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VARIAÇÕES DO NÚMERO DE CÓPIAS NA SÍNDROME DE CÂNCER
COLORRETAL HEREDITÁRIO E AGREGAÇÃO FAMILIAL.
COPY NUMBER VARIANTS IN SYNDROME OF COLORECTAL CANCER
AND FAMILIAL AGGREGATION
Aluno-autor: Eliane Roio Ferreira; Orientador: Rogério Saad Hossne; Colaboradores: Silvia
Regina Rogatto, Erika Maria Monteiro Santos.
Campus de Botucatu – Faculdade de medicina de Botucatu – Medicina – [email protected] – PIBIC/CNPQ.
RESUMO
Palavras-chave: câncer colorretal hereditário; agregação familial; variação do número de cópias.
Keywords: Hereditary colorectal cancer; familial aggregation; copy number variants.
INTRODUÇÃO
As variações estruturais no número de cópias são uma nova forma de variação genética,
identificada nos últimos anos. (Sebat et al., 2004; Feuk et al., 2006). A sua importância decorre do
fato de poderem influenciar a suscetibilidade a doenças complexas como o câncer. (McCarroll e
Alshuler, 2007; Beckmann et al., 2007).Apesar disso, a investigação de CNVs é uma abordagem
quase inexplorada para a descoberta de novos genes no câncer familial. (Shlien et al., 2008).
Esses estudos podem ajudar a estabelecer um perfil das doenças, como no caso da
Síndrome de Lynch(LS). Esta doença é caracterizada pelo processo acelerado de carcinogênese,
por mutação em genes de reparo do DNA, com idade precoce de manifestação de tumores
colorretais(CRC)(Lynch e Lynch, 2005; Lynch et al., 1988; Marra et al., 1997). Além disso, pode
estar associada a tumores extra-colônicos. E acredita-se que os pólipos não tratados nos portadores
de mutação tem risco elevado de transformação maligna.
Com relação aos pacientes de alto risco hereditário para CRC, não temos conhecimento de
estudos nacionais para avaliar como surgem as lesões precursoras e se ocorrem alterações
moleculares associadas. A investigação molecular pode definir o diagnóstico de uma síndrome
hereditária. Neste contexto, o julgamento correto do espectro de tumores em LS adquire grande
importância; e pode levar a mudanças nos critérios usados para diagnósticos.
OBJETIVOS
Normatizar o diagnóstico clínico e anatomopatológico.
Rastrear com efetividade lesões precoces em cólon.
Estabelecer o diagnóstico molecular dos principais genes envolvidos na etiologia do câncer
colorretal e câncer de mama hereditários.
Disponibilizar o modelo de registro em Oncogenético (OncoTree) para as diferentes Instituições
envolvidas no projeto.
MATERIAL E MÉTODOS
Serão selecionadas 30 famílias (prospectiva e retrospectivamente) que apresentem os
critérios clínicos internacionalmente aceitos para a categorização de uma Síndrome de Câncer
Familial ou agrupamentos familiais. Tais pacientes serão oriundos do ambulatório de
coloproctologia (câncer) da disciplina de gastrocirurgia da FMB-UNESP. Será aplicado um
questionário e colhido amostra de sangue periférico.
Os perfis de variação no número de cópias (CNV) serão analisados usando a versão customizada
de microarrays de oligonucleotídeos de 60 mers de 244AK da Agilent(Agilent Technologies, Santa
Clara, CA). O desenho da plataforma será realizado com o uso do software eARRAY v4.5 da
Agilent (http://earray.chem.agilent.com/earray/login.do) disponível on line. O DNA teste será
extraído de linfócitos de sangue periférico dos probandos e seus familiares de acordo com os
protocolos padrão. Como DNA referência, será usada uma amostra de DNA comercial (Promega,
Mannheim, Germany) de placenta do mesmo sexo que o DNA teste, consistindo de uma mistura
de 10 indivíduos normais. Às amostras, serão incorporadas Cy3-e Cy5-dCTPs (Amersham
Biosciences, Buckinghamshire, UK) utilizando reação de marcação por random primer (Bioprime
Labeling Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA). Purificação, hibridação e lavagem serão realizadas. As
imagens dos arrays serão obtidas com o uso de um scanner a laser da Agilent, e então processadas
com o programa Feature Extraction v 9.5.1 e analisadas usando o programa CGH Analytics 3.4.40.
O algorítimo estatístico ADM-2 e o limiar de sensitividade 6.0 serão utilizados para determinar as
alterações. CNVs comuns serão filtrados por comparações tanto com o banco de dados de 300
famílias brasileiras estudadas em nosso laboratório quanto pelo uso do Database of Genomic
Variants (DGV-http://projects.tcag.ca/variation/). Cada região de CNV será avaliada para
evidências de ruído ou artefatos experimentais. Os genes candidatos serão avaliados por PCR
quantitativa ou seqüenciamento de alta performance (Roche 454).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O trabalho está em andamento. Até a presente data foram selecionados 140 pacientes do
ambulatório de Gastrociurugia do HC da Unesp. Destes, 17 foram excluídos por se tratarem de
casos de PAF (Polipose Adenomatosa Familiar); 27 por não haver laudos anatomo-patológicos
para comprovação do câncer colorretal no sistema local de dados; 29 por não poderem ser
incluídos nos critérios utilizados neste estudo; 6 por terem falecido antes da data em que seriam
convidados; 1 por decisão pessoal em não querer participar ; 4 por não terem comparecido na data
marcada para a primeira entrevista; 15 que não foram encontrados; e 11 pediram para serem
convocados posteriormente.
Os probandos convocados, incluídos nos critérios Amsterdam ou Bethesda,13 no total, foram
entrevistados, assinaram o TCLE, e foi colhido amostra de sangue, que foi enviada ao laboratório
Neogene da Faculdade de Medicina de Botucatu. Isso também foi feito com 27 familiares desses
probandos, fossem eles afetados ou não, totalizando 40 pessoas no estudo. Para cada família foi
construído um heredograma e os protocolos foram preenchidos.
Todos os afetados também assinaram um termo de responsabilidade para que os blocos dos
seus tumores pudessem ser retirados, na Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, para
subseqüente análise deste estudo. Tal termo também foi assinado pelos familiares responsáveis das
pessoas já falecidas. Até o momento temos 15 blocos de tumores.
Para os familiares falecidos dos probandos foram pedidos os prontuários para que
tivéssemos acesso aos laudos de biópsias para comprovação do câncer, para preenchimento dos
protocolos e para fazermos os pedidos dos blocos dos tumores.
Dentre as 13 famílias encontramos em média 5,7 afetados com câncer por família, sendo
mais da metade casos de câncer colorretal(CCR). Entre vivos e falecidos houve 39 casos de CCR,
com idade média de aparecimento aos 43 anos. O número máximo que houve de afetados em uma
única família foi de 9 casos de CCR. A idade mínima encontrada entre os afetados entrevistados
para o aparecimento do CCR foi de 26 anos.
Em relação à outros cânceres encontramos 8 casos de câncer de estômago, 4 de câncer de
endométrio, 2 de câncer de mama, 3 de câncer de útero, 3 de câncer de garganta, 2 de câncer de
fígado, entre outros.
A detecção da mutação permitirá identificar os indivíduos que apresentam um risco em
desenvolver carcinoma e os familiares portadores, mesmo que assintomáticos.
A identificação de indivíduos em risco para o câncer hereditário é de grande importância,
pois vai permitir que indivíduos afetados tomem conhecimento de que apresentam um risco
aumentado em relação a população e de que existem protocolos de rastreamento ou guias de
conduta a serem seguidos para a redução deste risco. Medidas de rastreamento intensivo e
intervenções preventivas (cirurgias profiláticas e quimioprofilaxia) se mostram eficazes em reduzir
significativamente o risco de câncer em portadores de mutação. (Rebbeck, 1999; Hartmann et al.,
1999; Eisen, 2000; Hartmann et al., 2001; Meijers-Heijboer et al., 2001; Shih et al., 2002; Kauff et
al., 2002; Rebbeck, 2002; Eisen et al., 2005).
A identificação da mutação em um indivíduo não afetado vai permitir a diminuição da
ansiedade do indivíduo e de sua família, assim como a redução dos custos com rastreamento e
intervenções preventivas desnecessárias. (Grusenmeyer et al., 2007; Meropol et al., 2007).
Os pacientes com a síndrome de Lynch devem ser acompanhados periodicamente, assim
como seus familiares que apresentam risco em desenvolver o câncer. O acompanhamento deve
incluir colonoscopia com um a dois anos de intervalo, com início entre 20-25 anos; exame
ginecológico com ultrassonografia transvaginal e biópsia aspirativa anual, com início entre 30-35
anos; endoscopia digestiva alta, especialmente se há câncer gástrico na família, com um a dois
anos de intervalo, com início entre 30-35 anos; ultrassom abdominal; urianálise e citologia
urinária, com um a dois anos de intervalo, com início entre 30-35 anos.
A realização periódica dos exames indicados possibilita que tumores sejam detectados em
estágio inicial, evitando procedimentos de alto custo necessários no tratamento de tumores
avançados, como cirurgias de grande porte e longas internações, assim como, tratamentos
quimioterápicos. Desta forma, pacientes e familiares que apresentam alto risco para o
desenvolvimento de tumores, muitas vezes assintomáticos, podem receber um acompanhamento
individualizado visando à detecção precoce de tumores.
CONCLUSÕES
Ainda não há resultados das análises genéticas para o levantamento de conclusões segundo
alguns dos objetivos propostos inicialmente.
REFERÊNCIAS
1.
Feuk, L et al. Structural variation in the human genome. Nat Rev Genet, 7, 85-97, 2006.
2.
McCarroll, SA and Altshuler, DM. Copy-number variation and association studies of human
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Beckmann, JS et al. Copy number variants and genetic traits: closer to the resolution of
phenotypic to genotypic variability. Nat Rev Genet, 8, 639-646, 2007.
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predisposition syndrome. Proc Natl Acad Sci USA, 105, 11264-11269, 2008.
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Rebbeck, TR. Inherited genetic predisposition in breast cancer. A population-based
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17. Sebat, J et al. Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Science, 305,
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