UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC:
CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, PIBIT E
FAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: agosto/2014 à julho/2015
(
) PARCIAL
( X ) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: A base genética de variação fenotípica e inovação
evolutiva no peixe de quatro olhos Anableps anableps.
Nome do Orientador: Patricia Neiva Coelho Schneider
Titulação do Orientador: Doutora
Faculdade: Faculdade de Biotecnologia
Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas/ICB
Laboratório: Laboratório de Evolução e Desenvolvimento de Vertebrados
Título do Plano de Trabalho: Descrição e morfometria ontogenética dos
embriões do peixe de quatro olhos Anableps anableps.
Nome do Bolsista: Jamily Lorena Ramos de Lima
Tipo de Bolsa: ( X ) PIBIC/FAPESPA
RESUMO DO RELATÓRIO ANTERIOR
No relatório anterior, os parâmetros morfométricos quantitativos e qualitativos
para descrição dos estágios de desenvolvimento de Anableps anableps foram
definidos através de levantamento bibliográfico e análise de larvas obtidas em
coletas. Foram estabelecidos 6 estágios de desenvolvimento para A. anableps, com
ênfase no desenvolvimento de estruturas oculares. Seguindo esta metodologia, no
presente trabalho, o n amostral foi aumentado para confirmar a definição dos
estágios, além disso análise ontogenética de estruturas do neurocrânio foi realizada.
INTRODUÇÃO:
Durante o desenvolvimento do sistema nervoso central, vários processos
morfogenéticos em conjunto com a migração de linhagens celulares dão origem às
estruturas que formarão o cérebro. Os olhos de vertebrados são estruturas
altamente complexas e especializadas onde a integração de fatores morfogenéticos
pode ser observada. O primeiro indício de surgimento da estrutura precursora dos
olhos, a vesícula ótica, é visto durante a formação e maturação do cérebro anterior
ou prosencéfalo, num processo de evaginação do prosencéfalo onde um grupo de
células migra e forma o campo ocular. Este campo ocular pode ser visualizado
através da análise de expressão de genes que fazem parte da rede de formação e
especificação dos olhos na placa neural anterior (Chuang & Raymond, 2002; Jadhao
& Pinelli, 2001).
O gênero Anableps (Cyprinodontiformes, Anablepidae), compreende três
espécies: A. anableps, A. microlepis e A. dowi. As duas primeiras ocorrem no
Atlântico Ocidental, que se restringe desde o Golfo de Paria na Venezuela até o
Delta do Parnaíba, no estado do Piauí. A terceira espécie, é restrita ao Pacífico
Oriental (Cervigón et al., 1993). O gênero Anableps pertence ao grupo dos
Cyprinodontiformes, são vivíparos com fertilização interna, e se reproduzem
continuamente ao longo do ano. Alguns estudos já descreveram entre 4 à 7 estágios
de desenvolvimento larval (Nascimento et al., 2008; Oliveira et al., 2011; Cavalcante
et al 2012). A espécie A. anableps habita estuários, mas também pode ser
encontrada em águas rasas do litoral, sendo menos frequente em ambientes
marinhos. Os indivíduos vivem em cardumes e não migram grandes distâncias
(Miller, 1979; Oliveira et al., 2011).
Peixes do gênero Anableps são popularmente conhecidos como tralhotos ou
peixes de quatro olhos por possuírem adaptações morfológicas únicas nos olhos,
caracterizadas por olhos extremamente grandes em relação ao tamanho da cabeça
e divisão de estruturas oculares. Estas adaptações permitem com que estes peixes
sejam capazes de obter uma visão simultânea dos ambientes aéreo e aquático onde
diferenças de luminosidade, passam através da retina com intensidades diferentes.
A principal diferença entre a estrutura ocular deste gênero e a de peixes que
possuem exclusivamente visão aquática é a duplicação da córnea e da pupila, e
retina funcionalmente duplicada. Em Anableps, a luz proveniente do ambiente
aéreo, ou aquático, entra pela córnea e pupila dorsal, ou córnea e pupila ventral
respectivamente. A luz então passa por um único cristalino e incide na retina. Esta
por sua vez possui expressão diferenciada de fotorreceptores (opsinas) presentes
na retina dorsal (que recebe luz proveniente do ambiente aquático) e na retina
ventral (luz proveniente do ambiente aéreo) (Owens et al., 2009; Puelles et al.,
2006).
JUSTIFICATIVA:
O olho de vertebrados é um órgão altamente especializado que ao longo da
evolução manteve-se consideravelmente inalterado. A mais comum modificação à
estrutura ocular é a perda de olhos, associada à adaptação ao ambiente de pouca
ou nenhuma luminosidade. Entretanto, adaptações envolvendo ganho de função,
apesar de raras, também ocorrem e peixes do gênero Anableps são um notável
exemplo desta categoria. A. anableps possui duplicação completa da pupila e
córnea, além de duplicação funcional da retina. Estas inovações morfológicas
permitem o processamento de imagens oriundas tanto do ar quanto da água.
A biologia evolutiva do desenvolvimento (evo-devo) tem como objetivo
essencial explicar variação fenotípica, de valor adaptativo ou não, através de
mudanças em programas do desenvolvimento embrionário. Para tanto, a utilização
de organismos-modelo foi e tem sido fundamental para elucidar as bases
embriológicas e genéticas dos conceitos de modularidade e homologia, os
mecanismos por trás do surgimento independente de morfologias similares em
múltiplos taxa (homoplasia) ou de inovações evolutivas. Entretanto, cada organismomodelo representa um ponto amostral no espectro de morfologias ocorrentes em um
dado táxon. Portanto, é necessário expandir para além dos modelos clássicos, de
forma que novas espécies ofereçam oportunidade para o estudo de características
diferentes daquelas observadas em organismos-modelo já estabelecidos. Neste
contexto, o peixe de quatro olhos do gênero Anableps proporciona oportunidade
singular para o estudo de variação e inovação fenotípica de olhos.
OBJETIVOS:
Objetivo geral:
Caracterização ontogenética dos estágios larvais de Anableps anableps e análise da
duplicação ocular parcial ao longo do desenvolvimento.
Objetivos específicos:
- Coleta e obtenção de embriões de Anableps anableps;
- Análise morfométrica e ontogenética para auxiliar a descrição dos estágios larvais
desta espécie.
MATERIAL E MÉTODOS:
Coletas
Duas coletas de Anableps anableps foram realizadas nos meses de setembro
e dezembro de 2014. As coletas ocorreram no Furo da Ostra, em Bragança – Pará,
Brasil (00°53’28” S, 46°39’22” W), utilizando-se de redes de arrasto (40mm x 40mm)
(Figura 1). As fêmeas foram transportadas em água oxigenada até o laboratório
onde foram sacrificadas e os embriões obtidos por remoção dos ovários com auxílio
de tesouras e pinças cirúrgicas.
Figura 1: Mapa do local de coleta de A. anableps no Furo da Ostra em Bragança, PA.
Processamento das larvas
Para caracterização dos estágios de desenvolvimento, as larvas foram
processadas logo apos serem coletadas, seguindo protocolo da tabela 1.
Tabela 1: Processamento das larvas.
Etapas
Duas lavagens em 1xPBS.
Fixação em 4% paraformaldeído overnight à 4°C.
Desidratação em lavagens graduais: 1)100% PBS; 2) 75% PBS/25% Metanol; 3)
50% PBS/50% Metanol; 4) 25% PBS/75% Metanol; 5) 100% Metanol (duas vezes),
10 minutos cada e armazenadas em -20°C.
Esta pesquisa foi aprovada pelo Ministério de Meio Ambiente (MMA) 12773-1
concedido à Profª. Iracilda Sampaio. Todos os procedimentos foram realizados de
acordo e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Pará.
Biometrias
Para a caracterização dos estágios do desenvolvimento, os seguintes
parâmetros morfométricos foram adotados: comprimento total, diâmetro ocular,
perímetro ocular, distância entre olhos e, observações qualitativas de padrões de
pigmentação, quantidade de vitelo e desenvolvimento de estruturas oculares
(Pereira et al., 2006; Oliveira et al., 2011). Biometrias e fotografias foram realizadas
com o auxílio de lupas, réguas e dos programas Motic Imagens Plus 2.0. e câmera
LUMIX-FZ150.
Figura 2: Demonstração de como foram medidos os parâmetros morfométricos quantitativos das larvas. Na foto, larva do
estágio 2. Em A, a seta de ponta dupla para diâmetro do olho e linha pontilhada para o perímetro ocular (aprox. 2.0); Em B, as
pontas da seta indicam a distância entre os olhos (aprox. 0.8); Em C, a linha mostra como foi medido o comprimento total do
animal.
Osteologia
O protocolo utilizado para análise osteológica consistiu em dupla coloração
para cartilagem e ossos. A técnica de diafanização foi adaptada de Taylor & Van
Dyke (1985) (Tabela 2). Ao todo, 23 indivíduos foram analisados. Após dissecação,
o Neurocrânio foi fotografado dorsal e lateralmente usando Axiocam 105 color
acoplada a esteromicroscópio Zeiss stereomicroscope e Zen Software com manual
Z-Stacking. Medidas dos espécimes diafanizados foram adotadas em termos de
tamanho da notocorda (NL) para larvas pre-flexionadas e comprimento padrão (SL)
para larvas totalmente flexionadas.
Tabela 2: Protocolo de processamento das larvas para diafanização.
Etapas
Duração
Fixados em PFA 4%
24 hrs
Desidratação com
lavagens graduais de
PBS/Metanol
10 min cada
Especificações
Remoção de olhos e
vísceras
1.
1x PBS (2 vezes)
2.
75% PBS + 25% MeOH
3.
50% PBS + 50% MeOH
4.
25% PBS + 75% MeOH
5.
100% MeOH (2 vezes)
Com auxílio de pinças e tesouras
cirúrgicas
Coramento de
cartilagem com Alcian
Blue 8GX
24 hrs
0.03g Alcian Blue 8GX em
solução de 40% ácido acético
glacial e etanol absoluto
Neutralização
48 hrs
Solução de borato de sódio
Clareamento
De 30 min à 2 hrs
(depende do
tamanho do
indivíduo)
Solução de peróxido de
hidrogênio (H2O2) 10%/solução
de hidróxido de potássio (KOH)
0.5%
Limpeza
12 horas
Enzima tripsina diluída em borato
de sódio 30% (0.45g tripsina
purificada em 400 ml de 30%
borato de sódio)
Coramento ósseo
24 hrs
0.5% KOH em 0.1% alizarina
vermelha
Limpeza
12 hrs
Lavagem em água destilada, e
colocadas novamente em
tripsina quando necessário
(Armazenamento
em -20ºC)
1) glicerol 40% + KOH 0.5%60%;
Lavagens em
glicerol/KOH 0.5%
12 horas cada
2) glicerol 70% + KOH 0.5%30%;
3) glicerol 100%
As larvas processadas para diafanização foram analisadas com enfase no
padrão de ossificação do neurocranio, em colaboração com o Dr. George Mattox da
Universidade de São Carlos, São Paulo. Ao todo, foram realizadas triplicata de cada
um dos seis estágios larvais.
RESULTADOS:
Coletas
Duas coletas de Anableps anableps foram realizadas nos meses de setembro e
dezembro de 2014. Ao todo, 17 e 18 fêmeas grávidas capturadas respectivamente.
Apenas embriões da coleta 1 foram contabilizados até o momento (Tabela 3). As
119 larvas obtidas na coleta 1 foram classificadas em seis diferentes estágios de
desenvolvimento de acordo com parâmetros quantitativos e qualitativos previamente
descritos.
Figura 3: Anableps anableps. (A) Indivíduo adulto. (B) Morfologia externa do olho. (C) Desenho esquemático das estruturas
oculares (córnea dorsal (DCo), córnea ventral (VCo), íris (Ir), faixa de pigmento (PS), pupila dorsal (DP), pupila ventral (VP),
epitélio pigmentado da retina (RPE), retina dorsal (DR), retina ventral (VR), nervo óptico (OpN), cristalino (L), coróide (Cr),
camada de células ganglionares (GCL), camada interna (INL), camada externa (ONL).
Biometrias
Ao todo, dez representantes de cada estágio foram medidos para definição
dos parâmetros morfométricos. Média e desvio padrão das medidas foram
cauculados (tabela 3).
Tabela 3: Parâmetros quantitativos para definição dos estágios de desenvolvimento.
Estágios de desenvolvimento larval
Medidas
(mm)
1
2
3
4
5
6
Compriment
o total
4,5 ± 0,79
8,41 ± 0,85
19 ± 1,57
27 ± 3,9
39,85 ± 2,34
61 ± 1,25
Diâmetro
ocular
0,29 ± 0,05
0,44 ± 0,08
1,33 ± 0,04
2,04 ± 0,05
2,24 ± 0,05
2,61 ± 0,18
Perímetro
ocular
0,93 ± 0,1
1,46 ± 0,23
4,2 ± 0,17
6,16 ± 0,22
6,79 ± 0,32
8,42 ± 0,51
Distância
interorbital
0,49 ± 0,11
1,04 ± 0,26
3,37 ± 0,18
4,53 ± 0,35
5,44 ± 0,36
5,69 ± 1,1
A partir dos parâmetros de classificação previamente definidos, as larvas
restantes foram classificadas em um os estágios de desenvolvimento. Todas as
larvas de uma mesma fêmea encontravam-se no mesmo estágio (Figura 4).
Figura 4: Estágios larvais de Anableps anableps. Representantes dos estágios larvais 1, 2, 3, 4, 5, e 6, em A, C, E, G, I e K,
respectivamente. Figuras a direita são ampliações da região ocular dos indivíduos à esquerda. Escala: A, C, E, G, I e K (5
mm); B, D, F, H, J e L (500µm).
Das 122 fêmeas capturadas, 118 estavam grávidas, obteve-se 826 larvas em
vários estágios de desenvolvimento. Cada fêmea apresentou entre 1 à 26
embriões/larvas em desenvolvimento. A identificação dos estágios larvais foi obtida
através de coleta de dados morfométricos associados ao desenvolvimento dos olhos
(média aritmética de comprimento total corporal, diâmetro do olho, perímetro ocular,
e distância entre os olhos) (Figura 4).
No estágio 1, larvas com média de 4,5mm de comprimento total já possuem
olhos pigmentados, mas a divisão transversão da pupila ainda não é visível; pontos
de pigmentação já estão presentes na região dorsal da cabeça, vitelo presente de
coloração clara. (Figura 4A, B).
No estágio 2, o comprimento total médio é de 8,41mm, com larvas que
possuem corpo esbranquiçado, pupilas ainda não divididas, pigmentação na região
dorsal da cabeça, vitelo vascularizado de coloração rósea-alaranjada (Figura 4C, D).
No estágio 3, larvas apresentam comprimento médio de 19mm, pigmentação
dispersa ao longo do corpo; início da divisão da córnea e pupila já é visível; início do
padrão de formação das escamas; vitelo altamente vascularizado e presença da
linha lateral pigmentada (Figura 4E, F).
Larvas no estágio 4 (comprimento total de 27mm) possuem corpo bastante
pigmentado, a divisão da córnea e pupila avança com presença de pontos de
pigmentos na região média-lateral do olho, mas estas estruturas ainda não estão
completamente divididas (Figura 4G, H).
No estágio 5, larvas com média de 39,85mm de comprimento total possuem
pigmentação no corpo inteiro, pigmentação na região mediana do olho (onde a
divisão da córnea e pupila ocorre); córnea e pupila ainda não estão completamente
divididas. Linha dorsal em formato de “Y” já é evidente, início da redução do vitelo
(Figura 4 I, J).
No estágio 6, la rvas já possuem padrão de pigmentação semelhante ao
adulto; com comprimento total médio de 69mm, pupila e córnea completamente
divididas; vitelo completamente absorvido; nadadeiras peitorais pigmentadas (Figura
4 K, L).
Ao todo, 150 larvas foram classificadas de acordo com os parametros
quantitativos e qualitativos previamente descritos (Tabela 4).
Tabela 4: Quantidade total de larvas classificadas por estágio
Estágios larvais
Quantidade de larvas
1
11
2
5
3
68
4
32
5
20
6
14
Total
150
Diafanização: Análise osteológica do neurocânio de larvas de Anableps
anableps
A análise osteologica foi utilizada para confirmar o estagiamento
morfométrico já realizado, através da obtenção de informações importantes quanto
à sequência de ossificação neurocraniana durante o desenvolvimento nesta espécie
(Figura 5).
Figura 5: Diafanização dos estágios larvais e juvenis de Anableps anableps. Representantes de cada estágio larval antes (AF) e após o processo de diafanização (A’-F’). Representantes dos estagios 1, 2, 3, 4, 5, e 6 (A, B, C, D, E e F,
respectivamente).
Expansão dorso-lateral do frontal
A mais conspícua característica osteológica no crânio de Anableps é o
desenvolvimento dorsal do frontal, formando uma cobertura óssea medial em
relação à órbita que se desenvolve ultrapassando o perfil dorsal da cabeça. Não há
sinais de ossificação no estágio 3 (Figura 6B e C, anterior direita). O início da
ossificação do neurocrânio aparece no estágio 4, quando o frontal é visto como uma
fina estrutura óssea ao longo da margem mediana de taenia marginalis anterioris
(Figura 6B e C, anterior esquerda). O neurocrânio em geral ainda é pouco
desenvolvido e incluem além dos frontais, apenas paresfenóide, esfenótico, próótico, basioccipital, exoccipital e a ponta do pterótico. No estágio 5, o
desenvolvimento do frontal avança com expansão medial em direção a região
contralareral, e uma porção lateral laminar, projetada do restante de taenia
marginalis anterioris. A expansão medial também é desenvolvida posteriormente. A
expansão lateral laminar é inclinada dorsolateralmente a partir de taenia, formando
um sulco entre as duas porções laminares (Figura 6B e C, posterior direita). No
estágio 6, o frontal continua a se expandir posteriormente além da barra epiphyseal
e medialmente em direção a região contralateral (Figura 6B e C, posterior esquerda)
ele encosta posteriormente ao parietal, que também está desenvolvido
anteriormente, assim como o frontal contralateral, unindo-os.
Figure 6: Dorsolateral expansão do frontal durante A. Anableps desenvolvimento. (A) Início da ossificação do neurocrânio,
larva no estágio 3. (B e C) Estágios 3, 4, 5 e 6 (sentido anterior-posterior, direita-esquerda em todos os painéis. Vista dorsal (A
e B) vista lateral (C). Seta indica localização do frontal em todos os painéis.
CONCLUSÃO:
O olho relativamente grande de Anableps com pupila e córnea divididas
transversalmente tem sido uma característica marcante do gênero e a expansão
dorsal do frontal para acomodação do olho foi interpretada como uma autapomorfia
do gênero. O presente trabalho descreve brevemente o desenvolvimento desta
expansão que tem início pouco perceptível depois que frontal aparece e
rapidamente se desenvolve dorsalmente acompanhando o crescimento dorsal da
órbita ocular. Vale ressaltar que o início da expansão dorsolateral do frontal coincide
com o início da divisão transversal da pupila (e.g., estágio 3) sugerindo que estes
dois eventos possam estar relacionados durante o processo ontogenético.
PUBLICAÇÕES
Poster apresentado no EVO-DEVO PAN-AM, Pan-American Society for
Evolutionary Developmental Biology, Inaugural 2015 Meeting
Co-autores bolsistas IC: Jamily Lima, Maysa Araújo.
Resumo:
The evolution and development of the eye has intrigued developmental biologists for
centuries. Aside from partial or complete loss, few vertebrates display substantial
modifications to the eye morphology. The four-eyed fish Anableps anableps consists
in a unique model system to study eye Evo-Devo due to its distinctive feature of
having duplicated eye structures. This species is commonly found in the amazon
region and reproduces throughout the year. Featuring “split eye” this species is
capable of looking above and under the water level and has duplicated structures
such as pupils and cornea and a functionally duplicated retina. The retina is divided
into dorsal and ventral regions and photoreceptors have been shown differential
expression pattern in the adult fish. Our goal is to describe these larval stages and to
characterize morphological and molecularly the retina during eye development. We
have identified at least six distinct developmental stages for A. anableps.
Furthermore, our transcriptome analysis has identified visual and non-visual opsins
expressed in developing eyes. We find asymmetric opsin protein expression in the
developing retina. The result of this study will shed light on the molecular basis of
this innovative feature.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Taylor, W. R. & G. C. van Dyke. Revised procedures for staining and clearing small
fishes and other vertebrates for bone and cartilage study. Cybium, v.9, p.107-119.
1985.
PARECER DO ORIENTADOR:
A aluna Jamily Ramos realizou tanto o trabalho de levantamento bibliográfico quanto
o de experimentação laboratorial com grande independência. Durante o período de
estágio, Jamily apresentou o trabalho em eventos nacionais e internacionais e
ganhou um prêmio do NSF (National Science Foundation) para um estágio de 10
semanas em um laboratório nos Estados Unidos, na Universidade de Chicago.
Jamily é uma aluna excepcional, que consegue combater as adversidades e
executar as tarefas que lhe são dadas.
DATA : 10/08/2015
_________________________________________
ASSINATURA DO ORIENTADOR
Jamily Lorena Ramos de Lima
ASSINATURA DO ALUNO
INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Em caso de aluno concluinte, informar o destino
do mesmo após a graduação. Informar também em caso de alunos que
seguem para pós-graduação, o nome do curso e da instituição.
A aluna dará início à pos graduação após terminar a graduação.