Expressão gênica em procariotos: fundamentos e aplicações

SUMÁRIO
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos
Departamento de Medicina Veterinária
1. Organização genômica
2. Expressão gênica
3. Mecanismos de transferência genética
4. Operon
EXPRESSÃO GÊNICA EM PROCARIOTOS:
FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES
5 Aplicações
A li õ em Biotecnologia
Bi t
l i
5.
Prof. Dr. Ricardo L. M. de Sousa
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA

ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
4
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
A célula procariótica

cromossomo único, circular,
dupla fita, no nucleóide

DNA extra-cromossomal 
plasmídeos

uso de quase todo genoma na
codificação
e
regulação
(ausência
de
seqüências
reduntantes)

colinearidade  genes →
produtos protéicos
Tortora et al., 2005
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
Prokaryotic Chromosomes
Eukaryotic Chromosomes
 Many prokaryotes contain a single
 Eukaryotes contain multiple linear
circular chromosome.
chromosomes.

Prokaryotic chromosomes are
condensed in the nucleoid via DNA
supercoiling and the binding of
various proteins (HU, IHF).

Because prokaryotic DNA can
interact with the cytoplasm,
transcription and translation occur
simultaneously
simultaneously.

Most prokaryotes contain only one
copy of each gene (i.e., they are
haploid).
Nonessential prokaryotic genes are
commonly encoded on
extrachromosomal plasmids.


5
Prokaryotic genomes are efficient
and compact, containing little
repetitive DNA.

Eukaryotic chromosomes are
condensed in a membrane-bound
nucleus via histones.

In eukaryotes, transcription occurs
in the nucleus, and translation
occurs in the cytoplasm.

Most eukaryotes contain two copies
of each gene (i.e., they are diploid).

Some eukaryotic genomes are
organized into operons, but most are
not.

Extrachromosomal plasmids are not
commonly present in eukaryotes.

Eukaryotes contain large amounts of
noncoding and repetitive DNA.
Griswold, 2008
6
Blumberg, 2004
1
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
7
Madigan et al., 2010
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
8
Garland Science, 2008
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
Madigan et al., 2010
9
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
Madigan et al., 2010
10
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA

ORGANIZAÇÃO GENÔMICA

DNA superenovelado (supercoiled): DNA girase  4,6 × 106 pb
DNA girase (toposiomerase)
esticados em 1mm = 1000 vezes > célula, mas ocupa 10% do volume
celular
11
Griswold, 2008
12
Madigan et al., 2010
2
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA

ORGANIZAÇÃO GENÔMICA

Cromossomo bacteriano
13
Griswold, 2008
14
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA

ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
Plasmídeos

DNA extra-cromossomal de replicação autônoma (replicons)

fita dupla, 1-1000kb, circular, replicação similar a cromossomo

pequenos (várias cópias por célula), grandes (cópia única)

ações: produção de toxinas, bacteriocinas, adesinas, resistência
a antibióticos (plasmídeos R ou fatores R)
16
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
17
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
Plasmídeos


alguns com genes de transferência (conjugativos)
conjugação  plasmídeo F ou plasmídeos tipo-F

capacidade de integração ao cromossomo

plasmídeos de resistência (R)
Prescott, 2008
Ferreira, 1997
15

Mapa genético cromossomal de Escherichia coli

Plasmídeos F


Tortora et al., 2005
18
IS2 e IS3: seqüências de
inserção
: transposon (Tn1000)

tra genes: síntese de pilus
e conjugação

rep genes: replicação de
DNA

oriV: início de replicação
para DNA circular

oriT: início da replicação
círculo-rolante
e
transferência gênica
Prescott, 2008
3
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA

19
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
Elementos transponíveis

Seqüências
de
inserção:
seqüências curtas (750 a
1600pb),
transposase
+
repetições invertidas de bases

Transposons
complexos:
genes: toxinas, resistência a
antibióticos
antibióticos,
transposase
(evento raro = 10-7/geração)
Prescott, 2008

Transposon
20
Tortora et al., 2005
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA

ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
Transposon

Madigan et al., 2010
21
22
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA

23
Transposon
Madigan et al., 2010
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
Transposon  Mutagênese
Madigan et al., 2010
24
Prescott, 2008
4
REPLICAÇÃO DO DNA
EXPRESSÃO GÊNICA
26
Madigan et al., 2010
REPLICAÇÃO DO DNA
Madigan et al., 2010
27
REPLICAÇÃO DO DNA
Madigan et al., 2010
28
REPLICAÇÃO DO DNA
REPLICAÇÃO DO DNA


29
Replicação bidirecional
http://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0&feature=related
Madigan et al., 2010
30
Madigan et al., 2010
5
REPLICAÇÃO DO DNA

TRANSCRIÇÃO
Mecanismo de revisão: atividade de exonuclease (3’ 5’) da DNA
polimerase III
Madigan et al., 2010
32
TRANSCRIÇÃO
33

Fator sigma principal de E. coli: 70

cerne: α2  ’ 
Madigan et al., 2010
Marques, 2012

cerne: α2  ’ 

Promotor: sítio de
iniciação à síntese de
RNA
TRANSCRIÇÃO
34
TRANSCRIÇÃO
35
RNA
polimerase:
subunidades α  ’  
Madigan et al., 2010
31

Madigan et al., 2010
TRADUÇÃO
36
Madigan et al., 2010
6
DOBRAMENTO E SECREÇÃO DE PROTEÍNAS
DOBRAMENTO E SECREÇÃO DE PROTEÍNAS


chaperonas moleculares
ou
chaperoninas:
dobramento correto

maioria: dobramento
espontâneo junto com a
ç
tradução
seqüência sinal: 15 a 20 aa
 proteína
pronta para
ser exportada
 impede
o dobramento
completo
(SRP)
Madigan et al., 2010
37
Madigan et al., 2010
38
REGULAÇÃO DO FATOR SIGMA 32

resposta ao choque térmico: sigma 32 e chaperonas
MECANISMOS DE TRANSFERÊNCIA
GENÉTICA
Marques, 2012
39
TRANSFERÊNCIA GENÉTICA

41
Conjugação
TRANSFERÊNCIA GENÉTICA


transferência de DNA de uma bactéria para outra, envolvendo
o contato entre as duas células: doadora (F+) e receptora (F-)

depende de genes localizados no operon tra plasmidial: síntese
do pilus F (contato) e transferência do DNA plasmidial

plasmídeos podem ser integrados ao cromossomo  células
Hf
Hfr (Hi
(High
hF
Frequency off R
Recombination):
bi ti ) 1 em cada
d 105 células
él l
Madigan et al., 2010
Ponte de Conjugação (Pilus ou
Fímbria sexual)
42
7
TRANSFERÊNCIA GENÉTICA
Madigan et al., 2010
43
TRANSFERÊNCIA GENÉTICA
Madigan et al., 2010
44
TRANSFERÊNCIA GENÉTICA
Prescott, 2008
45
TRANSFERÊNCIA GENÉTICA
Tortora et al., 2005
46
TRANSFERÊNCIA GENÉTICA

47
TRANSFERÊNCIA GENÉTICA
Transformação


Captação de molécula
de DNA ou fragmento
do meio e incorporação
no genoma da bactéria

DNA
captado:
simples (maioria)
Transformação
fita
Madigan et al., 2010
48
Prescott, 2008
8
TRANSFERÊNCIA GENÉTICA

TRANSFERÊNCIA GENÉTICA
Transdução (DNA viral)
49

Prescott, 2008
Transdução
Madigan et al., 2010
50
Controle da
expressão gênica
CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA
51
OPERON

OPERON
Expressão gênica



Operon: grupo de genes relacionados, transcritos em
conjunto  unidade de expressão gênica (genes estruturais
+ elementos que controlam a expressão). Composto por 3
partes:

Promotor: sítio de ligação da RNA-polimerase

Operador: sítio de ligação de proteínas regulatórias

Genes estruturais contíguos
Operon lac  codifica enzimas utilizadas no catabolismo da lactose
(galactose + glicose). Lactose = indutor
gene lacI
Z
Operon é transcrito em um único mRNA policistrônico
(codifica mais de uma cadeia polipeptídica)
Y
hidrólise da lactose
transporte da lactose para dentro da célula
53
Madigan et al., 2010
A
acetila lactose nãohidrolisados 
eliminação da célula
54
9
OPERON

OPERON
Operon lac  codifica enzimas utilizadas no catabolismo da lactose
(galactose + glicose). Lactose = indutor (operon indutível)
55
56
OPERON
OPERON
indução
enzimática
57
Tortora et al., 2005
Tortora et al., 2005
58
OPERON
OPERON

Operon triptofano  codifica enzimas utilizadas na síntese de
triptofano. Exemplo de operon repressível
AMP cíclico é um
alarmônio  sinal de
alarme celular em
resposta ao estresse
ambiental ou nutricional
Repressor
inativo 
operon ligado
(ausência de
triptofano)
CRP: proteína receptora
de AMP (adenosina
monofosfato) cíclico
repressão enzimática
59
Tortora et al., 2005
60
Tortora et al., 2005
10
OPERON

OPERON
Operon triptofano
Repressor
ativo 
operon
desligado
(presença de
triptofano)
61
Tortora et al., 2005

Repressão enzimática  afeta enzimas biossintéticas (anabólicas).
Ex.: operon triptofano, operon arginina

Indução enzimática  afeta as enzimas degradativas (catabólicas).
Ex.: operon lac
Madigan et al., 2010
62
PLASMÍDEOS

Aplicação de plasmídeos em tecnologia do DNA recombinante
APLICAÇÕES EM BIOTECNOLOGIA
oriV de alto número de cópias
(>100): pUC, pBR322, pET
64
PLASMÍDEOS

65
PLASMÍDEOS
Aplicação de plasmídeos em tecnologia do DNA recombinante

Aplicação de plasmídeos em tecnologia do DNA recombinante
66
11
PLASMÍDEOS
67
Prescott, 2008
PLASMÍDEOS
68
Prescott, 2008
PLASMÍDEOS
PLASMÍDEOS

69
Prescott, 2008
Alfacomplementação
Marques, 2012
70
PLASMÍDEOS
PLASMÍDEOS

71
72
Vetor de Expressão
Marques, 2012
12
PLASMÍDEOS

73
VACINAS DE DNA

Aplicação de proteínas recombinantes
Prescott, 2008
Mecanismo de ação

composição  DNA de interesse inserido em plasmídeo
bacteriano com promotor forte (citomegalovírus humano)

injeção no músculo ou intra-dérmica (melhores resultados),
mas também endovenoso, intranasal, subcutânea

administração: biobalística (gene gun)  DNA + partículas de
ouro
74
Koide et al., 2000
VACINAS DE DNA
VACINAS DE DNA
Shedlock & Weiner, 2000
75
Beard & Mason, 1998
76
VACINAS DE DNA
VACINAS DE DNA

Vantagens

dispensa o cultivo de agentes infecciosos

não há risco de reversão de virulência

não apresenta risco para animais jovens ou imunossuprimidos

maior imunogenicidade: apresentação de proteínas na forma
nativa
ti

77
78
opção para microrganismos de difícil cultivo ou atenuação

baixo custo de produção, administração e conservação (estável
em temperatura ambiente)

vacinas para múltiplos agentes e única administração (100 a
1000 microgramas de DNA)
Beard & Mason, 1998
13
VACINAS DE DNA

Desvantagens

79
VACINAS DE DNA
integração do DNA plasmidial no genoma do hospedeiro 
inativação de genes supressores de tumor ou ativação de
oncogenes  neoplasia

existência de genes de resistência a antibióticos no vetor

produção de anticorpos anti
anti-DNA
DNA

possibilidade de tolerância

ineficiente captura do DNA pela célula ou pelo núcleo

degradação do DNA em lisossomos
Dubensky et al, 2000
80
VACINAS DE DNA
Koide et al., 2000
81
Koide et al., 2000
VACINAS DE DNA
82
Beard & Mason, 1998
VACINAS DE DNA
83
Prud’homme, 2005
14