IL1-β nos grupos desnutridos e nutridos do período
experimental de 7 dias. Observa-se diferença estatisticamente significante
(p≤0,05) nos grupos Tendinite e Fármaco quando comparados aos demais
grupos.
86
FIGURA 11 - Expressão de IL1-β nos grupos desnutridos e nutridos do período
experimental de 14 dias. Observa-se diferença estatisticamente significante
(p≤0,05) nos grupos Tendinite e no grupo nutrido Fármaco quando comparados
aos demais grupos.
Figura 12 - Fotomicrografia de imunohistoquimica da expressão de TGF-β dos
tendões de ratos. As imagens foram capturadas no aumento 200x, a barra de
escala determinada foi de 100 micra. Na prancha (C) estão apresentados os
animais do período experimental de 7 dias e na prancha (D) estão
apresentados os animais de 14 dias.
87
FIGURA 13 - Expressão de TGF-β nos grupos desnutridos e nutridos do
período experimental de 7 dias. Observa-se diferença estatisticamente
significante (p≤0,05) somente nos grupos desnutrido e nutrido Tendinite.
FIGURA 14 13 - Expressão de TGF-β nos grupos desnutridos e nutridos do
período experimental de 14 dias. Observa-se diferença estatisticamente
significante (p≤0,05) nos grupos desnutridos e nutridos Tendinite quando
comparados aos demais grupos.
88
5. Considerações Finais
Quando há um processo inflamatório no organismo o mesmo passa por
diversas cascatas de reação, o envolvimento de células e migração das
mesmas aumentam exacerbamente. No quadro de desnutrição, os resultados
deste trabalho mostraram que essa mobilização de célula inflamatória é ainda
maior. Entretanto, nossos resultados mostraram que apesar do quadro de
desnutrição os LED apresentou resultados anti-inflamatorios, sendo um recurso
importante para o processo de reabilitação.
89
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