Microorganismos

54º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
Bahia Othon Palace Hotel • Salvador • BA • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
Estresses ambientais inibem o splicing no
fungo aquático Blastocladiella emersonii
Georg, RC; Gomes, SL
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: cádmio, choque térmico, splicing, íntrons
A exposição a estresses ambientais leva à interrupção de vários processos intracelulares, em particular aqueles realizados
por complexos macromoleculares como o spliceossomo, que são extremamente sensíveis à perturbação em condições
de estresse. Durante o seqüênciamento de bibliotecas de cDNA, construídas a partir de RNA de células de B. emersonii
submetidas a estresses (choque térmico e cádmio), verificamos um grande número de ESTs com seqüências intrônicas
putativas. Dentre as 6.350 ESTs seqüenciadas nas bibliotecas de estresse, 181 ESTs (correspondendo a 85 genes diferentes)
apresentavam íntrons, ou seja, 3% das ESTs. Quando esta mesma análise foi feita para bibliotecas de cDNA obtidas a
partir de RNA de células não submetidas a estresse, observamos que as ESTs que apresentaram íntrons correspondiam
a apenas 0,3% do total. Estes dados indicam fortemente um enriquecimento de ESTs com íntrons nas bibliotecas de
estresse, que pode ser decorrente da inibição do splicing nessas condições. Com o intuito de caracterizar as ESTs que
apresentaram íntrons realizamos uma busca manual por junções de splicing conservadas nas regiões que flanqueavam
as possíveis seqüências intrônicas e por seqüências similares às seqüências consenso de sítios de ramificação presentes
dentro do provável íntron. Dos 85 genes que apresentaram íntrons nas bibliotecas de cDNA de estresse, 19 possuíam
mais de um íntron em sua seqüência e três apresentaram três íntrons. O tamanho dos íntrons variou desde 53 até 333
nucleotídeos, sendo que a maioria dos íntrons tinha entre 50 e 90 nucleotídeos. As junções de splicing canônicas do
tipo GT-AG foram observadas em grande parte dos íntrons. Os sítios de ramificação também seguiram o consenso
observado para outros íntrons descritos em B. emersonii. Estes dados indicam que as junções de splicing observadas
nos mRNAs com splicing inibido pelo estresse não são diferentes das junções observadas na maioria dos mRNAs
que estão presentes na célula, sugerindo que o processo de inibição do splicing pelo estresse pode ser aleatório. Para
confirmar se estresses ambientais interferem no correto processamento dos íntrons realizamos ensaios de Northern
blot utilizando como sonda o cDNA do gene gpx3-1 de B. emersonii, um dos que apresentaram ESTs com seqüências
intrônicas. Observou-se que após o tratamento das células com cádmio ocorreu um aumento dos níveis do transcrito
não processado em relação ao transcrito processado. Além disso, a inibição do processamento do íntron pareceu ser
dependente da concentração de cádmio utilizada, pois em células tratadas com 100 µM CdCl2 observou-se um aumento
maior dos níveis do mensageiro não processado e uma diminuição dos níveis do transcrito processado. Esta proporção
foi invertida quando as células foram tratadas com 50 µM CdCl2. Estes dados indicam que o estresse por cádmio e por
choque térmico inibe o processamento dos íntrons em B. emersonii.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Identificação de genes em Neurospora
crassa modulados por NUC-2, uma proteína
da família das anquirina
Gras, DE1; Rei, EM2; Silveira, HCS1; Peres, NTA1; Sanches, PR1; Mazucato, M1 Martinez-Rossi, NM1; Rossi, A3
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brasil
2
Instituto de Química, Universidade de São Paulo, Brasil
3
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brasil
[email protected]
1
A regulação da expressão gênica é vital para todos os organismos e é especialmente requerida pelos fungos, para que
eles se adaptem rapidamente às mudanças do meio ambiente. Estes mecanismos adaptativos são complexos e a maioria
deles não está completamente esclarecida. O fosfato inorgânico (Pi), um nutriente essencial para todos os organismos,
é requerido em importantes processos celulares como na biossíntese de ácidos nucléicos e sinalização metabólica.
O sistema de aquisição do Pi em Neurospora crassa inclui pelo menos quatro genes regulatórios: nuc-2, preg, pgov e
nuc-1. Em privação de Pi, NUC-2, uma proteína com domínio de repetição da anquirina, inibe o funcionamento
do complexo PREG-PGOV, ativando assim o fator de transcrição NUC-1 e a expressão de fosfatases ácida e alcalina,
fosfato permeases e nucleases. Visando entender a funcionalidade do gene nuc-2, como participante da via transdutora
de sinal em resposta aos níveis de Pi, foram construídas duas bibliotecas subtrativas de cDNA (SSH) entre as linhagens
St.L.74A selvagem e nuc-2A de N. crassa, cultivadas por 5 horas em Pi limitante. De um total de 900 clones subtraídos,
21% confirmaram expressão diferencial em experimentos de macro-arrays dot-blot. As seqüências destes clones foram
processadas e analisadas pelo algoritmo BLASTx contra a base de dados de N. crassa do Broad Institute. Obtivemos 47
genes up-regulated e 17 genes down-regulated pela proteína NUC-2. Estes resultados foram validados por Virtual Northern
blotting e Northern blotting, revelando o envolvimento de novos genes na resposta adaptativa dos microrganismos aos
níveis de Pi. Entre os genes modulados negativamente pela proteína NUC-2, foi identificado um gene que codifica a
proteína MAK-2 (mitogen-activated protein kinase-2), envolvida em vias de sinalização intracelular. Para estudar o papel
deste gene no monitoramento do Pi extracelular, foi adquirida uma linhagem de N. crassa com o gene mak-2 inativado
e foram realizados experimentos de microarrays de cDNA comparando as linhagens selvagem e mutante (mak-2ko),
cultivadas em diferentes concentrações de Pi. Os resultados deste trabalho possibilitaram uma melhor compreensão das
vias de sinalização intracelular e regulação gênica envolvidas na captação de Pi que permitem aos fungos sobreviverem
em condições adversas.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, FAEPA e CAPES.
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Identificação de um fator de transcrição
de Aspergillus westerdijkie possivelmente
envolvido na biossíntese de ocratoxina A
Sartori, D1; Ferri, D2; Mata, MM1; Andrade, A3; Labate, CA3; Losi-Guembarovski, R2; Fungaro, MH2
Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual de Londrina
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina
3
Departamento de Genética Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Aspergillus, proteômica
Dentre os metabólitos secundários fúngicos classificados como policetídeos encontra-se a micotoxina denominada
ocratoxina A (OA). A esta micotoxina, que vem sendo encontrada freqüentemente em alimentos, têm sido atribuídos
efeitos nefrotóxicos, carcinogênicos e imunossupressores. Poucos genes envolvidos na biossíntese desta micotoxina
são conhecidos e nenhum fator de regulação transcricional foi descrito até o momento. Dentre os fungos capazes de
produzir esta toxina destaca-se o Aspergillus westerdijkiae, freqüentemente encontrado colonizando grãos de café. Na
tentativa de encontrar genes envolvidos na via biossintética da OA uma linhagem de A. westerdijkiae foi transformada
via Agrobacterium. Dos transformantes obtidos, foi selecionado um mutante (ITAL142-T10) cuja produção de OA
foi muito reduzida em relação ao tipo selvagem (ITAL142). A identificação parcial do gene interrompido revelou 89%
de identidade com um gene putativo que codifica para um fator de transcrição PHD (Rum1) do tipo C2H2. Com o
objetivo de identificar genes estruturais regulados por este fator foi feita uma análise proteômica comparativa da linhagem
selvagem de A. westerdijkiae, com a linhagem mutante. Para isso, inicialmente ambas as linhagens foram cultivadas por
96 horas em meio permissivo (YES) à produção da OA. O micélio coletado foi utilizado para extrações de proteínas
segundo o método SDS-Fenol modificado. Para a eletroforese bidimensional utilizou-se o gradiente de pH 4-7 e SDSPAGE (12%). As três replicas de géis obtidas foram coradas com Coomassie R250 e as análises comparativas foram
realizadas utilizando o programa ImageMaster. Um total de 20 spots diferenciais foi isolado e submetido à análise por
espectrometria de massa. Esta análise permitiu identificar proteínas “Heat shock”, álcool desidrogenase, álcool redutase,
malato desidrogenase, entre outras, como mais expressas na linhagem selvagem, indicando que a interrupção do gene
que codifica para o regulador de transcrição PHD foi responsável pela diminuição da síntese destas proteínas.
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Utilização do marcador RFLP-ITS do rDNA
para separação de isolados do grupo
Aspergillus niger
Maciel, MHC¹; Brasileiro, BTRV²; Oliveira, NT¹; Souza-Motta, CM¹; Lins, LMSS¹; Silva, LRC¹
Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco
²Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Católica de Pernambuco
[email protected]
1
A taxonomia de fungos pertencentes ao grupo Aspergillus niger constitui-se em uma das mais complexas do gênero,
sendo baseada no uso de características morfológicas e culturais, que não são suficientes devido à grande diversidade
genética existente. Atualmente métodos moleculares têm sido universalmente aplicados e fornecem grande auxílio
na sistemática desses microrganismos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar geneticamente isolados do grupo
Aspergillus niger obtidos da Coleção de Culturas – Micoteca URM, do Departamento de Micologia - UFPE utilizando
os marcadores moleculares de RFLP de fragmentos amplificados da região ITS do rDNA com as enzimas de restrição
DraI e HaeIII. A amplificação da região ribossomal ITS1-5.8S-ITS2 utilizando os iniciadores ITS4 e ITS5 resultou
um fragmento de aproximadamente 600pb, para as espécies de A. japonicus (3 isolados), A. carbonarius (2 isolados),
A. heteromorphus (1 isolado), A. foetidus (1 isolado), A. elatior (1 isolado), A. tubingensis (1 isolado), A. granulatus (1
isolado), A. phoenicis (1 isolado), A. aculeatus (1 isolado) e A. niger (12 isolados). Os fragmentos amplificados da região
ITS do rDNA não apresentaram sítio de restrição para a enzima DraI. Para a HaeIII todos os fragmentos amplificados
apresentaram sítio de restrição, sendo obtidos dois subfragmentos de 450pb e 150pb, portanto estas enzimas não são
capazes de diferenciar as espécies do Grupo Aspergillus niger. Este resultado reforça a importância da pesquisa utilizando
marcadores moleculares para a diferenciação de espécies e linhagens de fungos.
Apoio: CNPq/RENNEBRA.
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Um sistema de detecção molecular para o
gênero Aspergillus derivado da subunidade
pequena do DNA ribossomal de DNA
mitochondrial que utiliza um controle
interno de amplificação
Midorikawa, GEO1; Freire, F2; Miller, RNG1
1
Universidade Católica de Brasília, SGAN 916, Módulo B, Brasília, DF, CEP 70790-160, Brasil
Embrapa Agroindústria/CNPAT, Rua Dra Sara Mesquita, 2270, Planalto do Pici - Cx. Postal 3761, CEP 60511110, Fortaleza, CE
[email protected]
2
Palavras-chave: Aspergillus, mtDNA SSU rDNA, IAC
Alimentos em geral são extremamente suscetíveis a contaminação por fungos produtores de micotoxinas, os quais
pertencem a diferentes classes químicas. Um grupo bastante importante são as aflatoxinas, as quais têm sido apontadas
como o grupo mais importante de micotoxinas devido a sua alta toxicidade, suas propriedades hepatocarcinogênicas e
sua ocorrência comum em diferentes alimentos. No Brasil, a contaminação desses alimentos representa uma perda anual
de mais de 10% de toda a produção de castanhas, levando o Brasil a grandes perdas econômicas. Os objetivos desse
projeto são desenvolver métodos de detecção molecular para fungos aflatoxigênicos, contribuindo assim, em programas
de monitoramento de qualidade de produtos agrícolas, como amendoim, castanha do Brasil, e castanha de caju. A técnica
de PCR, apesar de ser bem descrita nos últimos 15 anos para a identificação de fungos, não está livre de potenciais
problemas, sendo estes em geral, contaminações das amostras, amostragem não representativa, e o principal, inibição
da PCR, levando ao resultado falso negativo. Para tanto, está sendo desenvolvido um controle interno de amplificação
(IAC) para a região do mtDNA SSU rDNA específico para o gênero Aspergillus, visando a utilização de um conjunto
de primers e IACs num método de PCR multiplex para a identificação de Aspergillus flavus em alimentos.
Apoio: PRODETAB, CNPq, FAPDF e UCB.
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Molecular characterization of the Aspergillus
fumigatus NCS-1 Homologue, NCSA
Mota Jr, AO1; Malavarzi, I2; Goldman, GH3
Departamento Biologia Molecular, FMRP-USP
Departamento de Ciências Farmacêuticas, FCFRP-USP Ribeirão Preto-SP Brazil
[email protected]
1,3
2
Keywords: NCS, A.fumigatus, calcium ligands proteins
Here, we characterize the A. fumigatus Neuronal Calcium Sensor, ncsA homologue. We showed that ncsA is not an
essential gene and ∆ncsA growth was decreased in the presence of EGTA and SDS. Furthermore, the ∆ncsA mutant is
more resistant to calcium chloride. NcsA:mRFP localizes to the cytoplasm that its cellular localization is not affected
by the cellular response to calcium chloride. The ∆ncsA mutant strain is more sensitive to voriconazole, itraconazole,
and the ergosterol intercalating agent, amphotericin. Polar growth in the ∆ncsA mutant strain was also considerably
more affected by lovastatin than in the wild type mutant strain. The Spitzenkörper cannot be visualized in the ∆ncsA
mutant, and there is a significant decrease of the endosome/vacuole structures. NcsA supports pmcA and pmcB expression
therefore reduced expression of these ion pumps, and also of other genes involved in the response to calcium in A.
fumigatus. The ncsA inactivation mutation is not causing loss of virulence in a low dose murine infection when compared
to the corresponding wild type strain.
Suportedby: Fapesp.
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Análise in silico dos perfis de expressão
gênica de Trichophyton rubrum sob
diferentes condições de cultivo
Sanches, PR1; Peres, NTA1; Falcão, JP1; Paião, FG1; Silveira, HCS1; Maranhão, FCA1; Gras, DE1; Segato, F1; Cazzaniga, RA1;
Mazucato, M1; Cursino-Santos, JR1; Ferreira, RA1; Rossi, A2; Martinez-Rossi, NM1
1
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
2
Palavras-chave: Trichophyton rubrum, Dermatófito, Expressão gênica, EST, Bioinformática
Micoses cutâneas são infecções comuns tanto em indivíduos saudáveis como em imunocomprometidos, sendo o fungo
antropofílico Trichophyton rubrum o mais prevalente microorganismo isolado a partir de casos clínicos em todo o
mundo. Apesar de sua importância como organismo patogênico, pouco se conhece sobre o perfil de expressão gênica
do dermatófito. Nosso laboratório vem gerando uma coleção de transcritos gênicos através da construção de diferentes
bibliotecas (uma biblioteca de cDNA e nove bibliotecas subtrativas supressivas) que fornecem importantes informações
da resposta de T. rubrum aos diferentes desafios ambientais. Com o objetivo de analisar os perfis de transcrição gênica
deste fungo nas diferentes condições anteriormente testadas, um aplicativo baseado em web foi desenvolvido de modo
a permitir o processamento in silico e a disponibilização dos dados gerados. Um total de 2735 seqüências de alta
qualidade, com um tamanho médio de 339 nucleotídeos, foi obtido após o processamento inicial com os programas
Phred e Cross-Match. Estas seqüências foram então agrupadas, através do programa CAP3, formando 296 contigs e
1092 singlets, o que correspondem a 1388 seqüências únicas e redundância de 49,3%. Uma análise comparativa foi
realizada entre as seqüências de T. rubrum e as dos bancos de dados públicos, GenBank, dbEST e KOG, através dos
algoritmos BlastN e BlastX, para obter informações sobre a funcionalidade destas seqüências. Do total de seqüências
analisadas, 254 não apresentaram similaridade com seqüências existentes nos bancos de dados públicos, podendo
representar genes novos ou até mesmo genes exclusivos de dermatófitos. Da comparação com as proteínas depositadas
no GenBank, 680 seqüências foram anotadas com sucesso, sendo que 40,9% apresentaram similaridade com genes
de função predita e 8,1% com proteínas hipotéticas conservadas. Um agrupamento entre as diferentes bibliotecas foi
realizado identificando que nenhum dos contigs formados continha seqüências de todas as bibliotecas analisadas. Um
dos contigs foi formado por seqüências de 5 e outro de 6 bibliotecas. No entanto, a grande maioria dos contigs foi
gerada a partir de uma a quatro bibliotecas, o que sugere que os genes revelados são mais comumente responsivos a
um tratamento específico do que às condições gerais de estresse. Sendo assim, este trabalho apresenta um importante
mecanismo de consulta para pesquisadores envolvidos na análise de expressão gênica de diferentes fungos, além de
revelar a grande complexidade biológica de T. rubrum pela sua capacidade de modelar perfis de expressão diferentes
sob condições ambientais distintas.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, FAEPA e CAPES.
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Subtilisinas conservadas em dermatófitos
dos gêneros Trichophyton e Microsporum
Coelho, LM; Cursino-Santos, JR; Maranhão, FCA; Aquino-Ferreira, R; Mazucato, M; Martinez-Rossi, NM
Depto Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Fungos, Dermatófitos, Trichophyton, Microsporum, Subtilisina
Pouco se conhece sobre o processo de interação entre os fungos e seus hospedeiros. Genericamente, dermatófitos
apresentam a capacidade de invadir estrutura queratinizada como cabelo, unha e pele causando infecções superficiais
em humanos e animais. As proteases secretadas pelos fungos desempenham um importante papel no processo de
invasão dos tecidos queratinizados do hospedeiro. Entre elas estão as proteínas da família das subtilisinas que se
mostram conservadas entre diferentes espécies de fungos. ESTs (Expressed Sequence Tag)) relacionadas a genes que
codificam subtilisinas do tipo serina proteases (SUB3 e SUB5) foram previamente isoladas em nosso laboratório
quando Trichophyton rubrum foi cultivado em meio de cultura contendo queratina como fonte de carbono. Os objetivos
deste trabalho foram: a localização cromossômica dos genes que codificam as subtilisinas 3 e 5 em quatro espécies de
dermatófitos (T. rubrum, T. equinum, Microsporum canis e M. gypseum) e a avaliação in silico da similaridade entre estes
genes. Para tanto, foi realizada eletroforese em campo pulsado seguida de hibridação radioativa, quando as ESTs de T.
rubrum foram usadas como sonda. Para a análise comparativa in silico foram usados os programas BlastN e BlastX para
a busca de seqüências disponíveis em bancos de dados e o programa ClustalW para os alinhamentos múltiplos entre as
seqüências identificadas. Os resultados experimentais de hibridação radioativa mostraram que os genes das subtilisinas
3 e 5 foram localizados em vários cromossomos de T. rubrum e das demais espécies, para as quais as sondas utilizadas
foram consideradas heterólogas. A busca por seqüências de genes de subtilisina nos bancos de dados públicos permitiu
a identificação de poucas seqüências relacionadas a estes dois genes estudados no presente trabalho. A comparação
entre as seqüências dos genes que codificam a subtilisina 3 em T. rubrum e em M. canis mostrou alta conservação, com
grau de identidade de 86%. Não foram encontradas seqüências relacionadas às demais espécies estudadas. Contudo,
uma análise comparativa mais ampla entre genes relacionados às diversas proteínas da família das subtilisinas e de
diferentes espécies de fungos reforça nossos resultados experimentais pois, as sondas heterólogas revelaram a presença
de seqüências altamente conservadas entre as diferentes espécies investigadas. Em conclusão, a identificação de regiões
cromossômicas fortemente marcadas com sondas de T. rubrum sugere que os genes que codificam as subtilisinas 3 e 5
são altamente conservados entre as 5 espécies aqui estudadas.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPESP, FAEPA.
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Caracterização de um retrotransposon
em um isolado de Trichophyton rubrum
Cursino-Santos, JR; Coelho, LM; Martinez-Rossi, NM
Depto Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: retrotransposom, expressão gênica, dermatófitos, Trichophyton, Microsporum
Retrotransposons fazem parte de uma classe de elementos genéticos móveis que se replicam através de um RNA
intermediário cujo DNA cópia (cDNA) se integra ao genoma do hospedeiro. Seqüências relacionadas a retrotransposons
estão amplamente distribuídas entre os eucariotos e constituem uma significante porcentagem dos genomas dos
organismos, como 3% do genoma de Saccharomyces cerevisiae e 8% do genoma humano. Com função e estrutura
relacionadas a retrovírus, os retrotransposons não são patogênicos. Contudo, são potentes indutores de alterações
genéticas relacionadas a rearranjos e variações cromossômicas numéricas, além de mutações pontuais por deleção,
substituição ou inserção de nucleotídeo. Em fungos, muitas seqüências relacionadas a retroelementos vêm sendo descritas
porém, poucas são as evidências de elementos móveis ativos no genoma destes organismos. Em nosso laboratório, uma
ESTs (Expressed Sequence Tag) contendo um domínio de transcriptase reversa foi previamente isolada por apresentar
expressão aumentada quando a linhagen H6 de Trichophyton rubrum foi exposta a diferentes inibidores de crescimento.
Os objetivos deste trabalho foram: investigar a presença de seqüências relacionadas a transcriptase reversa em duas
linhagens diferentes de T. rubrum e mais outras 3 espécies de fungos dermatófitos (T. equinum, Microsporum canis
e M. gypseum) e caracterizar os retrotransposons quanto ao número de cópias no genoma, quanto sua localização
cromossômica e quanto às condições in vitro nas quais estes elementos são ativados ou reprimidos. Para tanto, foram
realizadas hibridações radioativas em membranas de nylon fixadas com cromossomos das diferentes linhagens estudadas
após eletroforese em campo pulsado e com DNA submetido à restrição enzimática com EcoRI, BamHI, NotI e BglII,
além de Northern Blotting para a análise de expressão gênica após a exposição da linhagem H6 a peróxido de hidrogênio
e a agentes citotóxicos (griseofulvina e terbinafina). Os resultados mostraram que seqüências relacionadas a transcriptase
reversa foram reveladas em cromossomos da linhagem H6 de T. rubrum e que elas se encontram em múltiplas cópias
no genoma desta linhagem. Nas demais linhagens, não foi observada marcação sobre os cromossomos isolados nem
tão pouco sobre o DNA genômico digerido. Análise de expressão gênica revelou a participação de um transcrito de
aproximadamente 3kb de comprimento que se mostrou super expresso na linhagem H6 quando exposta a griseofulvina
e terbinafina e reprimido quando exposta ao estresse oxidativo. Em conclusão, os resultados mostram que o tamanho
do transcrito observado é compatível aos RNAs de poliproteínas de retrotransposons previamente descritos em outros
organismos e sugerem que diferentemente das outras linhagens aqui estudadas, os retrotransposons desempenham um
importante papel no processo de adaptação da linhagem H6 aos agentes citotóxicos. Estes resultados são relevantes
visto que a caracterização de elementos móveis em fungos e a identificação das condições que induzem sua expressão
são pouco freqüentes na literatura.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPESP, FAEPA.
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Análise do perfil de expressão gênica
do dermatófito Trichophyton rubrum
em resposta ao pH ambiente durante o
processo de degradação de queratina
Silveira, HCS1; Cazzaniga, RA1; Sanches, PR1; Mazucato, M1; Marques, MMC3; Passos, GAS1,3; Gras, DE1; Rossi, A2;
Martinez-Rossi, NM1
1
Departamento de Genética, FMRP-USP
Departamento de Bioquímica e Imunologia, FMRP-USP
3
Departamento de Morfologia, Estomatologia e Fisiologia, FORP-USP, Ribeirão Preto, Brasil
2
Os dermatófitos como o Trichophyton rubrum são fungos filamentosos patogênicos que, uma vez estabelecidos em seu
hospedeiro, buscam nutrientes para o seu desenvolvimento. A secreção de enzimas, como queratinases, é um fator
determinante na invasão e utilização dos tecidos do hospedeiro como fonte de nutrientes e é freqüentemente regulada
pelo pH. Consequentemente, os mecanismos de instalação e manutenção da infecção no hospedeiro são provavelmente
dependentes direta ou indiretamente do monitoramento do pH ambiente. Além disto, o crescimento de T. rubrum
na presença de queratina como única fonte de nutriente in vitro é dependente do pH ácido inicial da cultura. Em
função do tempo de cultivo, o pH é alterado atingindo valores de pH 8,3-8,9, produzindo um ambiente no qual a
maioria das queratinases tem atividade ótima. Assim, a utilização da genômica funcional em larga escala no estudo da
modulação da expressão gênica durante as mudanças de pH é fundamental para o entendimento molecular das respostas
adaptativas de T. rubrum. Para isto, utilizamos a metodologia dos cDNA microarrays incrementada por supression
subtractive hybridization (SSH). Foram selecionadas cerca de 1.500 clones de cDNA, utilizando o banco de dados de
ESTs de T. rubrum (PipeLine) existente em nosso laboratório, que é enriquecido de clones oriundos de Bibliotecas
Subtrativas obtidas após submeter o T. rubrum ao efeito de uma variedade de estímulos. Esse conjunto de clones foi
seqüenciado, anotado, e cada um dos clones foi submetido a quatro reações de PCR. Essas reações foram avaliadas em
gel, para verificação da integridade dos amplicons e utilizados na construção da plataforma dos microarrays. Os RNAs
de T. rubrum utilizados nas hibridações, foram obtidos durante o processo de degradação de queratina, mimetizando as
condições de infecção. Além disso, foi utilizada uma linhagem de T. rubrum com o gene pacC rompido. O gene pacC
codifica uma proteína homóloga ao regulador transcricional PacC/Rim101 da conservada via de sinalização do pH. Os
resultados obtidos possibilitarão o estabelecimento de redes de interações gênicas que podem revelar genes envolvidos
nos mecanismos de patogenicidade deste dermatófito, que se constituirão em potenciais alvos para o desenvolvimento
de novas drogas antifúngicas.
Suporte Financeiro: FAPESP, FAEPA, CAPES e CNPq.
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Genes diferenciamente expressos no
dermatófito antropofílico Trichophyton
rubrum durante cultivo em fonte lipídica
Maranhão, FCA; Silveira, HCS; Martinez-Rossi, NM
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavra-chave: SSH, lipídeos, pH, dermatófitos, Trichophyton
Os dermatófitos são fungos patogênicos capazes de degradar substratos queratinizados e são especializados em infectar
unhas, pele e cabelo, sendo o Trichophyton rubrum considerado o principal agente causador de onicomicoses. Para
utilizar componentes celulares do sítio infectado, como proteínas e lipídeos, tais fungos necessitam regular sua expressão
gênica para propiciar a utilização dos nutrientes provenientes da quebra desses componentes, com ativação de genes
provavelmente governada pelo pH ambiente através do sensoriamento inicial da célula. A linhagen CBS118892 de
T. rubrum foi cultivada em meio SDA por 15 dias a 28 ºC para coleta de micélio e suspensão de conídios em solução
salina estéril (0,9%) com Tween 80. Os conídios foram divididos para distribuição igualitária em meio mínimo (pH
5,0 não tamponado) acrescido de glicose como amostra controle e outra parte contendo fonte de lipídeos (1% de azeite
de oliva extra virgem) para a preparação da amostra teste, ambas mantidas a 28 ºC por 72 h, visando a obtenção de
genes diferencialmente expressos provavelmente relacionados ao metabolismo de lipídeos, através da geração de uma
biblioteca subtrativa supressiva (SSH). A atividade metabólica de T. rubrum interferiu no pH local do meio suplementado
com lipídeos, aumentando-o de 5,0 até 7,4, enquanto o mesmo não foi observado na condição controle com glicose.
Foram obtidos 672 clones na biblioteca de cDNAs subtraídos, sendo realizado um screening através de reverse northern
blot para selecionar clones contendo insertos preferencialmente expressos na condição teste. Os clones com marcações
positivas foram isolados, seqüenciados automaticamente e submetidos a análise por bioinformática (PhrepPhrap e
CAP3) e funcional por comparação com seqüências depositadas no banco de dados NR do GenBank (NCBI). Dentre
os unigenes obtidos, alguns apresentaram similaridade com seqüências detectadas no genoma de fungos patogênicos
como o Coccidioides immitis (proteína hipotética) e Paracoccidioides brasiliensis (glicoproteína secretada de 43 kDa).
Além disso, várias seqüências similares a uma subunidade da proteína G do fitopatógeno Setosphaeria turcica indicam
funções referentes à transdução de sinais para geração de cascatas enzimáticas relacionadas à ativação ou repressão
gênica. Transcritos similares a genes codificadores de transportador MDR (multidrug resistence) de T. rubrum também
foram isolados, dentre outras seqüências envolvidas no metabolismo do fungo termoestável Neosartorya fischeri. Tais
genes podem estar envolvidos na patogenicidade ou virulência deste dermatófito, uma vez que lipídeos são elementos
abundantes na membrana de células epidérmicas humanas. Este é o primeiro ensaio molecular para detectar genes
expressos após contato de T. rubrum com lipídeos, sendo necessários detalhes com ensaios apurados de expressão gênica
para atestar o envolvimento destes genes no estabelecimento das dermatofitoses.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq, CAPES e FAEPA.
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Identificação de genes do dermatófito
Trichophyton rubrum envolvidos no
sensoriamento do pH alcalino
Cazzaniga, RA1; Silveira, HCS1; Gras, DE1; Sanches, PR1; Mazucato, M1; Martins, MD1; Rossi, A2; Martinez-Rossi, NM1
1
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
Departamento de Bioquímica e Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
[email protected]
2
Trichophyton rubrum é um fungo dermatófito com maior prevalência em isolados clínicos humanos. Esses fungos possuem
habilidade para invadir tecidos queratinizados como pele, cabelo e unhas. Na progressão da infecção, os dermatófitos
crescem acentuadamente utilizando como fonte de carbono e nitrogênio, substratos queratinizados. Para isto, secretam
enzimas proteolíticas como, queratinases e fosfatases, importantes para o sucesso da instalação e permanência no
hospedeiro. Além disto, o crescimento de T. rubrum é dependente do pH ácido inicial do meio. Durante o crescimento
do cultivo, o pH torna-se alcalino, produzindo um ambiente no qual a maioria das proteases tem atividade ótima.
Portanto, o dermatófito necessita dispor de uma maquinaria metabólica que atue de forma eficiente no sensoriamento
do pH ambiente, e na manutenção do pH alcalino durante o seu desenvolvimento e crescimento. Com o objetivo de
identificar genes diferencialmente expressos supostamente envolvidos no monitoramento do pH alcalino em T rubrum,
foi construída uma biblioteca de hibridação subtrativa utilizando o cDNA da linhagem H6 cultivada em pH 8,0 como
tester e em pH 5.0 como driver. Foram obtidos 1152 clones, dos quais 231 foram confirmados por differential screening,
como diferencialmente expressos em pH alcalino. As seqüências, agrupadas pelo programa CAP3, formaram 26 contigs
e 143 singlets (169 unigenes). Análises por BLASTX revelaram que 77% de seqüências apresentam similaridade com
proteínas depositadas no GenBank. Os transcritos revelaram ampla diversidade, quando classificados funcionalmente,
estando envolvidos em 15 processos celulares diferentes, como por exemplo, transcrição, síntese de proteínas, defesa e
virulência, transporte intracelular e metabolismo celular. Esses resultados contribuem para a elucidação em T. rubrum
da resposta ao pH extracelular e de mecanismos regulatórios envolvidos na instalação e manutenção da interação
patógeno-hospedeiro.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP, CAPES e FAEPA.
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Trichophyton rubrum transcription profile
during ex vivo human skin infection
Peres, NTA1; Gras, DE1; Sanches, PR1; Falcão, JP1,2; Rocha, LB3; Rossi, MA3;
Mazucato, M1; Rossi, A4; Prade, RA5; Martinez-Rossi, NM1
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
2
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, USP
3
Departamento de Patologia, FMRP-USP
4
Departmento de Bioquímica e Imunologia, FMRP-USP
5
Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University
1
Host-pathogen interactions involve specific adaptations that allow the pathogen to adhere and penetrate the target tissue,
remodel metabolic pathways to scavenge nutrients and adapt to the stress caused by host defense mechanisms. The
determination of these metabolic adaptations as well as morphogenesis and stress response interconnection are essential
to understand the pathogenic process, and enable the establishment of new therapeutic measures. The use of genomic
resources, in particular transcription analysis, generates global gene expression profiles during infection, which may
lead to the discovery and characterization of pathogen traits with key roles in adaptation to host environment. Due to
the high prevalence of clinical cases of cutaneous infections caused by the anthropophylic fungus Trichophyton rubrum,
and the lack of knowledge about the infection process of dermatophytosis, the aim of this work was to evaluate the
molecular aspects required for this fungus to survive in the host milieu. To achieve this, an ex vivo human skin infection
was used, followed by suppression subtractive hybridization (SSH) methodology, to identify T. rubrum expressed
genes during fungal-host interaction. After 96 hours of ex vivo infection, conidial germination and hyphal penetration
was observed with scan electron microscopy. SSH and differential screening were performed generating 116 unique
Expressed Sequence Tags (ESTs), after CAP3 clustering. EST annotation with protein and T. rubrum EST database
revealed 25 novel genes and 13 hypothetical proteins, which expression may be regulated during host interaction, and
are somehow involved in T. rubrum-skin interaction/adaptation. Functional categorization by Eukaryotic Ortholog
Group (KOG) revealed that 16% of the ESTs are involved in translation, ribosomal structure and biogenesis, 15% in
posttranslational modification, protein turnover and chaperones, and 31% were annotated as having a general functional
prediction only. In conclusion, we identified 116 T. rubrum up-regulated genes during skin infection, revealing 25
novel genes, which provide insights into the metabolic adaptations performed by T. rubrum during host infection.
Furthermore, these results encourage further studies about pathogenesis of dermatophytosis, and the search for new
molecular targets for antifungal therapy, as much as new therapeutic approaches.
Financial Support: CNPq, FAPESP, CAPES and FAEPA.
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Evaluation of iron homeostasis regulation
and its influence in virulence of
Cryptococcus gattii
Rosa e Silva, LK; Staats, CC; Leal, AL; Polese, M; Bresciani, F; Schrank, A; Vainstein, MH
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
PPGBCM/CBiot/UFRGS
[email protected]
Keywords: Cryptococcus gattii, RDA, iron uptake, iron homeostasis, virulence
Cryptococcus gattii is an encapsulated basidiomycetous fungus that causes life-threatening disease of the central nervous
system, lung and skin in humans and animals. C. gattii is considered restricted to tropical and subtropical climates;
however a recent outbreak of C. gattii infection in the temperate climate of Vancouver Island, Canada, was reported. Iron
is essential for host and pathogen, as both require this metal as a cofactor or as a prosthetic group for essential enzymes
that are involved in many cellular functions and metabolic pathways. Free iron is relatively unavailable in the host, since
this metal is bound to specific proteins (i.e. transferrin, lactoferrin and ferritin) or complexed to haemoproteins. Iron is
an important growth factor for pathogenic microorganisms. The mammalian host is an extremely hostile environment
for microorganisms, which require around 1011 –1012-fold higher concentrations of free iron than is physiologically
available. Pathogen iron uptake systems are extremely necessary to assurance of the proliferation and establishment of
infection. Iron levels are known to influence the elaboration of two major virulence factors, the polysaccharide capsule
and melanin, in the pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. The goal of this study is identify genes involved in
iron homeostasis, which may be important for pathogen-host interactions and virulence in C. gattii. Representational
Difference Analysis (RDA) was used to profile gene expression in C. gattii (R265) grown in low-iron medium for 3
hours or 12 hours at 37°C. We performed two consecutively subtractive hybridization rounds and approximately 600
expressed sequence tags are being sequenced. The differential expression of all gene products identified will be confirmed
by real time RT-PCR. The functional analysis of interested genes will be done by construction of null mutants. The
virulence of these strains will be evaluated in an experimental model of cryptococcosis. These findings will contribute
to a better understanding of the role of iron homeostasis in the virulence of C. gattii.
Financial support: FINEP, CNPq, CAPES.
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Proteomics of iron deprivation in
Cryptococcus gattii
Crestani, J; Oliveira, ES; Rosa e Silva, LK; Staats, CC; Schrank, A; Vainstein, MH
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
PPGBCM/CBiot/UFRGS
[email protected]
Keywords: Cryptococcus gattii, proteomics, iron deprivation
Cryptococcus gattii is encapsulated yeast, which causes cryptococcosis in immunocompetent individuals. Cryptococcosis
is thought to be acquired by inhalation of airborne propagules, basidiospores or desiccated yeasts that colonize the
host respiratory tract without producing disease. During infection, this fungus acquires iron and other micronutrients
and this is an important aspect for disease establishment. In addition, there were described connections between iron
levels and the expression of virulence factors in Cryptococcus neoformans, such as production of capsule and melanin.
In this study, we examine the differential protein expression in response to iron deprivation. The major focus is to
identify proteins possibly involved with pathogen-host interactions. Our model strain is C. gattii R265, which was
responsible by an epidemic outbreak in Vancouver Island, Canada. The strain was pre-incubated in YPD medium
(16h/ 37°C/ 200 rpm) followed by a incubations in YNB medium amended with 2.0% glucose (24h/ 37°C/ 200 rpm)
to synchronize cells. The treatment with low-iron medium (LIM) and iron-replete medium (LIM + FeEDTA) was
done by incubation of 5 x 107 cells.mL-1 in these media for 12 hours at 37°C/ 200rpm. Total protein were extracted
and submitted to isoelectric focusing (IEF) using 4 – 7 pH strips. Focused strips were used for the second dimension
in 12% SDS-PAGE. Proteins were visualized by Commassie blue staining. Qualitative and quantitative differences in
spots are under analysis using the PDQuest 8.0 software (BioRad). Spots showing differential expression will be excise
and analyzed by Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI-TOF).
Financial support: FINEP, CNPq, CAPES.
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Padronization of an enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for diagnosis
of human criptococosis: a laboratorial tool
Polese, M; Azevedo, LG; Correa, JF; Staats, CC; Leal, AL; Schrank, A; Ferreira, HB; Vainstein, MH
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
PPGBCM/CBiot/UFRGS
[email protected]
Keywords: Cryptococcus neoformans, diagnosis, ELISA, MALDI-TOF, Q-TOF
Cryptococcus neoformans is a basidiomycete that causes invasive and potentially fatal disease in both immunocompromised
and immunocompetent individuals. C. neoformans var. grubii and C. neoformans var. neoformans are cosmopolitan and cause
cryptococcosis all over the world. Pigeon dropping are their major natural reservoir. In human immunodeficiency virus
(HIV)-infected individuals, cryptococcosis is an AIDS-defining infection and, in the absence of immune reconstitution,
the patients who survive the initial presentation require life-long suppressive therapy to reduce the likelihood of relapse.
The major virulence factors of C. neoformans are its ability to grow at 37°C, production of a polysaccharide capsule
and expression of laccase. Rapid diagnosis of cryptococcosis is based on the clinical presentation, the quantification
of capsular polysaccharide antigen using sensitive commercial tests and/or India ink preparation methods. However,
as clearance of cryptococcal polysaccharide do not correlate with active disease status and cannot be used to monitor
the effects of the treatment we are developing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect antibodies
against C. neoformans var. grubii in serum of patients with cryptococcosis using whole cell protein extracts. This test
was developed with the aim to find an alternative mean for the serodiagnosis of cryptococcosis and for monitoring
therapy. To date, the sera tested by ELISA were from 38 patients with cryptococcosis. From that, 57.5% were positives
and 42.5% were false-negatives. Thirty-five samples from laboratory workers (i.e. health people) were also tested,
being 11.43% false-positives. Several situations of cross-reactivity or false-positive test results have been reported. To
test cross-reactivity, we used 10 samples from patients with histoplasmosis (20% cross-reactivity), 9 from patient with
paracoccidioidomicosis (55.55% cross-reactivity), 9 from patients with candidosis (20% cross-reactivity) and 7 from
patients with aspergilosis (14.28% cross-reactivity). To solve the cross-reactivity problem, we search for proteins with
characteristics of immunogenicity but specific to C. neoformans var. grubii. To achieve this aim, 2D polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) followed for Western Blot was utilized. Sixty-eight immunogenic proteins were selected
and these proteins are being analyzed by Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI-TOF and Q-TOF). The
identified proteins of interest will be used for further ELISA padronization.
Financial support: FAPERGS, PROCOREDE III and CNPq.
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Evaluation of copper homeostasis in
Cryptococcus gattii virulence
Leal, AL; Staats, CC; Rosa e Silva, LK; Polese, M; Schrank, A; Vainstein MH
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul PPGBCM/CBiot/UFRGS
[email protected]
Keywords: Copper deprivation, Cryptococcus gattii, RDA, virulence, copper homeostasis
The basidiomycetes of the Cryptococcus species complex, Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, have been
extensively studied since cryptococcosis became one of the most important mycosis causing life-threatening in AIDS
patients from the 80’s until now. The main manifestation of this disease is meningitis, even as lungs and skin can also
be affected. These pathogenic yeasts have some well-characterized virulence factors, such as their ability to grow at the
human body temperature, to produce a polysaccharide capsule and to produce the antioxidant pigment melanin. Even
more interest have being raised in these yeasts after the ongoing outbreak caused by C. gattii in Vancouver where it was
isolated from humans, animals and many different environmental locations. In 2005, the complete genome of two strains
of C. neoformans was published and other strains of both species of this complex are being sequenced. The availability
of entire genome sequences facilitates the development of studies concerning gene function using methodologies
such as DNA microarray hybridizations, SAGE and RDA. Differentially expressed genes were identified in response
to temperature (37°C), low-oxygen environment and iron deprivation. It is known that copper is necessary for the
activity of several enzymes in C. neoformans, like respiratory oxidases, the Cu/Zn superoxide dismutase (SOD), laccase
(an enzyme required for production of melanin) and also for iron transporter systems. Despite this need for copper for
the yeast viability, the availability of copper in the host is low, and how this yeast overcomes this unfavorable condition
remains to be understood. Using Representational Difference Analysis (RDA), we are comparing the gene expression
pattern in the C. gattii strain R265, responsible for the Vancouver outbreak, when cultivated in deprivation or excess
of copper for 3 and 12 hours. RNA was extracted, cDNA was synthesized and two rounds of subtractive hybridization
were performed. The obtained products were cloned in PCR4 TOPO vector and transformed to Escherichia coli
OMNIMAX. Six hundred clones are under sequence analyses and the expression of the products will be confirmed
by real time RT-PCR. Genes will be chosen among the identified based on the expression profile and null mutants
will be constructed. The mutants strains will be characterized for classical virulence factors expression and virulence
in murine model.
Financial support: FINEP, CAPES and CNPq.
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The high affinity copper transporter of
Paracoccidiodes brasiliensis is induced
during infection process
Santos, RS1; Bailão, AM1; Deepe Jr., GS2 ; Soares, CMA1
Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Goiás, Goiânia - Brasil
2
Divisão de Doenças Infecciosas, Faculdade de Medicina, Universidade de Cincinnati, Ohio - EUA
[email protected]
1
Keywords: Paracoccidioides brasiliensis, copper, infection, expression analysis and protein interaction
Paracoccidioides brasiliensis is causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a dimorphic fungus alternating between
the mycelia from found at room temperature and the yeast phase detected in infection tissues or in cultures at 37ºC.
The fungus undergoes a complex differentiation in vivo. Conidia produced by mycelium phase infect the mammalian
host through inhalation into the lungs, where they differentiate into the pathogenic yeast phase. The disease is the
result of an intimate relationship between host and pathogen. The success of host tissues colonization is intimately
associated to pathogen capacity on uptake essential nutrients from the host milieu. Copper is one of those nutrients
and the ability in acquiring this metal is considered a virulence factor. Copper is an important cofactor for a wide range
of enzymes involved in many biological processes such as respiration, cell growth, iron uptake and oxidative stress.
Transcriptional studies have shown that ctr3 (high affinity copper transporter) of P. brasiliensis is induced in yeast cells
recovered from liver of infected mice. In the present study we isolated and characterized the cDNA and gene sequences
coding to CTR3 of P. brasiliensis. The cDNA showed a 582 bp open reading frame (ORF) encoding a predicted protein
with 193 amino acids, predicted molecular mass of 21.5 kDa and of pI 8.6. The genomic sequence presented four
exons interrupted by three introns. The transcriptional behavior of the ctr3 gene was analyzed during exposure of P.
brasiliensis yeast cells to conditions of depletion of iron, copper and zinc by semi-quantitative RT-PCR. It was shown
a significant increase in the transcription level of the ctr3 gene in the combined absence of the three metals, in absence
of copper as well as in absence of iron. Real time RT-PCR was used to analyze the expression of ctr3 in the two fungal
morphological forms of P. brasiliensis and in yeast cells infecting macrophages. The ctr3 expression was upregulated
in the yeast phase and in yeast cells residing into macrophage phagosomes. Taken all together those data suggest the
importance of ctr3 and of the copper/iron uptake system during the infectious process. In order to better understand
the biological function of this molecule, proteic interactions of CTR3 has been done using a Saccharomyces cerevisiae
two hybrid system. Proteins related with zinc/iron transporter, metal-dependent hydrolase and proteins of a family
of sodium/calcium exchanger integral membrane proteins were found to interact with CTR3. The confirmations of
those interactions are under progress.
Financial support: MCT/CNPq, CAPES, FINEP and FAPEG.
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Expressão heteróloga e purificação de
uma proteína GPI de Paracoccidioides
brasiliensis
Valim, CXR; Coelho, PSR
Departamento de Biologia Celular, Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: P. brasiliensis, GPI, proteína recombinante, anticorpos
O Paracoccidioides brasiliensis, um fungo termodimorfico, é o agente etiológico de uma das micoses mais prevalentes da
América Latina, a paracoccidioidomicose. Assim como muitos microorganismos patogênicos, a capacidade de adesão
do P. brasiliensis a superfície de tecidos hospedeiros é um dos passos cruciais no processo patogênico e um pré-requisito
na colonização do hospedeiro. Genes conhecidos como PGAs (predicted-GPI-anchored) codificam proteínas que
apresentam motivos compatíveis com função na superfície celular. Proteínas ancoradas por GPI podem estar envolvidas
com funções tais como adesão célula a célula, célula a tecido, além de participar da biogênese e remodelamento da
parede de celular. Neste trabalho, sequencias protéicas deduzidas de uma biblioteca de EST de P. brasiliensis 18, foram
analisadas segundo um algoritmo que identificam o sítio ômega de ancoramento a glicosilfosfatidilinositol (GPI). Dentre
as proteínas identificadas, uma foi selecionada e identificada como PbPga1, de função desconhecida. Após amplificação
por PCR da ORF denominada PbPGA1, o fragmento foi clonado em vetor de expressão pGEX3X (GeHealthcare).
Bactérias E. coli da linhagem BL21(DE3)pLysS foram transformadas com o vetor pGEX3XpbPGA1 e a expressão da
proteína recombinante (GST-PbPga1) foi induzida pela adição de 1mM de IPTG em culturas liquidas. Após 5 horas
de indução uma proteína recombinante de 35 KDa foi detectada por SDS-PAGE na fração insolúvel do lisado celular.
A identidade da proteina GST-pbPGA1 foi confirmada por imunoblot de extrato protéico bacteriano incubado com
anticorpo anti-GST (Santa Cruz Biotecnology). A proteína foi solubilizada na presença de uréia (8M), separada em
SDS-PAGE e a banda correspondente cortada do gel, macerada, misturada a adjuvante de Freud e injetada em coelho
de 15 em 15 dias. Após a imunização, o soro dos coelhos apresentou anticorpos específicos que reconhecem a proteína
recombinante GST-pbPga1 em ensaio de imunoblot. Posteriormente, os anticorpos serão purificados e utilizados
para identificação da proteína endógena em extratos protéicos, bem como na imunolocalização em células de hifas e
leveduras.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES, CNPq e FAEPA.
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The carbonic anhydrase of Paracoccidioides
brasiliensis: identification, cDNA cloning
and characterization
Tomazett, MV1; Dantas, SFIM1; Santos, RS1; Soares, CMA1
Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Goiás, Goiânia - Brasil
[email protected]
1
Keywords: Carbonic anhydrase, Paracoccidioides brasiliensis, infection, Antibodies and cDNA sequence
Paracoccidioides brasiliensis is a thermodimorphic fungus, the etiological agent of Paracoccidioidomycosis. This fungus
undergoes a complex differentiation in vivo and is responsible for one of the most prevalent mycosis in Latin America.
The infection is acquired by the inhalation of airborne microconidia, which reach the pulmonary alveolar epithelium
and differentiate into the parasitic yeast form. Understanding of the complex interactions between the fungus and its
host must include the identification of gene expression patterns during infection. Carbonic anhydrase (CA) belongs
to the family of zinc metalloenzymes that catalyzes the reversible hydratation of carbon dioxide to bicarbonate.
Transcriptional studies have shown that carbonic anhydrase of P. brasiliensis is expressed in yeast cells recovered from
liver of infected mice. In the present work we characterized the cDNA encoding the carbonic anhydrase of P.brasiliensis
(PbCA) (GenBank accession number EU431184). The complete cDNA presents 906 nucleotides with an open reading
frame (ORF) encoding a protein with 302 amino acids, predicted molecular mass of 33 kDa and pI 6.34. The transcript
is accumulated in the yeast cells during infection in experimental models as demonstrated by RT-PCR. Antibodies to
the recombinant protein were induced in mice in order to study the protein regulation in yeast cells upon infection
in animals.
Financial support: MCT/CNPq, CAPES, FINEP and FAPEG.
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b-1,3-glucan synthase and glutaminefructose-6-phosphate amidotransferase
of Paracocccidioides brasiliensis respond
to stress conditions
Carvalho, MT; Tomazett, PK; Castro, NS; Zambuzzi-Carvalho, PF; Soares, CMA; Pereira, M
Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia-GO-Brazil
1
The yeast cell wall is an essential structure that, due to its mechanical strength, is able to resist internal turgor pressure
and consequently prevents cell lysis. In fungi, two covalently cross linked polysaccharides, b-1,3-glucan and chitin,
form a primary scaffold that is responsible for structural integrity and shape of the cell wall. Glutamine-fructose-6phosphate amido transferase (Gfa1), the first enzyme of the chitin metabolic pathways, is a key step on UDPGlcNAc
biosynthesis. b-1,3-glucan synthase (Fks1) is regulated by the Rho GTPase, which is a multifunctional regulator that
must has interface with numerous proteins and have extensive involvement on polar growth and cell wall synthesis. To
maintain the integrity of the cell wall, fungi posses a signal transduction cascade that is activated in response to cell wall
stress and induce the expression of genes that prevent cell lyses. Studies suggest that stresses can activate the budding
yeast “cell integrity” MAPK pathway acting between Rho1p and the MAPK in Saccharomyces cerevisiae. The growth of
P. brasiliensis was evaluated under stress conditions to determine the concentration in which the fungus is sensible to
the stressor agents: calcofluor white, congo red, SDS, NaCl, KCl and sorbitol, including cell wall damage and osmotic
stress. By using the concentration in which the fungus is sensible, the expression of PbFks1 and PbGfa1 was determined
by real time RT-PCR. The results showed that PbFks1 and PbGfa1 respond to stress conditions studied.
Finantial support: CNPq, Funape, IFS.
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Paracoccidioides brasiliensis transcriptional
profile changes induced by thioridazine
Rodrigues, ACFO1; Rodrigues, T2; Oliveira, MV1; Nunes, LR1; Costa de Oliveira, RL1
1
Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB), Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), Mogi das Cruzes, SP, Brasil
Centro Interdisciplinar de Investigação Bioquímica (CIIB), Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), Mogi das Cruzes, SP, Brasil
[email protected]
2
Keywords: Paracoccidioides brasiliensis, thioridazine, transcriptional profile
Paracoccidioides brasiliensis is a thermodimorphic fungus associated with paracoccidioidomycosis (PCM), a human
systemic, chronic and progressive mycosis prevalent in South America, with endemic areas in Colombia, Venezuela
and Brazil. To analyze changes in the gene expression profile of this human pathogen in a genomic scale, our group has
undertaken the construction of a comprehensive P. brasiliensis biochip, carrying representative sequences of 4,692 genes
from this microorganism. In previous works, it was demonstrated that a great number of oxidative stress-response genes
display up-regulation during differentiation into the yeast parasitic form of the fungus. Phenothiazines are antipsychotic
drugs used in the treatment of schizophrenia. Some derivatives have also been used as anti-emetic agents. This class
of compounds presents interesting chemical properties and recent literature data demonstrated that phenothiazines
are able to induce apoptosis in tumor cells and decrease the multidrug resistance to cancer chemotherapy. They also
exhibited antimicrobial activity in vitro and in vivo against microorganisms of great medical interest, such as bacteria,
parasites (protozoa and helmints) and yeasts. Since phenothiazines are able to promote eukaryotic cell death, in this
work we evaluated the effects of the phenothiazine derivative thioridazine (TR) on the viability of P. brasiliensis and
used the biochip constructed in our lab to monitor the overall gene expression modulation promoted by this drug in
sub lethal conditions. The incubation of P. brasiliensis cultures with TR resulted in decrease of cell viability, as evaluated
by trypan blue exclusion test. Next, we conducted microarray hybridization analyses with RNA samples obtained from
thioridazine-treated yeast cells in sub lethal concentrations. Our results showed that more than 10 % of the P. brasiliensis
genome was modulated in response to the TR treatment. The analyzes of the down- or up-regulated genes are extremely
helpful to identify pathways involved in the pathogen-specific resistance mechanism and may be important to evidence
new targets to the action of drugs for the treatment of systemic human PCM.
Supported by FAPESP and FAEP.
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Functional characterization of the CHIT30
chitinase gene from Metarhizium anisopliae
Staats, CC; Rosa e Silva, LK; Boldo, JT; Lubeck, I; Carlini, CR; Vaintein, MH; Schrank, A
Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
Keywords: Metarhizium anisopliae, chitinase, virulence, Agrobacterium tumefaciens, gene knockout
The entomophatogenic fungus Metarhizium anisopliae can infect and kill a broad range of arthropods, including
some agricultural plagues, like the bovine tick Riphicefalus (Boophilus) microplus and the cotton stainer bug Dysdercus
peruvianus. This fungus infects its hosts by direct penetration through the cuticle that involves mechanical pressure and
secretion of cuticle depolymerases, including chitinases, which are tough to be possible virulence determinants. One of
such chitinases (CHIT30) was shown to be expressed during the penetration events of the tick R. microplus. To address
the function of the CHIT30 chitinase in Metarhizium, the gene (chi3 gene) was cloned and the sequence was analyzed
in silico to identify elements in the putative promoter region. Canonical sequences for catabolite repression, heat shock
and developmental regulation were found. The functionality of these putative regulatory sequences was accessed by
Northern blot and real-time RT-PCR analysis. chi3 gene transcripts were detected in cultures that were submitted to
stress by heat shock (2 hours at 42°C) or amended with chitin, whereas no transcripts were detected in cultures added
of glucose, supporting the in silico analysis. To further characterize the chi3 gene, Agrobacterium tumefaciens mediated
transformation was employed to generate null chi3 gene mutants. From 115 transformants generated with a cassette
spanning the selection marker (a biaphalos resistance expression cassette) flanked by 1 kb of chi3 gene sequences, two
exhibit a genotype confirming the double crossover at the chi3 locus. Since chitinases in fungi may be involved in
either nutrient acquisition or morphological alterations, one of these mutants was analyzed for chitinase production
in chitin containing medium, nuclear kinetics, appressorium formation and virulence to D. peruvianus as a model
system. No differences were detected between the wild-type strain and the chi3 mutant strain in chitinase production,
nuclear kinetics or appressorium formation. However, chi3 gene activity is necessary for virulence, since mortality
analysis showed a higher TL50 value in the mutant compared to the wild-type. A GFP tagged version of the CHIT30
chitinase was constructed and analyzed by confocal laser microscopy to show that green fluorescence was present in
the apical tip of the hyphae from cultures amended with chitin, but not with glucose, confirming the transcriptional
analysis. Nevertheless, the participation of CHIT30 in morphological alterations during the infection process cannot
be ruled out. The analysis of morphological alterations of the mutant during host infection should contribute for a
better understanding of CHIT30 function in Metarhizium physiology.
Financial support: CAPES and CNPq.
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Identification of new transcripts associated
with conidiogenesis in the entomopathogenic
fungus Metarhizium anisopliae var. acridum
Marques, ER1; Silva, SH1; Nascimento, E; Roberts, DW2; Braga, GUL1
Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Ribeirão Preto, SP 14040903, Brazil
2
Utah State University, Department of Biology, Logan, UT 843225305, USA
[email protected]
1
Keywords: Metarhizium anisopliae, conidiogenesis, SSH (Suppression Subtraction Hybridization), differential expression, conidia
Conidia are responsible for the reproduction, dispersal and environmental persistence of different fungal species of
medical, industrial and agricultural interest. In entomopathogenic species such as Metarhizium anisopliae, conidia are
the final product commercialized in agriculture because they are responsible for host infection. The identification of new
genes expressed during conidiogenesis will provide important information for the understanding of the biology of this
fungal structure. We used suppressive subtractive hybridization (SSH) to isolate transcripts with increased expression
during conidiogenesis of the ARSEF 324 strain of M. anisopliae var. acridum. A total of 212 expressed sequences tags
(ESTs) were obtained. The sequencing and clustering of ESTs, which correspond to the genes with increased expression
during conidiogenesis, permitted the identification of 54 genes of the fungus. Only one of these (the G3PDH gene)
had been previously described in this specie. The increased expression of three of these genes which are the hydrophobin
gene, the gene of a protein associated with senescence and an unknown sequence that has an active site present in
thiolases during conidiogenesis was confirmed by quantitative real time RT-PCR. Functional characterization showed
that most of the genes have unknown functions (48%) or code for hypothetical proteins (9 %). The description of 53
new genes expands the number of genes known in M. anisopliae.
Financial Support: FAPESP and CNPq.
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Diversidade genética de isolados de
Metarhizium anisopliae por marcadores
moleculares
Lima, BFR1; Almeida, CMA1; Donato, VMTS2; Cavalcanti, VALB2; Silva, MV1; Castro, NR2
Centro de Ciências Biológicas/Departamento de Bioquímica/UFPE, 2Laboratório de Genoma/Instituto Agronômico de Pernambuco/IPA
[email protected]
1
Palavras-chave: Metarhizium anisopliae, PCR-RAPD, variabilidade genética
Entre os microrganismos com potencial de aplicação no controle biológico destaca-se o fungo filamentoso Metarhizium
anisopliae, utilizado no controle de insetos-praga da agricultura em escala comercial desde a década de 60, para controlar
a cigarrinha-da-cana-de-açúcar e a cigarrinha-das-pastagens. Técnicas moleculares de análise do DNA têm possibilitado
o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e específicos na caracterização de entomopatógenos, em complemento
à análise morfológica. Este trabalho objetivou caracterizar e dimensionar a diversidade genética de oito isolados de
Metarhizium anisopliae, coletadas de cigarrinhas provenientes de diferentes regiões produtoras de cana-de-açúcar dos
estados Pernambuco, Alagoas e Rio Grande do Norte, por meio da análise da PCR-RAPD. Os isolados de M. anisopliae
foram cultivados em meio de cultura Batata-Dextrose, por 5 dias, temperatura 25ºC e 120 rpm. O DNA dos isolados
foram obtidos pelo método do CTAB (Ferreira e Grattaplagia,1998) e para análise do DNA, 10 primers Operon foram
utilizados. No estudo da variabilidade genética, a matriz de similaridade (Jaccard) gerou o dendrograma pelo método
UPGMA, utilizando-se o programa NTSYS. Foi possivel separar os isolados em dois grupos (A e B). O grupo A está
constituído de dois subgrupos com aproximadamente 58% de similaridade e o grupo B, constituído por três isolados
com aproximadamente 78% de similaridade. A alta similaridade entre os dois grupos e dentro de cada um deles indicou
que os isolados pertencem à mesma subespécie. Observou-se um padrão específico de agrupamento entre isolados
oriundos da mesma região ou hospedeiro, ou seja, a diversidade genética parece ser dependente do local de origem do
fungo, como seria esperado com um patógeno que, em geral, tem revelado alto grau de especialização ao hospedeiro.
Apoio Financeiro: IPA e CNPq/MCT/FACEPE.
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Obtenção de linhagens recombinantes de
Penicillium griseoroseum superprodutoras
de pectina liase e poligalacturonase
Teixeira, JA; Gonçalves, DB; Bazzolli, DMS; Queiroz, MV; Araújo, EF
Departamento de Microbiologia/BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG, Brasil
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: Penicillium, pectinases, transformação, pectina liase, poligalacturonase
O uso de microrganismos geneticamente modificados (OGM) para a produção de enzimas de interesse industrial tem
possibilitado a comercialização de um elevado número de preparações enzimáticas. Encontra-se atualmente no mercado,
cerca de 300 preparações enzimáticas produzidas por OGM, como amilases, xilanases, lípases e pectinases. As vantagens
do uso de OGM para a produção de enzimas incluem o aprimoramento da eficiência e da qualidade e melhor utilização
de matéria-prima. Nosso grupo tem utilizado com sucesso a estratégia da substituição do promotor endógeno por
um promotor forte e constitutivo para aumentar a expressão de genes que codificam pectinases no fungo filamentoso
Penicillium griseoroseum. Essas enzimas são utilizadas na indústria para desengomagem de fibras e no processamento de
vinhos e sucos de frutas. O objetivo do presente trabalho foi obter linhagens com maior produção das enzimas pectina
liase (PL) e poligalacturonase (PG) pela co-transformação da linhagem recombinante T105, utilizando-se os plasmídeos
pAN52pgg2 e pAN7.1. A linhagem recombinante 105 possui cópias adicionais do gene plg1, sob controle do promotor
do gene gpd de A. nidulans. O plasmídeo pAN52pgg2 contém o gene pgg2, que codifica PG em P. griseoroseum, sob
o controle do promotor do gene de gpd e a região de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans. O plasmídeo
pAN7.1 contém o gene hph, que codifica proteína que confere resistência a higromicina B. As atividades enzimáticas
de PL e PG foram determinadas segundo metodologias desenvolvidas por Albersheim e Killias, 1962 e Miller 1959,
respectivamente. Foram obtidas 525 linhagens co-transformantes. Dentre essas, cinco linhagens foram consideradas
superprodutoras PG e PL, apresentando pelo menos uma cópia heteróloga do plasmídeo pAN52pgg2 integrada no
genoma. A linhagem recombinante P. griseoroseum T20, selecionada, apresentou aumentos de 45 vezes na produção de
PL e 11 vezes na produção de PG, quando cultivada em meio mineral contendo caldo de cana, em relação à linhagem
selvagem (controle) cultivada em suas condições ótimas de produção. O perfil protéico do sobrenadante obtido com o
cultivo da linhagem recombinante T20 evidenciou duas bandas de proteínas distintas com aproximadamente 38 kDa
e 36 kDa, que correspondem a PG e a PL, respectivamente. A linhagem recombinante P. griseoroseum T20 apresenta
grande potencial de aplicação na indústria para produção de pectinases, e será cultivada em condições experimentais
em maior escala visando à produção industrial.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CAPES e CNPq.
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Taxonomia molecular de fungos celulolíticos
associados a invertebrados marinhos
Silva, CHD1; Leal, RR1; Simioni, KCM1; Sette, LD1
Divisão de Recursos Microbianos CPQBA- Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: taxonomia molecular, fungos celulolíticos, invertebrados marinhos
Os fungos filamentosos derivados de ambiente marinho tem sido foco de grande interesse devido principalmente ao
fato da micologia marinha ser uma ciência relativamente recente e de pouco se conhecer sobre a natureza biológica desse
grupo de microrganismos. Em adição, o oceano cobre mais de 70% da superfície do planeta e representa um ambiente
pouco explorado com relação à sua biodiversidade e recursos genéticos. Apesar da diversidade dos microrganismos em
ambientes extremos, incluindo os salinos, ser baixa em comparação com habitats convencionais, os fungos derivados
de ambiente marinho representam uma fonte significativa de compostos químicos diversificados. O presente trabalho
está associado ao projeto Temático da FAPESP 05/60175-2 “Descoberta e desenvolvimento de potenciais agentes
quimioterapêuticos a partir de invertebrados marinhos e de microrganismos associados” e tem como objetivo principal
a caracterização taxonômica molecular de 31 fungos filamentosos derivados dos invertebrados marinhos Amphimedon
viridis, Didemnum sp., Mycale laxissima e Dragmacidon reticulata. Os fungos foram seletivamente isolados em meio
contendo celulose como única fonte de carbono. Após purificação e preservação dos isolados obtidos, o DNA genômico
total foi extraído e utilizado como molde para a amplificação e o sequenciamento do DNAr 28S (D1/D2) pela técnica
de PCR (Polymerase Chain Reaction). As seqüências obtidas foram submetidas a análises comparativas utilizando a rotina
BLAST (http://www.ncbi.nem.nih.gov) e análise filogenética utilizando o software Mega 4. Os resultados revelaram a
presença de diferentes gêneros dentro do Filo Ascomycota: Bionectria, Fusarium, Aspergillus, Cryptosphaeria, Cladosporium,
Acrostalagmus, Phoma e Penicillium.
Apoio: FAPESP.
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Potencial Biotecnológico de Fungos
Endofíticos de Piper aduncum
Oliveira, RL¹; Albuquerque, PM¹; Martins, MK²
¹Laboratório de Biorgânica, Universidade do estado do Amazonas
²Laboratório de microbiologia, Centro de Biotecnologia da Amazônia
[email protected]
Palavras-chave: Piperaceae, Microrganismos Endofíticos, CLAE, Metabólicos secundários
Piper aduncum L. é uma Piperaceae que ocorre naturalmente na Amazônia. É conhecida pelos nomes: Aperta-Ruäo,
Aperta-Joäo, Jaborandi do Mato, Pimenta-de-Macaco, Pimenta do Fruto Ganchoso. Possui grande potencial para
exploração econômica em função da comprovada ação do seu óleo essencial dilapiol sobre microrganismos, além de
comprovada ação analgésica e antiinflamatória com baixos níveis de toxicidade. Visando minimizar o extrativismo de
algumas espécies vegetais (por exemplo, Piper aduncum), uma estratégia seria a utilização de microrganismos endofíticos,
já que microrganismos associados a plantas hospedeiras podem produzir compostos presentes nas mesmas. Diante disso,
esse trabalho teve como objetivo avaliar isolados fúngicos endofíticos de P. aduncum quanto à produção de dilapiol.
Foram avaliados nove exemplares de três pontos da cidade de Manaus, onde 83 isolados fúngicos foram obtidos.
Foram encontrados isolados pertencentes aos gêneros Paecilomyces, Aspergillus, Fusarium, Colletotrichum, Guignardia,
Penicillium, Peniophora, Glomerella entre outros. Desses isolados, 31 (37,34%) produziram compostos com atividade
antimicrobiana, sendo que apenas dois isolados se mostraram promissores inibindo um número maior de espécies de
microrganismos-teste. Os líquidos metabólicos de dois isolados foram submetidos ao fracionamento para a extração
e purificação das moléculas responsáveis pela atividade antimicrobiana. As frações obtidas foram testadas e duas delas
(uma de cada isolado) apresentou atividade antimicrobiana. Essa fração foi analisada por CLAE e CCD para averiguar
se essas frações apresentavam o dilapiol. Com base nos resultados obtidos, foi verificado que os dois isolados avaliados
produzem compostos antimicrobianos, porém, diferentes do dilapiol. Em síntese, é importante ressaltar que os estudos
aqui realizados mostram que a investigação da diversidade microbiana de hospedeiros tropicais, ainda não explorados,
aponta claramente para novas perspectivas sobre o potencial que os microrganismos endofíticos representam para a
biotecnologia.
Apoio Financeiro: FAPEAM e IEL.
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Antibioses de extratos de fungos endofíticos
de Victoria amazonica contra a bacteria
fitopatógena Ralstonia solanacearum
de Souza, AQL1,2; Pereira, JO2; Demosthenes, LCR2; Bentes, JLS2; Amaro-Bianco, E3; Souza, ADL3
1
Escola Superior de Ciências da Saúde da Universidade do Estado do Amazonas
Faculdade de Ciências Agrárias e 3Departamento de Química do Instituto de Ciências Exatas da Universidade Federal do Amazonas
[email protected]
2
Palavras-chave: Victoria amazonica, Fungos endofíticos, Ralstonia solanacearum, Biodiversidade, Antibiose
A Ilha do Careiro pertence ao ecossistema de várzea da Região Amazônica, com solos favoráveis à agricultura. Diversas
culturas são encontradas na ilha e seu desenvolvimento responde ás necessidades da população, a tradição agrícola e a
proximidade de Manaus – mercado consumidor. Duas das principais culturas de ciclo curto cultivadas nesta ilha são: o
tomate (Lycopersicon esczilentum MILL.) e o pimentão (Capsicicm unnuum L.). Contudo varias pragas comprometem a
produção local. Ralstonia solanacearum, um terrível fitopatógeno, causa a murcha bacteriana, com graves perdas econômicas
em toda a agricultura mundial, também está presente nesta área cultivável. Sua patologia é relativamente complexa
tendo em vista sua diversidade e a alta virulência provocada que diminui a produção. Este é um estágio preliminar para
a detecção de antibióticos a partir de microrganismos endofíticos isolados de Victoria amazonica, visando uma possível
alternativa para o controle de pragas a partir de organismos adaptados às condições da região. Ele contribui também
para a realização de um levantamento do potencial biotecnológico destes isolados. Diversos microrganismos foram
isolados de V. amazonica no município de Careiro da várzea, próximo a cidade Manaus, no estado do Amazonas, após
purificação e conservação 21 linhagens foram cultivadas em pequena escala e tiveram seus metabólitos secundários
extraídos com etanol para os micélios e acetato de étila para os meios metabólicos. Pela metodologia de difusão em
ágar foram avaliados 42 extratos de Penicillium spp., Trichodema spp. e linhagens de um grupo não identificado,
produzidos por fermentação em meio sólido e líquido contra duas linhagens de R. solanacearum isoladas do tomateiro
e do pimenteiro que foram acompanhados por 24, 48 e 72 hrs. Vinte e sete extratos apresentaram antibiose, sendo que
22 apresentaram halos de 20 a 30 mm de diâmetros e 5 alcançaram os melhores resultados com halos de 40 mm de
diâmetro, vale ressalta que os cincos melhores resultados foram encontrados para o grupo não identificado e o restante
para Penicillium spp. e uma das seis amostras de Trichoderma apresentou antibiose o que ilustra a importância da busca
e do conhecimento sobre a biodiversidade de microrganismos presente em nichos ainda não investigados. Trabalhos
posteriores continuarão para identificar os princípios ativos destes extratos.
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Fungos Endofíticos Isolados de Annona sp.
da Amazônia Brasileira
Gama, AM1; Souza, ADL1; Costa, MST1; Pereira, JO2; de Souza, AQL2,3
1
Departamento de Química da Universidade Federal do Amazonas (Dq/UFAM)
Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Amazonas (FCA/UFAM)
3
Departamento de Odontologia da Escola Superior de Ciências da Saúde - Universidade do Estado do Amazonas (Do-ESA/UEA)
[email protected]
2
Palavras-chave: Annonaceae, Annona, Fungos endofíticos, Taxonomia, Biodiversidade
O Brasil possui 20% da biodiversidade da terra e grande parte desta está localizada na maior floresta tropical do
planeta – a Floresta Amazônica. Neste mosaico vivo de plantas, animais e microrganismos são encontradas espécies
vegetais da família Annonaceae, plantas típicas dos neotrópicos. Apenas nas últimas duas décadas foram descritos dois
grupos de moléculas consideradas marcadores taxonômicos dessa família, os alcalóides do tipo...com reconhecidas
atividades biológicas (antitumoral, antiparasitária, inseticida, miorelaxante, imunossupressor entre outras atividades) e as
acetogeninas, com atividades anticancerígenas e usadas como modelo para o estudo do Mal de Parkinson e de Alzheimer.
Devido à relevância das annonáceas e a falta de informações sobre seus microrganismos endofíticos, propomo-nos a
isolar, identificar e preservar fungos e bactérias de Annona sp. com vista a futuros usos biotecnológicos. A planta foi
coletada na mata do Campus da Universidade Federal do Amazonas, em Manaus, e amostras das raízes, caules, galhos
e folhas foram submetidas a assepsia com hipoclorito, semeadas em placas de Petri com BDA e terramicina a 100µg/
mL e incubadas em gradiente crescente de temperatura: 18o, 26o e 40oC por 30 dias. Após três dias de cultivo, dos 144
fragmentos incubados foram isolados 60 linhagens de fungos, classificados em 11 morfogrupos, cujos gêneros foram
identificados pelas características macro e micromorfológicas em: 10 isolados de Guignardia e 7 de Colletotrichum das
folhas, 3 de Trichoderma do caule e 1 da casca da raiz, 2 Pestalotiopsis das cascas do caule e do galho, 8 Phomopsis e 1
Xylaria da casca do galho, 2 Penicillium da casca do galho e do caule, 1 Metarrhizum da casca do caule e 25 isolados
subdivididos em 3 grupos desconhecidos. Esses fungos foram conservados em água destilada esterilizada (Castellani), óleo
mineral e glicerol (neste caso, apenas para os mitospóricos). Fungos dos gêneros Trichoderma, Pestalotiopsis, Penicillium e
Metarrhizum são usados na biotecnologia para controle biológico de pragas, produção de anticancerígenos, antibióticos
e inseticidas naturais respectivamente. Portanto estes primeiros resultados confirmam a importância do conhecimento
e da preservação da biodiversidade microbiana brasileira.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPEAM.
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Bioprospecção de policetônicos em
microrganismos endofíticos
Andrielli, F1; Rojas, JD1; Saenz, ECT1; Araujo, WL2; Padilla, G1
1
Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo
[email protected]
2
Palavras-chave: policetônicos, PKS, endofíticos, bioprospecção
Os compostos policetônicos correspondem a um vasto grupo de produtos naturais com atividade biológica variada,
compreendendo fármacos utilizados rotineiramente na clínica médica, como a lovastatina (regulador de colesterol),
doxorubicina (antitumoral), eritromicina (antibiótico) e avermectina (antiparasitário). A biossíntese destes compostos é
catalisada por enzimas da super família das policetônico sintases (PKS), que apresentam seqüências com regiões consenso
para a construção de primers para PCR, úteis para dinamizar a triagem de organismos produtores. Este trabalho teve
como objetivo: verificar a freqüência de genes da superfamília PKS em uma coleção de microrganismos endofíticos,
representada por 46 Actinomicetos e 210 fungos filamentosos e, avaliar a atividade biológica de cepas selecionadas. O
DNA genômico dos endofíticos foi usado como molde em reações de amplificação por PCR com primers degenerados
para os domínios de CHS (Chalcona sintase), cetosintase e metil transferase da superfamília de PKS. Cerca de 20% dos
fungos utilizados na bioprospecção apresentaram produtos de PCR com 700 bp para cetosintase e 350 bp para metil
transferase e 9% dos Actinomicetos obtiveram produtos de PCR com 600 bp para CHS e metade deles (50%), foram
amplificados com primers para cetosintase do tipo II (650 pb). Os fragmentos obtidos com a amplificação utilizando o
DNA de fungos foram seqüenciados e comparados com os dados do GenBank, revelando alta identidade (entre 60-98%)
com os domínios cetosintase e metiltransferase do sistema PKS tipo I, correlacionados a biossíntese de policetônicos
por fungos dos gêneros Aspergillus, Penicillum dentre outros. A triagem dos Actinomicetos também revelou amplicons
com elevada identidade (entre 84-91%) com genes que codificam proteínas do sistema PKS tipo III, como RppA
e THNS e do tipo II (cetosintase) das bactérias Streptomyces spp e Pseudomonas fluorescens. Ensaios de avaliação da
atividade antibiótica foram realizados com os endofíticos que tiveram as seqüências confirmadas de PKSs e, em alguns
casos ocorreu inibição contra bactérias Gram positivas e negativas, leveduras e fungos filamentosos. Em complemento,
12 extratos de fungos foram purificados por TLC (Thin Layer Chromatography) e apresentaram bandas com o valor
de Rf similar ao padrão de lovastatina. Estes resultados demonstram que os microrganismos da coleção de endofíticos
apresentam um grande potencial para a exploração biotecnológica e confirmam que a utilização de ferramentas de
biologia molecular, como os primers degenerados para PCR, dinamizam a bioprospecção de microrganismos produtores
de compostos com atividade biológica importante, como os policetônicos.
Apoio financeiro: CNPq e CAPES.
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População endofítica de fungos
filamentosos, bactérias e actinomicetos de
Duguetia stelechantha, uma Annonaceae
da floresta amazônica
Costa, MST1; Gama, AM1; Souza, ADL1; Pereira, JO2; de Souza, AQL2,3
1
Departamento de Química da Universidade Federal do Amazonas (Dq/UFAM)
Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Amazonas (FCA/UFAM)
3
Departamento de Odontologia da Escola Superior de Ciências da Saúde - Universidade do Estado do Amazonas (DO-ESA/UEA)
[email protected]
2
Palavras-chave: Annonaceae, Duguetia stelechantha, População endofítica, Fungos endofíticos, Planta medicinal
A família Annonaceae é tipicamente neotropical e tem como centro de dispersão a região Amazônica e as Guianas.
Algumas espécies são usadas como inseticidas pelos nativos e outras possuem relatos de atividades anticancerígenas e
antiprotozoárias. Outras espécies foram domesticadas e suas polpas são usadas in natura para o consumo direto, confecção
de sucos, sorvetes e balas, por exemplo: fruta-do-conde, biribá e a graviola. As informações cientificas são ainda precárias
sobre as annonáceas, contudo seu potencial tem sido relatado através da etnobotânica. A planta Duguetia stelechantha é
uma das 650 espécies de Annonaceae, sendo encontrada na Floresta Amazônica nos locais de vertentes, suas flores tem
odor de banana madura e de seus troncos são retiradas fibras (enviras) para a confecção de cestos e cordas artesanais
e de inseticidas naturais. As informações cientificas de D. stelechantha são na sua maioria taxonômicas havendo ainda
um grande vazio sobre a parte química e a microbiota associada, sendo este o primeiro relato de seus microrganismos
endofíticos. Dos órgãos vegetais: raiz, caule, galho, folhas e frutos foram inoculados fragmentos, previamente limpos
com hipoclorito a 4%, em placas de Petri contendo BDA com tetraciclina a 100µg/mL para o isolamento de fungos, e
ISP2 ou Aveia contendo cetoconozol, para o isolamento de bactérias e actinomicetos. As placas contendo os fragmentos
foram incubadas em BOD a temperatura crescente de 18o, 26o e 40o C, por 30 dias. A partir do terceiro dia os isolados
foram transferidos para tubos de ensaio com meio de cultura inclinado. Dos 432 fragmentos vegetais incubados foram
isolados 117 fungos filamentosos, 13 actinomicetos e 82 bactérias. Pela morfologia foram identificados os gêneros de
fungos: Trichoderma, Fusarium, Phomopsis, Pestalotiopsis, Xylaria, Penicillium, Aspergillus, Colletotrichum e outros 11
grupos ainda não identificados; dos actinomicetos foram diferenciadas pela morfologia três espécies de Streptomyces e
as bactérias Bacillus e Pseudomonas, entre outros grupos que ainda estão sendo identificados. A grande variabilidade de
microrganismos endofíticos de D. stelechantha sugere a continuação deste trabalho e a preservação deles para futuros
usos biotecnológicos.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPEAM.
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Penicillium purpurogenum como endofítico
de Turnera ulmifolia L. (Turneraceae)
Marins, EFC1; Kamei, SH2; Barbosa, A3, Silva, IEF4; Silva, LAF5; Caetano, LC6
Graduanda em biologia, ICBS, Universidade Federal de Alagoas. ([email protected])
2
Graduanda em biologia, ICBS, Universidade Federal de Alagoas
3
Mestre em Genética Humana, ICBS, Universidade Federal de Alagoas
4
Mestre em Genética Humana, ICBS, Universidade Federal de Alagoas
5
Doutor em Genética Humana, ICBS, Universidade Federal de Alagoas
6
Professor Orientador, PPGQB, IQB, UFAL
1
Palavras-chave: Turnera ulmifolia, Penicillium purpurogenum, endofíticos, metabólitos, DNAr
Microorganismos endofíticos são capazes de produzir antibióticos e outros metabólitos especiais. Colonizam
assintomaticamente os vegetais, desenvolvendo uma relação mutualística. Para se garantirem contra inimigos naturais
as plantas desenvolvem mecanismos de coevolução cada vez mais sofisticados de defesa química. Turnera ulmifolia,
é amplamente distribuída desde as Guianas até a região Nordeste do Brasil. Alguns gêneros são utilizados como
antinflamatório, antidepressivo e calmante, pela produção de substâncias aleloquímicas, que são muito utilizadas na
medicina popular. O estudo e a identificação dos seus microrganismos endofiticos torna-se importante pelo seu potencial
biotecnológico para aplicação na agricultura e na medicina. Os métodos clássicos utilizados na taxonomia fúngica
baseiam-se na morfologia de estruturas reprodutivas, chegando-se em nível de gênero. Sendo a identificação de espécie
ou mesmo linhagens intra-específicas feitas pela análise molecular das regiões ITS1 e ITS4 do seu DNAr. Os objetivos
deste trabalho foram isolar e identificar molecularmente o fungo endofítico de caules de Turnera ulmifolia L. Foram
coletadas 10 a 30 amostras de partes aéreas de T. ulmifolia, dando preferência a plantas em época de floração, acima
de 40 centímetros e aparentemente saudáveis, sem manchas ou qualquer tipo de lesão causada por patógenos, insetos
ou danos mecânicos. O material foi processado logo após a coleta feita na horta experimental de plantas medicinais,
localizada próximo ao Instituto de Psicologia da Universidade Federal de Alagoas. Os explantes dos caules utilizados
foram lavados com detergente, desinfectados em solução alcoólica a 70% por 10s e em solução de hipoclorito de sódio
a 10% por 15 min. Os endofíticos foram isolados em meio em meio AA, sendo posteriormente transferidos para
meio de cultura BD e BS onde ficou incubado por setenta e duas horas. O conteúdo desta cultura foi centrifugado a
7.000 rpm por 10 min e o precipitado do micélio fúngico foi submetido à extração de DNA empregando-se técnica
de CTAB. O DNAr foi amplificado através técnica de PCR, utilizando-se os primers ITS1 e ITS4. As condições de
termociclagem foram: desnaturação inicial a 94ºC por 2 min, e 35 ciclos de 1 min a 94ºC, 30 seg a 55ºC e 30 seg a
72ºC. Os produtos amplificados foram seqüenciados utilizando seqüenciador automático ABI-310. A seqüência mista
obtida apresentou 573 nucleotídeos e foi submetida para análise de alinhamento por BLAST no banco de dados do
NCBI. A análise morfológica microscópica foi feita por microcultivo.O fungo isolado pode ser identificado, com base
na similaridade genética em 100% (AY373926) com o Penicillium purpurogenum, provavelmente aqui descrito pela
primeira vez como endofítico.
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Nectria sp., Phomopsis sp. e Xylaria sp.
fungos endofíticos isolados de Borreria
verticillata (Rubiaceae) L
Kamei, SH1; Silva, MV2; Vilas Boas, TP2; Barbosa, ABG1; Silva, IHEF1; Silva, LAF1; Tovar, FJ; Melo, BLB; Caetano, LC2
Laboratório de DNA Forense da UFAL
Laboratório de Biotecnologia de Plantas, IQB, UFAL
[email protected]
1
2
Palavras-chave: fungos endofíticos, Borreria, rDNA, região ITS
A Borreria verticillata, popularmente conhecida como vassourinha-de-botão, é uma erva rasteira daninha encontrada
em campos de cultura, pastos e beiras de estradas. É comumente utilizada como antimicrobiano e antinflamatório,
mediante preparação de chás das raízes, folhas e folíolos para combater as chamadas “doenças de mulher” - leucorréias e
inflamações do trato vaginal. Esta atividade foi atribuída a três alcalóides bis-indólicos encontrados nesta planta. Como
a interação endofítico e planta medicinal ainda é pouco conhecida, as propriedades farmacológicas dos metabólitos
produzidos pelo hospedeiro podem ser atribuídas aos fungos ou, provavelmente, à interação endófito-planta. Para uma
maior compreensão torna-se necessária a indentificação fúngica. A taxonomia clássica baseia-se principalmente em
estruturas reprodutivas. Contudo, caracterísitcas fenotípicas estão sujeitas a influência de fatores ambientais, tornando,
muitas vezes, complexa a distinção de espécies muito próximas ou de linhagens intra-específicas. Nesse contexto, o
seqüenciamento do rDNA tem se mostrado útil na distinção ou, por vezes, reclassificação das espécies. Assim, o presente
trabalho objetivou isolar e identificar fungos endofíticos de caules de Borreria verticillata. Para a estrilização superficial
utilizou-se solução de hipoclorito de sódio a 10% por 20 min. Os caules foram incubados em meio AA (agar-água).
Dos fungos que apareceram na superfície dos caules, três foram separados e nomeados BvC1, BvC2 e BvC3. Estes
foram transferidos sucessivamente para o meio BDA (batata-dextrose-agar) até sua total purificação. Posteriormente,
foram transferidos para o meio líquido BD (batata-dextrose), ficando incubados por 72 horas. Cada conteúdo foi
centrifugado a 7.000 rpm por 10 min e o precipitado foi submetido à extração de DNA empregando-se a técnica de
CTAB. Amplificou-se o rDNA dos fungos através da PCR, utilizando-se os primers ITS1 e ITS4, mediante as seguintes
condições: desnaturação inicial a 94ºC por 2 min, e 35 ciclos de 1 min a 94ºC, 30 seg a 55ºC e 30 seg a 72ºC. Os
produtos amplificados foram seqüenciados e alinhados. As seqüências consenso de BvC1, BvC2 e BvC3 apresentaram,
respectivamente, 457, 479 e 583 nucleotídeos, que foram submetidas à ferramenta BLASTn para a análise comparativa
com dados disponíveis no banco do NCBI. Para análise morfológica microscópica, utilizou-se a técnica de microcultivo e
análise em microscópio óptico. O endófito BvC1 pôde ser identificado, com base na similaridade genética, em 97% com
o Nectria sp., um importante saprófita e patógeno, e também endófito de Theobroma cacao. O fungo BvC2 apresentou
similaridade de 99% com Phomopsis sp., um patógeno da soja mas que também já foi isolado como endófito de Annona
squamosa. Já BvC3 mostrou 99% de similaridade com Xylaria sp., que sintetizam celulases e lignases, podendo atuar
como patógenos latentes, decompositores e endofitico de Annona squamosa, Palicourea marcgravii, entre outras. As
análises microscópicas mostraram-se compatíveis com as espécies identificadas.
Apoio financeiro: FAPEAL.
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Ocorrência de RNA dupla fita em
Guignardia citricarpa e G. mangiferae:
relações com a patogenicidade e
especificidade com o hospedeiro
Kava-Cordeiro, V; Nishimura, RC; Mariussi, T; Montenegro, DH; Stringari, D; Fabris, J; Silvano, C; Galli-Terasawa, LV;
Glienke, C; Azevedo, JL
Laboratório de Genética de Microrganismos - LabGeM, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná
[email protected]
Palavras-chave: RNA dupla fita, Guignardia citricarpa, Guignardia mangiferae
Fungos endofíticos são organismos que habitam os mais variados tecidos vegetais, sem lhes causar danos aparentes. Os
fungos fitopatogênicos são aqueles que causam algum dano à planta hospedeira. Várias espécies de fungos endofíticos
foram relacionadas taxonomicamente a patógenos virulentos do mesmo hospedeiro. O isolamento de fungos endofíticos
pertencentes a espécies historicamente patogênicas tem levado ao uso do termo “endofitismo” como sinônimo de
latência, presumindo que alterações nas condições microambientais levariam ao surgimento de sintomas, sugerindo
assim transições entre os estados endofítico e patogênico. Estratégias de biologia molecular têm sido empregadas para
diferenciar os isolados patogênicos e endofíticos de Guignardia spp, um fungo de isolamento freqüente. A espécie G.
citricarpa é fitopatogênica e responsável pela Mancha Preta de Citrus (MPC). A espécie G. mangiferae vem sendo isolada
com freqüência de plantas cítricas, mas de forma assintomática, sendo denominada de endofítica nestes casos. Para
diversas espécies de fungos fitopatogênicos já foi relatado que a virulência pode ser alterada, em geral reduzida, pela
presença de certos elementos citoplasmáticos, chamados de VLPs (“vírus-like particles”) compostos por RNA dupla
fita (RNAdf ). Consequentemente, as micoviroses têm gerado grande interesse e tornaram-se alvo de extensas pesquisas.
Embora haja um grande número de relatos sobre RNAdf em fungos, o significado biológico dessas micoviroses ainda é
incerto para a maioria dos casos. Desde 2002, isolados de G. citricarpa e G. mangiferae tem sido investigados quanto à
presença de RNAdf no LabGeM. A confirmação das espécies de Guignardia foi feita por PCR espécie-específica e por
agrupamento por marcadores gerados por RAPD em trabalhos anteriores do grupo. Neste período foi observado que
dos 211 isolados de G. citricarpa investigados, 19 (9%) apresentaram um mesmo padrão de uma única banda de RNAdf
(3100pb). Estes isolados provêm de diversas regiões geográficas e foram isolados de 1996 a 2008. Destes 19 isolados,
17 são provenientes de lesão de MPC e dois foram isolados de folhas assintomáticas. Este fato indica que diferente do
observado em outros fungos fitopatogênicos, o RNAdf não está relacionado com diminuição da patogenicidade em
G. citricarpa. Dos 116 isolados de G.mangiferae, apenas três (2,6%) apresentaram bandas extras de RNAdf. Nos três
casos, foram observadas duas bandas (2700pb e 1500pb) de RNAdf. Apesar do pequeno número de isolados de G.
mangiferae com bandas de RNAdf, parece haver uma relação de especificidade entre o tipo de RNAdf encontrado e a
espécie de Guignardia investigada.
Apoio Financeiro: Fundecitrus, Fundação Araucária, CNPq, CAPES, FAPESP.
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Marcadores morfológicos e moleculares
na identificação dos isolados de
Colletotrichum endofíticos de Maytenus
ilicifolia Mart. ex Reiss
Waculicz-Andrade, CE1; Pileggi, SAV2; Vicente, VA3; Pimentel, IC3; Kava-Cordeiro, V1; Teresawa, LVG1; Massola Jr, N4;
Tosse Jr, HJ4; Glienke, C1
Departamento de Genética, UFPR, Curitiba, PR
Departamento de Biologia Estrutural, Molecular e Genética, UEPG, Ponta Grossa, PR
3
Departamento de Patologia Básica, UFPR
4
Departamento de Fitopatologia, ESALQ/USP, Piracicaba, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Endofíticos, Colletotrichum
Colletotrichum é um gênero de fungo frequentemente encontrado como fitopatógeno e também como endofítico
em diferentes vegetais. Plantas medicinais com propriedades antimicrobianas são habitadas por microrganismos
endofíticos e a ação antibacteriana ou antifúngica poderia estar no endófito e não na planta, ou provavelmente na
interação. Maytenus ilicifolia Mart. Reiss (espinheira-santa) é uma planta medicinal utilizada no tratamento de várias
doenças devido à produção de compostos químicos, como triterpenos e polifenóis. O presente trabalho teve por
objetivo definir marcadores morfológicos e moleculares para identificação de espécies de Colletotrichum endofíticos de
M. ilicifolia. Inicialmente foi realizada a caracterização por meio de características macroscópicas e microscópicas após
crescimento em meio BDA (Merck) em diferentes temperaturas. A caracterização molecular foi realizada por meio de
marcadores RAPD, seqüenciamento da região ITS1-5,8S-ITS2 do rDNA e PCR espécie específico com os pares de
primers CgInt/ITS4 e Col1/ITS4. Tais primers amplificam bandas específicas em C. gloeosporioides e Colletotrichum sp.,
respectivamente. Marcadores RAPD demonstraram a existência de duas espécies de Colletotrichum endofíticas nestas
plantas, identificadas como C. gloeosporioides e C. boninense por meio de seqüências ITS. Este é o primeiro relato do
fungo C. boninense como endofítico de M. ilicifolia. A identificação dos isolados como C. gloeosporioides foi confirmada
por meio de PCR com os primers CgInt/ITS4. Entretanto, os isolados de C. boninense tiveram amplificação em PCR
com os primers Col1/ITS4. Propomos assim, a utilização dos primers Col1/ITS4 em PCR para identificação molecular
de C. boninense. Todos os isolados de C. boninense apresentaram crescimento radial reduzido em relação aos isolados de
C. gloeosporioides quando crescidos em meio BDA a 22°C em fotoperíodo de 12h. Houve diferença significativa também
entre o comprimento dos conídios dos isolados das duas espécies. Propomos assim, a utilização destas características
como marcadores morfológicos na distinção entre C. gloeosporioides e C. boninense.
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Análise funcional dos promotores Sod e
Fen do fungo Moniliophthora perniciosa em
Saccharomyces cerevisiae
Pessoa, TB¹; Sena, JAL²; Pirovani, CP³; Pungartnik, C³; Cascardo, JCM³
¹Graduanda em Ciências Biológicas - UESC
²Mestranda em Genética e Biologia Molecular - UESC
³Professor – Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC
[email protected]
Palavras-chave: promotores, Moniliophthora perniciosa, Saccharomyces cereviseae, SOD, FEN
O genoma de qualquer organismo está sob constante ação de agentes endógenos e exógenos que danificam o DNA,
como por exemplo, as espécies reativas de oxigênio (Reative Oxygen Species, ROS) que induzem a oxidação das bases e
a quebra do DNA (endógenos), ou radiação ultravioleta (UV) e agentes químicos (exógenos) (BRANZEI e FOIANI,
2008). Sabendo-se que o fungo Moniliophthora perniciosa induz a um grande acúmulo de ROS ao infectar células de
Theobroma cacao L. (CEITA et al., 2007), e que, consequentemente, ele se defende desse aumento de ROS expressando
genes de detoxificação (Sod), bem como por mecanismos de reparo de DNA (Fen), promotores dos genes Sod e Fen
do fitopatógeno foram isolados via reação de PCR do DNA genômico do fitopatógeno e clonados em vetores de
transformação genética de Saccharomyces cerevisiae, com o objetivo de analisar a função dos mesmos em outro fungo
com uma genética mais simples. Para tanto, os promotores foram inseridos no vetor da série pGREG (-HIS), o qual
dirige a ativação da síntese de histidina e em seguida, células da linhagem W303 de S. cerevisiae foram submetidas à
transformação genética via método Acetato de Lítio. As células foram então plaqueadas em meio seletivo suplementado
com aminoácidos, com exceção de histidina e incubadas a 30°C, durante 3 dias. As colônias obtidas após este período
foram submetidas ao diagnóstico de transformação via reação de PCR e a visualização foi feita em gel de agarose 1%
contendo brometo de etídeo. Os resultados revelaram a funcionalidade dos promotores de M. perniciosa em S. cereviseae,
sendo assim de grande importância para os estudos funcionais de promotores do fitopatógeno em S. cereviseae, visto que
para este organismo existe protocolo de transformação estabelecido. Além disso, os resultados aqui obtidos ajudam a
entender as características funcionais desses dois promotores de M. perniciosa, envolvidos em resposta a estresses oxidativos
e a danos causados ao DNA. Análises de deleção dos promotores ajudarão a mapear os cis-elementos envolvidos nas
respostas dos danos causados ao hospedeiro pelo fitopatógeno.
Apoio Financeiro: CNPq, FINEP e FAPESB.
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The genome survey of Moniliophthora
perniciosa, the causal agent of cacao
Witches’ Broom Disease, gives insights
about novel phytopathogenicity mechanisms
Mondego, JMC1; Carazzolle, MF1; Costa, GGL1; Formighieri, EF1; Parizzi, LP1; Rincones, J1; Cotomacci, C1; Carraro, DM2;
Cunha, AF1; Carrer, H3; Vidal, RO1; Estrela, RC1; García, O1; Thomazella, DPT1; Oliveira, BV1; Pires, ABL4; Rio, MCS1;
Araújo, MRR1; Castro, ALB5; Gramacho, KP6; Gonçalves, MS7; Góes-Neto, A8; Barbosa, LV9; Guiltinam, M10; Bailey, B11;
Meinhardt, LW11; Cascardo, JCM4; Pereira, GAG1
Laboratório de Genômica e Expressão, Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
2
Centro de Pesquisa Fundação Antônio Prudente
3
Departamento de Ciênicas Biológicas, ESALQ, USP
4
Laboratório de Genômica e Expressão Gênica, Departamento de Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC)
5
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia – CENARGEN, Brasília - DF
6
CEPLAC/CEPEC/SEFIT, Itabuna – BA
7
Laboratório de Biologia Molecular, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia (UFBA)
8
Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM), Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS)
9
Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Biologia, UFBA
10
The Department of Horticulture, The Pennsylvania State University, USA
11
Sustainable Perennial Crops Laboratory, USDA–ARS, USA
[email protected]
1
Keywords:: Moniliophtora perniciosa, eukaryotic genome, Witches’ broom disease, phytopathogenicity mechanisms, cacao
The basidiomycete fungus Moniliophtora perniciosa causes the Witches’ Broom Disease (WBD) in cacao (Theobroma cacao).
This fungus display a hemibiotrophic lifestyle, firstly colonizing the apoplast of cacao´s meristematic tissues as biotrophic,
then switching to a saprotrophic lifestyle during later stages of infection. The M. perniciosa sequencing project was launched
in 2001, having the intention of provide genomic information for the WBD research community. M. perniciosa genomic
DNA was extracted and sheared into fragments of approximately 2 Kbp. After DNA sequencing, the reads were clusterized
resulting in 17,933 contigs and 7,807 singlets. M. perniciosa genome size was estimated in approximately 39 Mb. For the
estimation of the amount of M. perniciosa genes, ab initio gene prediction and extrinsic prediction methodology were
applied resulting in 16,336 gene models. M. perniciosa gene density was estimated in 2.77 ± 0.39 Kbp/gene or 0.36 ±
0.05 gene/Kbp, a number that is in agreement with gene density data of other filamentous fungi. Automatic annotation
tool AutoFACT was applied generating a functional classification that was manually inspected. The Markov Clustering
(MCL) gene assembly algorithm and CDD-PFAM protein domain analyses revealed that the prevalent gene family in M.
perniciosa genome was Cytochrome P450, which suggests a significant capacity for detoxification and synthesis of secondary
metabolites. Other interesting genes identified in M. perniciosa genome data mining include genes that encode hydrophobins
and putative secreted polypeptides rich in cysteine, genes related to methanol metabolism, genes that encode proteins of
gibberellin and auxin biosynthesis, as well as expansions of proteins involved in retrotransposition, reactive oxygen species
resistance, drug efflux transport, lipid and cell wall degradation. Our analysis provides new evidence revealing potential
adaptive traits that may play major roles in the mechanisms of pathogenicity in the M. perniciosa/cacao pathosystem.
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Financial Support: FAPESP, CNPq, Secretaria de Agricultura do Estado da Bahia (SEAGRI).
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Assessment of Moniliophthora perniciosa
gene expression after H2O2 treatment via
Real Time-PCR
Melo, SCO; Cascardo, JCM; Brendel, M; Pungartnik, C
Centro de Biotecnologia e Genética, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, BA, Brasil
[email protected]
Keywords: Moniliophthora perniciosa, RT- qPCR, gene expression
The basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa (Mp) Singer is the causal agent of witches’ broom disease of cacao
(Theobroma cacao L.). M. perniciosa is endemic to the Amazon basin region of South America; this phytopathogenic
fungus has spread to cacao plantations throughout the Americas and the Caribbean islands. In order to identify M.
perniciosa genes differentially expressed during oxidative stress, dikaryotic broken-hyphae were grown in glycerol (GLY)
for 7 days and exposed for 0, 0.5, 1 and 2 h to the oxidative stress agent hydrogen peroxide (H2O2). Quantitative
reverse transcription amplification (qRT-PCR) was performed with genes identified in the Mp libraries and involved
in oxidative stress protection or autophagy in this fungus. The five presumed genes are: ACT1, actin; CTA1, encoding
peroxisomal catalase; CTT1, encoding mitochondrial catalase; SOD2, superoxide dismutase and ATG8, involved in
formation of autophagosomes. Expression values were estimated for these 5 genes based on quantitative RT-PCR using
2-(Ct) method at four sampling periods (0, 0.5, 1 and 2h). The average Ct from the triplicates was used to determine
differences in expression using the internal reference (actin). The relative gene expression of the MpSOD2 showed
slightly increased expression at 0.5 and 2 h after treatment. The two putative M. perniciosa catalase genes yielded a
different pattern of expression. MpCTA1 was repressed in all points while MpCTT1 showed a slightly increased level
of expression. The MpATG8 gene was highly induced at 0.5 and 1 h after treatment. Our results indicate that oxidative
stress induced by H2O2 elicits different physiological responses in the fungus M. perniciosa.
Financial support: CNPq, FAPESB.
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Expressão de hemolisinas em Moniliophthora
perniciosa durante a frutificação
Muniz Sobrinho, JS1; Porto, RF1; Dias, CV2; Pereira, GAG4; Pires, ABL3; Cascardo, JCM3
Discente - Laboratório de Genômica e Expressão Gênica - UESC
Docente - Laboratório de Genômica e Expressão Gênica – UESC
3
Doutorando - Laboratório de Genômica e Expressão Gênica - UESC
4
Docente – Laboratório Genômica e Expressão - Unicamp
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Moniliophthora perniciosa, Expressão gênica, Hemolisinas, Frutificação, Basidioma
Algumas hemolisinas têm sido identificadas em basidiomicetos e são diferencialmente expressas durante a formação
inicial de basidiomas. Essas proteínas possuem um domínio conservado denominado aegerolisina (PFAM 06355)
e são capazes de lisar células com membranas ricas em colesterol e esfingomielina, entretanto a função que exercem
na formação dos basidiomas ainda não está elucidada. Em uma biblioteca representativa da fase de frutificação de
M. perniciosa foram identificados 4 ESTs que apresentaram similaridade à essas proteínas. A submissão ao banco de
dados do genoma de M. perniciosa (www.lge.ibi.unicamp.br) permitiu a identificação de 3 genes, nomeados de Mp1PriA, Mp2-PriA e Mp3-PlyB, sendo os 2 primeiros similares aos que codificam para AA-Pri1 de Agrocybe aerogerita
e PriA de Pleurotus ostreatus e Mp3-PlyB similar ao que codifica para a Pleurotolisina B de P. ostreatus. Primers foram
confeccionados para esses genes e suas expressões foram analisadas por qPCR em diferentes momentos do cultivo in
vitro em condições indutoras de frutificação. Mp1-PriA mostrou um pico de expressão em basidiomatas, mas aumentou
levemente em primórdios, enquanto Mp2-PriA aumentou bastante no micélio rosa, mas foi muito superior em micélio
com primórdios. Mp3-PlyB manteve-se alta desde o micélio rosa até o micélio com primórdios e diminuiu bastante
em basidiomas. Esses resultados indicam que realmente esses genes devem estar envolvidos no processo de formação
de basidiomas em M. perniciosa e que não possuem funções sobrepostas.
Apoio Financeiro: CNPq.
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In silico analysis of Moniliophthora
perniciosa catalase B and its role during
infection of cacao
Villela-Dias, C; Melo, SCO; Brendel, M; Pungartnik, C; Cascardo, JCM
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Centro de Biotecnologia e Genética, Universidade Estadual de Santa Cruz, Bahia, Brasil
[email protected]
Keywords: Catalase, H2O2, reactive oxygen species
Catalase is an antioxidant enzyme that plays an important role in protecting against oxidative stress by detoxification of
hydrogen peroxide (H2O2). A gene for a putative catalase was identified in M.perniciosa genome database (http://www.
lge.ibi.unicamp.br/vassoura/) showing similarity with catalases belonging to the mycelial secreted catalases family (CatB).
The open reading frame (ORF) of 2163 bp, encodes a protein with 720 amino acids. The putative protein has a molecular
weight of 77.4 kDa with predicted isoelectric point (pI) of 5.97. The deduced amino acid sequence (named MpCatB)
has characteristic features of family of catalases such as: the catalytic site motif (82FDHENIPERVVH94ARGAG99) and
the heme-ligand signature motif (381RLLSYVDT388). Phylogenetic analysis included MpCatB in the secreted catalase
group (CATB) and the result of BLAST showed high similarity with the catalase B of Podospora anserina. To generate the
protein 3D structural model, the deduced amino acid sequence was submitted to the Swiss-Model (http://swissmodel.
expasy.org/SWISS-MODEL.html). The prediction was made using the default parameters. The crystal structure of
Penicillium vitale (PDB No. 2iufE) was selected automatically as template and show 57% of identity with the sequence
of MpCatB. In vitro studies of gene expression showed that this gene is up-regulated after H2O2 treatment, showing the
inducible ability to respond against oxidative stress generated by the H2O2 production in host cells. Our results suggest
that MpCatB can play an important role in the process of parasitism triggered by M. perniciosa, allowing oxidative
stress regulation by H2O2 detoxification.
Financial support: FAPESB.
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Moniliophthora perniciosa produz
clamidósporos sob condições
de estresse nutricional
Oliveira, BV1; Rincones, J1; Pereira, GAG1
Laboratório de Genômica e Expressão, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: Moniliophthora perniciosa, clamidósporos, ITS (internal transcribed spacer)
O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é o agente causador da vassoura-de-bruxa, doença que afeta o
cacau, ocasionando grandes prejuízos à produção cacaueira. M. perniciosa apresenta um ciclo de vida hemibiotrófico,
com duas fases distintas: a primeira, biotrófica e a segunda, necrotrófica. O Projeto Genoma da Vassoura-de-Bruxa,
coordenado pelo Laboratório de Genômica e Expressão da Unicamp, visa à elucidação dos processos moleculares da
interação planta-patógeno a partir da decodificação genética de M. perniciosa com o objetivo principal de identificar
vias metabólicas candidatas que possam ser utilizados no controle da doença. Nesse contexto, é necessário o estudo
detalhado da fase biotrófica do fungo, visto que esse tipo de micélio é o responsável pelo estabelecimento da doença.
A manutenção desse micélio em condições in vitro (micélio biotrophic-like) é extremamente difícil, visto que ele tente
a mudar rapidamente para a fase necrotrófica. Apesar de já existir um meio padronizado para a manutenção desse tipo
de cultura, não conseguimos reproduzi-lo em nosso laboratório. Dessa forma, realizamos várias modificações nesse
meio visando à manutenção do fungo na fase biotrophic-like. Mantivemos algumas culturas em meios contendo pouco
nutriente por alguns meses, nas quais observamos, em microscopia ótica, a presença de estruturas esféricas, altamente
refringentes, adjacentes às hifas do fungo. Essa observação foi refinada através de microscopia eletrônica de varredura.
Tais estruturas, com diâmetro aproximado de 7µm, foram identificadas como sendo clamidósporos (intercalares e
terminais), esporos mitospóricos de resistência geralmente produzidos em condições de estresse fisiológico, o que é
totalmente compatível com o estresse nutricional à qual essas culturas foram submetidas. Com o intuito de averiguarmos
a pureza dessas culturas, extraímos o DNA genômico do micélio, o qual foi utilizado de molde para a amplificação da
região ITS (internal transcribed spacer) do DNA ribossomal. Em M. perniciosa, os primers ITS1 e ITS4B delimitam uma
região de 888 pares de bases, sendo presente um sítio de restrição para a enzima EcoRI, a qual produz fragmentos de
526 e 362 pB. O padrão de amplificação e digestão da culturas que produziram os clamidósporos foi o mesmo do que
o de uma cultura pura da linhagem BP10 de M. perniciosa, confirmando assim a pureza de nossa cultura. A descrição
da formação de clamidósporos em meio de cultura é inédita na literatura de M. perniciosa.
Apoio financeiro: Fapesp e CNPq.
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The bioinformatics of Moniliophthora
perniciosa genome survey
Carazzolle, MF 1; Costa, GGL1; Mondego, JMC1; Vidal, RO1; Parizzi, LP1; Formighieri, EF1; Pereira, GAG1
Laboratório de Genômica e Expressão, Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
[email protected]
1
Keywords:: Moniliophtora perniciosa, bioinformatics, gene finders, Witches’ broom disease
The basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches’ Broom Disease (WBD) of cacao.
It is a hemibiotrophic pathogen that colonizes the apoplast of cacao’s meristematic tissues as a biotrophic pathogen,
switching to a saprotrophic lifestyle during late stages of infection. The Witches’ broom Genome Project (www.lge.ibi.
unicamp.br/vassoura) involving several Brazilian and international laboratories was initiated to increase efforts in WBD
investigation. The genome sequences were generated by SANGER technology and the assembly was performed using
PHRAP program. The statistical analyses yielded a genome length of 39 Mbp and genome coverage of the 1.9X. The
ab initio gene models prediction was performed with the trainable, open source gene finders AUGUSTUS, SNAP and
GENEZILLA. Since there was not enough training data, the gene finder training was performed in two stages. The
initial training set was constituted by genes from C. cinerea and ESTs sequences from M. perniciosa. This training set
yielded an initial set of gene predictions from M. perniciosa that were compared (BLASTX) against the non-redundant
protein database (NR). The predictions which aligned to a protein in NR for at least 90% of both query and subject
length were added to the final training set, this time with sequences from M. perniciosa only, that yielded our final set
of ab initio gene models. In addition, we have also used extrinsic approaches to find genes in genomic regions covered
by no ab initio gene model. For that, we have used spliced alignments between genomic and EST sequences, using
Exalin, and genomic and similar proteins, using GenomeThreader. The final predicted gene models were submitted
for a functional annotation using the software AutoFACT which determines the consensus in the blast reports from
UNIREF100, UNIREF90, NR, and KEGG databases (using BLASTx, e-value ≤ 1E-10) and CDD-PFAM (using
RPS-BLAST, e-value ≤ 1E-5). For an inference of M. perniciosa metabolic maps, we used Pathway Tools, software of
BioCyc databases, which generates a metabolic map from a previously annotated genome. In order to find the groups
of similar proteins, it was applied the MCL graph clustering algorithm generating a M. perniciosa gene family data.
Using these methodologies we generated 16336 gene models distributed in 25740 clusters. After functional annotation
73% of gene models were classified proteins. Of these 45% had an assigned function, 28% had similarities in NR but
the program could not assign a function (conserved hypothetical protein). The remaining gene models (27%) were
considered as unclassified proteins. At the present time, the amount of M. perniciosa sequences has been increased using
pirosequencing (454) technology. The hybrid assembly has been performed using NEWBLER and CAP3 programs,
and the actual genome coverage is 6.8X (1.9X for SANGER sequences and 4.9X for 454 sequences).
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Identificação e clonagem de novos genes
expressos por Moniliophthora perniciosa,
fungo causador da vassoura de bruxa
do cacaueiro
Estrela, RC; Costa, GGL; Mondego, JMC; Pereira, GAG
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
Palavras-chave: Moniliophthora perniciosa, genes novos, predição de genes, proteínas secretadas, patogenicidade
A vassoura de bruxa é uma doença do cacaueiro que tem como agente etiológico o fungo basidiomiceto hemibiotrófico
Moniliophthora perniciosa (Crinipellis perniciosa). Após a germinação de esporos o fungo em estágio biotrófico coloniza o
apoplasto da planta hospedeira causando uma série de sintomas provavelmente relacionados a desequilíbrios hormonais.
Algumas semanas após a infecção o patógeno muda para o estágio necrotrófico; nessa fase as hifas colonizam o espaço
intracelular causando necrose e morte celular na planta hospedeira. Alguns meses após a mudança de fase, são produzidos
basidiocarpos que ao liberarem esporos reiniciam o ciclo de infecção. Acredita-se que durante o estagio de vida biotrófico
o patógeno secreta uma série de proteínas essenciais à colonização que contribuem para o processo infeccioso. Algumas
dessas proteínas podem agir como proteínas efetoras, capazes de suprimir a resposta de defesa da planta hospedeira.
Pesquisas prévias com outros fitopatógenos mostraram que alguns genes específicos destes organismos podem estar
ligados a essa função efetora de patogenicidade. Desta forma, a busca por genes exclusivos de fitopatógenos pode ser
de extrema importância para o entendimento e controle de doenças. Algumas das características estruturais comuns
a proteínas com função efetora são: tamanho reduzido, presença de peptídeo sinal para exportação e alto número de
resíduos de cisteínas. O principal objetivo deste trabalho foi identificar novos genes exclusivos do fungo M. perniciosa que
possuam as características supracitadas estando, potencialmente, relacionados à patogenicidade. Para a busca por genes
novos utilizamos predição gênica computacional, e em seguida validamos esses genes por RT-PCR. Selecionamos 22
genes preditos (“gene models”), sem similaridade nos bancos de dados, que codificam proteínas hipotéticas pequenas (<
35kDa) contendo peptídeo sinal para exportação e contendo no mínimo dois resíduos de cisteína. Os oligonucleotídeos
para amplificação dos genes foram desenhados tendo como base as seqüências fornecidas pelos preditores gênicos. Dos
22 modelos gênicos selecionados 14 foram validados por RT-PCR, sugerindo que aproximadamente 65% das predições
computacionais foram bem sucedidas. Alguns desses genes foram clonados em vetores de replicagem fazendo parte
da “biblioteca de genes novos” e outros foram clonados em vetores de expressão de proteína, visando futuros testes de
funcionalidade.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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Moniliophthora perniciosa survival
strategies against the defenses of infected
Theobroma cacao
Pungartnik, C; Melo, SCO; Basso, TS; Macena, W; Cascardo, JCM; Brendel, M
Laboratório de Biologia de Fungos, Centro de Biotecnologia e Genética, da UESC, Ilhéus, BA, Brasil
[email protected]
Keywords: Moniliophthora perniciosa, Theobroma cacao, oxidative stress, autophagy
The hemibiotrophic basidiomycete Moniliophtora perniciosa is responsible for the “witches’ broom disease” in cacao
(Theobroma cacao). In order to understand under which conditions in parasite-plant interaction M. perniciosa changes
from monokaryotic to dikaryotic growth phase, and whether this change is coupled to altered sensitivity/resistance
to genotoxins, we compared sensitivities of both types of M. perniciosa cultures and of basidiospores to different
mutagens. Monokaryotic/dikaryotic glycerol or glucose-grown cells and basidiospores were exposed to the chemical
mutagens H2O2, Paraquat and 4-nitroquinoleine oxide (4NQO) and to irradiation with short ultra-violet (UVC).
The resistance ranking to the oxidative stress-inducing mutagens H2O2 and PAQ was: basidiospores > monokaryon
(glycerol) > dikaryon (glycerol) > dikaryon (glucose) whereas the predominantly direct DNA-damaging agents UVC
and the UVC-mimeticum 4NQO elicited the same resistance response in basidiospores and glycerol-grown mono/
dikaryotic cells and only glucose-grown dikaryotic cells showed significantly higher sensitivity. A molecular approach
was also tried: RT-PCR analyses of gene expression of MpATG8 (autophagy-related gene) of H2O2 or 4NQO-treated
dikaryotic glucose or glycerol-grown mycelia showed that glucose induced the MpATG8 mediated autophagy process
while glycerol did not or even slightly repressed induction of this gene. A model of M. perniciosa survival strategy is
presented, which summarizes data collected both in vivo and in vitro.
Financial support: CNPq, FAPESB.
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Caracterização de um gene similar a
taumatina expresso pelo fungo causador
da Vassoura de bruxa, Moniliophthora
perniciosa
Franco, SF; Teixeira, PJ; Thomazella, DPT; Medrano, FJ; Mondego, JMC; Pereira, GAG
Laboratório de Genômica e Expressão, Instituto de Biologia, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Taumatina, Moniliophthora perniciosa, cacau, Vassoura de Bruxa
Moniliophthora perniciosa é um fitopatógeno de grande importância econômica no Brasil, em especial na região do
sul da Bahia, por ser o fungo causador da doença do cacaueiro conhecida como Vassoura de Bruxa. Esse fungo possui
um ciclo de vida hemibiotrófico, apresentando duas fases distintas: a primeira fase biotrófica e a segunda necrotrófica.
Devido à importância econômica dessa doença no Brasil em 2000 foi criado o projeto genoma Vassoura de Bruxa,
gerando um banco de dados que vem sendo explorado com o intuito de desvendar as vias metabólicas utilizadas pelo
patógeno para colonizar o cacaueiro. Em interações planta-patógeno, onde existe resposta hipersensitiva (HR), há a
indução da expressão de várias proteínas PRs (patogenesis related) que agem contra os patógenos. Entre elas se destacam
as PR-5, conhecidas como proteínas similares a taumatina, que têm como característica principal a atividade antifúngica
e clivagem de β-glucanas. Curiosamente, foi verificada no banco de dados de ESTs de M. perniciosa a expressão de um
gene similar a taumatina O presente projeto tem como objetivo a clonagem do gene MpTLP (M. perniciosa Thaumatinlike protein), a expressão da proteína recombinante MpTLP, o estudo da expressão desse gene durante o desenvolvimento
de M. perniciosa e a análise de seu promotor, a fim de que possamos ampliar o conhecimento sobre esse gene e inferir
possíveis funções dessa proteína no referido patossistema. Análises de Soutern blot e Pulse field sugerem que existam no
mínimo duas cópias do gene MpTLP em M. perniciosa. Análises filogenéticas de MpTLP indicam que esse gene está
inserido em um clado de taumatinas de basidiomicetos. Experimentos de Northern Blot demonstraram que MpTLP é
mais expresso em micélios necrotróficos jovens do que em senescentes e que sua expressão foi aumentada em presença
de extrato de cacau, sugerindo que esse gene participe da interação planta-patógeno. Experimentos de Real-time PCR
mostraram que MpTLP é mais expresso em micélios biotróficos do que em micélios necrotróficos e basidiomas do
fungo. A superexpressão de MpTLP em E.coli BL21(DE3) resultou em grandes quantidades de proteína recombinante
na fração insolúvel. Estratégias de renaturação da proteína a partir de corpos de inclusão foram conduzidas, resultando
em frações solúveis que estão sendo utilizadas em testes de atividade antifúngica e em ensaios de atividade β-glucanase.
Buscas por cis-elementos regulatórios na região promotora de MpTLP foram executadas. O promotor de MpTLP foi
clonado no plasmídeo YEP358 e os transformantes em Saccharomyces cerevisae estão sendo submetidos a testes de
indução do gene repórter LacZ.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Avaliação da produção de giberelina pelo
fungo Moniliophthora perniciosa causador
da vassoura-de-bruxa
Ambrósio, AB1; García, OC1; Milagre, HMS2; Pereira, GAG1
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
Laboratório ThoMSon, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Moniliophthora perniciosa, interação planta-patógeno, desbalanço hormonal, giberelina
O fungo Moniliophthora perniciosa é o agente causador da doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Em menos de uma
década essa doença levou o Brasil de exportador a importador de cacau, constituindo um problema complexo para a
região da Bahia, maior produtora de cacau do país. Os sintomas característicos da vassoura-de-bruxa são a hiperplasia
e hipertrofia das células dando lugar aos tecidos anômalos chamados de vassoura, superbrotamento e aparecimento
de frutos partenocárpicos. Esse fenômeno pode ser conseqüência de desbalanço hormonal. Análises do genoma de M.
perniciosa sugerem que o fungo poderia estar produzindo giberelina. Se esta hipótese for comprovada experimentalmente,
explicaria muito dos eventos que acontecem durante a interação M. perniciosa-cacaueiro. Assim sendo, este trabalho tem
o objetivo de estudar a possibilidade de M. perniciosa produzir giberelina; assim como o possível papel desse hormônio
na progressão da doença; possibilitando o desenvolvimento de novas estratégias para intervenção tecnológica e controle
da doença vassoura-de-bruxa. Análises de seqüências no banco de dados do genoma de M. perniciosa mostraram a
presença de seqüências semelhantes à cada um dos genes que constituem a via de síntese de giberelina descrita em
fungos. Foi detectado um gene com similaridade ao gene que codifica a enzima bifuncional copalil difosfato sintaseent-caureno sintase (CPS-KS), específica da via de síntese de giberelinas. Análises de seqüência mostram que este gene
em M. perniciosa codifica uma proteína de 613 aminoácidos, sendo menor do que as CPS-KS descritas em fungos
ascomicetos. Buscas em genomas publicados de basidiomicetos não permitiram a identificação desse gene. Análise do
genoma do fungo Moniliophthora roreri permitiram a detecção de duas seqüências com similaridade com CPS-KS de
tamanho aproximado ao gene de M. perniciosa. Análises filogenéticas desse gene não permitiram fazer inferências sobre
a sua herança em M. perniciosa já que não agrupa com proteínas de plantas nem de ascomicetos. Isso provavelmente
porque o gênero Moniliophthora é o primeiro dos basidiomicetos em que esse gene é detectado. Fragmentos de três
dos genes putativos para a via de síntese de giberelina (geranilgeranildifosfato sintase, CPS-KS e GA4 desaturase) foram
amplificados a partir do DNA genômico e comprovada a identidade por sequenciamento. Foi verificada a expressão dos
três genes em estudo em duas fases do ciclo de vida do fungo (biotrófica-like e necrotrófica) mediante PCR a partir de
amostras de cDNA. Foi detectada a presença de uma substância com massa molecular semelhante à giberelina comercial
GA3 em amostras de sobrenadante de cultura do fungo na fase biotrófica-like a través da análise por cromatografia
de camada fina acoplada a espectrometria de massas. O conjunto de dados obtidos sugere que o fungo M. perniciosa
poderia produzir giberelina na fase biotrófica do seu ciclo de vida.
Órgão Financiador: Capes.
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Moniliophtora perniciosa, o fungo causador da
Vassoura de Bruxa no cacaueiro, possui genes
pertencentes à família PR-1 diferencialmente
expressos ao longo de seu desenvolvimento
Teixeira, PJ; Franco, SF; Thomazella, DPT; Mondego, JMC; Pereira, GAG
Laboratório de Genômica e Expressão, Instituto de Biologia, Unicamp
[email protected]
Palavras-chave: Vassoura de Bruxa, Moniliophtora perniciosa, genes PR-1
O fungo basidiomiceto Moniliophtora perniciosa é o agente etiológico da doença Vassoura de Bruxa no cacaueiro
(Theobroma cacao). A sua introdução em 1989 no sul da Bahia, principal região produtora brasileira, reduziu drasticamente
a produção do Brasil, um dos principais produtores de amêndoas de cacau do mundo até então, transformando-o em
um importador do produto. M. perniciosa possui dois estágios de vida distintos sendo classificado como hemibiotrófico.
Inicialmente, o fungo assume um estágio biotrófico e infecta tecidos vivos do cacaueiro. Durante a progressão da doença
ocorre morte do tecido vegetal e o fungo assume um estágio morfogenético distinto, classificado como saprotrófico. Após
períodos intermitentes de chuva e seca, ocorre a produção de basidiomas responsáveis pela liberação de basidiósporos
que, ao germinarem sobre o tecido meristemático do cacaueiro, reiniciam o ciclo infectivo do patógeno. O Laboratório
de genômica e expressão da Unicamp realiza pesquisas visando o entendimento da biologia deste patógeno e de sua
interação com o cacaueiro. A análise do genoma de M. perniciosa revelou a existência de quatro genes pertencentes à
família PR-1 (Pathogenesis Related 1), denominados MpPR-1a a MpPR-1d. Genes PR-1 estão amplamente distribuídos
em eucariontes como plantas, humanos, moluscos, nematódeos e fungos apresentando funções relacionadas à
diferenciação morfológica, patogenicidade e defesa. Em nematódeos patogênicos, genes PR-1 parecem ser importantes
para determinação da patogenicidade, sendo mais expressos durante os estágios infectivos destes parasitas. No fungo
Candida albicans a deleção de um gene PR-1 ocasiona em perda da capacidade infectiva e na incapacidade de realizar
a transição da forma leveduriforme para a forma filamentosa. Este trabalho tem como objetivo verificar uma possível
participação dos genes MpPR-1 nos processos de estabelecimento da infecção e patogenicidade de M. perniciosa sobre
o cacaueiro. Através de Real Time PCR verificou-se o padrão de expressão dos quatro genes MpPR-1 em primórdios de
basidiomas, basidiomas maduros e em micélios cultivados in vitro das fases biotrófica (biotrophic-like) e saprotrófica.
Os resultados demonstraram que os genes MpPR-1a e MpPR-1b têm maior expressão durante a fase biotrophic-like,
enquanto os genes MpPR-1c e MpPR-1d são mais expressos em basidiomas maduros. Experimentos de Northern Blot
revelaram que a adição de ácido salicílico (um indutor de mecanismos de defesa em plantas), e extrato de cacau ao
meio de cultura da fase saprotrófica do fungo induz de maneira significativa o gene MpPR-1a. Estes resultados são um
indício de que um ou mais genes MpPR-1 possam estar envolvidos em processos de infecção. Para realização de testes
de atividade com proteínas MpPR-1, a região codante dos genes MpPR-1a e MpPR-1b foram clonadas em vetores
de superexpressão protéica e, então, utilizadas para transformação de cepas de Escherichia coli BL21. A expressão das
MpPR-1a e MpPR1-b foi realizada com sucesso.
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Avaliação da reposta molecular
de fagócitos murinos a esporos do fungo
Trichoderma stromaticum
Alves-Filho, ER; Batista, NV; Nascimento, ML; Noronha, FSM; Santos, JL; Costa, MGC
Genética e Biologia Molecular, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
Palavras-chave: Fagócitos, mecanismos microbicidas, receptores de membrana, iNOS, Trichoderma stromaticum
O controle do Moniliophthora perniciosa é de extrema importância para a preservação das plantações de cacau na região sul
da Bahia. Devido aos seus mecanismos de ação, o Trichoderma stromaticum está sendo usado como agente de biocontrole
no combate à vassoura-de-bruxa, sob a forma de biopesticida, o “Tricovab”, produzido e distribuído pela CEPECCEPLAC, Ilhéus-BA. Por ser manipulado e pulverizado num ambiente onde circulam pessoas e animais, o interesse deste
estudo foi investigar o efeito de esporos de T. stromaticum em células do sistema imune de camundongos. Os fagócitos
são responsáveis pelo reconhecimento, fagocitose e produção de substâncias tóxicas contra diversos microrganismos
invasores. Na tentativa de investigar a ação de T. stromaticum sobre essas células, neutrófilos e macrófagos peritoneais de
camundongos foram coletados e interagiram com diferentes concentrações dos esporos do fungo. O estudo mostrou que
os esporos inibem dois importantes mecanismos microbicidas de fagócitos, a produção de espécies reativas de oxigênio
(ROS) por neutrófilos e a produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos. Interessantemente, receptores de membrana
incluindo Dectina-1 e receptores tipo Toll (2 e 4) responsáveis pelo início da cascata de sinalização da via de produção
de ROS e NO respectivamente, também foram inibidos pelos esporos. Mostramos que a inibição da produção de NO
foi reflexo da redução dos níveis de expressão de iNOS, enzima responsável pela conversão de L-arginina em citrulina
e óxido nítrico. Após verificar a regulação negativa dos mecanismos microbicidas dos fagócitos causada pelos esporos,
nosso interesse foi investigar a possibilidade do esporo estar interferindo no curso de infecções cujo controle depende dos
mecanismos inatos da defesa. Dessa forma utilizamos o modelo de resistência para Leishmania major já bem esclarecido.
Após inalarem esporos do fungo, camundongos C57BL/6 foram inoculados na pata com formas promastigotas de
L. major. As patas foram medidas semanalmente e os resultados mostraram um aumento de 100% da lesão naqueles
animais que inalaram os esporos, além de aumentar o tempo de regressão dessa lesão mostrando que os esporos modulam
os mecanismos microbicidas in vivo, tornando o hospedeiro susceptível a L. major. Assim, pode-se dizer que, apesar
de não ser considerado um patógeno, os esporos do fungo, usados como controle biológico provavelmente induzem
mecanismos de imunossupressão. Este fato deve ser levado em consideração durante o uso do biofungicida na lavoura
cacaueira, principalmente no sul da Bahia, região considerada zona endêmica de leishmaniose.
Apoio financeiro: FAPESB.
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Identificação de um gene relacionado a
produção de melanina em Colletotrichum
lindemuthianum, agente causal da antracnose
do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris)
Santos, LV1,2; Araújo, EF1,2; Queiroz, MV1,2
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária – BIOAGRO
Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Colletotrichum lindemuthianum, REMI, melanina, patogenicidade
A antracnose causada pelo fungo filamentoso Colletotrichum lindemuthianum, é uma das doenças mais comuns e
severas do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) acarretando grandes perdas na produção. Esse patógeno afeta o feijoeiro em
todos os estágios de desenvolvimento, atacando diversos tecidos. Uma estratégia amplamente usada para detectar genes
envolvidos na patogenicidade é o isolamento de mutantes. Entre as técnicas de mutagênese empregadas, a inativação
gênica com plasmídeos utilizando a técnica de transformação REMI (Integração Mediada por Enzima de Restrição)
tem se destacado, pois já permitiu a detecção e isolamento de importantes genes em fungos fitopatogênicos. Desta
maneira, o gene interrompido fica marcado, facilitando sua recuperação e identificação. O isolado A2 2-3 da raça 89
de C. lindemuthianum foi transformado com o plasmídeo pSM1 em presença da enzima de restrição HindIII (10U),
empregando a técnica REMI. Foi observado que um dos transformantes obtidos (denominado LVSa1) apresentou
deficiência na pigmentação no micélio. Diversos estudos provam que a presença da melanina é necessária durante o
processo de infecção em vários fungos fitopatogênicos. O objetivo deste trabalho foi a recuperação e a identificação do
gene interrompido. O DNA do mutante foi digerido com as enzimas de restrição BglII e PstI, transferido para uma
membrana de nylon e hibridizado com o plasmídeo pMS1. Para recuperar o gene inativado, foram utilizadas duas
estratégias. Na primeira, o DNA total do mutante albino foi clivado com a enzima PstI e os fragmentos de DNA foram
circularizados e usados para transformar células ultra competentes de Escherichia coli DH5α. Na estratégia alternativa,
foi feita uma reação de PCR usando o oligonucleotídeo iniciador M13 Reverse, que anela no vetor na região que
flanqueia o gene interrompido, e um oligonucleotídeo iniciador arbitrário. O resultado da hibridização mostrou que
houve uma inserção única do plasmídeo no genoma do fungo. Após o emprego das duas estratégias de recuperação do
gene foram isolados dois plasmídeos denominados pRescueE e pRescue24. Ambos carregavam sequências do genoma
de C. lindemuthianum. A sequência de DNA de C. lindemuthianum encontrada no plasmídeo pRescue24 mostrou
baixa similaridade com a sequência do gene que codifica a proteína quitina sintase classe II nos fungos Coccidioides
immitis e Coccidioides posadassi. Essa proteína é responsável pela síntese de quitina, que é encontrada na parede celular
de diversos fungos. Alguns estudos relatam que a falta de quitosana (polímero obtido pela desacetilação da quitina)
na composição da parede celular reduz a capacidade de reter melanina. Atualmente, o fragmento de DNA recuperado
está sendo usado como sonda para a clonagem do gene completo de um banco genômico de C. lindemuthianum. O
gene isolado será usado para transformar o mutante LVSa1, a fim de restaurar seu fenótipo e confirmar a importância
da proteína na patogenicidade do fungo C. lindemuthianum.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG.
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Clonagem do gene que codifica um
transportador de membrana da família MFS
em Colletotrichum lindemuthianum
Pacheco, MVB; Bazzolli, DMS; Araújo, EF; Queiroz, MV
Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: Colletotrichum lindemuthianum, família MFS, transportadores de membrana
A antracnose do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) é uma doença de grande importância que acomete esta cultura e
apresenta, como agente etiológico, o fungo Colletotrichum lindemuthianum. Devido ao fato deste fitopatógeno apresentar
um grande número de raças fisiológicas diferentes e ampla variabilidade patogênica, torna-se difícil o desenvolvimento
de estratégias eficazes que possam ser utilizadas para o controle da doença. Entretanto, observa-se que a resistência
de cultivares de feijão associada ao uso de fungicidas constitui-se uma importante estratégia comumente utilizada no
controle da antracnose do feijoeiro. Neste contexto, os transportadores de membrana são hoje proteínas de amplo
interesse no entendimento da ocorrência de resistência dos fungos às drogas utilizadas no campo. Nesse presente
trabalho, a partir da triagem do banco genômico de C. lindemuthianum LV49 (raça fisiológica 81), utilizando uma
sonda de DNA de 408 pb que codifica para uma seqüência parcial do transportador MFS obtido a partir do isolado
LV49, foram isolados quatro fagos recombinantes denominados λ MFSCl-1, λ MFSCl-2, λ MFSCl-3 e λ MFSCl-4.
A análise dos perfis de clivagem e de hibridização apresentados pelos fagos recombinantes permitiu comprovar que os
mesmos são diferentes entre si, sendo que o fago λ MFSCl-3 foi escolhido para estudos posteriores. Um fragmento de
2,3 kb deste clone originado pela clivagem com SalI foi subclonado e sequenciado, mostrando homologia com outros
transportadores MFS de fungos. Trabalhos estão sendo conduzidos no sentido de determinar a organização deste gene
no genoma de C. lindemuthianum e sua expressão em diferentes condições.
Apoio financeiro: FAPEMIG/CAPES.
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PacCl, o fator de transcrição de resposta ao
pH do fungo Colletotrichum lindemuthianum
Nogueira, GB; Soares, MA; Araújo, EF; Queiroz, MV
Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: Colletotrichum lindemuthianum, antracnose, pacCl, resposta ao pH
O fungo Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose, uma das mais importantes doenças que acometem
a cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris). Sua notória variabilidade genética tem dificultado significativamente a obtenção
de estratégias de controle da doença. Desse modo, o isolamento de genes que contribuam para a patogenicidade do fungo,
levando a elucidação dos mecanismos envolvidos na interação de C. lindemuthianum com o seu hospedeiro, possibilitará
a elaboração de novos e eficientes métodos de combate à doença. Nesse contexto, o gene pacC/HIM101, constitui um
importante alvo de estudos, pois codifica um fator de transcrição que regula a resposta adaptativa dos fungos ao pH
ambiental. Esse processo ocorre ativamente em muitos fungos e já foi bem caracterizado em Aspergillus nidulans. Em
trabalhos anteriores, o cDNA correspondente ao gene pacC de C. lindemuthianum (denominado pacCl), bem como
um mutante denominado Mutpac2 foram obtidos, e foi também demonstrado que a proteína PacCl é necessária à
patogenicidade de C. lindemuthianum. Para uma melhor compreensão da regulação do gene pacCl foi realizado neste
trabalho o seu isolamento a partir do banco genômico de C. lindemuthianum, bem como uma caracterização do mutante
Mutpac2 quanto à resposta ao estresse salino. Para isolamento do gene foi utilizada a metodologia de hibridização de
DNA em placas de lise, a partir de um banco genômico construído no fago λEMLB3, usando como sonda o cDNA
do gene de interesse. Para a análise do mutante Mutpac2, as linhagens selvagem e mutante foram crescidas em meio de
cultura contendo LiCl (0,1M e 0,15M), e NaCl (0,4M e 0,8M) por 10 dias. Foram isolados quatro fagos recombinantes
positivos, denominados respectivamente de λpac1.1, λpac2.1, λpac3.1 e λpac4.1, os quais apresentaram diferentes
perfis de restrição/hibridização. Oligonucleotídeos específicos foram desenhados a partir da seqüência de cDNA do
gene, os quais foram utilizados para amplificar um fragmento de aproximadamente 2,3 kb. Após subclonagem desse
fragmento no vetor pGEM-T easy, cerca de 300pb foram seqüenciados e o alinhamento múltiplo com o banco de
dados (GenBank), confirmou o isolamento do gene pacCl. A análise do mutante Mutpac2 revelou uma significativa
sensibilidade do mesmo ao estresse causado por NaCl e LiCl, quando comparado à linhagem selvagem LV49
(raça fisiológica 81) sugerindo a relação entre a proteína PacC e a tolerância ao estresse salino, possivelmente pela
ativação de um sistema de efluxo de cátion, como já foi demonstrado ocorrer em outros fungos.
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Compatibilidade vegetativa e formação de
heterocário entre diferentes isolados de
Colletotrichum lindemuthianum através de
mutantes nit
Carvalho, CR; Mendes-Costa, MC
Laboratório de Pesquisa I (Fungos), Centro Universitário de Lavras – UNILAVRAS
[email protected]
Palavras-chave: Colletotrichum lindemuthianum, mutantes nit, heterocário
A antracnose do feijoeiro é causada por Colletotrichum lindemuthianum, patógeno causador de danos expressivos à
cultura. A utilização de cultivares resistentes é uma das maneiras de se prevenir a doença, porém é dificultada pela
grande variabilidade do patógeno. Os mecanismos genéticos responsáveis pela grande variabilidade apresentada por
esse fungo não são totalmente conhecidos. A formação de heterocários entre diferentes linhagens é um componente
importante do ciclo de vida de muitos fungos. A heterocariose pode ser uma possível causa de aumento da variação
genética nesta espécie. Linhagens que são capazes de se fundirem (anastomose) e formar heterocários estáveis e funcionais
são conhecidas como sexualmente ou vegetativamente compatíveis, sendo descritas como membros do mesmo grupo
de compatibilidade vegetativa ou VCG (LESLIE, 1993). O conhecimento de VCGs é de particular interesse em fungos
assexuados, pois, subdividem a população em grupos que podem trocar informação genética via heterocariose e o ciclo
parassexual. Dentre as técnicas utilizadas para os estudos de VCGs destaca-se a produção de mutantes nit. Este trabalho
teve como objetivos: obter heterocários através da seleção de mutantes nit em diferentes isolados de C. lindemuthianum,
determinar os VCGs e consequentemente avaliar um mecanismo potencial de aumento de variabilidade genética da
espécie. Utilizou-se 20 isolados que foram mantidos em meio M3. Segundo técnica descrita por Brooker et al. (1991)
recuperaram-se os mutantes nit e estes foram classificados fenotipicamente de acordo com o crescimento micelial em
meios suplementados com diferentes fontes de nitrogênio. Recuperaram-se 17 mutantes das diferentes classes fenotípicas:
nit1, nit2, nit3 e nit M. Do confronto entre as colônias dos diferentes mutantes nit em meio de nitrato, foram obtidos
9 heterocários. Tais isolados foram divididos em 9 VCGs, sendo 1 grupo composto de 8 isolados, 1 composto por
2 e 7 compostos de 1 isolado separado e diferente. Para formação de anastomoses selecionou-se 10 mutantes que foram
confrontados dois a dois. Após o tempo de crescimento, as hifas foram coloridas com Orceína acética (2%), e analisadas
ao microscópico óptico. Os resultados obtidos da formação de anastomoses foram submetidos à análise de similaridade e
obtido o agrupamento através do programa NTSYS – pc 2.1 (ROHLF, 2000). Na formação de anastomoses obtiveram-se
31 combinações compatíveis, 24 incompatíveis. Concluiu-se que a metodologia utilizada permitiu a seleção de mutantes
nit em C. lindemuthianum, possibilitou a determinação de VCGs e a formação de heterocários, sendo adequada para
demonstração de mecanismos de aumento de variabilidade genética nesta espécie.
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Obtenção e regeneração de protoplastos
em Phaeoisariopsis griseola, agente causal
da mancha-angular do feijoeiro comum
Gonzaga, LL; Lima, SS; Araújo, EF; Queiroz, MV
Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: Phaeoisariopsis griseola, protoplastização, mancha-angular, fitopatógeno, estabilizador osmótico
O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) é considerado uma excelente fonte de proteínas e constitui uma das bases
alimentares da população brasileira. Essa leguminosa é acometida pelo fungo Phaeoisariopsis griseola (Sacc) Ferraris,
agente etiológico da mancha-angular que ocorre em mais de 60 países e pode ocasionar perdas de até 70% na produção
feijoeiro no Brasil. Por causar um grande impacto econômico, se faz necessário o desenvolvimento de técnicas que
permitam contribuir para o entendimento da biologia deste fitopatógeno. Nesse contexto, a obtenção e regeneração de
protoplastos permitirá determinar o cariótipo eletroforético, realizar transformação genética e fusão de protoplastos,
possibilitando a análise funcional de genes. O objetivo desse trabalho foi isolar e regenerar protoplastos do fungo P.
griseola. Para a obtenção dos protoplastos foram empregados 500mg de micélio do isolado Ig865, patótipo 63-31, o
estabilizador osmótico KCl 0,8M em tampão fosfato 10mM pH 5.8 e a enzima lítica “Lysing Enzymes” extraída de
Trichoderma harzianum (“Sigma Chemical Co.”), na concentração de 7mg/mL. A preparação foi incubada a 30ºC e 80rpm.
Para determinar o melhor estabilizador osmótico para a regeneração dos protoplastos foram testados os seguintes
estabilizadores osmóticos adicionados em meio de polpa de tomate: manitol 0,6M; sorbitol 0,5M; e sacarose 0,6 e 0,7M.
Periodicamente, os protoplastos foram observados e contados em microscópio óptico com auxílio de câmara de
Neubauer, apresentando tamanho e aspecto uniforme. Os protoplastos (6x106/mL) foram obtidos após quatro horas
de tratamento e as freqüências de regeneração variaram de 0,041 a 0,084%. A maior freqüência de regeneração obtida
foi de 0,084% quando sacarose 0,6M foi utilizada. Este trabalho descreve, pela primeira vez, um protocolo para a
obtenção e regeneração de protoplastos em P. griseola. Este resultado terá uma aplicação imediata em estudos genéticos
com este importante fitopatógeno, visando entendimento dos mecanismos de patogenicidade.
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Análise comparativa do efeito da cafeína na
expressão dos genes de poligalacturonases
em Sclerotinia sclerotiorum
Breseghelo, L1; Moura, ALD1; Oliveira, MB1; Alves, EB1; Soares, DA; Petrofeza, S1
Departamento de Bioquímica e Biofísica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás
[email protected]
1
Palavras-chave: Sclerotinia sclerotiorum, AMPc, Poligalacturonases, Cafeína, Fosfodiesterase
O fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum é um fungo necrotrófico, de ampla distribuição mundial e de grande importância
na área agrícola. O ataque do fungo ao hospedeiro envolve a ação de diversas enzimas dentre elas as poligalacturonases
(PGs). Estas enzimas quebram as ligações existentes no ácido poligalacturônico, componente estrutural da parede celular
das plantas, causando a maceração do tecido vegetal. O AMPc, uma molécula sinalizadora intracelular que é sintetizada
e direcionada à vários processos bioquímicos, entre eles, na transição da fase saprofítica para a parasitaria, dessa forma
ele ativa a produção de enzimas que degradam a parede celular da planta hospedeira. É conhecido que a cafeína atua
como um inibidor da degradação do AMPc, através da inativação de uma fosfodiesterase. Dessa forma analisamos o
papel da cafeína, e consequentemente da elevação dos níveis de AMPc, sobre a expressão de genes de poligalacturonases,
e a atividade enzimática destas enzimas durante o crescimento de S. sclerotiorum em diferentes fontes de carbono. O
fungo foi crescido em meio mínimo contendo como fontes de carbono 1% pectina ou 1% extrato de parede celular
de plantas de feijoeiro, acrescidos de 5 mM de cafeína. Após 12, 24, 48 72 e 96 horas a expressão dos genes pg1, pg3,
pg5, pg6 e pg7 foi analisada através de RT-PCR semi-quantitativo e a atividade enzimática do sobrenadante de cultura
foi determinada. A análise densitométrica das RT-PCR indicaram no tratamento com pectina/cafeína, em comparação
ao tratamento sem cafeína, um aumento na expressão dos genes pg1 em 48 horas, pg3 e pg5 no tempo de 96 horas,
pg6 em 72 e 96 horas e pg 7 em todos os tempos analisados. No tratamento com extrato de parede celular de feijoeiro,
não houve diferenças significativas na expressão gênica entre controle e tratamento. A atividade enzimática das PGs
no tratamento com pectina/cafeína demonstrou ser mais elevada em relação ao meio sem cafeína, principalmente
nos tempos de 24 e 96 horas, provocado pela maior liberação de enzimas e indicando uma antecipação do período
esperado para secreção destas enzimas. Os dados obtidos neste trabalho sugerem uma relação entre os níveis de AMPc
e a expressão de poligalacturonase para o fungo S. sclerotiorum.
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PGIPs são diferencialmente expressos
em feijoeiro durante a infecção de
Sclerotinia sclerotiorum
Oliveira, MB1; Nascimento, LB1; Lobo Junior, M2; Petrofeza, S1
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil
2
Embrapa Arroz e Feijão, Cx Postal, CEP, Santo Antônio, Goiás, Brazil
[email protected]
1
Palavras-chave: Sclerotinia sclerotiorum, polygalacturonase-inhibiting protein, endopolygalacturonase, phathogenesis,
oligogacturonides
A podridão branca é uma doença que acomete muitas espécies de plantas de interesse econômico. Tal doença é caracterizada
pela maceração dos tecidos da planta dando a estas um aspecto de podridão. O fungo Sclerotinia sclerotiorum, conhecido
também por mofo branco, é um fungo de solo causador desta doença. A cultura do feijoeiro sofre perdas expressivas
em sua produção, causada por S. sclerotiorum. Quando este patógeno infecta a planta seu primeiro desafio é vencer a
parede celular, para isso, produz enzimas responsáveis por degradar a parede celular da planta hospedeira. Dentre as
principais enzimas estão as endopoligalacturonases, responsáveis por degradar o polímero de pectina. A planta por
sua vez ativa seus mecanismos de defesa produzindo proteínas inibidoras de poligalacturonases (PGIPs) que limita o
potencial destrutivo do fungo. O presente trabalho caracterizou a expressão de genes de endopoligalacturonases e PGIP
em hastes de feijão (Phaseolus vulgaris L.) infectado com S. sclerotioum para determinar sua associação com o processo
de infecção. A análise transcricional de genes foi realizada empregando RT-PCR semi-quantitativo. Sob condições
de patogenicidade, os genes correspondentes a endopoligalacturonase do fungo S. sclerotiorum: PG1 foi altamente
expresso durante a infecção; PG3 foi regulado durante as últimas fases de infecção; PG5 apresentou níveis constantes
de expressão; PG6 e PG7 tiveram expressão reduzida. Durante este processo de infecção, nos estágios iniciais não foi
detectado na planta transcrito correspondente ao gene Pvpgip1, enquanto sua presença foi revelada a 72 – 96 horas
após a inoculação. Altos níveis de expressão do gene Pvpgip2 foram observados durante a fase inicial do processo de
infecção, revelando um nível máximo de expressão em 48 horas após o inóculo, e os níveis de transcritos declinou
em 72 – 96 horas após a inoculação. O gene Pvpgip3 teve sua expressão aumentada fortemente em 96 horas após o
inóculo. Entretanto, altos níveis da expressão do gene Pvpgip4 foram detectados na área de lesão. Interessantemente,
apenas o gene Pvpgip4 pareceu ser moderadamente induzido em plantas controles. Estes resultados fornecem evidências
de que as endopoligalacturonases contribuem para o processo de infecção durante a fase de colonização, promovendo
a liberação de oligogalacturonideos que são poderosas moléculas sinalizadoras podendo ativar a resposta de defesa da
planta, como a síntese de proteínas inibidoras de poligalacturonases.
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Caracterização de uma protease secretada
pelo fungo fitopatogênico Sclerotinia
sclerotiorum
Alves, EB1; Oliveira, MB1; Soares, DA1; Nascimento, LB1; Petrofeza, S1
Universidade Federal de Goiás - Laboratório de Biologia Molecular de Fungos Filamentosos, ICB II, CEP 7400-970, Goiânia, Goiás
1
Palavras-chave: Sclerotinia sclerotiorum, protease, fitopatogenese, Aspartyl protease, Expressão genica
Sclerotinia sclerotiorum é um fungo fitopatogeno que infecta muitas plantas economicamente importantes. A produção de
ácido oxálico, diminuição do pH do meio e a secreção de enzimas hidroliticas são fatores determinantes para a infecção
deste patogeno. As enzimas hidrolíticas secretadas pelo fungo S. sclerotiorum degradam a parede celular da planta, dentre
estas enzimas estão às proteases. Aspartyl protease é considerada um importante fator de virulência deste patogeno. Este
trabalho teve como objetivo a caracterização da expressão de proteases secretadas por S. sclerotiorum durante o cultivo
em diferentes fontes de carbono nos tempos de 12, 24, 48, 72, 96 horas após inoculação. A secreção destas proteases
foi detectada através de ensaios enzimáticos e o nível de expressão do gene que codifica uma protease ácida, a aspartyl
protease (aspS), avaliado através da técnica RT-PCR semi-quantitativo. A atividade enzimática das proteases tanto em
meio contendo pectina 1% quanto em extrato de parede celular de feijoeiro 1%, aumentou 48 horas após a inoculação
e se manteve constante nos tempos de 72 e 96 horas após inoculação. A atividade das proteases secretadas em indução
com pectina 1% foi maior do que a encontrada durante a indução com extrato de parede celular de feijoeiro 1%. O
gene aspS foi expresso em níveis elevados durante a indução tanto com pectina 1% como com parede celular de feijoeiro
1% em todos os tempos avaliados. Estes resultados sugerem que para S. sclerotiorum as diferentes fontes de carbono
avaliadas, similares a componentes da parede celular de plantas hospedeiras, são efetivas para a indução da expressão
gênica (aspS) e de elevados níveis de atividade enzimática para as proteases secretadas. Desta forma, as proteases têm
sido consideradas um importante fator de virulência aumentando a eficiência do fungo no ataque a plantas.
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Atividade antifúngica de Hyptidendrum
canum e Eugenia uniflora sobre Sclerotinia
sclerotiorum
Soares, DA; Inocêncio, APM; Nascimento, LB; Alves, EB; Oliveira, MB; Petrofeza, SS
Palavras-chave: atividade anti-fúngica,extrato de plantas, Sclerotinia sclerotiorum, Hyptidendrum canum, Eugenia uniflora
Sclerotinia sclerotiorum, popularmente conhecido como “podridão branca”, é considerado hoje um importante patógeno
causando danos em várias plantas de importante interesse econômico. Este fungo produz estruturas de resistência
conhecidas como escleródios que podem residir no solo por diversos anos e, em circunstâncias ambientais favoráveis,
podem germinar de maneira micelogênica, dando origem as hifas infecciosas, ou pela germinação carpogênica para
produzir os apotécios que liberam milhões os ascósporos. Para o combate as doenças provocadas por este fungo, várias
estratégias são adotadas. A mais utilizada é o uso de fungicidas que a curto prazo pode solucionar o problema, mas a
longo prazo a doença pode voltar a atingir a plantação; o fungo pode desenvolver resistência a ele. Considerando todos
estes fatores,o nosso trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de um pesticida biológico utilizando o extrato
de planta do Cerrado. Os efeitos antifúngicos do extrato bruto de Hyptidendrum canum e Eugenia uniflora foram
avaliados sobre o fungo S. sclerotiorum e também, seu efeito inibitório no crescimento micelial e na esclerogênese.
Os bioensaios,utilizando-se da técnica de diluição em ágar demonstraram atividade inibitória. Disco de ágar
(7mm de diâmetro) da borda da cultura em meio mínimo do fungo com 5 dias de crescimento foram colocadas no centro
de cada placa contendo diferentes concentrações do extrato bruto das respectivas plantas analisadas. A concentração
inibitória mínima (MIC) de 6,4 µg/mL foi observada para H. canum e 5,0µg/mL para E. uniflora. Alterações na formação
do escleródio foram observadas em diferentes concentrações. Estes dados sugerem que o extrato de plantas nativa do
cerrado podem ser utilizados como uma alternativa biofungicida no controle de fungos fitopatogênicos.
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Análise da variabilidade genética em
linhagens de Fusarium oxysporum f.
sp. lycopersici utilizando marcadores
moleculares
Silva, MLRB1; Brito, JZ1, Reis, NC1; Donato, VMTS1; Silva, MV2
Laboratório de Genoma/Instituto Agronômico de Pernambuco/IPA
Centro de Ciências Biológicas/Departamento de Bioquímica/UFPE
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Lycopersicon esculentum, murcha-de-fusário
A murcha-de-fusário, causada por três linhagens do fungo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, é uma das doenças
mais importantes do tomateiro. No Brasil, as três linhagens já foram relatadas, entretanto a linhagens três encontravase restrita a região Sudeste do Brasil e constitui uma enorme ameaça para a tomaticultura nacional. O objetivo deste
trabalho foi analisar a variabilidade genética das três linhagens de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici através de PCRRAPD e da amplificação da região espaçadora intergênica do DNA ribossomal (IGS e ITS). As linhagens de Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici foram cultivados em meio liquido (Batata-Dextrose), por 5 dias. A massa miceliar foi utilizada
para extrair o DNA genômico que serviu como molde para a reação de PCR. Após corrida eletroforética em gel de
agarose a 1.2% os amplicons foram analisados gerando uma matriz de dados binários que foi utilizada pelo programa
NTSYS 2.0 para cálculo da cálculo da variabilidade genética. Os resultados encontrados na PCR-RAPD demonstram
a proximidade genética entre a linhagens 1 e 2, bem como a distancia evolutiva da raça 3. Os produtos de PCR obtidos
na amplificação da região IGS e ITS do rDNA das três linhagens de Fusarium, apresentaram em torno de 1.500 pb e
600 pb respectivamente, foram clivados com as enzimas de restrição HaeIII, XhoI, NotI, EcoRI, HinfI, AluI, NdeI, RsaI,
HapII, TaqI, BamI, PstI, HindIII, EcoRV e NruI. Os fragmentos com tamanho acima de 100 pb foram considerados
na presente análise. De acordo com o padrão de clivagem obtido, foi possível observar de 2 a 9 fragmentos por enzima
de restrição. A combinação dos padrões de restrição com a técnica de RAPD permitiu a distinção das linhagens de
Fusarium o que podem representar importante ferramenta para diagnóstico rápido.
Apoio Financeiro: BNB, EMBRAPA, CNPq/FACEPE.
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“Análise da diversidade genética de
Guignardia citricarpa por RAPD e rDNA”
Bixilia, MP1; Holanda, FMC1; Ferreira, AJ1; Mano, ET1; Sposito, MB2; Araújo, WL1
Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, SP, Brasil
2
Departamento Científico, Fundecitrus, Araraquara, SP, Brasil
[email protected]; [email protected]
1
Palavras chaves: Guignardia citricarpa, Mancha Preta de Citrus, Diversidade Genética, RAPD, rDNA
A exportação de suco de laranja concentrado gera ao Brasil uma receita de aproximadamente US$ 1,5 bilhão anuais, sendo
o Brasil o maior produtor mundial. Entretanto, a citricultura brasileira é afetada por um grande número de doenças,
proporcionando um gasto exaustivo com produtos químicos e perda de grandes áreas de plantio. Pinta preta ou mancha preta
dos citros (MPC) é um sintoma causado pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely (Phyllosticta citricarpa Mc Alpine anamorfo)
que desqualifica o produto nacional, e prejudica a exportação. A distribuição deste patógenos em pomares sadios é
motivo de estudos, visto que permitirá o desenvolvimento de estratégias de controle e manutenção da sanidade no
pomar. Dessa forma, o presente projeto tem como objetivo principal analisar a variabilidade genética de Guignardia spp.
isolados de folhas e frutos de citros de uma área com histórico recente de infecção. Guignardia spp. foram isoladas de
folhas e frutos de Citrus sinensis cultivadas em uma área onde a infecção do patógeno foi realizada experimentalmente
e as folhas coletadas dois anos após a introdução do fungo. Foram amostradas 97 folhas próximas à região de inoculo,
bem como de um fruto com sintomas típicos de MPC. Foram isolados 40 isolados morfologicamente semelhantes à
G. citricarpa. A análise por RAPD e ARDRA mostrou baixa variabilidade genética, embora primers específicos para
Guignardia citricarpa (patógeno) tenha demonstrado que apenas o isolado obtido de fruto é patogênico a citros. A
análise da seqüência do rDNA, juntamente com RAPD permitirá uma identificação mais precisa dos isolados obtidos
de folhas de citros, bem como avaliar a distribuição de G. citricarpa (patógeno) e G. mangiferae no pomar estudado.
Além disso, tendo em vista que a fonte de inoculo é conhecida e a população do patógeno, o presente projeto permitirá
avaliar se ocorre seleção de genótipos do patógeno na área amostrada e estabelecer correlação entre estes genótipos e a
distribuição do patógeno no campo.
Apoio financeiro: FUNDECITRUS, PIBIC/CNPQ/UMC.
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PCR Multiplex na identificação de
Guignardia citricarpa e G. mangiferae
Fabris, J; Nishimura, RC; Stringari, D; Feltrin, LJ; Murai, MY; Gomes-Figueiredo, J;
Kava-Cordeiro, V; Galli-Terasawa, L; Glienke, C
LABGEM, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná. Curitiba-PR
[email protected]
Palavras-chave: PCR multiplex, Guignardia citircarpa, Guignardia mangiferae, Diagnóstico e Mancha Preta de Citros
A Mancha Preta de Citros (MPC) é causada pelo fungo G. citricarpa e traz grandes prejuízos aos produtores, danifica
a aparência dos frutos inviabilizando a exportação para a Comunidade Econômica Européia. Há entretanto, outra
espécie morfologicamente muito semelhante, G. mangiferae que é freqüentemente isolada como endofítica em citros.
BAAYEN et al. (2002) descreveram o teste morfológico em meio aveia como uma forma preliminar de discriminação.
Porém, não há relatos seguros para as condições brasileiras. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento
de metodologia rápida e precisa para identificação destas espécies. Para tanto, foram isoladas e analisadas 157 linhagens
obtidas de lesão de MPC e 97 linhagens isoladas como endofíticas de citros e 40 endofíticas de manga. As análises foram
realizadas por meio de PCR Multiplex e RAPD e por meio de cultivo em meio aveia. Para o PCR Multiplex foram
utilizados os pares de primers GCP1/GCP2 e GMF1/GMR2 que amplificam bandas específicas em G. citricarpa e G.
mangiferae respectivamente. A utilização de linhagens de G. citricarpa e de G. mangiferae anteriormente submetidas a
testes de patogenicidade, permitiu validar o diagnóstico por PCR Multiplex na identificação das linhagens de G. citricarpa
e G. mangiferae. O teste demonstrou-se sensível, por meio da amplificação da banda correspondente a G. citricarpa
em concentrações de até 2,5% em amostras diluídas do DNA fúngico em relação ao DNA vegetal. Entre as linhagens
isoladas de lesão de MPC 155 foram identificadas como G. citricarpa e 2 como G. mangiferae. 30 linhagens isoladas
como endofíticas de citros foram identificadas como G. citricarpa 67 identificadas como G. mangiferae. Em manga 22
linhagens foram identificadas como G. mangiferae e 18 como Guignardia sp, pois não apresentaram amplificação no
PCR multiplex. Estes resultados foram corroborados pelo RAPD. O teste do halo apresentou-se eficiente, porém houve
2,87% de resultados falsos negativos. Assim, constatou-se que o fungo G. citricarpa pode ser isolado como endofitico
em folhas de citros, porém não foi isolado de folhas de manga. O PCR Multiplex foi a metodologia mais eficiente na
identificação de G. citricarpa e G. mangiferae.
Apoio financeiro: Fundecitrus, FAPESP, CNPq, Fundação Araucária.
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Caracterização genética de Phytophthora
nicotianae e Phytophthora citrophthora
pela análise da região ITS
Astolpho, HA¹; Braz, JD¹; Santos, MA¹; Spósito, MB¹; Feichtenberger, E²; Belasque Jr, J¹
¹Fundo de defesa da citricultura (Fundecitrus)
²Unidade de Pesquisa e Desenvolvimento de Sorocaba/SP (APTA)
Palavras-chave: Gomose de Phytophthora, PCR-RFLP, Polimorfismo
Entre as principais doenças que afetam os citros, destaca-se a gomose de Phytophthora. Essa doença ocorre em todas as
regiões produtoras de citros no Brasil tendo sido primeiramente relatada em 1917. As espécies Phytophthora nicotianae
e Phytophthora citrophthora são predominantes como as causadoras dessa doença. Na maioria dos casos, esses patógenos
são encontrados em viveiros, sementeiras, e pomares comerciais. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização
genética de uma população de isolados de Phytophthora provenientes de diferentes municípios dos estados de São Paulo
e Minas Gerais, baseando-se na análise da região ITS (internal transcribed spacer). Foram utilizados 76 isolados, dos
quais 69 pertencem à espécie P. nicotianae e sete à P. citrophthora. Reações de PCR foram conduzidas com os pares de
primers I1/I4 e NICF1/NICR2.1 (Bonants et al., 2000). Os produtos amplificados foram clivados com as endonucleases
HaeIII, MspI, AluI, TaqαI, separados em gel de agarose (2%) e vizualizados em transiluminador UV. Dentre a população
estudada o padrão de bandas (loci polimórficos) de cada isolado foi comparado entre as espécies. Com os pares de
primers NICF1/NICR2.1 não houve amplificação dos isolados de P. citrophthora. A clivagem dos produtos gerados com
o par de primers I1/I4 para as endonucleases HaeIII, MspI e AluI apresentaram duas e três bandas para P. nicotianae e P.
citrophthora, respectivamente. O número de fragmentos obtidos com a TaqαI foi o mesmo para as duas espécies (quatro).
O perfil de restrição dos isolados amplificados com o par de primers NICF1/NICR2.1 (P. nicotianae) apresentou duas
bandas com as endonucleases HaeIII e AluI, três com MspI e quatro com TaqαI. Os resultados verificados não revelaram
polimorfismos nas seqüências nucleotídicas amplificadas da região ITS entre isolados da mesma espécie.
Bonants, P.J.M.; Deweerdt, M.H.; Veld, W.A.M.; Baayen, R.P. Molecular Characterization of Natural Hybrids of
Phytophthora nicotianae and P. cactorum. Phytopathology 90:867-874, 2000.
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Diversidade genética de Isolados
de Trichoderma
Melo, LS1; Souza, AQL de2;de Souza, ADL3; Bianco, EA3; Gama, AM3; Hanada, RE4; Rodrigues-Filho, E5; Pereira, JO1
1
Programa Multi-Institucional de Pós-Graduação em Biotecnologia – PPGBiotec/UFAM
Departamento de Odontologia da Escola Superior de Saúde da Universidade do Estado do Amazonas – DoESA/UEA
3
Departamento de Química da Universidade Federal do Amazonas – Dq/UFAM
4
Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia – INPA
5
Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos – Dq/UFSCar
[email protected]
2
Palavras-chave: Diversidade, Trichoderma, Região ITS, Variabilidade genética, Taxonomia molecular
A base para a diversidade das espécies é a variabilidade genética, que tem sido ao longo do tempo avaliada pela expressão
fenotípica permitindo a classificação dos indivíduos nos grupos aos quais pertencem. Contudo, para os microrganismos,
especialmente para os fungos, as características morfológicas muitas vezes não são suficientes para se determinar com
precisão a espécie do indivíduo, ficando a sua classificação apenas ao nível de gênero. Com o avanço de novas tecnologias
moleculares como a identificação e sequenciamento de regiões conservadas no DNA, o perfil químico dos metabólitos
secundários fixos e voláteis e dos ácidos graxos da parede celular, tem sido possível classificar com maior precisão os
microrganismos. Entre os fungos filamentosos o grupo Trichoderma tem relevância pela produção de enzimas hidrolíticas
e pelo uso no controle biológico de pragas da agricultura. Este grupo é considerado saprófito e, com freqüência, tem
sido isolado de solo e vegetais em decomposição. Foram escolhidos 39 isolados de Trichoderma oriundos de plantas e
do solo de São Paulo e do Amazonas e identificados por meio da região ITS-1 e ITS-2 do rDNA. Todas as amostras
foram submetidas a cultivos monospóricos e foram preservadas em óleo mineral, método Castellani e em glicerol à
10%, além do microcultivo para avaliar as estruturas micromorfológicas vegetativas e sexuais. A partir da suspensão
em glicerol, de cada amostra foi inoculado 10µL em 20mL de BD, incubado a 26oC a 100 RPM por 40hs, extraídos
os DNAs genômicos e realizada a PCR específica para as regiões ITSs. O resultado da identificação molecular está
sendo comparado com o resultado das análises morfológicas dos microcultivos tendo sido identificados: T. harzianum,
T. koningii, T. erinaceum, T. viride, T. ovaslisporum e T. koningiopsis. Esta pesquisa continuará com a identificação de
novos isolados e avaliações da produção enzimática dos mesmos.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e FAPEAM.
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Transformação do fungo ectomicorrízico
Laccaria laccata mediada por
Agrobacterium tumefaciens
Coelho, IS; Zubieta, MP; Delazari, FT; Walter, J; Queiroz, MV; Araújo, EF
Departamento de Microbiologia/BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa/MG, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Fungo ectomicorrízico, Laccaria laccata, transformação, Agrobacterium tumefaciens
Laccaria laccata é um fungo ectomicorrízico que tem sido encontrado abundantemente em plantações comerciais
de Eucalyptus do Brasil. Por apresentar a capacidade de crescer vegetativamente e/ou germinar dos basidiósporos
em meio de cultura, ele tem sido utilizado como modelo de estudo da interação ectomicorrízica e para produção de
inoculantes em programas de micorrização controlada. Visando o entendimento da formação de micorrizas, faz-se
necessário o isolamento de mutantes incapazes de formá-las, para que se possam avaliar funcionalmente os genes
envolvidos na micorrização. E, para obtenção de mutantes, a técnica de transformação mediada por Agrobacterium
tumefaciens tem se mostrado robusta, baseando-se na habilidade desta bactéria em transferir T-DNA para o genoma de
células eucarióticas. O objetivo deste trabalho foi estabelecer o protocolo de transformação do fungo Laccaria laccata
mediada por Agrobacterium tumefaciens. O estabelecimento de um método eficiente de transformação genética requer
o desenvolvimento de um sistema de seleção adequado. O fungo Laccaria laccata foi testado para a sensibilidade a
concentrações crescentes de higromicina B, mostrando-se resistente a higromicina B até a concentração de 40 µg/
mL. Em concentrações maiores, foi observada a inibição completa do crescimento do micélio do fungo. Para seleção
dos transformantes nos experimentos de transformação foi utilizado higromicina B na concentração de 80 µg/mL.
Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor binário pBGgHg foi co-cultivada com o micélio do fungo ectomicorrízico
Laccaria laccata. Dos 150 discos de micélio, foram observados 3 transformantes, representando 2% de eficiência de
transformação. Alta estabilidade mitótica dos transformantes foi observada após 5 passagens sucessivas em meio não
seletivo. Para detectar a presença do gene que codifica resistência a higromicina, o DNA genômico dos transformantes
foram amplificados utilizando os oligonucleotídeos hph1 e hph2, gerando um produto de 690 pb, confirmando a
presença do gene nos transformantes. O método de agro-transformação foi efetivo na obtenção de transformantes
de Laccaria laccata resistentes à higromicina, possibilitando seu emprego em estudos de mutagênese insersional neste
fungo visando o isolamento de genes envolvidos na interação fungo planta.
Apoio financeiro: FAPEMIG e CNPq.
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Caracterização das populações “mating” e
dos tipos “mating” de cepas de Fusarium
verticillioides isoladas de graõs de milho e
ração submetidas à irradiação
Simas, MMS; Rocha, L; da Silva, VN; Correa, B
Departamento de Microbiologia, Universidade de São Paulo
Palavras-chave: Fusarium verticillioides, variabilidade genética, mating, radiação, IGS
A espécie Fusarium verticillioides é amplamente distribuída na natureza, podendo ser patogênica para plantas e animais,
além da elevada capacidade de produzir fumonisinas. Possui duas fases, a anamórfica (assexuada – Fusarium verticillioides)
e a teleomórfica (sexuada – Gibberella fujikuroi). A fase teleomórfica é governada por dois alelos em um mesmo
loco MAT-1 e MAT-2 e um cruzamento fértil ocorre apenas entre duas cepas com alelos opostos. A dificuldade na
nomenclatura das diferentes espécies de Fusarium tem resultado em confusão na taxonomia. Portanto, a definição de
uma nomenclatura comum torna-se imprescindível. Métodos clássicos são insuficientes para a identificação destas
espécies, sendo necessária a associação da caracterização morfológica, biológica e filogenética. A região IGS do DNA
possui elevada variabilidade podendo ser utilizada na identificação de espécies fúngicas e em estudos filogenéticos. O
uso da PCR na identificação de Fusarium verticillioides constitui-se numa ferramenta importante, permitindo uma
análise rápida e eficiente desta espécie em diversos substratos. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar
molecularmente cepas de Fusarium verticillioides isoladas de amostras de milho e ração comercial de frangos de corte
submetidos à radiação gama. Para isto, 80 amostras de cada um destes dois subtratos foram coletadas na fábrica de ração
da Universidade de São Paulo (Pirassununga-SP), e submetidos a doses de 0, 5 e 10kGy no irradiador multipropósito
do IPEN (Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares-SP). Do total de Fusarium verticillioides identificados neste
experimento, 20% foram encontrados em milho e 80% em ração. A maioria das cepas foram isoladas de amostras
não irradiadas, com exceção de 12,5% que foram obtidas de ração irradiada com 5kGy. Todas as cepas mostraram-se
positivas para a reação de IGS (Intergenic Spacer), confirmando a identidade molecular do Fusarium verticillioides. Das
cepas isoladas, 37,5% foram caracterizadas como MAT-1 e 62,5% como MAT-2. Os dados preliminares obtidos no
presente experimento permitem concluir que as cepas isoladas são Fusarium verticillioides, confirmando a identificação
por métodos clássicos. A presença de MAT-1 e MAT-2 revela a possibilidade da ocorrência de cruzamento sexual entre
cepas no meio ambiente, o que pode contribuir para a variabilidade genética. Além disto, também foi evidenciada
a susceptibilidade do Fusarium verticillioides à radiação gama, sugerindo que este processo pode ser utilizado para o
controle efetivo deste fungo toxigênico.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Caracterização molecular do gene da
β-tubulina em Phakopsora pachyrhizi
Maciel, TEF1; Freire, MCM2, Almeida, AMR3; Oliveira, LO1
Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Viçosa
2
Departamento de Genética, Universidade Federal de Viçosa
3
Embrapa – Soja
[email protected]
1
Palavras-chave: Phakopsora pachyrhizi, β-tubulina
A soja é atacada por muitos patógenos, porém dentre todas as doenças a ferrugem asiática causada pelo fungo Phakopsora
pachyrhizi tem sido considerada como uma das mais importantes. Muitos trabalhos estão sendo realizados com o intuito
de se compreender melhor essa interação planta-patógeno. Dentre esses, destaca-se trabalhos de caracterização de genes
que podem estar relacionados com essa interação. O objetivo desse trabalho foi caracterizar o gene da β-tubulina de P.
pachyrhizi assim como a proteína codificada por este gene, e fazer uma análise comparativa desse gene dentre diferentes
ferrugens. Uredósporos do fungo foram coletados de doze municípios brasileiros. O DNA genômico foi extraído e o
gene da β-tubulina foi amplificado pela técnica de PCR de tal forma a cobrir toda a região do gene. Os fragmentos
obtidos foram purificados e seqüenciados. As seqüências obtidas foram alinhadas e comparadas entre si e com seqüências
obtidas do GenBank. O gene da β-tubulina de P. pachyrhizi apresentou 2815 pares de bases, sendo este constituído de
nove éxons e oito íntrons. Sua fase aberta de leitura (ORF) conteve 1341 pares de bases. Verificou-se que 452 pares de
bases são correspondentes a região promotora enquanto 234 pares de bases pertencem a extremidade 3’ não traduzida.
Os códons de início e final da tradução para este gene são ATG e TAG, respectivamente. A região promotora apresentou
os sinais típicos envolvidos com o início da transcrição. Um domínio de 30 nucleotídeos composto por citosina e
timina está presente nesta região, sendo este domínio comum a fungos filamentosos. Sítios envolvidos no mecanismo
de splincing estão presentes. Foi encontrada ainda a seqüência consenso “AATAAA”, situada downstream do códon de
terminação TAG, sendo esta seqüência crucial no processo de poliadenilação do mRNA precursor. A ORF encontrada
para este gene codifica uma proteína de 446 aminoácidos, a qual apresenta elevada similaridade com β-tubulina de
outras espécies de fungos relacionados, e até mesmo com organismos mais distantes evolutivamente, comprovando assim
que a seqüência de aminoácidos desta proteína é evolutivamente conservada. Identificou-se, comparando a seqüência
de aminoácidos predita para β-tubulina, que esta proteína possui quatro domínios conservados, sendo eles: domínio
de ligação a nucleotídeos, domínio de ligação ao taxol, domínio de interface alfa/beta e domínio de interface beta/alfa.
Análises filogenéticas, com base no alinhamento do gene da β-tubulina, permitiram alocar P. pachyrhizi junto ao clado
constituído pelas demais ferrugens. Comparações dos íntrons de P. pachyrhizi com as duas únicas espécies de ferrugens
que apresenta o gene da β-tubulina seqüenciado até o momento, mostraram alta conservação no número e posição dos
íntrons; já em relação à composição desses, foi observada pouca similaridade.
Apoio Financeiro: FAPEMIG e CNPq.
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Caracterização molecular de cianobactérias
isoladas de ecossistemas de manguezal e
investigação da produção
de compostos bioativos
Silva, CSP1; Genuário, DB1; Silva-Stenico, EM1; Moraes, LAB2; Fiore, MF1
Lab. Ecologia Molecular de Cianobactérias, Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo
2
Departamento de Química, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: 16S RNAr, Peptídeo sintetase, Policetídeo sintase, MS, seqüenciamento
Estudos sobre a diversidade de cianobactérias em manguezais brasileiros são bastante restritos e, em todos eles, a identificação
taxonômica tem sido realizada apenas utilizando amostras ambientais e análise morfológica. O cultivo monoespecífico de
cianobactérias de ecossistemas de manguezal no Brasil está no inicio e não existem estudos de caracterização molecular.
As cianobactérias são consideradas um dos grupos de microrganismos mais promissores para produção de compostos
com bioatividade. Os objetivos desse trabalho foram: (1) caracterizar morfologicamente e molecularmente, por meio do
seqüenciamento do gene de 16S RNAr, 24 linhagens de cianobactérias isoladas de ecossistemas de manguezal do Estado
de São Paulo; (2) selecionar entre os isolados, linhagens com potencial para produção de compostos bioativos, por meio
da amplificação de regiões dos genes de peptídeos sintetase (PS) e de policetídeo sintase (PKS), enzimas envolvidas na
produção desses compostos. Para confirmar o potencial das linhagens na produção de compostos bioativos e atestar a
eficácia da utilização de primers degenerados nesta investigação, ensaios de bioatividade foram realizados. Oito extratos
celulares das linhagens que apresentaram pelo menos um dos genes investigados (PS e/ou PKS) foram testados contra
bactérias e fungos patogênicos. Cinco extratos celulares de quatro linhagens (Leptolyngbya sp. CENA134 e CENA137,
Phormidium sp. CENA135 e Synechococcus sp. CENA136) foram analisados por espectometria de massas (MS). Os
resultados obtidos mostraram que a identificação morfológica está de acordo com análises moleculares de somente
algumas seqüências de nucleotídeos. Desta forma, para as linhagens com resultados divergentes, mais estudos devem ser
conduzidos na tentativa de elucidar esta incerteza. O gene de PKS foi encontrado em todas as linhagens investigadas e
o de PS em seis delas. O resultado de MS indicou a presença de uma potente toxina, a neosaxitoxina, sendo produzida
por duas linhagens de Leptolyngbya sp. (CENA 134 e CENA 137). Este é o primeiro estudo sobre filogenia molecular
para linhagens de cianobactérias isoladas de ecossistema de manguezal do Brasil, no qual 24 seqüências inéditas de 16S
RNAr foram geradas. O uso de primers degenerados mostrou-se eficaz na investigação do potencial de cianobactérias
para produção de compostos bioativos. Os resultados confirmaram o potencial desse grupo de microrganismos como
fonte promissora na produção de novos compostos bioativos.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Diversidade genética de cianobactérias da
filosfera de árvores de manguezal
da Ilha do Cardoso, Cananéia/SP
Rigonato, J; Alvarenga, DO; Fiore, MF
Laboratório de Ecologia Molecular de Cianobactérias. Centro de Energia Nuclear na Agricultura. Universidade do Estado de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Cianobactérias, DGGE, Biblioteca genômica, filosfera, mangue
Manguezais são ecossistemas de grande importância ecológica em regiões costeiras. Neste ambiente, cianobactérias
desempenham importância fundamental, podendo atuar como produtores primários, fonte de entrada de nitrogênio
(fixação de N2) e de carbono (fotossíntese), biosorventes de metais pesados e degradadoras de xenobióticos. Além
disso, ao se associarem com plantas, são capazes de produzir hormônios que protegem as plantas contra a predação
por insetos ou estimulam o seu crescimento. A filosfera é um habitat pouco estudado, mas com potencial para abrigar
cianobactérias epifíticas. Este trabalho teve como objetivo estudar a diversidade genética de cianobactérias colonizadoras
da filosfera de árvores de mangue do litoral de São Paulo por meio de ferramentas moleculares. Foram coletadas amostras
de folhas dos gêneros Avicennia, Rhizophora e Laguncularia em um manguezal da Ilha do Cardoso, em Cananéia-SP.
Após a agitação das folhas inteiras por 1 hora em frascos contendo água ultrapura esterilizada, a solução foi submetida à
extração de DNA genômico usando fenol/clorofórmio, seguido da amplificação de genes de RNAr 16S. Posteriormente
foi realizada uma PCR nested com iniciadores CYA 359 e CYA 781a e b com grampo G-C. Os produtos da PCR
nested foram separados usando a técnica de DGGE (gradiente de 20 a 60 % uréia/formamida), em uma corrida de
15 horas a 100 V, à temperatura de 60 ºC. As bandas obtidas foram excisadas e seqüenciadas. Paralelamente, foi realizada
a construção de uma biblioteca genômica, onde os produtos da amplificação por PCR dos genes de RNAr 16S foram
clonados e inseridos em células de Escherichia coli. Os plasmídeos, de 64 clones de cada gênero de árvore foram extraídos,
seqüenciados e comparados por análise BLAST com seqüências depositadas no GenBank. O resultado do DGGE mostrou
padrões de bandas muito similares para os três tipos de árvores, indicando que não existe especificidade de gêneros
de cianobactérias para os gêneros de árvores analisadas. O seqüenciamento das bandas revelou uma predominância
do gênero Pseudanabaena, onde 80% das bandas são deste gênero. Os dados obtidos até o presente momento para a
biblioteca genômica corroboram com os encontrados no DGGE onde para Avicennia, Rhizophora e Laguncularia, 47,
58 e 40% dos clones pertencem ao gênero Pseudanabaena respectivamente. Os demais gêneros encontrados na biblioteca
são: Anabaena, Limnothrix, Brasilonema e seqüências de cianobactérias não cultiváveis. Este estudo, portanto, identifica
pela primeira vez as cianobactérias que colonizam a filosfera das árvores do manguezal da Ilha do Cardoso e sugere que
existe uma homogeneidade de espécies de cianobactérias independente do gênero de árvore.
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Determinação filogenética de archaeas
ruminais em diferentes dietas contendo
feno e silagem de milho
Neves, MC1; Kishi, LT1; Gonçalves, JS2; Costa, JRV1; Alves, ECC1; Ezequiel, JMB2; Lemos, MVF1
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista – FCAV/UNESP, Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária Campus de Jaboticabal
2
Departamento de Zootecnia – Campus de Jaboticabal
[email protected]
1
Palavras-chave: alimentos volumosos, microrganismos, metanogênese, 16S rDNA e filogenia
A adoção de estratégias de alimentação baseada em princípios tecnológicos vem possibilitando o aumento da eficiência
de utilização do alimento por unidade de produção de leite e carne, além de contribuir potencialmente para a
estabilização da concentração de metano na atmosfera. A biotecnologia é reconhecida como uma tecnologia capaz
de gerar alternativas para diversas situações frente às suas características de inovação, impacto atual e potencial frente
alguns importantes problemas globais como doenças, nutrição e poluição ambiental, estando também relacionada ao
crescimento do processo produtivo. O objetivo deste trabalho foi verificar a filogenia das Archaeas no rúmen de bovinos
por meio de seqüências gênicas da região 16S rDNA em dietas alimentares com diferentes concentrações de volumoso.
Para isto, foram estudadas quatro diferentes dietas: dieta 1, feno de capim tifton (70%), polpa cítrica (14,2%), farelo
de girassol (15%) e suplemento mineral (0,8%); dieta 2, feno (30%), polpa cítrica (35,2%), casca de soja (19%),
farelo de girassol (15,0%) e suplemento mineral (0,8%); dieta 3, silagem de milho (70%), polpa cítrica (14,2%), farelo
de girassol (15,0%) e suplemento mineral (0,8%) e dieta 4, silagem de milho (30%), polpa cítrica (35,2%), casca de
soja (19%), farelo de girassol (15,0%) e suplemento mineral (0,8%). Foi realizada amplificação da região ribossomal
16S rDNA por PCR, transformação em células competentes de E. coli Dh10b, clonagem e, a seguir, realizou-se PCR de
seqüenciamento. Os dados foram analisados pelos programas “Sequencing Analysis 3.4” e “DNA Star” e, a qualidade
dos eletroferogramas das seqüências foi determinada pelo programa “Phred/Phrap/Consed”. Na dieta contendo 70%
de feno, grande parte das seqüências agruparam-se a organismos metanogênicos não identificados e o padrão de
espécie mais próximo a que se associaram foi Methanosphaera stadtmanae. Na dieta com 30% de feno a maior parte das
seqüências foi agrupada próxima a Methanobrevibacter smithii. Na dieta com 70% de silagem, a maioria das seqüências
foi agrupada a metanogênicas desconhecidas, sendo que alguns clones agruparam-se próximos a Methanosphaera
stadtmanae e outros próximos aos padrões Methanomicrobium móbile e Methanosarcina mazeii e, na dieta com 30%
de silagem foram observados muitos clones agrupados com microrganismos metanogênicos desconhecidos e outros
que se agruparam junto à Methanobrevibacter smithii, Methanobacterium bryantii e Methanosphaera stadtmanae. Os
resultados permitem concluir que dietas contendo diferentes relações volumoso:concentrado diferem quanto à filogenia
das Archaeas no rúmen dos bovinos.
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Polimorfismos conformacionais fita-simples
do gene da lipase extracelular (lipA)
em Aeromonas
Thomazi, G; Ferrarini, S; Costa, SOP; Echeverrigaray, S; Delamare, APL
Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul
[email protected]
Palavras-chave: Aeromonas, SSCP, lipA
Aeromonas, pertencentes à família Aeromonadaceae, são bactérias Gram negativas, oxidase positivas, ubiquas em ambientes
aquáticos. O gênero Aeromonas é formado por aproximadamente 14 espécies, sendo que A. hydrophila, A. caviae e
A. veronii var. sobria, são responsáveis por infecções gastrointestinais, otites, infecções do trato urinário, entre outras
afecções em humanos. As principais fontes de transmissão destas bactérias para humanos são alimentos e águas. Neste
contexto, a identificação de Aeromonas e a classificação dos isolados em amostras de águas e alimentos é essencial na
avaliação do risco potencial destes produtos. Diversos trabalhos tem sido realizados no sentido de utilização de marcadores
moleculares na classificação de Aeromonas, como RFLP-PCR do 16SrDNA, entre outros. Dados prévios do nosso grupo
mostraram que o gene lipA (fosfolipase extracelular) é específico de Aeromonas, podendo ser utilizado na identificação
destas bactérias por PCR. Entretanto, RFLP-PCR do gene lipA não permite a caracterização de isolados. Assim sendo,
no presente trabalho foi avaliada a utilização de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) de amplificados do
gene lipA na classificação e caracterização de isolados de Aeromonas. Para tanto, 30 isolados pertencentes a dez espécies
de Aeromonas incluindo várias cepas de A. hydrophila e A. caviae foram analisados. Todos os isolados apresentaram
amplificação de fragmento de peso molecular de aproximadamente 246 pb. A análise de polimorfismo conformacional
mostrou perfis formados por duas a três bandas, os quais permitiram a caracterização de grande parte dos isolados.
Variações foram observadas nos perfis de isolados de A. hydrophila. Os resultados obtidos indicam a possibilidade de
utilização de SSCP do gene lipA na caracterização de isolados e classificação de algumas espécies de Aeromonas.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Estrutura de Comunidades de Archaea em
Solos de Manguezal da Ilha do Cardoso no
Estado de São Paulo
Mendes, LW1; Tsai, SM1
Laboratório de Biologia Celular e Molecular, Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA), Universidade de São Paulo (USP)
[email protected]
1
Palavras-chave: Manguezal, Archaea, T-RFLP, Diversidade, Ecologia
Os manguezais são áreas localizadas nas planícies de inundação de marés sendo conhecidos e caracterizados como
berçários, fontes de alimento para peixes e outros animais, e importante habitat para microrganismos. Membros
do domínio Archaea compreendem uma fração significante do total da microbiota do solo, representando 10% dos
filotipos analisados pelo rRNA total. Estes são capazes de ter uma grande participação nos ciclos energéticos globais,
principalmente na transformação de carbono e nitrogênio. O objetivo desse trabalho foi estudar a diversidade e as
estruturas das comunidades de Archaea presentes em solos de Manguezais do litoral sul do Estado de São Paulo em
comparação com solos de Restinga e Floresta, ecossistemas inseridos na mesma paisagem. Através do T-RFLP, uma
técnica molecular independente de cultivo, foram determinados as estruturas e a diversidade das comunidades de Archaea
em amostras de solo desses ambientes. As amostras de solos foram coletadas e imediatamente levadas ao Laboratório
de Biologia Celular e Molecular (CENA-USP), onde foram armazenadas em superfreezer à -80oC. A extração do
DNA genômico do solo foi realizado com o Kit UltraClean Power SoilTM (MoBio), seguindo o protocolo sugerido
pelo fabricante. As reações de PCR foram realizadas com os oligonucleotídeos iniciadores 21F e 1492R, universais
para o domínio Archaea. Para a detecção de fluorescência na análise de T-RFLP a extremidade 5’ do primer 21F foi
marcada com 5-carboxyfluorescein (FAM). Os produtos de PCR foram digeridos com a enzima Hha I e os fragmentos
terminais lidos em seqüenciador automático ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). A determinação
do comprimento dos fragmentos terminais de restrição foi feita usando o software PeakScanner. Análises estatísticas
foram realizadas com o programa Canoco 4.5. A extração do DNA dos solos apresentou grande quantidade de material
genômico proveniente dos microrganismos presentes nas amostras, e as reações de PCR evidenciaram uma quantidade
representativa de microrganismos do domínio Archaea em todas as amostras analisadas. A Análise de Componentes
Principais mostrou diferenças estruturais nas comunidades de Archaea. Agrupamentos distintos foram definidos para
cada comunidade nos três ambientes, o que também pôde ser confirmado através dos eletroferogramas gerados pelo
T-RFLP. Os agrupamentos definidos no gráfico de ordenação demarcaram posições correspondentes à dos ambientes
estudados no contexto da paisagem local, onde a Restinga situa-se como um ambiente de transição entre o Manguezal
e a Floresta. O valor do Índice de Shannon revelou que os solos de Manguezal possuem diversidade de Archaea similar à
encontrada em solos de Floresta, sendo esta superior à encontrada em solos de Restinga. As diferenças nas comunidades
de Archaea podem estar relacionadas com os atributos do solo em cada ambiente estudado.
Apoio Financeiro: FAPESP/Biota.
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Produção de PHA em Aeromonas isoladas
de lodo de esgoto
Matsuda, TS1; Silva, LF1; Gomez, JGC1
Departamento de Microbiologia – Instituto de Ciências Biomédicas – Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Aeromonas, poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato, Biblioteca genômica, isolamento, PHA
Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres sintetizados e acumulados na forma de grânulos de reserva de carbono e
energia por diversas bactérias. Estes polímeros despertam grande interesse, pois apresentam propriedades termoplásticas, são
biodegradáveis e biocompatíveis, além de poderem ser sintetizados a partir de matérias-primas renováveis. Recentemente,
copolímeros contendo ácido 3-hidroxibutírico (3HB) como principal constituinte e 3-hidroxialcanoatos de cadeia
média (3HAMCL - C6 a C14) tem despertado especial interesse pois apresentam propriedades muito semelhantes ao
polietileno de baixa densidade. Alguns trabalhos têm demonstrado que espécies do gênero Aeromonas são capazes de
produzir poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato (P3HB-co-3HHx) a partir de óleos vegetais ou ácidos graxos.
Neste trabalho, a partir de amostras de lodo de esgoto foram isoladas Aeromonas utilizando o meio de cultura GSP-Agar.
Os isolados foram avaliados com relação à produção de PHA a partir de óleo de soja. Dentre 32 isolados, 7 apresentaram
a capacidade de produzir P3HB-co-3HHx correspondendo entre 2 e 6% da massa seca celular e contendo entre 13
e 17 mol% de 3HHx. A partir de um dos isolado, foi construída uma biblioteca genômica no vetor pBBR1MCS-2
e um fragmento de DNA provavelmente contendo o gene que codifica a PHA sintase foi clonado com base em sua
capacidade de restabelecer o acúmulo de PHA em mutantes de Ralstonia eutropha.
Apoio Financeiro: FAPESP 06/52826-6.
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Caracterização de proteases extraceluares
em Aeromonas sp. através de eletroforese
em géis de poliacrilamida
Zacaria, J; Costa, SOP; Delamare, APL; Echeverrigaray, S
Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul
[email protected]
Palavras-chave: Aeromonas, Proteases, SDS-PAGE
Aeromonas sp. são bactérias gram-negativas pertencentes a família Aeromonadaceae. Estas bactérias são encontradas em
ambientes aquáticos de todo o mundo, incluindo águas cloradas e poluídas. São patógenos oportunistas tanto de animais
de sangue quente quanto animais de sangue frio. A virulência de Aeromonas sp. é multifatorial, destacando-se toxinas
extracelulares e enzimas, entre elas as proteases. As proteases extracelulares desempenham um importante papel na
invasão e no estabelecimento desta bactéria em infecções. Neste trabalho foram avaliados perfis proteolíticos dos extratos
brutos de 17 linhagens e 30 isolados de Aeromonas sp., mediante eletroforese em géis de SDS-PAGE 10%, utilizando
gelatina como substrato. Todos os organismos foram inoculados em meio LB sob agitação constante até atingirem fase
estacionária de crescimento. O extrato bruto contendo proteases extracelulares foi obtido a partir da centrifugação
da cultura. Os resultados obtidos monstraram a presença de um total de 16 bandas distintas com pesos moleculares
variando de aproximadamente 27 a 171kDa. A análise de agrupamento empregando o algoritmo UPGMA permitiu a
formação de grupos caracterizando parcialmente as espécies. Visando diferenciar as serino e metaloproteases os extratos
foram previamente tratados com 1mM de PMSF ou 10mM de EDTA. Os dados obtidos utilizando PMSF (1mM),
permitiram evidenciar a inibição de uma banda com peso molecular de 33kDa e de 90kDa, assim caracterizadas como
serino-proteases. Os resultados obtidos empregando EDTA (10mM), demonstraram a inibição de bandas com pesos
moleculares de 33, 76, 90, 145, e 171kDa. A observação direta dos perfis e a análise multivariada dos mesmos indicam
elevada diversidade de proteases extracelulares em Aeromonas, com claras tendências de agrupamento por espécie.
Apoio financeiro: UCS e CAPES.
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Presença de genes de virulência em cepas
de Aeromonas isoladas de um surto de
diarréia no município de São Bento do Una,
PE em 2004
Nascimento, LM1,2; Mendes, CL1; Leal, NC1
Centro de pesquisa Aggeu Magalhães, Fiocruz
Centro de ciências biológicas, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Aeromonas, patogenicidade, diarréia, coprocultura, genes de virulência
Aeromonas são bacilos Gram-negativos, anaeróbios facultativos, pertencentes à família Aeromonadaceae. Há algumas
décadas só eram reconhecidos como patógenos para humanos imunossuprimidos porém, recentemente, esse gênero
tem sido associado a surtos como o ocorrido no primeiro semestre de 2004 no município de São Bento do Una,
Pernambuco, onde esses microrganismos foram isolados de pacientes apresentando diarréia semelhante à colérica.
Nas amostras analisadas por cultura foram identificadas, 18 cepas de Vibrio cholerae O1 e 114 cepas de Aeromonas
spp. caracterizando este como o primeiro relato de um surto envolvendo Aeromonas no Brasil. Elucidar o papel de
Aeromonas no surto é necessário e para isso foi realizada pesquisa, através de PCR, de genes de virulência específicos de
Aeromonas (gcat, exu, lip e aer) codificadores das enzimas glicerofosfolipídeo-colesterol aciltransferase, DNase, lipase
e aerolisina, todas envolvidas no mecanismo de patogenicidade de Aeromonas. Além destes, foram pesquisados os
genes de virulência ctxA e tcpA de V. cholerae O1. Não foi detectada a presença dos genes de V. cholerae nas cepas de
Aeromonas, excluindo a hipótese de transferência horizontal destes genes através dos fagos CTXφe VPIφ. Por outro
lado, foi observada alta freqüência dos genes de virulência de Aeromonas nas 106 cepas pesquisadas: 100% das cepas
apresentaram gcat, 86,6% exu, 84,8% lip e 36,2% amplificaram o gene aer. A detecção dos genes de virulência por
si só não determina o caráter patogênico dos isolados e por isso estudos posteriores que analisem a expressão destes
genes em comparação com a presença e expressão dos mesmos em Aeromonas isoladas de ambiente são relevantes e
serão realizados. Uma vez apontada a patogenicidade dos isolados, surgirá a necessidade da pesquisa de Aeromonas em
amostras de fezes diarréicas como rotina nas coproculturas.
Apoio financeiro: CPqAM/Fiocruz e FACEPE.
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Genes envolvidos na resposta
de Azospirillum amazonense
à limitação de nitrogênio
Sant’Anna, FH; Andrade, DS; Schrank, IS
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
Palavras-chave: RDA, limitação de nitrogênio, Azospirillum amazonense, ppGpp, Hsp
A utilização indiscriminada de fertilizantes industriais apresenta efeitos deletérios sobre o ambiente, portanto é
importante desenvolver formas alternativas de fertilização para uma agricultura sustentável. A bactéria Azospirillum
amazonense possui características propícias para ser empregada como biofertilizante, como a capacidade de promover
o crescimento de vegetais de importância econômica, utilizar sacarose como fonte de carbono, tolerar pHs ácidos e
possuir uma nitrogenase pouco sensível à presença de amônia. Apesar disso, muito pouco se conhece sobre a fisiologia
e a genética dessa bactéria.O solo é um ambiente altamente variável quanto à disponibilidade de nutrientes e quanto a
fatores físico-químicos e, portanto, bactérias que ocupam esse nicho possuem recursos genéticos capazes de sustentar sua
vida neste ambiente. Tendo em vista que a disponibilidade de nitrogênio é essencial para que a bactéria se estabeleça e se
desenvolva no competitivo ambiente da rizosfera, o presente trabalho tem como objetivo estudar genes transcricionalmente
ativos em condições limitantes de nitrogênio através da técnica Micro-RDA. Essa metodologia, baseada em PCR, é
muito sensível e permite um enriquecimento cinético de seqüências presentes exclusivamente na condição de cultivo
a ser testada (Tester, condição limitante de nitrogênio), com o auxílio de uma população de seqüências provenientes
de uma condição de cultivo controle (Driver, condição de suficiência de nitrogênio), que “conduzem” a subtração de
seqüências redundantes. Através desse procedimento, foram isolados oito genes de A. amazonense envolvidos na resposta
à limitação de nitrogênio. Sete deles apresentam homologia com genes de bactérias da classe Proteobacteria: dnaK e rpoH
(genes que codificam proteínas envolvidas em choque térmico), relA (envolvido na síntese de ppGpp, um mediador
da resposta “estringente”), um gene que codifica para uma diguanilato ciclase/fosfodiesterase (envolvido na síntese
de c-di-GMP, envolvido na formação de biofilmes), um gene que codifica uma subunidade do complexo I da cadeia
transportadora de elétrons, glnA (glutamina sintetase) e gltB (glutamato sintase). Estudos posteriores serão necessários
para entender o papel de cada um desses genes na resposta de A. amazonense à limitação de nitrogênio.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPERGS.
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Isolamento e caracterização molecular e
fenotípica de Aquitalea magnusonii da lagoa
carioca do parque estadual do Rio Doce
Lima-Bittencourt, CI; Costa, PS, Soares, MPS, Reis, MP, Chartone-Souza, E; Nascimento, AMA
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
Palavras-chave: Aquitalea magnusonii, gene de rRNA 16S, fingerprinting genômico
A Biogeografia, antes exclusiva de macrorganismos, estuda a distribuição espacial e temporal das espécies de seres vivos
e tem como objetivos compreender onde os organismos vivem e os fatores que controlam sua abundância. O Brasil
apresenta três biomas importantes quanto à biodiversidade e ao endemismo de macrorganismos: Floresta Amazônica,
Floresta Atlântica e o Cerrado. O Parque Estadual do Rio Doce se insere como o maior fragmento da Mata Atlântica
de Minas Gerais, sendo seu sistema hídrico formado por cerca de 50 lagoas. Este projeto propôs a analisar a distribuição
de bactérias e sua diversidade genética e fenotípica por abordagens clássica (utilização de citrato como fonte de
carbono, produção de amilase, crescimento em NaCl, susceptibilidade a antimicrobianos e perfil protéico) e molecular
(BOX-PCR, tDNA e ITS – seqüência espaçadora transcrita – e seqüenciamento do gene de rRNA 16S). As amostras de
água foram coletadas em três pontos, região litorânea, limnética e intermediária, na lagoa Carioca – considerada uma
lagoa rasa e moderadamente eutrofizada –, à profundidade de 3 m, que levava em consideração a penetração de 1% da
luz na coluna de água. As amostras de água foram semeadas em PTYG. A partir da análise filogenética das seqüências
do gene rRNA 16S, 30 isolados afiliados à espécie tipo Aquitalea magnusonii utilizaram citrato, apresentaram o mesmo
perfil protéico e cresceram em 4% de NaCl. Sabe-se que a espécie tipo cresce em até 1,5% de NaCl. As concentrações
inibitórias mínimas foram as seguintes: estreptomicina e amikacina (64 a 128 µg/ml), gentamicina (4 a 16 µg/ml),
cloranfenicol (16 a 64 µg/ml) e bicloreto de mercúrio (≤2 a 4 µg/ml). É importante ressaltar que a bactéria mais
proximamente relacionada à A. magnusonii, descrita como um novo gênero em 2006, é a Chromobacterium violaceum,
com 95% de similaridade. Entretanto, a similaridade entre os isolados e C. violaceum foi de 96%, enquanto a similaridade
entre a espécie tipo e os isolados foi de 99,1%. Esta variação pode ser explicada pela origem dos isolados uma vez que
a espécie tipo é originária de um lago oligotrófico, cujo ambiente contrasta com a Lagoa Carioca. A análise molecular
obtida por BOX-PCR revelou diversidade genômica, agrupando os isolados em três perfis. Os isolados apresentaram
perfis idênticos quando analisados por ITS e tDNA-PCR. Os resultados obtidos com os ensaios moleculares e fenotípicos
sugerem que esta população de isolados de A. magnusonii é homogênea.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG.
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Dosimetria de esporos: uma proposta de
monitoramento global da radiação solar UV
biologicamente ativa
Rampelotto, PH1,2; Freitas, SL1,2; Rosa, MB1; Schuch, NJ1; Pinheiro, DK3; Munakata, N4
Centro Regional Sul de Pesquisas Espaciais, Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais, Santa Maria – RS
Laboratório de Ciências Espaciais de Santa Maria, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria - RS
3
Departamento de Engenharia Química e Laboratório de Ciências Espaciais de Santa Maria, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria - RS
4
Departamento de Ciências da Vida, Universidade de Rikkyo, Tókio - Japão
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bacillus subtilis, radiação UV, monitoramento
A radiação solar é essencial para a vida na superfície terrestre, mas paradoxalmente é uma fonte de estresse ambiental
para os organismos vivos. Em conseqüência, diversos dosímetros biológicos objetivando monitorar a radiação solar
UV biologicamente ativa vêm sendo desenvolvidos nas últimas décadas. Entre os métodos biológicos propostos na
literatura, o uso de biosensor baseado na inativação de esporos de Bacillus subtilis TKJ 6312 apresenta várias propriedades
adequadas para sua utilização como dosímetro solar devido, principalmente, a sua simplicidade, facilidade no manuseio,
transporte, estável armazenamento prolongado e por apresentar um espectro de ação bem definido. Devido à deficiência
em ambos os mecanismos de reparo de DNA, reparo por excisão de nucleotídeo e liase SP, os esporos desta cepa são
hipersensíveis a radiação UV. Tentativas de aplicar este dosímetro sob várias condições têm sido insistentemente estudadas
nos últimos anos, assim como comparações com dosímetros físicos. Por outro lado, seu comportamento por longo
período de tempo, sob diferentes e adversas condições climáticas, ainda permanece desconhecido. Exposições mensais
do dosímetro biológico TKJ 6312 têm sido realizadas em diversos locais, em várias latitudes e continentes. Os dados
obtidos pelo biosensor são expressos na forma de SID (dose de inativação de esporo), obtida do logaritmo natural
negativo da fração de sobrevivência. Neste trabalho são apresentados os resultados de oito anos de análises da dosimetria
esporular, realizada mensalmente desde 2000, para as estações de monitoramento de Punta Arenas – Chile (53,2°S), São
Martinho da Serra – Brasil (Observatório Espacial do Sul, 29,4ºS), Padang – Indonésia (0,9°S), Tókio – Japão (35,7°N)
e Bruxelas – Bélgica (50,9°N). As análises demonstram uma variação de SID em concordância com a variação sazonal
da radiação UVB, tanto para baixas, quanto médias e altas latitudes de ambos os hemisférios. Os maiores valores de SID
foram encontrados nos verões: 1.031±113 para Punta Arenas e 4.798±1.723 para São Martinho da Serra, bem como
1.280±336 e 2.270±563 para Tókio e Bruxelas, respectivamente. Os menores valores foram observados nos invernos:
42,5±13, 401±171, 44±21 e 156±49 para Punta Arenas, São Martinho da Serra, Bruxelas e Tókio, respectivamente.
Variações sazonais máximas foram encontradas nos locais de altas latitudes. Além disso, as estações do Hemisfério Sul
apresentaram valores maiores de SID em comparação com as estações do Hemisfério Norte. Os resultados demonstram
o potencial de aplicação do dosímetro biológico TKJ 6312 para o monitoramento da radiação solar UV biologicamente
ativa tanto em escala local, quanto global, que são apresentados de forma detalhada.
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Ajuste metodológico para construção
de bibliotecas e seqüenciamento de
plasmídeos de Bacillus thuringiensis subsp.
kurstaki estirpe S76
Galvão, PG; Melo, LHV de; Gitahy, PM; Vidal, MS; Silva, FR da; Simões-Araujo, JL; Baldani JI
Laboratório de Genética e Bioquímica, Embrapa Agrobiologia, 23890-0000- Seropédica, Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: Seqüenciamento. Bacillus thuringiensis. Plasmídeos
O Bacillus thuringiensis deposita, no citoplasma da célula em esporulação, inclusões cristalinas de natureza protéica
com atividade para larvas de insetos de diversas ordens, nematóides, ácaros e protozoários. Os genes cry, que codificam
as delta-endotoxinas contidas nesses cristais, estão localizados em plasmídeos conjugativos de alto peso molecular.
Diversos aspectos do complexo perfil de elementos extracromossomais de B. thuringiensis, que pode representar até
20% do genoma da bactéria, têm sido estudados desde a década de 1970. Estudos recentes utilizando a estirpe brasileira
S76 de B. thuringiensis kurstaki, indicaram uma alta atividade entomopatogênica contra o gênero Diatraea. Segundo a
literatura, os genes responsáveis pela produção das deltaendotoxinas com atividade para insetos da ordem Lepidoptera
em Bt. subespécie kurstaki estão localizados em plasmídeos de aproximadamente 44 e 110 MDa. Entretanto, pouco
é conhecido a respeito destes e dos outros plasmídeos de Btk S76. Por isso, a otimização da metodologia utilizada
para extração e purificação dessas moléculas tornou-se extremamente necessária. Os plasmídeos de BtK S76 foram
extraídos e purificados através de ultracentrifugação em gradiente de CsCl e com o kit comercial QIAGEN, sendo que
ambas as técnicas apresentaram um perfil plasmidial semelhante. Foi selecionado o plasmídeo denominado pBt20 de
BtK S76, que foi extraído do gel e posteriormente eletroeluído e amplificado com o kit comercial GenomiPhi™ DNA
Amplification, visando aumentar a massa de DNA plasmidial para as futuras etapas do trabalho. O DNA plasmidial
do pBt20 foi fragmentado através de nebulização e os fragmentos obtidos (100 a 2000 pb) geraram uma biblioteca
com aproximadamente 6.600 clones. Foram seqüenciados 1.440 clones, que possibilitaram a montagem de 56 contigs,
totalizando 33,7 kb. A comparação desses contigs com o banco de dados revelou 41% com valores de e-value nãosignificativos, 7% que codificam para proteínas que não apresentaram similaridade com o banco de dados, 18% que
codificam para proteínas hipotéticas conservadas e 34% que possuem funções putativas. Dentre as proteínas similares
ao banco de dados destacam-se HxlR, Doc, Mob, Rep, além das enzimas pertencentes às famílias beta-lactamases,
exoribonuclease e fosfotransferases. A ocorrência de redundância observada na biblioteca, e conseqüentemente, na
montagem das seqüências, não permitiu o fechamento do seqüenciamento do pBt20.
Agradecimentos – programa CNE/FAPERJ, CNPq processo 475400/04-6 e 310474/06-0, Capes.
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Isolados de Bacillus thuringiensis de várias
regiões do Brasil apresenta novas toxinas
Cry no controle biológico de nematóides
Abreu, IL1; Marucci, SC1; Guidelli-Thuler, AM1; Lemos, MVF1
Departamento de Biologia Aplicada Agropecuária, Universidade Estadual Paulista/UNESP - Jaboticabal
[email protected]
1
Palavras-chave: controle biológico, gene recombinante, proteína Cry, nematóides
Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram positiva caracterizada por produzir proteínas Cry durante a fase de
esporulação; tais proteínas possuem alta especificidade em controlar insetos-praga, não prejudicando animais e plantas
do ambiente. Com o aumento na incidência de nematóides resistentes aos anti-helmínticos, que são parasitas de
ovinos, essa bactéria pode ser utilizada como alternativa no controle biológico desses tipos de nematóides. O objetivo
deste trabalho foi buscar linhagens ou isolados de B. thuringiensis, que contenham em genes que possam ser utilizados
no controle de nematóides. Foram utilizadas isolados de B. thuringiensis provenientes de várias regiões do Brasil: os
isolados BR42, lor2008, BR52, BR56, J2 e a linhagem padrão B. thuringiensis var. Soto, utilizada como controle
positivo para os genes cry5A, cry5Ba, cry5B, cry14Aa e cry21Aa, responsáveis pela toxicidade à nematóides. Os isolados
bacterianos e a linhagem padrão tiveram seu material genético extraído e submetido à amplificação com os iniciadores
específicos para os referidos genes cry, os isolados acima citados apresentaram amplificação de todos os genes. Nas
análises de proteínas pela técnica de SDS-Page houve uma diferenciação no tamanho das bandas, indicando que os
isolados possuem proteínas diferentes e que podem atuar em diferentes tipos de nematóides. A linhagem lor2008
apresentou proteína Cry com características morfológicas diferentes das outras proteínas já descritas na literatura, tais
como os cristais com morfologia mista bipiramidais/cubóides, que podem revelar um gene cry recombinante.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Caracterização de genes entomotóxicos de
Bacillus thuringiensis de interesse agrícola
Martins, PGS1; Jain, SA2; Lucena, WA2
Departamento de Biologia, Universidade Estadual da Paraíba
Laboratório de Biologia Molecular de Insetos, Embrapa Algodão
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Controle Biológico, Algodão, Genes cry, Cry toxinas, Coleoptera
A cotonicultura é uma das atividades de grande importância sócio-econômica para o Brasil e somente a fibra, seu
principal produto, apresenta mais de quatrocentas aplicações industriais. Porém, o cultivo do algodão sofre grandes
prejuízos com o ataque de insetos-praga, principalmente das ordens Coleoptera e Lepidoptera. O controle destas pragas
pela aplicação de inseticidas químicos acarreta danos ao ambiente e um considerado aumento nos custos de produção.
Considerando estes problemas, faz-se necessário o estudo de métodos alternativos que possam ser aplicados no controle
destes insetos. O Bacillus thuringiesis (Bt) é uma bactéria GRAM-positiva, presente no solo, que produz durante a fase
de esporulação, cristais protéicos com atividade entomotóxica para as mais diversas ordens de insetos. Estas toxinas são
o produto da atividade dos genes cry. Este trabalho teve como objetivo principal caracterizar genes cry de cepas de Bt
isoladas a partir de amostras de solo do Estado da Paraíba. Para a caracterização por PCR, foram utilizados 95 pares
de oligonucleotídeos (primers) que compreendem as famílias Cry1 a Cry28. Os fragmentos que apresentaram padrões
esperados foram purificados e seqüenciados. Das 135 cepas estudadas, a BV-5 apresentou um amplicon correspondente
a 1.500 pb, tamanho esperado para o par de iniciadores gerais da família Cry1. As amplificações realizadas com os
primers específicos para os genes cry1Ae, cry1F e cry1G, apresentaram fragmentos de amplificação correspondentes aos
esperados para cry1 (respectivamente, 1.169 pb, 967 pb e 1.128 pb). Apesar da similaridade do tamanho dos fragmentos,
o seqüenciamento revelou não homologia com genes cry1. Por outro lado, o seqüenciamento dos fragmentos gerados
pelos primers cry1 gerais resultou na identificação de um fragmento compatível com os descritos para genes do grupo
Cry8, os quais são ativos principalmente contra insetos da ordem Coleoptera, indicando que a cepa BV-5 é portadora
de um gene que codifica para proteínas do grupo Cry 8. As cepas BV-1 e AG-2 apresentaram perfis eletroforéticos
compatíveis com a presença das proteínas Cry9A e Cry16, respectivamente, ativas para as ordens Lepidoptera e Diptera.
Após aprofundar os estudos, os genes em questão poderão ser utilizados para a construção de plantas transgênicas com
resistência às principais pragas do algodão.
Apoio financeiro: Embrapa Algodão.
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Metal repressed promoter from Gram
positive Bacillus subtilis is highly active and
induced by various metals in Gram negative
Cupriavidus metallidurans
Ribeiro-dos-Santos, G; Biondo, R; Quadros, O; Vicente, EJ; Schenberg, ACG
Centro de Pesquisas em Biotecnologia da Universidade de São Paulo
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
Av. Prof. Lineu Prestes 1374, São Paulo, 05508-900, SP, Brasil
A synthetic version of the mrgA (metal regulated gene A) promoter from Bacillus subtilis, which in this Gram positive
bacterium is negatively regulated by excess manganese, iron, cobalt or copper, turned out to promote high level of basal
gene expression that is further enhanced by Cd+2, Co+2, Mn+2, Zn+2, Cu+2, Ni+2, Pb+2 or Fe+2, when cloned in the metal
resistant Gram negative, Cupriavidus metallidurans CH34. Gene expression was monitored by transcription of the
reporter gene EGFP (enhanced green fluorescence protein), and cellular intrinsic fluorescence was quantified by flow
cytometry. Expression levels in C. metallidurans driven by the heterologous promoter, here called pan, ranged from an
order of magnitude 25- to 60-fold the expression level of the Escherichia coli lac promoter (constitutively expressed in
C. metallidurans), whether in the presence or absence of metal ions, respectively. The pan promoter did also function in
E. coli in a constitutive pattern, regardless of the presence of Mn+2 or Fe+2. In conclusion, the pan promoter proved to be
a powerful tool to express heterologous proteins in C. metallidurans grown upon high levels of several heavy metals.
Support: VALE, CNPq, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/USP.
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Genômica funcional de Bacillus
thuringiensis: produção e análise
de um banco de mutantes
Cordeiro, JX1; Gonçalves, JF1; Laia, ML2; Paixão, DAA2; Lemos, MVF1
Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, UNESP campus Jaboticabal
2
Departamento de Tecnologia, UNESP campus Jaboticabal
[email protected]
1
Palavras-chave: genômica funcional, controle biológico, genes cry
Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria gram-positiva, encontrada no solo, amplamente utilizada no controle biológico.
Após a esporulação, B. thuringiensis produz um tipo de proteína, Cry, que é entomopatogênica para uma grande gama
de insetos pragas, incluindo espécies das ordens Lepidoptera, Diptera, Coleoptera e também nematóides. Existem
isolados que produzem uma grande quantidade dessas proteínas e outros que as produzem em pequenas quantidades,
sugerindo haver uma regulação da produção. Com o objetivo de identificar genes que atuam na regulação da produção
dessas proteínas, escolheram-se dois isolados de B. thuringiensis (Br55 e SP2), que se destacaram no controle de lagartas
de Spodoptera frugiperda, sendo que um destes isolados produz uma grande quantidade de esporos e o outro produz
baixa quantidade. Esses isolados foram submetidos à mutação aleatória por meio de transposon in vitro e os clones
recombinantes foram analisados quanto à produção de cristais. Os resultados indicam haver diferenças significativas
entre os mutantes e destes em relação ao isolado selvagem, podendo ser encontrado mutantes que produziram mais
que o isolado selvagem. A identificação do local de inserção do transposon permitirá identificar os genes envolvidos
no processo regulatório da produção de proteínas cristal em B. thuringiensis, o que, além de permitir entender os
mecanismos genéticos envolvidos na produção desse tipo de proteínas, poderá permitir transformar isolados pouco
em altamente produtivos. Além disso, no presente estudo foi padronizada uma metodologia de produção de células
eletrocompetentes para essa espécie de bactéria.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Estratégias para a obtenção do copolímero
biodegradável poli(3-hidroxibutirato-co3-hidroxihexanoato) (P3HB-co-3HHx)
acumulado por Burkholderia sacchari
Mendonça, TT1; Gomez, JGC1; Silva, LF1; Camargo, ARO1
Departamento de Microbiologia – Instituto de Ciências Biomédicas – Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Burkholderia sacchari, Poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato, ácido hexanóico, PHA, mutantes
Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres produzidos por diversas bactérias a partir de fontes renováveis que
despertam grande interesse por suas propriedades elastoméricas e/ou termoplásticas e por serem biodegradáveis.
Poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato (P3HB-co-3HHx) pertence à classe dos PHA e é produzido por Burkholderia
sacchari a partir de glicose e ácido hexanóico, porém, a fração de 3HHx acumulada ainda é pequena. O aumento
das frações deste monômero no copolímero pode melhorar as propriedades mecânicas e diversificar suas aplicações,
tornando-o interessante do ponto de vista industrial e acadêmico. Objetivando o aumento da fração de 3HHx, foram
realizados experimentos de acúmulo de PHA em meio mineral com diferentes concentrações de glicose (5, 10 e 15 g/L)
combinadas às concentrações 0,25, 0,5 e 1,0 g/L de ácido hexanóico. A partir desses cultivos, foram determinadas
as concentrações PHA acumuladas e sua composição utilizando análises de cromatografia gasosa. O acúmulo de
PHA nestes experimentos variou entre 11,2 e 58,15%, a proporção do monômero 3HB no copolímero esteve entre
99,15 a 100 mol% e de 3HHx atingiu cerca de 1,7 mol%. Em concentrações de glicose 5g/L e ácido hexanóico 1g/L
a fração de HHx do copolímero foi maior, quando comparada às outras concentrações testadas. Foram ainda obtidos
mutantes de B. sacchari por radiação UV, buscando-se por aqueles incapazes de crescer em ácido hexanóico (hx-), mas
ainda capazes de utilizar este substrato para produzir PHA. Estes foram submetidos a novos experimentos sob condições
de acúmulo para a verificação da possível melhora na capacidade em acumular P3HB-co-3HHx.
Apoio Financeiro: FAPESP 07/52113-2.
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Identificação de genes cry funcionais de
Bacillus thuringiensis com capacidade
bioinseticida contra larvas de Aedes aegypti
e Culex quinquefasciatus
Lopes, L; Costa, JRV; Campanini, EB; Lemos, MVF
Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária,Universidade Estadual Paulista – FCAV
[email protected]
Palavras-chave: Díptera, PCR
A bactéria de solo Bacillus thuringiensis, caracteriza-se por sua entomopatogenicidade relacionada à produção de
inclusões protéicas de formato cristalino (proteínas Cry), que se formam durante a esporulação. A patogenicidade e
a especificidade de uma linhagem de B. thuringiensis é determinada pelos tipos de genes cry funcionais que a mesma
possui. Estes genes codificam para as proteínas Cry, que são sintetizadas na forma de protoxinas. Ao serem ingeridas
por uma larva do inseto susceptível, tais protoxinas são solubilizadas no ambiente alcalino do intestino do mesmo
(pH~10) e, em seguida, são processadas por proteases específicas. Os produtos ativos das toxinas, resultantes de todos
esses processos, ligam-se de maneira irreversível a receptores de membrana das células epiteliais do intestino do inseto,
levando à formação de poros inespecíficos ou canais iônicos que alteram a permeabilidade destas células, acarretando a
lise celular e ruptura da integridade intestinal, com conseqüente morte da larva. Com o objetivo de detectar a presença
de genes cry efetivos no combate de Aedes aegypti e de Culex quinquefasciatus foram analisados 1073 isolados de B.
thuringiensis provenientes de diversas regiões brasileiras. As colônias isoladas foram obtidas do cultivo das bactérias em
placas de Petri contendo meio Ágar Nutriente. Posteriormente foi realizada, para cada isolado, a extração do DNA, coletada
a sua fase aquosa e armazenada a 20ºC. As amostras de DNA bacterianos foram submetidas à PCR com iniciadores
específicos para a confirmação da presença dos genes cry24, cry25, cry26, cry27, cry28, cry29, cry30, cry31 e cry32.
Após as amplificações, alíquotas das amostras foram misturadas a 2μl de tampão de amostra, aplicadas em géis de
agarose contendo brometo de etídeo e submetidos à eletroforese por 2 h a 70 V. Os géis de agarose foram visualizados
sob luz UV e fotodocumentados em um aparelho Gel-Doc 2000 da Bio-Rad. Em todas as eletroforeses realizadas, foi
empregada uma amostra de DNA com fragmentos de tamanhos conhecidos, múltiplos de 1kb (1kb DNA Ladder), que
serviram como referência de migração eletroforética para verificação dos tamanhos dos fragmentos obtidos nas reações
de amplificação. Poucos trabalhos têm relatado uma caracterização detalhada das coleções de B. thuringiensis em termos
de conteúdo de genes cry. No presente trabalho, para os genes cry26, cry28, cry30 e cry32, foi detectada a possibilidade
de obtenção de amplicons para 92 isolados, representando 8,57%. Os genes cry26 apresentaram maior porcentagem
de isolados (6,8%), podendo ser excelentes isolados efetivos no controle biológico de insetos da ordem Díptera.
Apoio Financeiro: PIBIC Reitoria.
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Detecção de genes cry e cyt em isolados
de Bacillus thuringiensis com capacidade
bioinseticida contra larvas de Aedes aegypti
(Diptera:Culicidae)
Costa, JRV1*; Rossi, JR1; Marucci, SC1; Neves, MC1; Alves, ECC1; Lemos, MVF1; Sena, JAD1
Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista – FCAV/UNESP –
Campus de Jaboticabal
[email protected]
1
Palavras-chave: Díptera, Controle Biológico, Dengue, genes cry, genes cyt
O aparecimento da resistência aos inseticidas químicos tem sido descrita em uma série de ordens de insetos, afetando a
reemergência de doenças transmitidas por vetores. Nos últimos tempos o Aedes aegypti, principal vetor do Dengue no
Brasil, tem sido combatido com o uso maciço de produtos químicos para o controle de adultos e larvas, o que torna
o combate ao mosquito uma difícil tarefa. A utilização de agentes de controle biológico é uma alternativa viável, visto
que, bioinseticidas formulados à base de Bacillus thuringiensis vêm apresentando resultados satisfatórios no controle de
dípteros, devido à produção de inclusões cristalinas compostas por proteínas bioinseticidas codificadas pelos genes cry
e cyt, os quais determinam a patogenicidade e especificidade de uma linhagem. O objetivo deste trabalho foi detectar a
presença de novos genes cry e cyt (díptero-específicos), em uma coleção de isolados de B. thuringiensis, provenientes de
diversas regiões brasileiras e, por meio de bioensaios, selecionar isolados que apresentarem alta eficiência no controle
de A. aegypti. Para tanto, foi realizada a extração do DNA genômico de cada um dos isolados, com a utilização da
resina de troca iônica InstaGene Matrix. Foi adotada a técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), com base
nos iniciadores específicos elaborados a partir das regiões conservadas das seqüências depositadas no Genbank, os quais
detectam os genes cry4Aa, cry4Ba, cry11Aa, cry11Ba, cyt1Aa, cyt1Ab e cyt2Aa. Para as análises de bioensaios, larvas de
3º ínstar de A. aegypti foram submetidas ao tratamento com suspensões na concentração de 1,5x108 esporos/mL dos
isolados de B. thuringiensis que apresentaram genes díptero-específicos, conduzido em quatro repetições, comparando-se
os resultados com a linhagem padrão HD-1 var kurstaki (controle negativo) e B. thuringiensis var israelensis (controle
positivo). As avaliações de mortalidade foram realizadas nas quatro primeiras horas, 24h e 48h após a aplicação da
suspensão bacteriana. Os resultados obtidos permitiram demonstrar que, dos 1073 isolados analisados, 5 apresentaram
amplificação para o iniciador cry4Aa, 23 para cry4Ba, 17 para cry11Aa e 12 isolados para cry11Ba. Para os iniciadores cyt,
23 isolados amplificaram para o iniciador cyt1Aa, seguidos de 9 isolados para cyt1Ab e 15 para cyt2Aa. Aproximadamente
23% dos isolados amplificados apresentaram combinações de genes cry e cyt, as quais dificilmente são encontradas.
Dos 46 isolados submetidos aos testes de bioensaios, 14 (30%) apresentaram índices de mortalidade satisfatórios. A
caracterização e identificação de genes cry e cyt, associadas à análise da eficiência de controle de insetos vetores, fazem-se
importantes pelo fato de permitir a seleção de isolados portadores de genes que codificam proteínas específicas contra
dípteros. Estes poderão ser utilizados em formulações de novos bioinseticidas eficientes no controle de insetos alvos na
saúde humana, podendo contornar possíveis resistências destes insetos às toxinas Cry.
Apoio financeiro: CNPq.
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Análise de genes cry em isolados de
Bacillus thuringiensis efetivos contra
Spodoptera frugiperda
(Lepidoptera: Noctuidae)
Campanini, EB1; Abreu, IL1; Davolos, CC1; Lopes, L1; Alves, ECC1; Lemos MVF1
Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, UNESP - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal
[email protected]
1
Palavras-chave: genes cry, proteína Cry, PCR, controle biológico, lagarta-do-cartucho
A crescente preocupação com o meio ambiente tem elevado a importância das pesquisas científicas envolvendo
microrganismos capazes de promover o controle biológico de pragas agrícolas e de interesse na saúde pública, com grande
destaque para o agente entomopatogênico Bacillus thuringiensis. Esta bactéria produz diferentes proteínas durante seu
processo de esporulação, denominadas proteínas Cry, cuja patogenecidade e especificidade são determinadas pelos genes
que as codificam, denominados genes cry. Essas proteínas possuem atividade tóxica contra insetos das ordens Lepidoptera,
Coleoptera e Diptera, e também contra nematóides, ácaros e protozoários. Por serem altamente específicas, são inócuas
à flora, não são poluentes e não atingem os inimigos naturais dos insetos-alvo. Para que a utilização de B. thuringiensis
como agente de controle biológico seja viável, é necessário seu contínuo isolamento, visando descobrir isolados com
maior atividade inseticida, inclusive contra insetos-praga tidos como não suscetíveis como é o caso da principal praga da
cultura do milho, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), conhecida como lagarta-do-cartucho. Dessa forma,
os objetivos desse trabalho foram: a seleção de isolados lepidópteros-específicos por análise molecular e a determinação
do potencial de controle desses isolados sobre lagartas de S. frugiperda, associando a presença e/ou ausência dos genes cry
com a mortalidade obtida em bioensaio. Para isso, foi realizado o isolamento das bactérias do solo a partir de 30 amostras
oriundas de Ilha Bela (SP), sendo obtidos 76 isolados, cujo material genético foi extraído por uma matriz de troca iônica
(Instagene). Posteriormente, o material genético foi submetido a amplificações com o oligonucleotídeo iniciador geral
gral-cry1, e com os seguintes oligonucleotídeos iniciadores específicos: cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ad, cry1Ae, cry1Af,
cry1Ag, cry1Ba, cry1Bb, cry1Bc cry1Bd, cry1Be, cry1Bf, cry1Ca, cry1Da, cry1Ea, cry1Fa, cry1Ga, cry1Ia e cry1Ja, cry1Ka.
Foi então realizado um bioensaio com os isolados que apresentaram amplificação para os oligonucleotídeos iniciadores
testados, onde foram adicionadas suspensões de esporos dos isolados à alimentação fornecida às lagartas, que ficaram
expostas à dieta durante sete dias. Dos 76 isolados analisados, foi observada amplificação de 9 para o oligonucleotídeo
iniciador geral e 11 para os oligonucleotídeos iniciadores específicos, sendo: 2 isolados para cry1Ad, 7 para cry1Bb, 6
para cry1Bc, 4 para cry1Bd, 7 para cry1Be, 9 para cry1Bf, 8 para cry1Da, 9 para cry1Fa, 10 para cry1Ia, e 9 para cry1Ka.
Esse resultado mostrou que o oligonucleotídeo iniciador geral gral-cry1 não contempla toda a diversidade de isolados
que está sendo encontrada no Brasil. Já o bioensaio, realizado com os 11 isolados caracterizados como lepidópteroespecíficos, revelou que três deles possuem um alto potencial de controle á S. frugiperda (taxa de mortalidade acima
de 70%) e, a partir desses resultados, pode-se inferir que esses três isolados são altamente viáveis para a utilização no
controle biológico desse inseto-praga.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Clonagem e caracterização de um possível
novo gene cry de Bacillus thuringiensis
Gonçalves, JF1; Laia, ML2; Cordeiro, JX1; Neves, MC1; Lemos, MVF1
Departamento de Biologia Aplicada a Agropecuária, UNESP/FCAV
2
Departamento de Tecnologia, UNESP/FCAV
[email protected]
1
Palavras-Chave: clonagem, caracterização, gene cry, biblioteca genômica, seqüenciamento
Ao longo dos anos vem aumentando a preocupação com o uso indiscriminado de agrotóxicos na agricultura,
despertando em cientistas e na população em geral desejos de encontrar uma alternativa a este tipo de controle. Uma
solução menos agressiva ao meio ambiente é o uso do controle biológico de pragas e doenças. Especificamente para
as pragas, o emprego da bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis (Bt) tem sido uma alternativa viável. Essas
bactérias produzem umas proteínas chamadas Cry, que ao serem ingeridas pelos insetos, causam a morte. Devido à alta
especificidade dessas proteínas, casos de resistência têm sido observados com certa freqüência, obrigando pesquisadores
a buscar em diferentes isolados novos genes cry efetivos contra as pragas. Diante disto, neste trabalho objetivou-se
identificar e caracterizar possíveis novos genes cry em três isolados de Bacillus thuringiensis. A partir da analise de 41
isolados de Bacillus thuringiensis, em comparação com B. thuringiensis var. kurstaki, B. thuringiensis var. tenebrionis
e B. thuringiensis var. israelensis, três foram selecionados. O seqüenciamento genético de um fragmento de DNA de
aproximadamente 560 pb indicou que dois isolados possuíam a mesma seqüência gênica e o outro era diferente destes.
Análises comparativas dessas duas seqüências em bancos de dados genômicos indicaram que aquela comum aos dois
isolados é similar a um gene cry efetivo contra nematóide. Já a outra seqüência não apresentou ortólogo no banco de
dados. Por meio de hibridização de colônias, uma biblioteca genômica parcial de Bacillus thuringiensis foi analisada e o
gene comum aos dois isolados foi caracterizado. Análises comparativas em bancos de dados genômicos indicam tratar
de um novo gene cry.
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Mapeamento das regiões codificadora e
promotora do gene cspC de Caulobacter
crescentus e análise de sua expressão em
diferentes condições nutricionais
Balhesteros, H; Silva, CAPT; Marques, MV
Instituto de Ciências Biomédicas, Departamento de Microbiologia, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Caulobacter crescentus, CspC, carência nutricional
A resposta ao choque frio em bactérias causa a indução de proteínas de choque frio de baixo peso molecular (cold shock
proteins, CSPs), cuja função conhecida é a de desestabilizar estruturas secundárias do mRNA, permitindo sua tradução
a baixas temperaturas. Caulobacter crescentus é uma alfa-proteobactéria aquática, oligotrófica, de vida livre e ciclo celular
assimétrico, que possui quatro genes codificando CSPs. Dois destes genes têm sua expressão induzida sob choque frio,
enquanto as proteínas codificadas pelos genes cspC e cspD são induzidas durante a fase estacionária. As CSPs possuem
um domínio de choque frio (cold shock domain, CSD) que apresenta propriedades de ligação a RNA. O seqüenciamento
da região codificadora do gene cspC de C. crescentus revelou que a proteína CspC, previamente anotada como portadora
de um domínio CSD, apresenta dois CSDs, arranjo que foi identificado apenas em proteínas de proteobactérias da
subdivisão alfa, assim como CspD de C. crescentus. A região promotora do gene cspC e sua regulação foram estudadas
através de ensaios de atividade de beta-galactosidase. Plasmídeos contendo deleções sucessivas da região promotora
do gene, clonadas à frente do gene repórter lacZ, foram introduzidos na linhagem parental C. crescentus NA1000. Os
ensaios indicaram a presença de uma região regulatória necessária para os máximos níveis de expressão, mas não para
a indução específica de fase estacionária, indicando que cspC possui regulação transcricional e/ou de estabilidade do
mRNA. O padrão de expressão do gene cspC foi analisado durante o crescimento das células em diferentes meios de
cultura, evidenciando uma grande indução da expressão do gene na presença de peptona como única fonte de carbono,
durante a fase estacionária. Além disso, quando se retira a glicose como única fonte de carbono do meio, há leve indução
da expressão de cspC, o que não ocorre ao se retirar a amônia como única fonte de nitrogênio. Estes resultados indicam
uma possível resposta específica da bactéria, em termos de expressão de cspC, ao estado nutricional da célula, condizente
com sua indução em fase estacionária.
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Papel de um regulador de transcrição da
família BlaI na resposta a estresse oxidativo
em Caulobacter crescentus
Braz, VS; Valença, EY; Santos, ES; Marques, MV
Departamento de Microbiologia – Instituto de Ciências Biomédicas – USP – São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Caulobacter crescentus, regulador de transcrição, auto-regulação, oxidoredutase
O genoma da alfa proteobactéria de vida livre Caulobacter crescentus apresenta três reguladores de transcrição da família
BlaI. O único mecanismo bem estudado envolvendo os reguladores de transcrição desta família é o mecanismo de
resistência a antibióticos β-lactâmicos. No sistema BlaI, a proteína de membrana BlaR1 é uma sensora do β-lactâmico,
que ao se ligar ao antibiótico é auto-clivada, liberando seu domínio citoplasmático. Sugere-se que este domínio é a
protease ativa que clivaria o dímero do repressor BlaI, tornando-o incapaz de se ligar ao operador no DNA, aumentando
assim os níveis de transcrição da β-lactamase. Previamente, demonstramos que uma linhagem mutante interrompida
aleatoriamente pelo transposon miniTn5lacZ em um gene que codifica um regulador de transcrição da família BlaI
(CC1640) em C. crescentus mostrou alta sensibilidade a Cd2+ e Zn2+. A jusante do gene CC1640 está o gene CC1639, uma
proteína hipotética que é um ortólogo de BlaR1, e através de RT-PCR foi visto que estes genes fazem parte de um mesmo
transcrito. Com o objetivo de caracterizar este regulador de transcrição e verificar se ele está envolvido na expressão de
outros genes, foi construído o mutante nulo SP2011, através de uma deleção em fase do gene CC1640 para evitar efeito
polar sobre o gene CC1639. Através de teste de viabilidade as linhagens mutantes contendo o miniTn5lacZ e SP2011
mostraram ser mais sensíveis a H2O2 do que a linhagem parental NA1000. A região promotora do operon CC1640/
CC1639 foi clonada no vetor pRKlacZ290, em frente ao gene repórter lacZ. Os resultados de ensaio de atividade de
β-Galactosidase, realizados nas linhagens parental e mutante SP2011, indicaram que o promotor deste gene é induzido
em fase estacionária e apresenta uma auto-regulação negativa, contudo não mostrou alteração da expressão na presença
de H2O2. O resultado da auto-regulação negativa sugere que BlaI possa ligar na sua região promotora e assim regular
a sua própria expressão. Para confirmar esta hipótese o gene CC1640 foi clonado, e a proteína His-BlaI, expressa
heterologamente em E. coli, foi purificada e usada em ensaio de mobilidade em gel (gel shift). Foi identificado um
retardamento da banda utilizando diferentes concentrações de proteína purificada, o que confirma que BlaI se liga na
região promotora do operon CC1640/CC1639. Genes localizados próximos ao operon CC1640/CC1639 no genoma
de C. crescentus, que codificam para proteínas hipotéticas e oxidoredutases, foram analisados quanto a sua regulação
por BlaI. Análise por RT-PCR semi-quantitativo com três destes genes candidatos mostrou que a expressão do gene
CC1638, que codifica uma oxidoredutase, não é detectada na linhagem parental, mas está presente na linhagem mutante
SP2011, indicando que BlaI (CC1640) age como repressor da expressão do gene CC1638, enquanto os outros dois
genes testados, CC1636 e CC1634, não apresentaram nenhuma alteração no padrão de expressão.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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Identificação de sinais celulares e fatores
de transcrição que regulam a expressão do
gene cspD de Caulobacter crescentus
Silva, CAPT; Balhesteros, H; Lang, EAS; Italiani, VCS; Marques, MV
Instituto de Ciências Biomédicas, Departamento de Microbiologia, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras–Chave: Caulobacter crescentus, cspD, choque frio, fase estacionária, regulação gênica
Caulobacter crescentus é uma bactéria mesófila, gram-negativa, encontrada em amostras de água de lagos que congelam
por completo no inverno. C. crescentus possui quatro genes de choque frio: cspA e cspB são induzidos em resposta ao
choque frio e cspC e cspD são induzidos em fase estacionária. O objetivo deste trabalho é a identificação de sinais
celulares e fatores de transcrição que regulam a expressão do gene cspD de C. crescentus. Inicialmente foi realizada
a varredura de uma biblioteca de 7.500 clones mutados pela inserção do transposon Tn5. Os clones mutantes da
biblioteca receberam o plasmídeo PcspD/lacZ (promotor de cspD clonado à frente do gene repórter lacZ no plasmídeo
pRKlacZ290) por conjugação com E.coli S17-1. Através de avaliação utilizando X-Gal e posteriormente ensaio de
atividade de β-galactosidase, foram selecionadas 6 linhagens mutantes que apresentaram baixa atividade enzimática
em comparação ao controle positivo (linhagem NA1000 de C. crescentus conjugada com o plasmídeo PcspD/lacZ).
Através de seqüenciamento de DNA, foram identificados os genes interrompidos em 5 mutantes: CC0254
(proteína transportadora de membrana); CC2587 (ABC Transporter); CC2518 (proteína hipotética); CC3167
(proteína da família glicoquinase) e CC3504 (proteína da família peptidase M13). A expressão de cspD no mutante
CC3167 foi avaliada em meio M2 (meio mínimo) e em M2 com carência de carbono na fase exponencial e fase estacionária
mostrando um aumento de expressão em carência de glicose. Também foi realizada uma curva de crescimento do mutante
CC3167 nos meios PYE e M2 onde foi visto um crescimento bem mais lento no meio M2. A expressão de cspD de
C. crescentus também foi avaliada em resposta a carência nutricional de carbono e amônia, em presença de diferentes
compostos. Notou-se um aumento significativo em torno de 50% da indução do gene cspD nas células crescidas em meio
mínimo com carência de carbono e amônia o que demonstra que carência nutricional também é um fator que altera a
expressão deste gene. No ensaio de crescimento em diferentes meios a expressão de cspD aumentou expressivamente na fase
estacionária em meio M2 contendo 2% peptona, o que nos leva a pensar que a expressão deste gene pode ser afetada pela
a via de regulação por ppGpp. A partir disto realizamos ensaios de atividade de β-galactosidase preliminares na presença
de metil-alfa-D-glicosídeo (simulando carência de glicose) e DL-serina hidroxamato (simulando carência de aminoácidos)
e foi verificado um aumento de duas vezes na expressão de cspD nas duas condições. A proteína CspD recombinante
foi expressa em em E.coli e purificada para obtenção de soro anti-CspD.
Apoio Finaceiro: Fapesp e CNPq.
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Obtenção e análise fenotípica de mutantes
de genes codificantes de proteínas
contendo domínios de choque frio de
Caulobacter crescentus
Mazzon, RR; Silva, CAPT; Lang, EAS; Marques, MV
Instituto de Ciências Biomédicas, Departamento de Microbiologia, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Caulobacter crescentus, choque frio, congelamento
Dentre os fatores ambientais mais críticos para a sobrevivência e crescimento das bactérias está a temperatura, que
exige adaptações rápidas. O estudo da resposta e adaptação ao choque frio é importante para o entendimento de como
os organismos sobrevivem a estresses de baixas temperaturas. A mais característica resposta à queda de temperatura
é a indução de proteínas de baixo peso molecular que possuem um domínio conservado, chamado de “Cold Shock
Domain” (CSD). Caulobacter crescentus é uma bactéria oligotrófica, gram-negativa, que possui grande resistência ao
frio e congelamento. Nesta bactéria há quatro genes codificando proteínas contendo CSD (cspA, cspB, cspC e cspD)
sendo que as duas primeiras são importantes para a adaptação a baixas temperaturas e os genes que codificam para
as duas últimas são induzidos somente em fase estacionária. No presente trabalho foi obtida uma linhagem mutante
para o gene cspB e esta mutação também foi combinada com mutações nos genes cspA e cspD. Estes mutantes foram
analisados quanto à sua capacidade de crescimento a 30ºC e 15ºC, entretanto, não apresentaram diferenças significativas
em relação a linhagem parental. Estas linhagens também foram submetidas ao congelamento a -20ºC e -70ºC e se
mostraram significativamente mais sensíveis que a linhagem selvagem a -70ºC. Nos mutantes duplos e triplo foi analisada
a expressão dos genes cspC e cspD para verificar se estaria havendo compensação da expressão, mas apenas nos mutantes
triplo e ∆cspA∆cspB foram observadas diferenças transcricionais relevantes. De posse destes dados, sugere-se que os
genes desta família em C. crescentus possuam relações hierárquicas, de expressão e de redundância de função diferentes
das apresentadas em Bacillus subtilis e Escherichia coli, os principais modelos de estudo para estes genes.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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Papel do regulador transcricional Fur na
homeostase de ferro e identificação de seu
regulon em Caulobacter crescentus
Da Silva Neto, JF; Marques, MV
Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas, USP, São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Caulobacter crescentus, carência de ferro, regulon Fur
A manutenção de níveis fisiológicos adequados de ferro requer a existência de sistemas eficientes de captação, dado
sua escassa disponibilidade, e mecanismos que evitem seu acúmulo, devido seu potencial de gerar espécies reativas
de oxigênio. Em bactérias, o repressor transcricional Fur desempenha papel fundamental neste processo. Caulobacter
crescentus, uma alfa-proteobactéria, Gram-negativa possui em seu genoma um grande número de genes potencialmente
envolvidos em captação e regulação da homeostase deste metal. O gene fur (CC0057) foi deletado do genoma da
linhagem selvagem NA1000 por troca alélica e a linhagem mutante nula mostrou defeito no crescimento durante fase
exponencial. A linhagem mutante fur também mostrou maior susceptibilidade a estresse oxidativo gerado por peróxido
de hidrogênio em relação à linhagem NA1000, tanto em fase exponencial quanto em fase estacionária de crescimento,
como verificado por ensaio de halo de inibição de crescimento. Estes dois fenótipos foram complementados em trans
pelo gene fur clonado em um vetor de poucas cópias. Para identificar membros do regulon Fur foi realizada uma busca
in silico nas regiões intergênicas do genoma completo de C. crescentus, utilizando uma matriz derivada de seqüências
Fur box de outras bactérias. Foram preditos sítios regulatórios de Fur na região promotora de genes associados a
diversas funções celulares, como sistemas de aquisição de ferro (vários receptores dependentes de TonB, o sistema
de transporte de Fe(II)), transportadores do tipo ABC, reguladores transcricionais, sistemas de transdução de sinal
e enzimas que utilizam ferro como co-fator que fazem parte de importantes vias metabólicas, como ciclo de Krebs e
cadeia de transporte de elétrons. A validação de três destes sítios Fur box preditos, localizados na região promotora dos
genes CC2194, CC0177 e CC3529, que codificam um receptor dependente de TonB, um sistema de transporte de
Fe(II) e a enzima succinato desidrogenase, respectivamente, foi realizada através da análise da expressão destes genes
por ensaio de atividade de beta-galactosidase. Os genes CC2194 e CC0711 foram induzidos em carência de ferro
(100 µM de 2,2’ dipiridil) na linhagem NA1000 e mostraram-se desreprimidos no mutante fur, enquanto o gene
CC3529 foi mais expresso em suficiência de ferro (100 µM de FeSO4) na linhagem NA1000 e teve redução de sua
expressão no mutante fur. Estes resultados confirmam o papel de Fur como repressor de genes de captação de ferro e
seu papel positivo na regulação da expressão de genes que codificam proteínas que estocam ou utilizam ferro como
co-fator. Portanto, os dados obtidos até agora apontam para um papel importante de Fur não apenas na regulação de
sistemas envolvidos na captação de ferro, mas também nos mecanismos utilizados por C. crescentus para controlar os
níveis intracelulares de ferro, evitando a formação de espécies reativas de oxigênio.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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DNA damage and cell cycle progression in
Caulobacter crescentus
Rocha, RP; Galhardo RS; Menck, CFM
Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
[email protected]
Keywords: Caulobacter crescentus, cell cycle, DNA repair
Caulobacter crescentus is a distinctive member of the alpha proteobacteria group. Every new cell cycle produces two
different cell types: one swarmer cell, with motility but unable to proceed to a new round of DNA replication (similar
to a eukaryotic cell in G1 phase), and one stalked cell, which is sessile but competent for the progression of the cell
cycle. The swarmer cell has to differentiate into a stalked cell in order to begin the DNA synthesis. This feature is rare
among bacteria and makes C. crescentus an excellent model to study the relationships between the integrity of the
genetic material and cell cycle progression. C. crescentus cultures can be easily synchronized in order to isolate only the
swarmer fraction. This approach makes it possible to analyze the responses of this organism to damages in the DNA
in each phase of the cell cycle. We used UV light as a model to induce damage in the DNA; synchronized cells were
UV-irradiated in different times of the cell cycle. C. crescentus is more sensitive to UV light in the beginning of G1.
This could happen due to less disponibility of DNA for recombinational repair or to lower expression of DNA repair
genes in those moments. We have followed the pattern of expression of one gene that is involved in DNA repair after
cell synchronization, and confirmed that its expression is lower in the early stages of the cell cycle. This could probably
be the explanation to the phenomenon observed above. New approaches are being developed in the moment to pursue
the effort of understanding the mechanisms coupling the cell cycle and DNA damage in C. crescentus. One of these is
the use of flow cytometry, a strategy to follow the behavior of individual cells.
Financial support: FAPESP and CNPq (Brazil).
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Análise de seqüências nucleotídicas de
genes de quitinase de Chromobacterium
sp. da região amazônica
Brito, DV1; Andrade, EV2; Astolfi-Filho, S2
1
Bolsista de PIBIC, Universidade federal do Amazonas
Centro de Apoio Multidisciplinar, Universidade Federal do Amazonas
[email protected]
2
Palavras-chave: enzimas quitinolíticas, seqüências nucleotídicas, Chromobacterium sp. CVT2, Chromobacterium sp. CVMO3, rio Negro
Chromobacterium violaceum é um bacilo gram-negativo, saprófito, que foi escolhido pelo Brazilian National Genome
Project Consortium para ter o seu genoma inteiramente seqüenciado por ser uma rica fonte de produtos com potencial
biotecnológico, dentre estes a quitinase, enzima que degrada a quitina. O controle biológico de insetos e de fungos
fitopatógenos destaca-se em meio às aplicações dessa enzima. Em resultados anteriores, amostras de Chromobacterium sp.
(CVT2 e CVMO3) do rio Negro mostraram-se mais ativas na degradação in vitro da quitina que a cepa seqüenciada de
C. violaceum, a ATCC 12472. Tal cepa, oriunda da Malásia, já havia sido selecionada como a mais ativa na degradação
de quitina dentre uma variedade de espécies bacterianas consumidoras desse carboidrato. A proposta deste trabalho
foi, então, seqüenciar e analisar as seqüências nucleotídicas de genes de quitinase previamente clonados no vetor
pGEM®-T easy das amostras CVT2 e CVMO3 e compará-las com a seqüência do gene de quitinase de C. violaceum
ATCC 12472 depositada no banco de dados (ORF CV2736). O seqüenciamento nucleotídico foi feito pelo método
de terminação de cadeia de Sanger & Coulson, com os iniciadores específicos para o vetor e para o gene, e a leitura
automática das seqüências foi efetuada no aparelho DNA MegaBACE™ 1000. A análise das seqüências nucleotídicas
incluiu a avaliação da qualidade com o programa Phred, o alinhamento e montagem da seqüência consenso com o
auxílio dos programas Clustal W e CAP3 e a comparação com o banco de dados do NCBI pelo programa Blastn. Para
o gene de quitinase de CVT2, foram analisados os insertos de dois clones, denominados pGCVT2 4 e 6. Os resultados
preliminares para os insertos dos clones 4 e 6 apresentaram 911 e 896 pares de bases (pb), respectivamente, sendo que o
tamanho do gene esperado é de aproximadamente 1.000 pb. A comparação com o banco de dados para ambos os clones
(pGCVT2 4 e 6) revelou uma similaridade de 98% com a ORF CV2736. Para o gene de quitinase de CVMO3, foram
analisados os insertos dos clones pGCVMO3 2 e C1P1. A seqüência consenso do clone C1P1 apresentou 881 pb e
98% de similaridade com a ORF CV2736 e a do clone 2, 555 pb e 97% de similaridade com a mesma ORF. Logo,
conforme o esperado devido a diferença na atividade enzimática in vitro, as seqüências dos genes de quitinase dos
isolados amazônicos, apesar de altamente similares, não são idênticas à seqüência nucleotídica do gene de quitinase de
ATCC 12472. As etapas posteriores do trabalho incluem a conclusão das análises das seqüências do gene de quitinase
de cada isolado e a predição e análise das suas respectivas seqüências dos aminoácidos, bem como a subclonagem destes
genes em vetores de expressão em bactérias.
Apoio finaceiro: CNPq e FAPEAM.
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Identificação de epítopos da superfície
de fagos para o imunodiagnóstico da
linfadenite caseosa em caprinos
Silva, WM1; Seyffert, N1; Santos, BMN1; Prudencio, CR3; Pacheco, LGC1; Castro, TLP1; Dorella, FA1; Cerqueira, PG1;
Pinto, AC1; D´Afonseca, V1; Portela, RW4; Soares, SC1; Mahecha, GAB5; Goulart, LR3; Meyer, R4; Miyoshi, A1;
Chavez-Olórtegui, C2; Azevedo, V1
1
Laboratório de Genética Celular e Molecular – Depto. Biologia Geral, ICB-UFMG, BH, MG
Laboratório de Imunoquímica de toxinas – Depto. Bioquímica e Imunologia, ICB-UFMG, BH, MG
3
Instituto de Genética e Bioquímica – Universidade Federal de Uberlândia, IGB-UFU, Uberlândia, MG
4
Laboratório de Biointeração – Instituto de Ciências da Saúde, Vale do Canela, Salvador, BA
5
Laboratório de Biologia da Reprodução LABRE, ICB-UFMG
2
Palavras-chave: phage display, C. pseudotuberculosis, imunodiagnóstico, proteínas, linfadenite caseosa
Corynebacterium pseudotuberculosis (CP) é o agente etiológico da linfadenite caseosa (LC) que acomete pequenos ruminantes.
Essa doença é atualmente uma das principais causas de perdas econômicas na caprinocultura e na ovinocultura mundial.
A infecção instala-se principalmente por ferimentos na pele e, caso não seja identificada precocemente, pode proliferar,
comprometendo o rebanho em sua totalidade. Alguns testes diagnósticos foram desenvolvidos, mas nenhum deles com
elevada acurácia principalmente no período subclínico da enfermidade. A técnica de phage display permite a seleção de
peptídeos que são expressos na superfície de fagos filamentosos pela especificidade individual a uma molécula alvo e de
uma ligação de alta afinidade. Os testes sorológicos, para detecção de anticorpos, geralmente são baseados no uso de
antígenos brutos e purificados que podem apresentar reações cruzadas e baixa sensibilidade. Baseado nesses fatores, o
trabalho tem por objetivo o desenvolvimento de testes diagnósticos para a LC, utilizando como antígenos os peptídeos
selecionados pela técnica de phage display. Até o momento, foram realizadas: (i) extrações das imunoglobulinas de soros de
animais experimentalmente infectados com CP; (ii) extrações das imunoglobulinas de soros de animais experimentalmente
infectados com proteínas secretadas por CP; (iii) extrações de proteínas secretadas de CP. As imunoglobulinas foram
quantificadas por Bradford e analisadas por ELISA para a utilização nos três biopannings com duas bibliotecas de fagos
filamentosos, contendo 12 e 15 aminoácidos. Os resultados de ELISA indireto sugerem considerável especificidade dos
fagos selecionados com os anticorpos de caprinos experimentalmente infectados. Contudo estudos mais detalhados
de avaliação de especificidade dos fagos estão em andamento para posterior seqüenciamento do DNA viral, análises in
silico, síntese dos peptídeos e padronização dos ensaios para utilização no diagnóstico da LC.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG e FINEP.
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Construção de uma biblioteca genômica de
Corynebacterium pseudotuberculosis para
a identificação de promotores através da
expressão de GFP
Cerqueira, PG1; Pinto, AC1; Dorella, FA1; Pacheco, LGC1; Soares, SC1; Castro, TLP1; D´Afonseca, V1; Seyffert, N1, Meyer, R2;
Miyoshi, A1; Azevedo, V1
1
Laboratório de Genética Celular e Molecular – Depto. Biologia Geral, ICB-UFMG, BH, MG
Laboratório de Imunologia de Doenças Infecciosas – Depto. Bioquímica e Imunologia, ICB-UFMG, BH, MG
[email protected]
2
A linfadenite caseosa é uma doença que acomete caprinos e ovinos e tem como agente etiológico a Corynebacterium
pseudotuberculosis. Apesar da ampla distribuição mundial desta doença e de sua grande importância econômica, a
imunoprofilaxia contra a infecção causada por esta bactéria ainda não é eficaz na redução da incidência da doença, o que
em grande parte pode ser explicado pelo pouco conhecimento sobre os mecanismos moleculares e as bases genéticas da
sua virulência. A compreensão dos mecanismos de patogenicidade em bactérias depende da identificação e caracterização
de genes e produtos gênicos que estejam envolvidos no processo de infecção. O desenvolvimento de técnicas de
biologia molecular associado ao progresso das diversas áreas da biologia tem levado à identificação e caracterização de
vários fatores de virulência, assim como o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos e vacinas. As estratégias
utilizadas baseiam-se na expressão e transferência gênica, mutações aleatórias ou dirigidas, comparação genômica e
seqüenciamento. Entre estas estratégias, os genes repórteres vêm sendo amplamente utilizados para estudar a expressão
gênica e outros eventos celulares ligados à expressão gênica, como atividade de promotores e receptores, transdução de
sinal intracelular, enovelamento de proteínas e interações proteína-proteína. Neste contexto, a proteína fluorescente
verde (GFP) vem sendo utilizada como um excelente sistema repórter que funciona produzindo fusões transcricionais
entre a seqüência gênica de interesse e o gene gfp, permitindo assim a mensuração da expressão gênica. Recentemente,
o nosso grupo iniciou a construção de uma biblioteca genômica de C. pseudotuberculosis, utilizando a expressão de gfp,
com o objetivo de identificar e caracterizar promotores, bem como relacionar sua atividade em situações de estresses,
podendo assim esclarecer alguns dos mecanismos de virulência de C. pseudotuberculosis. A estratégia escolhida baseiase na utilização do vetor pSM20, funcional tanto em Escherichia coli quanto em C.pseudotuberculosis, que contém o
gene repA, necessário para a replicação em ambas essas espécies, o gene de resistência a kanamicina e o gene gfp sem
seu promotor. A funcionalidade da seqüência de DNA clonada a montante do gfp poderá ser verificada caso esta seja
capaz de induzir a expressão da proteína GFP. Através deste sistema foram obtidos cerca de 7000 clones em E. coli que,
atualmente, estão sendo confirmados para a presença de fragmento. Após a confirmação, os vetores com a presença de
inserto serão transformados em C. pseudotuberculosis e a expressão de gfp nesta bactéria será analisada. Os clones que
apresentarem luminescência serão seqüenciados, caracterizados e submetidos aos testes de estresses.
Apoio Financeiro: FAPEMIG e CNPq.
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Integração da genômica e proteômica de
Corynebacterium pseudotuberculosis para
o imunodiagnóstico da linfadenite caseosa
Seyffert, N1; Pacheco, LGC1; Castro, TLP1; Dorella, FA1; Cerqueira, PG1; Pinto, AC1; Soares, SC1; Moraes, PMRO1;
D´Afonseca, V1; Carvalho, MAR; Farias, LM; Oliveira, SC2; Pimenta, AMC4; Meyer, R3; Miyoshi, A1; Azevedo V1*
Laboratório de Genética Celular e Molecular – Depto. Biologia Geral, ICB-UFMG, BH, MG
Laboratório de Imunologia de Doenças Infecciosas – Depto. Bioquímica e Imunologia, ICB-UFMG, BH, MG
3
Laboratório de Biointeração – Instituto de Ciências da Saúde, Vale do Canela, Salvador, BA
4
Núcleo de Biomoléculas e Laboratório de Venenos e Toxinas animais- Depto. Bioquímica e Imunologia ICB-UFMG, BH, MG
5
Laboratório de Microbiologia Oral e Anaeróbios – Depto. Microbiologia, ICB-UFMG, BH, MG
1
2
Palavras-chaves: Genômica, Proteômica, C. pseudotuberculosis, linfadenite caseosa, imunodiagnóstico
A linfadenite caseosa (LC) é uma doença infecciosa crônica de ampla distribuição mundial causada por bactérias da
espécie Corynebacterium pseudotuberculosis (CP). Esta enfermidade acomete principalmente pequenos ruminantes, sendo
caracterizada pela formação de abscessos em nódulos linfáticos superficiais e/ou órgãos internos, o que gera perdas
econômicas significativas relacionadas à produtividade dos animais. Vários testes diagnósticos foram desenvolvidos, porém
nenhum com suficiente sensibilidade e especificidade na fase subclínica da LC, o que é indispensável para o eficiente
controle desta patogenia. Neste contexto, estamos gerando um mapa proteômico de todas as proteínas secretadas pela
linhagem 1002 de CP a fim de identificar novos potenciais antígenos para produção de um diagnóstico subclínico
eficaz. Aliado a esta necessidade, o seqüenciamento do genoma da CP, realizado paralelamente, está fornecendo pistas
para a seleção de alvos que poderão ser utilizados no desenvolvimento deste teste diagnóstico ideal. Para atingirmos
nossos objetivos, foram realizadas extrações de proteínas secretadas em meio quimicamente definido, através da técnica
de fracionamento em três fases. Após, as proteínas obtidas foram resolvidas em géis bi-dimensionais (2D-PAGE) e
posteriormente transferidas para membranas de nitrocelulose para teste com soros de animais experimentalmente
infectados com CP, através da técnica de Western blot. Os spots imunogênicos foram excisados para identificação
através de espectrometria de massa utilizando o método MALDI-TOF MS/MS. As seqüências peptídicas estão sendo
analisadas in silico com dados do genoma de CP, como também dados provenientes de seqüências de microrganismos
similares. Os resultados são promissores na seleção de alvos para a utilização em um diagnóstico subclínico acurado, o
que contribuirá para a erradicação da LC dos rebanhos.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e Fapemig.
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Caracterização do conteúdo gênico e
organização genômica de Corynebacterium
pseudotuberculosis
D’Afonseca, V1; Moraes, P1; Dorella, FA1; Pacheco, LGC1; Almeida, S1; Pinto, AC1; Santos, AR1; Cerqueira, PG1; Seyffert,
N ; Castro, TLP1; Soares, SC1; Prosdocimi, F2; Pena, I2; Ortega, JM2; Oliveira, SC2; Oliveira, GC3; Coser, EM3; Oliveira, LM3;
Meyer, R4; Miyoshi, A1; Azevedo, V1
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Minas Gerais
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade Federal de Minas Gerais
3
Centro de Pesquisa Renée Rachou – FIOCRUZ
4
Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia
[email protected]
1
2
O gênero Corynebacterium consiste em um grande número de bactérias Gram-positivas, pleiomórficas, não esporulantes
e com alto conteúdo G+C. Um dos membros mais importantes deste grupo é a Corynebacterium pseudotuberculosis, um
patógeno intracelular facultativo que acomete principalmente pequenos ruminantes, causando a doença denominada
Linfadenite Caseosa (LC). Sua ampla ocorrência e importância econômica impulsionam estudos sobre as bases
moleculares de sua virulência, cujas informações ainda permanecem escassas. Através da construção e caracterização
de uma biblioteca genômica de C. pseudotuberculosis, linhagem T2, foi realizada uma abordagem do conteúdo gênico
deste patógeno. Cerca de 720 clones distintos resultaram em 1440 Genomic Sequence Survey (GSS). Tais seqüências
foram submetidas a análises in silico utilizando ferramentas computacionais. Banco de dados genômicos públicos
foram utilizados para análises comparativas entre genomas já seqüenciados de espécies do gênero Corynebacterium
(C. diphtheriae, C. jeikeium, C. glutamicum e C. efficiens) e C. pseudotuberculosis. Estas análises resultaram em
aproximadamente 1.000 GSS’s que apresentaram tamanhos entre 100 a 790 nucleotídeos e 346.860 pares de bases.
As seqüências genômicas não-redundantes de C. pseudotuberculosis foram utilizadas para análises de similaridades
entre as espécies do gênero já citadas. Como resultado, C. pseudotuberculosis apresentou maior similaridade em nível
de proteína do que em nível de DNA. Aproximadamente 10% do genoma da bactéria foram caracterizados, levando
em consideração o resultado parcial do genoma de C. pseudotuberculosis linhagem 1002 que está sendo realizado pela
Rede Genoma de Minas Gerais (RGMG). Através do banco de dados Cluster of Orthologous Genes (COG) as GSS’s
foram categorizadas em grupos funcionais, tais como: Armazenagem e Processamento de Informação e Metabolismo
Celular, entre outros. Nos resultados relativos à filogenia deste microrganismo, foi observado que C. pseudotuberculosis
apresenta estreita relação com o patógeno humano, C. diphtheriae. Em relação à descoberta de novos genes, foi
observada a presença de três genes de C. pseudotuberculosis presentes nesta espécie e ausente nas demais espécies citadas:
Dipeptídeo/ABC transportador (oppD), Prolina Iminopeptidase (PIP) e NADPH. A presença destes genes exclusivos
de C. pseudotuberculosis, pode auxiliar em estudos de epidemiologia molecular e diferenciação de linhagens de C.
pseudotuberculosis, que apresentam patologias distintas.
Suporte financeiro: CNPq, FAPEMIG, FINEP.
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Papel do fator sigma e de Corynebacterium
pseudotuberculosis na resistência ao
estresse e na regulação de fatores
asscociados à virulência
Pacheco, LGC1; Castro, TLP1; Seyffert, N1; Dorella, FA1; Pinto, AC1; D’Afonseca, V1; Soares, SC1; Bücker, DH1; Moraes,
PMRO1; Cerqueira, PG1; Silva, WM1; Ribeiro, D1; Santos, SG5; Farias, LM5; Carvalho, MAR5; Pimenta, AMC4; Meyer, R3;
Miyoshi, A1; Oliveira, SC2; Azevedo, V1
1
Laboratório de Genética Celular e Molecular – Depto. Biologia Geral, ICB-UFMG, BH, MG
Laboratório de Imunologia de Doenças Infecciosas – Depto. Bioquímica e Imunologia, ICB-UFMG, BH, MG
3
Laboratório de Biointeração – Instituto de Ciências da Saúde, Vale do Canela, Salvador, BA
4
Núcleo de Biomoléculas e Laboratório de Venenos e Toxinas animais- Depto. Bioquímica e Imunologia ICB-UFMG, BH, MG
5
Laboratório de Microbiologia Oral e Anaeróbios – Depto. Microbiologia, ICB-UFMG, BH, MG
[email protected]
2
Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, parasita intracelular facultativa, causadora da linfadenite
caseosa (LC) em caprinos e ovinos. A LC é mundialmente distribuída, e provoca perdas na produção de leite, carne
e lã principalmente nos países onde a ovinocaprinocultura é intensa. Apesar de o processo patogênico da doença ser
relativamente bem entendido, pouco foi estudado sobre os determinantes moleculares de virulência da C.pseudotuberculosis,
bem como sobre o controle da sua expressão gênica. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo identificar
o papel específico de um fator sigma alternativo de função extracitoplasmática de C. pseudotuberculosis na regulação
de processos de invasão do hospedeiro e de fuga do sistema imunológico. Para isto, foi gerada uma linhagem mutante
de C. pseudotuberculosis (1002 ∆sigE), deficiente para o fator sigma E, através de recombinação homóloga simples e a
resistência desta linhagem a diferentes condições de estresse ambiental foi avaliada in vitro. Dentre as condições testadas,
a adição de SDS ou de etanol no meio da fase exponencial de crescimento reduziu significativamente a viabilidade
da linhagem mutante em relação à linhagem tipo-selvagem (1002 wt). Para avaliar o efeito da mutação do gene sigE
no proteoma extracelular da C. pseudotuberculosis foi gerado um mapa completo do secretoma da linhagem 1002 wt.
A comparação de géis bi-dimensionais (2D PAGE) de secretoma das linhagens selvagem e mutante crescidas sob as
mesmas condições permitiu a observação de spots protéicos muito menos representados na linhagem mutante que na
selvagem. Experimentos de análise de virulência in vitro revelaram que a linhagem 1002 ∆sigE é capaz de se replicar
dentro de macrófagos, ativados ou não por IFN-gamma, e ainda é capaz de afetar significativamente a viabilidade
das células infectadas. A análise in vivo da virulência da linhagem 1002 ∆sigE está sendo feita por meio de infecções
experimentais em camundongos C57BL/6 e camundongos nocaute iNOS-/-, e os resultados preliminares sugerem que
o fator sigE é importante para a resistência ao estresse gerado por óxido nítrico.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CNPq.
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Analysis of the vaccine potential of
Corynebacterium pseudotuberculosis
mutants obtained through random
mutagenesis
Dorella, FA1; Cerqueira, PG1; Pacheco, LGC1; Seyffert, N1, Pinto, AC1; D´Afonseca, V1; Castro, TLP1; Soares, SC1;
Oliveira, SC2; Meyer, R3; Miyoshi, A1; Azevedo V1
1
Laboratório de Genética Celular e Molecular – Depto. Biologia Geral, ICB-UFMG, BH, MG
Laboratório de Imunologia de Doenças Infecciosas – Depto. Bioquímica e Imunologia, ICB-UFMG, BH, MG
3
Laboratório de Biointeração – Instituto de Ciências da Saúde, Vale do Canela, Salvador, BA
[email protected]
2
Keywords: Corynebacterium pseudotuberculosis, random mutagenesis, TnFuZ, mutants, vaccine
Corynebacterium pseudotuberculosis is the etiological agent of caseous lymphadenitis (CLA). CLA is a chronic infectious
disease characterized by superficial lymph nodes hypertrophy containing caseous material. This disease is worldwide
distributed, but affects regions mainly in Australia, New Zeland, South Africa, United States and Brazil. Economic losses
due to CLA are caused by reduced wool and meat production and increased culling and condemnation of carcasses and
skins in slaughterhouses. The immune prophylaxis against the infection has not enough efficacies to reduce the illness
incidence. Despite all economic losses caused by CLA, there is not much information about molecular mechanisms of
pathogenesis and virulence of this bacterium is not well defined. Recently, our research group obtained, through random
mutagenesis using TnFuZ transposition system, 34 recombinant strains of C. pseudotuberculosis. It was the first time this
technique was applied to this bacterium. After genomic DNA transposon insertion site sequencing, we identified 21
different loci coding for fimbrial and transport subunits, and also for hypothetical and unknown-function proteins, in
C. pseudotuberculosis. In the present study, we are testing these mutants in order to assess the virulence through murine
immunization assays and their capacity to protect mice against challenge with virulent wild-type strain. Furthermore,
we are correlating in vivo persistence, induction of cytokines and production of IgG with the obtained protection levels.
These results will be helpful in the development of alternative vaccination strategies against CLA.
Sponsored by: CAPES, CNPq, FAPEMIG, FINEP.
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Genes migrantes para Corynebacterium
pseudotuberculosis ausentes no clado
Corynebacterineae
Pena, IA1; Prosdocimi, F1; Azevedo, V2; Oliveira, G2; Rede Genoma, MG; Ortega, JM1
Lab. Biodados, Depto. Bioquímica e Imunologia, ICB, UFMG
2
Laboratório de Biologia Celular e Molecular, ICB, UFMG
3
Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ-MG
[email protected]
1
Palavras-chave: Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterineae, LGT, Nitric oxide reductase. EndoE
Corynebacterium pseudotuberculosis (Cps) é uma bactéria gram-positiva patogênica da classe Actinobacteria, subordem
Corynebacterineae, e causadora de linfadenite caseosa em pequenos ruminantes, o que gera perdas econômicas
significativas. Um importante fator de virulência dessa bactéria é a secreção da Esfingomielinase D, uma exotoxina
que tem sua existência em Cps atribuída à transferência lateral (LGT, Lateral Gene Transfer). Eventos de LGT são
freqüentes em bactéria e são considerados importantes fatores para a evolução e adaptação de procariotos. O recente
seqüenciamento completo do genoma da Cps pela Rede Genoma Minas Gerais permitiu a identificação de 2338
regiões codificadoras (CDS). O presente trabalho tem por objetivo a busca por genes que não ocorrem no clado
Corinebacterineae (txid85007), mas são encontrados em Cps possívelmente por conseqüência de eventos de LGT.
Vinte e seis espécies de Corynebacterineae possuem genoma completamente seqüenciado incluindo as cinco espécies
do gênero Corynebacterium: C. diphtheriae (Cdi), C. efficiens (Cef ), C.glutamicum (Cgl), C. jeikeium (Cje) e C.
urealyticum (Cur), além de bactérias do gênero Mycobacterium, Rhodococcus e Nocardia. Dentre as 2338 CDS de Cps,
310 não alinham com nenhum dos 110059 genes de Corynebacterineae. Desses, 30 são similares a proteínas de outros
organismos depositadas em bancos de dados (nr e UniprotKB), constituindo 26 genes distintos e 280 não encontram
sequer uma proteína relacionada. Dentre os 26 possíveis casos de LGT, encontram-se, dentre outros, duas subunidades
da Citocromo c552, uma nitrito redutase periplasmática encontrada em Proteobactérias, que promove resistência a
óxido nítrico em Macrófagos; uma EndoE, encontrada em Enterococcus e atua na IgG e Ribonuclease B de humanos
e outros genes como um membro do sistema PTS, proteína de associação a Fago, uma Subtilisina peptidase secretada
e uma proteína de inclusão viral encontrada em Protozoários como o Trichomonas vaginalis. Além dos 310 genes
encontrados somente em Cps, 32 genes estão presentes nas Corynebacterium patogênicas Cps, Cdi, Cje e Cur. Dentre
esses, encontram-se hidrolases, genes de resistência a antibióticos, uma cold shock protein e um virulence-associated
protein. Estes genes podem estar relacionados a patogenicidade destas bactérias. Os 310 CDS foram, ainda, analisados,
com 114320 matrizes PSSMs, geradas com agrupamentos COG. Com esse procedimento, 48 genes que não alinhavam
com nenhuma proteína depositada no nr encontraram similaridade com os agrupamentos COG. Dentre os 280 genes
que não encontram nenhuma proteína similar, foi possível encontrar relação com 4 outras proteínas de organismos
distantes como Cianobactérias e Espiroquetas. O relato completo dos possíveis eventos de LGT constará da publicação
do genoma completo de Corynebacterium pseudotuberculosis pela Rede Genoma de Minas Gerais.
Apoio financeiro: FAPEMIG.
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Análise do perfil de resistência de cepas de
Chromobacterium violaceum aos metais
ferro e cobre
Leal, AMS; Vieira, VKB; Agnez-Lima, LF
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
Palavras-chave: Chromobacterium violaceum, Metais pesados, Resistência a metais, Tolerância a metais, Biorremediação
Frente aos problemas gerados pela contaminação de diversos ambientes com metais pesados, estudos acerca das interações
entre microorganismos e metais têm se tornado cada vez mais comuns, visto que permitem a avaliação da possível
utilização dos sistemas de resistência microbianos em processos biotecnólogicos como a biorremediação de ambientes
poluídos com metais pesados. Dentre os microorganismos estudados, a Chromobacterium violaceum apresenta um
grande potencial, visto possuir resistência a vários metais, sendo inclusive também capaz de solubilizar ouro através
de processos livres de mercúrio. Frente a estas características e conseqüentes potencialidades de tal espécie, com o
objetivo de caracterizar o perfil de tolerância ou resistência aos metais Ferro (Fe) e Cobre (Cu), as cepas ATCC 12472,
CVT8 (linhagem isolada da Amazônia brasileira) e CV026 (derivada da ATCC 12472, com deficiência na síntese de
violaceína) de Chromobacterium violaceum foram cultivadas em meios LB sólido e líquido suplementados com diferentes
concentrações de soluções metálicas de FeSO4 (1-8 µM) e CuSO4 (1-6µM). A análise baseou-se no estabelecimento
das Concentrações Mínimas Inibitórias (CMI) de cada metal e na caracterização do perfil de tolerância ou resistência
aos metais. Os resultados obtidos nos cultivos com Cu, mostraram que as cepas CVT8 e ATCC12472 apresentam um
perfil de resistência às concentrações 1 e 2 mM deste metal. Já a cepa CV026 mostrou-se mais sensível ao tratamento,
crescendo apenas na concentração de 1 mM de Cu. Já nos testes com Fe, as cepas CVT8 e CV026 exibiram um perfil
de resistência nas concentrações 1 e 2 mM, enquanto que a cepa ATCC12472 demonstrou uma maior sensibilidade
ao metal, a partir da concentração 2 mM. Levando-se em consideração que a cepa CV026 é derivada da ATCC 12472
e difere da primeira quanto à produção de violaceína, é possível propor que este pigmento possa estar relacionado a
processos de resistência ou tolerância a metais.
Apoio financeiro: CNPq.
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Proteoma da Chromobacterium violaceum:
resposta ao estresse térmico
em baixas temperaturas
Cordeiro, IB1; Castro, MM1; Castro, D2; Grava, AF2; Orlandi, PP2; Lozano, JLL3; Andrade, EV1; Astolfi-Filho, S1
1
Centro de Apoio Multidisciplinar, Universidade Federal do Amazonas
Laboratório de Biodiversidade, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Centro de Pesquisa Leônidas e Maria Deane
3
Centro de Zoonoses, Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
[email protected]
2
Palavras-chave: Chromobacterium violaceum, proteoma, choque térmico, promotores termorreguláveis, expressão heteróloga
Chromobacterium violaceum (ATCC12472) é uma bactéria gram-negativa, capaz de sintetizar um pigmento de cor violeta
denominado violaceína, bem como outros componentes de potencial biotecnológico. O seu genoma foi seqüenciado,
identificando-se 4.431 ORFs (OpenReading Frames) que provavelmente expressam proteínas de interesse médico e
biotecnológico. Dentre estas, foram descritas ORFs relacionadas a proteínas de choque térmico, como as CV1645, 1643
e 1642 pertencentes ao sistema DnaJ-DnaK e GrpE. Devido à resposta de choque térmico ser uma reação conservada
em muitos organismos, a Rede Proteômica do Amazonas (PROTEAM) tem obtido mapas proteômicos da C. violaceum
em diferentes temperaturas de cultivo. As proteínas totais de C. violaceum foram extraídas e em seguida, analisadas por
eletroforese bidimensional e corados com Comassie Blue. Os resultados foram analisados pelo programa ImageMaster
Platinum 6.0 (Amershan Bioscience) para comparação das proteínas expressas em cada condição. Para cada temperatura
foram realizados três géis reprodutíveis entre si. O gel referente ao cultivo a 30°C foi comparado com o de 35°C, a
temperatura de referência para o cultivo de C. violaceum escolhida pela Rede. Dos resultados já obtidos para o fim da
fase exponencial (19h), têm-se um total de 275 pontos protéicos expressos a 35°C e 249 a 30°C. Há 40 pontos protéicos
coincidentes nestas condições, indicando uma similaridade de apenas 13%. Em ambos os géis, cerca de 70% do total
de pontos protéicos possuem pI na faixa de 3 a 7,9. Observou-se uma forte diminuição da expressão de proteínas de
massa molecular de 70 kDa para 30°C (entre pH 3 a 5) e estas podem estar relacionadas com o sistema DnaJ/DnaK
descrito no genoma de C. violaceum. Portanto, a condição de estresse térmico (cold shock) das culturas crescidas a 30°C
indicam uma diminuição na produção de proteínas e uma baixa similaridade comparada ao gel de 35°C. Essa taxa de
expressão diferenciada pode representar a resposta adaptativa da bactéria a este estresse térmico. A importância desse
estudo contribuirá com a anotação do genoma de C. violaceum e compreensão do mecanismo de adaptação desta bactéria
ao seu ambiente. As perspectivas deste trabalho serão identificar as regiões promotoras desses genes relacionados ao
choque térmico para que possam ser utilizadas na construção de vetores de expressão, possibilitando um controle da
expressão gênica de produtos heterólogos com custo baixo.
Órgãos Financiadores: CNPq, FINEP, FAPEAM.
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Atividade quitinolítica de quitinase
recombinante isolada de Chromobacterium
violaceum expressa em Escherichia coli
Andrade, EV1; Sausmikat, PH1; Neiva, M2; Astolfi-Filho, S1
Universidade Federal do Amazonas
2
Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Quitinase, Expressão Heteróloga, Chromobacterium violaceum, Quitinase Recombinante, Vetor de Expressão
Chromobacterium violaceum (ATCC12472) é um bacilo gram-negativo, saprófito, capaz de sintetizar um pigmento de
cor violeta denominado violaceína, o qual apresenta grande atividade como antibiótico. Devido ao grande potencial
de aplicação biotecnológica, a C. violaceum foi escolhida pelo Brazilian National Genome Project Consortium para ter
o seu genoma inteiramente seqüenciado. Estes estudos possibilitaram a identificação de 4.431 ORFS (Open Reading
Frames), que representam janelas abertas de leituras para síntese de prováveis proteínas, dentre as quais se destacam
quatro ORFs que codificam para a quitinase (E.C.3.2.1.14). As quitinases são responsáveis pela hidrólise da quitina,
que é o segundo biopolímero natural mais abundante na natureza, inferior apenas à celulose. A quitina é encontrada
no exoesqueleto de artrópodes e em plantas, dentre outros organismos. A sua utilização em controle biológico de
insetos e de fungos fitopatógenos destaca-se em meio às aplicações da quitinase. Adicional, oligômeros produzidos a
partir da hidrólise enzimática da quitosana e quitina têm importância econômica devido a aplicações nas áreas médica,
industrial e na agricultura. Neste trabalho são apresentados os resultados obtidos referentes à atividade enzimática de
uma quitinase recombinante (rCHIT) expressa em bactérias Escherichia coli. O isolamento do gene codificador para
quitinase a partir do genoma de C. violaceum (ATCC12472), bem como a construção do vetor de expressão em E.
coli (pCHIT) a partir do vetor pIg16 foi descrito previamente. Resumidamente, a rCHIT foi obtida fusionada ao
domínio B da proteína A de Staphylococcus aureus, utilizando células E. coli linhagem Origami (PROMEGA®). Para
a obtenção de proteína recombinante, células bacterianas foram transformadas com o vetor pCHIT, cultivadas em
meio LB na temperatura de 28 °C sob agitação até atingir Å600nm=0,6. Em seguida, foi adicionado 1mM IPTG e a
cultura mantida nas mesmas condições por duas horas para indução de síntese de rCHIT. Dois controles negativos
foram utilizados: células transformadas com o vetor pUC72 e com um vetor de expressão em E. coli (pIg16). Para se
determinar a atividade enzimática, 70 µL de extrato periplasmático foram incubados na presença do substrato sintético
4‑nitrofenil‑N‑acetil‑beta‑D‑glicosamina em tampão acetato pH 5,9. Após 30 min de incubação a 37 °C, a reação
colorimétrica foi monitorada por absorbância em comprimento de onda a 405 nm. A atividade quitinolítica observada
para rCHIT foi 2x superior ao controles negativo pUC72 e cerca de 10x superior a atividade detectada para o pIg16.
Com estes dados sugere-se que a rCHIT foi produzida em sua conformação nativa, pois foi direcionada para o extrato
periplasmático e demonstrou atividade enzimática. Para uma melhor caracterização, a quitinase recombinante deverá
ser submetida a procedimentos de purificação por cromatografia de afinidade e analisada quanto aos pH e temperatura
ótimos de atividade.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPEAM.
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Proteômica de Chromobacterium violaceum
após tratamento com peróxido de
hidrogênio: identificação de uma proteína
hipotética conservada
Lima, DC1; Duarte, FT1; Nogueira, FCS2; Agnez-Lima, LF1; Uchoa, AF1; Batistuzzo de Medeiros, SR1; Dumont, GB2
Departamento de Biologia Celular e Genética – Universidade Federal do Rio Grande do Norte
2
Instituto de Química – Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: Chromobacterium violaceum, proteômica, reparo de DNA, mutagênese, peróxido de hidrogênio
A Chromobacterium violaceum produz a violaceína, que possui atividade antimicrobiológica, antifúngica, antitumoral
e antioxidante. A análise de seu genoma mostrou que aproximadamente 40% de ORFs são hipotéticas conservadas ou
hipotéticas, indicando um patrimônio genético desconhecido. O objetivo deste trabalho é identificar novos genes de
reparo de DNA através da utilização da proteômica. Para tanto, C. violaceum foi cultivada na ausência e presença de
H2O2 e suas proteínas foram extraídas, quantificadas pelo método de Bradford e visualizadas em gel uni e bi-dimensional
a 12% SDS-PAGE. O resultado do gel 1-D mostrou que a partir da concentração de 2mM de H2O2 houve alterações
no padrão protéico. No gel 2-D, foram identificados 16 “spots” diferencialmente expressos. Estes “spots” tiveram seus
peptídeos extraídos e submetidos à espectrometria de massas em Maldi TOF-TOF, em que foi identificada uma ORF
contendo 147 aa. A análise “in sílico” através do BLASTp mostrou maior similaridade à uma proteína hipotética de
Pseudomonas entomophila com e-value de 7e-08 e score de 58,9. Quando submetida a predição de domínios funcionais
observou-se homologia ao domínio da superfamília DUF 1842, a qual foi catalogada recentemente como domínios que
se apresentam em porção N-terminal de proteínas. Sua função ainda não foi descrita sugerindo, assim, que representa
uma ORF de uma proteína hipotética conservada. Esta seqüência será clonada para a realização de ensaios visando
verificar sua função. Estes resultados sugerem que proteínas expressas em C. violaceum em condições normais estão
sendo requeridas e/ou degradadas em detrimento da síntese de novas proteínas e que uma nova condição fisiológica
emerge na presença de peróxido de hidrogênio.
Apoio financeiro - Capes.
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Clonagem e expressão do gene CV1887
de Chromobacterium violaceum em
Escherichia coli e avaliação de sua
atividade contra Callosobruchus maculatus
Lobo, MDP; Freire, EA; Bertini, CHCM; Bezerra, WM; Oliveira, ND; Grangeiro, TB
Lab. de Genética Molecular, Departamento de Biologia, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará - UFC
[email protected]
Palavras-chave: Chromobacterium violaceum; Callosobruchus maculatus
O surgimento de técnicas de biologia molecular que permitem a manipulação de genes de interesse destaca-se como
uma abordagem alternativa no controle de pragas e doenças. A identificação de ORFs de Chromobacterium violaceum
que apresentam similaridade com proteínas inseticidas de Xenorhabdus spp. e Photorhabdus luminescens pode
ser um indicativo do potencial dessa bactéria no controle de insetos. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi
avaliar a atividade inseticida de extratos de E. coli contendo a proteína recombinante CV1887 sobre o crescimento
e desenvolvimento do caruncho C. maculatus (Coleoptera: Bruchidae). O experimento foi realizado com sementes
artificiais contendo extratos totais e fracionados (extratos solúvel e insolúvel) de células de E. coli TOP10, transformadas
com um plasmídio de expressão, pBAD/Myc-His C, contendo a região codificadora da proteína CV1887. O extrato
total foi liofilizado e incorporado à farinha do feijão, nas concentrações (p/p) de 0,5%, 1,0%, 2,0% e 4,0%. Já o extrato
solúvel foi incorporado nas concentrações (p/p) de 2%, 4% e 6% e o extrato insolúvel nas concentrações (p/p) de 2%
e 4%. O controle consistiu de sementes contendo somente a farinha. O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, com 3 repetições por tratamento, e 10 sementes por repetição. Machos e fêmeas com até 24h de vida foram
colocados para ovopositar nas sementes de modo a se obter 5 a 8 ovos por cápsula. Durante o bioensaio, os seguintes
parâmetros foram analisados: percentual de emergência de adultos, tempo médio de desenvolvimento e peso médio
dos adultos. Todos os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias foram comparadas
pelo teste de Tukey. Não houve diferença significativa (P>0,01) entre o controle e os tratamentos com extrato total em
relação ao percentual de emergência. Porém, concentrações crescentes de extrato total de E. coli transformada com o
gene CV1887 retardaram significativamente (P<0,01) o tempo de desenvolvimento das larvas em adultos. Quanto à
fração insolúvel, houve diferença significativa (P<0,01) em relação ao tempo médio de desenvolvimento e percentual de
emergência. Nenhuma diferença significativa (P>0,01) em relação ao peso médio dos adultos emergidos foi observada
quando todos os tratamentos e o controle foram comparados. Dessa forma, os resultados sugerem que a proteína
codificada pelo gene CV1887 da C. violaceum é tóxica para o C. maculatus, interferindo com o seu desenvolvimento
e, ao ser produzida em E. coli, ela está localizada no extrato insolúvel após a lise das células transformadas.
Apoio: MCT/CNPq e FUNCAP.
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Construção de um vetor de expressão de
quitinase para Pichia pastoris
Castro, AV1; Cordeiro, IB1; Andrade, EV1; Astolfi-Filho, S1
Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas
[email protected]
1
Palavras-chave: Chromobacterium violaceum, quitinase, Pichia pastoris, clonagem, expressão heteróloga
Chromobacterium violaceum é definida como um bacilo gram-negativo, saprófito, anaeróbico facultativo e patógeno
oportunista. É capaz de sintetizar um pigmento violeta chamado violaceína, com grande potencial antibiótico. Esse
pigmento confere resistência aos agentes etiológicos Trypanossoma cruzi, Leishmania sp. e Mycobacterium tuberculosis e
por isso, muitos estudiosos acreditam que esta espécie tenha ampla aplicação biotecnológica. Com o seqüenciamento do
genoma da C. violaceum, muitas ORFs (Open Reading Frames) puderam ser identificadas, entre essas, a que codifica para
a enzima quitinase. As quitinases são responsáveis pela hidrólise da quitina. A quitina é encontrada principalmente no
exoesqueleto de artrópodes e alguns fungos. Seu estudo é de grande interesse por servir como um controle biológico de
pragas de insetos, nematódeos e fungos fitopatógenos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi clonar o gene codificador
para a quitinase em vetor de expressão para a levedura Pichia pastoris. A escolha desse sistema de expressão deve-se à
grande quantidade de proteína produzida pela levedura, além de sua capacidade de enovelar a proteína na conformação
esperada. Para posteriores transformações em P. pastoris, o vetor de expressão selecionado foi o pPIC9 (Invitrogen). Esse
vetor contém uma região que confere resistência à ampicilina, uma origem de replicação para bactérias Escherichia coli
(pBR322) e o promotor AOX1 que permite a transcrição dos produtos gênicos a ele fusionados sob regulação de metanol.
Em seu polylinker, há um sítio de restrição para EcoRI. O isolamento e clonagem do gene codificador para quitinase de
C. violaceum no vetor pGEMT-Easy (pGCHIT) foi descrito em trabalhos anteriores. Para a construção do vetor para
expressão em leveduras P. pastoris (pPQEG), ambos vetores (pPIC9 e pGCHIT) foram tratados com endonuclease
EcoRI, seguido de purificação do vetor pPIC9 linearizado e do inserto (gene quitinase). Com a recircularização do
vetor pPIC9 na presença do inserto liberado foi obtido o vetor pPQEG, utilizado para transformação de bactérias E.
coli, linhagem TOPO® (Invitrogen). Para a identificação dos clones recombinantes, as colônias transformantes foram
analisadas por PCR de colônias utilizando iniciadores específicos para o gene de quitinase. Para os clones recombinates
foi amplificado um fragmento de aproximadamente 1.000 pares de bases, conforme esperado. Para análise da orientação
correta do inserto no vetor pPQEG, o plasmídeo recombinante foi digerido com a enzima de restrição NcoI, adicionado
na extremidade 3’ do gene durante os procedimentos de construção do vetor pGCHIT. Adicional, o vetor pPIC9
também possui um sítio para esta enzima. De um total de 8 clones analisados, 2 liberam um inserto de aproximadamente
2.380 pb correspondem à orientação correta do gene da quitinase após o tratamento com NcoI. Como perspectivas
deste trabalho, as próximas etapas consistem na transformação da levedura Pichia pastoris por eletroporação utilizando
o plasmídeo pPQEG e análise da produção de quitinase recombinante.
Apoio Financeiro: FAPEAM.
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Perfil de resposta a diferentes estresses em
Chromobacterium violaceum deficiente na
síntese de violaceína
Vieira, VKB1,2; Marques, MV1; Menck, CFM1; Agnez-Lima, LF2
Departamento de Microbiologia, Universidade de São Paulo
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Chromobacterium violaceum, Mutante, Estresse
Chromobacterium violaceum é uma bactéria gram-negativa encontrada nas águas e margens do Rio Negro-AM, e tem
sido muito estudada a fim de explorar seu potencial biotecnológico, especialmente, o uso do pigmento violáceo como
componente terapêutico em produtos dermatológicos e sua atividade antimicrobiana e anticâncer. Apesar de importantes
atividades biológicas já terem sido descritas na literatura, pouco se sabe sobre a real função desse pigmento para a
fisiologia bacteriana. Entretanto, recente estudo, sugere que as propriedades da violaceína podem estar relacionadas a
um mecanismo de defesa utilizado pela bactéria contra o estresse oxidativo, uma vez que C. violaceum é encontrada em
ambientes que apresentam condições adversas, como por exemplo, acidez, elevada exposição às radiações ultravioletas e
aos metais pesados. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi a obtenção do mutante de um gene da via de biossíntese
da violaceína e sua posterior caracterização através de testes com agentes oxidantes, tais como o peróxido de hidrogênio
(H2O2) e os metais ferro (Fe) e cádmio (Cd). Por inserção de plasmídeo no gene vioB da C. violaceum ATCC12472,
que codifica uma enzima da via de síntese de violaceína, foi construído o mutante vioB. Para isso a região central do
gene foi amplificada por PCR e clonada num plasmídeo suicida que foi inserido em C. violaceum por conjugação com
E. coli S17-1. Através de Southern Blot, a interrupção do gene foi confirmada e o primeiro fenótipo observado foi
a mudança de coloração da linhagem mutada. A sensibilidade a H2O2 foi testada por ensaios de halo de inibição de
crescimento com culturas em fase estacionária. Discos de papel contendo H2O2 em concentrações crescentes foram
adicionados sobre as culturas. As placas foram incubadas por 16-24 horas a 30o C e foram feitas as medições do diâmetro
do halo, não sendo observada mudança significativa entre as linhagens. O mutante também foi submetido a ensaios
de sensibilidade/resistência a metais em diferentes concentrações de FeSO4 e CdCl2. A linhagem mutante demonstrou
ser mais resistente a esses metais quando comparada à selvagem. Curiosamente, estes dados não indicam uma função
da violaceína relacionada a atividade antioxidante, mas revelam um possível papel relacionado a sensibilidade a metais
no meio ambiente.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP.
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Plasticidade genômica de Corynebacterium
diphtheriae: implicações na virulência
Soares, SC1; Pinto, AC1; Dorella, FA1; Cerqueira, PG1; Pacheco, LGC1; Seyffert, N1; D´Afonseca, V1; Castro, TLP1; Hirata,
RJr²; Azevedo V1; Miyoshi, A1
Laboratório de Genética Celular e Molecular – Depto. Biologia Geral, ICB-UFMG, BH, MG
²Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Vila Isabel, RJ
1
Plasticidade genômica é a propriedade dinâmica do genoma que pode envolver ganho, perda ou rearranjo do DNA. A
compreensão da heterogeneidade bacteriana e dos métodos que levam a bactéria a essa plasticidade é de grande interesse
para estudos evolutivos, epidemiológicos e filogenéticos. Há relatos de reaparecimento ou aumento de casos de doenças
após um período de declínio significativo devido a essa heterogeneidade. Corynebacterium diphtheriae é um exemplo
de patógeno reemergente com mais de 150.000 casos relatados em todos os 15 países da antiga União Soviética, na
década de 90, e aproximadamente 10.000 casos provenientes da Índia em 2005. C. diphtheriae caracteriza-se por ser
um patógeno Gram-positivo, não-esporulante e pleomórfico, pertencente ao grupo das actinobactérias. Produz uma
potente exotoxina protéica, toxina diftérica (DT), responsável pelos efeitos causados pela bactéria e encontrada em
corynefagos lisogênicos. O gene da toxina diftérica (gene tox) apresenta grande heterogeneidade e está ausente em várias
linhagens desta espécie. Devido a essa heterogeneidade, a resposta imune obtida pela vacinação com o toxóide originado
da DT pode não oferecer proteção adequada às pessoas que tiveram contato com essas linhagens. O gene tox, assim
como vários genes de virulência e outras regiões provenientes de corynefagos, está localizado em uma das 13 ilhas de
patogenicidade (PAIs) que se encontram no cromossomo desta bactéria. Visando analisar a plasticidade destas PAIs, o
método PCR² (Plasticity of Chromosome Revealed by Long Range – Polymerase Chain Reaction) foi escolhido entre os
vários disponíveis por permitir análises in silico (desenho dos iniciadores) e in vitro (amplificação de regiões específicas
do genoma) de genomas bacterianos totalmente seqüenciados. Foram confeccionados iniciadores através dos programas
Ithos e GenoFrag que amplificam as ilhas de patogenicidade da C. diphtheriae NCTC13129. Até o momento, foram
gerados iniciadores para todas as ilhas de patogenicidade com amplicons de aproximadamente 5,7 kb, tamanho este que
cobre de forma satisfatória a menor ilha deste organismo. Estes serão utilizados em outras linhagens de C. diphtheriae
toxigênicas e atoxigênicas e permitirão descobrir alterações dentro do genoma através da comparação do tamanho dos
amplicons. Uma das PAIs já foi amplificada em 11 diferentes linhagens que mostraram diferença na presença/ausência
da mesma. A partir dessas análises poderão ser inferidas possíveis correlações entre a presença ou ausência de genes nas
ilhas e a patogenicidade destas linhagens. Essas inferências poderão auxiliar em estratégias direcionadas para a produção
de novas vacinas para difteria que sejam eficientes na imunização contra linhagens atoxigênicas, visto que elas também
têm aparecido como causa freqüente de processos infecciosos. A análise também poderá ajudar no desenvolvimento
de novos métodos de identificação das linhagens por centros de controle de epidemias.
Agências financiadoras: CNPQ, CAPES, FAPEMIG-RGMG.
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Resposta celular à irradiação com UV –
256mm: os mecanismos de reparo
do DNA em Escherichia coli
Mello, DK; Mangueira, LD; Barbosa, I
Departamento de Biologia Molecular, Universidade Federal da Paraíba
[email protected]
Palavras-chave: Radiação ultravioleta, DNA, Escherichia coli
A ultravioleta é uma radiação excitante capaz de agir sobre a estrutura das biomoléculas. A radiação ultravioleta (UV)
germicida (256 mm) possui a capacidade de interferência no DNA das bactérias (Oliveira, 2007). Nosso trabalho
procurou demonstrar a ação da UV-256mm em linhagens de Escherichia coli como também analisar a resposta celular
aos danos provocados por esta radiação ao DNA. Este trabalho optou pela utilização de células selvagens e modificadas
de Escherichia coli em diferentes mecanismos de reparação do DNA como modelo no estudo. A cepa mutante Uvr- é
deficiente no reparo por excisão, enquanto que a RecA não apresenta o sistema SOS. As células selvagens (E. coli AB
1156) e modificadas (E.coli AB1886 ou Uvr- e E. coli AB2463 ou RecA) foram irradiadas com diferentes doses de UV256mm. Utilizou-se a cultura de E. coli cujas células foram crescidas até a fase exponencial (108 células por ml). Desta
cultura, 8 ml foram filtrados em membrana de nitrocelulose (0,45mm) para a obtenção das bactérias. A membrana
foi colocada em eppendof com tampão fosfato (TP) e, posteriormente, passada para a placa de petri. Irradiou a placa
com UV-256 mm com as doses crescentes e assim por diante. Para cada dose obtivemos as frações de sobrevivência,
descrevendo, assim, as curvas de sobrevivência para cada linhagem bacteriana. Nossos experimentos indicaram que
a linhagem selvagem reficiente em reparo de DNA é mais resistente à UV – 256 mm, enquanto que as mutantes
Uvr- e RecA apresentaram maior sensibilidade. Podemos concluir que a resposta à irradiação celular é determinada,
principalmente, pela ação dos mecanismos de reparo do DNA.
Apoio financeiro: CNPq.
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Análise de respostas celulares de cepas
de Escherichia coli expostas à Riboflavina
fotossensibilizada
Timoteo, ARS1; Oliveira, AHS1; Silva, AE1; Melo, JTA1; Agnez-Lima, LF1
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
1
Palavras-chave: Riboflavina, EROs, citotoxicidade, mutagenicidade
O oxigênio é essencial para a maioria dos organismos, sendo metabolizado para a geração de energia. Entretanto,
durante este processo, espécie reativas de oxigênio (EROs), como o superóxido e o radical hidroxila, são gerados como
subprodutos. Estes radicais, provenientes do metabolismo celular são produzidos continuamente e apresentam a capacidade
de danificar algumas macromoléculas, como DNA e proteínas, desta forma, o desbalanço entre a produção de EROs e
substâncias antioxidantes, denominado de estresse oxidativo, ocasiona, normalmente, modificações deletérias a célula.
Além disso, tanto fatores internos, quanto externos, como radiações e substâncias químicas podem promover danos
à célula e a seus constituintes. Muitas substâncias têm sido utilizadas em pesquisas com EROs e na caracterização das
enzimas envolvidas no reparo de danos oxidativos, como por exemplo, a Riboflavina (7,8-dimetil-10-ribitil-isoaloxazina),
que é comumente denominada vitamina B2 e, ao ser fotossensibilizada, produz oxigênio singlete e radicais superóxido.
Com o objetivo de analisar a citotoxicidade e mutagenicidade, relacionadas com a produção de EROs, da Riboflavina
em cepas de Escherichia coli proficiente (CC104) e deficiente em reparo de danos oxidativos ao DNA (BH980, muty-)
e avaliar a resposta celular, através de perfil protéico destas, foram feitos tratamentos nos quais as cepas foram expostas
à Riboflavina fotossensibilizada. A concentração de Riboflavina utilizada foi de 50µM em diferentes tempos (0, 15, 30
e 60 minutos) de exposição à fonte luminosa (lâmpada incandescente de 60W), além do controle não tratado. A seguir,
foram obtidas curvas de sobrevivência e freqüência de mutação, por meio de contagem de colônias, além da extração de
proteínas. A partir dos resultados, observou-se atividade citotóxica em ambas as cepas, sendo a cepa MutY mais sensível
ao tratamento, assim como, ocorreu um aumento na freqüência de mutação nesta cepa, não sendo constatada atividade
mutagênica na cepa selvagem. Em relação aos perfis protéicos, foi possível visualizar uma mudança de expressão de
proteínas, em relação aos controles, e também diferentes respostas entre as cepas. Os resultados demonstraram atividades
citotóxica e mutagênica da Riboflavina fotossensibilizada, provavelmente ocasionadas pela produção de EROs, assim
como, a maior sensibilidade da cepa mutante, devido a ausência de uma das enzimas envolvidas no reparo de DNA.
Quanto à expressão protéica, as mudanças observadas em ambas as cepas, relaciona-se com a resposta ao estresse, ao
qual as bactérias foram submetidas.
Apoio financeiro: CNPq.
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Reparo das lesões induzidas pela
associação da radiação ultravioleta A com
cloreto estanoso em células de Escherichia
coli: participação das enzimas Nfo e Fpg
Motta, ES1; Rodrigues, MP1; Claudio, ILP1; Santos, PTS1; Vairo, EC1; Sinhorinho, SM1; Cassiano, TR1; Silva, CR1; Oliveira,
MBN1; Dantas, FJS1; Caldeira-de-Araujo, A1; De Mattos, JCP1
Departamento de Biofísica e Biometria, Universidade do Estado do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: Escherichia coli, radiação ultravioleta A, cloreto estanoso, espécies reativas de oxigênio, reparo por excisão de bases
As espécies reativas de oxigênio (ERO) podem ser produzidas em diversos processos químicos, sendo capazes de induzir
lesões em diferentes estruturas celulares, incluindo o DNA. Por seus efeitos, as ERO estão envolvidas em processos
como o envelhecimento, a mutagênese e a cancerização. O cloreto estanoso (SnCl2), utilizado pelo homem em diversos
setores industriais, e a radiação ultravioleta A (UVA) são agentes capazes de induzir lesões no DNA, mediadas pela
geração de ERO. Sabendo que os seres vivos estão em contato direto com o SnCl2 e a radiação UVA, o objetivo deste
trabalho foi avaliar os efeitos citotóxicos e genotóxicos da associação do UVA com o SnCl2 e identificar as enzimas do
reparo por excisão de bases (BER) que participam da restauração das lesões induzidas por estes agentes. Assim, células
de Escherichia coli (E. coli) deficientes em diferentes enzimas do BER foram pré-iluminadas com UVA (90kJ/m2),
seguidas da incubação com SnCl2 (25µg/mL) e submetidas a experimentos de inativação bacteriana e de eletroforese
em gel alcalino de agarose. Os resultados obtidos com os experimentos de sobrevivência mostraram que: i) o UVA não
foi capaz de causar inativação celular em nenhuma das cepas de E. coli testadas; ii) o SnCl2 diminuiu a sobrevivência de
todas as cepas de E. coli, sendo a mutante em nfo a mais sensível, seguida pela mutante em fpg; iii) a pré-iluminação com
UVA, seguida da incubação com SnCl2, causou um efeito sinergístico letal em todas as cepas estudadas e, novamente,
a deficiente em nfo foi mais sensível, sendo seguida pela mutante em fpg. As análises densitométricas dos géis obtidos
nos experimentos de eletroforese em gel alcalino de agarose mostraram que: i) o UVA induziu quebras no DNA de
todas as cepas testadas e a mutante em fpg foi a menos eficiente na restauração das lesões induzidas pelo UVA; ii) o
SnCl2 produziu um número maior de quebras no DNA das cepas, quando comparado com o UVA, e a deficiente em
nfo apresentou menor eficiência de reparação das lesões induzidas por este sal; iii) a associação do UVA com SnCl2
induziu um número maior de quebras no DNA de todas as cepas testadas, e a mutante em nfo também foi menos
eficiente na restauração das lesões produzidas pela associação destes agentes. Os resultados obtidos permitem concluir
que o reparo das lesões geradas pelos agentes estudados, de forma isolada ou associada, é preferencialmente realizado
pelas enzimas Nfo e Fpg.
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O efeito de guanosina tetrafosfato (ppGpp)
sobre a adesão de Escherichia coli
enteropatogênica
Ferreira, GM; Spira, B
Instituto de Ciências Biomédicas, Departamento de Microbiologia, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: adesão, Escherichia coli, ppGpp
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é a principal causadora de diarréia em crianças de até um ano de idade
em países em desenvolvimento. In vitro, EPEC adere de maneira localizada sobre a superfície das células epiteliais,
formando microcolônias. Este fenótipo depende da fimbria BFP codificada pelo plasmídio EAF. Além disso, EPEC
adere intimamente à célula hospedeira por meio da proteína intimina, codificada por eae, localizado em uma ilha de
patogenicidade conhecida como LEE (locus of enterocyte effacement). O nucleotídeo guanosina tetrafosfato (ppGpp) é
um regulador global em bactérias. Existem duas vias para a síntese de ppGpp. Uma delas é via RelA. A outra é via SpoT,
que além da função de síntese, também é responsável degradação da molécula, evitando o seu acúmulo na célula. A
carência de aminoácidos, bem como outros nutrientes induzem a síntese de ppGpp, que por sua vez causa a diminuição
do crescimento bacteriano. ppGpp também está relacionado à regulação de virulência em varias bactérias. O objetivo
deste trabalho foi estudar a relação entre ppGpp e a adesão e expressão das duas principais adesinas de EPEC. Mutações
nos genes relA e spoT foram transferidas para EPEC por transdução por fago P1. O nível de ppGpp das bactérias foi
medido pela incorporação de 32P em bactérias crescidas sob carência de aminoácidos em meio mínimo. Utilizando
cromatografia em placa delgada foi possível isolar e medir as moléculas de ppGpp cujo 32P foi incorporado. O duplo
mutante relA/spoT foi incapaz de sintetizar ppGpp. Sob carência de aminoácidos, a linhagem selvagem de EPEC
produziu altos níveis de ppGpp, ao contrário do mutante relA, cujo nível de ppGpp foi menor em relação ao nível
basal, confirmando o fenótipo esperado para os mutantes. A presença de ppGpp é essencial para a adesão e expressão
de adesinas em EPEC. Ensaios de adesão in vitro com células epiteliais humanas da linhagem Hep-2 mostraram que a
ausência de produção de ppGpp no duplo mutante relA/spoT praticamente aboliu a adesão de EPEC. Análises dos níveis
de RNAm por northern-blot e de proteínas por western-blot revelaram que na ausência de ppGpp não foi detectada
a expressão de bfpA (gene que codifica a pilina de BFP) e BFP, respectivamente. De maneira semelhante esse duplo
mutante mostrou menos expressão de eae e intimina. Quando os mesmos testes foram realizados com o mutante relA,
o nível de adesão foi reduzido à metade e o efeito não foi tão significativo em relação a expressão das adesinas BFP e
intimina, como no mutante relA/spoT. Resultados preliminares com a inserção in cis dos genes selvagens relA e spoT
mostraram que houve a complementação das mutações com relação aos fenótipos analisados. Esses resultados mostram
que ppGpp tem um papel fundamental sobre a adesão de EPEC.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Structural Studies of the Enterococcus faecalis
V583 SufU [Fe-S] Cluster Scaffold Protein
Riboldi, GP1; Frazzon, APG2; Verli, H1; Frazzon, J1
Centro de Biotecnologia; Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS
2
Departamento de Microbiologia; UFRGS
[email protected]
1
Palavras-chave: [Fe-S] cluster, Enterococcus faecalis, SUF, NIF, ISC
Iron-sulfur clusters are ubiquitous and evolutionary ancient inorganic prosthetic groups and its biosynthesis depends
on complex protein machineries. Three distinct assembly systems involved in the maturation of cellular [Fe-S] proteins
have been determined, designated NIF, ISC and SUF systems. Although well described in several organisms, these
machineries are poorly determinated in Gram-positive bacteria. This study is aimed on the phylogenetic analysis and
structural characterization of Enterococcus faecalis V583 SufU protein. BLAST searches of the Enterococcus genome
revealed series with sequence similarity to the E.coli IscU. SufU was found to contain all features considered essential
for their biological activity, including amino acid residues involved in substrate and/or co-factor binding, and
phylogenetic analyses showed a close relationship with orthologs from other Gram-positive bacteria. The presence of
essential residues suggests its involvement in cluster assembly. Molecular dynamics for structural determinations were
preformed. First of all, molecular modeling using E. faecalis V583 SufU primary sequence protein over PDB:1su0
(Streptococcus pyogenes) crystallographic model was realized, with a subsequent fifty nanoseconds molecular dynamic
trajectory, which presented a stable model, containing interesting secondary structure modifications near the active
site and conserved cysteine residues. A fifty nanoseconds trajectory of S.pyogenes crystal data was performed for model
validation. Molecular modeling using H. influenzae IscU primary sequence over PDB:1su0 crystal followed by 50
ns trajectory was performed to analyze differences in C-terminus region of Gram-positive SufU and Gram-negative
orthologous proteins, where several modifications in secondary structure could be identified.
Financial Support:: CAPES, CNPq.
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Análise do operon SUF de
Enterococcus faecalis
Mattos, EP1; Riboldi, GP1; Frazzon, APG2; Frazzon, J1; Basso, LA3
1
Centro de Biotecnologia – Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
Departamento de Microbiologia – Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
3
Centro de Pesquisa em Biologia Molecular e Funcional – Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS)
[email protected]
2
Palavras-chave: Cofatores [Fe-S], Enterococcus faecalis, SUF, NIF, ISC
Cofatores ferro-enxofre (Fe-S) correspondem a grupamentos prostéticos inorgânicos associados a proteínas de todos os
organismos e participantes dos mecanismos básicos de sustentação da vida na Terra, como os processos de fotossíntese,
respiração celular e fixação de nitrogênio. Tais estruturas formam-se espontaneamente in vitro, no entanto, tal associação
in vivo é realizada por diferentes maquinarias celulares devido à toxicidade desses elementos químicos em suas formas
livres. Três maquinarias distintas de formação de cofatores [Fe-S] foram determinadas. O sistema NIF (nitrogen fixation)
foi o primeiro a ser descrito (em Azotobacter vinelandii) e está relacionado à maturação da proteína nitrogenase e a
mecanismos de fixação de nitrogênio; o sistema ISC (iron-sulfur cluster assembly) participa no metabolismo basal
de formação de cofatores [Fe-S] e na renovação constante desses grupamentos; o sistema SUF (sulfur mobilization
system), primeiramente observado em Escherichia coli, está envolvido na produção de cofatores em condições de
estresse oxidativo e de supressão celular de ferro. Apesar de amplamente descritos em Proteobacteria, tais sistemas não
estão bem identificados em microrganismos Gram-positivos. O presente trabalho visa à caracterização da maquinaria
de formação de cofatores [Fe-S] em Enterococcus faecalis através da análise de genes cognatos e da clonagem dos
fragmentos de interesse. Para tanto, foram realizadas buscas de seqüências homólogas das maquinarias NIF, ISC e
SUF de formação de cofatores [Fe-S]. Quatro genes característicos do sistema SUF (sufB, sufC, sufD, sufS) e um
quinto gene correspondente à proteína arcabouço SufU foram identificados no genoma de E. faecalis. Os genes foram
clonados em vetor de clonagem pCR-Blunt e transformados em E. coli linhagem DH10B. Experimentos de clivagem
com a enzima EcoRI e de seqüenciamento de DNA permitiram a confirmação da inserção dos fragmentos desejados.
Clivagens nos sítios de restrição NdeI e BamHI possibilitaram a excisão dos fragmentos para posterior clonagem em
vetor de expressão pET23a(+). Trabalhos posteriores permitirão a superexpressão das proteínas codificadas pelos genes
em estudo, a fim de purificá-las e de submetê-las a ensaios enzimáticos para caracterização bioquímica.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Análise da expressão dos genes Clp em
Enterococcus faecalis
Oliveira, NEM1; Laport, MS1; Bastos, MCF2; Giambiagi-deMarval, M1
Laboratório de Microbiologia Molecular-Departamento de Microbiologia Médica
2
Laboratório de Genética Molecular-Departamento de Microbiologia Geral
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes – UFRJ
[email protected]
1
Palavras-chave: Enterococcus, Enterococcus faecalis, Clp/ATPase, HSP100, Choque térmico
O Enterococus faecalis, um importante patógeno em infecções nosocomiais, é uma bactéria residente do trato gastrointestinal
que se apresenta na forma de coco Gram-positivo, com resistência a múltiplos antimicrobianos, crescendo sob condições
de estresse térmico, sendo capaz de sobreviver por 30 minutos a 60ºC. Em resposta ao choque térmico, as células
sintetizam, entre outras, proteínas pertencentes à família das Clp/ATPases ou HSP100. Essas proteínas induzidas por
estresse são principalmente chaperonas moleculares ou proteases, que atuam enovelando ou degradando proteínas
desenoveladas ou desnaturadas. Membros da família Clp/ATPase são classificados baseando-se na presença de um ou
dois domínios de ligação de ATP. A proteína ClpP não está relacionada com a família das Clp/ATPases e tem somente
atividade de peptidase. Contudo, a ClpP pode associar-se com membros da família das Clp/ATPases, atuando como
uma serina-protease. O objetivo deste trabalho é estudar a organização e a expressão dos genes clp de E. faecalis. Análises
computacionais “in silico” mostraram que os genes clpB, clpC, clpE, clpP e clpX, anotados no genoma de E. faecalis
V583 (www.tigr.org), codificam, respectivamente, polipeptídios com 868, 831, 750, 197 e 417 aminoácidos e com
massas moleculares de 98,07 kDa, 92,68 kDa, 82,98 kDa, 21,6 kDa e 46,11 kDa. Anticorpo policlonal anti-ClpB
de Synechococcus sp., direcionado para o domínio carboxi-terminal, detectou duas formas da proteína ClpB. Proteínas
marcadas com 35S-Met, analisadas em SDS-PAGE e autorradiografia, mostraram a indução desta proteína já a 42°C,
atingindo o ponto ótimo a 50ºC. Anticorpos policlonais anti-ClpX e anti-ClpE detectaram, respectivamente, duas
proteínas (48 kDa e 82 kDa). Análise da expressão do gene clpB por “Northern blot” mostrou um único mRNA de
aproximadamente 2,6 kb de tamanho, indicando se tratar de um mRNA monocistrônico. Não houve um aumento
significativo do mRNA clpB quando as células foram submetidas às temperaturas de 42º e 45ºC, porém, sob temperaturas
elevadas de 48° e 50ºC, aumentos de 10 e 35 vezes da quantidade do transcrito foram respectivamente observados.
O transcrito do gene clpP apresentou 0,6 kb e teve a sua expressão aumentada em aproximadamente 10 vezes apenas
na temperatura de 50°C. Os transcritos do mRNA clpX e do clpE apresentaram tamanho maior do que o esperado. A
análise da região gênica e o tamanho dos transcritos sugerem a organização em operon para estes genes. A presença da
seqüência CtsR/Box na região promotora de clpB sugere que este gene seja regulado pelo repressor CtsR.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPERJ.
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Caracterização de promotores de transcrição
de Gluconacetobacter diazotrophicus
regulados em resposta a caldo de variedades
comercial e selvagem de cana-de-açúcar
Figueiredo, NLA; Batista, SCO; Baldani, JI; Schwab, S
Laboratório de Genética e Bioquímica, EMBRAPA Agrobiologia
[email protected]
Palavras-chave: Promotores de transcrição, expressão gênica, gene repórter lacZ
A bactéria endofítica Gluconacetobacter diazotrophicus tem grande potencial para ser utilizada como biofertilizante em
associação com cana-de-açúcar, pois fixa nitrogênio e estimula o crescimento da planta principalmente em resposta a
baixos níveis de N no solo. Recentemente sua seqüência genômica foi publicada, abrindo perspectivas para estudos de
regulação da expressão gênica a nível genômico. Trabalhos recentes têm demonstrado a modulação de genes da cana-deaçúcar conforme a presença de bactérias endofíticas inoculadas (inclusive G. diazotrophicus), e diferenças de expressão
em vias de transdução de sinais por variedades comercial e selvagem de cana. Estes dados mostram diferentes respostas
metabólicas conforme a variedade, sugerindo que os programas de melhoramento da cana têm afetado as interações
planta-bactéria. Por outro lado, não existem trabalhos com o intuito de investigar quais os efeitos do melhoramento
da cana-de-açúcar sobre o metabolismo/regulação gênica das bactérias associadas à planta (especialmente do modelo
G. diazotrophicus). Promotores e fatores de transcrição desempenham um papel central na regulação gênica, e a sua
identificação e caracterização são fundamentais para a compreensão dessa regulação. Com o objetivo de identificar e
caracterizar promotores e fatores de transcrição envolvidos na interação com diferentes variedades de cana, clones de
G. diazotrophicus de uma biblioteca de promotores foram submetidos a uma triagem para avaliar a expressão diferencial
do gene repórter lacZ na presença de caldo de variedades comercial e selvagem de cana-de-açúcar. Dezessete clones
foram identificados apresentando superexpressão na presença de caldo de cana da variedade selvagem (Chunee) e nove
clones foram identificados apresentando inibição da expressão gênica na presença de caldo de ambas as variedades de
cana. Treze clones apresentaram inibição da expressão gênica na presença do caldo da variedade comercial (SP701143) de cana. Os resultados preliminares mostraram diferenças na expressão dos clones os quais encontram-se em
análise para caracterização da região promotora e dos reguladores da transcrição por análises de seqüência de DNA e
de proteômica”.
Agradecimentos: Projeto Pronex/Faperj, CNPq, Embrapa.
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Efeito do extrato cana-de-açúcar e
diferentes fontes de carbono no perfil de
expressão gênica de Gluconacetobacter
diazotrophicus
Galisa, PS1,3; Alves, GC2,3; Macedo, AVM3; Vidal, MS3; Baldani, JI3; Simões-Araújo, JL3
Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal - Universidade Federal do Rio de Janeiro
Pós-Graduação em Ciência do Solo - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
3
Embrapa Agrobiologia – BR 465 Km 07, Seropédica – RJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, Expressão gênica, cDNA-AFLP, FBN, Endofíticos
Parte do nitrogênio necessário para a cultura da cana-de-açúcar pode ser obtido por meio da associação entre cana-deaçúcar e a bactéria diazotrófica endofítica Gluconacetobacter diazotrophicus. Nos últimos anos, um grande esforço tem
sido feito para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos nesta interação. Neste trabalho foi investigado o perfil
de expressão gênica de G. diazotrophicus (estirpe PAL5) em resposta a diferentes fontes de carbono com o objetivo de
identificar genes ou grupos de genes da bactéria cuja expressão está relacionada com a utilização de diferentes fontes
de carbono e sinais da planta, empregando a metodologia de cDNA-AFLP. As bactérias foram cultivadas em meio
LGI com diferentes fontes de carbono (glicose, glicerol e manitol) e com LGI suplementado com diferentes volumes
de extrato de cana, para posterior extração do RNA total. A síntese do cDNA foi realizada após enriquecimento do
mRNA por meio da remoção dos rRNAs. O cDNA foi digerido com diferentes combinações de enzimas de restrições:
HindIII/TaqI ou PstI/TaqI ou EcoRI/MseI. Após as digestões, os fragmentos foram ligados a adaptadores e submetidos
a uma reação de PCR (pré-amplificação) utilizando iniciadores complementares aos adaptadores. A PCR seletiva foi
realizada empregando 4 combinações de iniciadores (HindA/TaqC, HindA/TaqG, PstAG/TaqG e PstAG/TaqC), sendo
os iniciadores HindA e PstAG marcados com [γ-32P] ATP. O produto da amplificação radioativa foi separado em gel
de poliacrilamida, que foi posteriormente seco, e exposto junto a um filme de raio-X durante pelo menos 24 horas, de
acordo com a intensidade de marcação. A região do gel contendo as bandas correspondentes aos genes diferencialmente
expressos, em função da fonte de carbono e extrato de cana-de-açúcar utilizados, foi removida do gel e empregada na
reamplificação do fragmento e reação de seqüenciamento. Foram obtidos 88 fragmentos, sendo 43 seqüenciados até
o momento. As seqüências obtidas foram submetidas a uma análise de similaridade utilizando o programa BlastX. A
análise de Blast mostrou similaridade significativa com diversas seqüências já depositadas no banco de dados, como
por exemplo: hidrolase beta-fosfoglucomutase, succinato dehidrogenase, ferro-sulfo fumarato redutase, serine/treonina
proteína quinase, fosfoadenilsulfato redutase (tioredoxina), dentre outros. Estes resultados mostram a identificação de
vários genes relacionados com o metabolismo de carboidratos e transdução de sinal. Uma análise mais detalhada do
padrão de expressão será realizada para os fragmentos já caracterizados.
Apoio financeiro: Projeto Pronex/FAPERJ, Instituto Milênio, CNPq, CAPES e EMBRAPA.
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Identificação e caracterização de mutantes de
Gluconacetobacter diazotrophicus defectivos
para solubilização de fósforo e zinco
Intorne, AC1; de Oliveira, MVV1; Lima, ML1; Silva, JF1; Olivares, FL2; de Souza Filho, GA1
Laboratório de Biotecnologia
Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Gluconacetobacter diazotrophicus, genômica funcional, solubilização de nutrientes, fixação biológica de nitrogênio
Recentemente, seqüenciou-se o genoma da bactéria aeróbica Gluconacetobacter diazotrophicus e iniciaram-se seus
estudos de genômica funcional. Este microrganismo promove o crescimento de cana-de-açúcar e outras espécies vegetais
economicamente relevantes. Entre os efeitos benéficos promovidos, destaca-se: fixação biológica de nitrogênio (FBN),
produção de fitormônios, ação contra fitopatógenos e solubilização de nutrientes. A habilidade de mobilizar P e Zn,
nutrientes freqüentemente indisponíveis para as plantas, pode representar um componente importante da promoção
do crescimento demonstrada por G. diazotrophicus. Entretanto, as bases genéticas responsáveis por esta característica
permanecem desconhecidas nesta bactéria. Assim, este estudo analisou genes de G. diazotrophicus envolvidos na sua
capacidade de solubilizar P e Zn. Tais genes foram identificados a partir de uma biblioteca de mutantes de transposição
(2554 clones), selecionando-se 5 transformantes defectivos. A seleção baseou-se na formação do halo de solubilização,
utilizando meio DYGS com ZnO (0,12%) ou Ca5(PO4)3OH (0,54%). O gene interrompido nestes mutantes foi
identificado pelo seqüenciamento das bordas do transposon. Estes genes são: pqqB, pqqC, pqqE e gdhA. Os genes pqqs
participam da síntese de pirroloquinolina quinona (PQQ), que é cofator da enzima glicose desidrogenase codificada
por gdh. Esta proteína, localizada no periplasma, converte glicose a ácido glucônico. Logo, verificou-se que todos
os genes mutados participam da produção de ácido glucônico, tornando sua síntese a principal via metabólica, que
participa da solubilização de nutrientes em G. diazotrophicus. Possivelmente, este ácido secretado pela bactéria reduz
o pH da rizosfera, solubilizando nutrientes presentes no solo. Dados da literatura mostram que este composto está
envolvido com outros aspectos na bactéria: metabolismo energético e FBN. A FBN requer alto consumo de energia,
todavia, a nitrogenase – enzima responsável pelo processo – é sensível a altas concentrações de O2. Assim, é discutido
que a respiração periplasmática realizada por G. diazotrophicus, convertendo glicose a ácido glucônico, é importante
para manter a atividade da nitrogenase no citoplasma sem danos causados pelas altas tensões de O2 no periplasma, o
que caracteriza um mecanismo de proteção da nitrogenase. Após análise destes mutantes em meio LGI semi-sólido
sem nitrogênio, observou-se que eles também são fortemente depreciados na FBN. Então, com os resultados obtidos
elucidou-se o principal mecanismo genético envolvido na solubilização de nutrientes nesta bactéria, que é decorrente
do metabolismo de açúcar e relacionado à FBN.
Apoio Financeiro: UENF, FAPERJ, CAPES e FINEP.
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Mutação na região regulatória do grupo
gênico tonB-exBD1D2 sugere o seu
envolvimento no transporte de auxinas em
Gluconacetobacter diazotrophicus
Rodrigues, EP1; Soares, CP2; Silva, JR3; Oliveira, ALM4; Simões-Araújo, JL5; Vidal, MS5; Baldani, JI5
Doutora em Biotecnologia Vegetal – Universidade Federal do Rio de Janeiro
Mestrando em Biotecnologia Vegetal – Universidade Federal do Rio de Janeiro
3
Graduando em Agronomia – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
4
Depto. de Bioquímica – Universidade Estadual de Londrina
5
Laboratório de Genética e Bioquímica – Embrapa Agrobiologia
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Endofítico, Diazotrófico, Auxina, Tn5, Fitohormônio
Gluconacetobacter diazotrophicus é uma bactéria diazotrófica endofítica encontrada em associação com plantas de canade-açúcar e conhecida por beneficiar o crescimento desta planta através do processo de fixação biológica de nitrogênio
(FBN) e produção de ácido indol acético (AIA). O presente trabalho buscou estudar a(s) via(s) de biossíntese e os
genes envolvidos na produção de auxinas em G. diazotrophicus. Mutantes aleatórios deficientes na produção de auxina
foram gerados pela inserção do Tn5 no DNA da estirpe selvagem PAL5 e avaliados quanto à produção de auxinas
pelo método colorimétrico de Salkowski. Foram selecionados alguns mutantes negativos para a produção de AIA; no
entanto, este trabalho será focado no mutante Gdiaa31. A identificação do sítio de inserção do elemento de transposição
foi realizada pela metodologia de PCR invertido (PCRi) seguida de reação de sequenciamento e, a caracterização dos
intermediários da(s) via(s) de biossíntese de AIA foram avaliados por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).
As análises por HPLC permitiram identificar e quantificar os compostos ácido-3-indol pirúvico (IPyA), indol-3-ácido
lático (ILA) e indol-3- ácido acético (AIA) no sobrenadante da estirpe selvagem. O mutante Gdiaa31 apresentou os
compostos indólicos IPyA e ILA; entretanto, a quantidade observada foi apenas 5% da quantidade produzida pela
estirpe selvagem. Com a caracterização deste mutante foi possível observar que a produção de auxinas foi afetada pela
inserção do Tn5 na região regulatória do grupo gênico tonB-exBD1D2, os quais codificam proteínas de membrana
(TonB-ExbBD) envolvidas no transporte ativo de moléculas em bactérias gram-negativas. Isto sugere, portanto, que
estas ORFs podem estar envolvidas no transporte de auxinas produzidas por G. diazotrophicus.
Apoio financeiro: Projeto Pronex/FAPERJ, Instituto Milênio, CNPq, CAPES e EMBRAPA.
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Caldos de variedades comercial e
selvagem de cana-de-açúcar modulam a
expressão gênica a partir de promotores de
Gluconacetobacter diazotrophicus
Batista, SCO; Figueiredo, NLA; Teixeira, KRS; Baldani, JI; Schwab, S
Laboratório de Genética e Bioquímica, Embrapa Agrobiologia
[email protected]
Palavras-chave: Gluconacetobacter diazotrophicus, expressão gênica, promotores
Gluconacetobacter diazotrophicus é uma bactéria que foi isolada de cana-de-açúcar, produz fito-hormônios como
giberelinas e ácido indol-3-acético, e fixa nitrogênio na presença de nitrato e a baixos valores de pH, podendo ser
responsável pela elevada taxa de FBN na cultura; desta forma, apresenta um grande potencial para ser utilizada como
biofertilizante. Recentemente, sua seqüência genômica foi publicada, abrindo foco para estudos de regulação gênica
a nível genômico. Trabalhos recentes têm demonstrado a modulação de genes de cana-de-açúcar conforme a presença
de bactérias endofíticas inoculadas (inclusive G. diazotrophicus), além de diferenças de expressão em vias importantes
de sinalização metabólica por variedades comercial e selvagem de cana. Estes dados mostram diferentes respostas
metabólicas conforme a variedade, sugerindo que os programas de melhoramento da cana têm afetado as interações
planta-bactéria. Por outro lado, não existem trabalhos com o intuito de investigar quais os efeitos do melhoramento da
cana-de-açúcar sobre a expressão gênica da bactéria (especialmente do modelo G. diazotrophicus) durante a interação
com a cana. Promotores de transcrição desempenham um papel central na regulação gênica, e a sua identificação e
caracterização são fundamentais para a compreensão dessa regulação. Com o objetivo de identificar e caracterizar
promotores de transcrição envolvidos na interação com diferentes variedades de cana, clones de G. diazotrophicus de
uma biblioteca de promotores foram submetidos a uma triagem para avaliar a expressão diferencial do gene repórter
lacZ na presença de caldo de variedades comercial e selvagem de cana-de-açúcar. Foram identificados dezessete clones
apresentando superexpressão na presença de caldo de cana da variedade selvagem (Chunee) e nove apresentaram inibição
da expressão na presença de caldo de ambas as variedades testadas e treze clones apresentaram inibição da expressão
exclusivamente na presença de caldo de cana da variedade comercial (SP70-1143). Os promotores que foram ativados
na presença de caldo da variedade selvagem Chunee serão fusionados com os genes repórteres gfp e gusA. Células de
G. diazotrophicus contendo as construções serão inoculadas na referida variedade de cana-de-açúcar com o objetivo de
monitorar a expressão dos promotores in planta através da atividade de GFP e GusA.
Agradecimentos: Projeto Pronex/Faperj, CNPq, Embrapa.
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Genômica comparativa do operon gum de
Gluconacetobacter diazotrophicus e outras
bactérias endofíticas
Menezes, CHSG1; Filho, FCA2; Simões-Araújo, JLS3; Vidal, MS3; Baldani, JI3
Doutorando em Biotecnologia Vegetal – Universidade Federal do Rio de Janeiro
2
Graduando em Agronomia – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
3
Laboratório de Genética e Bioquímica – Embrapa Agrobiologia
[email protected]
1
Palavras-chave: Gluconacetobacter diazotrophicus, Exopolissacarídeos, Açúcares de superfície, Genes gum, Genômica comparativa
Gluconacetobacter diazotrophicus é uma bactéria diazotrófica endofítica encontrada em associação com diversas plantas
que em geral apresentam um alto teor de carboidratos. Uma estratégia comum utilizada por vários microrganismos
que interagem com plantas é a produção de grande quantidade de exopolissacarídeos, que são fundamentais tanto
para a sobrevivência quanto para a associação da bactéria com a planta. Em diversos microrganismos endofíticos já
caracterizados, os genes relacionados à biossíntese destes exopolímeros encontram-se organizados em operon, como
por exemplo, o operon gum de Xanthomonas campestris. No presente trabalho ferramentas de bioinformática foram
utilizadas no estudo comparativo dos genes gum de G. diazotrophicus e outras bactérias endofíticas. A predição dos
genes presentes no genoma de G. diazotrophicus foi realizada por meio do programa GLIMMER e a anotação das vias
de biossíntese de exopolissacarídeos no genoma de G. diazotrophicus feita pelo programa ARTEMIS, com auxílio dos
programas BLAST e GENECONTEXT. A partir da anotação do genoma foi possível identificar uma região de 19,72
kb contendo 14 ORFs organizados em operon que apresentam homologia com genes que compõem os operons gum
de Xanthomonas campestris, Azoarcus sp. estirpe BH72 e Gluconacetobacter xylinus. O operon gum de X. campestris, uma
bactéria fitopatogênica, é composto por 12 genes (gumB, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L e M) que encontram-se organizados
em tandem. No caso de G. diazotrophicus foi observado apenas sete ORFs que apresentaram homologia com os genes
gumB, D, E, H, J, K e M do operon gum de X. campestris. Os genes gumC, F, G, I e L não estão presentes nesta região
do genoma de G. diazotrophicus e não apareceram em qualquer outro local do genoma, inclusive nos plasmídeos. Em
Azoarcus sp. estirpe BH72, endofitico diazotrófico, dos 15 genes do operon gum (gumB, C, D, E, F, H, J, K, M, ugd,
eglA, wzc1, AZO2243, AZO2244 e AZO2245) 10 ORFs foram encontradas em G. diazotrophicus e apresentaram alta
similaridade com os genes gumB, C, D, E, H, J, K, M e ugd. A maior similaridade e sintenia para o operon gum de G.
diazotrophicus foi observada com o operon de G. xylinus, responsável pela síntese de acetan. Este operon é formado
por 15 genes: aceA, B, C, D, E, F, G, H, I, J, M, P, Q, R e S, e G. diazotrophicus possui nove ORFs que apresentaram
homologia com os genes aceA, B, C, D, E, H e I. O gene aceF aparece em outro local do genoma de G. diazotrophicus.
A comparação dos operons revelou um surpreendentemente elevado grau de similaridade entre os operons de G.
diazotrophicus e X. campestris, Azoarcus sp. estirpe BH72 e Gluconacetobacter xylinus, onde nesta ultima, também foi
observado um alto grau de sintenia.
Apoio financeiro: Projeto Pronex/FAPERJ, Instituto Milênio, CNPq, CAPES e EMBRAPA.
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Prevalência de cepas virulentas (CagA+)
da Helicobacter pylori em pacientes com
adenocarcinoma gástrico no estado
do Pará, Brasil
Barile, KAS1; Xavier, JN2; Assumpção, MB3; Martins, LCM1; Corvelo, TCO1
Universidade Federal do Pará
2
Hospital Ophyr Loyola
3
Hospital Universitário João de Barros Barreto
[email protected]
1
Palavras-chave: Helicobacter pylori, Cancer gástrico, gene CagA
A Helicobacter pylori apresenta distribuição cosmopolita, atingindo 50% da população mundial, entretanto apenas 1%
destes indivíduos infectados desenvolve câncer gástrico. A colonização da mucosa gástrica por cepas patogênicas da H.
pylori leva a maior agressão e inflamação da mucosa, sendo importante na cadeia de eventos da oncogênese gástrica.
O Estado do Pará apresenta um elevado índice de doenças gastroduodenais, portanto faz-se importante investigar a
prevalência de cepas patogênicas CagA+ em pacientes que desenvolveram adenocarcinoma gástrico. Foram estudados
40 pacientes com câncer gástrico. A infecção por H. pylori foi avaliada por PCR para identificação dos genótipos cagA
em amostras de material de biopsia gástrica. A extração de DNA foi realizada pela técnica de fenol-clorofórmio e a
amplificação com primers específicos para cada gene. A analise molecular do gene UreA observou 100% de indivíduos
colonizados pela bactéria e o gene cagA foi detectado em amostras de 90% (36/40) dos pacientes com câncer gástrico.
A freqüência de infecção pelo Helicobacter pylori foi bem elevada, confirmando a relevância do genótipo patogênico
cagA da H. pylori em achados de lesões gástricas significativas tais como o câncer gástrico, sugerindo que o fator de
virulência CagA+ H. pylori é requerido para a indução de eventos na da carcinogênese gástrica.
Apoio: Sectam; Capes & UFPa.
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Epidemiologia e diversidade genética
de Haemophilus parasuis isolados no
estado de Minas Gerais/Brasil
Reis, KCP; Henriques, MR; Guimarães, WV; Santos, LF; Santos, DL; Santos, JL
Microbiologia Veterinária Especial, MICROVET, Viçosa - MG
[email protected]
Palavras-chave: Haemophilus parasuis, Suíno, ERIC-PCR, Sorotipo, Doença de Glässer
Haemophilus parasuis (HPS) é uma bactéria gram negativa, não hemolítica, imóvel e NAD dependente, pertencente à
família Pasteurellaceae. HPS é comumente encontrada no trato respiratório de suínos. Entretanto, também é o agente
causador da Doença de Glässer, podendo provocar infecção sistêmica a qual pode resultar em morte súbita ou no
desenvolvimento de lesões manifestada por poliserosite, poliartrite e meningite em suínos jovens. Isolados de HPS
podem ser classificados em 15 diferentes sorotipos. O estudo da epidemiologia molecular da infecção por HPS permite a
caracterização da variabilidade genética de isolados envolvidos em mortalidade e definição de grupos prevalentes. Várias
seqüências repetitivas podem ser utilizadas para genotipagem por Rep-PCR, incluindo as seqüências REP (Repetitive
Element Palindrome), ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus), e BoxA. Os resultados dos testes de sorologia
utilizando 71 amostras da coleção de HPS, revelaram que a maior prevalência no estado de Minas Gerais foi de HPS
sorotipos 2 e 5, seguido pelos sorotipos 1, 9 e 12. Análise por ERIC-PCR demonstrou diversidade genética entre os
sorotipos mais prevalentes testados. Considerando que o estado de Minas Gerais, junto com os estados da região sul
do Brasil são pólos produtores de suínos e que esta doença acarreta prejuízos econômicos consideráveis, informações
de epidemiologia e diversidade genética são cruciais para a seleção de isolados para produção de vacinas autógenas e
para a prevenção de introdução de animais carreadores de linhagens virulentas em rebanhos susceptíveis.
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Caracterização genética de isolados clínicos
de K. pneumoniae multirresistentes
Barbosa, BGV1; Almeida, ACS1,3; Cavalcanti, FLS1,2; Vilela, MA1,4; Morais, MMC1; Morais Junior, MA4
1
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Pernambuco
Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco
3
Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco
4
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
2
Palavras-chave: K. pneumoniae, ESBL, blaCTX-M, blaSHV, blaTEM
Isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae apresentam freqüentemente a capacidade de produzir beta-lactamases de
espectro estendido (ESBL), sendo um fator importante na determinação de multi-resistência, apresentando muitas vezes
resistência associada a drogas não beta-lactâmicas (MDR). Este estudo visou a caracterização de isolados produtores
de ESBL em relação à presença dos genes blaCTX-M, blaSHV e blaTEM; à variabilidade genética, através de ribotipagem
por PCR, e ao perfil plasmidial. Foram analisados 40 isolados do período de 2002 a 2004. A identificação dos genes
de ESBL presentes nestes isolados foi feita através de PCR específica. A ribotipagem foi realizada segundo Kostman
et al. (1992) e para a extração plasmidial utilizou-se o kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System
(Promega). Os resultados da ribotipagem demonstraram a presença de 4 ribotipos distintos, sendo 70,3% das amostras
pertencentes ao ribotipo 1, o que indica uma baixa variabilidade nesta população. Dos 40 isolados analisados, 32%
apresentaram apenas um dos genes pesquisados, 45,4% possuíam dois genes e em 22,5% foram encontrados os três
genes simultaneamente. Observou-se a predominância do gene blaSHV (82,4%), seguido dos genes blaTEM (60,2%) e
blaCTX-M (50,3%). A elevada incidência destes genes nos isolados sugere um mecanismo de disseminação plasmidial,
pois os genes de ESBL encontram-se freqüentemente nestes elementos genéticos. Para verificar esta possibilidade,
procedeu-se à análise plasmidial, inicialmente realizada em 12 isolados MDR. Os resultados mostraram uma variação na
quantidade de plasmídios de 0 a 7 entre os isolados, com a maioria apresentando entre 3 e 4 plasmídios. Cerca de 47%
desses plasmídios foram de baixo peso molecular até 2kb e apenas 14% apresentaram peso molecular superior a 50kb.
Isto sugere que os genes de ESBL em vários dos isolados analisados podem também estar presentes em cromossomos,
fixados por mecanismos de integração plasmidial. Este pré-suposto se deve ao fato de que são os plasmídios de alto
peso molecular que mais portam os cassetes gênicos de resistência. Análises preliminares dos 40 isolados detectaram
a presença de integrons de classe 1 em 90% das amostras. Trabalhos posteriores serão realizados com a finalidade de
investigar a presença dos genes de ESBL nos integrons.
Apoio Financeiro: CNPq e FACEPE
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Construção de um sistema “food-grade”
de expressão gênica e endereçamento
protéico para Lactococcus lactis
Almeida, MO1; Azevedo, MP1; Lima, FA1; Viguetti, SCZ1; Bueno, BT1; Luerce, TD1; Costa, KM1; Grael, E2; Lerayer, ALS2;
Moreno, I2; Azevedo, V1; Miyoshi, A1
Laboratório de Genética Celular e Molecular – Depto. Biologia Geral, ICB-UFMG, CP 486, CEP 30161-970 Belo Horizonte, MG, Brasil
1
Centro de P&D em Laticínios, Instituto de Tecnologia de Alimentos,, Av. Brasil, 2880, Campinas- SP
2
[email protected]
Palavras-chave: Lactococcus lactis, sistemas de expressão, xilose, food-grade, clonagem
As bactérias lácticas (BL) constituem um grupo de microrganismos Gram-positivos e anaeróbios facultativos capazes
de converter açúcares em ácido láctico. Lactococcus lactis, a mais bem caracterizada bactéria láctica é um microrganismo
amplamente utilizado na indústria alimentícia para a produção e preservação de produtos lácteos fermentados. Isso fez
com que essa bactéria tenha sido extensivamente engenhada para a produção de proteínas de interesse biotecnológico
com alto valor agregado, como, por exemplo, enzimas e antígenos. Dentre os mais promissores sistemas de expressão
gênica já desenvolvidos, encontra-se o sistema NICE (nisin controlled expression system), já utilizado para a produção
de diversas proteínas heterólogas em diferentes BL; contudo, esse sistema é induzido pela presença de nisina, a qual pode
inviabilizar a sua utilização extralaboratorial. Assim, foi desenvolvido em nosso laboratório um sistema de expressão
gênica e endereçamento protéico para L. lactis denominado XIES, o qual combina o forte promotor PxylT, elementos
genéticos (RBS e SP) da proteína Usp45 de L. lactis e o gene repórter nuc de Staphylococcus aureus. Esse sistema demonstrou
ser capaz de produzir elevados níveis da proteína, além de corretamente endereçar o produto final para o citoplasma
ou meio extracelular. No entanto, o sistema XIES não pode ser classificado como “food grade”, uma vez que utiliza
como marcador de seleção um gene de resistência ao cloranfenicol. Dessa forma, seria interessante que fosse realizada
uma construção na qual os genes responsáveis pelo metabolismo da xilose, fenótipo variável em linhagens de L. lactis,
funcionassem como marcadores de seleção. Assim, em um meio de cultivo bacteriano suplementado com xilose como
única fonte de carbono, apenas as bactérias que contivessem os genes xylRAB (responsáveis pelo metabolismo de xilose)
poderiam se proliferar e desempenhar a função desejada: a produção de proteínas de interesse. Para tal, no presente
trabalho, clonamos e analisamos os três genes com a finalidade de construirmos um vetor “food grade” passível de ser
utilizado em várias linhagens de diferentes espécies de BL.
Apoio Financeiro: FAPESP, FAPEMIG, CNPq, UFMG.
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Um novo sistema de obtenção de um
peptídeo hipotensor: Lactococcus lactis
expressando TsHpt-I isolado do veneno
do escorpião Tityus serrulatus
Viguetti, SCZ1; Rocha, CSR1; Almeida, MO1; Azevedo, MP1; Luerce, TD1; Bueno, BT1; Costa, KM1; Verano-Braga, T2;
Pimenta, AM2, Santos, RAS3; Azevedo, V1; Miyoshi, A1
1
Laboratório de Genética Celular e Molecular – Depto de Biologia Geral, ICB -UFMG
Laboratório de Venenos e Toxinas Animais – Depto de Bioquímica e Imunologia, ICB – UFMG
3
Laboratório de Hipertensão – Depto de Fisiologia e Biofísica, ICB - UFMG
2
A hipertensão é um importante desafio para as autoridades de saúde pública mundial. Atualmente, as classes de drogas
que são eficazes no tratamento da hipertensão ainda apresentam efeitos colaterais, e, por isso, há um grande interesse
no desenvolvimento de novos fármacos anti-hipertensivos. Em 2003, foram isolados quatro peptídeos do veneno de
Tityus serrulatus, sendo que um deles, TsHpt-I, é capaz de potencializar o efeito hipotensor da bradicinina (BK) em
ratos normotensos por mais de 2 horas, quando injetado por via intravenosa. Demais estudos demonstraram que
um análogo sintético deste peptídeo possui um longo efeito hipotensor independente da injeção de BK, o que torna
claro o potencial terapêutico da molécula. Entretanto, o maior inconveniente da aplicabilidade biotecnológica deste
peptídeo está relacionado aos processos de obtenção da molécula: isolamento do peptídeo diretamente do veneno do
escorpião ou a produção laboratorial do análogo sintético; os quais podem ser dificultosos e onerosos. Dessa forma, o
presente trabalho teve como objetivo construir linhagens recombinantes de Lactococcus lactis produtoras do peptídeo,
buscando assim desenvolver um novo processo de obtenção da molécula. Para tal, sintetizamos a ORF codificadora do
peptídeo através de uma PCR recursiva e o amplicom foi então clonado no vetor pCRII-TOPO e subclonado nos
vetores pXylT:SEC e pXylT:CYT. Os plasmídeos finais pXIES:sc-tshpt1 e pXIES:cyt-tshpt1 foram primeiramente obtidos
em E. coli e posteriormente em L. lactis por eletroporação. Nosso próximo passo será avaliar a capacidade produtiva
das linhagens em relação à quantidade e qualidade da molécula recombinante e avaliar, in vivo (ratos hipertensos),
a atividade de TsHpt-I produzido em L. lactis. Nossos resultados preliminares constituem o primeiro passo rumo ao
desenvolvimento tecnológico do processo de obtenção deste peptídeo, e poderá contribuir para o desenvolvimento de
uma nova estratégia contra a hipertensão.
Apoio financeiro: FAPEMIG.
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Tipagem intra-específica de Lactobacillus
fermentum isolados do processo de
fermentação alcoólica através do REP-PCR
Lucena, BTL; Santos, BM; Morais Jr, MA
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: Lactobacillus fermentum, rep-PCR, Fermentação alcoólica, GTG5
Episódios de contaminação bacteriana podem causar prejuízos econômicos de até vários milhares de reais às destilarias
de álcool combustível no país, tanto diretamente pela diminuição do rendimento etanólico da fermentação como
indiretamente pelos gastos com o uso de antibióticos industriais para a contenção dessas contaminações. Até o
momento não há ainda um catálogo completo de informações sobre todas as possíveis espécies bacterianas envolvidas
na contaminação industrial, e poucos são os dados encontrados na literatura científica sobre contaminantes bacterianos
do processo de fermentação alcoólica. Acredita-se que mais do que a carga bacteriana, o tipo bacteriano envolvido no
processo de contaminação deve definir a severidade do episódio. Portanto, linhagens diferentes de uma mesma espécie
bacteriana devem se comportar diferencialmente em diferentes processos industriais. Este trabalho teve como objetivo
diferenciar a nível intra-específico exemplares de Lactobacillus fermentum isolados do processo de fermentação industrial
durante as safras 2005/2006 e 2006/2007 em duas destilarias de álcool combustível utilizado a técnica rep-PCR com o
primer GTG5. A fim de se identificar isolados diferentes a nivel intra-específico de Lactobacillus fermentum nas diferentes
destilarias, e numa mesma destilaria em períodos de safras diferentes, foram tipificados cerca de 29 isolados, sendo seis
obtidos na destilaria A durante a safra 2005/2006, cinco obtidos na destilaria A durante a safra 2006/2007 e 18 na
destilaria B durante a safra 2006/2007. Foram obtidos diferentes perfis de fingerprinting dos isolados caracterizados
demonstrando que a técnica de rep-PCR pode ser utilizada como marcador intra-específico. Na destilaria A foram
identificados seis diferentes tipos de Lactobacillus fermentum, já na destilaria B foram identificado oito tipos. Dentre
esses tipos, o tipo I mostrou-se presente em ambas as destilarias nas diferentes safras. Na destilaria B, o final da safra
foi caracterizado pela mudança do substrato de fermentação, de caldo de cana para melaço. Neste caso observou-se um
tipo específico de Lactobacillus fermentum para esse substrato o qual foi denominado de tipo II. A espécie Lactobacillus
fermentum tem sido apontado como principal contaminante em processo de fermentação alcoólica industrial, sendo
algumas linhagens capazes de causar floculação em leveduras, o que pode acarretar alguns problemas no processo.
Trabalhos futuros visam correlacionar os isolados com diferentes perfis intra-específico com algum dano do processo,
visando assim traçar uma melhor estratégia de controle microbiano.
Apoio Financeiro: AEB Bioquímica Latino Americana S.A, CAPES e Genetech.
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Identificação molecular de bactérias
isoladas da fermentação alcoólica industrial
pela técnica de ARDRA-PCR
Santos, BM1; Lucena, BTL1; Moreira, JLS2; Nunes, ÁC2; Azevedo, V2; Morais Jr, MA1
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
2
Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]; [email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: ARDRA-PCR, Bactérias lácticas, Contaminantes Bacterianos, Fermentação alcoólica, lactobacillus
A indústria alcooleira no Brasil perde anualmente vários milhares de reais devido a episódios de contaminação produzidos
por bactérias. Além disso, outros milhares são gastos com o uso de antibióticos industriais para a contenção dessas
contaminações. Infelizmente, não há ainda um catálogo completo de informações sobre todas as possíveis espécies
bacterianas envolvidas na contaminação industrial, seus efeitos no processo e os fatores que levam a essas contaminações.
No presente trabalho, propomos a utilização da técnica de ARDRA-PCR para a identificação bacteriana e monitoramento
das bactérias presentes em processos industriais de produção de álcool combustível. Para isso foram coletas amostras de
mosto fermento em uma destilaria no estado da Paraíba, no início (partida) do processo fermentativo e a cada 30 dias
durante a safra 2007-2008. Após diluição do mosto, as células foram semeadas em meio MRS e incubadas em jarras
anaeróbias a 37ºC. Foram escolhidas para identificação cerca de 20 colônias com base no percentual de cada morfotipo
nas placa. A identificação dos isolados foi realizada através da análise do perfil de restrição da amplificação da região
espaçadora 16S-23S do DNA ribossomal amplificada por PCR. Observando a dinâmica da população bacteriana nas
primeiras coletas pode-se sugerir que algumas bactérias surgem no processo, contudo não conseguem se manter, como
por exemplo, Lactobacillus plantarum na primeira coleta, Lactobacillus ferintoshensis e Lactobacillus brevis na segunda
coleta. Outras surgem e se mantém no processo, ainda que modificando a sua freqüência, como Lactobacillus sp 2 e
Lactobacillus fermentum. Um isolado que nos tem chamado atenção é o L6, que surge e logo aumenta sua freqüência
no processo. Os isolados L6 apresentam perfil de amplificação típico de Lactobacillus, porém o perfil de restrição
apresentado não consta no nosso banco de dados. Estes isolados L6 parecem apresentar resistência aos antibióticos
usados na indústria, pois suas freqüências são mantidas mesmo quando há tratamento com antimicrobianos levando a
seleção de algumas espécies no processo. Este isolado L6 foi submetido a seqüenciamento de DNA e identificado como
Lactobacillus vini a partir da similaridade de 99-100% com as seqüências desta espécie depositadas no GenBank. Esta
bactéria foi recentemente isolada de processo fermentativo em associação com a levedura Dekkera bruxellensis (Passoth
et al, 2007), e os autores sugerem que este pode constituir um bom consócio para produção de álcool combustível.
Apoio Financeiro: AEB Bioquímica Latino Americana S.A, CAPES e Genetech.
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Construção de linhagens de Lactococcus
lactis produtora de quimosina bovina
Luerce, TD1; Azevedo, MP1; Moreno, I2; Lerayer, ALS2; Marasca, ETG2; Azevedo, VAC1; Miyoshi, A1
Departamento de Biologia Geral, Universidade de Minas Gerais
2
Instituto de Tecnologia de Alimentos
[email protected]
1
Palavras-chave: Lactococcus lactis, produção heteróloga, quimosina bovina
Quimosina bovina é uma aspartil endoprotease presente no abomaso de bezerros lactentes. As principais proteínas
que compõe o leite são as α e β caseínas que precipitam em presença de cálcio, porém encontram-se solúveis no leite
formando micelas com κ caseína. Quando a quimosina é secretada neste ambiente cliva a κ caseína, desfazendo o
agregado protéico e promovendo a precipitação das caseínas, formando o coalho. Esta atividade garante ao bovino
recém-nascido a digestão das proteínas ingeridas por aumentar o tempo de permanência do leite no estômago. Esta
propriedade também é explorada pela indústria produtora de queijo que utilizada a quimosina no processo de coagulação
do leite. O elevado custo da obtenção da quimosina bovina despertou interesse na aquisição da enzima a partir de outras
origens. Nesse contexto, microrganismos geneticamente modificados produzindo quimosina foram desenvolvidos. A
proteína produzida por estes microrganismos combinada com outras proteases apresentou satisfatórias propriedades
de coagulação. No entanto, várias limitações são encontradas no processo de obtenção da quimosina recombinante,
como por exemplo, a formação de corpúsculos de inclusão, sendo necessário que a proteína sofra um processo de
desnaturação e renaturação, o que pode comprometer a estrutura protéica, além de reduzir o rendimento. Sistemas
de expressão em altos níveis foram conseguidos apenas em produção intracelular, que exige purificação complexa e
elevado custo. De modo que ainda é faz-se necessário a produção de quimosina bovina em um sistema de expressão
que permita a obtenção da enzima por processos menos dispendiosos e possam ser utilizados facilmente na indústria.
Lactococcus lactis surge como uma opção para a produção de quimosina. Gram-positivo, pertencente ao grupo das
bactérias lácticas (BL), é utilizado na produção e fermentação de produtos a base de leite. Cultura de L. lactis, assim
como a quimosina, é adicionada ao leite no processo de fabricação de queijo. Assim, a construção de linhagens de L.
lactis produtoras de quimosina mostram-se como alternativas interessantes para simplificar o processo downstream e
produção em larga escala. O objetivo deste trabalho foi clonar a ORF (open reading frame) proquimosina bovina em
L. lactis. Como a quimosina é sintetizada in vivo como uma molécula precursora, a proquimosina, tornando-se ativa
somente após encontrar condições ácidas do ambiente extracelular, para a construção das linhagens foi utilizada a
seqüência do mRNA da proquimosina de Bos taurus disponível GenBank, número de acesso NM_180994. Sendo esta
seqüência modificada para os códons preferenciais de L. lactis. Utilizou-se os vetores com endereçamento intracelular
e extracelular do sistema de expressão XIES. Sistema que utiliza a xilose como indutor. A integridade da seqüência
clonada foi verificada por seqüenciamento e transformada em L. lactis, gerando linhagens produtoras da quimosina
bovina nas formas intracelular e extracelular.
Agências financiadoras: FAPEMIG e FAPESP.
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Estratégia de seqüenciamento parcial
direcionado revela diferenças entre os genomas
de duas subespécies de Leifsonia xyli
Zerillo, MM1; Paschoal, AR2; Camargo, LEA3; Van Sluys, MA1; Monteiro-Vitorello, CB4
Instituto de Biologia, Departamento de Botânica, Universidade de São Paulo
2
Instituto de Matemática e Estatística, Universidade de São Paulo
3
Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia, ESALQ, Universidade de São Paulo
4
Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC
[email protected]
1
Palavras-chave: Leifsonia xyli, Actinobacteria, Genômica comparativa, Patógeno, Transposon
Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é um patógeno exclusivo de cana-de-açúcar e Leifonia xyli subsp. cynodontis (Lxc) foi
isolada do xilema de várias gramíneas, causando sintomas leves de raquitismo apenas em gramíneas do gênero Cynodon.
Em cultura, Lxx e Lxc apresentam crescimento lento, sendo Lxx considerada mais fastidiosa. Uma estratégia de
seqüenciamento parcial do genoma de Lxc foi utilizada na análise comparativa ao genoma completamente seqüenciado
de Lxx (Monteiro-Vitorello, et al., 2004). A estratégia privilegiou o seqüenciamento de fragmentos distintos ao
genoma de Lxx. Bibliotecas genômicas de Lxc foram construídas e ambas as pontas dos insertos clonados em vetores de
plasmídeo e BAC foram seqüenciadas, gerando 7.005 seqüências. Ferramentas de bioinformática foram utilizadas na
anotação dos genes e nas análises comparativas. As regiões específicas de Lxc somaram 311.353 pb e foram anotadas.
De um total de 317 seqüências, 290 apresentaram ortólogos em bancos de dados de acesso público. Cinqüenta e nove
seqüências apresentaram ortólogos em Lxx, e 18 corresponderam a genes exclusivos de Lxc. Dentre os últimos, genes
associados ao metabolismo de arginina, e de outros aminoácidos, metabolismo de lipoato, e associados à via da pentose
podem indicar que Lxc apresenta um metabolismo mais versátil do que Lxx, coerente com sua maior diversidade de
habitats. Baseando-se no mapeamento de insertos de BAC, dois grandes eventos de rearranjo foram descritos. Devido
a associação conhecida de elementos genéticos móveis com reorganização cromossômica e transferência horizontal de
genes, um estudo detalhado dos transposons do tipo IS, presentes em ambos os genomas, foi realizado. A análise revelou
um número variável de elementos para cada genoma atuando na diversificação dos mesmos, sendo que alguns estavam
associados a rearranjos e regiões específicas de cada genoma. As seqüências geradas pelo seqüenciamento parcial poderão
ser utilizadas por pesquisadores interessados neste organismo e deverão estimular futuras investigações da biologia e
patogenicidade de Leifsonia xyli. Os resultados indicam que a estratégia de seqüenciamento utilizada permitiu revelar
diferenças genômicas significativas, fazer inferências de análise funcional com um número menor de seqüências.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Polimorfismo genético de amostra isolada
em Minas Gerais do gênero Leptospira
genótipo hardjoprajitno
Cosate, MRV; Oliveira, CSF; Moreira, EC; Barouni, AS; Farnezi, IV; Salas CE
Departamento Bioquímica e Imunologia, ICB, Departamento de Medicina Preventiva, Escola Veterinária, Universidade Federal Minas Gerais, 31270-901
[email protected]
Palavras–chave: Leptospiroses, LSSP-PCR, Bovino, sorovariedade hardjo, polimorfismo
O gênero Leptospira esta agrupado em 200 sorovariedades e 24 sorogrupos. Na espécie bovina a sorovariedade mais
freqüente é a hardjo, na qual estão inclusas duas espécies, L. interrogans, genótipo hardjoprajitno e L. borgtepersenii,
genótipo hardjobovis. No Brasil o genótipo hardjoprajitno foi inicialmente identificado em Minas Gerais. A amostra
caracterizada como sendo do genótipo hardjoprajitno, espécie L. interrogans e denominada de Norma e foi obtida a
partir da urina de bovino infectado. O objetivo deste trabalho é identificar polimorfismos genéticos para o isolado
Norma, em relação às amostras de referência hardjoprajitno, do genótipo hardjoprajitno, espécie L. interrogans e
amostra sponselee, do genótipo hardjobovis, classificada na espécie L. borgtepersenii. Foram utilizados dois pares de
primers denominados G1/G2 referente ao gene secy, localizado no lócus S10-spc-α e LepAF/LepAR referentes a região
23S rRNA, em conjunto com as técnicas de seqüênciamento e LSSP-PCR para a caracterização molecular da amostra
Norma. A amplificação com os primers G1/G2 gerou um fragmento com 300 bp nas três amostras analisadas. No
sequenciamento deste fragmento foi encontrada uma região polimórfica, com 18 nucleotídeos presente na amostra
Norma, mas ausente na amostra hardjoprajitno. Esse polimorfismo foi identificado em outras sorovariedades como
canicola, icterohaemorrhagiae, copenhageni, bataviae, wolffi e bratislava, classificadas na espécie Leptospira interrogans
e nas sorovariedade hardjo da espécie Leptospira borgtepersenii. Na análise da região secy foram observadas substituições
não-sinônimas e sinônimas entre as seqüências de aminoácidos das diferentes sorovariedades. Na amplificação com os
“primers” LepAf/LepAR foi obtido um fragmento com aproximadamente 300 bp para as três amostras analisadas. O
sequenciamento deste amplicon demonstrou elevado grau de homologia entre as amostras do mesmo genótipo (Norma
e hardjoprajitno), enquanto que polimorfismos pontuais foram identificados em relação à amostra sponselee do genótipo
hardjobovis, espécie L. borgtepersenii. O fragmento de 300 bp obtido com os primers G1/G2 foi reamplificado com
apenas um primer por reação com G1 ou G2, e um perfil mais complexo foi observado com o primer G2. No genótipo
hardjoprajitno foram obtidos 5 fragmentos para a amostra Norma e 6 fragmentos para a amostra hardjoprajitno com
G2. No genótipo hardjobovis com o primer G2 foram gerados 3 fragmentos, isto é, um perfil diferencial foi encontrado,
em relação ao genótipo hardjoprajitno, permitindo a diferenciação de amostras classificadas na mesma sorovariedade.
A realização deste trabalho permitiu concluir que existem polimorfismos entre amostras classsificadas na sorovariedade
hardjo, do mesmo genótipo e espécie classificados no gênero Leptospira, isoladas em diferentes regiões geográficas
provenientes de diferentes hospedeiros.
Apoio: CNPq, Fapemig.
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Expressing heterologous gene cry by endophytic
bacterium Pantoea agglomerans and its
potential on biocontrol of Diatraea saccharalis
Quecine, MC1; Lacava, PT1; Silva, MCP1; Araújo, WL1,2; Azevedo, JL1; Pizzirani-kleiner, AA1
Department of Genetics, University of São Paulo – ESALQ-USP
Núcleo Integrado de Biotecnologia, University of Mogi das Cruzes
[email protected]
1
2
Keywords: Pantoea agglomerans, cry protein, biocontrol, Diatraea saccharalis, sugarcane
The gram-positive, aerobic, spore-forming bacterium Bacillus thuringiensis has been used as an alternative and supplement
to chemical pesticides for over 2 decades. It is a pathogen of insect larvae, which produces highly specific crystal inclusions
during sporulation. These crystals consist predominantly of protoxin molecules known as d-endotoxins, Cry toxins,
or Cry proteins. Despite the success of conventional B. thuringiensis-based products, they have several disadvantages
as bioinsecticides. In the case of the sugarcane borer Diatraea saccharalis, a widespread sugarcane pest which causes
considerable crop loss in cane-growing areas of Brazil, these include instability in the environment and on the surface
of sugarcane, as well as difficulty in reaching the internal regions where the larvae feed. The use of recombinant DNA
technology has provided solutions to the problems through the development of two approaches, namely, genetically
modified microorganisms that are able to colonize and to live inside of sugar cane. For this reason, the cry1Ac7 gene
from B. thuringiensis strain 234 was previously introduced into a endohytic bacteria Pantoaea agglomerans strain 33.1.
The colonization of sugarcane by the strain 33.1 was previously evaluated. Toxicity bioassays indicated that D. saccharalis
larvae fed of artificial diet added the strain 33.1 carrying the integrated gene expressing the gene cry1Ac7 showed a
mortality rate significantly higher than D. saccharalis larvae fed of artificial diet added the strain 33.1 wild type. The
larval development of D. saccharalis was also impaired when added the strain 33.1 genetically modified carrying the
gene cry1Ac7. However the difference between pupa weight were not significantly when compared treatments with
and without the bacterium expressing the Cry protein. These results showed that the use of an endophytic bacterium
could be a possible solution to the problem of inaccessibility of conventional B. thuringiensis-based products to the
interior regions of the plant. The possible advantages of using these recombinant endophytes are their high stability in
sugarcane and the ability to be transferred to subsequent generations via sugarcane setts.
Financial Support: FAPESP.
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Taxonomia de Vibrios associados com
necrose de gorgônias Phyllogorgia dilatata
do Recife de fora (Bahia)
Alves Junior, N1; Silva, BSO1; Thompson, CC2; Vicente, ACP2; Coelho, A1; Thompson, FL1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro
2
FIOCRUZ
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Taxonomia, Biodiversidade, Vibrios
Este é o primeiro estudo no âmbito nacional sobre a caracterização da diversidade de procariontes associados com
gorgônias saudáveis e doentes da espécie Phyllogorgia dilatata em diferentes pontos do recife de Fora (Porto Seguro,
Bahia). Durante o verão de 2007, vários episódios de necrose do mesênquima deste organismo foram observados. Foram
realizados isolamentos seletivos para caracterizar taxonomicamente os grupos de vibrios associados com a necrose de
Phyllogorgia dilatata. Doze espécies de vibrios foram identificadas por sequenciamento do gene pyrH (Uridilato quinase)
dos isolados do meio de cultivo TCBS. As espécies V. alginolyticus, V. campbellii, V. coralliilyticus, V. harveyi, V. rotiferianus
foram encontradas em espécimens saudáveis de P. dilatata. As espécies V. chagasii, V. diabolicus, V. pelagius, V. neptunius,
V. tubiashii e V. xuii foram encontradas em amostras de corais doentes. V. alginolyticus, V. campbellii, V. coralliilyticus, e
V. harveyi são conhecidos patogênos de corais. Sequências do 16S rDNA, FtsZ e MreB de uma linhagem proveniente
de um coral saudável, sugerem que essa linhagem pertence a uma espécie nova, próxima a Photobacterium leiognathi.
Bioensaios utilizando artemias estão sendo realizados a fim de checar a patogenicidade dos vibrios.
Apoio financeiro: Cnpq, FAPERJ e IFS.
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Regulação da expressão da fímbria
CupD por sistemas de dois componentes
localizados na ilha de patogenicidade
PAPI-1 de Pseudomonas aeruginosa PA14
Boechat, AL; Nicastro, GG; Baldini, RL
Departamento de Bioquímica – Instituto de Química – USP
[email protected]
Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa, regulação gênica, sistema de dois componentes, fímbria
Pseudomonas aeruginosa é uma gamaproteobactéria ubíqua capaz de infectar indivíduos imunocomprometidos e causar
infecções hospitalares. A cepa PA14 apresenta duas ilhas de patogenicidade que contribuem para sua alta virulência. Entre
duas repetições diretas situadas na maior dessas ilhas, a PAPI-1, encontra-se dois grupos de genes transcritos em direções
opostas. O primeiro, composto de dois operons, pvrSR e rcsCB, codifica proteínas de sistemas de dois componentes e está
relacionado com virulência, enquanto o segundo, um operon compreendendo cinco genes (cupD1-D5), codifica uma
fímbria do tipo “chaperone-usher” e apresenta alta similaridade com o grupo cupA, envolvido na formação de biofilme
em outras linhagens de P. aeruginosa. Fímbrias da mesma família são importantes na patogenicidade de outras bactérias.
Com o objetivo de investigar a regulação da expressão da fímbria CupD pelos sistemas de dois componentes codificados
pelos genes adjacentes, foram realizados ensaios de qRT-PCR, os quais mostraram uma menor expressão de cupD na
linhagem mutante rcsB, confirmando resultados anteriores de expressão de um gene repórter para β-galactosidase. RcsB
apresenta um domínio de ligação a DNA e os dados obtidos indicam fortemente que essa proteína funciona como
um ativador de transcrição dos genes da fímbria. Corroborando esses achados, uma linhagem de P. aeruginosa PA14
superexpressando RcsB mostrou níveis exacerbados de mRNA de cupD1. Essa linhagem é deficiente na formação de
biofilme e nas motilidades tipo swarming e twitching, sugerindo uma desorganização das organelas extracelulares devido
aos altos níveis de RcsB, possivelmente por uma maior quantidade de fímbrias CupD. Foi observado, ainda, que a
expressão dessa fímbria é regulada por temperatura (mais expressa a 28º que a 37ºC) e pelo regulador global de expressão,
MvaT, uma proteína HNS-like. Ainda visando elucidar os mecanismos de regulação de cupD, os inícios de transcrição
dos operons em estudo foram identificados por RACE 5’ e analisados para a presença de seqüências regulatórias que
venham a dar informações sobre a natureza do sinal necessário para a ativação dessa cascata de regulação.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Estudo da função da proteína KrbM de
Pseudomonas aeruginosa PA14
Meireles, DA; Baldini, RL
Instituto de Química, Departamento de Bioquímica, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa, metiltransferases
P. aeruginosa PA14 é uma linhagem isolada de queimadura que apresenta vários fatores de patogenicidade comuns
no quadro de infecção de hospedeiros filogeneticamente distintos (plantas, mamíferos ou invertebrados). A busca por
mutantes atenuados em virulência da linhagem PA14, em uma biblioteca de transposons, levou a descoberta do gene
krbM. Foi então construída uma linhagem com uma deleção não polar neste gene, denominada D12. A caracterização
desta linhagem D12 confirmou sua virulência atenuada e ensaios mais detalhados mostraram alteração na expressão
de diversos genes relacionados com o sistema de “quorum sensing” (Baldini, RL, dados não publicados). O gene krbM
está organizado em um operon onde à jusante se encontram o gene rnhA e dnaQ, que codificam proteínas envolvidas
na replicação e reparo do DNA. Análises de bioinformática indicam que KrbM é uma metiltransferase dependente
de S-adenosil-metionina (SAM), apresentando um domínio bem conservado de ligação a SAM e uma arquitetura de
domínio compatível com a organização em fitas-beta e hélices-alfa alternadas descritas para a família das metiltransferases
dependentes de SAM. Ela não apresenta outros domínios conservados que indiquem seu substrato de metilação. O
objetivo deste trabalho foi verificar o alvo de metilação desta metiltransferase tendo como hipótese inicial o DNA já que
este alvo melhor se enquadra com o fenótipo pleiotrópico apresentado pela linhagem D12. Ensaios de duplo-híbrido
mostraram que KrbM não interage com os produtos de rnhA e dnaQ, sugerindo que KrbM não está diretamente
relacionado com suas funções. A freqüência de mutação na linhagem D12 não está alterada, o que sugere que KrbM
não está diretamente envolvida em processos de reparo de DNA. A investigação inicial do estado de metilação do DNA
de PA14 e D12 foi feita através do uso de algumas enzimas de restrição que são sensíveis ou não a metilação. Nesta
análise preliminar não observamos diferenças no padrão de digestão, porém ao utilizar outra abordagem, que se baseia
em diferenças de intensidade dos picos obtidos de cromatogramas de seqüências, foi detectada um possível sítio de
metilação: o resíduo mais interno de citosina na seqüencia 5’-GGGCCC-3’. A expressão heteróloga desta proteína em
E. coli, seja fusionada a uma cauda de histidina ou a uma Glutationa S-Transferase (GST), mostrou que quase sempre
ela é expressa de maneira insolúvel. Diversas condições de indução foram testadas e a proteína somente foi expressa
de maneira parcialmente solúvel quando co-expressa com as chaperoninas GroeL/GroeS em baixas temperaturas.
A purificação desta proteína mostra que ela é co-eluída com a chaperonina GroeL sugerindo que para atingir sua
conformação nativa ela necessita dessas proteínas acessórias. A proteína recombinante solúvel será usada para ensaios
‘in vitro’ de ligação a SAM e ensaios de ligação a DNA com seqüências previamente escolhidas.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP.
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Tipagem molecular de amostras
de Pseudomonas aeruginosa isoladas
do estado de Sergipe-Brasil por RAPD-PCR
(Randomly Amplified Polymorphic DNA)
Costa, RV1; Lopes, TF1; Andrade, ACM1; Silva, WRT1; Santos, IAO1; Santos, IFO1; Passos, GB1; Carneiro, MRP1; Cândido, AL1
Departamento de Morfologia, Universidade Federal de Sergipe
[email protected]
1
Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa, RAPD, genotipagem, tipagem molecular, resistência a antibióticos
Nos últimos anos muitos métodos para tipagem de Pseudomonas aeruginosa têm sido avaliados e esses métodos procuram
ser ferramentas úteis para fins epidemiológicos e filogenéticos e para caracterização de amostras isoladas de diversas fontes.
Todos os métodos procuram ter baixos custos, rapidez e eficiência. Uma união dessas informações pode auxiliar além de
uma investigação epidemiológica uma informação sobre resistência a antimicrobianos e contaminação com o mesmo
microrganismo em diversos ambientes hospitalares. Foi realizada a tipagem molecular das amostras de pseudomonas
aeruginosa, usando a técnica de RAPD PCR sem a prévia extração de DNA das amostras isoladas. Dez amostras foram
isoladas do Hospital de Urgências Governador João Alves Filho Aracaju-SE, de sete diferentes alas. Antibiogramas
foram contra com vinte um diferentes antibióticos. Utilizaram-se três iniciadores (P2, P3 a P4) do sistema Ready-ToGo (Invitrogen) e os produtos amplificados foram submetidos à corrida eletroforética em gel de agarose. O iniciador 2
formou dois grupos, o 3 formou apenas um grupo mas discriminou as amostras e o iniciador 4 formou três grupos. Os
resultados obtidos foram analisados pelo sistema NTSYS. O uso de RAPD PCR da forma apresentada revelou ser um
processo mais rápido, barato e eficiente. Foi possível discriminar as 10 amostras de Pseudomonas aeruginosa mostrando,
suas similaridades e perfil de resistência a drogas. As amostras apresentaram perfil de resistência e similaridade genética
e foi possível uma avaliação quanto à contaminação em uma mesma ala e evidenciar a formação de grupos com a
resistência a antibióticos.
Apoio financeiro: FAPITEC-SE, FAPESE, COPGD-UFS e CNPq.
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Ribosomal and functional based analysis
of the diversity of Methylobacterium spp.
from different host plants
Dourado, MN; Andreote, FD; Araújo, WL
Department of Genetics, Universidade de São Paulo, ESALQ/USP, Piracicaba - SP, Brazil
[email protected]
Keywords: Methylobacterium, genetic diversity, 16S rRNA gene, mxaF gene
The genus Methylobacterium is constituted by the PPFMs (pink-pigmented facultative methylotrophic) bacteria. They
can fix nitrogen, nodulate plants, produce cytokinin (plant hormone) and enzymes, such as pectinase and cellulose.
These characteristics make Methylobacterium spp. important species in association with plants. In this context, a few
studies have been conduced to a better understanding of the diversity of this bacterial genus. Therefore the aim of
this study is to analyze the genetic diversity of Methylobacterium spp. isolated from different species by the sequence
analysis of the genes 16S rRNA (ribosomal gene) and mxaF, which codifies for a subunit of the enzyme methanol
dehydrogenase (MDH). In total, 60 isolates of Methylobacterium spp. obtained from 5 different plants species (Coffea
Arabica, Saccharum spp., Citrus spp., Bommeria verticillata, Capsicum annuum) and one hybrid (Eucalyptus grandis x E.
urophyla). After amplification the partial sequence of 16S rRNA and mxaF genes were obtained and further evaluated
by BLASTn analysis against the GenBank database, allowing the determination of Methylobacterium species found in
the collection. Additionally, the sequences were aligned with sequences generated from type strains which represents
the Methylobacterium genus and phylogenetic inferences were constructed using the software MEGA 4 (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis, version 4). Results have shown the partial congruence in the phylogeny of these genes,
with shifts in trees positioning, indicating that some specificity between Methylobacterium and the host plant. The
clustering according to the host plant was observed for a subset of isolates, indicating that deterministic and stochastic
events influence the establishment of interactions between Methylobacterium spp. and plants. In addition it is also
indicated the presence of isolates not related to already described species in this genus. These data shadow light in the
phylogenetic relationship of an important bacterial group by a comparative analysis of sequences from structural and
functional ubiquitous genes.
Apoio Finaceiro: FAPESP (Proc: 04/15414-6).
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Infecções pulmonares associadas
ao Mycobacterium massiliense,
M. bolletii e M. abscessus
Costa, ARF1,2; Lopes, ML1; Lima, EJC3; Conceição, EC4; Lima, KVB1
Instituto Evandro Chagas, Secretaria de Vigilância em Saúde/Ministério da Saúde
2
Núcleo de Medicina Tropical, Universidade Federal do Pará
3
Estudante de Farmácia, Universidade Federal do Pará
4
Estudante de Biologia, Universidade Federal do Pará
1
Palavras-chave: Micobactérias não tuberculosas, infecção pulmonar, Mycobacterium massiliense, M. bolletii, M. abscessus
O gênero Mycobacterium é composto por espécies estritamente patogênicas como os membros do complexo M.
tuberculosis e M. leprae, e demais espécies de patogenicidade variável conhecidas coletivamente como Micobactérias
não tuberculosas (MNT). A classificação taxonômica das MNT pode ser realizada através de técnicas fenotípicas, que
oferecem a distinção de poucas espécies, e por técnicas focadas em características genotípicas, que apresentam elevado
poder discriminativo. A aplicação de técnicas genotípicas tem permitido o reconhecimento de espécies como causa de
doença humana ou reclassificação taxonômica. As MNT de crescimento rápido (MCR), quando associadas a infecção
pulmonar são clinicamente relevantes. Dentre as MCR que causam doença pulmonar, o M. abscessus tem sido relatado
como a espécie mais freqüente. Recentemente, foram descritos M. bolletii e M. massiliense, que apresentam 100% de
similaridade nas sequências do gene do DNAr 16S com M. abscessus, sendo necessária a avaliação de outros alvos como
os genes hsp65 e rpoB para a distinção dessas espécies. O objetivo deste trabalho foi caracterizar espécies estreitamente
relacionadas ao complexo M. chelonae-abscessus através do seqüenciamento parcial do gene hsp65. As cepas foram
obtidas a partir de espécimes clínicos pulmonares encaminhados ao Instituto Evandro Chagas no período de 2004 a
2007. Entre os anos estudados, foram diagnosticados 15 pacientes, suspeitos de tuberculose pulmonar, com infecção
por M. abscessus, identificado pela técnica PCR-restriction enzyme analysis-hsp65. As sequências consenso obtidas
após o seqüenciamento parcial do gene hsp65 de 8 cepas demonstraram similaridade de 100% com M. massiliense (Nº
acesso GenBank EU 266578.1), 5 cepas com similaridade de 99,7% a 100% com M. bolletii (Nº acesso GenBank
EU 266576.1) e 2 cepas com 100% de similaridade com M. abscessus (Nº acesso GenBank AY458075.1). M. abscessus,
M. massiliense e M. bolletii são espécies estreitamente relacionadas, sendo melhor diferenciadas pelo sequenciamento
de regiões genômicas variáveis como os genes hsp65 e rpoB. Como poucos laboratórios dispõem dessa tecnologia, as
infecções causadas por essas espécies podem ser atribuídas incorretamente ao M. abscessus. Esta é a primeira descrição
de M. massiliense e M. bolletii associadas à infecções pulmonares no Brasil. Estudos complementares em nível nacional
serão de relevância na determinação da circulação dessas espécies no Brasil.
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Otimização da STNPCR para detecção do
alvo IS6110 do genoma do Mycobacterium
tuberculosis em amostras de urina e
sangue humanos
Costa-Lima, JF; Montenegro, LML; Montenegro, RA; Melo, FL; Lima, JFA; Schindler, HC
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ. Departamento de Imunologia
Palavras-chave: PCR, genoma do M, tuberculosis, detecção de DNA, sangue, urina
A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) permite a síntese enzimática in vitro de seqüências específicas de DNA
através do uso de dois oligonucleotídeos que hibridizam fitas opostas. Este método está sendo proposto como diagnóstico
laboratorial alternativo para tuberculose pulmonar e extrapulmonar, apresentando a vantagem de ser específica, sensível
e rápida. Com detecção, teoricamente em 24h e sensibilidade de até uma cópia de DNA alvo em uma única célula
micobacteriana. A Single Tube Nested-PCR (STNPCR) é um método que utiliza dois pares de oligonucleotídeos em
duas reações consecutivas, sem abertura dos tubos. Os oligonucleotídeos internos foram previamente fixados no interior
da tampa do microtubo e os oligonucleotídeos externos adicionados aos reagentes para a 1ª reação de amplificação. É
utilizada nos casos em que se requer alta sensibilidade e especificidade. O alvo molecular utilizado foi à seqüência de
inserção IS6110, específica do complexo Mycobacterium tuberculosis. Foram realizados testes de especificidade com DNA
genômico extraído de cepa de referência de M. tuberculosis (H37Rv), outras cepas de micobactérias e DNA humano.
Para determinar o limite de detecção da técnica, foram realizadas curvas de diluição seriadas, fator 10, utilizando DNA
genômico purificado de M. tuberculosis (H37Rv), o DNA genômico diluído em amostras de sangue e urina coletados
de humanos sadios e também diluições seriadas, fator 10, de bacilos crescidos em meio Lowestein-Jensen, a partir do
tubo 1 da escala de McFarland. As amostras de urina foram processadas pelo método de Petroff e todas as amostras
foram submetidas à extração do DNA genômico para análise pela técnica. A 1ª reação de amplificação da STNPCR
foi realizada a 92ºC por 1 minuto, 57ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto durante 15 ciclos e a 2ª reação foi a
92ºC por 1 minuto, 57ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto durante 45 ciclos. No término da 1ª amplificação,
os tubos foram retirados do termociclador e os microtubos homogeneizados, para que os oligonucleotídeos internos
participassem da 2ª reação. Os amplicons produzidos foram de 409pb e 316pb, nas 1ª e 2ª reações, respectivamente.
A técnica foi capaz de detectar apenas DNA de cepa do complexo Mycobacterium tuberculosis. A menor quantidade
detectada pela técnica de STNPCR foi de 0.0001fg, 1000fg, 0.01fg de DNA, utilizando DNA genômico purificado,
DNA diluído em amostras de sangue e urina, respectivamente. Foi detectada a quantidade de até 3x102bactérias/ml em
sangue e urina pela STNPCR. A técnica demonstrou ser específica, sensível e rápida nos experimentos preliminares,
necessitando ser avaliada em amostras clínicas de pacientes com tuberculose confirmada pelos métodos convencionais
utilizadas para a confirmação da doença e em indivíduos sem tuberculose.
Apoio financeiro: CPqAM/FIOCRUZ, PDTIS/FIOCRUZ, ICOHRTA, FACEPE.
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Ensaio de Viabilidade Molecular
de M. leprae através da técnica de PCR
Martinez, AN1,2; Lahiri, R2; Williams, D2; Moraes, MO1
1
Laboratório de Hanseníase, Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ
Molecular Biology Research Dept., National Hansen’s Disease Programs, Laboratory Research Branch, LSU, USA
2
Como conseqüência do longo tempo de geração do M. leprae a hanseníase é a doença que apresenta um dos maiores
períodos de incubação já descritos. Trata-se de uma doença de apresentação espectral onde formas paucibacilares (PB),
consideradas pouco infectivas e multibacilares MB, consideradas muito infectivas, são observadas. A determinação
da viabilidade do M. leprae é extremamente difícil devido a impossibilidade do cultivo in vitro dessa micobactéria.
Atualmente, testes moleculares como PCR para detecção específica do DNA de M. leprae eventualmente presente em
amostras clínicas vêm sendo utilizados, em pequena escala, para elucidação de casos de difícil diagnóstico. Porém,
especialmente em pacientes PB, a técnica de PCR desenhada para a detecção de DNA, apresenta uma limitação
importante no que diz respeito à impossibilidade de fazer a distinção entre organismos viáveis e não viáveis. Além
disso, ensaios de viabilidade convencionais como a radiorespirometria e Baclight requerem grandes quantidades de
bacilos para a detecção se comparados a metodologia de PCR. É nesse sentido, que estabelecemos um ensaio de RTPCR em tempo real (sodA e 16S rRNA) para a determinação da viabilidade do M. leprae. A tecnologia FastPrep/Trizol
foi utilizada para purificar RNA micobacteriano. Resultados demonstraram que esse ensaio foi capaz de detectar a
queda da viabilidade em M. leprae tratado com rifampicina após 48 horas. Ainda, o mesmo foi capaz de detectar a
queda da viabilidade induzida pela morte imunológica quando macrófagos foram ativados com IFN-γ e infectados
com M. leprae. Por último, a avaliação de amostras de pacientes MB acompanhados durante dois anos (antes, após
um e dois anos de tratamento) demonstrou queda da viabilidade ao longo do curso do tratamento e uma correlação
significativa com o IB (p < 0,001). Desse modo, através desse ensaio, esperamos poder responder algumas perguntas
relativas à epidemiologia e imunopatogênese da doença tanto em pacientes MB quanto em PB, bem como, em contatos
domiciliares desses pacientes.
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Comparison of different PCR protocols,
standardization and validation of a
straightforward PCR method for molecular
detection of mycoplasma in Yellow Fever
vaccine produced in Bio-Manguinhos/FIOCRUZ
Ferreira, RL1; Santos, JPS1; Yoshida, CH1; Lourenço, SLS1; Guimarães, RC2; Brum, RC1; Ferreira, FC1; Hokama, DA1;
Rosendo, EN3, Caride, E4
Laboratory of Microbiologic Control, Department of Quality Control, Bio-Manguinhos, FIOCRUZ
Laboratory of Metrology and Validation, Department of Quality Assurance, Bio-Manguinhos, FIOCRUZ
3
Laboratory of Ornitopathology, Department of Veterinary, Universidade Federal Fluminense
4
Laboratory of Virological Technology, Vice-Directory of Technological Development, Bio-Manguinhos, FIOCRUZ
[email protected]
1
2
Keywords: Mycoplasma, PCR, quality control
The Institute of Technology in Immunobiologicals - Bio-Manguinhos/FIOCRUZ is one of the most important
immunobiological production centres in Latin America. Among the vaccines produced by Bio-Manguinhos is the yellow
fever vaccine, produced in specific pathogen free (SPF) embryonated eggs, certified by both Brazilian National Regulatory
Authority (ANVISA) and World Health Organization (WHO) to meet the Brazilian Ministry of Health and United
Nations Agencies’ demand. According to WHO, vaccines produced for human use must demonstrate the absence of
Mycoplasma orale and Mycoplasma pneumoniae. Also when poultry material is used during the production, the absence
of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae is also necessary. Mycoplasma is a fastidious microorganism of
difficult detection through culturing, whose method lasts 35 days, according to WHO requirements. Assays described
by different research groups throughout the world amplifying fragments of the 16S rRNA gene region were assessed
on spiked intermediate products of yellow fever vaccine. An alternative method was submitted to parameter analysis
in order to provide extra optimization for the assay in our products. In order to demonstrate that the test is adequated
for the proposed goal, 286 samples were used in a validation of the PCR methodology. We demonstrated absence
of unspecific amplification with the tested intermediate products or with other microorganisms not related to the
Mollicutes class. Also, a detection level of as low as 12.5 colony forming units (CFU) was established. The specificity
towards different microorganisms as well as negative controls was confirmed. An outcome of 100% was achieved for
specificity, sensitivity, and the contingency table, validating thus a new molecular protocol for mycoplasma detection
on Yellow Fever vaccine. As far as we know, this is the first methodology reported to employ a molecular approach
towards detection of Mycoplasma spp. in quality control of the Yellow Fever vaccine production.
Financial support: Bio-Manguinhos/FIOCRUZ.
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Identificação e caracterização de ilhas
genômicas em bactérias do gênero
Mycoplasma
Rocha, PKL1; Rangel, LTLD1; Monteiro-Vitorello, CB2; Araújo, DAM1; Rêgo, TG3
Laboratório de Bioinformática, Departamento de Biologia Molecular, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal da Paraíba
2
Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC
3
Laboratório Nacional de Computação Científica
1
Palavras-chave: Transferência horizontal, ilhas genômicas, Mycoplasma, evolução, bioinformática
As ilhas genômicas compreendem regiões do genoma, as quais são potencialmente adquiridas via transferência horizontal.
Elas podem ser classificadas como ilhas de: patogenicidade, secreção, resistência, simbiose ou metabólicas (Hacker
e Kaper, 2000; Hentschel e Hacker, 2001; Hentschel et al., 2000). Os genes transferidos podem ser identificados
através de características distintas do resto do genoma, como a quantidade de bases guanina (G) e citosina (C), o uso
de códons e de aminoácidos (Hsiao et al., 2003; Karlin, 2001; Lio e Vannucci, 2000). Regiões encontradas utilizando
essas três metodologias foram consideradas ilhas genômicas. Elementos comumente associados à transferência horizontal
(tRNAs, transposases, integrases, fagos e sequências de inserção) foram identificados para validar às análises. Nesse
trabalho realizamos análise de ilhas genomicas em organismos pertencentes ao gênero Mycoplama. Entre as espécies
deste gênero estão aquelas com o menor genoma já completamente seqüenciado. Entre as espécies estudadas estão: M.
agalactiae PG2, M. capricolum subsp. capricolum ATCC 27343, M. genitalium G37, M. gallisepticum R., M. pulmonis
UAB CTIP, M. penetrans HF-2, M. mobile 163K, M. pneumoniae M129, M. synoviae 53, M. hyopneumoniae 232, M.
mycoides subsp. mycoides Sc str. l, M. hyopneumoniae 7448 e M. hyopneumoniae J, sendo as três últimas seqüenciadas no
Brasil pelo Projeto Genesul (Vasconcelos et al., 2005). nós encontramos um total de 55 ilhas genômicas. Muitas destas
apresentam proteínas hipotéticas compartilhadas por vários organismos não pertencentes ao gênero Mycoplasma. Em
M. genitalium e em M. hyopneumoniae J foi identificada uma proteína hipotética com um domínio conservado (YqaJ)
característico da família de recombinases virais, sugerindo que essa proteína tenha sido adquirida por meio de um fago
(Myers et. al, 2003). Muitas lipoproteínas e proteínas transmembranas do tipo ABC foram localizadas em diferentes
espécies de Mycoplasma, sugerindo uma relação com ilhas de resistência (Herrman, 1996). Foram encontradas ainda
proteínas que apresentam domínio conservado da família Sec. Hemaglutininas, proteínas do capsídeo viral, foram
localizadas em M. pneumoniae e M. penetrans (Blanchard et. al, 2001). A maioria das ilhas eram antecedias, sucedidas
ou continham elementos típicos de transferência horizontal, sendo destes os mais comuns tRNAs e transposases. Nós
concluimos que a análise das proteínas fornecem maior base para inferirmos que estas regiões encontradas podem ter
sido adquiridas via transferência horizontal.
Suporte financeiro: CNPq.
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Diversidade de bactérias fixadoras de
nitrogênio simbiontes dos nódulos de
Mimosa arenosa e M. ophthalmocentra
Santos, HRM1; Gross, E2
Mestranda em Genética e Biologia Molecular PPGGBM/UESC
2
Professor DCAA/UESC
[email protected]
1
Palavras-chave: Leguminosas, Mimosoideae, Diversidade de bactérias simbióticas
O gênero Mimosa pertence à família das leguminosas, subfamília Mimosoideae, e é formado por cerca de 480 espécies, em
sua maioria de distribuição neotropical, especialmente no Brasil (LEWIS, 1987). Muitas destas plantas são utilizadas na
reabilitação de solos degradados por sua agressividade e capacidade de se desenvolver em condições edáficas adversas(DE
FARIA; LIMA, 1998). Essas características são em parte devido à simbiose com rizóbios, bactérias fixadoras de nitrogênio
simbiontes, que ocorre através da formação de nódulos caulinares e radiculares. Os nódulos de leguminosas apresentam
grande diversidade anatômica e morfológica, entretanto, podem ser classificados, basicamente, em dois tipos: os
determinados e os indeterminados, que diferem pela presença de meristema permanente nesse último. Atualmente, as
informações taxonômicas sobre bactérias são em grande parte fornecidas através da biologia molecular e manipulação
do DNA. Nos estudos com rizóbio, têm-se observado uma utilização crescente da técnica de PCR (polymerase chain
reaction) e o seqüenciamento da subunidade menor do DNA ribossômico (16S rDNA). A análise de diferentes tipos
de isolados, pode ser realizada através da comparação das seqüências obtidas com o banco de genes (GenBank, p. ex.)
buscando alinhamentos significativos. O presente estudo isolou bactérias dos nódulos de Mimosa ophthalmocentra Mart.
ex Benth e M. arenosa Willd. e caracterizou morfo-anatomicamente essas colônias bacterianas. O DNA genômico
desses isolados foi extraído, amplificado e seqüenciado com o intuito de identificar através do 16S rDNA as bactérias
simbiontes. Amostras de nódulos de Mimosa ophthalmocentra e M. arenosa foram coletados na Estação Ecológica do
Raso da Catarina (BA) e as bactérias do interior dos nódulos foram isoladas e crescidas em meio de cultura 79 sendo
a morfo-anatomia das colônias avaliadas 72 h após o isolamento. O DNA cromossômico dos rizóbios foi extraído e
a região que codifica o 16S rRNA amplificada e seqüenciada. As seqüências confirmadas nas direções 3´ e 5´ foram
submetidas ao banco de genes (GenBank) e comparadas com outras buscando alinhamentos significativos. A grande
maioria das colônias bacterianas isoladas apresentou coloração amarela, brilhante, com bordas inteiras, com produção
de mucopolissacarídeos e tiveram crescimento rápido (24 -48 h). No total foram seqüenciados 5 isolados de M. arenosa
e 9 isolados de M. ophthalmocentra. Os isolados apresentaram seqüências consenso com aproximadamente 400 pares de
bases e através de BLAST tiveram alinhamentos significativos com o gênero Burkholderia. Essas betaproteobactérias têm
grande versatilidade nutricional e apresentam resistência a antibióticos produzidos por outros microrganismos, ao que se
soma sua capacidade de síntese de enzimas pectolíticas, úteis na invasão dos tecidos vegetais, lhes conferindo vantagens
competitivas (WILLENS; COLLINS, 1993). Os resultados do presente estudo confirmam a ampla distribuição do
gênero Burkholderia como nodulante de Mimosa em diferentes biomas.
Apoio financeiro: FAPESB E UESC.
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Diversidade da comunidade bacteriana
endofítica associada aos propágulos de
mangue vermelho (Rhizophora mangle)
Holanda, FMC1; Ferreira, AJ1; Pitombo, MB1; Alves, FHL1; Lacava, PT2; Araújo, WL1
Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, SP, Brasil
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP, Brasil
[email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: Manguezais, Sequenciamento, 16S RNAr, Sazonalidade, Endófitos
O manguezal é um ambiente de importância econômica e social, por ser o habitat de peixes e caranguejos endógenos a
este ambiente, que são comercializados pela comunidade pesqueira que vive em seu entorno. Nesse hábitat, as plantas
podem interagir de uma forma neutra, mutualística ou antagônica com microrganismos. Entre estes microrganismos,
encontram-se aqueles denominados de endófitos, os quais colonizam os tecidos sadios das plantas, em algum ciclo
de sua vida, sem lhe causar danos aparentes ou estruturas externas visíveis. Desta forma, este trabalho objetivou
isolar bactérias endofíticas do caule e da raiz de propágulos de Rhizophora mangle e avaliar sua diversidade por meio
do sequenciamento do 16S RNAr, sendo as amostragens feitas em duas épocas do ano. O isolamento de bactérias
endofíticas revelou uma densidade média bacteriana do caule de 10,26 a 39,61 x 10³ UFC.g caule-1, enquanto que na
raiz esta densidade variou entre 8,36 a 58,02 x 10³ UFC.g-1. A variação sazonal foi observada apenas para a comunidade
endofítica da raiz, possivelmente devido a um efeito relacionado com alterações no regime de chuvas do local. Em
relação à identificação das bactérias isoladas dos propágulos de Rhizophora mangle, os dados permitem definir esta
comunidade como composta pelos gêneros Bacillus, Enterobacter, Mangroveibacter, Pandoraea, Pantoea, Pseudomonas,
Stenotrophomonas e Tsukamurella. Este trabalho mostra que a densidade bacteriana endofítica em propágulos de R.
mangle é responsiva a fatores ambientais, e nomeia os principais gêneros cultiváveis encontrados neste nicho.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPQ.
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Caracterização genética de bactérias da
rizosfera de cana-de-açúcar utilizando a
técnica de ARDRA
Andrade, PAM1; Dias, ACF2; Andreote, FD2; Marcon, J2; Pizzirani-Kleiner, AA2; Araújo, WL2; Kuklinsky-Sobral, J1
1
Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
[email protected]
2
Palavras-chave: cana-de-açúcar, diversidade microbiana, ardra, bactérias, solo
Os microrganismos apresentam imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de
ecossistemas, como componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoquímicos. Além disso, representam
uma fonte de recursos naturais de fácil manipulação em laboratório, que tem sido usada para o entendimento da natureza
de processos vitais, tratando de problemas relacionados à medicina, agricultura e industria. Além disso, tem um papel
importante na fertilidade de solos. Apesar de sua grande importância, o número de grupos microbianos conhecidos e
descritos (diversidade de espécies) representa apenas pequena fração da diversidade microbiana encontrada na natureza.
A evolução das metodologias de biologia molecular e da bioinfomática, aplicadas ao estudo do meio ambiente, tem
contribuído significativamente para o avanço do conhecimento sobre a diversidade microbiana. Neste contexto, a
técnica de ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), que é baseada no princípio de que os sítios de
restrição no rDNA são conservados de acordo com padrões filogenéticos, tem sido utilizada no estudo da diversidade
microbiana associada a vegetais ou a diferentes solos. Desta forma, o presente trabalho teve o objetivo de analisar a
diversidade genética de bactérias associadas à cana-de-açúcar por meio da técnica de ARDRA, com a utilização de três
enzimas de restrição. Foram analisadas 23 bactérias isoladas da rizosfera de plantas de cana-de-açúcar (transgênica e
convencional), pertencentes à coleção do Laboratório de Genética de Microrganismos da ESALQ/USP. O gene do
16S rRNA foi amplificado, por PCR, e clivado com as enzimas de restrição MboI, HhI e HaeIII, separadamente. A
amplificação do 16S rDNA, com primers universais para bactérias, produziu uma banda única em torno de 1350 pb
para todas as linhagens testadas, mostrando não haver polimorfismo nesta característica. Os produtos de PCR clivados
com as enzimas de restrição geraram fragmentos com tamanho variando entre 100 e 1000 pb que foram considerados
na análise. De acordo com o padrão de clivagem, foi possível observar de 1 a 6 fragmentos por enzima de restrição,
com 15 perfis para a enzima MboI, 13 para HhI e 15 para HaeIII. A combinação dos padrões de restrição permitiu a
distinção de 23 haplótipos, não havendo relação entre a origem dos isolamentos. Contudo, avaliando individualmente
os perfis das enzimas, foi possível observar alguns perfis exclusivos e alguns comuns em relação à origem das linhagens
bacterianas. As próximas etapas do trabalho serão aumentar o número de enzimas de restrição e identificar as linhagens
por meio do sequenciamento do gene do 16S rRNA.
Apoio financeiro: CNPq.
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Prospecção do gene acdS em rizobactérias
isoladas de plantas do semi-árido
Oliveira, LKX1,2; Moitinho, BM1; Almeida, AS1; Roque, MRA1
1
Departamento de Ciências Biológicas, LAMASP - Universidade Estadual de Feira de Santana
Parte da dissertação de mestrado defendida no curso de Pós-graduação de Biotecnologia UEFS/FIOCRUZ
[email protected]
2
Palavras-chave: Bioprospecção, ACC Deaminase, Rizobactérias, Plantas Endêmicas, Semi-árido
Os microrganismos benéficos presentes no solo desempenham diversas funções no equilíbrio do ecossistema e na
ciclagem de nutrientes, dentre as atividades envolvidas na proteção de plantas, rizobactérias promotoras do crescimento
de plantas (RPCPs) podem auxiliar ou induzir o crescimento de plantas e diminuir ou prevenir efeitos danosos de
fitopatógenos. Muitas RPCPs produzem a enzima ACC deaminase que metaboliza o ácido 1-amino-ciclo-propano1-carboxílico (ACC) em -ketobuterato e amônia, um precursor do etileno na planta. Esta inibição da produção
de etileno pode estar relacionada com um maior alongamento da raiz, induzido pelo aumento da concentração por
indução da produção de ácido indol acético (AIA). Este processo está relacionado com um aumento na tolerância
de plantas ao estresse salino, viabilizando o cultivo de plantas sensíveis em solo com alta salinidade. As linhagens
bacterianas isoladas e purificadas da rizosfera de Starchytarpheta crassifolia subsp. crassifolia, foram utilizadas para testes
em gradiente de salinidade e quatro linhagens foram selecionadas para a caracterização molecular e prospecção do gene
da ACC deaminase. Uma linhagem bacteriana do gênero Bacillus spp. foi utilizada para a prospecção do gene acdS
(acc deaminase) e analisada in silico quanto a aspectos filogenéticos. Foi observado a primeira anotação de acdS para
o referido gênero. A seqüência da enzima ACC deaminase, obtida neste trabalho, foi comparada com seqüências de
diferentes espécies depositadas no banco de dados NCBI e demonstrou ser filogeneticamente próxima de Pseudomonas
putida e Achromobacter xylosoxidans.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESB.
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Novas espécies de rizoactérias
promotoras de crescimento vegetal no Rio
Grande do Sul, Brasil
Beschoren, P1; Beneduzi, A1; Campos, S1; Passaglia, LMP1
Departamento de Genética, Universidade federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
Palavras-chave: Inoculação, Bacilos, Trigo, Arroz, Lavouras
O estudo de populações de bactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPB, do inglês Plant Growth Promoting
Bacteria) de solos tem atraído grande interesse devido à resposta positiva das plantas à inoculação de algumas linhagens.
O objetivo deste trabalho foi o isolamento e a caracterização de bacilos que possam agir como PGPBs para as lavouras de
arroz e trigo. De regiões do RS produtoras dessas culturas foram coletadas amostras da rizosfera das plantas. As linhagens
bacterianas foram isoladas e submetidas à PCR do gene nifH e à quantificação da fixação biológica de nitrogênio (FBN).
As bactérias isoladas também foram testadas quanto à produção de ácido indolacético (AIA), sideróforos e solubilização
de fosfato. Duas amostras, SB_R5 (isolada da rizosfera de trigo de São Borja) e SVP_R30 (isolada da rizosfera de arroz
de Santa Vitória do Palmar) destacaram-se das demais. Essas bactérias apresentaram uma maior produção de AIA (269,
4 e 68, 27µg AIA. ml-1, respectivamente), amplificação do gene nifH, com uma atividade de FBN de 6, 8 e 12, 8 µg
N. ml-1, respectivamente, produção de sideróforos e solubilização de fosfato. Através de caracterização bioquímica
esses isolados produziram ácidos de vários carboidratos, catalase, se multiplicaram em pH 10, hidrolisaram amido,
apresentaram motilidade e reduziram nitrato à nitrito. Diferentemente do isolado SB_R5, o isolado SVP_R 30 também
produziu a enzima urease, se multiplicou na presença de 5% NaCl, em temperaturas elevadas (entre 40°C - 50°C),
hidrolisou amido, caseína e esculina. O seqüencimento parcial do gene 16S rDNA destas bactérias revelou que elas
correspondem a duas novas espécies de bacilos: SB_R5 pertencente ao gênero Paenibacillus sp. e SVP_R30 pertencente
ao gênero Bacillus sp. Experimentos de inoculação em casa de vegetação revelaram que as linhagens apresentaram
resposta positiva em plantas de arroz, aumentando significativamente suas raízes e partes aéreas.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Análise de polimorfismo do espaço
intergênico 16-23S DNAr de Sphingomonas
spp. oriundas de arroz
Videira, SS1; de Araujo, JLS 2; Baldani, JI2; Baldani, VLD2
Instituto de Agronomia, CPGA-CS, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
2
Embrapa Agrobiologia - CNPAB
[email protected]
1
Palavras-chave: Espaço intergênico 16-23S DNAr, PCR, RFLP, Diversidade, Sphingomonas spp
Bactérias do gênero Sphingomonas (subdivisão alfa da classe Proteobacteria) são bacilos gram-negativos com mais de 50
espécies descritas (Yabuchii e Kosako, 2005). As espécies S. paucimobilis, S. trueperi e S. azotifigens são freqüentemente
encontradas em associação com arroz, sendo S. azotifigens a única espécie do gênero descrita como fixadora de nitrogênio.
Este trabalho teve o objetivo de estudar a diversidade entre 23 isolados de Sphingomonas spp. oriundos de plantas de
arroz cultivadas em solos do RJ e Goiás por meio da análise de restrição do espaço intergênico 16S-23S DNAr. A
amplificação por PCR dessa região mostrou a presença de um único fragmento de aproximadamente 1.000 pares de
bases (pb) para as espécies S. paucimobilis, S. trueperi e S. azotifigens e de dois fragmentos com tamanhos que variaram
entre 800 e 1.000 pb para os 23 isolados. Uma análise conjunta dos perfis gerados pela restrição com as endonucleases
RsaI, AluI, Hae III e MspI mostrou a formação de dois grandes grupos a 70% de similaridade e de quatro subgrupos com
75% de similaridade. Um primeiro subgrupo é formado por 7 isolados obtidos de plantas crescidas em solo originário
do RJ enquanto que o segundo é formado exclusivamente pela espécie S. trueperi. O terceiro subgrupo é formado pela
maioria dos isolados de ambos os solos enquanto que o quarto é formado por 4 isolados e pela espécie S. azotifigens. A
análise da região intergênica mostrou uma diversidade relativamente alta entre os isolados sendo que a origem do solo
influenciou na formação dos agrupamentos gerados.
Apoio: CNPq, FAPERJ, CAPES, CPGA-CS, EMBRAPA-CNPAB.
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Tipagem molecular de amostras de
Staphylococcus aureus utilizando a técnica de
Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Lopes, TF1; Andrade, ACM1; Silva, WRT1; Costa, RV1; Trindade, CMR1; Assis, HS1; Santana, TMB1; Carneiro, MRP1; Cândido, AL1
Departamento de Morfologia, Universidade Federal de Sergipe
[email protected]
1
Palavras-chave: MRSA, RAPD, genotipagem, tipagem molecular, Staphylococcus aureus
Vários métodos têm sido desenvolvidos para a tipagem molecular de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina
(MRSA). A técnica ideal deve ter um custo acessível, simples execução e resultados com poder de discriminação
satisfatório. Este estudo teve o objetivo de genotipar amostras de MRSA, isoladas de diversas fontes, através da técnica
de Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Tal técnica tem sido frequentemente utilizada devido a sua rapidez
e eficiência. Foram utilizadas quatro amostras de Staphylococcus aureus da bacterioteca do Laboratório de Virologia
Comparada – DMO/CCBS/UFS (isoladas de alimentos), cinco isoladas no Hospital de Urgências Governador João
Alves Filho e uma amostra padrão. Para realizar as reações RAPD, três iniciadores do sistema Ready-to-go (Amersham
Biosciences) foram usados, P2 - GTTTCGCTCC, P3 – GTAGACCCGT e P4 – AAGAGCCCGT. Uma mistura
constituída de 2,5 µL de Tampão PCR (30 mM de KCl e 10 mM de Tris-HCl pH 8.3), 0,75 µL de MgCl2 (3 mM),
16,9 µL de água DEPC, 3 µL do iniciador (15 pmol), 0,6 µL de dNTPs (0,4 mM), 0,25 µL de Taq DNA polymerase
(0,25 U) foram distribuídos em tubos de 200 µL. Os tubos foram aquecidos em um termociclador a 95ºC (PTC-100
Peltier Thermal Cycler) por 5 minutos antes da adição de 0,25 µL de Taq DNA polymerase. Seguiram-se 40 ciclos a
94°C por 30 segundos, 35°C por 1 minuto e 72°C por 2 minutos. Depois dos ciclos, foi realizada a extensão final por
5 minutos a 72°C. Os produtos amplificados foram separados por eletroforese em gel de agarose 2% a 100 volts por
45 minutos e visualizados. Após análise computacional pelo programa NTSYS foi possível discriminar as 10 amostras
de Staphylococcus aureus mostrando que são geneticamente diversas. Ao grupar as amostras de Staphylococcus aureus,
não foi observado relacionamento epidemiológico molecular entre as amostras hospitalares e isoladas de alimentos.
A investigação por RAPD é uma ferramenta eficiente para discriminação de amostras podendo ser considerado um
método auxiliar para genotipagem.
Apoio financeiro: FAPITEC-SE, FAPESE, COPGD-UFS e CNPq.
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Caracterização fenotípica e genotípica de
cepas de Staphylococcus aureus meticilina
resistente (MRSA) na região
de Oeste do Paraná
Santos, LL1; Vendruscolo, ECG1; Viana, C1; Hilgert, AR1; Berger, J1; Martins, PK2
Laboratório de Genética,Universidade Federal do Paraná-Campus Palotina
2
Coodetec, Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola Ltda
[email protected]
1
Palavras-chave: MRSA, tipagem molecular, S.aureus
Staphylococcus aureus é um dos microrganismos responsáveis por grande morbidade e mortalidade tanto no homem
quanto em animais. Atualmente cepas multirresistentes são responsáveis por diversos surtos em todo o mundo e o
arsenal terapêutico tem ficado cada vez mais escasso. Como o tratamento dessas doenças infecciosas tem se tornado
cada vez mais difícil, é necessário conhecer profundamente sua epidemiologia a fim de podermos estabelecer planos
de controle e prevenção. Staphylococcus aureus, tanto os sensíveis como os resistentes à meticilina, podem habitar as
narinas anteriores das pessoas, especialmente aquelas que convivem diariamente em ambiente hospitalar. Na Medicina
Veterinária, esse assunto é ainda bastante recente e o número das cepas isoladas tem aumento freqüentemente. Em vista
disso, esta pesquisa teve como objetivo tentar conhecer uma possível colonização da equipe que trabalha no hospital
veterinário da UFPR e assim o perfil epidemiológico dessas cepas. Nesse trabalho 68 amostras foram coletadas das
narinas de componentes da equipe clínica, alunos e funcionários do Hospital Veterinário. Os swabs foram semeados
em meio agar sal manitol e agar sangue e incubados a 35-37oC por 24 horas. Os isolados constituídos por cocos Gram
positivos foram submetidos os testes da catalase em lâmina, coagulase em tubo e prova do VP para confirmação do
agente. A caracterização fenotípica quanto à sensibilidade aos antimicrobianos foi realizada pelo método de disco difusão
em meio sólido (agar Mueller-Hinton) para vários antibióticos (amicacina, cefepime, clindamicina, cloranfenicol,
eritromicina, norfloxacina, oxacilina, penicilina G, sulfazotrim, tetraciclina e vancomicina). Dessas 68 amostras 22
foram identificadas como S. aureus (32%) e o antibiograma evidenciou uma cepa resistente (4.5%) e três intermediárias
à oxacilina (13.6%). A caracterização fenotípica tem algumas restrições como o tempo necessário para a obtenção dos
resultados, a necessidade de bactérias viáveis, a interferência de outros microorganismos e de fatores ambientais do
meio de cultura que podem gerar resultados imprecisos. Métodos moleculares como o multiplex PCR podem reduzir o
tempo de obtenção de resultados e aumentar o grau de confiabilidade dos mesmos. Neste trabalho estão sendo usados
três pares de primers para a amplificação dos genes: mecA (específico para a resistência à oxacilina), Coa (específico para
S. aureus) e ribossomal 16S universal de bactérias. Os resultados a serem obtidos permitirão a confirmação dos dados
da caracterização fenotípica, além de possibilitar a distinção de indivíduos portadores de MRSA o que, contribuirá
para um melhor monitoramento, tomada de medidas para a prevenção da disseminação do agente e implantação de
práticas higiênicas mais adequadas dentro do Hospital Veterinário.
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Análise da capacidade de mobilização do
plasmídio bacteriocinogênico pRJ9
de Staphylococcus aureus
Coutinho, BG; Coelho, MLV; Bastos, MCF
Instituto de Microbiologia, Departamento de Microbiologia Geral, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: Mobilização, Plasmídio, Bacteriocina, Conjugação, S. aureus
O pRJ9 (10,4 kb) é um plasmídio bacteriocinogênico que codifica a aureocina A53. Este plasmídio está originalmente presente
na estirpe de S. aureus A53, que foi isolada de leite comercial, juntamente com outras estirpes de S. aureus, também produtoras
de bacteriocina, como a aureocina A70, codificada pelo pRJ6 (8,0 kb). Esses dois plasmídios apresentam uma grande região
de homologia de 2,6 kb, onde estão presentes os genes associados a processos de mobilização plasmidial. Entretanto, o pRJ6
apresenta quatro genes mob (mobA, mobB, mobC e mobD), enquanto o pRJ9 possui apenas três (mobA, mobB e mobC).
Além disso, em experimentos anteriores, apenas foi possível se detectar mobilização do plasmídio pRJ6 e não do pRJ9.
O objetivo do presente trabalho é verificar se as funções mob do pRJ9 são passíveis de complementação pelas funções
mob do pRJ6 e descobrir se o gene mob ausente no pRJ9 é o responsável pela sua incapacidade de mobilização.
Para se alcançar esse objetivo, foi construída uma estirpe portadora do pRJ6, do pRJ9::Tn551 (pRJ14; resistência à
eritromicina - Emr) e do plasmídio conjugativo pGO1 (resistência à gentamicina -Gmr), chamada de MB367, que
serviria como doadora em ensaios de conjugação. Como receptora, foi utilizada a estirpe MB91 [resistente à rifampicina
(Rifr) e ao ácido fusídico (Fusr) (mutações espontâneas)]; tal estirpe é resistente à ação das aureocinas A70 e A53.
Foram realizados experimentos de conjugação envolvendo as estirpes MB367 e MB91 Rifr Fusr, visando a detecção da
mobilização do pRJ14, auxiliado in trans pelas funções mob do pRJ6. Esses experimentos geraram colônias Emr, Fusr
e Rifr, e que possuíam apenas um plasmídio com o tamanho do pRJ14, visualizado após extração de DNA plasmidial
e eletroforese em gel de agarose. Este resultado demonstra que há mobilização do pRJ14 na presença do pRJ6.
Para se determinar se o gene mobD ausente no pRJ9 é o responsável pela sua incapacidade de mobilização, foram
desenhados oligonucleotídios iniciadores que foram utilizados em reações de PCR, amplificando, desse modo, o gene
mobD. Esse gene será, então, clonado em um vetor de expressão. A região mob do pRJ9 também será clonada em um
vetor, pois desse modo, não teremos a interferência da bacteriocina na escolha da estirpe receptora para os experimentos
de conjugação. Essas duas construções serão colocadas em uma mesma estirpe, juntamente com o pGO1 e, então,
testaremos a capacidade de mobilização do vetor que possui a região mob do pRJ9, na presença da proteína MobD
super-expressada.
Apoio Financeiro: CNPq, PRONEX, FAPERJ.
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Detecção de resistência a antimicrobianos
por testes fenotípicos e genotípicos
em Staphylococcus aureus
Faria, RCB1; Barbosa, DB1; Amaral, IMR1; Vieira, CU1; Valverde, BT1; Moreira-Neto, JF1; Pereira, BB1; Terra, APS2; Bonetti, AM1
Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, Universidade Federal de Uberlândia/MG
2
Departamento de Clínica Médica, Laboratório Central, Universidade Federal do Triângulo Mineiro/MG
[email protected]
1
Palavras-chave: Staphylococcus aureus, resistência antimicrobiana, gene mecA, RAPD
Staphylococcus aureus resistentes a múltiplos antibióticos representam um grande problema no controle das infecções
hospitalares. O perfil de resistência a antimicrobianos de isolados de S. aureus presentes em cateteres vasculares central de
pacientes internados em leitos do centro de terapia intensiva do Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo
Mineiro foi avaliado por meio de testes antimicrobianos, pelos quais foi possível detectar um elevado nível de resistência
à penicilina (94,7%) e ampicilina (86,8%), considerando-se somente as amostras que possuíam resistência, além de uma
cepa resistente à vancomicina. A avaliação da resistência à oxacilina foi confirmada por PCR através da presença do gene
mecA. A associação dos resultados obtidos no teste fenotípico com a presença do gene mecA, considerado um método de
referência, foi confirmada através da Tabela de Contingência e do Teste de Χ2 com correção de Yates. Em 49 amostras
avaliadas, 23 apresentaram resistência à oxacilina, sendo possível detectar a presença do gene de resistência mecA em
21 amostras. O teste de tipagem molecular por RAPD permitiu a separação dos grupos fenotípicos em dois padrões
diferentes de agrupamento, os que possuíam resistência e os sensíveis aos antimicrobianos, com uma dissimilaridade de
73,3%. Há maior similaridade genética entre grupos que apresentam o mesmo tipo de resistência, confirmando assim
as análises fenotípicas. Marcadores moleculares para detecção de resistência à oxacilina, como o gene mecA, foram mais
sensíveis que os marcadores fenotípicos.
Apoio Financeiro: CAPES, FAPEMIG e UFU.
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Análise proteômica da formação de biofilme
em Staphylococcus haemolyticus
Barros, EM1; Kruger, WMAV2; Bisch, PM2; Giambiagi-de-Marval, M1
Departamento de Microbiologia Médica, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro
2
Unidade Multidisciplinar de Genômica, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: análise proteômica, biofilme, Staphylococcus haemolyticus
Diversas infecções graves estão associadas à formação de biofilme em dispositivos médicos invasivos, cada vez mais
utilizados na medicina moderna. Nestes instrumentos forma-se uma comunidade estruturada de microrganismos que
fica embebida em uma matriz composta por polímeros que as próprias células produzem. Isto contribui para resistência
das bactérias aos efeitos dos antibióticos e ao ataque do sistema imune. Várias espécies de Staphylococcus apresentam
capacidade de formar biofilme. Entretanto os estudos estão centrados sobre S. aureus e S. epidermiidis. Este trabalho se
propõe a estudar os mecanismos moleculares envolvidos na formação de biofilme no patógeno oportunista S. haemolyticus,
através da análise proteômica de células formadoras de biofilme e de células planctônicas. Inicialmente a habilidade
da formação de biofilme na cepa seqüenciada S. haemolyticus JSCS1535 foi avaliada em microplacas de poliestireno.
Foram utilizados os meios TSB e BHI suplementados ou não com glicose ou NaCl. Observou-se produção máxima em
meio BHI com 1% de glicose. Diferentes concentrações dos cátions divalentes como Ca2+, Fe2+ e Mn2+, também foram
testados. Concentrações maiores que 0,4 mM de Ca2+ e 0,1 mM de Mn2+ foram inibitórias. Porém não foi observada
indução significativa mediante a adição destes cátions. Análise por bioinformática revelou que a maioria dos genes
envolvidos no processo de formação de biofilme já descritos para S. epidermidis e S. aureus, não foram encontrados no
genoma da cepa S. haemolyticus JSCS1535. Isto sugere que esta espécie deve possuir mecanismos diferenciados para
formação de biofilme. Mapas de eletroforese bidimensional para células planctônicas de S. haemolyticus JSCS1535,
foram obtidos por focalização isoelétrica em tiras de poliacrilamida de 7 cm com gradiente de pH 4-7, seguido de
SDS-PAGE. Utilizando o extrato protéico total, observou-se que as proteínas presentes na porção acídica do gel não
foram bem resolvidas. Para tentar solucionar este problema, o extrato protéico total foi submetido a ultracentrifugação.
Assim foi possível separar as frações protéicas solúveis e insolúveis. De um modo geral as proteínas foram separadas
eficientemente nestas condições. Somente um pequeno rastro na porção acídica do gel contendo as proteínas insolúveis
ainda precisa ser resolvido. Através dessas análises foi estabelecida a melhor condição para formação de biofilme e
separação de proteínas por eletroforese bidimensional. Esta é a primeira etapa para análise proteômica diferencial,
visando determinar os mecanismos envolvidos na formação de biofilme em S. hemolyticus.
Apoio financeiro: CNPQ, FAPERJ.
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Isolamento e classificação de uma nova
espécie de Streptomyces sp.
de solo de Cerrado
Lobo, LHA1; Carvalho, SL1; Krüger, HR1; Quirino, BF1
Pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília
1
Palavras-chave: Cerrado, microorganismo, sequenciamento, filogenética
O Cerrado, bioma característico do Brasil central, é notável por uma grande variação na fisionomia, apresentando
formas florestais, savânicas e campestres. Possui admirável diversidade biológica, representando 1/3 da biota mundial.
Os solos do Cerrado são antigos, profundos e bem drenados, são ácidos e de baixa fertilidade, com níveis elevados
de ferro e alumínio, apresentando grande biodiversidade microbiológica. Entretanto, a biota bacteriana do solo de
Cerrado ainda é pouco estudada, bem como o seu potencial biotecnológico. Sabe-se que menos de 1% das espécies
bacterianas que compõem esta biota é cultivável em meios de cultura artificiais. Para identificar microrganismos com
potencial atividade antimicrobiana, amostras de solo de cerrado sensu stricto foram plaqueadas tanto em meios ricos
como em meios pobres de nutrientes. No meio R2A foi identificado uma bactéria nomeada C1R20 com capacidade
antimicrobiana contra outras bactérias. Genes essenciais que apresentam regiões polimórficas flanqueadas por regiões
conservadas podem ser facilmente utilizados para sistemática filogenética. O objetivo desse trabalho é a caracterização
filogenética de C1R20 por sequenciamento total dos genes que codificam 16S rRNA e Gyrβ (Girase subunidade β). A
análise das seqüências completas de ambos os genes sugerem que C1R20 é uma bactéria do gênero Streptomyces. Testes
fenotípos e sequenciamento multi-loci serão realizados para corroborar a posição taxonômica da espécie.
Apoio Financeiro: CNPq, TWAS, Ouro Fino Veterinária.
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Avaliação da reatividade cruzada e ensaios
funcionais de soros anti-PspA em isolados
de Streptococcus pneumoniae
Moreno AT1; Darrieux M1; Ferreira DM1; Leite LCC1; Ferreira-Jr JMC1; Pimenta FC2; Andrade ALSS2; Ho PL1; Miyaji EN1
1
Centro de Biotecnologia, Instituto Butantan -São Paulo – SP
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia - GO
[email protected]
2
Streptococcus pneumoniae é o agente causador de diversas doenças com alta mortalidade e morbidade como meningite,
pneumonia, bacteremia, além de outras infecções freqüentes do trato respiratório, como otite e sinusite. Aproximadamente
um milhão de crianças morre de doenças pneumocócicas todo ano e os idosos também representam uma faixa da
população com risco aumentado para este tipo de infecção. A vacina composta de diversos polissacarídeos capsulares
purificados de S. pneumoniae apresenta baixa efetividade em crianças e idosos, além de não ser capaz de induzir memória
imunológica. Já as vacinas polissacarídicas conjugadas a proteínas, recentemente licenciadas, representam um grande
avanço, mas seu custo de produção é um grande obstáculo à utilização pelo sistema público de saúde brasileiro. Uma
proposta para se aumentar a abrangência em uma vacina de baixo custo é identificar um antígeno comum ao maior
número de isolados de pneumococo. PspA (pneumococcal surface protein A) parece ser o antígeno mais promissor para
ser utilizado em uma vacina protéica contra S. pneumoniae, além de ser um fator de virulência exposto, está presente
em todos os isolados descritos de pneumococo. No entanto, PspA apresenta uma grande variabilidade entre diferentes
isolados, sendo dividido em 3 famílias e subdividido em 6 clados. A família 1 compreende os clados 1 e 2, a família 2
os clados 3,4 e 5 e a família 3 o clado 6. A grande maioria dos isolados clínicos possuem PspA da família 1 ou família
2. Como é de extrema importância que as proteínas escolhidas para compor uma vacina contra infecções causadas
por pneumococo apresentem uma ampla cobertura, propomos o estudo da reatividade cruzada entre PspA de diversos
isolados. Para isso, foram produzidos soros anti-PspA dos clados 1 a 5, que foram testados por Western Blotting quanto
à reatividade com extratos de diferentes isolados. Os resultados obtidos mostram que os soros anti-PspA4 e anti-PspA5
possuem uma ampla reatividade cruzada, sendo capazes de reconhecer a grande maioria dos isolados testados. Esses
resultados foram confirmados através de ensaios funcionais de ligação de anticorpos anti-PspA e deposição de complemento
na superfície de pneumococos intactos. Propomos, portanto, que a utilização do PspA4 ou PspA5 como uma vacina
protéica apresentaria uma ampla cobertura de proteção contra a grande maioria dos isolados de pneumococo.
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Generation of specific polyamine uptake
knockout mutants of Streptococcus mutans
UA159 strain
Nepomuceno, RSL1; Lemos, JA2; Luz, DE1; Ferreira, LCS1; Ferreira, RCC1
1
Univesity of Sao Paulo, São Paulo, Brazil
University of Rochester Medical Center, Rochester, USA
2
Polyamines are polycationic compounds presents in all living being and play an important role in different biological
reactions, such as DNA, RNA and protein synthesis. Microorganisms are able to obtain polyamines by exogenous
uptake or endogenous synthesis. Among the systems related to the uptake of exogenous polyamines, one has been
correlated with pathogenesis of Streptococcus pneumoniae. This transporter belongs to the family of ABC-transporters
and is encoded by four genes (potA, B, C and D) arranged in an operon-like organization. The aim of the present study
was the in silico characterization of the pot operon and evaluate the role of the pot genes on the virulence of Streptococcus
mutans, the etiological agent of caries. Analysis of the genome sequence of the S. mutans UA159 revealed a typical pot
operon with four cistrons encompassing potA (1,1 kb), potB (0,7kb), potC (0,7kb) and potD (1kb). The PotD amino
acid sequence shared highest similarity value with the S. thermophilus LMG18331 (78% identity) although there was
no evidence of a horizontal gene transfer event between the two species. PotD is the component involved in polyamine
binding before transport to cell cytoplasm and possess a molecular mass of 40,9kDa. A mutants of pot operon were
constructed by site-direct mutagenesis by insertion of an erythromycin (insertion into the potD gene) encoding gene
cassette. The S. mutans strain knockout did not show any significant impairment on biofilm production in the presence
of sucrose. On the other hand, the mutant depleted on potD expression showed an increase on the resistance to low
pH (5,0). Taken together the present results indicate that the Pot system may participate on relevant physiological
features, such and sensitivity to chemical stress but not in biofilm production.
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Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
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Detecção por PCR de genes de virulência
em amostras de Salmonella Enteritidis
Andrade, ACM1; Lopes, TF1; Silva, WRT1; Costa, RV1; Vieira, J1; Santos, OB1; Filho, NAM1; Carneiro, MRP1; Cândido, AL1
Departamento de Morfologia, Universidade Federal de Sergipe
[email protected]
1
Palavras-chave: Salmonella, PCR, genes de virulência, detecção molecular, variabilidade genética
Infecções por Salmonella enterica serovars Enteritidis (S. Enteritidis) continua sendo um grande problema de saúde
pública. Nove amostras de Salmonella Enteritidis, agentes de gastroenterites e bacteremia, isolada de frango, e uma
amostra padrão internacional, foram avaliadas para detecção de genes de virulência pela reação em cadeia pela polimerase
(PCR). Para realizar a reação de PCR, foram desenhados iniciadores sintéticos por análise computacional das seqüências
depositadas no GenBank, seguindo critérios como a especificidade do fragmento do gene, número de pares de bases,
temperatura de anelamento e tamanho do produto a ser amplificado. Estes iniciadores são complementares à sequência
de cinco regiões alvo do genoma bacteriano; agfA (Doran et al., 1993), sefD (Clouthier et al., 1994), sfbA (Pattery et al.,
1999), fimA (Doran et al., 1994) e fliC (Li et al., 1994). As amplificações foram feitas com o auxilio do termociclador
Applied Biosystem GeneAmp System (Model 2400). As amplificações foram obtidas utilizando um ciclo de “hot
start” de 95 °C por 5 minutos, seguindo-se 35 ciclos de 95 °C por 1 minuto, 50 °C por 1 minuto e 72 °C por 1 min,
finalizando com a extensão a 72 °C por 6 minutos. Alíquotas (15 µl) dos produtos da amplificação foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 2% usando TAE (Tris- acetato/EDTA) como tampão de corrida. Os géis foram corados
com brometo de etídio após corrida eletroforética a 100 volts durante 45 minutos e visualizados em transluminador
de luz UV. Os resultados indicam que ocorreu variabilidade genética quanto à presença das seqüências dos genes em
relação às amostras testadas, sendo que as amostras isoladas de sangue e fezes humanas foram os que apresentaram
maior quantidade de genes de virulência. Possivelmente devido à necessidade destes fatores para a sua manutenção no
hospedeiro. Novos experimentos devem ser realizados para relacionar melhor estes achados.
Apoio financeiro: FAPITEC-SE, FAPESE, COPGD-UFS e CNPq.
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Análise comparativa da expressão protéica
de Vibrio cholerae Amazonia
e um mutante HlyU
Leme, JMM; Faria, MLH; Santos, EO; Coelho, A
Rede de Proteômica do Rio de Janeiro - FAPERJ
Departamento de Genética, Instituto de Biologia, UFRJ
[email protected]
Palavras-chave: Vibrio cholerae, proteoma, regulação gênica
Vibrio cholerae Amazonia é uma linhagem isolada de pacientes no Norte do Brasil, durante a epidemia de cólera que
atingiu a América Latina, na década de 90. Esta linhagem não apresenta a toxina colérica, entretanto é citotóxica e
causa diarréia por mecanismos desconhecidos. Para descrever um possível regulon hlyU, construiu-se inicialmente,
a partir da linhagem Amazonia 3509, um mutante de inserção no gene hlyU, o ativador transcricional de hlyA. O
objetivo do presente trabalho é comparar as proteínas presentes na linhagem Amazonia e no mutante hlyU. As proteínas
totais foram separadas em géis de eletroforese bidimensional e a identificação de proteínas comuns e exclusivas das
linhagens foi realizada através de espectrometria de massas. A comparação dos mapas de proteoma revelou 124 spots
detectados apenas na Amazonia selvagem e 86 exclusivos da mutante hlyU, sendo 100 comuns em ambas. 290 spots
foram analisados por espectrometria de massas, resultando em 227 proteínas celulares identificadas: 113 da linhagem
Amazonia selvagem e 114 do mutante hlyU. Proteínas relacionadas à síntese e destino de proteínas, e transporte e ligação
de aminoácidos, peptídeos e aminas foram identificadas em grandes quantidades nas duas linhagens. Encontramos
duas proteínas ausentes na linhagem El Tor N16961, cujo genoma está totalmente seqüenciado: açúcar kinase, família
pfkB que tem genes ortólogos em algumas espécies de Vibrios e uma proteína D de fago que tem proteína similar em
um fago de V. vulnificus. Existe a possibilidade de que HlyU regule positivamente a produção de OmpV, uma vez que
14 spots contendo esta proteína foram detectados na Amazonia selvagem e apenas 1 na mutante, e este spot era bem
menos intenso que o correspondente na linhagem selvagem.
Apoio financeiro: CNPq/FAPERJ/FINEP e CAPES.
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Proteoma diferencial de Vibrio cholerae El
Tor cultivada na presença
de N-acetilglicosamina ou glicose
Santos, EO; Leme, JMM; Coelho, A
Rede de Proteômica do Rio de Janeiro – FAPERJ
Departamento de Genética, Instituto de Biologia, UFRJ
[email protected]
Palavras-chave: Vibrio cholerae, N-acetilglicosamina, regulação gênica, proteoma
Este projeto propõe uma análise da expressão protéica da linhagem C3294 de Vibrio cholerae El Tor sob condições de
cultivo na presença de N-acetilglicosamina, o monômero da quitina, em comparação com o cultivo com glicose como
fonte de carbono e energia. Esta linhagem foi isolada em 1993 de um paciente de cólera do Rio de Janeiro, durante
a epidemia que ocorreu no Brasil, na década de 90. O método utilizado inclui as técnicas de proteômica, como a
eletroforese bidimensional e espectrometria de massas. Foram realizados experimentos de extração protéica total para
separação em eletroforese bidimensional, utilizando-se o sistema de focalização isoelétrica com faixas diferentes de pH
e dois sistemas de eletroforese Multhiphor e Ettan Dalt-six, gerando, então dois conjuntos de géis para cada condição
de cultivo. Em um trabalho anterior o perfil protéico de V. cholerae foi analisado com tiras de pH de 4 a 7 e sistema
Multiphor, revelando que há uma expressão proteica diferencial por V. cholerae quando utiliza N-acetilglicosamina como
única fonte de carbono. 69 identificações foram obtidas, correspondendo a 54 proteínas diferentes. Neste trabalho,
foram utilizadas faixas de pH de 3 a 10 e de 6 a 11 e sistema Ettan Dalt-six para uma análise ampliada da expressão
protéica diferencial. Buscamos identificar um número maior de proteínas expressas constitutivamente e exclusivamente
nas duas condições de cultivo, para detectar genes regulados por cada açúcar. No total, foram identificados 400 spots.
Proteínas envolvidas com o metabolismo de energia, transporte e ligação, e síntese e destino de proteínas foram
detectadas como abundantes e expressas em ambas condições. Algumas proteínas hipotéticas, trigger factor e cisteína
sintase, entre outros, foram evidentemente mais expressos quando V. cholerae utiliza N-acetilglicosamina como fonte
de carbono. Uma análise funcional está sendo realizada, com as proteínas exclusivas de cada condição de cultivo, para
achar vias metabólicas e de regulação gênica afetadas.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPERJ.
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Interação entre genes conservados
em Ilhas genômicas
Stefanello, E; Baldini, RL
Instituto de Química, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Ilhas genômicas, PAPI-1, interação proteína-proteína, duplo-híbrido, Pseudomonas aeruginosa,
Xanthomonas axonopodis
Genomas bacterianos são extremamente dinâmicos e boa parte dessa dinâmica ocorre devido a transferência horizontal
e aquisição de DNA exógeno, um processo natural e fundamental para a evolução, adaptação e diversificação dos
microrganismos. Ilhas genômicas são grandes regiões do cromossomo bacteriano adquiridas por transferência horizontal
e estão presentes em apenas algumas linhagens, podendo conferir alguma vantagem seletiva como adaptação ao meio,
inclusive permitindo que seu portador se torne patogênico ou mais virulento. Em Pseudomonas aeruginosa PA14, encontrase a ilha de patogenicidade PAPI-1 contendo 115 genes, sendo a grande maioria de função desconhecida. PAPI-1 possui
a capacidade de se excisar do genoma de PA14 e também pode ser transferida por conjugação para outras linhagens
de P. aeruginosa, através da presença de um sistema de transferência similar ao descrito recentemente em Haemophilus
influenza. Este novo sistema de secreção tipo IV está presente em uma grande variedade de ilhas genômicas de diversas
bactérias além de P. aeruginosa e H. influenza, como Salmonella typhimurium, Pseudomonas syringae e Xanthomonas
axonopodis pv citri 306 (Xac). Apesar de alguns genes desse sistema serem similares a outros sistemas de secreção tipo
IV conhecidos, a função de varias proteínas codificadas por esse novo sistema de transferência é desconhecida. Uma
das estratégias que podem ser aplicadas para elucidar a função de genes hipotéticos é a elaboração de redes de interação
proteína-proteína utilizando-se o sistema de duplo híbrido em levedura. Os genes PA14_59860 e XAC2269 fazem parte
do conjunto de genes conservados e codificam pequenas proteínas possivelmente secretadas, possuindo um domínio
RAQPRD na porção C-terminal, de função desconhecida. A fim de se elucidar se estas proteínas fazem parte do sistema
de secreção/transferência, seus genes foram amplificados a partir do DNA genômico de PA14 e Xac, respectivamente,
clonados no vetor pOBD e estão sendo utilizados como iscas em uma biblioteca de duplo-híbrido contendo o genoma
de Xac. O seqüenciamento destes clones é o primeiro passo na tentativa de elucidar as relações entre as proteínas que
formam o sistema de secreção/transferência presentes nas ilhas genômicas dessas bactérias, que será estendido com o
uso de outras iscas derivadas dos genes conservados.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP.
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Molecular modelling of maltose-binding
protein of MalE of Xanthomonas citri
and analysis ligands interactions
by spectroscopy assays
Souza, CS1; Balan, A1; Barbosa, JAR2; Ferreira, LCS1
Departament of Microbiology of the University of São Paulo USP – São Paulo – Brazil
2
Brazillian Synchrotron Light Laboratory, Campinas - Brazil
1
The uptake of maltose and maltodextrins is usually mediated by a member of the ATP-binding-cassete (ABC) transporter
superfamily. Maltose ABC transporters are composed of a membrane-bound complex comprising two hydrophobic
permease subunits (MalF and MalG) and two copies of the ATPase subunit (MalK). The soluble periplasmic maltose
binding-protein (MBP) confers specificity and affinity to the transported molecules. The three-dimensional structure
of bacterial MBPs have already been solved including those expressed by Escherichia coli K12, bound to maltose;
Themococcus litoralis, bound to threhalose Alicyclobacillus acidocaldarius, binding to maltose Pyrococcuus furiosus, bound
to maltotriose; Thermus thermophilus, bound to maltotriose and Termotoga maritma, bound to maltotriose. In this
work we report the construction of the Xac MBP structurals models obtained using the Modeller 9v2 program based
on the atomic coordinates of the T. litoralis (PDB code1EU8), E. coli (PDB code 1ANF) e T. marítima (PDB code
2FNC) with these models we done docking analyses with differents sugars (maltose, threhalose, maltotriose). Docking
analysis with performed both sugars and comparisons among the Xac_MBP models with more five orthologs revealed
a high conservation of 3D structure, including some residues in the sugar-binding pocket. Spectroscopic analysis of the
Xanthomonas axonopodis pv. citri maltose-binding protein (Xac_MBP) using circular dichroism and intrinsic fluorescency
were performed with the protein in the absence and presence of different sugars in different pHs. Xac_MBP is able to
bind both maltose and threhalose.
This work was supported by FAPESP.
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Proteínas potencialmente envolvidas com
a fitopatogenicidade de Xanthomonas
axonopodis pv. citri: estudos preliminares
de frações celulares e da fração extracelular
Artier, J1; Belasque Jr, J 2; Bertolini, MC3; Selistre-de-Araujo, HS4; Novo, MTM1
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos- UFSCar
2
Fundo de Defesa da Citricultura – Fundecitrus, Araraquara-SP
3
Departamento de Bioquímica, Universidade Estadual Paulista - UNESP
4
Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal de São Carlos- UFSCar
[email protected]
1
Palavras-chave: Xanthomonas axonopodis pv citri, proteínas, patogenicidade
O cancro cítrico é uma doença economicamente importante pois acarreta grandes prejuízos para a citricultura em
vários países, inclusive no Brasil, sendo que não existem atualmente medidas preventivas e curativas eficazes contra
a doença. O agente etiológico do cancro cítrico é a bactéria Xanthomonas axonopodis (Xa), sendo que estirpe Xac-A
(patovar citri) foi o objeto deste estudo por apresentar maior virulência e/ou gama de hospedeiros quando comparada
a outras estirpes conhecidas. Este trabalho consistiu na etapa inicial de um projeto mais abrangente que visa à análise
proteômica em Xa e teve como objetivo investigar de forma preliminar as alterações dos perfis protéicos das várias
frações celulares e da fração extracelular da bactéria, após indução da patogenicidade in vitro. Para isto, a estirpe Xac-A
foi cultivada em meio indutor de patogenicidade (XAM1) e em meio não indutor de patogenicidade (caldo nutriente)
e as metodologias de extração das proteínas das frações da membrana citoplasmática, do esferoplasto, do periplasma e
do meio extracelular foram padronizadas. A comparação dos perfis protéicos (em meio indutor e em meio não indutor
de patogenicidade) foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil-sulfato de sódio (SDSPAGE). Previamente à análise da fração extracelular por SDS-PAGE, o meio indutor livre de bactérias (obtido antes e
após crescimento bacteriano) foi concentrado por liofilização e dialisado. Os resultados da eletroforese mostraram que
em situação de indução da patogenicidade proteínas das várias frações apresentaram expressão diferencial. Tentativas
para a identificação de algumas das proteínas diferencialmente expressas na fração extracelular foram realizadas por
meio da sua transferência para membrana de PVDF e seqüenciamento do seu terminal amino, sendo as seqüências
obtidas comparadas por BLASTp com as seqüências presentes em banco de dados. O terminal amino de três proteínas
extracelulares que apresentaram expressão aumentada no meio indutor de patogenicidade teve identidade de 83% e
62% com parte das seqüências de duas proteínas hipotéticas de Xac-A e identidade de 50% com parte de uma proteína
de quimiotaxia dessa mesma estirpe. Estudos adicionais serão necessários para confirmar a identidade dessas proteínas e
averiguar o seu real envolvimento com a fitopatogenicidade de Xac-A. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que
o cultivo bacteriano em meio indutor de patogenicidade, comparativamente ao cultivo em meio não indutor, seguido
da análise de frações protéicas pode ser uma estratégia promissora para estudos de proteômica que visem a detecção de
proteínas potencialmente envolvidas com a fitopatogenicidade em Xa.
Apoio financeiro: Fundecitrus.
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Diversidade molecular em isolados de
Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae e
aplicações em diagnose
Munhoz, CF1; Weiss, B1; Zucchi, MI2; Fungaro, MHP3; Oliveira, ALM3; Vencovsky, R1; Vieira, MLC1
Universidade de São Paulo, ESALQ, Departamento de Genética
2
Instituto Agronômico - IAC
3
Universidade Estadual de Londrina
[email protected]
1
Palavras-chave: Xanthomonas axonopodis, Passiflora, AFLP, Diagnose
A bacteriose causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae é uma das doenças dos pomares comerciais de maracujá,
sendo limitante à produção de frutos em várias regiões do Brasil. Para se entender a complexa interação patógenoplanta, é importante avaliar a variabilidade do patógeno. Por isso, o objetivo deste trabalho foi analisar uma coleção de
87 isolados de X. axonopodis pv. passiflorae, oriundos de 11 cidades de SP, 10 cidades de MG, uma cidade do PR e do
DF. Inicialmente, foi feita uma análise molecular desses isolados por REP, ERIC e BOX-PCR, comparando-os com os
perfis de 9 isolados, cada um representando um outro patovar de X. axonopodis. Perfis específicos e consideravelmente
homogêneos foram obtidos para o pv. passiflorae, confirmado pelo agrupamento gerado com dados de similaridade
genética entre os patovares. Para analisar a variabilidade dos isolados do pv. passiflorae foi usada a técnica de AFLP,
e 89 locos polimórficos foram detectados. Calcularam-se os valores de similaridade, usando o coeficiente de Jaccard,
e realizou-se o agrupamento por UPGMA, usando o software NTSYS-PC (Rohlf, Exeter Software 2000). Houve
a formação de 12 grupos que reuniram 77 isolados, considerando-se valores de similaridade superiores a 0,70. A
correlação cofenética foi 0,9255, indicando uma alta correlação com a matriz de similaridade original. Observou-se
uma associação entre os agrupamentos e a origem geográfica dos isolados. Posteriormente, os isolados foram arranjados
em 15 grupos, de acordo com a região de coleta, e para visualizar a estruturação da variabilidade foi realizada a análise
molecular da variância (AMOVA). Verificou-se que 59,6% (φST = 0,596) da variabilidade se encontra entre grupos e
40,4% dentro de grupos. O teste de atribuição, realizado pelo software STRUCTURE (Pritchard et al. Genetics 2000)
resultou em um K = 14, mostrando consistência com os resultados anteriores e com a origem geográfica dos isolados.
Cinco regiões se apresentaram bem definidas com próximo a 100% e as demais contêm isolados que participam de
diferentes grupos ( ≠100%). Finalmente, foi amplificada a região intergênica do rRNA 16S-23S de isolados do pv.
passiflorae e dos demais patovares. Nenhuma diferença no tamanho do amplicon foi observada e os produtos da PCR
foram seqüenciados em MegaBACETM. A qualidade das seqüências foi analisada pelo pacote computacional Phred/
Phrap/Consed. O alinhamento das seqüências (661) mostrou variação nucleotídica entre os patotovares e permitiu o
desenho de primers específicos para a diagnose do pv. passiflorae.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP.
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Validação de genes endógenos em
Xanthomonas axonopodis pv. citri para
normalização de qRT-PCR
Jacob, TR; Laia, ML; Ferro, JA; Ferro, MIT
Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal, Departamento de Tecnologia
[email protected]
Palavras-chave: PCR quantitativo em tempo real, Genoma Funcional, cancro cítrico
citricultura é uma atividade agro-industrial de suma importância para o Estado de São Paulo e para o Brasil. Com uma
área plantada em torno de 820 mil hectares, 77% só na região Sudeste, o país mantém a posição de maior produtor
mundial de citros. Entretanto, todo este potencial econômico vem sendo prejudicado por uma doença denominada cancro
cítrico, a qual é causada por um fitopatógeno bacteriano denominado Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Não existe
método eficaz de controle dessa fitobacteriose, sendo a erradicação das plantas infectadas o método empregado no Estado
de São Paulo. No entanto, a erradicação das plantas não tem controlado a incidência da doença. Dada a sua importância,
Xac teve o seu genoma seqüenciado e os genes anotados em 2002. A partir de então, estudos de genômica funcional
têm sido iniciados com o intuito de identificar a maquinaria gênica que esse patógeno utiliza para se desenvolver no
interior do seu hospedeiro e, assim, chegar a algum alvo para um futuro controle do cancro cítrico de forma satisfatória.
Dentre as diversas técnicas utilizadas no estudo da expressão gênica, a análise da transcrição reversa em tempo real por
PCR (qRT-PCR) tem se destacado nos estudos comparativos. No entanto, devido a sua alta sensibilidade, os resultados
obtidos a partir do uso de qRT-PCR precisam ser normalizados, a fim de controlar erros entre as amostras, tais como
diferentes quantidades iniciais de RNA e/ou diferentes eficiências durante a produção do cDNA, ou qualquer outra
variação aleatória. Tradicionalmente, 16S rRNA e GAPDH têm sido utilizados como controles internos em análises
de expressão gênica comparativa. Mas, estudos têm mostrado que esses, e outros, tradicionais controles internos tem
variado acima de 30 vezes entre amostras. Assim, com o intuito de estudar a expressão gênica comparativa em Xac por
meio da técnica de qRT-PCR, 10 genes candidatos a controle interno foram analisados. O experimento consistiu da
análise dos respectivos genes em 4 amostras de cDNA produzidas a partir de RNA de Xac multiplicada em meio de
cultura mínimo comparativamente a 4 amostras de cDNA produzidas a partir de RNA de Xac multiplicada in planta.
Os resultados indicam que os genes NADH (Xac2172), NADPH (Xac2229) e 16S rRNA (Xac3896) foram altamente
variáveis e que, além disso, não é possível utilizar um único gene normalizador, sendo, nestas condições, necessários pelo
menos 2 controles endógenos. A validação de genes normalizadores é altamente específica para um modelo experimental
particular e é um componente crucial a ser determinado antes de um novo estudo.
Apoio Financeiro: FUNDECITRUS, FAPESP e CAPES.
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Expressão heteróloga da proteína CzcD de
Xylella fastidiosa e aumento da tolerância a
zinco em células de Escherichia coli
Rodrigues, CM1,2; Takita, MA1; Caserta, R1,3; Silva, MS1,3; Olivato, J1,4; Coletta-Filho, HD1; Machado MA1; Souza, AA1
1
Centro APTA Citros Sylvio Moreira-IAC
Universidade Estadual Paulista-Unesp- Campus Botucatu
3
Universidade Estadual de Campinas-UNICAMP
4
Universidade Estadual Paulista-Unesp- Campus Rio Claro
[email protected]
2
Palavras-chave: expressão heteróloga, indução proteica, MIC
A bactéria Xylella fastidiosa (Xf ) é responsável por várias doenças vegetais de importância econômica, no Brasil é
responsável pela clorose variegada dos citros (CVC), doença que causa prejuízos da ordem de 100 milhões de dólares
anuais ao agronegócio citrícola. O principal mecanismo de patogenicidade dessa bactéria é a formação de biofilme no
xilema da planta hospedeira causando bloqueio de água e nutrientes. Uma das características do biofilme é o aumento
da resistência a compostos antimicrobianos. Nosso grupo demonstrou recentemente, que as células de Xf na condição
de biofilme apresentam o dobro de resistência a CuSO4 em relação às células planctônicas. Além disso, foi verificado
mudanças na expressão gênica de Xf com crescimento em biofilme comparado às células planctônicas, sendo que
muitos desses genes estão relacionados à resistência a agentes antimicrobianos. O gene czcD, provavelmente envolvido
na resistência a zinco, foi identificado no genoma da Xf e através da análise por PCR quantitativo em tempo real,
verificamos um aumento significativo na expressão desse gene no biofilme de Xf na presença de zinco. O objetivo deste
trabalho foi verificar através da superexpressão da proteina CzcD seu possível papel biológico na resistência a zinco. Para
isso, o gene czcD foi clonado no vetor de expressão pET28a e transformado na linhagem Rosetta de Escherichia coli. O
clone recombinante (czcD+pET28a+Rosetta) foi induzido com 1 mM de IPTG por 2 e 4h. A superexpressão da proteína
correspondente foi confirmada em gel de SDS-PAGE. O clone recombinante também foi submetido a ensaios para
determinação da concentração mínima inibitória (MIC) de zinco, comparado aos controles contendo pET28a (com e
sem ZnSO4) e czcD+pET28a+Rosetta sem adição de zinco. Diferentes concentrações foram testadas, contudo, com 1,5
mM de ZnSO4 já foi possível observar inibição do crescimento bacteriano. Com base nessa observação, foi utilizada essa
dose nos ensaios da MIC. A avaliação do efeito inibitório foi verificada pelo número de UFC (unidade formadora de
colônia) após tratamento com zinco. Nos ensaios da MIC, o clone recombinate foi significativamente mais resistente em
relação a todos os controles utilizados. Estes resultados sugerem que CzcD é um membro funcional na homeostase de
zinco. Este fato é muito importante, visto que, a manuntenção dos níveis de íons de metais intracelular é um importante
fator de virulência de muitas bactérias patogênicas. Isso pode ter um importante papel na sobrevivência das células de
Xf na presença de zinco, o que certamente constitui uma importante estratégia de sobrevivência celular.
Apoio financeiro: CNPq, Fapesp.
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Expressão temporal de adesinas fimbriais
e afimbriais durante a formação
do biofilme de Xylella fastidiosa in vitro
e detecção in planta
Caserta, R1 2; Takita, MA1; Targon, ML1; Rosseli, LK2; Souza, AP1; Peroni, L1; Stach-Machado, DR2; Andrade, A3;
Labate, CA3; Kitajima, EW3; Machado, MA1; Souza, AA1
1
Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC
Universidade Estadual de Campinas/UNICAMP
3
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”/USP
[email protected]
2
Palavras-chave: Anticorpos policlonais, Western blot, Microscopia de fluorescência, microscopia eletrônica de transmissão, imunomarcação
Biofilmes são agregados de bactérias que se estabelecem aderidas a uma superfície ou crescem na interface líquido-ar de meios
de cultura e ambientes naturais. Eles apresentam como característica, um aumento da resistência a antibióticos, ativação de
diferentes genes de virulência e proteção da colônia contra adversidades do meio, resultando em vantagens adaptativas para
seus indivíduos. As fases do desenvolvimento do biofilme são, basicamente, três: adesão inicial, maturação e dispersão celular.
Proteínas de adesão, tanto fimbriais quanto afimbriais, são fundamentais para o desenvolvimento do biofilme. O fitopatógeno
Xylella fastidiosa (Xf), causador da clorose variegada dos citros, apresenta como mecanismo de patogenicidade o entupimento
dos vasos do xilema causados pela formação de biofilme. No genoma da Xf foram encontrados vários genes que codificam
adesinas fimbriais e afimbriais, similares às de bactérias patogênicas de humanos que formam biofilme, contudo nenhum estudo
foi feito para avaliar seus papéis na formação do biofilme de Xf. Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi determinar
em quais fases do biofilme de Xf estas adesinas fimbriais e afimbriais são produzidas. Para tal, regiões internas dos genes PilC
(xf2538), FimA (xf2539), Hsf (xf1516) e UspA1 (xf1519) foram amplificadas, seqüenciadas e clonadas em pET28a para
expressão da proteína fusionada a uma cauda de histidina. A proteína superexpressa foi purificada por coluna de afinidade e a
identidade das proteínas foi confirmada por seqüenciamento por ESI-QTOF. Estas proteínas foram utilizadas para produção
de anticorpos policlonais os quais serviram para ensaios de western blot com proteínas extraídas de fases distintas da formação
do biofilme de Xf. A expressão destas proteínas foi também analisada in situ nas diferentes fases da formação do biofilme
através de imunomarcação em Microscopia de Fluorescência. Microscopia eletrônica de transmissão foi realizada em secções
de pecíolos de três diferentes hospedeiros (Citros, vinca e hibiscos) infectados com Xf, para a localização das proteínas in
planta. Os resultados de western blot revelaram que as proteínas fimbriais PilC e FimA são superexpressas aos cinco dias de
crescimento do biofilme, ou seja, no inicio da formação, sugerindo uma função de adesão das células a superfície. As afimbriais
Hsf e UspA1 tiveram sua expressão aumentada ao longo do desenvolvimento do biofilme, sugerindo um papel na adesão célula
a célula, auxiliando na formação de multicamadas do biofilme. A imunofluorescência mostrou ainda interessantes “ilhas” de
UspA1. Nas secções de pecíolos foi possível encontrar as proteínas fimbriais mais associadas à membrana interna das bactérias,
enquanto as afimbriais se localizam externamente, sugerindo uma expressão destas proteínas na interação patógeno-planta.
Esses resultados são importantes para nortear possíveis estratégias de bloqueio pontual das adesinas, impedindo assim que o
biofilme se forme e/ou se estabeleça não propiciando o desenvolvimento da doença.
Apoio Financeiro: Fapesp (04/14576-2 e 06/52681-8).
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Expressão e purificação para caracterização
estrutural da proteína VapD, relacionada
à virulência de Xylella fastidiosa
Favaro, MTP1; Rosselli, LK1; Souza, AP1
Instituto de Biologia, Departamento de Genética e Evolução, Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
A bactéria Xylella fastidiosa é um fitopatógeno que ocasiona, entre outras doenças, a Clorose Variegada dos Citros
(CVC). Embora seu genoma já tenha sido completamente seqüenciado, as proteínas codificadas pelos seus genes são
pobremente caracterizadas. A proteína VapD (virulence-associated protein D), codificada pela orf XFa0052 e localizada
no plasmídeo pX51 de X. fastidiosa, já foi encontrada em muitas outras bactérias virulentas, como Haemophilus influenzae
e Dichelobacter nodosus. Nesta última, VapD foi observada em todas as linhagens virulentas, mas em apenas 23% das
linhagens avirulentas. Embora sua importância para a patogenicidade já tenha sido enfatizada, informações bioquímicas
descrevendo seu papel biológico são raras na literatura, e sua função ainda não foi elucidada. Estudos anteriores,
realizados em nosso laboratório de pesquisa, mostraram que os cristais da proteína VapD não apresentam boa difração
por raios-X, impedindo a resolução de sua estrutura tridimensional. Sabendo-se que a flexibilidade de determinadas
regiões da proteína dificulta o processo de cristalização e pode gerar um cristal de baixa qualidade, decidiu-se trabalhar
apenas com o seu domínio estável, possivelmente responsável pela função da proteína, estimado a partir do banco de
dados do BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov). No presente trabalho são apresentados os estudos de clonagem, expressão
e purificação do domínio truncado VapD de 16,3kDa, tendo por objetivo a resolução de sua estrutura tridimensional
por cristalografia de raios-X. Para tal finalidade, o domínio VapD foi clonado no vetor de expressão pET32Xa/LIC
(Novagen) e a proteína expressa na linhagem de E. coli BL21(DE3) utilizando a lactose como indutor. A proteína
heteróloga expressa foi purificada através de duas etapas de cromatrografia de afinidade em íon metálico imobilizado
(resina Ni-NTA). A identidade da proteína recombinante de 16,3 kDa foi verificada por SDS-PAGE e espectrometria
de massas (MALDI-TOF). Para verificação e estimativa da presença de estrutura secundária e correto enovelamento,
ainda serão coletados espectros de Dicroísmo Circular (CD), anteriormente aos ensaios de cristalização da proteína. Em
suma, o objetivo inicial deste trabalho de clonar, expressar e purificar o domínio truncado VapD em quantidade e pureza
necessários para os estudos cristalográficos, foi plenamente alcançado. O conhecimento da estrutura tridimensional
poderá auxiliar no entendimento do papel da proteína VapD na patogênese de Xylella fastidiosa.
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Análise da expressão gênica de Xylella
fastidiosa regulada pelas interações com a
comunidade bacteriana endofítica de citros
Ciraulo, MB1; Lacava, PT2; Araújo, WL1 Azevedo, JL2
1
Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, SP
Departamento de genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” –USP, Piracicaba, SP
[email protected]
2
Palavra-chave: Xylella fastidiosa, CVC, bactérias endofíticas, qPCR
O Brasil é o maior produtor mundial de citros, sendo responsável por mais de 35% da produção, 53% do suco de
laranja e 80% do suco concentrado distribuído no mercado mundial. Atualmente uma das grandes preocupações com
a cultura de citros é a doença conhecida como Clorose Variegada dos Citros (CVC). A CVC é causada por Xylella
fastidiosa, uma bactéria Gram-negativa, sem motilidade que coloniza os vasos do xilema de uma ampla variedade
de espécies de plantas e está associado ao desenvolvimento de doenças em diversas espécies de plantas cultivadas
com importância econômica em toda a América. Em Citrus sinensis foi observado que o balanço entre X. fastidiosa e
bactérias endofíticas poderia estar associado aos sintomas da CVC. A bactéria endofítica Curtobacterium flaccumfaciens
foi isolada principalmente de plantas resistentes (assintomáticas), enquanto que bactérias do gênero Methylobacterium
foram isoladas principalmente de plantas afetadas pela CVC, mostrando a necessidade de mais estudos para um melhor
entendimento dessa interação entre X. fastidiosa e bactérias endofíticas de citros. Estudos com análise genômica vêm
sendo desenvolvidos atualmente, no intuito de compreender os mecanismos de controle da expressão gênica de X.
fastidiosa quando submetida a diferentes condições experimentais e identificar genes diretamente envolvidos em variados
processos metabólicos. Portanto, uma das formas de se compreender os mecanismos de interação de X. fastidiosa com
Methylobacterium spp. e C. flaccumfaciens é a utilização do estudo da expressão gênica baseados na utilização da PCR
quantitativo, que permite uma análise quantitativa precisa e real da expressão de genes relacionados a formação de
biofilme, transporte de íons ferro e toxidade supostamente envolvidos nas interações entre X. fastidiosa, M. extorquens,
M. mesophilicum e C. flaccumfaciens. Desta forma, para o estudo da expressão gênica de X. fastidiosa induzido pela
interação entre bactérias endofíticas foram testados os primers de seqüências especificas de X. fastidiosa (Xf 9a5c) para
os genes tonB, pks e gumK. Primers específicos de Xf 9a5c para o gene dnaQ também foram testados e serão utilizados
como controle endógeno. Nossos resultados poderão fornecer subsídios para um melhor entendimento da patogênese
de X. fastidiosa e o papel da comunidade endofítica de citros no desenvolvimento dos sintomas e controle da CVC.
Suporte financeiro: FAPESP (Proc. no. 06/55494-4).
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Análise proteômica do biofilme maduro
de Xylella fastidiosa em comparação
ao crescimento planctônico
Silva, MS1 2; Souza, AA1; Stuart, RM1 2; Bonatto, JMC3; Andrade, A3; Labate, CA3; Machado, MA1
1
Centro APTA Citros Sylvio Moreira
Universidade Estadual de Campinas
3
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”/USP
[email protected]
2
Palavras-chave: biofilme maduro, planctônico, Xylella fastidiosa
A bactéria Xylella fastidiosa é o agente causal de um grande número de doenças economicamente importantes, como
a clorose variegada dos citros (CVC). A bactéria é limitada ao xilema e ao lúmen do canal alimentar de insetos vetores
(cigarrinhas). O mecanismo de patogenicidade dessa bactéria difere do de outras, uma vez que ela não apresenta genes
típicos que conferem especificidade planta-patógeno (avr e/ou hrp). A bactéria é injetada pelo inseto vetor diretamente
nos vasos do xilema, onde se adere e coloniza. O processo todo leva à formação de biofilme, sendo considerado um de
seus principais mecanismos de patogenicidade. Biofilmes são comunidades de microrganismos fixadas em uma superfície
biótica ou abiótica. Células em biofilme são metabolicamente e fenotipicamente diferentes de sua condição planctônica.
A formação do biofilme é caracterizada em três diferentes estádios, sendo o estádio de biofilme maduro (fase de maior
densidade celular) caracterizado pela maior virulência e resistência das células a substâncias tóxicas como antibióticos,
detergentes, entre outras. Apesar do genoma sequenciado, o estudo bioquímico quanto à expressão de proteína da X.
fastidiosa em biofilme, foi pouco explorado. Análise proteômica foi realizada para comparar a expressão de diferentes
proteínas no biofilme maduro de X. fastidiosa estirpe 9a5c, comparado à condição de crescimento planctônico. Para tal
as bactérias foram cultivadas até sua fase estacionária, onde tiveram suas proteínas totais extraídas por tampão de lise.
Cerca de 750 µg de cada amostra foi aplicado no gel de poliacrilamida desidratado como imobilizador de pH, IPG
strips com alcance de pH entre 3-10 NL, para focalização das proteínas (1-D) e gel de eletroforese bidimensional (2-D)
para análise dos spots. Após a análise dos géis, foi encontrado um total de 259 proteínas na condição de biofilme e
162 proteínas no crescimento planctônico. No biofilme houve 37% (ou 97 proteínas) a mais do que as encontradas na
condição de crescimento planctônico. Provavelmente essa diferença de proteínas pode ser responsável pelas alterações
fisiológica das células na condição de biofilme de X. fastidiosa. Espectrometria de massa usando Q-TOF-Ultima API
(ESI-MS/MSquadrupole/aceleração orthogonal time-of-flight) da Water-Micromass, acoplado a um sistema on-line
de HPLC capilar, CaplC (Waters) esta sendo utilizada para identificação destas proteínas. Resultados similares foram
encontrados em Pseudomonas aeruginosa PAO, onde 40% das proteínas foram diferencialmente expressas na condição
de biofilme maduro em relação ao crescimento planctônico. Isto sugere que as diferenças fenotípicas do biofilme de
uma bactéria de planta podem envolver as alterações semelhantes àquelas encontradas em patógenos oportunistas e
causadores de infecções em humanos. Este trabalho reporta uma primeira análise proteômica do biofilme maduro de
X. fastidiosa, abrindo novas perspectivas para o entendimento bioquímico desta forma de crescimento em um patógeno
de plantas.
Apoio financeiro: CAPES, FAPESP (04/14576-2).
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Similaridade genética entre linhagens de
Yersinia enterocolitica biotipo 1A de origem
clínica, de alimentos e de ambiente,
por ERIC-PCR
Campioni, F1; Freitas, SF1; Pitondo–Silva, A1; Falcão, DP2; Falcão, JP1
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara- UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Yersinia enterocolitica, Biotipo 1A, Tipagem molecular, ERIC-PCR
Entre as espécies de Yersinia, Y. enterocolitica é o patógeno de maior prevalência entre os humanos, sendo sua patogenicidade
relacionada, entre outras características, a seis biotipos: o 1B considerado de alta virulência, 2 a 5 de virulência moderada
e o biotipo 1A considerado como não-patogênico. Entretanto, dados recentes da literatura têm relacionado linhagens de
Y. enterocolitica biotipo 1A como sendo os agentes causais de infecções em humanos e animais. Este estudo teve como
objetivo comparar a similaridade genética de linhagens de Y. enterocolitica do biotipo 1A de origem clínica, com linhagens
isoladas de alimentos e do ambiente. Foram tipadas molecularmente por ERIC-PCR 11 linhagens isoladas de material
clínico de humanos, 11 isoladas de animais, 15 de alimentos e 15 do ambiente. A análise do padrão de bandas foi feita
pelo software Bionumerics. O dendrograma gerado, construído pelo método de agrupamento de UPGMA, baseado no
coeficiente de Jaccard, permitiu a visualização de três grandes grupos. No primeiro ficaram agrupadas 13 linhagens de
ambiente com 70% de similaridade entre si. No segundo, ficaram agrupadas 10 linhagens de origem clínica humana
e oito de animal, com 74% de similaridade entre si e, com 64% de similaridade com nove linhagens de alimentos e
outras três de origem animal. No terceiro grupo, ficaram agrupadas seis linhagens de alimentos, duas de ambiente
e uma de origem humana, com 32% de similaridade entre si, sendo as linhagens deste grupo, as que apresentaram
maior divergência genética. Os resultados obtidos demonstraram que as linhagens de ambiente formaram um grupo
separado das linhagens de origem clínica. As linhagens isoladas de alimentos demonstraram ser as mais diversificadas
geneticamente, pois apresentaram-se distribuídas pelo segundo e terceiro grupos. O agrupamento dessas linhagens com
as de origem clínica sugere que alguns isolados de alimentos podem ser fontes de contaminação de humanos e animais.
A técnica de ERIC-PCR demonstrou que, apesar de serem diversificadas genotipicamente, as linhagens de diferentes
origens de Y. enterocolitica biotipo 1A estão relacionadas epidemiologicamente.
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Multilocus sequence typing para
identificação de linhagens atípicas
de Yersinia
Souza, RA1; Pitondo-Silva, A1; Brocchi, M2; Falcão, DP3; Falcão, JP1
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
2
Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas
3
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Universidade Estadual Paulista
[email protected]
1
Palavras-chave: Yersinia sp. linhagens atípicas, relações genéticas, análise filogenética, Multilocus Sequence Typing
A classificação fenotípica das 11 espécies de Yersinia é baseada em suas características bioquímicas. O Laboratório de
Referência em Yersinia do Brasil recebeu mais de 700 amostras que foram confirmadas como Yersinia e completamente
tipadas. Entretanto, algumas amostras não puderam ser identificadas bioquimicamente em nenhuma das espécies atualmente
conhecidas e, por essa razão, foram denominadas como Yersinia atípicas. O objetivo desse trabalho foi tentar identificar
essas linhagens atípicas de Yersinia sp. por Multilocus Sequence Typing (MLST). Sete linhagens bioquimicamente atípicas
foram tipadas por análise da seqüência de cinco loci conservados: 16S rRNA e quatro genes housekeeping (glnA, HSP60,
gyrB e recA). Essas seqüências foram comparadas às seqüências de DNA dos mesmos genes de cada uma das 11 espécies
de Yersinia depositadas no GenBank. Após as amplificações cada produto de PCR foi seqüenciado pelo menos três vezes
em ambas as direções. Para cada uma das linhagens atípicas foram obtidas seqüências consenso utilizando o programa
ChromasPro 1.41. Visando obter seqüências de boa qualidade e padronização dos tamanhos, as seqüências resultantes
foram analisadas e suas extremidades excedentes foram excluídas mantendo-se apenas seqüências de ótima qualidade e
tamanho padronizado de 380 a 430 bp. O programa BioNumerics 5.1 foi utilizado para construção dos dendrogramas
de similaridade genética através do algoritmo Neighbor-joining. Valores de bootstrap de 1000 reamostragens foram usados
para estimar a consistência interna das análises filogenéticas. As análises individuais de cada gene bem como as análises
dos quatro genes housekeeping concatenados agruparam duas das linhagens atípicas (FCF 229 e FCF 231) junto ao
cluster de Y. ruckeri. Uma linhagem atípica (FCF 487) foi agrupada junto aos representantes de Y. enterocolitica. Quatro
linhagens atípicas (FCF 216, FCF 465, FCF 457 e FCF 494) foram agrupadas junto a uma Y. frederiksenii que não foi
clusterizada junto aos demais representantes dessa espécie. A proximidade filogenética entre as linhagens atípicas FCF
229 e FCF 231 e Y. ruckeri sugere que elas pertençam a essa espécie e, dessa forma, sejam os primeiros representantes
dessa espécie isolados no Brasil. A proximidade filogenética de uma das linhagens atípicas (FCF 487) e do cluster de Y.
enterocolitica sugere que essa linhagem pertença a essa espécie. O grupo formado pelas linhagens atípicas FCF 216, FCF
465, FCF 457, FCF 494 e Y. frederiksenii sugere que, possivelmente, tais linhagens sejam de uma nova espécie, visto
que o cluster representativo da espécie Y. frederiksenii não teve todos os seus representantes agrupados em um cluster
espécie-específico, como ocorreu para a maioria das espécies. Conclui-se que a análise filogenética por MLST foi melhor
que os testes fenotípicos em tipar amostras que não puderam ser identificadas bioquimicamente em uma das espécies
de Yersinia conhecidas e também permitiu o estabelecimento de relações intra e inter-espécies para esse gênero.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Avaliação da sintenia e dos padrões
de utilização de códons sinônimos
dos genes da ilha de alta patogenicidade
de Yersinia pestis
Figueirêdo-Júnior, CAS; Alecrim, FM1; Batista, MVA1; Cardoso, MV1; Costa-Júnior, CRL1; Cunha, WL1; Freitas, NSA1;
Lima, TLD1; Oliveira, APA1; Tenório, KER1; Balbino, VQ1 Sena-Júnior, MR2; Ferreira, TAE3; Leal-Balbino, TC4; Almeida, AMP4
Laboratório de Genética Molecular Humana, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brasil
2
Departamento de Estatística, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE
3
Departamento de Estatística e Informática, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE
4
Departamento de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Recife, PE
[email protected]
1
Palavras-chave: Yersinia pestis, ilha de patogenicidade, sintenia, genômica comparativa, evolução
A Yersinia pestis, bactéria Gram-negativa da família Enterobacteriaceae, é o agente etiológico da peste, doença primária de
roedores geralmente transmitida pelas pulgas e que pode infectar o homem e outros mamíferos. A patogenicidade da Y. pestis
encontra-se associada, entre outros fatores, à presença de uma região genômica denominada de ilha de alta patogenicidade
(HPI) de aproximadamente 29 Kb e rica em GC. A HPI codifica um sideróforo denominado yersiniabactina (Ybt) que é um
sistema de captação de ferro. A HPI também é encontrada nas outras duas espécies de yersínia patogênicas (Y. pseudotuberculosis
e Y. enterocolitica) e em outras Enterobacteriacae. As descrições sobre as regiões vizinhas à HPI são parciais e ainda não se
dispõe de informações acerca do grau de sintenia entre os genes nelas encontrados. Neste trabalho, analisamos a composição e
utilização de códons sinônimos dos genes da HPI (fyuA, ybtE, ybtT, ybtU, irp1, irp2, ybtA, ybtP, ybtQ, ybtX, ybtS) em cepas de
Y. pestis (CO92; KIM; 91001; Angola; Antiqua; Pestoide), Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica e Escherichia coli (536, APEC
O1, CFT073 e UTI89). As seqüências dos genes presentes em blocos de ~30Kb upstream e downstream em relação às HPIs
(5HPI3s) também foram analisadas. As seqüências e respectivas anotações funcionais dos genes contidos nestes segmentos
foram obtidas no sítio do National Center for Biotechnology Information – NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e compiladas
em um banco de dados local contendo as seguintes informações: posições de início e término de cada gene; contéudo GC;
posição relativa dos genes nos blocos analisados; e seqüência presumida de aminoácidos dos polipeptídeos originados a partir dos
genes investigados. Nossas observações nos mostraram que a forma de utilização de códons sinônimos nas HPIs é inteiramente
similar entre todas as cepas analisadas, evidenciando o alto grau de conservação destes elementos genéticos. A sintenia entre
os blocos localmente colineares (LCBs) foi avaliada pelo software Mauve (http://gel.ahabs.wisc.edu/mauve), visando avaliar a
existência de padrões evolutivos comuns entre as diferentes espécies estudadas. Quando foram consideradas todas as espécies,
os alinhamentos das regiões analisadas revelaram LCBs apenas para os genes das HPIs. Entretanto, quando a análise era restrita
a cepas da mesma espécie, foram identificados padrões de colinearidade entre genes que codificam polissacarídeos, histidinas
quinases e de reguladores associados ao sistema quorum sensing. Observou-se uma inversão na ordem das unidades ybt nas
cepas de Y. enterocolitica, E. coli e de Y. pestis Kim e Pestoide em relação às demais. Mesmo não sendo perfeita, a colinearidade
entre os genes analisados pode indicar a existência de um padrão de expressão antero-posterior ainda não explorado. Portanto,
pode-se presumir que a inserção de elementos exógenos nos genomas hospedeiros não é casual, sugerindo a existência de
mecanismos que restringem a inserção das HPIs em determinadas áreas do genoma bacteriano.
Apoio: FIOCRUZ; FACEPE; e CNPq.
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Detecção da bactéria endossimbionte
Wolbachia em Psilideo-de-Concha
(Hemiptera: Psyllidae) e seus parasitóides
(Physilaphaqus bliteus Hymenoptera: Encyrtidae)
Coscrato, VE1; Marcon, HS1; Costa, SRS1; Wilcken, F2; Marino, CL1
1
Depto. de Genética, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP
Depto. de Fitossanitária, Faculdade de Ciências Agrárias, UNESP, Botucatu, SP
[email protected]
2
Palavras-chave: Wolbachia,16S rDNA, wsp, Controle de Pragas, Psilideo
Wolbachia são bactérias endossimbiontes intracelulares obrigatórias que têm sido detectadas em uma ampla diversidade
de artrópodes. A sua transmissão é vertical, porém a ocorrência de transferência horizontal tem sido demonstrada.
Estas bactérias causam em seus hospedeiros uma série de alterações reprodutivas, dentre elas, incompatibilidade
citoplasmática, feminização, indução de partenogênese e algumas vezes ocorre desvio na razão sexual na prole. Devido
a essa característica de “manipular” a reprodução dos hospedeiros, têm sido intensamente estudadas especialmente em
insetos-praga pelo seu potencial na aplicação em programas de controle populacional. Investigações foram feitas em
Psilideo-de-concha (Glycaspis brimblecombei - Hemíptera: Psyllidae) que é um parasita de espécies do gênero Eucalyptus.
Este inseto, originário da Austrália, vem se dispersando rapidamente pelo seu tamanho reduzido, alta capacidade de
reprodução e sua infestação pode levar a morte de árvores. Neste trabalho investigou-se também a presença da bactéria
em parasitóides (Physilaphaqus bliteus - Hymenoptera: Encyrtidae) que são amensais a esta espécie de psilideo e usados
em muitos paises como controle biológico. A detecção das bactérias foi realizada por PCR, utilizando primers específicos
para uma região do rDNA 16S e de uma proteína de superfície de membrana (wsp) da Wolbachia. Os fragmentos
foram seqüenciados, comparados com o banco de dados NCBI, e mostraram-se homólogos às seqüências de Wolbachia
descritas para outros insetos. As análises dos dados indicam que a presença destas linhagens de Wolbachia é um evento
único para estes grupos taxonômicos. Os dados obtidos até o momento são compatíveis com a hipótese de ocorrência
de transmissão horizontal destas bactérias neste grupo de insetos.
Apoio financeiro: IB-UNESP-Botucatu/IPEF/FCA/UNESP.
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Sensibilidade de Diferentes Primers
na Detecção da bactéria Wolbachia
em Moscas das Frutas do Gênero Anastrepha
Marcon, HS1; Coscrato, VE1; Selivon, D2; Perondini, ALP2; Marino, CL1
1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, UNESP, Botucatu – SP
Instituto de Biociências, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, USP, São Paulo/SP
[email protected]
2
Palavras-chave: Wolbachia, wsp, 16S, ftsZ, mosca das frutas
A bactéria endossimbionte Wolbachia é estudada devido ao grande número de infecções em artrópodes e nematóides,
causando alterações reprodutivas como a incompatibilidade citoplasmática, feminização e partenogênese. A transmissão
desta bactéria é feita via vertical e também horizontal, podendo levar a um desvio sexual na prole. O gênero Wolbachia é
dividido em seis supergrupos taxonômicos, de A a F, os grupos A e B são mais freqüentes em insetos, e os outros grupos
foram descobertos recentemente em outros invertebrados. Este estudo teve como objetivo identificar o tipo de grupo
de Wolbachia presente em 3 populações de moscas de frutas do gênero Anastrepha sp, utilizando seis pares de diferentes
primers, wsp A e B, 16S A e B e ftsZ A e B. Com a utilização dos primers wsp A e B observou-se dupla infecção com
os grupos A e B de Wolbachia em todos os indivíduos estudados. Dados da literatura indicam que o primer wsp pode
gerar fragmentos como pertencentes ao grupo B devido a efeito de reação cruzada. Dessa forma, com a utilização dos
primers 16S A e B e ftsZ A e B pode-se confirmar que as moscas analisadas estavam infectadas somente com o grupo
A, o que indica que houve um falso positivo na detecção da bactéria para o grupo B. Os primers 16S A e B mostraramse mais sensíveis na detecção da bactéria, sendo que os primers wsp A e B e ftsZ A e B foram menos sensíveis, sendo
necessárias algumas alterações na reação de PCR. Um dos primers mais utilizado, em diferentes organismos para se
descobrir a Wolbachia é o wsp, no entanto seu comportamento de reação cruzada e menor sensibilidade faz com que
seja necessário à utilização de outros primers para confirmar a presença da bactéria, para que não sejam gerados dados
de falso positivo ou negativo. Este problema poderia ser resolvido se fossem feitos primers específicos para os diferentes
subgrupos em que a bactéria é subdividida, porém isso se torna impossível, devido o grande número de primers que
seriam necessários.
Apoio Financeiro: Processo: 07/52828-1 - FAPESP.
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Análise de diversidade genética
de bactérias do rúmen e das fezes
de bovinos resistentes a antibióticos por RAPD
Costa, LEO; Queiroz, MV; Mantovani, HC; Araújo, EF
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária, Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: rúmen, fezes, resistência a antibióticos, diversidade genética, RAPD
Neste trabalho, foram isoladas 97 bactérias do rúmen e 87 bactérias das fezes de três bovinos, alimentados com ração
(24% proteína) e silagem de milho. A resistência dos isolados bacterianos aos antibióticos foi avaliada, por meio do
método de diluição em agar, utilizando-se os seguintes antimicrobianos: ácido nalidíxico (NAL), ampicilina (AMP),
cloranfenicol (CHL), eritromicina (ERY), estreptomicina (STR), penicilina (PEN) e tetraciclina (TET). Os isolados do
rúmen e das fezes resistentes a antibióticos foram agrupados, de acordo com as concentrações inibitórias mínimas para
os sete antibióticos testados sendo selecionados representantes de cada grupo para a análise de diversidade. A diversidade
genética de 29 isolados do rúmen e 28 isolados das fezes foi avaliada, por meio da técnica de polimorfismo de DNA
amplificado ao acaso (RAPD). O DNA total de cada isolado foi submetido à amplificação por RAPD utilizando 11
oligonucleotídeos iniciadores (Operon Technologies) e os produtos das reações de amplificação foram analisados por
eletroforese em gel de agarose a 1,5 %. As análises do padrão de bandas realizadas no programa Gel Pro Analyser 3.1.
As matrizes quadradas de distância genética e os dendrogramas foram construídos, utilizando-se o índice de Jaccard
e análise de agrupamento hierárquico pelo método UPGMA no programa Genes. Nenhum isolado do rúmen ou das
fezes foi, simultaneamente, resistente aos sete antibióticos. Os isolados do rúmen, que apresentaram maior número
de marcas de resistência, foram simultaneamente resistentes a seis antibióticos, enquanto os obtidos das fezes foram
simultaneamente resistentes a cinco antibióticos. A matriz de dissimilaridade obtida das bactérias isoladas do rúmen
mostrou que a distância genética entre os isolados bacterianos do rúmen variou de 58 % a 100 %, enquanto a matriz
de dissimilaridade das bactérias isoladas de fezes mostra que a distância genética entre os isolados variou de 16 % a 96
%. No dendrograma dos isolados do rúmen a menor distância genética (58%) foi observada entre os isolados R020
e R096 e a maior distância genética (100%) foi observada entre os isolados R019 e R035 e os demais isolados. No
dendrograma dos isolados das fezes verifica-se que os isolados F117, F118 e F122 possuem maior distância genética
(100%) em relação aos demais, e a menor distância genética foi observada entre os isolados F014 e F042. O padrão de
bandas da amplificação do DNA total dos isolados das fezes evidenciou que a diversidade genética, entre os isolados das
fezes, foi menor do que a diversidade genética entre os isolados do rúmen. Não foi observada existência de correlação
entre a diversidade genética dos isolados e o perfil de resistência aos antibióticos dos isolados.
Apoio financeiro: FAPEMIG CNPq.
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Taxonomia de bactérias celulolíticas
da Mata Atlântica do Estado do Rio de Janeiro
Martinez, IB3; Lemos, AA2; Thompson, CC1; Vicente, ACP2; Thompson, FL1
Departamento de Genética, Instituto de Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro
2
FIOCRUZ
3
Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto Biomédico, Universidade Federal Fluminense
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Mata Atlântica, rDNA 16S, bactérias celulolíticas, taxonomia, biodiversidade
A Mata Atlântica é considerada um dos biomas mais diversos do planeta. Porém, pouco se conhece sobre a biodiversidade
de procariontes deste bioma. O objetivo deste trabalho foi a caracterização taxonômica de procariontes celulolíticos
putativos de oito tipos diferentes de solo que estão distribuídos em uma área de aproximadamente 40 km2 do Parque
Nacional Serra dos Órgãos (RJ). A abundância média de bactérias celulolíticas putativas foi de 1,8 X 107 UFC/g.
Morfotipos representativos de cada tipo de solo foram selecionados. De acordo com as seqüências do rDNA 16S, a
maioria dos morfotipos pertence aos filos Proteobacteria, Actinobacteria e Firmicutes. Isolados dos gêneros Burkholderia
e Mycobacterium, Streptomyces apresentaram ampla distribuição geográfica. A posição taxonômica destes isolados está
sendo determinada por meio da caracterização fenotípica e do seqüenciamento de outros genes, incuindo o recA e o pyrH.
Resultados preliminares apontam para a presença de espécies novas pertencentes aos gêneros Arthobacter, Cupriavidus,
e Mycobacterium, ilustrando uma ampla diversidade microbiana na Mata Atlântica. A maioria dos isolados bacterianos
apresenta atividade celulolítica, sugerindo que eles poderiam ter um papel positivo na ciclagem de carbono do solo.
Apoio financeiro: FAPERJ, CAPES, CNPq.
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Estudo da organização genética
da simulancina 3299
Costa, KFS1; Ceotto, H1; Nes, IF2; Bastos, MCF1
Departamento de Microbiologia Geral, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro
2
Norwergian University of Life Sciences, Noruega
[email protected]
1
Palavras-chave: bacteriocina, simulancina 3299, Staphylococcus simulans 3299, organização genética, regiões intergênicas
A simulancina 3299 é uma bacteriocina recentemente identificada por nós, produzida pela estirpe Staphylococcus
simulans 3299, isolada de gado com mastite bovina no Brasil e com uma atividade antagonística significativa contra
Streptococcus agalactiae, um dos mais importantes patógenos envolvidos em mastite bovina. A purificação do peptídio,
o seqüenciamento de ácidos aminados, experimentos de espectrometria de massa MALDI-TOF e a clonagem do gene
estrutural da simulancina 3299 revelaram que ela é idêntica à nukacina ISK-1, um lantibiótico de 27 ácidos aminados,
detectada em uma estirpe de Staphylococcus warneri isolada de “nukadoko” (produto de fermentação do arroz), no
Japão. Em função dessa identidade, resolveu-se investigar se a simulancina 3299 e a nukacina ISK-1 teriam a mesma
organização genética. Desse modo, foram realizadas amplificações de DNA, por PCR, das regiões intergênicas entre
os genes envolvidos na biossíntese da simulancina 3299, para se comparar com a organização dos genes envolvidos
na biossíntese da nukacina ISK-1. Para a realização do experimento supracitado, pares de oligonucleotídeos foram
empregados. Dos sete fragmentos amplificados, seis produtos tiveram tamanhos correspondentes aos esperados, mas o
produto da amplificação com os iniciadores ORF1 e nukAR foi maior (>1.300 pb) do que esperado (755 pb). Desse
modo, esse fragmento foi clonado no vetor pGEM-T Easy e posteriormente seqüenciado, a fim de se comparar a sua
seqüência com essa mesma região presente no plasmídio codificador da nukacina ISK-1. Foram seqüenciados 646 pb
da extremidade esquerda e 628 pb da extremidade direita do amplicon, faltando seqüenciar parte da região central.
Este seqüenciamento está em fase de conclusão. Análises preliminares dessas seqüências sugerem que o aumento desse
fragmento seja devido à presença de um elemento IS257 na região intergênica entre os genes orf1 e nukA.
Apoio Financeiro: CNPq, PRONEX, FAPERJ.
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Caracterização molecular de consórcios
bacterianos coletados na Lagoa Carioca no
Parque Estadual do Rio Doce-MG
Costa, PS; Lima-Bittencourt, CI; Chartone-Souza, E; Nascimento, AMA
Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Minas Gerais
A colonização dos procariotos ocorre nos mais diversos ecossistemas existentes na Terra e estes podem manter interações
entre si e com outros organismos. A coexistência de bactérias de diferentes gêneros pode levar à formação de um consórcio
onde há a interação entre os diferentes organismos, auxiliando no crescimento e na sobrevivência, através de transferência
gênica e de metabólitos, como aminoácidos ou vitaminas, ou ainda, complementando uma via metabólica, na qual cada
integrante do consórcio realizaria uma parte da via. Este trabalho tem como objetivo a caracterização molecular dos
consórcios bacterianos coletados na Lagoa Carioca, Parque Estadual do Rio Doce (PERD). O PERD possui a maior
área contínua de Mata Atlântica do Estado e contém cerca de 50 lagoas naturais, entre elas a lagoa Carioca, considerada
um ambiente moderadamente eutrofizado. Para o isolamento de bactérias, amostras de água foram plaqueadas em meio
PTYG e incubadas, por até sete dias, a 28oC. Um total de 1255 colônias, aparentemente uniformes, foi recuperado e
repicado em caldo nutriente e, em seguida, estriado por esgotamento com alça de platina em placas com ágar nutriente.
Entretanto, durante a purificação dessas colônias, aparentemente puras, observou-se, após várias passagens de purificação,
que 55 colônias eram constituídas de dois a quatro isolados os quais apresentavam morfologias diferentes. Em alguns
casos, essa associação era muito forte, pois mesmo após vários passos de purificação alguns isolados ainda permaneciam
associados. Ao final do processo de purificação foram obtidos 120 isolados. Em seguida, foi realizada a extração de DNA
e a amplificação do gene de rRNA 16S e os amplicons foram digeridos com as endonucleases de restrição (ARDRA,
Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) NlaIV e AflIII. A análise gerada por ARDRA dos 120 isolados revelou
65 perfis de restrição. Alguns isolados, com morfologias diferentes, vindos originalmente da mesma colônia mostraram
perfil de restrição idêntico. Estes isolados provavelmente são do mesmo gênero ou até da mesma espécie e as diferenças
morfológicas podem ser devidas a alterações na via metabólica. A identificação taxonômica, pelo sequenciamento do
gene de rRNA 16S, dos isolados associados, encontra-se em andamento.
Apoio: CNPq e FAPEMIG.
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Phylogenomics of Enzyme Families Highlights
Metabolic Diversity of Model Bacteria
Nahum, LA1,2; Goswami, S1,3; Serres, MH1
1
Bay Paul Center, Marine Biological Laboratory, USA
Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Brasil
3
Toxikon Corporation, USA
[email protected]
2
Keywords: protein family, phenotypic diversity, molecular evolution, comparative genomics, bioinformatics
Members of gene/protein families are believed to have originated from one or a few common ancestors and have diverged
through multiple processes across lineages over evolutionary time. As shown by independent studies, gene duplication
followed by divergence is the major mechanism by which functional and genomic innovation has been generated in
nature. Families vary in size, composition, and relatedness of their members within and across diverse taxonomic groups
(e.g. species, ecotypes, etc.). Our work aims at understanding how differences among members of enzyme families may
connect to metabolic diversity of the three model bacteria: Escherichia, Bacillus, and Pseudomonas. For this purpose,
we collected amino acid sequences of representative enzyme families including aminotransferases and decarboxylases
and reconstructed evolutionary trees using a Bayesian method. We then combined sequence-based relationships to
biochemical and metabolic knowledge available for the selected organisms. Our results have shown that the clustering of
family members in each tree is supported by the current knowledge of functions of these enzymes, especially in respect
to their reaction mechanism, substrate specificity, and cofactor usage. In some cases, new functional predictions were
made to proteins previously uncharacterized. In summary, our work illustrates how comparative analysis of protein
families may connect genomic information to phenotypic diversity highlighting metabolic capabilities of bacteria and
perhaps contribute to the understanding of other organisms that are relatively unknown or currently uncultured in
the laboratory.
Financial support: Department of Energy (DOE), USA.
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Caracterização das funções envolvidas na
imunidade à aureocina A70
Coelho, MLV; Bastos, MCF
Departamento de Microbiologia Geral, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, UFRJ
[email protected]
Palavras-chave: bacteriocina, imunidade, S. aureus
A aureocina A70 é uma bacteriocina da classe II, produzida por Staphylococcus aureus e codificada pelo plasmídio
pRJ6 (7,9 kb), sendo composta por quatro peptídios de baixo peso molecular (2.954 a 3.086 Da). Dentre as suas
características mais marcantes estão a sua termoestabilidade, a sua sensibilidade à tripsina e a capacidade de inibir
patógenos alimentares importantes como Listeria monocytogenes. Por estes motivos, ela possui um grande potencial
de aplicação como biopreservativo de alimentos. Contudo, apesar destes conhecimentos acerca desta aureocina, os
mecanismos envolvidos na proteção da célula produtora (imunidade) contra a ação da aureocina A70 ainda não foram
elucidados. Há no pRJ6 duas possíveis funções relacionadas com a imunidade: o operon orfAB e o gene aurT. A orfB
codifica uma proteína altamente hidrofóbica, com elevado pI e quatro possíveis domínios de membrana, características
encontradas em proteínas de imunidade, enquanto a orfA codifica uma proteína com características de reguladores de
transcrição, não estando, portanto, diretamente envolvida na conferência de imunidade. O produto do gene aurT é
um transportador ABC de 571 ácidos aminados, relacionado com a secreção da aureocina A70. Em alguns sistemas de
bacteriocinas, o transportador é responsável pela imunidade. O objetivo deste trabalho é entender como a imunidade à
aureocina A70 funciona. Para tanto, o operon orfAB foi amplificado por PCR, clonado no plasmídio pCR2.1-TOPO
(Invitrogen) e subclonado no plasmídio pE194 (Emr) e introduzido nas estirpes de S. aureus RN4220 e A70 Bac(curada do pRJ6) através de transdução generalizada utilizando-se o fago 80α. Curiosamente, não houve modificações
detectáveis na sensibilidade dessas estirpes à aureocina A70. Este resultado preliminar indica que, possivelmente, a orfB
sozinha não confere imunidade à aureocina A70. O próximo passo será clonar o gene aurT e introduzi-lo em estirpes
sensíveis à aureocina A70 que possuam ou não a orfB clonada para se avaliar a conferência da imunidade.
Apoio Financeiro: CNPq, PRONEX, FAPERJ.
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Importância da técnica do PRA (PCRRestriction Enzyme Pattern Analysis)
na confirmação molecular dos isolados
clínicos de pacientes atendidos
no ambulatório da cidade de Araraquara
com suspeita de tuberculose
Miyata, M1; Santos, ACB1; Pavan, FR1; Silva, RMG2; Viana, BHJ2; Leite, CQF1
Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho” – UNESP – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Departamento de Ciências Biológicas –
Lab. de Micobactérias Prof. Dr. Hugo David
2
Serviço Especial de Saúde de Araraquara – SESA – USP – Araraquara - SP
[email protected]
1
Palavras-chave: PRA, Micobactérias, Mycobacterium tuberculosis
A identificação de micobactérias por testes fenotípicos é onerosa e demorada, podendo levar semanas para a definição
da espécie em um diagnóstico. Em algumas micobactérias não pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis,
a identificação através de testes fenotípicos pode carecer de ensaios discriminatórios para diferenciação entre espécies,
levando a conclusões falhas. Uma técnica de identificação molecular versátil e de reprodutibilidade é a técnica do PRA
(PCR- Restriction Enzyme Pattern Analysis), onde é realizada uma PCR para amplificar um fragmento de 439 pb dentro
da seqüência do gene hsp65, específico do gênero Mycobacterium, e a posterior digestão do fragmento por duas enzimas
de restrição (BstEII e HaeIII). Os fragmentos então são revelados em gel de agarose a 4%, obtendo perfis específicos
para cada espécie de micobactéria, sendo estes analisados com o auxílio do PRASITE (http://app.chuv.ch/prasite/index.
html). Por outro lado, bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis são rotineiramente identificados empregando
primers específicos para o complexo, pela amplificação de fragmento de 245 pb contido na seqüência de Inserção IS6110.
Entretanto, esta IS pode estar presente desde múltiplas copias até ausente no genoma do complexo M. tuberculosis. Este
trabalho teve como objetivo avaliar se os 30 isolados clínicos provenientes de pacientes do ambulatório de Araraquara,
com suspeita de tuberculose, identificados fenotipicamente como sendo de M. tuberculosis eram efetivamente deste
complexo. Para tal, os 30 isolados foram submetidos à técnica da PCR para amplificar fragmento do IS6110 e à técnica
do PRA. Dos 30 isolados 21 foram confirmados como sendo de M. tuberculosis pela técnica da PCR apresentando o
fragmento de 245 pb. Dos nove (9) isolados restantes, em cinco (5) o Mycobacterium fortuitum tipo1 foi confirmado
pela técnica do PRA, e os demais isolados foram identificados como de outras micobactérias sendo: M. xenopi, M.
gordonae e M. abcesus. Estas micobactérias são consideradas ambientais, mas com capacidade de infectar pacientes com
imunodebilidade. Nossos resultados indicam que na cidade de Araraquara é possível isolar micobactérias com ausência
da IS6110 e que nestes isolados, a técnica do PRA é de grande serventia para a confirmação da espécie.
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Bioprospecção de estirpes formadoras
de endosporos e produtoras
de ciclodextrinas em amostras de solo
de cerrado e solo de floresta
Siqueira, SC; Vollú, RE; Mota, FF; Seldin, L
Laboratório de genética microbiana, Departamento de Microbiologia Geral, Instituto de Microbiologia, UFRJ
[email protected]
A capacidade de produzir ciclodextrinas (CDs) está restrita a um pequeno grupo de bactérias que produz a enzima
extracelular CGTase (responsável pela síntese de CDs a partir de moléculas de amido). Dentre as bactérias que apresentam
essa característica encontram-se principalmente, estirpes dos gêneros Bacillus e Paenibacillus. Esse estudo teve como
objetivo, realizar a bioprospecção de estirpes formadoras de esporos em amostras de solo de cerrado e de floresta. Após
a pasteurização dos solos e plaqueamento em meio seletivo (TBN), foram isoladas 120 estirpes, sendo metade delas
de solo de cerrado e a outra metade do solo de floresta. Também foi avaliada a produção de amilases e de alfa-CDs e
gama-CDs por essas estirpes em meio sólido contendo amido (Horikoshi). Dentre estas, 40% produziram amilases
em meio Horikoshi, sendo 23 estirpes isoladas de solo de cerrado e 25 estirpes isoladas de solo de floresta. Entre as
48 estirpes produtoras de amilase, somente 21 estirpes isoladas do solo de floresta e 23 estirpes do solo de cerrado
produziram alfa-CDs e gama-CDs em meio Horikoshi contendo amido e os corantes diferenciais alaranjado de metila
(a-CDs) e verde de bromocrisol (gama-CDs). Além disso, as estirpes produtoras de CDs aqui isoladas e outras estirpes
pertencentes ao gênero Paenibacillus foram caracterizadas geneticamente através de BOX-PCR. Após a eletroforese
em gel de agarose dos fragmentos obtidos por PCR, foi detectada uma grande diversidade entre as estirpes. Foram
observados quatro grupos no dendrograma construído com base nos perfis genotípicos, onde as estirpes isoladas do solo
de cerrado se agruparam e ficaram separadas das estirpes do solo de floresta. A partir do perfil gerado no dendrograma e
da avaliação da produção de alfa-CDs e gama-CDs em placa foram selecionadas seis estirpes com um possível potencial
de produção de ciclodextrinas. As estirpes escolhidas foram caracterizadas fenotipicamente através do teste de Gram
para observação da morfologia celular e dos esporos. Foi realizado o teste bioquímico miniaturizado API 50CHB
assim como testes bioquímicos adicionais de degradação da caseína, redução de nitrato, crescimento em anaerobiose,
fermentação acetoínica (VP), crescimento em pH 5.7, e 5% e 10% de NaCl. Os resultados obtidos até o momento
revelaram que a estirpe F20 possui características bioquímicas semelhantes à espécie Paenibacillus polymyxa e que a
estirpe F8 se assemelhou à espécie Bacillus cereus. As seis estirpes selecionadas serão ainda caracterizadas genotipicamente
para complementar os resultados fenotípicos.
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Análise por T-RFLP das estruturas das
comunidades bacterianas em solos e
fragmentos de carvão pirogênico de Terra
Preta Antropogênica da Amazônia
Cannavan, FS; Paulo, EN; Terceti, MS; Tsai, SM
Lab. de Microbiologia e Biologia Molecular - Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA/USP), Piracicaba/SP
[email protected]
Palavras-chave: Terra Preta Antropogênica, T-RFLP, Comunidade bacteriana
A Terra Preta Antropogênica (TPA) é considerada como um dos solos mais férteis do mundo. Este solo pode ser
identificado por sua cor escura, resultado da concentração de substâncias orgânicas depositadas no solo, apresentando
altos teores de cálcio, carbono, magnésio, manganês, fósforo e zinco. A TPA apresenta também maior atividade biológica
quando comparada com os solos adjacentes menos enriquecidos em matéria orgânica. Uma proporção significativa, até
35-45% do carbono orgânico nas TPAs está sob forma de carvão pirogênico comparado a 14% em solos adjacentes. Este
pode significativamente afetar a retenção de nutrientes e ter um papel chave nos processos biogeoquímicos nos solos,
especialmente no ciclo dos nutrientes. Assim, a estrutura das comunidades microbianas nesse habitat é de importância
para o conhecimento da funcionalidade desses microrganismos e seu papel na sustentabilidade da agricultura deste
bioma tropical. Os fragmentos de carvão pirogênico provenientes de TPA, assim como os solos TPA e adjacente foram
analisados por meio da técnica de T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Lenght Polimorphism), um método muito
sensível às mudanças na estrutura bacteriana do solo. Na coleta de amostras, uma trincheira foi aberta em cada solo nas
profundidades 10 e 20 cm, no Sítio Mina I, na Floresta Nacional de Caxiuanã, Pará, para análises químicas e moleculares.
Na separação do carvão pirogênico do solo TPA, foi usada pinça esterilizada com auxílio de lupa estereoscópica. O DNA
total das amostras de solo TPA, solo adjacente e carvão pirogênico foram extraídos e o gene 16S rRNA bacteriano foi
amplificado utilizando primers universais, sendo um deles marcado com 6FAM. Os amplicons foram digeridos com
as enzimas MspI e HhaI em reações separadas. O comprimento dos fragmentos terminais de restrição foi determinado
através de análise de fragmentos com o seqüenciador ABI 3100 e o programa Peak Scanner 1.0 (Applied Biosystems).
Os dados foram analisados através de Análise de Componentes Principais (PCA) utilizando distância de Hellinger,
com o programa CANOCO 4.5. A PCA revelou agrupamentos bem distintos das amostras de solo TPA, carvão e solo
adjacente. Dados preliminares indicam que os resultados obtidos pela técnica de T-RFLP apresentaram maior diversidade
de Eubactéria em solo de TPA e carvão quando comparado com solo adjacente. Na análise química dos solos, amostras
de TPA apresentaram elevados teores de cálcio, matéria orgânica, capacidade de troca de catiônica, pH, soma de bases
e fósforo quando comparados com solos adjacentes.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Banco de dados biológico especializado
no conhecimento e análise de sistemas
secretórios de tipo IV (T4SS) em bactérias
Souza, RC1; Netto, DS1; Costa, M2; Vasconcelos, ATR1; Nicolás, MF1,2
Laboratório de Bioinformática, Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC)
Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Biologia, Universidade Federal da Bahia (UFBA)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bactérias, Banco de dados biológico, T4SS, Anotação de Proteínas, Filogenia
O T4SS pode ser classificado como uma família de transportadores de macromoléculas envolvidos em diferentes funções
bacterianas. A maior subfamília do T4SS é a do sistema de conjugação, o qual permite a transferência de material
genético entre bactérias. Analogamente à conjugação, o sistema pode transferir material genético entre bactérias e
eucariotos, tal como a transferência de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens. O sistema de transporte de proteínas
efetoras constitui uma segunda subfamília do T4SS, sendo indispensável nos processos de infecção de vários patógenos
de mamíferos e plantas. A última subfamília corresponde ao sistema “DNA uptake/release” que funciona independente
de contato com uma célula alvo. (Christie et al., 2005, Dillard, et al., 2001). Muitas características básicas do T4SS
são bem conhecidas, entretanto o conhecimento para a classificação simples e intuitiva ou a anotação apropriada das
proteínas continua ambíguo, impedindo em alguns casos estabelecer correlações evolutivas deste sistema em bactérias.
Com a finalidade de organizar, classificar e integrar o conhecimento do T4SS foi construído um banco de dados
especializado para este sistema secretório bacteriano. O banco de dados T4SS foi criado utilizando o SGBD MySQL
e a linguagem Perl. Uma interface web (HTML/CGI) fornece acesso ao banco. Este banco conta atualmente com
44 genomas bacterianos e 10 plasmídeos obtidos do GenBank NCBI, estes organismos vão desde Actinobactérias até
Proteobactérias, incluindo simbiontes e patogênicos. Foi utilizada a metodologia do “Bidirectional Best-Hits”, com a
qual foi possível obter um conjunto mínimo de 45 “clusters” entre 896 proteínas envolvidas no T4SS comuns entre as
bactérias que compõem o banco. Nesta etapa, também os programas BlastP, Muscle e ClustalW foram utilizados. O
banco foi anotado manualmente utilizando referências cruzadas incluídas nas páginas de anotação do T4SS, tais como
UniProtKB/Swiss-Prot, COG, InterPro e TCDB. Também, para cada cluster foram realizadas análises filogenéticas
através dos métodos “Neighbor-Joining” e “Maximum Likelihood”. Nossas análises do banco T4SS permitiram criar
uma classificação hierárquica e funcional para as proteínas do T4SS, consistentes em cinco grupos (Type IVA Mpf/
T4CP, Type IVA Dtr, F-type plasmid, IncP–type plasmid, Type IVB Icm/Dot) contendo várias famílias de proteínas,
as quais podem estar envolvidas em conjugação, transferência de T-DNA, transferência de efetores ou “DNA uptake/
release”. Além disso, através da análise filogenética, foi possível verificar que T4SSs envolvidos em transferência de
efetores evoluíram de plasmídeos conjugativos adquiridos, provavelmente, via transferência horizontal de genes (HGT).
O banco T4SS será de uso público, oferecendo ao usuário respostas sobre a classificação hierárquica e análise filogenética
do sistema submetido.
Apoio financeiro: MCT e CAPES.
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Genes de resistência a antibióticos
selecionados de biblioteca metagenômica
de solo de Terra Preta de Índio, Amazonas
Carvalho, CF1; Leomil, L1; Astolfi-Filho, S1
Laboratório de Tecnologias de DNA, CAM, UFAM, Manaus, AM
[email protected]
1
Muitos microrganismos na natureza não podem ser cultivados por técnicas tradicionais de cultivo, sendo necessário o
desenvolvimento de outros métodos, como a clonagem direta de DNA ambiental em vetores apropriados que servem
para estudar a grande diversidade microbiana presente em comunidades bacterianas não-cultiváveis - abordagem
metagenômica. Para se pesquisar genes microbianos de amostras ambientais isoladas sem cultivo prévio, são desenvolvidas
as bibliotecas metagenômicas. Tais amostras ambientais são provenientes de diversas fontes, sendo os solos conhecidos
como grande reservatório de bactérias ainda desconhecidas, que chegam a conter até dez mil espécies procarióticas não
relatadas em um grama de solo. Os solos de Terra Preta de Índio (TPI) encontrados na região Amazônica possuem
um alto grau de fertilidade, além de ser rico em minerais e apresentar grandes quantidades de matéria-orgânica, o que
possibilita o crescimento e manutenção de bactérias e outros microrganismos. Nesse ambiente fértil a competição entre
integrantes da microbiota faz com que esse habitat seja rico em metabólitos secundários, entre eles os antibióticos e
conseqüentemente de seus genes de resistência.. Utilizando técnicas de seleção, juntamente com técnicas de engenharia
genética, genes de resistência a diferentes antibióticos presentes em solos de TPI podem ser clonados e caracterizados. A
partir de uma biblioteca metagenômica de TPI construída de fosmídios (pCC1FosTM – EPICENTRE - Biotechnologies)
contendo cerca de 15.000 clones independentes, foi possível isolar um clone contendo gene de resistência a tetraciclina
e dois clones contendo genes de resistência à ampicilina. Os genes estão sendo subclonados e serão seqüenciados e
analisados por ferramentas de bioinformática. O isolamento e a caracterização desses genes poderá contribuir para
o melhor entendimento das relações entre os microrganismos nessa microbiota e servirá para a construção de novos
vetores de clonagem molecular em microrganismos.
Apoio: CT-AMAZONIA/MCT/CNPq/FAPEAM.
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Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
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Caracterização de novas espécies
de bactérias isoladas
da Ilha Rei George, Antártica
Jesus, HE; Peixoto, R; Teixeira, LCRS; Rosado, AS
Laboratório de Ecologia Molecular Microbiana – Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
Isolada dos demais continentes por correntes oceanográficas e pela distância, a Antártica é um ambiente que se caracteriza
por extremos de clima, habitats e biogeografia. Em um ambiente tão restritivo, os ciclos biogeoquímicos e as cadeias
alimentares chegam a ser exclusivamente formadas por microrganismos. Dessa forma, os microrganismos têm um papel
fundamental no transporte de energia, matéria e muitas vezes constituem a base do funcionamento dos ecossistemas
terrestres e aquáticos na Antártica. Apesar disso, o tema da diversidade biológica no ambiente antártico durante muitos
anos esteve relacionado com a diversidade de peixes, aves e mamíferos marinhos e raramente os microrganismos foram
contemplados. Mais recentemente, após a introdução das técnicas moleculares esse conhecimento tem avançado,
trazendo novas informações sobre evolução, endemismo, invasão e seleção. Os objetivos do presente projeto é avaliar
a diversidade da população bacteriana total presente nas amostras de solos coletados na Ilha Rei George. As atividades
desenvolvidas durante o período envolveram a coleta de amostras de sedimento, solo, vegetação (liquens, musgos e
gramíneas) Parte das amostras obtidas foi processada no laboratório do módulo de química da EACF (Estação Antártica
Comandante Ferraz) e parte armazenada para análises no Brasil. As amostras de solo e sedimento foram coletadas com
colheres estéreis, e armazenadas em bolsas Whirl pack também estéreis, em cada ponto foi retirado a camada superior
e foram coletadas amostras de 0-10 centímetros de profundidade. Foram obtidos 200 isolados bacterianos que tiveram
seu DNA genômico extraído com a utilização do Kit comercial Quiagen e amplificado via PCR utilizando iniciadores
para BOX-PCR. A seguir, o DNA de representantes de cada grupo foi amplificado com iniciadores específicos para o
16S rRNA e os amplicons foram sequenciados. As seqüencias obtidas indicam a presença de espécies bacterianas da
Antártica (Antarticobacter sp., Polaribacter sp.) e também novas espécies de procariontes.
VINCENT, W. F. Evolutionary origins of Antarctic microbiota: invasion, selection and endemism. Antarctic Science, v. 12, p.
374-385, 2000. CLARKE, A. Evolution, adaptation and diversity: global ecology in an Antarctic context. In: HUISKES, A. H.
L.; GIESKES, W. W. C.; ROZEMA, J.; SCHORNO, R. M. L.; VAN DER VIES, S. M.; WOLFF, W. J. (Eds). Antarctic Biology
in a Global Context, Backhuys Publishers, Leiden, pp. 3-17, 2003.
OBS: RETIRAR REFERÊNCIAS?
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Diversity of endophytic bacteria from
Eucalyptus species seeds and colonization
of seedlings by Pantoea agglomerans
Ferreira, A1; Quecine, MC1; Lacava, PT1; Oda, S2; Azevedo, JL1; Araújo, WL1,3
Departamento de Genética, Esalq/USP. Piracicaba, São Paulo
2
Suzano Bahia Sul Papel e Celulose S/A. Suzano, São Paulo
3
Núcleo Integrado de Biotecnologia, UMC. Mogi das Cruzes, São Paulo
[email protected]
1
Keywords: Microbial ecology, 16S rRNA, fluorescence microscopy, plant bacteria interaction
The diversity and beneficial characteristics of endophytic microorganisms have been studied in several host plants.
However, information regarding naturally occurring seed associated endophytes and vertical transmission among different
life history stages of hosts is limited. Endophytic bacteria were isolated from seeds and seedlings of ten Eucalyptus
species and two hybrids. Those bacteria were identified for 16S rRNA gene sequencing and evaluation in BLASTn
(National Center for Biotechnology Information website) against the data base of the GenBank. The results showed that
endophytic bacteria, such as Bacillus, Enterococcus, Paenibacillus and Methylobacterium are vertically transferred from
seeds to seedlings. In addition, the endophytic bacterium Pantoea agglomerans was tagged with the gfp gene, inoculated
into seeds and further re-isolated from seedlings. These results suggested a novel approach to change the profile of the
plants, where the bacterium is a delivery vehicle for desired traits. This is the first report of an endophytic bacterial
community residing in Eucalyptus seeds and the transmission of these bacteria from seeds to seedlings. The bacterial
species reported in this work have been described as providing benefits to host plants. Therefore, we suggest endophytic
bacteria can be transmitted vertically from seeds to seedlings, assuring the support of the bacterial community in the
host plant.
Financial Support: Suzano Papel e Celulose S/A, CNPq.
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Vias de resposta do sistema antioxidante
bacteriano a herbicida da classe
cloroacetanilida
Carvalho, G1; Martins, PF1; Pileggi, M2; Azevedo, RA1
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo
2
Departamento de Biologia Estrutural, Molecular e Genética, Universidade Estadual de Ponta Grossa
[email protected]
1
Palavras-chave: Bactéria, Herbicida, Sistema antioxidante
O estudo dos pesticidas é de grande importância devido aos seus efeitos tóxicos ao homem e outros seres vivos, associados
à exaustiva utilização destes na agricultura. Espécies Ativas de Oxigênio (EAOs) são normalmente produzidas pelo
metabolismo aeróbio. A exposição a agentes estressantes, como herbicidas, pode intensificar a produção dessas EAOs e
causar sérios danos ao metabolismo celular. Em resposta a esse desequilíbrio redox, as bactérias ativam mecanismos de
defesa nos quais estão envolvidos dois tipos de sensores: 1) reações com o grupo tiol, onde o gene OxyR é o sensor de
estresse causado por H2O2 e codifica um fator de transcrição que ativa a expressão das enzimas como catalase (CAT)
glutationa-redutase (GR) e 2) reações que envolvem o grupo de ligações Fe-S, cujo regulon SoxRS, está envolvido na
defesa contra o radical superóxido, que pode aumentar a atividade de aproximadamente 45 proteínas, entre elas a enzima
superóxido dismutase (SOD). Alguns dados de literatura relacionam a tolerância de microrganismos a herbicidas com
a capacidade de resposta do sistema antioxidante, responsável pelo combate as EAOs. O objetivo desse trabalho foi
estudar a relação entre o efeito do herbicida acetochlor (classe toxicológica I) e a resposta do sistema antioxidante de
três linhagens de Klebsiella oxytoca (I, II e III) isoladas de solos. As linhagens foram submetidas ao crescimento em meio
nutritivo (controle) e com herbicida nas concentrações de 62 e 620 mM. Foram avaliados o perfil protéico e a atividade
das enzimas antioxidantes CAT, GR e SOD. O perfil protéico revelou diferenças de intensidade das bandas, bem como
a presença e ausência das mesmas em meio com herbicida. O estresse oxidativo foi avaliado através da peroxidação de
lipídeos, a qual foi constatada nas linhagens I e II para as duas concentrações testadas e para a linhagem III apenas na
concentração de 62 mM. As três linhagens apresentaram indução da atividade enzimática para as duas vias de defesa: em
combate ao peróxido (CAT) e ao superóxido (SOD) na concentração de 62 mM seguida de queda em 620 mM. Para
a atividade da GR foi observado decréscimo gradativo da atividade com o aumento da concentração de herbicida para
as três linhagens. Esses dados sugerem que há integração das duas vias de defesa em resposta a presença do herbicida
e que essa reposta foi efetivamente positiva ao combate as EAOs para a linhagem III na concentração de 62 mM. O
estudo da resposta antioxidativa de microrganismos na presença de xenobióticos é importante para a compreensão de
mecanismos de tolerância, biodegradação, bem como para aplicação na biorremediação de ambientes contaminados.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP.
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Análise da comunidade Metanotrófica de
uma Zona Anóxica do reservatório da Usina
Hidrelétrica de Tucuruí, Pará
Graças, DA1; Ghilard Jr., R2; Barbosa, MSR1; Silva, A1; Schneider, MPC1
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Polimorfismo de DNA
2
Centrais Elétricas do Norte do Brasil S/A. Superintendência de Meio Ambiente
[email protected]
1
Palavras-chave: Metagenoma, Metanotróficas, Zona Anóxica
A oxidação do metano (CH4) em ambientes anóxicos aquáticos e terrestres é mediada por microorganismos, e possui
importância global, devido ser um dos gases que mais contribui para o efeito de estufa. Bactérias oxidantes de metano
ou metanotróficas formam uma comunidade microbiana que utilizam este gás como única fonte de carbono e energia,
participando desta forma do ciclo do metano. Estas bactérias oxidam metano através de uma enzima chamada metano
monooxigenase particulada, situada no citoplasma e codificada pelo gene pmoA. Neste trabalho foi utilizada uma
abordagem metagenômica para caracterizar a comunidade metanotrófica presente numa zona anóxica do reservatório
da Usina Hidrelétrica de Tucuruí-PA, chamada Caraipé. Para isto, foram coletadas amostras de água e do sedimento,
separadamente, para a extração de DNA, feita de acordo com o protocolo de Fenol/Clorofórmio. O DNA extraído foi
utilizado como molde para amplificação, via PCR, utilizando os iniciadores A189f e A682r descritos na literatura. Os
amplicons foram purificados e ligados em plasmídeo pCR 2.1 (Invitrogen) e depois eletrotransformados em bactérias
competentes TOP10 (Invitrogen). A seleção dos clones recombinantes foi realizada em placas contendo X-Gal e
amplicilina. Da biblioteca obtida, cerca de 80 clones foram analisados em seqüenciador automático MegaBACE 1000 e
os reads gerados foram submetidos a ferramentas de bioinformática como ClustalW, Mallard e BLAST para alinhamento
múltiplo, checagem de quimeras e identificação das seqüências mais próximas em bancos de dados, respectivamente.
Após análises estatísticas, 49 seqüências restantes foram submetidas ao BLAST que identificou que a totalidade é
classificada dentro do filo Proteobactéria, sub-filo γ-Proteobactéria e também relacionada à outras Proteobactérias
não-cultiváveis. Baraúna et al. (2007), utilizando o 16S rRNA como gene marcador, encontrou nesta mesma zona
anóxica um número muito elevado de γ-Proteobactéria. As usinas hidrelétricas têm sido alvo de diversos estudos sobre
as emissões de gases do efeito estufa pelo reservatório, vertedouro e turbinas, e tendo em vista que as comunidades
microbianas estão diretamente envolvidas na produção e consumo destes gases, são necessários aprofundamentos
acerca da concentração destes microorganismos nas amostras, bem como a quantificação de genes envolvidos no ciclo
biogeoquímico do carbono para estabelecer uma relação consumo/produção.
Apoio Financeiro: Eletronorte & CNPq.
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Identificação de bactérias endofíticas em
Piper tuberculatum Jacq
Nascimento, SB; Costa, CNM; Cardoso, CMY; Harada, ML; de Souza, CRB
Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém-PA
[email protected]
Palavras-Chave: Piper tuberculatum Jacq, Fusarium solani f. sp. piperis, bactérias endofíticas, gene 16S rDNA, diversidade
Piper tuberculatum Jacq é uma espécie nativa da Amazônia que pertence à família Piperaceae. Pesquisas agronômicas têm
referido esta espécie como resistente ao fungo Fusarium solani f. sp. piperis que causa a fusariose em pimenteira-do-reino
(Piper nigrum L). O objetivo do presente trabalho foi estudar a diversidade da comunidade de bactérias endofíticas
de raízes de plantas de plantas de P. tuberculatum coletadas de mata secundária da região de Ananindeua-PA. As raízes
foram esterilizadas externamente com álcool 70% e hipoclorito de sódio 2% e maceradas na presença de tampão PBS.
Em seguida, o extrato foi espalhado em placas individuais contendo meio Ágar nutritivo e Ágar triptona de soja, as
quais foram incubadas a 27ºC, por até três dias para crescimento bacteriano. As bactérias foram agrupadas em quarenta
grupos de acordo com a morfologia, forma de crescimento e cor da colônia. Amostras de DNA genômico de 16 grupos
de bactérias foram obtidas e utilizadas na amplificação do gene 16S rDNA. Em todas as amostras foram amplificados
fragmentos em torno de 1,5 Kb de tamanho, os quais foram clonados e seqüenciados. As seqüências nucleotídicas obtidas
foram avaliadas através de análises comparativas em banco de dados utilizando-se o programa BLASTn do NCBI. Os
resultados das análises preliminares mostraram alta homologia com: Rhizobium sp., Burkholderia sp., Agrobacterium
rhizogenes, Ralstonia sp., Cupriavidus pauculus, Bacillus sp., Enterobacter sp., Pantoea agglomerans, Gamma proteobacterium,
Erwinia persicinus, Ensifer adhaerens, Sinorhizobium sp., Alpha proteobacterium, Arthrobacter sp. e Pseudomonas sp. Os
resultados obtidos indicam que as bactérias endofíticas isoladas de raízes de P. tuberculatum podem estar potencialmente
envolvidas na interação planta-microrganismo através de mecanismos relacionados à promoção do crescimento vegetal,
fixação de nitrogênio e controle biológico. Análises de filogenia molecular estão sendo realizadas para complementar a
identificação das bactérias isoladas.
Apoio Financeiro: UFPA e CNPq.
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Bactérias endofíticas e promoção
de crescimento em cacaueiro
Leite, HAC1; Silva, AB1; de Souza, JT2; Gramacho, KP3; Loguercio, LL1
Endophytic bacterias and growth-promoting in cacao tree
1
Universidade Estadual de Santa Cruz-UESC
2
Universidade Federal do Recôncavo Bahiano - UFRB
3
Centro de Pesquisas do Cacau – CEPEC/CEPLAC
[email protected]
Palavras-chave: Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae, colonização endofítica, RAPD, cacau
Microrganismos endofíticos beneficiam as plantas em diversas situações ao produzirem substâncias de interesse
biotecnológico (enzimas, fitormônios, antimicrobianos), promover tolerância a estresses e resistência sistêmica, ou
mesmo auxiliar no controle biológico. Neste trabalho, dois isolados bacterianos endofíticos – ‘344’ e ‘629’, previamente
obtidos de plantas de cacau sadias, foram caracterizados molecularmente e em seus efeitos na promoção de crescimento
vegetativo em cacau. O seqüenciamento dos genes 16S rDNA e hsp-60 (heat-shock protein 60 kDa) para o 344 e
629, bem como rpo-B (subunidade β da RNA polimerase) para o 344, permitiu a classificação taxonômica desses
isolados como sendo pertencentes às espécies Enterobacter cloacae (344) e Bacillus subtilis (629). Em experimentos de
casa-de-vegetação utilizando-se plântulas de cacau ‘comum’ (cv ‘Sial 70’), suspensões bacterianas dos isolados 344
e 629, em duas concentrações, foram inoculados por imersão de sementes e aplicação direta no solo. As plântulas
foram acompanhadas por 90 dias, sendo que avaliações da altura da parte aérea e contagem do número de folhas
foram feitas a cada 15 dias. Em cada avaliação, plântulas de cada tratamento eram removidas, desinfestadas
superficialmente, e segmentos de raiz, caule e folhas eram plaqueados em meio TSA para avaliação da presença
do endofítico. Além da análise morfológica (aspecto típico de colônias dessas espécies), primers RAPD foram
utilizados para verificar a recuperação dos endofíticos inoculados. Observou-se que plântulas inoculadas com
suspensão bacteriana de 1010 UFC.ml-1 do isolado 629 diretamente no solo apresentaram diferença significativa de
crescimento em relação às plântulas controle. De acordo com a morfologia de colônia e os padrões de amplificação
obtidos a partir de 5 primers de RAPD, em DNA extraído de isolados antes e depois da inoculação, verificou-se
que ambos os endofíticos foram re-isolados de todas as partes da planta, evidenciando colonização generalizada
dos mesmos. Esses resultados indicaram efeito positivo de promoção de crescimento em plântulas de cacaueiro
pelo isolado 629 de Bacillus subtilis. Análise comparativa da biomassa total das plântulas inoculadas e controle está
em andamento, visando confirmar os efeitos encontrados. A partir desses resultados, o padrão temporal e espacial
de colonização desses endofíticos poderá ser adequadamente estudado, visando auxiliar no manejo futuro dessa
característica de interesse agronômico.
Apoio: FAPESB.
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Diversidade filogenética de bactérias
presentes em ecossistema pristino e
anóxico do reservatório da UHE Tucuruí,
Pará
Baraúna, RA1; Miranda, PRO1; Ghilardi Jr, R2; Andrade, SS1; Barbosa, MSR1; Schneider, MPC1; Silva, A1
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Polimorfismo de DNA
2
Superintendência do Meio Ambiente, Centrais Elétricas do Norte S/A
[email protected]
1
Palavras-chave: Metagenoma, filogenética, bactérias
A Usina Hidrelétrica de Tucuruí (UHE Tucuruí) está localizada no Sudoeste do Estado do Pará, no Rio Tocantins. Sua
construção levou à inundação de 2.785 km2 de floresta primária para formação de seu reservatório, caracterizando-se como
um ambiente de interesse para estudos metagenômicos. As seqüências obtidas por extração direta de ácidos nucléicos
do ambiente, podem revelar a diversidade filogenética de duas regiões do reservatório que apresentam características
distintas quanto a sua localização geográfica e seus parâmetros físico-químicos. A região C1 é um ambiente anóxico e
mais próximo à barragem da usina, enquanto a região M5 é um ambiente prístino fora do reservatório. Dessa forma,
objetivou-se caracterizar as seqüências do gene 16S rRNA de bactérias presentes nestes dois ambientes. Fragmentos
deste gene com aproximadamente 1200 nt foram amplificados, clonados e seqüenciados. As seqüências obtidas foram
editadas nos aplicativos Sequencher e Bioedit, e a presença de quimeras analisada no programa Mallard. Utilizando-se
a ferramenta Sina Webaligner disponível no banco de dados ARB-SILVA alinhou-se as seqüências de acordo com sua
estrutura secundária. Deste alinhamento obteve-se uma matriz de distância no modelo Jukes-Cantor pelo software
Phylip. O arquivo gerado foi analisado pelo programa DOTUR para identificação das OTU’s únicas em nível de
espécie com 3% de dissimilaridade. Das 300 seqüências, 45 foram classificadas como quimeras e retiradas da análise.
Na região C1 foram observadas 58 OTU’s únicas na camada fótica, estimando-se uma diversidade total de 219 espécies
pelo modelo Ace e 170 pelo Chao, além de 69 OTU’s únicas na camada afótica, com estimativa de 522 espécies pelo
estimador Ace e 1.014 pelo Chao. Na região M5 foram observadas 22 OTU’s únicas na camada fótica, estimando-se uma
diversidade de 210 espécies por Ace e 141 pelo Chao. A partir da árvore gerada, pode-se observar uma predominância
de cianobactérias em M5, sendo a maioria das seqüências agrupadas com Synechococcus e cianobactérias não cultiváveis,
diferente da camada fótica de C1 que apresentou uma maior diversidade entre os filos actinobactéria e proteobactéria. Já
na sua camada afótica, o filo de maior predominância foram as proteobactérias, sendo a maioria dos contigs agrupados
no clado da classe gama proteobactéria. A presença deste filo pode ser explicada devido a região C1 ser um ambiente
com presença predominantemente de arqueias metanogênicas (Graças et al. 2007), sendo as proteobactérias um filo
que participa ativamente da degradação do gás metano produzido extensivamente por este grupo de arqueias. Além
disso, proteobactérias e cianobactérias são os principais responsáveis pelo seqüestro do carbono proveniente da matéria
orgânica da floresta submersa, devido estarem envolvidos na assimilação deste composto pelo ciclo de Calvin-BensonBassham. Por fim, com auxílio dos estimadores não-paramétricos Ace e Chao pode-se caracterizar a camada anóxica
da região C1 como a mais diversa dentre aquelas estudadas.
Apoio Financeiro: ELETRONORTE e CNPq.
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Diversidade de arquéias metanogênicas
da região C1 do reservatório da usina
hidroelétrica de Tucuruí baseada na estrutura
tridimensional da proteína Mcr alfa
Santana, PPB1; Ghilardi, RJ3; Alves, CN2; Silva, JRA2; Schneider, MPC1; Silva, AC1
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Exatas e Naturais
3
Centrais Elétricas do Norte do Brasil S/A, Superintendência de Meio Ambiente
[email protected]
1
2
Palavras-chave: arquéias, metano, diversidade, estrutura 3D, modelagem de homólogos, mcrA
As arquéias metanogênicas caracteristicamente metabolizam compostos de carbono, sob condições anaeróbias, e liberam
metano no ambiente. A enzima metil coenzima M reductase (Mcr) está presente em todas as arqueias metanogênicas,
promovendo a liberação de metano que é um dos gases agravadores do efeito de estufa, além de ser de interesse da industria
de biocombustíveis. Este fenômeno causado por esta enzima é de grande importância. O acesso a estrutura tridimensional
(3D) desta enzima é possível usando o método da modelagem de homólogos a partir da seqüência nucleotídica. Dada a
importância ambiental e possíveis aplicações biotecnológicas, este estudo destinou-se a análise da diversidade de arquéias
metanogênicas, baseando-se na estrutura 3D da proteína alfa de mcr, da região C1 do reservatório da UHE-Tucuruí, zona
anóxica e rica em matéria orgânica em decomposição. Foi coletada amostra de sedimento, e o amplicon mcrA gerado
por PCR. Os amplificados (750pb) foram clonados em pGEM-T vector (Invitrogen) e transformados em E.coli Top10
(Promega Corp, EUA) por eletroporação. Os plasmídeos recombinantes foram seqüenciado no MegaBACE 1000 (GE
HealthCare, EUA) e as seqüências nucleotídicas e de aminoácidos foram editadas e alinhadas com ClustaW e BioEdit
7.05. No programa Dotur 1.3, de um total de 28 seqüências nucleotídicas, 17 unidades taxonômicas operacionais únicas
foram determinadas, com as quais gerou-se as árvores gênicas, de nucleotídeo e aminoácido, no programa MEGA 4.1
aplicando modelo de máxima parcimônia. As estruturas 3D foram geradas no servidor online Swiss Model e avaliadas
nos programas Procheck 3.0 e Prosa 3.0. Para detectar quaisquer desvios de dobramento foi calculado índice de RMSD
(Root Mean Square Deviation) no programa VMD 1.8.6, e as estruturas 3D foram superpostas no programa UCSF
Chimera. Ao comparar as árvores de nucleotídeos e de aminoácidos uma maior resolução foi observada em nível de
seqüência de nucleotídeos, o que explica-se pelo fato de mutações em nucleotídeos nem sempre refletirem mudança de
aminoácidos. O índice RMSD foi igual a 0.06, indicando desvio pouco significante entre os dobramentos das estruturas
3D, o que também foi observado através da superposição destas. As estruturas 3D de mcrA de arquéias da região C1 na
UHE-Tucuruí mostraram-se pouco variantes, assim como seqüências nucleotídicas e protéicas das mesmas. O perfil da
comunidade de arquéias de C1 na UHE-Tucuruí é bastante homogêneo, concordando com estudo anterior, baseado
em 16S rDNA, que verificou uma abundância de 82% de methanomicrobiales (Assis et al. 2007). O achado não exclui
a possibilidade de que outras arqueias metanogênicas possam ser encontradas em diferente período sazonal.
Apoio Financeiro: Eletronorte S/A, UFPA e CNPq.
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Caracterização de isolados de bactérias
promotoras de crescimento de plantas
(BPCPS) em relação à presença
de enterotoxinas
Crialesi, PCB1; Thuler, AMG1; Thuler, RT2; Lemos, MVF1
Depto de Biologia Aplicada a Agropecuária, Universidade Estadual Paulista - UNESP/FCAV
2
Depto de Fitossanidade/Entomologia, Universidade Estadual Paulista - UNESP/FCAV
[email protected]
1
Palavras-chave: controle biológico, enterotoxinas, BPCP, PCR, microrganismos
A maioria dos relatos de resistência induzida mediada por microrganismos está relacionada com as Bactérias Promotoras
de Crescimento de Plantas (BPCPs), organismos que podem colonizar as plantas de forma endofítica ou epifítica,
promovendo efeitos benéficos como: o maior desenvolvimento de plantas, resistência a artrópodes e a doenças, além
da adaptação a estresses ambientais. Observações recentes de algumas dessas bactérias mostraram que essas podem,
também, apresentar efeito entomopatogênico quando utilizadas diretamente sobre insetos-praga. Além desta ação
entomopatogênica, algumas dessas bactérias são responsáveis por ocasionar doenças gastro-intestinais, uma das espécies
de BPCP presentes neste estudo é a Bacillus cereus, conhecida por causar sérios problemas à indústria de produtos
alimentícios. As enterotoxinas HBL e NHE são atualmente apontadas como causadoras das infecções diarréicas por
contaminação alimentar, devido ao B. cereus. Esta também possui o gene plcR (regulador pleiotrópico) que atua como
fator de virulência, pois contribui na lesão do tecido, induzindo a degradação dos neutrófilos. Este trabalho objetivou
caracterizar os isolados de BPCP quanto à presença das enterotoxinas HBL, NHE e o regulador pleiotrópico plcR
através de análises moleculares. Para tanto foi realizada a extração do DNA total de 11 isolados através do protocolo
de MARMUR et al., (1961), em seguida esse material foi utilizado para reação de PCR (Reaction Chain Polimerase)
com iniciadores específicos dos genes acima citados. A presença dos genes foi confirmada por eletroforese em gel de
agarose 1,5% contendo brometo de etídio. Dentre os isolados analisados, seis confirmaram presença para o gene hbl
(883pb), cinco para o gene nhe (1200pb) e apenas dois para o gene plcR (684pb). Os isolados Bacillus cereus (C240)
e Enterobacter cloacae (ENF14) possuem os três genes referidos. Os genes hbl e nhe foram detectados nas linhagens
B. thuringiensis kurstaki (HPF14), B. megaterium pv. cerealis (RAB7), B. cereus (C210) e B. amyloliquefaciens (PEP81)
e nenhum gene relacionado às enterotoxinas estudadas foram constatados nas demais linhagens (B. subtilis, Kluyvera
ascorbata, Alcaligenes piechaudii, B. Kenyae e B. pumilus), permitindo sua utilização como bioinseticida no cultivo de
alimentos. Como BPCP, essas bactérias permitem um controle biológico eficaz, diminuindo os custos de produção
e evitando perdas no plantio. Devido a grande demanda por tecnologias que viabilizam uma agricultura sustentável,
pode-se esperar que futuramente, uma percentagem maior destas bactérias seja usada na produção de alimentos. Tornase necessário, portanto um estudo minucioso em relação a efeitos subsidiários que estas bactérias possam promover
quando em contato direto com o homem, como estudos da expressão desses genes enterotóxicos.
Apoio Financeiro: CAPES.
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Método molecular para identificação
das bactérias metabolicamente ativas
de biofilmes na superfície de membranas
de osmose reversa
Almeida, RNA1; Barreto, CC1; Schneider, RP1
Departamento de Microbiologia, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Osmose reversa, Biofouling, Biofilme, rRNA 16S, Comunidades microbianas
A colmatação de membranas de osmose reversa devido à formação de biofilmes microbianos, principal determinante de
perda de eficiência operacional e de redução de vida útil, tem sido um importante entrave para a redução de seu custo
operacional. A identidade dos organismos formadores de “biofouling” nestas membranas é desconhecida. O objetivo
deste trabalho foi desenvolver, validar e aplicar método molecular para a identificação das bactérias formadoras de
biofilme metabolicamente ativas na superfície de membranas de osmose reversa. O método envolve extração do rRNA
16S da camada de “biofouling”, reações de RT-PCR e clonagem. A diferenciação dos clones foi realizada pela técnica
de ARDRA. O método mais adequado de extração de rRNA, dentre os testados, foi realizado por meio de lise física“Bead beater”. A remoção do biofilme da membrana foi realizada por meio de trituração. Os ácidos nucléicos foram
quantificados no espectrofotômetro Nanodrop®. Para a validação do método foram realizados consórcios com cDNA e
rRNA de três bactérias diferentes, misturados em proporções de 1:1:1, 1:1:2 e 1:1:8. As comunidades artificiais foram
empregadas para avaliar a eficiência de amostragem (detecção de todos os componentes do consórcio) e a fidedignidade
na representação do consórcio (informação correta sobre a proporção dos organismos) pelos métodos de RT-PCR seguido
de clonagem. Não houve considerável variação na quantidade de produto gerado na síntese da primeira fita de cDNA
das diferentes bactérias após reação de transcriptase reversa, ao passo que após a síntese total do cDNA foram observadas
variações entre os produtos gerados. Os clones obtidos das misturas de cDNAs de diferentes bactérias apresentaram
variações inferiores a 20% em relação ao esperado, demonstrando que o método de clonagem não acarreta em grandes
variações nas proporções esperadas. Em contrapartida, os clones obtidos das misturas de rRNA de diferentes bactérias
apresentaram variações nas proporções em relação ao esperado chegando a serem superiores a 100%, dados que sugerem
que a etapa de RT-PCR pode distorcer a proporção original dos componentes da comunidade. A aplicação do método
para análise das bactérias metabolicamente ativas em biofilme de um sistema de pré-tratamento de água resultou na
obtenção de 117 clones, representando 47 perfis diferentes de ARDRA. Somente poucos perfis foram recuperados em
maior abundância. Os perfis dos três organismos numericamente dominantes correspondiam a 47, 10 e 6 clones. Os
menos representativos totalizaram 6 clones com 2 a 5 perfis e 29 com um único perfil, sendo estes considerados de
pouca relevância na análise da atividade metabólica.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Identificação molecular de bactérias
capazes de remover fósforo de rejeitos
de uma indústria de aço
Guedes, RLM; Freitas, DB; Reis, MP; Assis, PS1; Chartone-Souza, E; Nascimento, AMA
Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Minas Gerais
Departamento de Engenharia Metalúrgica e de Materiais, Escola de Minas, Universidade Federal de Ouro Preto
2
Palavras-chave: rRNA 16S, remoção de fósforo, rejeitos siderúrgicos, diversidade, bioremediação
A produção de aço é uma atividade industrial indispensável à economia e ao desenvolvimento mundial, porém acarreta
a liberação de uma grande quantidade de rejeitos nos quais se encontra alto conteúdo de fósforo, um dos responsáveis
por danos ao meio ambiente no processo de eutrofização. Nesta pesquisa, isolou-se e caracterizou-se, por abordagem
molecular, uma comunidade bacteriana desses rejeitos, testando, a seguir, a capacidade desses isolados de acumularem
fósforo inorgânico na forma de polímeros de polifosfato (Poli-P). Assim, alíquotas de 100 µl de diferentes diluições desses
rejeitos foram semeadas em TSA (“tryptone soy agar”) e incubadas a 37ºC por até sete dias. Colônias morfologicamente
diferentes foram estriadas para a obtenção de isolados puros, os quais foram armazenados a -70°C, em caldo do mesmo
meio com 15% de glicerol. O seqüenciamento parcial do gene de rRNA 16S, previamente amplificado pela técnica
de PCR (“polimerase chain reaction”), possibilitou a construção de uma árvore filogenética. Os isolados acumuladores
de Poli-P foram selecionados em meio seletivo (MOPS), contendo o corante 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato. Vinte
e cinco de 200 isolados foram capazes de acumular fósforo, tendo sido identificados como membros de oito gêneros
distintos: Limnobacter, Leptothrix, Micrococcus, Microbacterium, Bacillus, Exiguobacterium, Acinetobacter e Pseudomona.
Dessa forma, o presente estudo permitiu conhecer a diversidade de isolados bacterianos desses rejeitos siderúrgicos,
sugerindo potencial biotecnológico para a despoluição de área impactada com esses rejeitos ricos em fósforo, bem como
sua reciclagem para o reaproveitamento na produção de aço.
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Análise da diversidade microbiana presente
em ambientes contaminados com petróleo
através da técnica de PCR-DGGE
Santos, ACF; Maciel, BM; Ganem, SMS; Silva, MM; Souza, SS; Dias, JCT; Rezende, RP
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
Palavras-chave: DGGE, Microrganismos, Solos, Landfarming
Estudos baseados em microrganismos cultiváveis geram informações incompletas a respeito da diversidade genética.
Perfis eletroforéticos de sequências do DNA ribossomal (rDNA) amplificados por PCR têm sido bastante utilizados
no estudo de comunidades microbianas ambientais. Neste trabalho propõe-se o estudo da diversidade de solo de
Landfarming (L) e solo de Landfarming constantemente enriquecido com petróleo (LE) através da técnica de DGGE
(denaturing gradient gel electrophoresis). Desse modo, amostras de solo de Landfarming da refinaria Landulpho Alves,
São Francisco do Conde – BA foram coletadas para a análise de diversidade. Parte do solo foi colocado sob agitação
e enriquecido com constantes adições de meio mineral e 10% de petróleo. O DNA dos solos foi extraído com o
PowerSoil™ DNA Isolation Kit (MoBio, UK) e realizado DGGE após as amplificações de rDNA 16S para os Domínios
Bacteria e Archaea. As análises de similaridades entre as amostras permitiram verificar que a adição de petróleo altera a
comunidade microbiana. Em especial, foi observada uma diminuição do número de bandas no LE, indicando a perda
de alguns organismos presentes no L que não foram capazes de sobreviver em um ambiente com um teor mais elevado
de petróleo. Entretanto, os microrganismos presentes no LE são os mais adaptados para degradar hidrocarbonetos
derivados do petróleo, deles retirando sua fonte de energia, e desempenham um papel importante na biorremediação
dos poluentes da indústria petrolífera.
Apoio Financeiro: FAPESB, UESC e CNPq CTPETRO processo: 502697/2003-2.
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Diversidade bacteriana de carvão
pirogênico de terra preta antropogênica:
construção de biblioteca e análise de
clones 16s rRNA
Terceti, MS1; Cannavan, FS1; Neill, BO2; Taketani, RG1; Tsai, SM1
Laboratório de Biologia Celular e Molecular – Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA), Universidade de São Paulo, Av. Centenário – 303,
Piracicaba – SP, CEP. 13.416-000, Brasil. Fone (55) 19-34294640 Fax (55) 19-3429-4844
2
Department of Crop and Soil Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, Cornell University, 232 Emerson Hall, Ithaca, NY, USA
[email protected]
1
Palavras-chave: Diversidade Bacteriana, carvão pirogênico
A Terra Preta Antropogênica (TPA) ou Terra Preta de Índio recebe esta denominação porque é encontrada em sítios
arqueológicos onde viveram grupos pré-históricos. Uma das suas principais características é a presença de alto teor de
carvão pirogênico, que além de preservar o solo, aumenta em quase duas vezes a capacidade de troca catiônica nestes
solos em relação aos adjacentes, devido à oxi-redução da superfície do carvão. Esse processo é realizado por mecanismos
biogeoquímicos. Sabe-se que existe uma microbiota habitante no carvão, porém esta comunidade de microrganismos
foi, até o presente momento, pouco estudada. Portanto, o objetivo do trabalho foi construir uma biblioteca de clones do
gene 16S rRNA de bactérias do carvão pirogênico e desta forma, definir a microbiota do carvão pirogênico. Um estudo
comparativo foi também realizado com as comunidades de solo adjacente à TPA. O carvão pirogênico foi separado
fisicamente com auxílio de pinça esterilizada. Após a extração de DNA do carvão, procedeu-se à amplificação do gene
16S rRNA para determinação da estrutura das comunidades bacterianas. Uma biblioteca de clones do gene 16S rRNA
foi obtida e posteriormente seqüenciadas para comparação com as seqüências depositadas no banco de dados RDP
II http://rdp.cme.msu.edu/classifier/hierarchy.jsp. Foi obtida biblioteca do carvão com 274 clones. Das sequências
parciais analisadas da biblioteca do carvão foram observados 32,1% de microrganismos não conhecidos, 21,2% do
filo Acidobacteria, 19,3% do filo Proteobacteria, 8,0% do filo Actinobacteria, 7,3% do filo Firmicutes, 6,9% do filo
Planctomycetes, 2,6% do filo Verrucomicrobia, 1,8% do filo Nitrospira e 0,8% do filo Chloroflex. O filo Gemmatimonadetes
foi encontrado no solo adjacente e não encontrado no carvão pirogênico. Embora o carvão pirogênico seja recalcitrante,
ele possui uma diversidade bacteriana considerável que deve ser melhor estudada.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP.
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Aplicação da técnica de DGGE
na investigação de genes ribossomais
de microrganismos que realizam
fermentação lática em cacau
Santana, LKD; Aragão, EV; Santos, ACF; Rezende, RP; Dias, JCT
Universidade estadual de Santa Cruz (UESC-BA)
[email protected]
Palavras-chave: Fermentação, cacau, bacterias láticas, 16S RNA, DGGE
A análise de seqüência dos genes para o RNA ribossomal (rRNA) tem sido amplamente aplicada em estudos filogenéticos
e ecológicos. O gene para o rRNA 16S é uma excelente molécula marcadora, uma vez que: está presente em todas as
bactérias e apresenta regiões conservadas, assim como região variada (região ITS flanqueadora dos genes 16S e 23S),
tornando possível o desenvolvimento de primers e sondas com diferentes níveis de especificidade. Estudos a cerca de
comunidades microbianas tem utilizado a técnica de DGGE, na qual iniciadores de regiões específicas do rDNA tem
em uma de suas extremidades um grampo GC que impede total desnaturação da molécula de DNA. Com o objetivo
de aplicar a técnica de DGGE na investigação de genes ribossomais de microrganismos que realizam fermentação lática
no cacau foram utilizados iniciadores baseados em regiões específicas do rRNA. Para tanto foi realizada durante seis
dias, em intervalos de 12 horas, coletas de amêndoas de cacau em fermentação em cochos na Fazenda São Jorge (Km 20
da rodovia Ilhéus- Uruçuca). As amostras foram despolpadas com auxilio de Tween 80 a 0,1%. O DNA das amostras
foi extraído utilizando protocolo baseado em sonicação, choque térmico e extração com fenol- clorofórmio- álcoolisoamílico (25:24:1) e posteriormente amplificados com o conjunto de iniciadores Lac 1, Lac 2 e Lac 3. A diversidade
genética destes genes foi determinada pelo perfil de bandas no gel de DGGE realizado com gradientes de 35-60%
e 20-70%. Considerando que cada banda no gel corresponde a um microrganismo, um grupo foi constante nas 11
amostras coletadas, sendo que a maior similaridade de bandas foi detectada entre 36 e 48 horas. Dois grupos surgem
após 36 horas mantendo-se constante até as 120 horas de fermentação. O numero máximo de bandas foi de 11 para
os primers Lac 1 e 2 e de 12 para Lac 3 e 2. Este trabalho é um trabalho pioneiro, no qual demonstra a possibilidade
da utilização da técnica de DGGE em pesquisa básica e ecologia microbiana.
Orgão Finaciador FAPESB.
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Isolamento e caracterização de bactérias
com atividade antimicrobiana isoladas de
esponjas marinhas
Santos, OCS1; Pontes, PVM1; Andrade, CL1; Muricy, G2; Giambiagi-deMarval, M1; Laport, MS1
Departamento de Microbiologia Médica, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro
2
Departamento de Invertebrados, Museu Nacional, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: 16S rDNA, antimicrobianos, bactérias associadas, esponjas marinhas, plasmídeos
O uso extensivo de antibióticos tem acelerado o surgimento de bactérias resistentes e por isso vem se fortalecendo a
busca por produtos com atividade antimicrobiana (Goldrick, 2004). As esponjas apresentam uma diversidade notável
de metabólitos secundários, muitos deles de grande interesse para a pesquisa biomédica e farmacológica, pois atuam
como agentes antibióticos, antitumorais e antivirais (Tincu & Taylor, 2004). Vários estudos sugerem que as bactérias
associadas às esponjas poderiam ser as verdadeiras fontes de alguns destes compostos (Faulkner et al., 2000). As bactérias
por produzirem rapidamente uma grande biomassa poderão tornar possível a produção dos compostos em larga escala
sem a necessidade de coletar constantemente ou cultivar as esponjas. Deste modo, este trabalho tem objetivo isolar e
caracterizar bactérias com atividade antimicrobiana a partir de esponjas estudadas por nosso grupo. Com esta finalidade,
149 estirpes foram isoladas e submetidas ao teste de detecção de produção de substâncias antimicrobianas (SAM) pelo
método descrito por Giambiagi-deMarval e colaboradores (1990). Dezesseis estirpes (11%) apresentaram atividade
inibitória contra a bactéria Corynebacteria fimi. Dentre as estirpes SAM+, nove apresentaram um amplo espectro de
ação contra estirpes de importância médica e foram, então, submetidas à identificação fenotípica e molecular. Através
do sequenciamento do gene 16S rDNA, utilizando-se o iniciador universal 9f [5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’]
(Weisburg et al., 1991), três estirpes foram identificadas como pertencentes ao gênero Pseudomonas sp., com 98% de
homologia; quatro estirpes foram identificadas como pertencentes ao gênero Bacillus sp., com 99% de homologia; e
duas estirpes foram identificadas como pertencentes ao gênero Pseudovibrio sp., com 99% de homologia. A identificação
realizada através do seqüenciamento está coincidente com a identificação fenotípica. A extração de plasmídeos das
bactérias SAM+ foi realizada segundo Giambiagi-deMarval e colaboradores (1990). Dentre as bactérias analisadas,
três estirpes identificadas como Bacillus sp. apresentaram em eletroforese em gel de agarose pelo menos uma forma
plasmidial com tamanho entre 8,0 e 10,4 kb; e uma estirpe de Pseudomonas sp. apresentou em eletroforese de gel de
agarose uma forma plasmidial com tamanho maior do que 27 kb. Estes resultados nos permitem sugerir que as bactérias
que estão sendo caracterizadas podem ser potenciais fontes de produção de substâncias antimicrobianas contra infecções
bacterianas de importância médica.
Apoio financeiro: FAPERJ e CNPq.
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Diversidade bacteriana do solo
de cana-de-açúcar geneticamente modificada
Dini-Andreote, F1; Andreote, FD2; Araujo, WL1,3
Departamento de Genética, Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP, Brasil
2
Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna, SP, Brasil
3
Núcleo Integrado em Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: PCR-DGGE, sequenciamento, 16S RNAr, Filogenia, rarefação
Estudos recentes destacam as preocupações em avaliar e quantificar possíveis impactos de plantas geneticamente
modificadas sobre a biodiversidade microbiana do solo. Desta forma, este trabalho teve como objetivo amostrar e
avaliar de maneira independente de cultivo a diversidade do solo utilizado para cultivo de cana-de-açúcar (SP80-1842)
e de sua variedade geneticamente modificada (IMI-1) para a resistência ao herbicida imazapir, sob três diferentes
condições de manejo: i) plantas geneticamente modificadas (IMI-1) conduzidas com capina; ii) plantas geneticamente
modificadas (IMI-1) tratadas com herbicida e iii) plantas convencionais (SP80-1842) conduzidas com capina. Estas
análises foram realizadas em três épocas distintas de desenvolvimento da planta: três, dez e dezoito meses após o plantio.
Inicialmente foi realizado o estudo desta comunidade por meio da técnica de PCR-DGGE utilizando primers universais
e específicos para os grupos das Actinobactérias, Alfa e Betaproteobactérias, mostrando que não houve alterações das
comunidades bacterianas ao longo do tempo, dentro dos três tratamentos aplicados. Posteriormente, devido à ausência
de diversidade entre os tratamentos aplicados, realizou-se uma análise geral de um grupo de 116 seqüências de bactérias
cultiváveis, as quais foram submetidas à caracterização por meio do software RDPQuery, seguido de um alinhamento
e construção de filogenia, onde se observou a presença dos grupos taxonômicos referentes às classes Actinobacteria,
Alfa, Beta e Gamaproteobactérias. Por fim, foram estimados os índices de diversidade (Shannon) e de riqueza (Chao1)
e realizada a análise de rarefação, a qual determinou a presença de 33 Unidades Taxonômicas Operacionais (UTOs)
e uma cobertura amostral eficiente para o estudo da diversidade bacteriana cultivável neste ambiente. A ausência de
efeitos do genótipo da planta e das práticas de cultivo na diversidade bacteriana ao longo do tempo e dentro dos três
tratamentos pode ser justificada devido a uma estabilidade microclimática do solo, sendo que, possivelmente, regiões
sujeitas a maiores interferências do metabolismo das plantas, como a rizosfera e rizoplano, podem sofrer maior impacto
sobre sua diversidade, revelando-se como possibilidades para estudos posteriores.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Análise da Diversidade Bacteriana Endofítica
por DHPLC Durante o Processo de Fermentação
da Mandioca (Manihot esculenta)
Kodama, CS¹; Miranda, PRO¹; Barbosa, MSR¹; Andrade, SS¹; Bandeira, CHMM²; Santos, AS²; Schneider, MPC¹; Silva, A¹
¹Laboratório de Polimorfismo de DNA, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
²Laboratório de Investigação Sistemática em Biotecnologia e Química Fina, Instituto de Ciências Exatas e Naturais, Universidade Federal do Pará
[email protected]
Palavras-chave: Mandioca, Manihot esculenta, Bactérias, Metagenoma, DHPLC
A mandioca é empregada no preparo de diversos derivados alimentícios nas regiões tropicais do planeta e apresenta interesse
na produção de diversas moléculas, inclusive biocombustíveis, que pode ser realizada por processos biotecnológicos.
Neste sentido, a fermentação da mandioca promove a redução da toxicidade degradando os compostos cianogênicos,
além do amolecimento das células e o melhoramento das características organolépticas do produto final. Este processo
envolve ação de enzimas liberadas por diversos microorganismos, alguns já conhecidos e outros ainda não descritos.
O objetivo deste trabalho foi caracterizar a diversidade filogenética bacteriana através de abordagem independente
de cultivo durante os sete primeiros dias do processo de fermentação das raízes de mandioca. Para isso, o tubérculo
vegetal, previamente lavado e submetido a métodos assépticos, foi mantido submerso em água destilada, na razão
1:2 m/v, por 7 dias a temperatura de 28ºC. A cada 12 horas foram coletadas alíquotas de 100ml, que foram submetidas
à filtração em membranas de nitrocelulose de 0,22μm. As protocélulas retidas foram usadas para obtenção do material
genético com auxílio do kit Ultra CleanTM Soil DNA (MoBio Laboratories, Inc.). Os amplicons da região V3 do gene
16S foram obtidos pela PCR com os iniciadores descritos por Muyzer et al. (1993). No sistema Transgenomic WAVE
de cromatografia líquida desnaturante de alto rendimento, as seqüências foram separadas de acordo com o tempo de
retenção na coluna poliestireno/polidivinilbenzeno e os picos coletados, reamplificados, clonados e seqüenciados em
sistema GE MegaBACE 1000. No total, coletamos 12 picos que geraram distintas bibliotecas plasmidiais. As seqüências
foram editadas e alinhadas com auxílio do pacote BioEdit (Hall, 1999). A identificação dos microorganismos foi realizada
através da ferramenta on-line ARB-Silva (Pruesse et al., 2007), em seguida, foram agrupados em OTUs únicos, com 3%
de dissimilaridade, pelo aplicativo DOTUR (Schloss, 2005) e posterior agrupamento por vizinhos pelo pacote Phylip
(Felsenstein, 2007). Das 132 seqüências obtidas observou-se 45% variantes relacionadas a bactérias ambientais, não
cultiváveis e não classificadas em nenhum filo reconhecido. Verificaram-se ainda a presença de Proteobacteria (29%) e
Firmicutes (22%), além de uma pequena quantidade de Bacteroidetes (3%) e Actinobacteria (1%). No arranjo obtido,
o grupo de bactérias não-classificadas encontra-se distribuído em todos os clados. Encontramos, também, Firmicutes
frequentemente envolvidas no processo de fermentação, como Clostridium beijerinckii e Lactococcus lactis. A grande
abundância de organismos não cultiváveis em nosso estudo reforça a necessidade do uso de novas tecnologias no
conhecimento e monitoramento da diversidade microbiana, envolvida em processos de biotransformação mediado
por microorganismos.
Apoio Financeiro: Eletronorte S/A e CNPq.
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Análise da diversidade do gene blaTEM em
três lagoas do Parque Estadual do Rio Doce
Pinheiro, FA; Pontes, SD; Lima-Bittencourt, CI; Chartone-Souza, E; Nascimento, AMA
Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
O uso indiscriminado de drogas antimicrobianas na medicina humana e veterinária, e na agricultura tem levado à
contaminação de águas e solos, alteração do ecossistema microbiano e, principalmente, disseminação de microrganismos
resistentes a antibióticos. Os estudos sobre resistência a antibióticos são realizados normalmente utilizando isolados
bacterianos obtidos de ambientes clínicos. Contudo, os determinantes de resistência estão presentes em muitas
comunidades bacterianas de ambientes naturais. O mecanismo de resistência mais comum aos antibióticos β-lactâmicos
é a produção de β-lactamases. Essas enzimas constituem um grupo caracterizado por altos níveis de diversidade
molecular. A maioria dos determinantes genéticos de resistência a β-lactâmicos caracterizados até agora foi obtida de
isolados clínicos. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo explorar a presença de genes de β-lactamase da família
TEM, em três lagoas do Parque Estadual do Rio Doce, com diferentes graus de ação antrópica. As lagoas foram: Lagoa
Jacaré, Lagoa Gambazinho e Lagoa Dom Helvécio. Para isso, foi feita a extração de DNA total dos isolados, que foram
identificados através da amplificação e sequenciamento do gene de rRNA 16S. A presença do gene foi detectada por PCR
utilizando os iniciadores TEM_F 5’ AAAGATGCTGAAGATCA 3’ e TEM_R 5’ TTTGGTATGGCTTCATTC 3’.
O polimorfismo do mesmo foi determinado por sequenciamento. A maioria dos isolados pertencia aos gêneros
Enterobacter, Acinetobacter e Pseudomonas. Dos 165 isolados obtidos, 54 possuíam gene blaTEM, sugerindo que estes
isolados apresentariam o gene blaTEM, intrinsecamente. A análise das seqüências revelou que o gene blaTEM apresentou
grande heterogeneidade genética, com uma diversidade nucleotídica de 4,7%. A árvore filogenética gerada por essas
seqüências mostrou que os genes recuperados das três lagoas não refletiam a origem geográfica nem a origem filogenética
dos isolados. Sendo assim, este estudo é importante para avaliar a prevalência e alta disseminação de genes blaTEM nesses
ambientes moderadamente impactados, sugerindo uma função primitiva desse gene.
Apoio: FAPEMIG.
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Prospecção do gene lipA em biblioteca
metagenômica de solo
Rangel, MP1; Picchi, SC1; Dimitrov, MR1; Lemos, EGM1
Departamento de Tecnologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
[email protected]
1
Palavras-chave: metagenoma, lipase
Na manufatura, industrialização alimentícia e produção de detergentes, as enzimas servem como “chaves” de ativação
de componentes presentes nos mesmos. Em função do enorme potencial biotecnológico, as enzimas lipolíticas estão
atraindo atenção no mercado global. A abordagem metagenômica passou a ser usada para encontrar novos genes
codificadores de produtos gênicos relevantes como lipases e esterases. Este projeto tem como objetivo prospectar genes
codificadores de lipases em biblioteca de cosmídeos com insertos de DNA obtidos do solo de uma mata de eucalipto
do Estado de São Paulo. Foram desenhados dois pares de oligonucleotídeos iniciadores de síntese (primers) para detectar
o gene lipA, o primeiro, denominado BACDEG, é degenerado e foi desenhado tendo como molde seqüências de
nucleotídeos do lipA retiradas do genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) dos microrganismos B. subtilis e B. pumilus.
O segundo, denominado PCON, foi baseado na região conservada do gene lipA de 12 bactérias, sendo elas: Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas fragi, Burkholderia glumae, Burkholderia cepacia e várias estirpes de Pseudomonas. As reações de
PCR para os dois pares de primers foram padronizadas e seus produtos seqüenciados. Após a padronização, foram feitas
reações de PCR com o par de primer BACDEG utilizando DNA de pools da biblioteca metagenômica, e em seguida
duas placas que tiveram amplificação foram selecionadas para identificar os clones responsáveis pela amplificação do
gene lipA. O produto de PCR do controle positivo (B.subtilis) do primer BACDEG foi seqüenciado, apresentando
100 % de similaridade com o gene lipA de B. subtilis depositado no banco, afirmando que este bacilo pode ser usado
como controle nas reações de PCR, como também foi confirmado para a amplificação com a P. aeruginosa do par de
primer PCON que apresentou 99% de similaridade com a mesma espécie depositada no banco de genes. Foi possível
identificar doze clones responsáveis pela amplificação do gene lipA em um total de 9030 clones que compõem a
biblioteca metagenômica.
Apoio financeiro: PIBIC/CNPq.
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Identificação molecular de isolados clínicos
bacterianos por PCR De amplo espectro e
sequenciamento do rDNA 16S
Júnior, JBO1; Coimbra, DG1; Nascimento, CA1,3; Gitaí, DLG2; Barbosa, ABG2; da Silva, LA2; Oliveira, MC1; de Andrade, TG1
Campus Arapiraca, Universidade Federal de Alagoas
Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Alagoas
3
Unidade de Emergência Dr. Daniel Houly, Arapiraca-AL
[email protected]
1
2
Palavras-chave: rDNA 16S, infecção hospitalar, PCR de amplo espectro, bactérias, sequenciamento
Uma das principais estratégias de diagnóstico molecular de agentes causativos de infecções hospitalares consiste na análise
da região codificadora de RNA ribossômico 16S (rDNA 16S). A PCR de amplo espectro (broad-range PCR) oferece a
possibilidade de identificação bacteriana através de um único par de iniciadores, específicos para regiões conservadas
do rDNA. Este par de iniciadores universais pode amplificar a região 16S do rDNA independente de conhecimento
prévio da espécie de microorganismo em estudo. O posterior sequenciamento do fragmento amplificado e análise de
bioinformática por algoritmos de alinhamento contra banco de dados de seqüências de DNA, permitem a identificação
do patógeno. Neste trabalho, utilizamos a PCR de amplo espectro, acoplada ao sequenciamento do rDNA 16S, para
a identificação de isolados clínicos de infecção hospitalar. Cinco amostras de secreções purulentas foram semeadas
em meio ágar sangue e MacConkey para crescimento de colônias. Colônias obtidas foram inoculadas em meio de
enriquecimento BHI e as culturas saturadas foram submetidas ao isolamento de DNA utilizando protocolo com CTAB
(hexadecyltrimethyl ammonium bromide), extração por fenol/clorofórmio e precipitação com isopropanol. A PCR de
amplo espectro produziu, para todas as amostras, um amplicon de aproximadamente 520pb, correspondente a porção
inicial do gene. Os produtos de PCR foram então sequenciados em equipamento ABI310 e as seqüências geradas foram
submetidas a alinhamento por BLASTn contra os bancos de seqüências do NCBI (National Center for Biotechnology
Information) e do RDP (Ribosomal Database Project). Todas as seqüências produziram altos escores de alinhamento
(E value = 0.0 no BLAST) e identificaram Proteus mirabilis, Klebsiela pneumonie, Morganella morganii, Acinetobacter
baumannii e Staphylococcus sciuri como os patógenos correspondentes. S. sciuri é uma das espécies de Staphylococcus mais
abundantes do planeta e é geralmente encontrada na pele de animais domésticos e selvagens, não sendo normalmente
incluída nos protocolos de identificação de rotina em laboratórios de microbiologia clínica. Recentemente, entretanto,
S. sciuri tem sido isolada de amostras clínicas humanas. Além disto, apesar da grande maioria dos isolados de S. sciuri ter
sido sensível aos antibióticos beta-lactâmicos, alguns espécimens demonstraram resistência microbiana. Curiosamente,
a amostra desta espécie identificada em nosso laboratório apresentou uma ampla resistência a este grupo de antibióticos,
o que pode indicar, como sugere a literatura, a aquisição de um gene de resistência ou a super-expressão do gene mecA
nativo, homólogo ao gene adquirido por cepas de S. aureus resistentes a este grupo de antibióticos. Estudos genéticos
posteriores podem esclarecer a causa deste padrão de resistência singular. A aplicação da estratégia de identificação
molecular aqui descrita pode auxiliar à prática clínica, em especial quando se necessita de um diagnóstico rápido, de
maior sensibilidade e precisão. Além disto, as sequências, continuamente geradas, serão depositadas em um banco
informatizado de DNA, localmente desenvolvido, para posteriores análises epidemiológicas.
Apoio Financeiro: Ministério da Saúde; CNPq; FAPEAL.
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Biodiversidade e taxonomia da microbiota
da Mata Atlântica
Rodrigues, TB1; Vicente, ACP2; Coelho, A1; Krüger, RH3; Thompson, FL1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro
2
FIOCRUZ
3
Programa de Pós Graduação em Ciências Genômicas, Universidade Católica de Brasília
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Mata Atlântica, rDNA 16S, metagenômica, taxonomia, biodiversidade
O presente trabalho realizou a primeira caracterização abrangente da biodiversidade da microbiota do solo da Mata
Atlântica do Estado do Rio de Janeiro, empregando métodos-independentes-de-cultivo e a taxonomia em amostras
representativas dos oito tipos de solo da Mata Atlântica. O projeto pretende obter um panorama geral sobre a composição
microbiana em termos taxonômicos, que podem estar relacionadas com os fatores bio-abióticos do bioma Mata
Atlântica. A biodiversidade taxonômica foi inferida a partir de bibliotecas metagenômicas de rDNA 16S. Acidobacteria,
Proteobacteria e Verrucomicrobia foram os filos mais comumente encontrados, porém também foram encontrados
os filos Bacteroidetes, Actinobacteria, TM7, Gemmatimonadetes, Chloroflexi, Cianobacteria e Planctomycetes. A
maioria das sequências agrupou com procariontes não cultivados. Foram encontrados pelo menos 77 filos e mais de
120 espécies nas bibliotecas de rDNA 16S. Nossos resultados apontam para a descoberta de cerca de 20 filos novos.
Sete filos novos foram abundantes nas bibliotecas de rDNA 16S. Os outros 13 filos foram representados por apenas
uma seqüência de rDNA 16S, além de novas espécies de filos como Acidobacteria e Proteobacteria. Foram delineados
36 grupos com pelo menos duas seqüências (similaridade >97%). Dezesseis destes grupos estão presentes nos dois tipos
de solo. Esses dados revelam que a microbiota da Mata Atlântica contém uma tremenda diversidade taxonômica. A
taxonomia polifásica permitrá a descrição de novas espécies presentes no Bioma Mata Atlântica.
Apoio financeiro: FAPERJ, CNPQ e IFS.
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Biodiversidade e bioprospecção de solo de
mangue via metagenômica
Bitencourt, LMC; Macena, TNS; Oliveira, JM; Cascardo, JCM; Brendel, M
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
Palavras-chave: Metagenômica, rDNA 16S, diversidade microbiana, bioprospecção
É bem sabido que a biotecnologia tem uma contínua demanda por novos biocatalisadores e agentes terapêuticos, e a
diversidade natural fornece tais compostos, especialmente entre os microrganismos do solo (Schmeisser et al., 2007).
Entretanto, a taxa de descobertas de novas moléculas com interesse biotecnológico, utilizando técnicas tradicionais
de cultivo, está diminuindo significativamente. Existe uma vasta quantidade de informação presente no genoma dos
microrganismos que podem ser valiosas para o conhecimento e desenvolvimento em áreas de ecologia, medicina e
biotecnologia, e a metagenômica é uma promissora ferramenta para acessar este potencial (Steele e Streit, 2005).
O mangue, é um ecossistema costeiro, de transição entre os ambientes terrestre e marinho, característico de regiões
tropicais e subtropicais, que apresenta solo salino e deficiência de oxigênio. Esse trabalho mostra as primeiras descrições
de biodiversidade e bioprospecção de solo de Mangue da Baía de Camamu/BA através de métodos moleculares
independentes de cultivo. Para análise de filogenia construiu-se uma biblioteca onde os fragmentos amplificados de
genes 16S rDNA na comunidade total foram clonados no vetor pTZ57R/T. Para identificação de possíveis genes com
aplicações biotecnológicas o DNA metagenômico total com foi clonado em vetor fosmídeo (pCC1FOS). A análise
de biodiversidade deste solo revelou que os filótipos foram dominados por seqüências relacionadas à Proteobacteria e
Acidobacteria, e também foi possível o isolamento de exemplares do domínio Archaea. Além disso, mais de 25% das
seqüências não apresentaram similaridade com seqüências conhecidas e não foram classificadas. Através dos dados
analisados verificou-se que a amostra analisada apresenta uma ampla diversidade microbiana, com potencial para
screening funcional. A biblioteca metagenômica construída com o CopyControlTM Fosmid Library Production Kit
gerou 6.048 clones, dentre estes, alguns foram selecionados aleatoriamente para extração de DNA, e posterior digestão
com NotI. Esta digestão mostrou que os fragmentos inseridos possuem entre 25-40Kb, o que confirma a restrição no
empacotamento do fosmídeo vetor. Esta clonagem com fragmentos grandes permite aumentar a chance de encontrar
novos genes e óperons com aplicação biotecnológica. Para tanto, os bioensaios tanto para antimicrobianos quanto
enzimáticos estão sendo realizados.
Apoio Financeiro: FAPESB, UESC.
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Avaliação de bactérias isoladas de
maracujá (Passiflora edulis f. flavicarpa)
quanto à produção de ácido indol acético
Ferreira, MTB1; Silva, ND1; Côrrea, FS1; Santos, ST2; Olivares, FL2; Souza Filho, GA1; Souza, AN1
1
Laboratório de Biotecnologia
Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro
[email protected]
2
Palavras-chave: bactérias endofíticas, ácido indol acético e promoção de crescimento
Os hormônios vegetais são reguladores naturais de crescimento das plantas, influenciando os processos fisiológicos em
baixas concentrações. Algumas bactérias conhecidas como endofíticas podem colonizar o interior da planta sem causar
danos aparentes a seus hospedeiros, possibilitando benefícios de diversas formas. Muitos endofíticos podem produzir
fitohormônios, e são conseqüentemente capazes de promover o crescimento de planta. O objetivo deste trabalho foi
pesquisar a produção do promotor de crescimento da planta, ácido indol acético (AIA) em bactérias endofíticas isoladas
de maracujá, a fim de selecionar isolados promissores para inoculação em plantas. Foi usado o ensaio de Salkowski para
detectar AIA em sobrenadantes da cultura. O pré-inóculo foi realizado crescendo os isolados em meio DYGS (líquido)
sob agitação a 30oC por 24 horas. Após esse período os isolados foram inoculados no meio DYGS suplementado
com D/L-triptofano (0,005 g/mL). Os frascos foram incubados a 30oC sob agitação (180 rpm). Após 48 horas, uma
alíquota de 1 mL foi coletada da cultura e centrifugada a 5.000 rpm com o objetivo de baixar as células. Foi usado
1 mL do sobrenadante para o teste de produção do AIA + 1 mL do reagente de Salkowski (7,9 mol/L de H2SO4 com
12 g FeCl3). As soluções foram incubadas no escuro, à temperatura ambiente, durante 30 minutos. A reação de uma
solução de AIA com o reagente de Salkowski resulta coloração amarelada para o teste negativo e rosa avermelhado para
o teste positivo. Um total de 40 isolados endofíticos foi analisado quanto à capacidade de produzir ácido indol acético.
Foram obtidos 9 isolados positivos para a produção de AIA e destes 1 já foi identificado. Para o sequenciamento, o
DNA total foi extraído e o gene 16S rRNA amplificado com os oligonucleotídeos específicos via PCR. Os amplicons
resultantes foram seqüenciados e análise comparativa entre eles foi realizada. Na análise da seqüência desta região em
comparação com algumas depositadas no GenBank, observou-se a a formação de agrupamento com as espécies do
gênero de Pseudomonas. Estes resultados sugerem que estes isolados têm potencial para serem utilizados na promoção
do crescimento de maracujá por meio da suplementação de auxina para plantas hospedeiras. A metodologia utilizada
para a seleção qualitativa desta característica foi eficiente, pois permitiu uma boa leitura dos resultados.
Apoio financeiro: UENF; FAPERJ; CNPq.
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Avaliação de bactérias isoladas de
maracujá (Passiflora edulis f. flavicarpa)
com potencial de promoção de crescimento
Souza, AN1; Silva, ND1; Côrrea, FS1; Ferreira, MTB1; Marques, VC1; Santos, ST2; Olivares, FL2; Souza Filho, GA1
Laboratório de Biotecnologia
Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: bactérias solubilizadoras, solubização de fósforo, solubilização de zinco, promoção de crescimento, gene 16S rRNA
A agricultura tradicional, baseada no uso intensivo de fertilizantes e defensivos agrícolas tem se mostrado nociva
ambientalmente, devido à persistência e a acumulação de agrotóxicos na cadeia trófica, bem como na eutrofização dos
ecossistemas aquáticos devido ao aporte de nutrientes lixiviados do solo. Fica claro a necessidade do desenvolvimento
de alternativas tecnológicas para o aumento da produtividade agrícola, tanto de alimentos como de culturas voltadas
para os biocombustíveis. Uma alternativa viável tanto sob o ponto de vista agrícola quanto sob o prisma ambiental é a
utilização de bactérias endofíticas como promotoras do crescimento vegetal. Essa associação com bactérias endofíticas
é registrada para um grande número de plantas. A seleção e caracterização das cepas mais eficientes como promotoras
de crescimento é um passo fundamental no desenvolvimento dessa importante tecnologia. Neste contexto este trabalho
tem como objetivo selecionar bactérias isoladas de maracujá positivas para solubilização de fósforo e zinco. Para tanto
foi realizado um screening qualitativo dos isolados, buscando cepas positivas tanto para a solubilização fósforo quanto
de zinco. O screening foi realizado utilizando a metodologia de formação de halo de solubilização em placa de Petri,
com meio LGI com indicador de pH acrescido de Ca5(PO4)3OH (0,54%) e ZnO (0,12%). Após 120h, foi verificada
a formação ou não do halo, mediado pela alteração de pH através da secreção de ácidos orgânicos pela bactéria. Do
total de 40 isolados testados, 7 foram capazes de solubilizar fósforo e zinco, e destes 4 já foram identificados. Para
o sequenciamento, o DNA total foi extraído e o gene 16S rRNA amplificado com os oligonucleotídeos específicos
via PCR. Os amplicons resultantes foram seqüenciados e análise comparativa entre eles foi realizada. Na análise da
seqüência desta região em comparação com algumas depositadas no GenBank, observou-se a formação de agrupamento
com as espécies do gênero de Pseudomonas e Bacillus. Em um futuro próximo essas bactérias endofíticas poderão ser
inoculadas em mudas de plantas agrícolas para gerar um aumento na produtividade aliada a um uso mais racional dos
recursos naturais.
Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPq e UENF.
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Padrão de colonizacão mono e policlonal
de Candida albicans altamente virulenta
entre pacientes diabéticos e seus cônjuges
não-diabéticos
Boriollo, MFG; Bassi, RC; Spolidório, DMP
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade de Alfenas, Alfenas, MG, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: C. albicans, transmissibilidade bucal, diabetes mellitus, virulência, MLEE
Objetivo: Infecções bucais por espécies de Candida podem ser freqüentes e severas em pacientes com diabetes mellitus. Essas
espécies têm desenvolvido mecanismos específicos de virulência que conferem habilidades para colonizar as superfícies
dos hospedeiros, e invadir tecidos profundos ou evadir as defesas dos hospedeiros. A presente pesquisa investigou o
perfil de colonização bucal por C. albicans, associada ou não a outras espécies do gênero, e sua habilidade de virulência
e transmissão entre pacientes com diagnóstico clínico de diabetes mellitos e seus cônjuges não-diabéticos. Metodologia:
Amostras bucais de 52 casais foram plaqueadas diretamente sobre meio cromogênico a fim de avaliar a homogeneidade
populacional das espécies de Candida. A detecção de linhagens de C. albicans strains (Electrophoretic Types - ETs) e
seus relacionamentos genéticos foram estabelecidos por marcadores isoenzimáticos (MLEE) e análises de agrupamento.
A virulência dos isolados de C. albicans isolates foi avaliada pelos testes de proteinases e fosfolipases usando métodos
de cultura microbiológicos específicos. Resultados: Em 12 casais (23,1%), ambos os cônjuges mostraram colonização
por C. albicans exclusivamente (9,6%) ou em associação (13,5%), incluindo C. tropicalis, C. krusei, C. dubliniensis e
Candida spp. Em trinta e três casais (63,4%), apenas um dos cônjuges foi colonizado por C. albicans (i.e., 19 pacientes
diabéticos versus 14 cônjuges não-diabéticos). Espécies de Candida não-albicans foram observadas em ambos os cônjuges
de três casais (5,7%), e a ausência de colonização por essas leveduras ocorreu em quatro casais (7,7%). MLEE revelou 52
linhagens entre 119 isolados de C. albicans e 6 isolados de C. dubliniensis. Linhagens idênticas (1,9% dos casais/8,3%
dos casais C. albicans-positivos) ou altamente relacionadas (13,5% dos casais/58,3% dos casais C. albicans-positivos)
foram observadas em ambos os cônjuges de oito casais, enquanto que linhagens moderadamente relacionadas ou
relacionadas geneticamente à distância ocorreram entre cônjuges de quatro casais (7,7% dos casais/33,4% dos casais
C. albicans-positivos). Em adição, casais ou cônjuges não-relacionados também mostraram um padrão de colonização
por linhagens idênticas ou altamente relacionadas. A habilidade de virulência foi observada em acima de 90% dos
isolados testados independentemente das características genéticas do patógeno ou clínicas do hospedeiro. Conclusão:
A colonização bucal simultânea por espécies de Candida, especialmente C. albicans, entre pacientes diabéticos e seus
respectivos cônjuges foi relativamente baixa (12 de 52 casais), porém na maioria desses casos a transmissão e a adaptação/
microevolução de linhagens podem ocorrer entre cônjuges relacionados (8 de 12 casais). Independentemente dessa
colonização simultânea, a maioria dos pacientes diabéticos (34 de 52) e dos seus cônjuges não-diabéticos (29 de 52)
podem representar uma fonte de transmissão e, em condições de imunossupressão, apresentar sintomatologia clínica
infecciosa proveniente de uma variabilidade de linhagens oportunistas de C. albicans, altamente virulentas, bem como
outras espécies de Candida menos freqüentes.
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Análise molecular da trealase ácida
extracelular de Candida glabrata
Lopes, RG; Alves-Jr, SL; Zilli, DMW; Stambuk, BU
Laboratório de Biotecnologia e Biologia Molecular de Leveduras, Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Santa Catarina
[email protected]
Palavras-chave: Candida, trealase, trealose, ATH1, clonagem
Candida glabrata é considerado um importante patógeno fúngico emergente devido principalmente à ampla dispersão
de terapias imunosupressivas e o uso indiscriminado de compostos azólicos, resultando em altas taxas de mortalidade
pela resistência inata desta levedura aos antifúngicos normalmente utilizados. Estratégias que objetivam a pronta
identificação deste patógeno são extremamente importantes já que permitem a pronta implementação de um tratamento
medicamentoso apropriado. A utilização de trealose por C. glabrata é apontada como importante metodologia
diagnóstica na pratica laboratorial, já que é uma característica marcante desta levedura a utilização de apenas glicose
e trealose como fontes de carbono. Nossos resultados indicam que esta levedura cresce em trealose graças à secreção
no meio de cultura de uma trealase ácida que prontamente hidrolisa o dissacarídeo, permitindo a rápida fermentação
da glicose liberada. No intuito de verificar se o gene postulado no genoma de C. glabrata para a trealase ácida
(ORF CAGL0K05137g) é realmente um gene que codifica para este tipo de enzima, a seqüência de DNA correspondente
foi amplificado por PCR, e o fragmento obtido foi clonado entre a seqüência promotora e terminadora do gene da
gliceraldeido-3P desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae presente no plasmídeo multicópia pGRSd (2 μm, URA3),
de forma a sobre-expressar este gene em S. cerevisiae. Foram utilizadas linhagens de S. cerevisiae deletadas no gene da
trealase ácida codificada por ATH1 (ath1Δ), bem como outras cepas ura3Δ como receptoras do plasmídeo recombinante.
A atividade trealase foi determinada nas células íntegras e no sobrenadante de cultura após o crescimento em glicose
ou trealose. Obtivemos a confirmação do gene postulado como sendo o responsável pela síntese desta enzima em
C. glabrata (gene CgATH1), já que este gene ao ser sobre-expresso em S. cerevisiae incrementou ~5 vezes a atividade
enzimática na parede extracelular, permitindo um crescimento mais eficiente desta levedura em meios contendo trealose
como única fonte de carbono. Entretanto, não foi detectada a enzima trealase ácida nos sobrenadantes de cultura das
linhagens de S. cerevisiae sobre-expressando o gene CgATH1. Acreditamos que a caracterização molecular da trealase
ácida na levedura C. glabrata permitirá melhorias no diagnóstico laboratorial, bem como uma melhor compreensão
do papel desta enzima, e do metabolismo de trealose, na fisiopatologia deste importante patógeno oportunista e de
outros fungos de interesse médico.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP.
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Diversidade genética de Candida albicans
e Candida dublieniensis produtores de
exoenzimas provenientes da cavidade bucal
de pacientes diabéticos brasileiros
Bassi, RC; Spolidório, DMP; Boriollo, MFG
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade de Alfenas, Alfenas, MG, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: C. albicans, C. dubliniensis, diabetes mellitus, virulência, MLEE
Objetivo: Pacientes diabéticos apresentam elevadas suscetibilidades às espécies de Candida, especialmente C. albicans,
com elevados índices de candidíases bucal. A presente pesquisa investigou a diversidade genética e a virulência de
isolados bucais de C. albicans e C. dubliniensis provenientes pacientes com diagnósticos de diabetes mellitos sob controle
clínico. Metodologia: O estudo envolveu 54 pacientes provenientes das Unidades de Atendimento do Programa Saúde
da Família - Ministério da Saúde do Brasil -, do município de Limeira, estado de São Paulo. A diversidade genética e a
virulência foram avaliadas por marcadores isoenzimáticos (MLEE) e análises de agrupamento e pelos testes de produção
de aspartil proteinases e fosfolipases em meios de cultura microbiológicos específicos, respectivamente. Resultados:
Espécies de Candida foram observadas em 79,9% dos pacientes, sendo 70,4% deles colonizados por C. albicans com ou
sem associação a outras espécies do gênero, incluindo C. tropicalis, C. krusei e C. dubliniensis. Um total de 84 linhagens
(ETs – Electrophoretic Types) em 189 isolados de C. albicans e 6 isolados de C. dubliniensis foram encontrados. A maioria
dos pacientes Candida–positivo (92,1%) compartilhou isolados altamente relacionados, porém não-idênticos com
pacientes diabéticos não-relacionados, independentemente do gênero do paciente. Entretanto, clusters gênero-específicos
e menores também foram observados, os quais demonstraram um modo mono- ou policlonal de colonização bucal em
um mesmo paciente. Atividades exoenzimáticas de aspartil poteinases e fosfolipases ocorreram em 100% e 92,6% dos
isolados de C. albicans, respectivamente sem qualquer correlação com o gênero do paciente, ET (electrophoretic type),
e clusters de isolados altamente relacionados. Conclusão: Os resultados sugerem a ocorrência bucal de linhagens (ETs)
altamente relacionadas e não-idênticas de C. albicans, capazes de produzir altos níveis de exoenzimas, entre a maioria
dos pacientes portadores de diabetes mellitos não-relacionados sob controle clínico, independentemente do gênero.
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Eletroforese de enzima multiloco (MLEE)
e análises de agrupamento de Candida
albicans isolada da cavidade bucal
de estudantes brasileiros saudáveis
da Silva, JJ; Bassi, RC; Florêncio, D; Resende, MR; Alves, VE; da Silva, LM; Rodrigues, RS; Boriollo, MFG
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade de Alfenas, Alfenas, MG, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: C. albicans, diversidade genética, estudantes saudáveis, MLEE, análises de agrupamento
Objetivo: Candida albicans e espécies relacionadas são encontradas de forma ubíqua e comensal na microbiota de cavidades
(retal, bucal, vaginal, uretral, nasal, aural) e pele humanas. Estas espécies são consideradas patógenos oportunistas capazes
de causar infecções, variando desde desordens mucocutâneas, não comprometedoras ao indivíduo, até doenças invasivas,
envolvendo quase todos os órgãos. O objetivo da presente pesquisa foi avaliar a diversidade genética de C. albicans
isolada da cavidade bucal de populações de estudantes clinicamente saudáveis através de marcadores isoenzimáticos
(MLEE) e análises de agrupamento. Metodologia: Isolados de leveduras foram previamente identificados através dos
ensaios de formação de tubo germinativo, teste de produção de clamidoconídeos, crescimento em meio cromogênico
CHROMagar Candida®, e testes de assimilação e fermentação de carboidratos. Enzimas intracelulares, de leveduras
previamente cultivadas, foram extraídas em água bidestilada gelada empregando-se pérolas de vidro e aparelho BeadBeater
(Biospec Products, Inc.). Essas enzimas foram separadas em géis de amido, sob tensão de 130 volts a 4ºC overnight, e
submetidas ao processo de revelação por métodos descritos para 11 sistemas: álcool desidrogenase, sorbitol desidrogenase,
manitol-1-fosfato desidrogenase, malato desidrogenase, isocitrato desidrogenase, glucose desidrogenase, glucose-6-fosfato
desidrogenase, aspartato desidrogenase, catalase, peroxidase e leucina aminopeptidase. A interpretação genética dos
padrões de MLEE foi realizada seguindo a regra comumente aceita, a qual permite a dedução da composição alélica de
um organismo diplóide. A diversidade e o relacionamento genético dentro e entre populações de isolados de C. albicans
foram determinados pelo coeficiente de distância genética de Nei e visualizados em dendrogramas UPGMA gerados
pelo método SAHN (Sequential, Agglomerative, Hierarchic, Nonoverlapping Clustering Methods) algoritmo UPGMA
(Unweighted Pair-Group Method Using an Arithmetic Average). Essas análises foram feitas com o auxilio do software
NTSYSpc versão 2.2. Resultados: Alta diversidade genética de C. albicans foi observada em todas as populações de
estudantes, com predominância de algumas linhagens. Nenhuma correlação foi observada entre grupos de linhagens
altamente relacionadas e determinada população de estudantes. Em adição, divergências significantes entre as freqüências
genotípicas observadas e esperadas não foram detectadas (teste do equilíbrio de Hardy-Weinberg). Conclusão: A existência
de rotas de propagação direta e indireta dentro e entre populações de estudantes saudáveis foi sugerida pela presente
análise. Alterações microevolucionárias foram observadas em isolados de C. albicans provenientes de estudantes de uma
mesma escola (origem geográfica). Tais resultados vêm contribuir com os estudos sobre a diversidade e epidemiologia
molecular dessa espécie em populações de indivíduos clinicamente saudáveis. Ainda, esses dados poderiam ser utilizados
comparativamente com outras análises retrospectivas e em andamento de C. albicans a fim de detectar a existência de
grupos de leveduras predominantes em candidíases e contribuir com o desenvolvimento de estratégias para a prevenção
de sua transmissão entre populações imunocompetentes ou imunossuprimidas.
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Análise genômica comparativa em linhagem
de Saccharomyces cerevisiae utilizada na
indústria de etanol
Duarte, FM1; Missawa, SK1; Galzerani, F1; Carvalho Netto, OV1; Carazzolle, MF1; Gomes, LH2; Tavares, FCA2; Andrietta,
MGS3; Mieczkowski, P4; Petes, TD4; Pereira, GAG1; Argueso, JL1,4
1
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo
3
Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas, Universidade Estadual de Campinas
4
Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University
[email protected]
2
Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, Linhagem industrial, Etanol, Comparação genômica, Estrutura genômica, Biotecnologia
Apesar do interesse global na produção de etanol combustível, existem poucos estudos sobre as linhagens industriais
da levedura Saccharomyces cerevisiae responsáveis pela conversão de glicose a etanol nas usinas. Neste projeto foi
analisada a estrutura de organização do genoma na linhagem industrial de S. cerevisiae JAY270, derivada de Pedra2
(PE2) – linhagem selvagem de alto rendimento isolada de processos fermentativos no estado de São Paulo. As análises
de genômica comparativa foram realizadas aproveitando-se a vasta disponibilidade de informações disponíveis para
linhagens laboratoriais dessa levedura. Análises meióticas e de cariotipagem molecular demonstraram que JAY270 é uma
linhagem diplóide, naturalmente heterotálica. Além disso, cruzamentos entre JAY270 e a linhagem laboratorial padrão
de S. cerevisiae (S288c) produziram híbridos viáveis e férteis, confirmando que JAY270 de fato pertence à espécie S.
cerevisiae. Análises do perfil cariotípico através de PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) demonstraram que existem
variações de tamanho em muitos dos cromossomos de JAY270 em relação ao perfil de S288c. O perfil cariotípico também
demonstrou que alguns cromossomos de JAY270 apresentam polimorfismo entre homólogos, com evidentes variações
de tamanho para um mesmo cromossomo. Experimentos de sub-cultivo demonstraram que o cariótipo desta linhagem
é estável sob condições de laboratório. A linhagem industrial JAY270 também foi analisada através de “CGH-array”,
que consiste na caracterização da dosagem gênica em todas as regiões do genoma em relação à linhagem de laboratório
através de microarranjos. A análise do “CGH-array” demonstrou que a maior parte dos rearranjos cromossômicos
existentes entre JAY270 e S288c estão localizados nas regiões sub-teloméricas, além de pequenas deleções em regiões
de sítios de DNA repetido em tandem. O “CGH-array” forneceu um esboço geral da organização genômica de JAY270
e confirmou que a mesma apresenta uma quantidade significativa de rearranjos cromossômicos, que foram explorados
mais detalhadamente através de “Band-arrays” e análises físicas. Finalizando a análise, o genoma da linhagem JAY270
está sendo seqüenciado, o que fornecerá dados essenciais para a sua completa caracterização estrutural e funcional.
A caracterização da organização genômica nessa linhagem representa uma etapa importante para o desenvolvimento
de estratégias de manipulação genética das linhagens industriais visando o melhoramento de características ligadas à
produção de etanol.
Apoio Financeiro: CNPq e NIH.
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Aplicação da engenharia metabólica em
leveduras industriais para produção de
álcool combustível
Gueiros, RS; Pereira, EVS; Morais, MA; Simões, DA
Departamento de Genética e Departamento de Bioquímica. Universidade Federal de Pernambuco. Recife, PE, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, engenharia metabólica, etanol
Os conceitos da engenharia metabólica vêm sendo utilizados com o objetivo de aumentar rendimentos e incluir novas
rotas metabólicas que possibilitem a produção de metabólitos de interesse biotecnológico. Uma das alternativas para suprir
o aumento pela demanda por etanol combustível é a engenharia metabólica de linhagens industriais de Saccharomyces
cerevisiae visando o aumento do rendimento em etanol. Portanto, a deleção ou superexpressão de algumas desidrogenases
pode contribuir para se alcançar este objetivo. Nesse contexto, o gene GDH1 foi parcial ou completamente removido
com o uso de fragmentos de PCR que continham seqüências com mais de 300 bp de homologia com as regiões
5’ e 3’ do gene alvo do genoma da linhagem industrial JP1, que segundo Silva-Filho et al (2005) é dominante no processo
fermentativo de diferentes destilarias. O gene GDH1 codifica a principal enzima da via de assimilação de amônia e sua
remoção deve causar a substituição dos cofatores NADPH por NADH na assimilação de amônia. A segunda estratégia,
com base nos experimentos de Bro e cols. (2006), consistiu na inserção genômica por integração homóloga do gene
bacteriano gapN, codificador da enzima gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase. Esta enzima bacteriana utiliza NADPH
como cofator, ao invés de NADH, e não promove a síntese de ATP durante a produção 2-fosfoglicerato. O gene gapN foi
clonado sob a regulação do promotor do gene TPI1 em um plasmídeo integrativo que apresenta seqüências das regiões
5’ e 3’ do gene HO de S. cerevisiae para gerar o vetor integrativo pHO-GAPN. O cassete de integração foi purificado
após digestão coma enzima NotI e utilizado para inserção no lócus HO do genoma da levedura por transformação
celular segundo o método descrito por Gietz e Woods (2002). As linhagens recombinantes ∆gdh1 e TPI1-gapN foram
foram avaliadas em ensaios fermentativos para a produção de glicerol e etanol. Com relação aos rendimentos em
glicerol, conclui-se que a deleção do gene GDH1 não apresenta os efeitos previamente descritos quando testada em
meios com razão carbono/nitrogênio (C/N) elevada (condição industrial), enquanto a superexpressão do gene gapN
manteve seu efeito naquela condição. Desta forma, consideramos promissora a aplicação em ambientes industriais de
linhagens construídas baseadas nas duas últimas estratégias citadas. Quanto aos rendimentos em etanol, conclui-se que
não houve diferença significativa ao nível de 4% entre as condições testadas, em comparação com a linhagem parental.
Sendo assim, os resultados mostraram que as modificações genéticas em alguns pontos do metabolismo central podem
contribuir para o aumento na produção e rendimento de etanol durante a fermentação industrial.
Apoio financeiro: CNPq e FADE-UFPE.
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Phenotypic characterization of
Saccharomyces cerevisiae alcohol
dehydrogenases ADH1 and ADH2
Ganda, IS1; Marisco, G1; Brendel, M1; Pungartnik, C1
Laboratório de Biologia de Fungos, Centro de Biotecnologia e Genética, UESC, Bahia, Brasil
[email protected]
1
Keywords: alcohol dehydrogenase, hydrogen peroxide, paraquat, yeast
Alcohol dehydrogenase 1 (Adh1) and alcohol dehydrogenase 2 (Adh2) enzymes play different roles in alcohol production
and consumption in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Humans do not possess Adh1 but Adh2 that catalyzes the first
step in ethanol metabolization in both humans and yeast. In the final step of alcoholic fermentation Adh1p converts
acetaldehyde into ethanol, whereas Adh2p is responsible for the conversion of ethanol via acetaldehyde into acetate,
which participates as Acetyl-CoA in the Krebs Cycle, allowing the utilization of ethanol as energy source. This study
aimed to further phenotypically characterize yeast mutants adh1Δ and adh2Δ, when compared to their respective
wild type (WT, BY10000) after chronic exposure to the chemicals H2O2 [inducer of oxidative stress] and paraquat
[lipid peroxidation] or to the physical agents UVC [formation of pyrimidine dimers and of (6-4) pyrimidine photoproduct]
and to 48oC [heat stress]. Yeast strains were grown on YPD agar medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose, 2% agar)
for 16 to 18 hours to obtain exponentially growing (LOG) cells; cells were washed three times with 0.9% NaCl
solution and re-suspended to a titer of 1x108/mL. LOG cells were either exposed to H2O2 (5mM, 30, 60, 90 min;
acute exposure); properly diluted and plated on YPD agar containing PAQ (40, 80 and 160 μM; chronic exposure) or
irradiated with UVC (40, 60 and 80 J/m2); or incubated at 48°C for 10, 20 and 30 min. Results show that (a) yeast
adh1 mutant was less resistant to PAQ while adh2 was as resistant as the WT strain (b) when exposed to H2O2 adh2 was
more resistant than the WT, while adh1 showed intermediate resistance; (c) both mutants showed the same resistance
phenotype to UVC as the WT; (d) at 48oC both mutants were more resistant than the WT, as previously described
in the literature. These results show that although involved in the same biochemical pathway of ethanol anabolism/
catabolism, the absence of either enzyme has different influence with oxidative stress biochemical pathway and seem
not related to DNA repair processes.
Financial support: CNPq, CAPES.
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Polimorfismo dos genes que codificam
adesinas em leveduras utilizadas na produção
industrial de álcool combustível no Brasil
Figueiredo, CM1; Alves-Jr, SL1; Lopes, ML2; Amorim, HV2; Stambuk, BU1
Laboratório de Biotecnologia e Biologia Molecular de Leveduras, Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Santa Catarina
2
FERMENTEC Ltda., Piracicaba, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: FLO1, FLO11, Floculação, Espuma, Biofilme, Hidrofobicidade
No Brasil, o álcool combustível é produzido principalmente através de processos de batelada alimentada onde as células
de leveduras, principalmente Saccharomyces cerevisiae, são constantemente centrifugadas e reutilizadas nos vários ciclos
fermentativos ao longo da safra. As dornas onde ocorrem os processos fermentativos são ambientes com condições
adversas (ex. concentrações elevadas de açúcares, pH, pressão osmótica e temperatura), levando às leveduras presentes
nestes ambientes a desenvolverem características adaptativas (floculação celular, formação de espuma, biofilme, etc.)
de forma a sobreviver nestas condições estressantes. Estas formas adaptativas são indesejáveis para a indústria de álcool
combustível, pois dificultam o reciclo e centrifugação das leveduras, diminuem a capacidade volumétrica útil dos
fermentadores, afetando a produtividade e aumentando os gastos da indústria. Desta forma, a pronta identificação destas
características na população de leveduras presentes no processo fermentativo faz-se necessária para minimizar as perdas
no rendimento. Estudos recentes têm demonstrado que genes pertencentes à família FLO (FLO1 e FLO11), DAN4
e estão envolvidos com alguns destes fenótipos, e que polimorfismos no tamanho destes genes (principalmente nas
regiões repetitivas ricas em serina e treonina) podem influenciar o grau de expressão destas características fenotípicas nas
leveduras. O presente trabalho tem como objetivo correlacionar polimorfismos encontrados nos genes FLO1 e FLO11
(determinados através de PCR), com as características fenotípicas de floculação, formação de espuma, hidrofobicidade
da parede celular, crescimento invasivo no agar, e formação de biofilmes por linhagens isoladas no ambiente industrial
de produção de álcool combustível no Brasil. Os resultados obtidos revelaram enormes polimorfismos nos genes
estudados, sendo que o gene FLO1 apresentou uma correlação significativa entre seu tamanho e a hidrofobicidade da
parede celular, bem como com a taxa de floculação celular na presença de cálcio. Já no caso do FLO11, seu polimorfismo
demonstrou relações mais significativas com a formação de biofilme e de espuma, embora seja também significativa a
sua correlação com a floculação celular. Por outro lado, foi verificada uma relação inversa entre o crescimento invasivo,
e a capacidade de produção de espuma e biofilme pelas leveduras industriais. De acordo com nossas análises, o gene
AWA1 não foi encontrado nas linhagens estudadas e o polimorfismo do gene DAN4 não apresentou uma boa correlação
com as características fenotípicas estudadas. Portanto, nossos resultados demonstram que o polimorfismo dos genes
FLO, determinado através de PCR, pode ser uma ferramenta útil na caracterização rápida de linhagens de levedura
com fenótipos apropriados para a indústria de produção de álcool combustível no Brasil.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP.
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Caracterização genética e fisiológica
de leveduras selecionadas para
a eficiente produção industrial
de álcool combustível no Brasil
Espírito Santo, JCA1,2; Dário, MG1,2; Machado, LO1; Gonçalves, DL1; Alves-Jr, SL1,2;
Klinkowstrom, AM1; Schlogl, PS1; Stambuk, BU1,2
1
Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Santa Catarina
Programa de Pós-graduação Interunidades em Biotecnologia, ICB-USP/IPT/I. BUTANTAN
[email protected]
2
Palavras-Chave: SUC2, S. cerevisiae, sacarose, invertase, álcool combustível
No Brasil a produção de álcool combustível depende da eficiente fermentação de mostos (caldo-de-cana e/ou melaço)
contendo altas concentrações de sacarose. Geralmente são utilizados sistemas de batelada alimentada com altas
concentrações de leveduras, que são constantemente recicladas de volta ao fermentador durante todo o período da
safra. Desta forma, o sucesso desta indústria depende da utilização de leveduras com alta capacidade fermentativa, e
capazes também de suportar as diversas condições estressantes do processo industrial. No presente trabalho realizamos
a caracterização genética e fisiológica de um grupo de leveduras Saccharomyces cerevisiae selecionadas e comercializadas
para este setor industrial, isoladas no Sudeste e Nordeste do Brasil, e comparadas com linhagens de laboratório com
genótipos conhecidos. Foram analisados os padrões de utilização de açúcares, a atividade e regulação da invertase
extracelular, bem como possíveis polimorfismos e amplificações gênicas nos genes SUC responsáveis pela síntese desta
enzima, necessária para a eficiente fermentação da sacarose. Todas as 7 linhagens estudadas foram capazes de utilizar e
fermentar eficientemente a sacarose, glicose, galactose e maltose, enquanto que apenas algumas delas foram capazes de
fermentar a maltotriose. Embora tenha sido amplamente descrito na literatura que cepas de S. cerevisiae que utilizam
mostos contendo sacarose apresentam amplificação dos genes SUC (Benitez et al, Biotechnol. Prog. 12: 149, 1996;
Codon et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 154, 1998), todas as linhagens analisadas apresentaram apenas o gene
SUC2 no cromossomo IX, com exceção de uma das cepas isoladas no Nordeste que apresentou, alem do SUC2, os
genes SUC1 (cromossomo VII) e SUC4 (cromossomo XIII). De fato, nossa análise da atividade invertase extracelular
nas diferentes linhagens industriais confirmou que a expressão e regulação desta enzima é semelhante à verificada em
linhagens de laboratório contendo apenas o gene SUC2, e significativamente mais alta na linhagem que apresenta
a amplificação dos genes SUC (SUC1 e SUC4). Entretanto, todas as linhagens, incluindo as de laboratório, foram
capazes de fermentar a sacarose com praticamente as mesmas cinéticas e produzir etanol na mesma velocidade, quando
testadas em condições que simulam o ambiente industrial (~200 g/L sacarose, ~10 g/L de células de levedura). Estes
dados indicam que a atividade invertase não é o fator limitante na fermentação de sacarose para a produção de álcool
combustível no Brasil.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.
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A seqüencia genômica de CAT-1, uma
linhagen de Saccharomyces cerevisiae
utilizada na eficiente produção industrial de
álcool combustível no Brasil
Stambuk, B1-3; Gharizadeh, B2; Wang, C2; Jalili, R2; Babrzadeh, F2; Shokralla, S2; Robinson-Mosher, A2; Shafer, B2;
Sherlock, G3; Dunn, B3; Schlogl, PS1; Basso, LC4; Lopes, ML5; Amorim, HV5; Ronaghi, M2
Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Santa Catarina, Brasil
2
Stanford Genome Technology Center, Stanford University, USA
3
Department of Genetics, Stanford University, USA
4
Departamento de Ciências Biológicas, ESALQ, Universidade de São Paulo, Brasil
5
FERMENTEC Ltda., Piracicaba, SP, Brasil
1
A produção de álcool combustível a partir da cana-de-açúcar é uma atividade industrial que tem papel significativo
na matriz energética Brasileira, como vai de encontro ao grande desafio mundial de produção de energia renovável
neste terceiro milênio. Este processo fermentativo geralmente utiliza o sistema de batelada alimentada com altas
concentrações de açúcar e leveduras, que são constantemente recicladas ao termino de cada ciclo fermentativo para
iniciar um novo processo, durante todo o período da safra. Desta forma, o sucesso desta indústria depende da utilização
de leveduras com alta capacidade fermentativa, alem de serem capazes de suportar as diversas condições estressantes
do processo industrial. No intuito de otimizar este importante processo industrial, foi determinada a seqüência do
genoma da linhagem CAT-1, uma levedura isolada no ambiente industrial nos anos 90 pela FERMENTEC e ESALQ
e utilizada em grande escala para a produção de bilhões de litros de álcool combustível todo ano. A seqüência do DNA
genômico desta levedura foi determinado através da técnica de pirosequenciamento, usando tanto a plataforma GS
20 como GS FLX (454, Roche). Foram obtidas 2.153.802 leituras, totalizando 276.527.657 bases de seqüência total
(o que corresponde a aproximadamente uma cobertura de 22x o genoma haplóide de S. cerevisiae). Estas seqüências
foram montadas em 2.138 contigs, dos quais 837 eram maiores do que 1 kb, sendo o maior com 150 kb. Após
mapeamento destes contigs no genoma já conhecido de S. cerevisiae (linhagem S288C), 11.889.204 nucleotídeos foram
montados em 16 cromossomos e o DNA mitocondrial. A análise de SNPs, e comparando-se o genoma desta linhagem
com outras 3 cepas já seqüenciadas deste microrganismo (cepas S288C [laboratório], RM11-1a [vinho] e YJM789
[isolado clínico]), permitiu verificar que a linhagem industrial CAT-1 é mais próxima da cepa RM11-1a, do que das
outras linhagens. Serão também apresentados vários exemplos de significativas amplificações e deleções genômicas que
certamente contribuem para o sucesso desta linhagem como eficiente produtora de álcool combustível. O genoma de
CAT-1 constitui o primeiro passo para a utilização de modernas técnicas de engenharia genómica visando à otimização
deste importante processo industrial não só para o Brasil, mas para a futura produção e uso global dos combustíveis
renováveis obtidos a partir da fermentação da biomassa.
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Validação de leveduras Y190 e KGY37 para
utilização com um novo protocolo de triagem
líquida para o sistema de duplo-híbrido
Donnard, ER1; Ortega, JM1; Gietz, RD2
1
Depto. Bioquímica e Imunologia, UFMG, Brazil
Dept. Biochemistry and Medical Genetics, UofM, Canada
[email protected]
2
Palavras-chave: two-hybrid, duplo-híbrido, triagem, Y190, KGY37
O sistema de duplo-híbrido é um sistema de seleção genética que permite a seleção de produtos de cDNA que interagem
com uma proteína de interesse. Recentemente, nosso grupo desenvolveu um novo protocolo de triagem, menos trabalhosa
e mais eficiente, feita inteiramente em meio líquido. Relatamos aqui a validação das linhagens Y190 e KGY37 realizando
experimentos de triagem completos. As iscas utilizadas com a linhagem KGY37 foram as proteínas Trim2, RTel e
Trim32 e as respectivas bibliotecas de cDNA eram originadas de tecidos onde elas são expressas. Comparativamente a
levedura Y190 foi utilizada para seleção de proteínas que interagem com Trim2. As triagens com KGY37 e as iscas acima
envolveram, respectivamente, 4.6, 8 e 40 milhões de transformantes, enquanto o experimento com Y190 envolveu 5.4
milhões. A triagem foi realizada em placas de 96 poços (“deep well”). Utilizando KGY37, respectivamente 21, 6 e 27
clones positivos foram selecionados nas triagens com as proteínas acima. Com Y190, 35 poços apresentaram crescimento
em meio sem histidina com 10mM de 3-aminotriazol, uma concentração cinco vezes mais baixa que a gasta em placas
de meio sólido (com KGY37 utiliza-se apenas 0,5 mM). Com exceção da triagem para RTel onde dois dentre os seis
clones apresentaram ativação do gene repórter LacZ, nas outras triagens todos os clones apresentavam tal ativação,
denotando a alta eficiência de recuperação de clones com forte interação com este procedimento. Os clones obtidos com
Y190 foram completamente caracterizados, sendo que, a partir de 14 deles, plasmídios codificantes de cDNA foram
extraídos e foi possível restaurar a ativação dos genes repórteres, resultando sempre em ativação forte do repórter LacZ.
O seqüenciamento dos insertos revelou que sete deles correspondiam à proteína EFS, e os outros envolviam Trim3,
Cofilin, RanBPM, ativador de plasminogênico e Ubac 1. Um clone da triagem com KGY37 e Trim2 foi caracterizado
e identificado como Dynactin 1, os demais estão em análise. O novo protocolo será publicado no livro “Methods in
Molecular Biology”. Além de melhorar a performance, como estes dados mostram, o novo método pode ser utilizado
em estações robóticas, o que permitirá a montagem mais eficiente de novos interactomas. É a primeira vez que estas
linhagens foram validadas com este novo método e, embora rotineiramente a linhagem KGY37 consiga fornecer maior
número de transformantes (40 milhões para Trim32) e utilize menores concentrações de 3-aminotriazol (0,5 mM), a
levedura Y190 também foi validada para utilização no sistema de triagem em meio líquido.
Agências financiadoras: CNPq e FAPEMIG.
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DNA damage induced by disulfiram and
diepoxyoctane in alcohol dehidrogenase
mutants of Saccharomyces cerevisiae
Marisco, G1; Ganda, IS1; Brendel, M1; Pungartnik, C1
Laboratório de Biologia de Fungos, Centro de Biotecnologia e Genética, UESC, Ilhéus, BA, Brasil
[email protected]
1
Keywords: DNA damage, disulfiram, diepoxyoctane, alcohol dehidrogenase
During alcoholic fermentation in yeast, pyruvate decarboxylase converts pyruvate into acetaldehyde [ACA] and CO2;
ACA is metabolized either to ethanol by alcohol dehydrogenase-1 (Adh1p) or, alternatively, to acetate by aldehyde
dehydrogenase (Aldp). Under aerobic conditions ethanol may be used by yeast as a carbon source; it is converted by
Adh2p to ACA that is metabolized to acetate by Aldp that enters the Krebs cycle via acetyl-CoA. Humans do not possess
Adh1p but Adh2p, which enables the liver to convert ethanol to ACA that is converted to acetate by Aldp. Disulfiram
[DSF] is used in medicine as an adjuvant therapy for control of alcoholism. DSF inhibits Aldp and, therefore, causes
ACA accumulation, which at higher concentrations is a potential human health hazard as it produces DNA lesions,
amongst them the highly genotoxic DNA inter-strand cross-links [ICL]; these are mutagenic and pose a carcinogenic
hazard. Yeast mutants perturbing ACA metabolism (adh1∆ and adh2∆) and blocked in repair of DNA-ICL (pso2∆)
are, therefore, ideal for evaluation of lethal DNA damage induced by endogenously accumulated ACA. The drug DSF
may amplify ACA accumulation in mutant adh1∆ and even in the wild-type [WT] as the conversion to acetate is
blocked. The known ICL forming chemical diepoxyoctane [DEO] was used for monitoring sensitivity to DNA-ICL.
Yeast was grown in YPD (yeast extract 1%, dextrose 2%, peptone 2%, 30oC, 16-18 h), washed 3x in 0.9%NaCl),
and re-suspended to a final concentration of 1-2 x 108 cells/mL. Cells were diluted and plated on YPD-agar with DSF
(10, 20 and 30 µM). Exponentially growing cells were incubated for 1 hour with DEO (30 and 40 mM), diluted and
plated on YPD-agar. Survival was assayed after 3 days at 30ºC. Results are expressed as mean and standard deviation
of at least three experiments. As expected, DEO-exposed pso2∆ was more sensitive than the WT, while mutants adh2∆
and adh1∆ showed WT-like resistance. When exposed to DSF, pso2∆ was also more sensitive than the WT, while
adh2∆ was slightly more sensitive and adh1∆ had WT-like resistance. That shows that DSF, through the inhibition
of Aldp, leads to accumulation of ACA. This could be responsible for the formation of DNA-ICL with consequent
loss of transcription or replication and a sensitivity phenotype. Thus, it is expected that mutant pso2∆ has greater
sensitivity than the other mutant strains, because DNA-ICL produced by the natural glycolysis intermediate ACA
are not repaired but accumulate during incubation with DSF. It may thus be the natural function of Pso2 protein to
prevent this accumulation of ACA-induced damage that is formed in formidable quantities when yeast grows on high
sugar-containing media and fruits.
Financial support: CNPq, CAPES.
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Fermentação de sacarose por linhagens
de Saccharomyces cerevisiae deletadas
no gene SUC2
Dário, MG1,2; Machado, LO1; Schlogl, PS2; Stambuk, BU1,2
Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia, Universidade de São Paulo
2
Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Santa Catarina
[email protected]
1
Palavras-chave: Álcool Combustível, Engenharia genômica, Sacarose, Saccharomyces cerevisiae
A levedura Saccharomyces cerevisiae é utilizada em grande escala para a produção de álcool combustível no Brasil,
fermentando mostos contendo altas concentrações de sacarose (caldo-de-cana e/ou melaço). Nesse processo é desejável a
elevada produtividade de etanol (fermentação total dos açúcares em um curto espaço de tempo), com máximo rendimento.
Esta levedura apresenta duas vias de utilização de sacarose já amplamente caracterizadas: a hidrólise extracelular pela
ação da invertase periplasmática (produzindo glicose e frutose que são a seguir captadas e fermentadas pelas células),
e outra envolvendo o transporte ativo da sacarose com a posterior hidrólise intracelular do açúcar. Entretanto, a
hidrólise extracelular do dissacarídeo é indesejada na produção de álcool combustível por dois motivos: contribui para
incrementar o estresse osmótico sofrido pelas células, gerado pelos elevados níveis de açúcares redutores formados, e os
monossacarídeos liberados no meio podem servir de fonte de carbono para microorganismos contaminantes do processo
fermentativo. Com o intuito de otimizar a produção de etanol, levando em conta as características do setor industrial,
neste trabalho realizamos a análise bioquímica de linhagens de laboratório com genótipos conhecidos, modificadas
através de engenharia genômica, de forma a expressar apenas uma das vias de utilização de sacarose pela deleção do gene
que codifica para a invertase extracelular. Os resultados mostram que quando o gene SUC2 foi deletado do genoma
da levedura, as células continuaram fermentando eficientemente baixas concentrações de sacarose (~20g/L), com a
vantagem de não produzir glicose e frutose no meio. Nessas cepas engenhadas a sacarose é transportada diretamente
para o interior da célula, onde é hidrolisada pela maltase (α‑glicosidase) citoplasmática. Por outro lado, em condições
industriais de fermentação em batelada que utiliza alta concentração de sacarose (>180g/L), as leveduras sem atividade
invertase não foram capazes de consumir totalmente a sacarose. Nossos resultados mostram portanto que células de
levedura são capazes de fermentar a sacarose mesmo sem atividade invertase (p.ex. pela deleção do gene SUC2), mas
novos estudos ainda são necessários para otimizar a captação desse açúcar pelas leveduras, especialmente em condições
de fermentação em batelada com altas concentrações de sacarose. Acreditamos que a análise molecular das vias de
utilização de sacarose por S. cerevisiae possibilitará melhorar a performance fermentativa das leveduras utilizadas no
processo industrial, identificando os genes alvo para otimização via engenharia genômica.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq e FAPESP.
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Identificação e análise estrutural do gene
codificante da enzima álcool desidrogenase
de Saccharomyces cerevisiae
em Dekkera bruxellensis
Liberal, ATS1; Pita,WB1; Torres, RRNB1; Carazzolle, MF2; Pereira, GAG2; Morais Jr, MA1
Lab. de Genética de Microorganismos, Departamento de Genética, UFPE
2
Lab. de Genômica e Expressão, Departamento de Genética, UNICAMP
[email protected]
1
Palavras-chave: Fermentação alcoólica, Dekkera bruxellensis, ADH
A levedura Dekkera bruxellensis tem sido recentemente detectada como principal contaminante em diversos processos
fermentativos; inclusive na fermentação das destilarias de álcool combustível, causando problemas de rendimento
industrial. Apesar destas constatações industriais, pouco se sabe sobre a fisiologia e genética desta levedura. Portanto, são
necessários estudos sobre a constituição genética desta espécie para que, em conjunto com os dados fisiológicos, possamos
entender os mecanismos de adaptação desta levedura aos processos fermentativos industriais. Recentemente, nosso grupo
de pesquisas iniciou a análise do genoma desta levedura, com o objetivo de identificar genes responsáveis pelas vias do
metabolismo central e genes relacionados com a adaptação dessa levedura ao processo industrial. Neste contexto, o
objetivo do presente trabalho foi o de identificar os genes ADH que codificam enzimas da família álcool desidrogenase,
enzima que cataliza a conversão de acetaldeído a etanol na última etapa da via do metabolismo fermentativo. Seqüências
de nucleotídeos do genoma parcial de D. bruxellensis obtidas da Universidade de Lund (Suécia) foram utilizadas para
a construção de um banco de dados genéticos (www.lge.ibi.unicamp.br/dekkera). Estas seqüências foram coletadas
a partir da similaridade com os genes de S. cerevisiae usando a ferramenta de alinhamento local, sendo considerado
apenas os contigs com e-value menor do que -20. Os contigs 3093 e 357 foram escolhidos por representar dois dos três
conjuntos presentes na S. cerevisiae. Essas seqüências foram submetidas à análise de BLAST dentro dos bancos de dados
do NCBI, de S. cerevisiae (SGD) e de leveduras ascomicetos (Genolevures). Dentro de cada grupo buscou-se o gene
ADH de S. cerevisiae mais próxima de cada contig de D. bruxellensis. O contig 3093 apresentou maior semelhança com
o gene ADH3, enquanto o contig 357 ao gene ADH7. Para confirmar a distinção entre os dois grupos de genes ADH
representados pelos contigs de D. bruxelensis foi construída uma árvore filogenética com a presença de representantes
do grupo dos Ascomicetos relacionados a cada contig. No grupo do contig 357/ADH7 foram agrupadas as leveduras
Candida albicans, Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces lactis, Candida glabrata e S cerevisiae que formaram uma topologia
semelhante à topologia descrita no artigo de Woolfit et al (2007), enquanto que no grupo do contig 3093/ADH3 foram
agrupadas as leveduras Candida albicans, Yarrowia lipolytica, Ashbya gossypii, Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces lactis,
Candida glabrata e S cerevisiae que formaram uma topologia não descrita no artigo. A topologia encontrada mostrou
a correlação desses genes nos diferentes ascomicetos, mas as diferenças tipológicas nas árvores filogenéticas desses dois
genes provavelmente indicam uma diferença quanto à origem desses genes na D bruxellensis.
Apoio Financeiro: CNPq, Capes.
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Monitoramento de linhagens de
Saccharomyces cerevisiae por PFGE durante
a safra anual de produção da cachaça
artesanal:comparação com genótipos
obtidos por RAPD-PCR e mtDNA-RFLP
Linhares, ND; Araújo, RAC; Rosa, CA; Cisalpino, PS
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
[email protected]
Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, eletroforese de pulsos alternados, genotipagem molecular, fermentação, safra
anual de cachaça
Durante a safra de produção da cachaça artesanal a fermentação é conduzida por uma diversidade de linhagens de S. cerevisiae.
Métodos que permitam a identificação e monitoramento de linhagens durante o processo podem auxiliar na padronização da
qualidade e características organolépticas da bebida. Avaliou-se a cariotipagem eletroforética na diferenciação de 97 isolados
coletados de três dornas (início, meio e fim da safra, junho-outubro, 2000) numa destilaria em Moeda-MG. As condições da
separação eletroforética foram otimizadas (tampão TBE 0,5X, 12ºC, 180V, duas fases de pulsos 140-20s por 35h e 75-15s
por 7h; Gene NavigatorTM System). Estimaram-se computacionalmente os tamanhos das bandas cromossômicas (programa
LabImage v. 2.7.1), utilizados para construção de matrizes binárias e dendogramas (programa TFPGA v. 1.3). Observaramse perfis com 14 a 21 bandas de tamanhos entre 225-2200Kb, registrando-se polimorfismos de tamanho e número de
bandas. Foram encontrados 45 cariótipos, agrupados em dois clusters de baixa similaridade (60%). O primeiro (87 isolados,
similaridade 66%) tem representantes em todas as dornas e períodos. O segundo (10 isolados, similaridade 90%), foram
todos oriundos da dorna C, final da safra, quando foi adicionado fermento de padaria à dorna. As amostras que apresentaram
similaridade genética superior a 90% no dendograma, diferindo pela presença ou ausência de até no máximo três bandas
foram agrupadas, gerando 22 genótipos. Os genótipos majoritários, D (cariótipos 9, 10, 11 e 12; 39 isolados) e H (19, 20,
21, 40 e 41; 13 isolados), totalizando 54% das amostras, distribuíram-se por todas as dornas e períodos, excetuando-se a
dorna C, final da safra. Araújo et al. (2007) caracterizaram estes mesmos isolados por RAPD-PCR (41 perfis) e mtDNARFLP (12 padrões). Análise comparativa dos genótipos utilizando as três técnicas geraram 62 padrões compostos, 15 dos
quais permitiram identificar amostras clonais, ou seja, duas ou mais amostras que partilharam os mesmos genótipos segundo
cada um dos três métodos de análise empregados. Estes 15 padrões compostos abrigaram 50 dos 97 isolados, destacando-se
que todos os métodos discriminaram as leveduras indígenas daquelas correspondentes ao fermento de padaria. Genótipos
majoritários por PFGE (D e H) corresponderam a padrões majoritários por mtDNA e RAPD. O caráter clonal destes grupos
sugere que leveduras da cachaça, à semelhança de linhagens isoladas de vinho, se reproduzam por mitose durante o processo.
O polimorfismo cromossômico é atribuído a deleções, inserções e translocações de grandes fragmentos de DNA. O curto
ciclo da cachaça, com altas temperaturas, altas concentrações de açúcar no início e de etanol ao final pode gerar forte pressão
seletiva, favorecendo genótipos melhor adaptados. A PFGE mostrou-se um método confiável, reprodutível e sensível para
discriminação de isolados. Seu uso em larga escala pode ser limitado pelo custo e tempo de execução do procedimento.
Orgão financiador: CNPq.
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Genetic diversity of Saccharomyces
cerevisiae from cachaça, a traditional
distilled beverage from Brazil
Badotti, F1,2, Rosa, CA1, Querol, A3, Barrio, E2
Departamento de Microbiologia, ICB, C.P. 486, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG 31270-901, Phone 31-3499 2751, Brazil
2
Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biología Evolutiva, Departament de Genética, Universitat de València, Spain
3
Instituto de Agroquímica y Tecnologia de los Alimentos, CSIC, València, Spain
[email protected]
1
Keywords: cachaça, Saccharomyces cerevisiae, genetic diversity
Cachaça is the most traditional distilled beverage from Brazil produced from spontaneously fermented sugar-cane juice.
At the beginning of the fermentation process, a great diversity of non-Saccharomyces yeast species is observed. These
yeasts are responsible for flavour compounds formation. However, Saccharomyces cerevisiae is the predominant yeast
during alcoholic fermentation because is more tolerant to osmotic stress and alcohol. The reduced knowledge of yeast
biodiversity during sugar-cane juice fermentation is one of the most important problem for maintaining the stability
and quality of cachaça. Our objective is study the genetic diversity of S. cerevisiae isolated from cachaça to determine
the origin of these strains. We have isolated 76 S. cerevisiae strains from six Brazilian cachaça-producing regions with
different climatic characteristics (high or low humidity, cold or hot conditions, etc.). These strains were screened by the
restriction profile of the mitochondrial DNA and at least one strain from each profile was sequenced for four nuclear
genes (CAT8, BRE5, EGT2 and GAL4) and one mitochondrial gene (COX2). The genetic diversity found in cachaça
strains will be compared with that from strains present in other fermentation processes. The phylogenetic relationships
among cachaça strains as well as between these strains and those from other fermentation processes and origins will
also be analysed to determine the origin of cachaça strains.
This work has been supported by Programa ALBAN, CNPQ and FAPEMIG.
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Otimização da extração de DNA
mitocondrial de Dekkera bruxellensis
Cardoso, MV1; Alecrim, FM1; Batista, MVA1; Costa Júnior, CRL1; Cunha, WL1; Figueirêdo Júnior, CAS1; Lima, TLD1; Oliveira,
APA1; Pereira, L1; Pita, WB1; Tenório, KER1; Balbino, VQ1; Pereira, GA2; Morais Junior, MA1
1
Departamento de Genética, UFPE
Departamento de Genética, UNICAMP
[email protected]
2
Palavras-chave: Dekkera bruxellensis, Genoma mitocondrial, Protoplastos, PCR semi-quantitativa, Ascomicota
A levedura Dekkera bruxellensis é a principal causa de contaminação nas destilarias em todo mundo, provocando a
diminuição da produtividade de etanol e, conseqüentemente, ocasionando prejuízos à indústria. Sendo esta uma levedura
com metabolismo Crabtree positivo e tolerante a etanol, necessita-se que os genomas nuclear e mitocondrial estejam
trabalhando em conjunto. Assim, um estudo detalhado do DNA mitocondrial a partir do seu sequenciamento deve ser
realizado com a finalidade de correlacionar os fenótipos compartilhados por D. bruxellensis e Saccharomyces cerevisiae
(crescimento em anaerobiose e tolerância a etanol) através de estudos de filogenia em busca de melhor entendimento
desse “fitness competitivo” em favor de D. bruxellensis nas destilarias de caldo de cana da região Nordeste do Brasil.
Para isso, sete isolados industriais desta espécie, escolhidos por apresentarem contaminação em diferentes meios de
cultivo (cerveja, vinho, cachaça), foram inoculados em meio YPA (2% de extrato de levedura, 2% de peptona e 1% de
acetato de potássio). Estes foram submetidos a um sistema lítico (20mg.ml-1 da enzima lítica glucanex; 10mg.ml-1 de
BSA; 0.8M de KCl; 20mM de citrato de sódio) para formação de protoplastos, os quais foram lavados em solução 01
(1M sorbitol, 50mM tampão citrato pH 5.8) para mimetizar o estado vivo da célula. Logo em seguida, os protoplastos
foram ressuspensos em solução 02 (200mM de sucrose; 65mM de KCl; 20mM de EGTA; 10mM de MgCl2; 50mM
de HEPES- KOH pH 7.2) e acrescidos de solução 03 (20mM de sucrose; 65mM de KCl; 20mM de EDTA; 50mM de
HEPES-KOH pH 7.2) e 10 U.ml-1 de DNAse com a finalidade de eliminar a maior parte do DNA nuclear, mantendo
a osmorregulação da célula. Nesta etapa, a solução 04 (10mM de EDTA; 50mM de Tris-HCl pH 8.2; 50μg.ml-1 de
proteinase K; 0,3% de SDS) foi usada para lisar a parede da mitocôndria, obtendo assim o DNA mitocondrial a partir
da desproteinização por fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). A viabilidade do método foi testada através de
uma PCR semi-quantitativa em gel de agarose a 0,8%, utilizando os primers nuclear Db e o mitocondrial DbCOX2
sintetizados a partir do programa Primer3 (http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm). Deste modo, foi verificado
que o meio usado para o crescimento favoreceu a respiração, visto que a amplificação com o primer DbCOX2 aconteceu
a partir do décimo quinto ciclo, ao passo que com o primer Db ocorreu no vigésimo primeiro, garantindo assim a
acurácia do protocolo estabelecido.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Estudo de complementação funcional
de rad51 de Saccharomyces cerevisiae
por radA de Halobacterium salinarum
Santos, CR; Farias, ST1; Bucciarelli-Rodriguez, M
Departamento de Biologia Geral, ICB Universidade Federal de Minas Gerais, 31270-901 Belo Horizonte - MG, Brazil
Núcleo Acadêmico de Ciências Naturais e da Vida, Universidade Federal da Bahia, 45055-090 Vitória da Conquista – BA, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, Halobacterium salinarum, RadAp, Rad51p
A avaliação de complementação funcional é uma ferramenta importante para o entendimento das diferenças e
similaridades funcionais entre organismos. Estudos realizados in silico com as proteínas RadA de Halobacterium
salinarum e Rad51 de Saccharomyces cerevisiae mostraram grande similaridade estrutural e conservação espacial de
resíduos de aminoácidos essenciais para a atividade de Rad51 no sistema de reparo de DNA. Estes estudos sugerem a
possibilidade de complementação funcional em leveduras deficientes em RAD51p pela expressão de RadAp. Com o
objetivo de avaliar esta hipótese, os genes radA e rad51 foram amplificados por PCR utilizando-se iniciadores desenhados
a partir de seqüências disponíveis no GeneBank e clonados em vetores de expressão em leveduras (pYES). Leveduras
mutantes em rad51 ou rad52, bem como selvagens para estes dois genes, foram transformadas com os plasmídios: pYES,
pYES-radA e pYES-rad51. As leveduras transformadas tiveram suas marcas de auxotrofias verificadas. Os clones
selecionados para os ensaios de complementação estão sendo seqüenciados para a confirmação de ausência de mutações
nos genes. O próximo passo será avaliar a capacidade de complementação funcional in vivo, utilizando ensaios de
sobrevivência das leveduras transformadas ao Metilmetanosusulfonato (MMS), um agente mutagênico cujas lesões
são reparadas principalmente por reparo por recombinação homóloga. A capacidade das leveduras de reparar os danos
ao DNA e sobreviver à exposição ao MMS será um indicativo de que RadA é capaz de complementar funcionalmente
Rad51 no reparo por recombinação homóloga.
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Identificação e análise estrutural
do gene da levedura Dekkera Bruxellensis
ortólogo a família dos genes que codificam
a enzima piruvato descarboxilase
em Saccharomyces cerevisiae
Torres, RRNB1; Liberal, AT1; Balbino, VQ1; Carazzolle, MF; Pereira, GAG, Morais Jr, MA1
1
Departamento de Genética, UFPE
Departamento de Genética, Unicamp
[email protected]
2
Palavras-chave: Fermentação Alcoólica, Saccharomyces cerevisiae, Dekkera bruxellensis, Piruvato Descarboxilase, YDR380w/ARO10
Na produção industrial de álcool, o fermento torna-se totalmente vulnerável à contaminação microbiana que acompanha
a matéria-prima, acarretando reduções significativas na eficiência industrial. A Espécie Dekkera bruxellensis tem sido
associada a contaminações nas indústrias de vinho, cerveja e na produção de álcool combustível causando queda no
rendimento fermentativo e na qualidade do produto. Recentemente, iniciamos a análise do genoma desta levedura
com vistas a identificar genes importantes do metabolismo central e genes relacionados com a adaptação células ao
ambiente industrial. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo identificar genes que codifiquem a enzima
piruvato descarboxilase, o ponto chave do metabolismo fermentativo da glucose pela descarboxilação de piruvato a
acetaldeído. Os gene PDC1, PDC5, PDC6, ARO 10 e THI3, de S. cerevisiae e seus ortólogos em diferentes ascomicetos
selecionadas dos bancos de dados Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/), GENOLEVRES
(http://cbi.labri.fr/Genolevures/) e NCBI foram utilizados para a busca de genes homólogos no banco de dados
Dekkera bruxellensis (http://www.lge.ibi.unicamp.br/dekkera/) usando as ferramentas do BLAST, com limite de e-value
-20 ou menor.. Os resultados revelaram que os dois contigs, 3332 e 2774, de D. bruxellensis, encontrados a partir do
alinhamento tBLASTn de seqüências de aminoácidos do gene PDC1 de S. cerevisiae, foram muito semelhantes ao gene
YDR380w/ARO10. Para corroborar os resultados, uma árvore filogenética foi construída a partir das seqüências obtidas
mostrando que o contig 3332 tem relação mais próxima com ARO10 de D. hansenni e o contig 2774 é mais próximo
de A. gossypii. Todas as seqüências do gene ARO10 das espécies S. cerevisiae, D. bruxellensis e Ascomicetes ficaram
agrupas em um grupo distinto. A árvore filogenética obtida neste trabalho se assemelhou com a árvore de topologia
2 quando comparado com o trabalho de Woolfit et al (2007), indicando que o gene ARO10 de D. bruxellensis seguiu
com o mesmo padrão evolutivo do genoma. Análises comparativas entre os contigs e as seqüências de aminoácidos dos
genes PDC1, PDC5, PDC6, THI3, ARO10 de S. cerevisiae mostraram um percentual de aminoácidos conservados de
apenas 11%, entretanto 31,7% das variações apresentaram semelhanças químicas entre os aminoácidos divergentes.
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Construção de vetores para expressão
do hormônio de crescimento da carpa
Hypophthalmichthys molitrix na levedura
Pichia pastoris
Monteiro, ARS¹; Vicente, EJ¹; Astolfi-Filho, S²
Instituto de Ciências Biomédicas, Programa de Pós-graduação Interunidades em Biotecnologia, Universidade de São Paulo
2
Divisão de Biotecnologia, Centro de Apoio Multidisciplinar, Universidade Federal do Amazonas
1
Palavras-chave: aqüicultura, expressão heteróloga, hormônio de crescimento, Hypophthalmichthys molitrix, Pichia pastoris
A demanda por produtos da aqüicultura vem crescendo rapidamente, sendo economicamente interessante a aplicação
de técnicas modernas de biotecnologia visando o aumento desta fonte de proteína. Neste contexto, já é sabido que a
introdução da proteína GH (hormônio de crescimento) ao alimento dos peixes resulta num efeito significante em termos
de aumento na taxa de crescimento e produção de massa protéica (PITKANEN et al., 1999; PITKANEN et al., 2001).
O objetivo deste trabalho é obtenção de leveduras recombinantes com capacidade de produção de GH, visando sua à
aplicação futura como suplemento de ração para crescimento de peixes. Neste sentido, num trabalho anteriormente
realizado pelo nosso grupo (PEDRAÇA, 2000), o c-DNA codificador de GH de Hypophthalmichthys molitrix foi
clonado no plasmídio pCGH1. Neste trabalho, o c-DNA codificador do GH de H. molitrix foi amplificado por PCR,
empregando-se o plasmídio pCGH1 como DNA molde. Este fragmento de DNA foi inserido nos plasmídios pHILD2
(de expressão) e pPIC9K (de expressão e excreção) da levedura Pichia pastoris, gerando os plasmídios pHILGH e pPICGH.
O sucesso das construções dos plasmídios recombinantes foi confirmado por seqüenciamento. Foram selecionados
dois clones de transformantes de levedura obtidos com o plasmídio recombinante pPICGH, capazes de crescer em até
4mg/ml de G418, indicando a ocorrência de, no mínimo, 7 cópias do plasmídio recombinante integradas no genoma
da levedura. A inserção do GH no cromossomo da levedura foi confirmada por reação de PCR, utilizando-se DNA
genômico como molde. Na próxima etapa deste trabalho, será analisada a expressão de GH pelos clones recombinantes
de levedura.
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Expressão dos genes YNR1, YNI1, YNT1
e YNA1, associados ao metabolismo do
nitrato na levedura Dekkera bruxellensis
através de qPCR
Pita, WB; Liberal, ATS; Alecrim, FM; Morais JR., MA
Laboratório de Genética de Microorganismos, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
Palavras-chave: Metabolismo do Nitrato, Dekkera bruxellensis, qPCR
A levedura Dekkera bruxellensis está sendo continuamente identificada como principal contaminante dos sistemas de
fermentação alcoólica no Brasil e em diversos outros países. Contagens elevadas desta levedura nestes processos podem
resultar em diminuição da produção de etanol e conseqüente prejuízo econômico. Recentemente, esta levedura teve
seu genoma parcialmente seqüenciado e foram identificadas seqüências correspondentes a genes do metabolismo do
nitrato. A presença de tais genes indica que D. bruxellensis possa usufruir deste composto como fonte de nitrogênio,
ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, durante o processo fermentativo. Como estas duas leveduras competem no
ambiente industrial, a presença de nitrato poderia ser um fator diferencial na adaptação de D. bruxellensis. Entretanto,
isto depende da regulação da expressão dos genes desta via metabólica durante o processo fermentativo. A qPCR
(PCR quantitativa) é uma técnica bastante sensível, capaz de determinar a variação dos níveis de expressão gênica em
diversas condições. Os genes do metabolismo do nitrato em Dekkera bruxellensis foram avaliados quanto à sua expressão
em dois diferentes meios: um contendo amônia (YNB) e o outro contendo amônia e nitrato como fontes de nitrogênio.
A fonte de carbono em ambos foi a glicose. As células foram cultivadas nestes meios e coletadas quando as culturas
atingiram o valor de DO660nm igual a 1 (um), representando células no meio da fase exponencial de crescimento. Nesta
fase, o RNA foi extraído e utilizado para a síntese de cDNA, o qual foi analisado pela técnica de qPCR. Os primers foram
desenhados a partir das seqüências dos genes YNR1 (Nitrato Redutase), YNI1 (Nitrito Redutase), YNT1 (Permease)
e YNA1 (Fator de transcrição), de D. bruxellensis, disponíveis no banco de dados do NCBI. O método utilizado para
análise da expressão gênica foi o 2-∆∆Ct e o gene escolhido como controle endógeno foi o EFB1, codificador da cadeia
beta do fator de alongamento de tradução. Os experimentos foram realizados com repetição. Todos os quatro genes
estudados apresentaram indução de sua expressão na presença de nitrato. Em comparação com o meio sem esta fonte,
a expressão do gene YNR1 foi 5,17 vezes maior. O gene YNI1 apresentou uma indução de 3,91 vezes. O gene YNT1
mostrou uma expressão aumentada em 2,15 vezes e o YNA1 demonstrou apenas uma leve indução de 1,33 vezes.
Este estudo comprova que os genes da assimilação do nitrato em Dekkera bruxellensis são induzidos em presença deste
composto. Entretanto, maiores estudos acerca da expressão destes genes em outros meios e no caldo de cana ainda são
necessários para correlacionar esta indução com a adaptação de D. bruxellensis no meio de fermentação alcoólica.
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Contribuição linhagem-específica dos genes
YCF1 e PMR1 para a desintoxicação de Cd2+
em S. cerevisiae
Mielniczki-Pereira, AA1; Hahn, AB1; Bonatto, D2; Henriques, JAP1,2,3
PPPBCM – Centro de Biotecnologia – UFRGS – Porto Alegre/RS
2
Instituto de Biotecnologia – UCS – Caxias do Sul/RS
3
Departamento de Biofísica – UFRGS – Porto Alegre/RS
[email protected]
1
Palavras-chave: PMR1, YCF1, Cadmium, Sacharomyces cerevisiae
Cádmio (Cd2+) é um contaminante ambiental carcinogênico, cuja toxicidade está associada à indução de estresse oxidativo
e inibição do reparo de DNA por erro no emparelhamento de bases. Em S. cerevisiae a desintoxicação de Cd2+ tem
sido associada principalmente à atividade da proteína Ycf1 – uma ATPase vacuolar homóloga à MRP1 de humanos,
que transporta complexos Cd.[GS]2 do citosol para o vacúolo. Além disso, resultados obtidos em nosso laboratório
demonstram que a desintoxicação deste metal também pode ser mediada pela proteína Pmr1p – um transportador de
Ca2+ localizado no complexo de Golgi. O objetivo deste trabalho foi comparar a contribuição e/ou interação dos genes
YCF1 e PMR1 na tolerância à Cd2+ em duas linhagens de S. cerevisiae com diferentes backgrounds genéticos. Neste
sentido, foram realizados testes de sensibilidade à Cd2+ nos mutantes ycf1Δ, pmr1Δ e ycf1Δpmr1Δ derivados de linhagens
selvagens distintas (W303 e BY4741). A construção dos duplos mutantes foi feita via interrupção do gene YCF1 nas
linhagens pmr1Δ derivadas da W303 e BY4741, pelo método de disrupção gênica mediada por PCR e recombinação
homóloga. Todas as linhagens foram expostas a diferentes concentrações de Cd2+ (entre 20 e 400µM) em tratamento
crônico (crescimento em placas com Cd2+) e agudo (análise de sobrevivência após 4 h de exposição). Os resultados obtidos
demonstram que no background da selvagem BY4741, as células ycf1Δ são as mais sensíveis à Cd2+, enquanto que as
células pmr1Δ apresentam uma leve resistência a este metal. Neste mesmo background, o duplo mutante pmr1Δycf1Δ
apresentou fenótipo similar ao simples mutante ycf1Δ. Nos mutantes derivados da selvagem W303, a maior sensibilidade
à Cd2+ foi observada nas células pmr1Δ. Surpreendentemente, neste background, a linhagem ycf1Δ não foi sensível a
nenhuma das concentrações de Cd2+ testadas, apresentando fenótipo idêntico ao das células selvagens. Por outro lado, o
duplo mutante pmr1Δycf1Δ mostrou-se tão sensível à Cd2+ quanto o simples mutante pmr1Δ. Estes resultados confirmam
que em S. cerevisiae ambos os genes, YCF1 e PMR1, podem contribuir para a tolerância a Cd2+. Entretanto, fica claro
que a contribuição relativa de cada gene é linhagem-específica. O aumento da resistência à Cd2+ observado na linhagem
pmr1Δ derivada da BY4741, pode ser resultado da indução de expressão de Ycf1p. Ao passo que a sensibilidade similar
observada nos mutantes pmr1Δ e pmr1Δycf1Δ derivados da W303 pode indicar que a proteína Ycf1 não está atuando
na desintoxicação de Cd2+ nesta linhagem ou que sua atuação é ineficiente na ausência de Pmr1p.
Apoio Financeiro: CNPq, PROCAD – CAPES, Genotox/Instituto Royal.
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Study of the Saccharomyces cerevisiae
Kin3 protein in DNA damage response
Moura, DJ1; Canhedo, A2; Immich, B1; Castilhos, B1; Henriques, JA1,3; Lenz, G1; Saffi J1,3
Departamento de Biofísica/Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
2
Laboratório de Cardiologia Molecular e Celular, Instituto de Cardiologia de Porto Alegre
3
Laboratório de Genética Toxicológica, Universidade Luterana do Brasil
[email protected]
1
Keywords: Cell cycle, DNA damage, Kin3p, Saccharomyces cerevisiae
The serine/threonine protein kinase Kin3 is a NIMA-related kinase found in budding yeast S. cerevisiae, sharing
approximately 55-60% similarity with NIMA (never in mitosis A), which is a mitotic regulator in Aspergillus nidulans
with a pivotal role in controlling G2-M transition. NIMA-related kinases have been identified in several species based
on sequence similarity to the catalytic domain of NIMA, and have different functions like mitosis, cell cycle control
and DNA damage response. The KIN3 gene was identified in 1990 and neither its deletion nor it’s over expression
resulted in a phenotype, suggesting that KIN3 is not essential for yeast. However, the exact role of Kin3 has not
yet been determined and this protein remained somewhat enigmatic. Since the majority of cell cycle regulators are
conserved throughout the eukaryotic kingdom, the aim of this work was to evaluate the role of Kin3 in S. cerevisiae
by sensitivity assays against mutagenic agents and evaluation of cell cycle profile. The results showed that in a general
manner, kin3∆ showed pronounced sensitivity to several genotoxic agents used in this study, when compared to WT
strain in stationary phase of growth. So interesting, the forward mutation rate was not significant different between
the two strains in the same conditions. Wild-type cells and kin3∆, under normal conditions undergo normal cell cycle
progress. However, after genotoxic exposure to the alkylating agents nitrogen mustard and methyl metano sulfonate,
as well as to cisplatin and doxorubicin, WT cells progressed markedly slower through G2-M. While kin3∆ reaches
a new cycle in 120 minutes (retuning to G1 phase), WT cells had their cell cycle delayed and reached the G1 phase
again after 150-180 minutes, suggesting that this mutant is not proficient in sensing DNA damage, thus not triggering
the DNA damage checkpoint pathways. Therefore, KIN3 seems to be important for sensing DNA lesions generated
by different mutagens, allowing the repair or regulating the progression of cell cycle. As this gene is not essential to
cells, the data obtained in this work suggest that KIN3 seems to be necessary in a stressing environment, like under
genotoxic challenge. Future investigation might contribute to further elucidate the Kin3p role in checkpoint pathways
and as DNA damage sensor in S. cerevisiae.
Apoio Financeiro: CNPq e Capes.
233
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Bioinformatics analysis determined for
design primers to the mitochondrial genome
of the yeast Dekkera bruxellensis
Alecrim, FM1; Batista, MVA1; Cardoso, MV1; Costa Júnior, CRL1; Cunha, WL1; Figueirêdo Júnior, CAS1; Lima, TLD1;
Oliveira, APA1; Pereira, L1; Pita, WB1; Tenório, KER1; Balbino, VQ1; Pereira, GA2; Morais Junior, MA1
Departamento de Genética, UFPE
Departamento de Genética, Unicamp
[email protected]
1
2
Keywords: Dekkera bruxellensis, mitochondrial genome, bioinformatics
The yeast Dekkera bruxellensis, also known as Brettanomyces bruxellensis, is the major cause of distilleries spoilage
worldwide, provoking the reduction of the productivity of ethanol and, consequently, causing damages in the industry
that use sugar cane broth in the Northeast region of Brazil. Despite of this importance, few genetic studies are published
in scientific literature. The recent works of our group show that this yeast presents a great adaptability to the industrial
process and we propose wide genomic analysis to identify the responsible factors for this characteristic. In the present
work, we initiate the comparative analysis in silico of the mitochondrial genome of all ascomicota yeast sequenced
and deposited in the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). With this, the construction of a physical map of the
mitochondrial genome of this clade was possible. Six species presenting nuclear genomic similarity with D. bruxellensis
had been submitted to the alignments through the computational program Mega v. 4.0 (http://www.megasoftware.
net).The genetic order was defined as L-rRNA COII COIII S-rRNA COI ATPase 8 ATPase 6 Cyt b 9 ATPase 9 Var
1, based in the genome of Saccharomyces cereviseae. The program CODEHOP (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/
blocks/codehop.html) and Codon Usage was used with the objective to refine the design of degenerated primers in
order to amplify D. bruxellensis ortholougous genes. The alignments had shown representative for construction of
primers, a time that had a good conservation between the nearly genetic sequences of the structural genes previously
cited. These dates provide resource to further analyses of the population genetics and evolution of D. bruxellensis and
of the genetic bases of its physiological capabilities
Supported by: CNPq, Programa de Pós-graduação em Genética - UFPE.
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Construção e expressão de uma formulação
vacinal inédita contra tumores cervicais
induzidos pelo HPV-16
Porchia, BFMM1; Diniz, MO1;Farinha-Arcieri, LE2;Ventura, AM2; Ferreira, LCS2
Interunidades em Biotecnologia, USP, São Paulo, Brasil
Departamento de Microbiologia, USP, São Paulo, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: glicoproteina D, E7, HPV-16, vacinas, câncer cervical
O câncer cervical é a segunda maior causa de morte entre as mulheres no mundo e resulta da infecção persistente com
tipos de alto risco do papilomavírus humano (HPV), particularmente o HPV-16. O desenvolvimento de vacinas baseadas
nas oncoproteínas E6 e E7 representa uma oportunidade de conter lesões pré-existentes e tumores malignos associados
ao HPV-16 através da geração de resposta imune celular. Neste trabalho exploramos uma estratégia vacinal inédita
contra tumores cervicais induzidos pelo HPV-16 que consiste em uma forma recombinante da proteína E7 do HPV-16.
Esta proteína foi fusionada geneticamente com a glicoproteína D (gD) do vírus herpes simples tipo 1 (HSV-1), que
apresenta propriedades adjuvantes endógenas, particularmente para células T CD8+. A competição pelo receptor HVEM
(Herpes virus entry mediator) com o BTLA (B and T lymphocyte attenuator), um agente inibitório de respostas
imune, sugere o papel adjuvante da proteína gD. O gene híbrido que codifica para a proteína E7 fusionada à gD foi
clonado e expresso em dois sistemas distintos: em vetor bacteriano (pET28a) utilizando a linhagem BL21 (DE3) de
E. coli e em vetor baculoviral, utilizando células de inseto Spodoptera frugiperda 9 (Sf9). As proteínas recombinantes
foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna niquelada. A proteína produzida em células bacterianas se
mostrou insolúvel e foi purificada após desnaturação com 8M de uréia. Por outro lado, a proteína expressa em células
Sf9 foi obtida na forma solúvel acumulada no citoplasma dessas células e foi possível detecta-la também, em menores
concentrações, no sobrenadante da cultura. Diferentes condições de cultivo e indução foram avaliadas em relação à
produção da proteína híbrida nas formas solúvel ou insolúvel para os dois sistemas. O rendimento final das proteínas
recombinantes variou entre 0.3g/L a 0.5g/L para E. coli, e entre 0.06g/L e 0.08g/L para as células Sf9. A obtenção das
proteínas híbridas recombinantes permite que abordagens vacinais voltadas para o controle de tumores associados ao
HPV-16 e infecções pelo HSV possam ser realizadas.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Human papillomaviruses E6 oncoprotein in
human cells mitochondria
Zulczewski, V1*; Palumbo, ACM1Ŧ; Aires, KA2; Bazan, SB2; Ho, PL2; Boccardo, E3; Villa, LL3; Armbruster-Moraes, E1;
Cianciarullo, AM1
1
Laboratory of Genetics and
Laboratory of Molecular Biotechnology, Biotechnology Center, Butantan Institute
3
Laboratory of Virology, Ludwig Institute for Cancer Research, São Paulo, Brazil
[email protected]
2
Keywords: HPV, E6, Oncoprotein, Anogenital Cancer, Mitochondria
Anogenital cancer is attributed to high-risk Human Papillomaviruses (HPVs), mainly HPV16 and HPV18. The HPV
genomes persist as episomal molecules in HPV-preneoplastic lesions or/and integrated into the host cell genome in
chromosomes and mitochondrial DNA. There are three proteins encoded by high-risk HPVs, E6, E7 and E5 which
control the cell cycle and proliferation. The E6 oncoprotein encoded by the virus is a small polypeptide with about 150
amino acids and two zinc-finger motifs, whose integrity is essential for E6 function. Like other viral oncoproteins, E6 is
multifunctional presenting numerous cellular targets, however, it is not clear if all these activities are related to the cellular
malignancy or, perhaps, some of them are acting in the disruption of the cellular antiviral response. In this study we
evaluate the distribution in transformed and non-transformed mammalian cells of: E6 and E7 oncoproteins, mitochondria,
transferrin receptors (TfR), transferrin (Tf ) and ferritin (Fe) for the iron endocytic pathway mediated by clathrin in
human and animal cells, as alternative pathway for HPV infection. HPV-negative cell lines (CHO, BHK-21, 293T)
were transfected with the pLXSN vectors, containing the complete sequence of E6 and E7 genes (kindly given up by
Dr. Denise Galloway from Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, USA), using GeneJuice® Transfection
Reagent (EMD Biosciences/Merck). Cells transformed by HPV (HeLa, SiHa and CaSki) were used as positive controls.
Primary antibodies against TfR, Tf and Fe (Dako), E6 and E7 (Oncogene/Zymed) and secondary antibodies (anti-IgGs)
conjugated with AlexaFluor® Dyes (Molecular Probes) were applied in immunofluorescence assays and analyzed by
laser scanning confocal microscope LSM Zeiss 510 Meta. Western blotting method is being used as control of proteins
expression. Ultrastructural immunocytochemical assays are being performed using Zeiss EM 109 Transmission Electron
Microscope. The antibodies recognize the E6 and E7 oncoproteins in HeLa and SiHa, in the cytoplasm and nucleus,
and in pLXSN vectors transfected cells CHO and 293T, only in the cytoplasm. TfR were detected in abundance at
the plasma membrane of cells, as well as the Fe was intensely labeled in the cytoplasm, nucleus and mitochondria. Colocalizations of E6 into mitochondria were detected in HeLa, SiHa and CaSki HPV transformed cells. The great amount
of iron suggests a participation of this element in the HPV cells transformation, keeping the mitochondrial cytochrome
c levels. The co-localization of E6 into mitochondria also suggests be relating to the intracellular iron metabolism
involving the oncogenetic process of cellular transformation associated with the events of apoptosis inhibition.
*Post-Graduation Program Interunits in Biotechnology USP-IBU-IPT.
CNPq Fellowship.
Ŧ
Supported by: FAPESP, Butantan Institute, Butantan Foundation and Ludwig Institute.
26o REGEM - 2008.
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Estudo in vitro sobre a interação celular de
papilomavírus humano em leucócitos do
sangue periférico
Szulczewski, V1, Palumbo, ACM1♦, Leão, E2, Borelli, P3, Beçak, W1, Müller, M4, Armbruster-Moraes, E1, Cianciarullo, AM1
Laboratório de Genética, Instituto Butantan
2
ELSME, Hospital São Joaquim
3
Departamento de Análises Clínicas, Instituto de Química-USP, São Paulo, Brasil
4
Tumorvirus-Specific Vaccination Strategies Group, German Cancer Research Center - DKFZ, Heidelberg, Alemanha
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Leucócitos, HPV, VLP, L1, Câncer anogenital
Diversos tipos de câncer são geralmente atribuídos a mutações gênicas e fatores ambientais. No caso do câncer anogenital,
o papilomavírus humano (HPV) aparece como o principal agente etiológico da doença, sendo este semelhante em muitos
aspectos ao papilomavírus bovino (BPV). Ao redor de 120 tipos já foram totalmente caracterizados, sendo o HPV16 e o
HPV18 os vírus oncogênicos responsáveis por aproximadamente 70% de todos os cânceres cervicais. O câncer cervical
causado pelo HPV atinge em torno de 500 mil mulheres por ano no mundo, levando ao óbito a metade delas. Estudos
recentes evidenciaram que além da transmissão sexual do HPV, há outras formas de contágio, entretanto, a dificuldade na
obtenção de quantidades viáveis do tipo selvagem ou mutante do HPV tem limitado em muito os estudos de diversos aspectos
da biologia do papilomavírus. Este estudo visa investigar a possibilidade de o HPV infectar células leucocitárias do sangue
periférico humano, como parece ocorrer com BPV. Com base nesta proposta, induzimos a expressão das proteínas heterólogas
recombinantes L1 e L2 em culturas de células epiteliais humanas da linhagem 293T, através do sistema de transfecção transiente,
utilizando o vetor pUF3L1h construído sob a regulação do promotor de citomegalovírus humano [1]. Desenvolvemos o
método de separação dos leucócitos a partir de amostras de sangue coletadas com heparina sódica [2]. As contagens totais e
diferenciais foram realizadas em câmara de Neubauer e esfregaços corados com Rosenfeld. A viabilidade celular foi analisada
com Violeta de genciana, Azul de tripan, Rhodamina 123, Iodeto de propídio e DiOC6(3), sendo os fluorocromos analisados
em microscópio confocal a laser. Confirmamos a expressão de L1 por Western-blot e microscopia eletrônica de transmissão. As
células expressaram intracelularmente as proteínas recombinantes L1 e VLPs. Nos ensaios de interação das VLPs produzidas
neste estudo e as células leucocitárias do sangue de mulheres voluntárias sadias, tanto as proteínas do capsídeo L1 quanto
as VLPs estruturadas interagiram com leucócitos, através da internalização das partículas, comprovados por ensaios de
imunofluorescência analisados em microscópio confocal a laser. Estamos produzindo VLPs constituídas pela proteína L1 de
HPV16 para investigar os mecanismos pelos quais as infecções virais tornam as células tumorais. Desenvolvemos um método
simples, rápido, de baixo custo e eficiente, para a separação dos leucócitos, com preservação da morfologia e viabilidade celular,
adaptado às necessidades de nossas pesquisas. A possibilidade de o HPV infectar células leucocitárias do sangue periférico,
como parece ocorrer com BPV, pode aumentar significativamente a presença de partículas virais no organismo e torna o
contato com sangue contaminado uma via de propagação da doença, atualmente não considerada, agravando ainda mais esta
séria questão de saúde pública. Novos estudos estão sendo realizados para determinar os mecanismos envolvidos nas possíveis
interações entre VLPs e leucócitos do sangue periférico humano.
Mestranda - Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP-IBU-IPT.

Bolsista do PIBIC-CNPq.
♦
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Suporte Financeiro: ATV-DKFZ, FAPESP, Fundação Butantan e Instituto Butantan.
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Estudo “piloto” sobre prevalência de tipos
de HPV e interação com co-fatores
em Ouro Preto, MG
Lima, AA¹; Miranda, PM²; Pitol, BCV¹; Moran, M¹; Felix, PM²; Giovanni, DNS²; Campos, SRC²; Carneiro, C¹; Lima Filho,
JL3; Stocco, RC²; Beçak, W2, 4
¹Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, MG
²Laboratório de Genética, Instituto Butantan, São Paulo, SP
³Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco, PE
4
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE
[email protected]
Palavras-chave: Papilomavírus, HPV, Pteridium aquilinum, Co-fatores
Os papilomavírus humanos (HPV) possuem um genoma constituído por uma molécula de DNA, dupla fita, com
aproximadamente 7,9 Kb, com cerca de 100 genótipos diferentes, sub-classificados em alto e baixo risco, de acordo
com sua associação com progressão celular maligna. Estudos prévios demonstraram a presença de genomas de HPV em
vários tipos de câncer: cervix uterina, pele, conjuntiva, trato respiratório superior. Vários fatores ambientais de risco têm
sido sugeridos, como tabagismo, etilismo, poluentes ambientais. Recentemente alguns dados foram obtidos referentes
a compostos da samambaia (Pteridium aquilinum), constante na dieta de algumas populações, como em Ouro Preto,
MG e no Japão relacionando-o ao desenvolvimento de tumores. O objetivo deste projeto é investigar as relações entre
a infecção pelo HPV, o desenvolvimento do câncer cervical e co-fatores ambientais, com especial enfoque à samambaia
Pteridium aquilinum. Desenvolvemos estudo piloto em Ouro Preto, Minas Gerais, analisando pacientes recebidas em
rotina pelos Postos de Saúde do Município para controle ginecológico. Submetidas a anamneses, as pacientes tiveram
material biológico colhido (cervical e sangue periférico), para detecção de presença de seqüências de DNA viral e
tipagem, análise de polimorfismo do gene p53 no códon 72 e tipificação viral. Das 77 pacientes analisadas: 76,62%
(59) foram verificadas como consumidoras do broto, 42,86% (33) apresentaram polimorfismo para o códon 72 do
gene p53 e 3,9% (3) foram verificadas como portadoras de HPV, sendo os tipos verificados 53, 57, 66 e 83. As análises
citológicas correspondentes indicaram que uma das pacientes HPV positiva apresenta ASC-US e é consumidora do
co-fator. As demais são não consumidoras e negativas em seus exames citológicos. Os dados obtidos corroboram as
hipóteses de que as prevalências virais podem variar conforme as regiões e seus costumes, e que estudos populacionais
devem ser desenvolvidos previamente à abordagens vacinais, comparando estudos de prevalência populacional a estudos
de prevalência em lesões neoplásicas.
Apoio financeiro: CNPq, FACEPE/PRONEX, FAPESP.
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Prevalência dos papilomavírus humanos 31
e 33 em lesões cervicais de mulheres
de Recife
Chagas, BS1,2; Silva, MFPTB1,2; Guimarães, RL2; Brandão, LA2; Beçak, W1,3;
Stocco, RC3; Guimarães, VB2; Crovella, S1,2; Freitas, AC1,2,3
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
Setor de Biologia Molecular, LIKA, Universidade Federal de Pernambuco
3
Laboratório de Genética, Instituto Butantan
[email protected], [email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer cervical, genotipagem, papilomavírus, PCR, vacinas profiláticas
Evidências experimentais apontam uma estreita relação entre a infecção com alguns tipos específicos de papilomavírus
humano (HPV) e a etiologia do câncer cervical, tido como a segunda maior causa de morte entre as mulheres no mundo.
Os tipos virais 16, 18, 31 e 33 são considerados HPVs de alto risco, e os principais causadores de carcinoma cervical.
Estudos indicam que o HPV 16 é o mais prevalente em todas as regiões do Brasil, no entanto, diferente de outros países,
o HPV 18 apresenta diferenças entre as regiões brasileiras, sendo mais prevalente no Norte, Sudeste e Sul. Na região
Central e Nordeste os HPVs 31 e 33 são discutidos como sendo o segundo mais prevalentes. No intuito de aumentar
o conhecimento relativo à prevalência dos HPVs 18, 31 e 33 e o processo de vacinação na região Nordeste do Brasil,
este trabalho pretendeu avaliar a prevalência destes tipos na cidade do Recife, associando com os tipos de lesões. As
amostras foram cedidas pelo Hospital Materno Infantil de Pernambuco (IMIP), a partir de mulheres que estavam em
tratamento de rotina. Um total de 224 amostras foram submetidas à PCRs para detecção viral com primers genéricos. Para
tipificação viral foram utilizadas somente as amostras positivas, utilizando primers específicos para o HPVs 16, 18, 31 e 33.
Os dados obtidos demonstraram que a população de Recife apresenta uma prevalência maior do HPV 31 (12,50%),
seguido pelo HPV 33 (5,80%) quando comparado com o HPV 18 (2,23%). Também foi possível observar uma
porcentagem elevada de infecção conjunta HPV16/31 (5,78%) e HPV 16/33 (4,73%). As vacinas profiláticas bi
(16 e 18) e quadrivalente (6, 11, 16 e 18) disponíveis no mercado são altamente eficazes na prevenção de infecção
tipo-específica, porém deixam de fora pelo menos 13 outros papilomavírus oncogênicos responsáveis por quase 30%
de todos os casos de câncer cervical. Além disso, se a co-infecção confere algum benefício tipo-específico mútuo de
sobrevivência, a eliminação de um tipo de HPV poderia ter um efeito benéfico inesperado na história natural de outros.
As vacinas disponíveis não correspondem aos tipos mais incidentes na população recifense, o que pode fazer com que a
vacinação atual possa aumentar a incidência de tipos menos comuns, em conseqüência da redução dos tipos utilizados
na vacina. Apesar de haver proteção vacinal contra alguns tipos virais, nada se pode dizer da eficácia contra os HPVs
31 e 33. Assim, variações regionais na distribuição de determinados tipos de HPV devem ser levadas em consideração
na criação e comercialização de vacinas.
Apoio Financeiro: CNPq, UFPE-PROPESQ, Programa de Pós-Graduação em Genética.
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Genótipos de papilomavírus humano (HPV)
associados a neoplasias intraepiteliais
cervicais (NICS) em Alagoas
Nascimento, VX; Neto, ER; Castro, KCB; Orsi, AR; Barros, EMLR; Morais, VMS; Machado, RRS; Silva, DW
Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Setor de Microbiologia, Universidade Federal de Alagoas
[email protected]
Palavras-chave: Papilomavírus humano, PCR, Neoplasia intraepitelial cervical, HPV, Bioinformática
A infecção cervical pelo Papilomavírus humano (HPV), representa a doença sexualmente transmissível (DST) de
etiologia viral mais frequente no mundo, a qual pode induzir a formação de tumores epiteliais e de mucosa, benignos
ou malignos. O HPV genital é considerado um fator de risco para o estabelecimento de lesões precursoras de carcinoma
cervical, um problema de saúde pública no Brasil, onde estimativas do INCA (Instituto Nacional do Câncer) revelam
que mais de 18.000 novos casos de câncer de colo de útero devam ocorrer em 2008. Objetivou-se, com este estudo
descritivo, avaliar a distribuição dos genótipos de HPV associados a diferentes graus de neoplasias intraepiteliais cervicais
(NIC) em Alagoas. Foram avaliadas 25 mulheres HPV positivas atendidas em clínicas ginecológicas e unidades de
saúde portadoras de lesões neoplásicas, sendo 20 de baixo grau (NIC I) e 5 de alto grau (3 NIC II e 2 NIC III). Os
esfregaços cervicais foram coletados e um fragmento de 450pb da região L1 do genoma viral foi amplificado por PCR
e clivado com endonucleases de restrição para a determinação do tipo viral (RFLP/PCR). As sequências nucleotídicas
de 11 amostras, cujos genótipos não puderam ser determinados pelos métodos convencionais, foram analisadas em
sequenciador automático MegaBace500 e comparadas com sequências homólogas disponíveis no GenBank utilizando o
algoritmo BLASTn, visando a identificação do tipo viral. Em 9 dos 20 casos de NIC I estavam presentes HPVs de baixo
risco (HPV 6), e em outros 9 casos foram diagnosticados HPVs de alto rico (HPV 16, 31, 52, 58, 62, 66 e LVX 100).
Em apenas 2 casos o tipo viral continuou indeterminado. Nas 3 mulheres portadoras NIC II, todos os HPVs encontrados
foram de alto risco (variantes de HPV 16 e HPV 58), e nos 2 casos de NIC III foram identificados variantes de HPV
16. Os resultados obtidos nesta pesquisa constatam a exequibilidade da utilização de ferramentas de Bioinformática
no diagnóstico do vírus e constatam a presença de HPVs de alto risco oncogênico associados a lesões de baixo grau,
reforçando a importância da inclusão da genotipagem viral em programas de prevenção do câncer do colo do útero.
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Estudos citogenéticos em linfócitos periféricos
de bovinos afetados por papiloamatose de
fazenda do Estado de Pernambuco
Melo, TC1; Diniz, N1; Beçak, W1,2; Rieger, TT1; Stocco, RC2
Laboratório de Genética e Citogenética Animal (Depto. de Genética, UFPE)
2
Laboratório de Genética, Instituto Butantan, Brazil
[email protected]
1
Palavras-chave: Bos taurus, Papilomavirus Bovino, Alteração cromossômicas
O Papilomavírus Bovino (BPV) é um papilomavírus representado por 10 subtipos virais, que podem ser epiteliotrópicos
ou mucosotrópicos. A ancoragem do genoma do BPV aos cromossomos do hospedeiro se dá de forma epissomal na
célula, mediada pela oncoproteína viral E2, e este mecanismo assegura sua segregação entre as células filhas de modo
eqüitativo durante a mitose. Este trabalho teve como objetivo estudo citogenético em animais afetados por papilomatose.
Foram coletadas amostras de sangue periférico de bovinos da espécie Bos taurus, e realizadas culturas de linfócitos. O
sangue foi inoculado em Meio Cariótipo (Cultilab) e as culturas, mantidas a 37 °C por 72 horas, sendo acrescido 0,1 mL
de colchicina na última hora deste período. As culturas foram hipotonizadas em solução 0,075M KCL pré-aquecidas
(37 °C), e fixadas três vezes em trocas sucessivas de fixador (metanol 3: ácido acético 1). As lâminas foram analisadas
por coloração convencional (solução de azul de metileno, segundo WRIGHT (5% em tampão de fosfato; pH 6,8) e
bandamento C. Todas as amostras foram tipificadas para a presença ou ausência de BPV, utilizando a técnica de reação
em cadeia da polimerase (PCR) com primers específicos de detecção. Uma amostra de 50 bovinos infectados pelo BPV
foi avaliada citogeneticamente, após confirmação molecular da presença do vírus. Foram analisadas 50 a 100 células/
indivíduo. As alterações cromossômicas identificadas neste trabalho foram: Associação Cêntrica, Fragmento Acêntrico,
Células Aneuplóides,Associação Telomérica, Fissão, Cromossomo Dicêntrico, Trocas entre Cromátides e Cromossomo
Tricêntrico. Este detalhamento dos tipos de aberrações pode permitir a correlação destes dados citogenéticos com
informações gênicas, o que pode ser importante à compreensão do ciclo viral na célula hospedeira.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP, FACEPE, Fundação Butantan.
241
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Papilomavírus bovino: interação víruscromatina hospedeira em linfócitos
periféricos e em células cultivadas de
lesões papilomatosas cutâneas
Carvalho, RF1,2; Campos, SRC1; Caetano, HVA1,2; Lima, AA1,3; Ferraz, OP1; Giovanni, DNS1;
Félix, PM1; Dagli, MLZ2; Birgel Jr, EH4; Beçak, W1,5; Stocco, RC1
Laboratório de Genética, Instituto Butantan, São Paulo, SP
2
Departamento de Patologia, FMVZ-USP, São Paulo, SP
3
Escola de Farmácia, UFOP, Ouro Preto, MG
4
Departamento de Clínica Médica, FMVZ-USP, São Paulo, SP
5
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE
1
Palavras-chave: Papilomavírus, BPV, Cultivo Celular, Latência Viral, Atividade Gênica
O Papilomavirus é um vírus oncogênico de DNA, descrito como tecido específico, dermotrópico. Entretanto, seqüências
virais têm sido descritas em outros tecidos, como, por exemplo, em sangue periférico. A descrição de aberrações
cromossômicas estruturais em linfócitos de bovinos infectados pelo papilomavirus bovino levou à proposição de que
as seqüências virais pudessem estar ativas e não ser apenas restos de células apoptóticas. No intuito de avaliar a ação
das seqüências de DNA viral em linfócitos periféricos, buscamos comparar os tipos de aberrações cromossômicas
verificáveis nos linfócitos periféricos e em células cultivadas de lesões papilomatosas dos mesmos animais estudados.
Fragmentos de lesões (verrugas) e amostras de sangue periférico foram coletadas de bovinos afetados. Todas as amostras
foram avaliadas quanto à presença de genomas virais por PCR usando “primers” genéricos e tipificados por digestão
enzimática. Fragmentos de lesões foram incubados em meio DMEM (Cultilab), suplementado com 10% soro fetal
bovino e mantidas a 37° C, em atmosfera de 5% de CO2. Amostras de sangue foram incubadas em meio RPMI 1640,
suplementadas com 20% soro fetal e 2% de fitohemaglutinina, mantida a 72 horas a 37° C. Em ambos os procedimentos,
colchicina (16ug/mL) foi adicionada por 1 h, o material foi centrifugado, seguindo-se a hipotonização (KCl 0.075 M)
e fixação (metanol: ácido acético, 3:1). As lâminas foram coradas em Giemsa 3% em tampão fosfato, pH 6.8. As
amostras foram identificadas como positivas em relação a BPV 1, 2 e 4. A aberração cromossômica mais relevante e
freqüente observada foi a presença de marcadores metacêntricos e submetacêntricos. Tais resultados são comparáveis aos
achados em células de linhagens estabelecidas, transformadas por oncogenes virais e submetidas à ação de co-fatores.
A similaridade entre os achados entre diferentes células corrobora a hipótese de que as seqüências virais estão ativas
em ambos os sistemas.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP, Fundação Butantan.
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Identificação da presença do papilomavirus
bovino em sêmen comercial congelado
de touros (Bos taurus)
Lira, RC1; Silva, MAR1; Chagas, BS1; Pontes, NE1; Stocco, RC2; Beçak, W4; Santos, JF1; Freitas, AC1,2,3
Lab. Genética de Microrganismo, Dep. Genética, Universidade Federal de Pernambuco
2
Lab. Genética – Instituto Butantan
3
Setor de Biologia Molecular do Lika,
4
Professor/Pesquisador visitante CNPQ – Lab. Genética de Microrganismo, UFPE
[email protected], [email protected]
1
Palavras chave: Papilomavírus bovino, PCR, Sêmen
Os papilomavírus (PV) são vírus de DNA dupla fita que infectam o epitélio escamoso da pele e mucosa. O papilomavírus
bovino (BPV) apresenta 10 diferentes tipos (BPV-1 a 10) e causam graves doenças em rebanhos de corte ou leiteiro,
gerando grandes perdas econômicas aos criadores. A presença de BPV já foi detectada em tecidos reprodutivos e fluídos
corporais, tais como sangue periférico, plasma sanguíneo, oócitos, ovário, útero, células do cúmulus, fluídos uterinos,
sêmen e espermatozóide, placenta e líquido amniótico. O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de BPV, através
da técnica PCR, em sêmen congelado de touros (Bos taurus). Para isso, foram utilizados primers de detecção geral para
PV (MY09/11 e FAP59/64) e específicos para os tipos de BPV-1 a 6. Os primers para os BPV 1, 2 e 4 já se encontram
descritos na literatura, tendo sido realizado o desenho e a validação in silico de primers para os BPV 3, 5 e 6, a partir de
seqüências do gene L1 depositadas no National Center for Biotechnology Information (NCBI). Após a obtenção dos
primers, foi realizada a padronização das condições de PCR e o ajuste da temperatura de anelamento para as reações.
Em cada reação foram utilizados clones em plasmídio dos BPV 1-6 como controle positivo, bem como para a realização
de testes cruzados para certificação da especificidade de cada primer. Os primers para os BPV 1, 2, 4 e 5 mostraram-se
específicos para cada tipo viral. No entanto, os primers para BPV 6 amplificaram os tipos virais 3 e 6, de maneira que e
a diferenciação entre estes foi realizada através de sequenciamento. Foi detectada a presença de DNA de BPV em 100%
das amostras de sêmen analisadas. O tipo viral mais freqüente foi o BPV-2 em 100% das amostras analisadas, seguido
por BPV6 em 17% das amostras e BPV- 4 presente em 6,9% das amostras avaliadas. Houve detecção simultânea de
mais um tipo de BPV em 17% das amostras de sêmen analisadas. Estes resultados demonstram a importância do estudo
e de um melhor detalhamento da relação entre BPV e sêmen. Dada a grande utilização, a inseminação artificial com
sêmen contaminado com BPV pode ter importância similar à via sexual para a dispersão viral entre o rebanho.
Apoio Financeiro: CNPq/RENORBIO, PROPESQ/UFPE, Programa de Pós Graduação em Genética - UFPE.
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Identificação de diferentes tipos de
papilomavírus bovino presentes em lesões
cutâneas de gado afetado por papilomatose
Carvalho, C. C. R1,2;Pontes, N. E.1,2;Monteiro, V. L. C.3; Coelho, M. C. O. C.3;
Beçak, W.1,2,4; Stocco dos Santos, R. C.4; Rieger. T. T1,2; Freitas, A. C1,2,4,5
1
Laboratório de Genética Animal, Departamento de Genética - UFPE
Laboratório de Genética de Microorganismos, Departamento de Genética - UFPE
3
Faculdade de Medicina Veterinária – UFRPE
4
Laboratório de Genética, Instituto Butantan
5
Setor de Biologia Molecular, LIKA – UFPE
[email protected]
2
Palavras-chave: Papilomavírus, PCR, Lesões, Epiteliotrópico, BPV
Os papilomavírus constituem um grupo de pequenos vírus de DNA de dupla fita caracterizados por induzirem a
formação de verrugas ou papilomas numa grande variedade de organismos, incluindo o homem. Estas lesões são em
geral benignas, podendo regredir naturalmente ou se transformar em tumores malignos. Os papilomavírus que infectam
naturalmente animais, em especial mamíferos, têm sido estudados como agentes da doença em animais e como modelos
de estudo para infecções humanas. Dentre estes papilomavírus se encontra o papilomavírus bovino (BPV). No gado, a
infecção pelo (BPV) é caracterizada pela presença de lesões que ocorrem na pele, mucosa e em alguns órgãos. Embora o
BPV seja um vírus epiteliotrópico, nosso grupo mostrou evidências da presença de BPV em células do sangue periférico,
placenta, gametas e fluídos corpóreos de bovinos, sendo sugerida a transmissão vertical dos BPVs 1 e 2. Até o momento
são bem caracterizados seis diferentes tipos de BPVs (BPVs de 1-6) e recentemente outros quatro novos tipos (BPVs
7, 8, 9 e 10) tiveram seu genoma seqüenciado. O objetivo deste trabalho foi avaliar por meio de PCR tipo específica
a presença dos BPVs tipos 1-6 em animais afetados por papilomatose cutânea. Os resultados obtidos em PCRs de
detecção e tipificação viral, em lesões cutâneas, demonstraram a presença de pelo menos um dos tipos de BPV 1-6
em 97,2% do total de amostras. O tipo mais freqüente foi o BPV 2. A presença simultânea foi verificada em 88.99%,
geralmente envolvendo os tipos BPV2 e BPV3. Estes resultados confirmam a presença de diferentes tipos de BPVs no
gado afetado por papilomatose cutânea e sugere que o BPV-2 seja o mais freqüente.
Apoio financeiro: RENORBIO/CNPq.
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Establishment and evaluation of degenerate
and type-specific primers for detection and
typing of bovine papillomavirus (BPV)
Batista, MVA1; Alecrim, FM1; Cardoso, MV1; Costa-Júnior, CRL1; Cunha, WL1; Figueirêdo-Júnior, CAS1; Lima, TLD1;
Oliveira, APA1; Tenório, KER1; Freitas, AC2,3; Balbino, VQ1
Laboratório de Genética Molecular Humana, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brasil
2
Laboratório de Genética de Microrganismos, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brasil
3
Setor de Biologia Molecular, LIKA-UFPE
[email protected]
1
Keywords: Bovine papillomavirus, L1 gene, Bioinformatics, Primers, Papillomaviridae
Papillomavirus forms a highly diverse and strict specific group of virus that infects mammals, birds and reptiles. The
evolution of papillomavirus is relatively slow when compared with the RNA viruses, once its genome consists of a molecule
of double strand DNA that is faithful replicated by the host cell’s DNA replication machinery. Bovine papillomavirus
(BPV) is distributed worldwide and it is recognized as an etiological agent associated with many forms of tumors.
In opposition to the great diversity of human papillomavirus (HPVs), in which there had already been recognized
at least 130 different types, only ten BPV types had been identified so far, based on the similarities of the nucleotide
sequences of L1 gene of its genomes. In HPVs, conserved regions in this gene have been used in the definition of
broad-spectrum primers objecting the detection and typing of BPVs. However, it has been observed that these primers
present limitations in the capacity of detection of some BPV types. Thus, a study aiming at finding conserved regions in
L1 gene of the ten BPV types is fundamental for the establishment of new sets of primers, efficient in the detection of
these viral types. This work consisted on the analysis of BPV L1 gene sequences that has complete genomes sequenced
and deposited in public data bases, with the objective to find conserved regions that can be used for the establishment
of degenerate and type-specific primers. The sequences of BPV L1 had been obtained in the data base of the National
Center will be Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov), from which local data bases had
been established containing basic aspects of the sequences (size, function and composition), through the program
BioEdit v. 7.0.9 (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html). Later on, the sequences were processed and aligned
using an incorporated version of the program ClustalW (http://www.clustal.org). CODEHOP (http://bioinformatics.
weizmann.ac.il/blocks/codehop.html) and Codon Usage (http://www.bioinformatics.org/sms2/codon_usage.html)
programs were used as complementary tools in the recognition of the most favorable regions for the establishment of
the primers. The employed methodology allowed the identification of the regions that presented the highest levels of
conservation (high similarity and reduced number of transition and transversion events, and absence of insertions and/
or deletions), resulting in the attainment of degenerate and also type-specific primers that are already being validated
experimentally and incorporated in the laboratorial routine. Primers produced in this work presents criteria of specificity
and sensitivity superior to those described in the literature, resulting in the increment of the capacity of identification
of the viral types circulating in Brazil.
Financial support: FACEPE, CNPq e Programa de Pós Graduação em Genética/UFPE.
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BPV (Papilomavírus bovino): Estudos
integrados sobre a interação vírus
–cromatina hospedeira em Fazenda Leiteira
no Estado de Pernambuco
Diniz, N1; Melo, TC1; Campos, SRC2; Rieger,TT1; Beçak, W1,2; Stocco, RC2
Laboratório de Genética e Citogenética Animal (Depto. de Genética, UFPE)
2
Laboratório de Genética, Instituto Butantan, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Papilomavírus bovino, sangue periférico, culturas temporárias de sangue periférico, ação viral, cromatina hospedeira
O Papilomavírus (PV) é um dos grupos virais mais relevantes pelos efeitos patológicos que causam. Mais especificamente
em gado, o papilomavírus bovino (BPV) acomete o animal com a indução do aparecimento de verrugas (lesões
benignas), câncer de bexiga e do trato digestório (lesões malignas).As lesões benignas podem freqüentemente regridir
espontaneamente. Entretanto, as lesões podem persistir e progredir para tumores malignos, quando associadas a
co-fatores. Esses vírus são considerados tecido específico (tecido epitelial: revestimento e mucosas), porém existem
evidências de sua presença em placenta, gametas e fluídos corpóreos de bovinos, além das células sanguíneas. Não
existem dados relativos à prevalência de tipos de BPV em Pernambuco, assim como na maioria dos estados do país. O
presente trabalho tem como objetivo detectar a presença de seqüências do genoma de BPV no sangue de animais de
uma fazenda leiteira, estabelecida no Município de Ribeirão (PE), comparando com as culturas temporárias de linfócitos
de sangue periférico, derivadas das mesmas amostras. Foram coletadas amostras de sangue periférico de 50 animais
afetados por papilomatose: estas amostras foram utilizadas para extração de DNA e culturas temporárias de linfócitos
de sangue periférico. As amostras de DNA foram submetidas a PCR com “primers” genéricos (FAP 59/64), assim como
as culturas. Tem sido reportada a detecção de aberrações cromossômicas em cultura de linfócitos do sangue periférico
de animais infectados e/ou afetados por papilomatose, sendo indicadas como evidência da presença do BPV nessas
células. Os resultados deste trabalho também demonstram a presença de infecção em sangue de animais apresentando
aumento da taxa de aberrações cromossômicas nas células analisadas obtidas de culturas temporárias de linfócitos de
sangue periférico. A presença de BPV no sangue dos animais é uma preocupação constante, devido à utilização do
sangue periférico como meio de disseminação desse vírus.
Apoio: CNPq, RENORBIO,FAPESP.
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Construção e avaliação de um vetor gênico
para imunização genética com o gene L2 do
papilomavírus bovino tipo 1 e 2
Jesus, ALS1,2; Souza, HM1,2; Mariz, FC1,2; Cordeiro, MN1,2; Lira, RC1,2; Castro, CMMB3; Stocco, RC4; Beçak, W1,4; Freitas, AC1,2
Laboratório de Genética de Microorganismos, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
2
Setor de Biologia Molecular, LIKA, Universidade Federal de Pernambuco
3
Setor de Microbiologia, LIKA, Universidade Federal de Pernambuco
4
Laboratório de Genética, Instituto Butantan
[email protected]
1
Palavras-chave: BPV, Papilomavírus Bovino, gene L2, vacina de DNA, transfecção
Os papilomavirus são conhecidos por causarem lesões tumorais, geralmente benignas, em tecidos epiteliais de diversos
organismos, que podem sob condições adequadas progredirem para o câncer. O papilomavírus bovino (BPV) tem
sido amplamente caracterizado tanto por ser considerado um modelo experimental para o estudo do papilomavírus
humano (HPV), quanto por sua grande importância na bovinocultura. Os diversos estudos realizados com modelos
animais comprovam claramente que as vacinas de DNA são instrumentos bastante eficazes no controle de infecções
virais proporcionando uma forte resposta imune celular e humoral. Vacinação com a proteína L2 dos papilomavírus
humano tem se mostrar capaz de induzir anticorpos neutralizantes que protegem contra infecções de tipos homólogos,
além de reação cruzada contra um variado número de HPVs genitais. Neste trabalho, nos propomos a desenvolver
um vetor gênico para imunização genética usando o gene L2 de BPV-1 e BPV-2. O gene L2 foi amplificado por PCR
a partir do genoma completo de BPV-1 e BPV-2 clonado em vetor pAT153. Os produtos gerados por PCR foram
clonados no vetor pGEM-T Easy (Promega), e posteriormente subclonados no vetor de expressão pCI-neo (Promega)
por digestão com enzimas de restrição. Então, o plasmídeo recombinante foi transformado em E. coli DH5alfa. Os clones
recombinantes foram analisadas quanto à presença dos insertos por meio de digestão enzimática, PCR e sequenciamento,
gerando as construções pCIL2B1neo e pCIL2B2neo. As construções moleculares foram produzidas em larga escala e
submetidas a transfecção de células de macrófago de rato utilizando o reagente TransFastTM (Promega). Foram obtidos
macrófagos através de lavados broncoalveolares de ratos e usados para cada transfecção 2x106 células/mL e 2,5 μg do
vetor gênico. Após 48 horas da transfecção, a expressão do gene L2 de BPV-1 e -2 foi detectada através de RT-PCR.As
construções serão agora avaliadas quanto a sua imunogenicidade, em modelo experimental murino, visando o futuro
estabelecimento de uma estratégia vacinal aplicada a bovinos.
Apoio financeiro: CNPq e Renorbio.
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Construção do vetor de expressão
pPICZAαL1B2 para a produção da proteína
L1 do papilomavírus bovino tipo 2 Em
células da levedura Pichia pastoris
Cordeiro, MN1,2; Jesus, ALS1,2; Mariz, FC1,2; Carvalho, JC1,2; Beçak, W2,3; Stocco, RC3; Freitas, AC1,2
Setor de Biologia Molecular, Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami, UFPE
Laboratório de Genética de Microrganismos, Departamento de Genética, UFPE
3
Laboratório de Genética, Instituto Butantan, São Paulo, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: papilomavírus, vetor de expressão, proteína L1, VLP, Pichia pastoris
Os papilomavírus constituem um grupo de pequenos vírus de DNA de dupla fita caracterizados por induzirem a formação
de lesões que são em geral benignas, podendo regredir naturalmente ou se transformar em tumores malignos. Para a espécie
humana, os papilomavírus estão intensamente relacionados a doenças sexualmente transmitidas (DST), sendo os tipos
conhecidos como papilomavírus humano (HPV) importantes causadores de câncer cervical. O papilomavírus bovino
(BPV), por sua vez, representa um importante problema econômico do ponto de vista pecuário. Na região Nordeste,
em especial no Estado de Pernambuco (região da Zona da Mata), a incidência de papilomatose bovina é muito alta
provocando grandes perdas econômicas para os criadores. No momento não há tratamento com eficácia comprovada.
A proteção contra infecção é conferida por anticorpos neutralizantes direcionados contra epítopos conformacionais
da proteína estrutural L1 do capsídeo viral. Estes anticorpos podem ser eficientemente induzidos por imunização
com virus-like particles (VLP), que se formam espontaneamente após a expressão de L1 em sistemas heterólogos. Nos
últimos anos, a levedura metilotrófica Pichia pastoris emergiu como um sistema heterólogo, eficiente e de baixo custo
para a produção de altos níveis de proteínas. O foco deste trabalho foi construir o plasmídeo pPICZAαL1B2, um vetor
para expressão do gene L1 do BPV-2 em células de P. pastoris, cuja característica diferencial em relação a outros vetores
de expressão é inserir um sinal de secreção à proteína recombinante. O gene L1 foi amplificado por PCR a partir do
genoma completo de BPV-2, clonado no vetor de passagem pGEM-T (Promega), e, posteriormente, subclonado no
vetor de expressão, pPICZAα (Invitrogen). Análises de PCR e restrição puderam indicar a correta inserção do gene L1
no vetor de clonagem, permitindo uma seleção mais precisa do fragmento clonado. Por análise de PCR de colônias,
foram encontrados possíveis clones contendo a construção pPICZAαL1B2, os quais foram submetidos às análises de
restrição e seqüenciamento. Por eletroporação, as leveduras P. pastoris da linhagem X33 foram transformadas com a
construção pPICZAαL1B2, cuja integração do vetor ao genoma pôde ser indicada por PCR de colônias. Em análises
futuras, espera-se detectar a expressão da proteína L1 pelas leveduras transformadas, bem como purificá-la a partir do
meio de cultura, graças a sua secreção. A clonagem do gene L1 do BPV-2 no vetor de expressão pPICZAα abre caminho
para uma estratégia vacinal baseada em VLPs contra as papilomaviroses bovinas, além de modelo experimental para
estudos em relação ao HPV.
Apoio: CNPq.
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Expressão do gene L1 de BPV-2 em células
de levedura Pichia pastoris: construção do
vetor de expressão pPICZAL1B2 e obtenção
de clones recombinantes
Mariz, FC1,2; Jesus, ALS1,2; Souza, HM.1,2;Campos, JF1,2; Coimbra, EC1,2; Cordeiro, MN1,2; Stocco, RC1,3; Beçak, W3; Freitas, AC1,2
Laboratório de Genética de Microrganismos, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami,Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil
3
Laboratório de Genética, Instituto Butantan, São Paulo, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: BPV-2, Pichia pastoris, VLPs, papilomavírus, proteína L1
Os papilomavírus constituem um grupo de pequenos vírus caracterizados por infectarem o epitélio cutâneo e mucoso,
induzindo a formação de lesões hiperproliferativas benignas em humanos e animais. Estas lesões podem regredir
naturalmente ou, sob condições ambientais apropriadas, progredir até tumores malignos. O papilomavírus bovino
(BPV) está associado com papilomatoses e câncer em bovinos, problemas de saúde significativos com importantes
conseqüências econômicas. Até o momento são bem caracterizados 6 tipos de BPV (BPV de 1-6) e recentemente
quatro novos tipos (BPVs 7 a 10) foram descritos. As infecções por papilomavírus induzem uma resposta imune tipoespecífica essencialmente dirigida contra a proteína L1, que compõe 90% da estrutura capsidial do vírus. Nos últimos
anos, a levedura metilotrófica Pichia pastoris emergiu como um sistema heterólogo eficiente e de baixo custo para a
produção de altos níveis de proteínas. Considerando-se que a proteína L1 tem a capacidade de adquirir a conformação
estrutural de partículas semelhantes ao vírus (VLPs), nosso grupo verificou que a levedura P. pastoris pode expressar
proteínas de HPV. Neste trabalho realizou-se a construção do vetor pPICZAL1B2 e posterior transformação em
células de levedura P. pastoris, visando à obtenção da proteína L1 de BPV-2 e conseqüente produção de VLPs como
estratégia vacinal para o controle das papilomatoses de gado. Para isso, o gene L1 foi amplificado por PCR a partir
do genoma completo de BPV-2, utilizando-se primers específicos contendo sítios para enzimas de restrição presentes
no vetor de expressão pPICZA (Invitrogen). Após clonagem inicial no vetor pGEM-T Easy (Promega), o gene L1 foi
subclonado no vetor de expressão pPICZA. Células competentes de Escherichia coli Top10 foram transformadas com
a construção pPICZAL1B2 e selecionadas em crescimento na presença de antibiótico para posterior extração de DNA
plasmidial através de kit comercial. A presença e a orientação do inserto no vetor de expressão foram analisadas por
PCR, digestão enzimática e sequenciamento. Em seguida, linearizou-se a construção por meio de digestão enzimática
para transformação da levedura Pichia pastoris X-33 por eletroporação. Os transformantes foram repicados em placas
YPDS com antibiótico e a integração do cassete de expressão foi confirmada mediante PCR de colônia. Os resultados
apresentados neste trabalho constituem um passo fundamental no estabelecimento de um sistema de expressão e
conseqüente produção de VLPs.
Apoio financeiro: CNPq.
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HPV 18 and 33 L1 gene expression
in Pichia pastoris yeast
Campos, JF1,2, Coimbra, EC1,2, Leitão, MCG2, D’arc, M1,2, Carvalho, JC1,2, Stocco, RC3, Beçak, W1, Freitas, AC1,2
Laboratório de Genética de Microrganismos, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil
3
Laboratório de Genética, Instituto Butantan, São Paulo, Brasil
[email protected]
1
2
Keywords: human papillomavirus, cervical cancer, Pichia expression system, prophylactic vaccine, virus-like particles
Papillomaviruses are a group of small non-enveloped DNA tumor viruses that infects various animals from birds to
mammals, including humans. Persistent infection with a “high-risk” subset of sexually transmitted HPVs may lead to
potentially precancerous lesions and can progress to invasive cancer, which in less developed countries are the leading
cause of female cancer mortality. The major capsid protein, L1, can assemble spontaneously into a structure that
closely resembles native virions (VLPs). Antibody responses elicited by VLPs immunization are quite specific for the
individual HPV type, with limited crossneutralisation even for closely related HPV types. Currently Merk and GSK
have vaccines on the market to combat 4 serotypes of HPV, unfortunately the cost (US$360.00) of these vaccines are
prohibitive towards general distribution to developing coutries. Furthermore, these vaccines do not include all oncogenic
types, leaving out at least 13 oncogenic papillomaviruses, responsible for almost 30% of all cases of cervical cancer.
The development of a recombinant system that can produce a VLPs vaccine at reduced cost and in larger volumes will
go a long way. Many of the limitations of the current production system might be overcome by the use of a different
system. The use of the methylotrophic yeast, Pichia pastoris, as a cellular host for the expression of recombinant proteins
has become increasing popular in recent times. This work aimed the expression of HPV 18 and 33 L1 gene in Pichia
pastoris yeast. Those genes were amplified and the PCR fragment was ligated to the pGEM-T cloning vector. After
digestion of the pGEML1H18 and pGEML1H33 plasmids with BstBI and XhoI, it was purified and ligated to the
corresponding sites of P. pastoris expression vector generating the pPICZL1H18 and pPICZL1H33 constructs, with
a histidine tail in the C-terminal region. The recombinant plasmids were linearized with SacI and used to transform
P. pastoris by electroporation. The transformed cells were grown in YPDS plates and colony PCR was performed to
confirm gene integration. After methanol induction, total RNA was extracted and the L1 transcripts were detected
by RT-PCR. A dot blot assay using anti-His antibody was performed and the expression of a protein with histidine
tag was verified, probably L1. A national production of HPV vaccines is expected to be more cost-effective in Brazil.
Furthermore, regional variation in the distribution of certain HPV types should be taken into account in the creation
of vaccines made to different geographic regions.
Financial support: CNPq, PROPESQ/UFPE, Pós Graduação em Genética/UFPE.
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Região 5’ não traduzida do vírus da
hepatite c (HCV): alvo em potencial para
diagnóstico e terapia molecular
Oliveira Filho, AB1,2; Maradei, C2; Pimenta, ASC2; Rojas, MFM2; Chagas, MCM2; Crespo, DM3; Crescente, JAB4; Lemos, JAR1,2
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA
Laboratório de Biologia Celular e Molecular, HEMOPA
3
Programa de Prevenção e Controle de Hepatites Virais, SESPA
4
Núcleo de Medicina Tropical, UFPA
[email protected]
1
2
O genoma do HCV mede aproximadamente 9,6Kb e contém única fase de leitura aberta (ORF). A ORF é flanqueada
pelas regiões não-traduzidas (UTR) 5’ e 3’, ambas altamente conservadas. A 5’ UTR mede 341nt de comprimento e
contêm 4 estruturas nucleotídicas em forma de alça que funcionam como sítios de ligação ribossomal para tradução do
RNA viral. Por causa da elevada taxa de similaridade entre seqüências nucleotídicas, a 5’ UTR é candidata em potencial
para utilização no diagnóstico molecular e desenvolvimento de terapias antivirais baseadas em ácidos nucléicos. O
objetivo deste trabalho foi determinar os sítios/fragmentos conservados e polimórficos da 5’ UTR do HCV circulante
em diferentes locais do mundo visando facilitar o desenho de iniciadores e sondas para diagnóstico molecular e
oferecer alvos em potencial para desenvolvimento de terapia molecular. Empregando a metodologia de Nested-PCR
e seqüenciamento nucleotídico foram obtidas 190 seqüências nucleotídicas da 5’ UTR de HCV circulante no Estado
do Pará, Brasil. A edição e o alinhamento das seqüências foram realizados utilizando os programas BioEdit e Clustal
W, respectivamente. Durante alinhamento foram adicionadas 105 seqüências oriundas de infectados dos Estados do
Acre e Amazonas (Brasil) e 628 seqüências oriundas de outras localidades do mundo (América, Europa, África, Ásia),
todas depositadas em bancos públicos de seqüências nucleotídicas (NCBI e Los Alamos). A partir do alinhamento de
923 seqüências nucleotídicas (referência: NC004102, Cepa H77, NCBI), sítios/fragmentos conservados e polimórficos
foram anotados. Inferências filogenéticas foram geradas empregando os programas Modeltest e PAUP*. Dos quatro
domínios localizados na 5’ UTR – domínio I (nts 5-20), domínio II (nts 44-118), domínio III (nts 134-329) e
domínio IV (nts 330-341) – somente o domínio IV e a porção final do domínio III (nts 283-329) não apresentaram
nenhum polimorfismo. Provavelmente, reflexo da antecessão do início da tradução da poliproteína viral. Entretanto,
o domínio III (nt 134-282) apresentou a maior taxa de distância genética (~0,2), sendo detectados SNPs e fragmentos
nucleotídeos capazes de diferenciar os genótipos 1, 2, 3 e 6 do HCV (nts: 175-189, 200-228, 248-255, 263-278). Os
domínios I e II e os fragmentos entre os domínios apresentam polimorfismos, entretanto inconsistente para distinção
genotípica do HCV. Em suma, este trabalho mostrou que a máxima similaridade entre seqüências do domínio IV e
a porção final do domínio III da 5’ UTR podem ser utilizada como alvo para diagnóstico molecular da hepatite C
e para terapias moleculares de desestabilização dos processos de replicação e de tradução do HCV. Por outro lado, o
restante do domínio III da 5’UTR mostrou ser o único capaz de diferenciar genótipos do HCV por seqüenciamento
nucleotídico ou PCR (convencional, PCR-RFLP e PCR em tempo real).
Apoio financeiro: SECTAM, FUNTEC, CNPq.
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Adequação da transformação do
Lycopersicon (tomate) com plasmídeos
recombinantes contendo o gene da proteína
não estrutural 1 do vírus dengue-2
Dias, ACF1; Versiani, AF1; Viana, PC1; Rocha, AS1; Balmant, KM1; Oliveira, MD1;
Coelho Jr., RJ1; Otoni, WC3; Barros, EG1; De Paula, SO1
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa,
Laboratório de Imunovirologia Molecular
2
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa,
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas(BioAgro)
3
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Departamento de Biologia Vegetal, Universidade Federal de Viçosa,
Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais II (BioAgro)
[email protected], [email protected]
1
Palavras-chave: dengue, diagnóstico, proteína NS1 recombinante
A dengue é causada por um arbovirus pertencente à família Flaviviridae, sendo de grande importância médica e para o
campo da Saúde Pública. Atualmente, a ocorrência global da dengue tem crescido drasticamente, sendo que uma das
principais formas de diagnóstico desta enfermidade depende da detecção de anticorpos específicos no soro de pacientes.
Apesar dos processos de diagnóstico da dengue estarem em profundo desenvolvimento e aperfeiçoamento, um empecilho
na realização destes testes reside na dificuldade de produção em grande escala de antígenos a serem usados na captura
do anticorpo presente no soro de pacientes infectados. Devido a este fator, temos como objetivo obter antígeno em
grande quantidade e qualidade utilizando um sistema de expressão heteróloga de proteínas em plantas. Para tanto, foi
construído um plasmídeo recombinante, pCAMB3301/NS1, que carrega o gene que codifica a proteína não-estrutural
NS1, e que será utilizado para transformação de plantas do tomate, via Agrobacterium. O plasmídeo em questão,
pCAMB3301/NS1, possui gene que confere resistência a fosfinotricina, um princípio ativo de herbicidas, utilizado para
seleção das plantas transformadas. Devido a isto, foi necessária a padronização da concentração inibitória do composto
fosfinotricina para seleção das plantas transformadas. Para a clonagem do gene da proteína NS1, foi extraído o RNA total
do sobrenadante de uma cultura de células infectadas com vírus dengue-2, e a partir deste foi confeccionado o cDNA.
O gene da proteína não estrutural (NS1) foi obtido através da Reações em Cadeia da Polimerase (PCR), separado por
eletroforese e purificado. Após purificação, o mesmo foi inserido em um vetor de clonagem e mantido em Escherichia
coli transformada. Deste estoque, foi obtido o gene da proteína NS1 e este foi inserido no vetor pCAMBIA 3301. Este
vetor recombinante foi utilizado para transformação de Agrobacterium tumefaciens, cujas colônias transformadas foram
analisadas, confirmando a presença do plasmídeo, e estocadas. A obtenção da concentração inibitória do composto
fosfinotricina foi obtida a partir da análise de regeneração de explantes de plantas do gênero Lycopersicon em meios
apropriados contendo diferentes concentrações de fosfinotricina. Essa concentração inibitória será utilizada para seleção
das plantas que expressam o gene da proteína NS1, durante a transformação do tomate por Agrobacterium contendo
plasmídeos pCAMB3301/NS1.
Apoio financeiro: PIBIC-CNPq/UFV.
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Ausência de viremia por dengue
em doadores de sangue de São Paulo
Rodrigues, CLL1; Foglietto, MA2; Laganaro, L2; Takaoka, D2; Silva, ICA2; Wendel, S2; Levi, JE1,2
Laboratório de Virologia, Instituto de Medicina Tropical, Faculdade de Medicina da USP
2
Centro de Imunologia e Imunogenética, Hospital Sírio Libanês
[email protected]
1
Palavras-chave: dengue, doadores de sangue, PCR em Tempo Real
O vírus da Dengue pertence à família Flaviviridae tem formato esférico, é composto por RNA de fita simples e
positiva. A dengue é uma doença transmitida ao homem pela picada da fêmea dos mosquitos infectados pertencentes à
espécie Aedes aegypti e é considerada endêmica principalmente em regiões tropicais e subtropicais em todo o mundo e,
predominantemente, em áreas urbanas e semi-urbanas. Recentemente tem havido um aumento na preocupação teórica
da transmissão transfusional da dengue. Já se sabe que existe um maior número de portadores assintomáticos do que
sintomáticos. Assim, os doadores de sangue podem conter o vírus da dengue sendo, portanto, passíveis à doação no
período de viremia. Segundo pesquisas realizadas na Fundação Pró-Sangue-São Paulo uma em cada mil bolsas de sangue tem o vírus da
dengue. Este estudo tem como objetivo investigar a presença do RNA viral entre doadores de sangue, durante o período
de surto do ano de 2008. Foram coletadas 23568 amostras (5321 pools) no Banco de Sangue do Hospital Sírio Libanês
em São Paulo/SP, no período de novembro 2007 a abril 2008. Alíquotas de 140 µL destas amostras foram empregadas
para a extração de RNA, empregando-se o kit Pure link TM Viral RNA/DNA (Invitrogen). A presença do RNA viral
foi testada através de uma reação de PCR em Tempo Real utilizando primers complementares a região não-codificante
3’UTR conforme descrito por LAI et al, 2007. Casos positivos foram definidos analisando-se o perfil da curva de
amplificação baseado no Ct (ciclo do limiar início da detecção de fluorescência), em que é possível visualizar uma
relação entre a quantidade de RNA e Ct. O perfil da curva de dissociação foi também analisado para assegurar que os
perfis de amplificação do fragmento específico deste vírus apresentavam curvas de dissociação com padrão específico
de temperatura de melting (TM). Em todas as reações foram adicionados controles positivos e negativos do vírus da
dengue. Em nenhuma amostra doada foi constatada a presença do RNA viral da dengue. A incidência da dengue foi
muito alta no Brasil durante o verão de 2008. Entretanto, na cidade de São Paulo, foram reportados apenas 5 casos,
mostrando que a ausência de doadores virais corrobora com a fraca epidemia no local de estudo. Embora não tenha
havido nenhum doador virêmico, considera-se importante continuar a pesquisa de dengue em doadores de sangue e
especialmente, em áreas endêmicas onde surtos já foram descritos, pois, apresentam um potencial risco de transmissão
transfusional da dengue.
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Padronização de um protocolo rápido, facil e
de baixo custo para o estudo da variabilidade
genética de dengue virus 2 por polimorfismo
conformacional de fita simples (SSCP)
Carvalho, KSS1; Reis, GLMR1; Lima Filho, EF1; Maciel, SS1; Silvestre, EA1; Soares, MJS1; Coelho, LFL1
Laboratório de Pesquisa em Microbiologia, Departamento de Parasitologia e Microbiologia, Universidade Federal do Piauí
[email protected]
1
Palavras-chave: variabilidade genética, dengue, SSCP
O Dengue virus (DV) é um vírus envelopado, RNA fita simples positiva pertencente à família Flaviviridae, gênero
Flavivirus. Até o presente momento foram descritos quatro diferentes sorotipos do DV: DV-1, DV-2, DV-3 e DV-4.
Estudos demonstram que determinadas mutações no genoma de DV estão relacionadas ao aumento da virulência das
amostras, pois estas mutações são capazes de influenciar diretamente a patogênese da doença e a taxa de infecção dos
hospedeiros vertebrados e invertebrados. A técnica de Polimorfismo conformacional de fita simples (SSCP -SingleStrand Conformation Polymorphism) é um método rápido para a identificação de mutações em fragmentos de DNA
amplificados por PCR. Neste estudo foram analisadas 49 amostras de DV-2 isoladas no Piauí durante a epidemia de
2007. A identificação do genoma viral foi realizada através da técnica de RT-PCR descrita por Lanciotti et al., 1998.
O fragmento correspondente à região C-pRM do genoma viral foi submetido a ensaios de SSCP. Resumidamente,
estes foram submetidos à desnaturação a 95ºC em tampão apropriado (0,05% azul de bromofenol, 95% formamida,
20mM EDTA, 10mM NaOH) por quinze minutos e posteriormente mantidos no gelo. As amostras foram submetidas
a uma eletroforese em gel de Poliacrilamida 10% contendo 1,5% de glicerol em tampão TBE 0,6X por 1 hora e
30 minutos sendo posteriormente o gel corado com Brometo de etídeo. As amostras analisadas apresentaram 15 perfis
diferentes de bandas. Os perfis 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 estão relacionados a casos de FD e os perfis 5, 12, 13, 14 e 15
somente a casos de FHD. Nossos resultados indicam que este protocolo de SSCP é de extrema importância, pois é
capaz de utilizar o fragmento obtido nos ensaios de RT-PCR para identificação dos sorotipos de DV à tecnologia de
SSCP, contribuindo assim para o estudo da diversidade genética do DV em situações epidêmicas. Estudos futuros serão
realizados com o objetivo de identificar estas mutações e o papel destas na patogênese da dengue.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPEPI e UFPI.
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Construção de um vírus vaccínia ankara
modificado (MVA) recombinante
expressando as proteínas e e ns1
do vírus dengue 3
Diniz, TC; Maia, MQ; Pinho, TMG; Kroon, EG; Fonseca, FG
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: Dengue, Poxviridae, MVA, CEFs, arbovirose
A dengue é hoje objeto da maior campanha de saúde pública do Brasil, encontrando-se presente nos 27 estados da
Federação. Visto que, as campanhas de combate ao vetor foram historicamente mal sucedidas, o desenvolvimento de
uma vacina antidengue, ainda não existente, torna-se a opção mais segura para o controle desta arbovirose urbana. Os
vírus MVA pertencentes à família Poxviridae, podem ser utilizados como um vetor poxviral vacinal antidengue possuindo
vantagens como: ser incapaz de se multiplicar em células de mamíferos, métodos de construção e manipulação genéticos
são relativamente simples, baseados principalmente no fenômeno de recombinação homóloga, seu genoma suporta a
inserção de enormes quantidades de DNA exógeno, proteínas produzidas são processadas e transportadas de maneira
idêntica ao que ocorre nas células de origem do gene estudado, dentre outras. Neste trabalho foram realizadas técnicas
de biologia molecular para a construção de uma vacina recombinante contra o sorotipo 3 de Dengue, sorotipo mais
prevalente no Brasil. Inicialmente foi realizada uma RT-PCR de uma amostra clínica positiva de DEN3, com o intuito
de amplificar a região do genoma que codifica a proteína E. A proteína E é a maior e a principal proteína do envelope
viral, sendo também o principal alvo de anticorpos neutralizantes o que revela o importante potencial que esta proteína
pode possuir na construção de uma vacina recombinante. Subseqüentemente, a região que codifica a proteína para
DEN 3 E foi inserida num plasmídeo de clonagem e seqüenciada, na etapa seguinte, DEN3 E foi introduzida num
plasmídeo de expressão. Células de fibroblasto de embrião de galinha (CEFs) foram preparadas para que ocorresse
infecção por MVA, que se multiplicam muito bem nestas células, e transfecção com o plasmídeo de expressão, afim de
que ocorresse a recombinação homóloga entre vírus e plasmídeo nas CEFs. Obteve-se então um vírus MVA recombinante
capaz de expressar a proteína E do sorotipo 3 de Dengue virus sendo este resultado analisado pela utilização da técnica
de western blot. Os resultados obtidos até agora sugerm que a implementação da tecnologia dos poxvírus no país, e
sua utlização na construção de vacinas recombinantes multivalentes torna este projeto relevante e inovador.
Apoio Financeiro: FAPEMIG e CNPq.
.
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Análise de regiões imunogênicas da
proteína de nucleocapsídeo do gênero
hantavirus utilizando ferramentas
de imunoinformática
Rigo, MM; Antunes, Da; Vieira, GF; Chies, JAB
Laboratório de Imunogenética (UFRGS)
[email protected]
Palavras-chave: hantavírus, imunogenicidade, bioinformática. nucleocapsídeo, conservação evolutiva
O sistema imune realiza um verdadeiro controle de qualidade da produção de proteínas endógenas através da rota de
apresentação de antígenos, que envolve as moléculas de MHC (Complexo Principal de Histocompatibilidade) de classe
I e os receptores dos linfócitos T (TCR) CD8+. Este é um mecanismo que objetiva a detecção de patologias celulares,
sobretudo, infecções virais, através da apresentação de pequenos peptídeos (de 8 a 12 aminoácidos de tamanho)
produzidos no interior das células. Uma grande questão na apresentação de antígenos é: como um epitopo tão pequeno,
oriundo de proteínas traduzidas a partir de genes com alta taxa de mutação, em meio à apresentação de tantos outros
peptídeos próprios, pode ser identificado como sendo de origem viral? A importância do contexto inflamatório deve ser
considerada, mas também a de que os epitopos virais possuam algum tipo de “padrão”, o qual facilitaria sua identificação.
Uma das principais evidências do compartilhamento de elementos entre epitopos virais é a reatividade cruzada, ou seja,
o reconhecimento de mais de um epitopo pela mesma célula T, o que leva ao desenvolvimento de resposta imune contra
elementos que não foram, necessariamente, os desencadeadores primeiros da resposta em questão. Com o objetivo de
compreender por que o sistema imune “escolhe” determinadas regiões de proteínas, comparamos as seqüências das proteínas
de nucleocapsídeo (NC) de 45 organismos do gênero hantavírus. Os organismos a serem estudados foram selecionados
dentre aqueles que continham proteínas similares com epitopos virais de hantavírus – Puumala (PUUV), Sin Nombre
(SNV) e Hantaan (HTNV) - já descritos na literatura, através da utilização da ferramenta BLASTp disponibilizada pelo
NCBI. A partir das seqüências das proteínas, realizamos o alinhamento no programa ClustalX e a visualização no programa
GeneDoc. Uma premissa para a correta geração de epitopos é a de que eles apresentem os requerimentos para a sua
digestão pelo proteassomo. Para as simulações de clivagem utilizamos o NetChop, um simulador de imunoproteassomo.
Os primeiros resultados demonstram que epitopos descritos na literatura da proteína NC de PUUV, SNV e HTNV
estão localizados em regiões altamente conservadas, (salientando-se as posições 90 a 240 e 320 a 400 do alinhamento)
comparado com outros trechos desta proteína de outros representantes do gênero Hantavírus. Estes são os primeiros
indícios de que o sistema imune selecionaria áreas preferenciais nas proteínas, não só por serem essas regiões mais
conservadas, mas também porque elas poderiam possibilitar a ocorrência de reatividade cruzada. Outra hipótese
desse favorecimento pode ser a de que a fim de evitar autoimunidade o sistema imune estaria selecionando seqüências
tipicamente virais, as quais apresentam baixa similaridade com proteínas do hospedeiro, facilitando a identificação do
invasor.
Apoio Financeiro: Capes e CNPq.
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Interações entre o genoma de hospedeiros
e dos vírus que os infectam: evidência
de adaptação do uso de códons em
famílias de vírus e sua relação com o uso
de códons em seus hospedeiros
Lobo, FP1; Mota, BE2; Macedo, AM1; Pena, SDJ1; Machado, CR1; Franco, GR1
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade Federal de Minas Gerais
2
Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Minas Gerais
1
Palavras-chave: genômica comparativa, uso de códons, interação vírus-hospedeiro
A redundância observada no código genético gera a existência de códons sinônimos. Esperar-se-ia que, na ausência
de pressões seletivas, a sua freqüência seria aproximadamente a mesma em um dado genoma. Entretanto, organismos
distintos usualmente utilizam preferencialmente um ou poucos códons sinônimos, fenômeno este conhecido como viés
no uso de códons. Atualmente, duas hipóteses são propostas para explicar este fenômeno: otimização da tradução e viés
genômico intrínseco (como um conteúdo elevado de GC, por exemplo). Vírus são caracterizados pela obrigatoriedade
da maquinaria da célula hospedeira para seu ciclo. Este fenômeno permite supor que estes organismos estariam sujeitos
ao viés de otimização de tradução observado em suas espécies hospedeiras, uma vez que vírus que sofram mutações
para os códons mais utilizados pela célula hospedeira seriam favorecidos por seleção natural. Genomas virais também
estão sujeitos a pelo menos dois vieses genômicos intrínsecos: diminuição do uso esperado de dinucleotídeos CpG
(viés causado pelo sistema imune); e diminuição na freqüência de citosinas (viés causado pela desaminação espontânea
gerando uracila). Para o nosso conhecimento, nenhum estudo que correlacionasse o uso de códons em vírus ao de seus
hospedeiros e/ou aos vieses genômicos já descritos para estes foi realizado em larga escala, o que nos levou a realizar
este estudo. Para este trabalho, seqüências genômicas de 132 espécies de vírus e seus 14 hospedeiros foram obtidas do
banco de dados RefSeq e, para cada uma destas, foi calculada a métrica “RSCU” (“Relative sinonimous codon usage”),
a qual é definida como a freqüência observada do códon “j” no genoma “x” dividida pela freqüência esperada do códon
“j”. Para a análise da correlação de uso de códons entre os diferentes organismos, o índice de correlação de Spearman
(ρ) foi calculado a partir da métrica RSCU e utilizado como medida de distância para o agrupamento hierárquico
dos organismos. Para a análise dos vieses intrínsecos do genoma dos vírus, as freqüências esperadas e observadas dos
códons contendo o dinucleotídeo CpG ou citosinas na terceira base foram calculadas e comparadas através de testes
qui-quadrado. Em todas as famílias de vírus analisadas observou-se ao menos um dos vieses esperados para os vírus,
em diversas intensidades. Análises de correlação positiva associaram os vieses genômicos observados ao tamanho do
genoma dos vírus, sugerindo que genomas maiores são mais sujeitos ao viés de diminuição do motivo CpG e de
desaminação de citosinas. Diversas espécies de vírus apresentaram uso de códons significativamente mais próximo ao
de seus hospedeiros do que ao de outros vírus filogeneticamente relacionados, o que sugere fortemente a hipótese de
otimização da tradução entre vírus e, assim, a interação entre o genoma destes e o de seus hospedeiros.
Apoio: FAPEMIG, CAPES, CNPq.
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Detection of recurrent series of allelic
substitutions under selection: IOP
Iamarino, A; Corsini, MAB; Zanotto, PMA
Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas. Universidade de São Paulo
[email protected]
Our immune system is responsible for protection against external organisms and toxic proteins (i.e., defense against non-self ).
It consists of a series of distinct processes, ranging from innate immunity to low (IgM) and high (IgG) specificity
antibodies. Immunity acquisition and maintenance is crucial to the effective resistance upon re-exposition to the same
or a serologically-related pathogen. On the other hand, pathogens can escape from the immune system by promptly
changing the amino acids residues in some of their proteins that are presented to the host immunity, by means of higher
mutation and substitution rates than those of the host. Ultimately, the immune escape is only made possible when
viral proteins have the capacity to change without loosing functionality or significant fitness reduction. Immuno-OPath (IOP) is a suite of PERL scripts that recovers recurrent series of allelic replacement over distinct lineages in viral
genealogies. It was envisaged to inform on the repertoire of observable substitutions. For example, a residue in a putative
escape mutant indicated by positive section pressure may be associated with a number of additional compensatory
mutations at distinct protein sites. Input datasets include viral protein coding sequences and their genealogy estimated
using maximum likelihood from the DNA data. The most parsimonious reconstructions of amino acid replacements
along the tree constitute the series of replacement substitutions. The series are then ranked by the number of times that
each replacement occurred in a codon. All tree branches presenting substitution series are compared. Recurrent series
(i.e., those that occurred independently in different branches) are then saved to a file containing their position in the
phylogenetic tree and the actual residues of each series. By ranking the recurrent substitution series by frequency and
searching for the series containing the largest number of replacements under positive selection we may spot residues
involved in putative immune escape replacements. The user can set the desired number of “immuno-paths” to be
included in the output using a set of classification methods. The IOP provides a useful tool to analyze viral proteins
not only for immune escape mutations, since replacements that provide drug resistance on HIV-1 protease and reverse
transcriptase enzymes usually called “primary mutations” can cause loss of function and reduce viral fitness. Additional
secondary mutations, not necessarily causing drug resistance, may restore enzyme activity, increasing fitness and causing
the potential spread of resistance under the absence of selection by anti-viral drugs.
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Detecção do vírus da pinta verde do
maracujazeiro (Passion fruit green spot
virus-PFGSV) através de RT-PCR
Antonioli-Luizon, R1,2; Freitas-Astúa, J2,3; Locali-Fabris, EC2; Machado, MA2 & Kitajima, EW1,4
Programa de Microbiologia Agrícola, ESALQ/USP – Piracicaba, SP
2
Centro APTA Citros Sylvio Moreira, IAC – Cordeirópolis, SP
3
EMBRAPA Mandioca e Fruticultura Tropical - Cruz das Almas, BA
4
NAP/MEPA, ESALQ/USP - Piracicaba, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: PFGSV, Diagnose, RT-PCR
O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá e essa produção destina-se tanto ao mercado de consumo in natura
como ao processamento para produção de suco concentrado. A cultura do maracujá tem sido afetada por um grande
número de pragas e de doenças, que exigem dedicação e esforços urgentes, no sentido de minimizar as perdas e evitar
sua disseminação. O vírus da pinta verde do maracujazeiro (Passion fruit green spot virus – PFGSV), transmitido pelo
ácaro Brevipalpus phoenicis, caracteriza-se por induzir a formação de pequenas manchas verdes em frutos maduros,
manchas verdes em folhas que se tornam cloróticas por senescência, e lesões necróticas em ramos. Quando a infecção é
precoce, as lesões das hastes coalescem, produzindo anelamento e morte da planta. Exames ao microscópio eletrônico
de transmissão revelam a presença de partículas baciliformes em cisternas do retículo endoplasmático e viroplasma
denso no citoplasma. Seu controle é essencialmente preventivo através do manejo químico do ácaro. Apesar de seu
relato inicial há 10 anos, em Vera Cruz, SP,, pouco se sabe sobre o PFGSV, sendo que não existe qualquer seqüência
genômica disponível em bancos de dados como o GenBank, não há estudos sobre a variabilidade do patógeno, e
tampouco métodos rápidos e confiáveis para a sua detecção. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver
um método fácil, rápido e confiável para diagnosticar a doença e apoiar os trabalhos de sua epidemiologia. Com base
na caracterização molecular parcial do PFGSV, foram desenhados primers específicos para parte do gene que codifica
a proteína de movimento putativa do vírus. RNAs de plantas de maracujá sadias e sintomáticas para pinta verde da
região de Limeira-SP foram utilizadas como moldes para a síntese de cDNA. Amplificações por PCR resultaram em
fragmentos únicos esperados de 245pb, apenas para as plantas com sintomas de pinta verde, evidenciando a utilidade
destes primers como uma ferramenta nova para a diagnose da doença.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq.
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Diversidade de vírus algais (Phycodnaviridae),
fagos e bactérias na represa de Guarapiranga,
São Paulo/S.P., Brasil
Gimenes, MV1; Freddi, AMM2; Marques, MV2; Garrafa, P1; Mehnert, DU1
Laboratório de Vírus Entéricos Humanos e Animais
2
Laboratório de Fisiologia de Microorganismos
Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências biomédicas, USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Diversidade, Vírus algais, Fagos, Bacérias, Guarapiranga
A história e funcionamento da vida na Terra têm sido guiados pela presença de microrganismos, uma vez que eles foram
e continuam sendo indispensáveis agentes na evolução climática, geológica, geoquímica e biológica do planeta. Por
muitos anos a existência e o papel da comunidade microbiológica, especialmente a comunidade viral (virioplâncton,)
em ambientes aquáticos, foi pouco estudada. Considerando a enorme importância dos vírus algais (Phycodnaviridae)
e fagos em processos como ciclagem de nutrientes, diversidade e distribuição de organismos hospedeiros (microalgas e
bactérias), terminação de florações algais e transferência lateral de genes, e a equivalente importância de bactérias em
processos de produção priimária e decomposição, o presente trabalho teve como objetivo a caracterização preliminar
das comunidades de vírus algais, fagos e bactérias presentes na represa de Guarapiranga em São Paulo. Esse foi um
primeiro passo em direção a um melhor entendimento das relações microbiológicas deste ambiente, o qual é responsável
pelo abastecimento de 3,7 milhões de pessoas da região metropolitana. Amostras de água coletadas na represa de
Guarapiranga em agosto de 2005 foram filtradas em membrana eletropositiva (Zeta Plus 60S), ultracentrifugadas
(100.000xg) e ressuspendidas em solução salina, perfazendo uma concentração viral de 8000 vezes. Após purificação com
Vertrel-XF®, as amostras foram analisadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e por técnicas moleculares
– PCR, DGGE (Degenerate Gradient Gel Electrophoresis), clonagem e sequenciamento. A grande diversidade de ambos
os grupos virais estudados foi constatada através de técnicas diferentes: DGGE para fagos e sequenciamento de clones
para vírus algais. Considerando os Phycodnavírus, fica evidente a predominância de um tipo de genoma dentre os 12
genomas encontrados (n= 34 clones), sendo que todas as sequências obtidas formam um grupo mais proximamente
relacionado entre sí do que com as seqüências depositadas no Gene Bank, que abrangem isolados desconhecidos de
Phycodnavirus, isolados de organismos não cultiváveis e vírus que infectam Emiliana huxlei e Micromonas pusilla. Para o
estudo das bactérias provindas da amostra, o material retido nos filtros utilizados na filtragem da água foi ressuspendido
em um volume menor do filtrado da represa para aumentar a concentração bacteriana. Diferentes concentrações dessa
suspensão foram espalhadas em placas com 4 diferentes meios de cultura: PYE para isolamento de bactérias heterotróficas
oligotróficas, Agar-nutriente para heterotróficas, BG-11 para cianobactérias e NFB para bactérias fixadoras de nitrogênio.
Para evitar contaminações por fungos, foi utilizado o antibiótico cicloheximida 100 μg/ml em todos os meios. Após
isolamento, os gêneros bacterianos foram identificados pelo método de seqüenciamento de um fragmento do DNA
ribossomal 16S, utilizando iniciadores nas posições 27 e 1401. Foi também realizado um teste de resistência aos metais
cádmio e níquel com diversas bactérias dos diferentes tipos de meio de cultura. Foram verificados vários isolados que
apresentaram diferentes graus de resistência.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP.
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Identificação e caracterização do vírus
que infecta a lagarta desfolhadora
do dendezeiro
Balmant, KM1; Tinôco, RS2; Serrao, JE1; De Paula, SO1; Coelho Júnior, RJ1; Dias, ACF1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
Departamento de Biologia Animal, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chaves: Dendezeiro, Opsiphanes, controle biológico, proteínas
O dendezeiro, conhecido cientificamente por Elaeis guineensis, Jacq., é uma monocotiledônea pertencente à família
Arecaceae. Originário da Costa Ocidental da África foi trazido, no século XVII, pelos escravos ao Brasil e adaptou-se
bem ao clima tropical úmido do litoral baiano. Foi cultivado inicialmente na Bahia e depois no Pará e outros Estados
da Amazônia, sendo o Pará, atualmente, o maior produtor de óleo de palma no Brasil e onde se concentram mais
de 80% da área plantada com dendezeiros. O principal produto do dendezeiro é o óleo extraído industrialmente da
polpa do fruto - óleo de palma internacionalmente conhecido como “palm oil”, cuja demanda vem crescendo de forma
acelerada e consistente há quase dez anos. Como qualquer monocultura, o aumento da área plantada proporciona sérios
problemas no equilíbrio biológico e o desenvolvimento de pragas, principalmente insetos desfolhadores como formigas,
lepidópteros e coleópteros, cujos danos geram grandes prejuízos e queda de produtividade. Dentre os desfolhadores
do dendê destacam-se os lepidópteros em especial o gênero Opsiphanes. Considerando-se que o ecossistema de uma
floresta homogênea é bastante frágil, e que o uso de inseticidas convencionais pode trazer sérios danos ao equilíbrio,
acredita-se que os produtos de baixo impacto ecológico, utilizados isoladamente e/ou em um programa de manejo
integrado de pragas possam ser de grande valia no controle de lagartas desfolhadoras. Por isso, as viroses de insetos têm
sido muito estudadas, devido ao interesse geral dessas patologias, e mais particularmente, por causa de seu potencial
ambientalmente favorável ao manejo de pragas. Lagartas do gênero Opsiphanes foram coletadas em plantações de dendê
no estado do Pará. Essas apresentavam sintomas como regurgitação, típico de infecção viral. Com o intuito de realizar
um controle biológico dessa lagarta foi feita uma etapa de identificação e caracterização desse vírus. Para tanto, 80g
de lagartas doentes foram maceradas; o extrato obtido foi submetido à centrifugação e ultracentrifugação. As supostas
partículas virais foram purificadas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose 10-40%. A banda formada localizada
no terço superior do tubo, na qual estariam as supostas partículas virais, foi coletada e armazena a -20oC. Foi realizada
uma separação eletroforética das proteínas virais (SDS-PAGE) dessa banda para identificação protéica. Constatou-se
um perfil semelhante entre as proteínas dessa suposta partícula viral com as proteínas de Baculovírus, de acordo com
o peso molecular.
Apoio Financeiro: FAPEMIG.
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Análise de um transposon de Anticarsia
gemmatalis (Lepidóptera: Noctuidae)
Nunes, JF; Carpes, MP; Ribeiro, BM
Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, UNB, Brasília, DF, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Baculovírus, transposon
Os transposons, ou elementos transponíveis, são seqüências de DNA capazes de se moverem no genoma tanto por via
DNA, pela ação da enzima Transposase quanto por via RNA, sendo estes relacionados aos retrovírus. Durante uma
infecção de uma célula por um vírus de DNA, um transposon celular ativo pode ser inserido no genoma do vírus,
gerando ou não fenótipos distintos ao do vírus selvagem, dessa forma, esses vírus, assim como os transposons, podem
ser isolados e estudados. O transposon Tid (transposable iap disruptor) foi encontrado no genoma do baculovírus
Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) em 1999 durante a construção de um recombinante
viral em células de Anticarsia gemmatalis (UF-LAG-286) e foi isolado por ter gerado um fenótipo viral incapaz de
bloquear a apoptose celular. Esse transposon, que se move via DNA, foi localizado interrompendo o gene inibidor
de apoptose 3 (iap-3) do vírus AgMNPV e a sua seqüência obtida. Esse transposon possui 2.500 pb e apresenta duas
regiões invertidas e entre as mesmas uma ORF de 1638 pb codificando a enzima Transposase. Esse transposon foi
também localizado em outras duas linhagens de células de inseto derivadas de Spodoptera frugiperda (IPLB-Sf21-AE)
e Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4), respectivamente. O presente estudo, tem como objetivo, o isolamento de células e
vírus contendo genes exógenos através de um sistema binário com o transposon Tid. Três plasmídeos ajudantes foram
construídos com os genes das transposases do tipo Tid das linhagens celulares IPLB-Sf21-AE, BTI-Tn5B1-4 e UFLAG-286 sob o comando do promotor de Drosophila melanogaster hsp70. Os plasmídeos doadores foram construídos
contendo as regiões esquerda e direita do transposon e entre elas o cassete do promotor hsp70 com o gene da proteína
enhanced green fluorescent protein (EGFP) e o cassete do promotor da fase precoce de baculovírus ie-1 com o gene da
proteína puromicina acetiltransferase (Pac), separadamente. Sistemas binários de transfecção foram formados com os
plasmídeos de transferência dos genes reporteres e os plasmídeos ajudantes separadamente; estes foram transfectados
em células BTI-Tn5B1-4, após 72 h as células transfectadas com o plasmídeo contendo o gene egfp foram analisadas
em citometria de fluxo e microscopia de fluorescência apresentando um aumento na expressão de EGFP em relação ao
controle; as células transfectadas com o plasmídeo contendo o gene Pac foram tratadas com puromicina e analisadas
em miscroscopia de luz. Foi realizado também ensaios de co-transfecção com os sistemas binários com o vírus
AgMNPV, após 72 h o sobrenadante foi coletado e utilizado para infecção de novas células BTI-Tn5B1-4 que foram
posteriormente analisadas em microscopia de luz, revelando expressão de EGFP. As células transfectadas expressando
os genes exógenos, assim como os vírus, estão sendo isolados para posterior análises de transposição Os experimentos
revelaram uma possível atividade de transposição.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, PRONEX, FAPDF, FINATEC.
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Diversidade genética do vírus
da hepatite B (HBV): Recombinantes
inter e intra-genotípicos
Oliveira-Silva, M1; Martinez, AMB2; Silveira, J2; Oliveira, DL3; Silva, SGC4; Kimura, RS5;
Júnior, DFS6; Moreira, AS7; Moreira, MAM8; Bonvicino, CR8,9
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro
2
Universidade Federal do Rio Grande, Rio Grande
3
Hemocentro do Estado do Espírito Santo, Vitória
4
Serviço de Hematologia e Hemoterapia do Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro
5
Laboratorio I da DRS II, Departamento Regional de Saúde, Araçatuba
6
Centro de Hematologia e Hemoterapia de Alagoas, Maceió
7
Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática, Plataforma de Seqüenciamento PDTIS/FIOCRUZ – IOC, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro
8
Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro; 9Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Reservatórios Silvestres, IOC, Fundação Oswaldo
Cruz, Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: HBV, evolução, diversidade, recombinação, inter e intra-genótipos
O vírus da hepatite B (HBV), membro da família Hepadnaviridae, possui genoma de DNA circular com cerca de
3200pb e quatro regiões abertas de leitura. A classificação do HBV em oito genótipos, designados de A a H, é definida
pela divergência genética maior que 8%, sendo muitos genótipos divididos em subgenótipos que apresentam distintas
distribuições geográficas e propriedades virais. Essa grande diversidade genética é dada pela falta da atividade de correção
da polimerase viral durante o processo de replicação, pelas interações entre os vírus e os hospedeiros e por um importante
elemento na evolução do HBV, a recombinação inter e intra-genotípica. A infecção simultânea por diferentes cepas
do HBV, reportada em países onde diferentes genótipos co-circulam, é requerida para o evento de recombinação.
Nesse estudo, análises filogenéticas foram realizadas a fim de detectar possíveis recombinantes do HBV em amostras
brasileiras. Um fragmento de 900pb da região pré-S/S do genoma viral foi amplificado de 106 amostras positivas para
marcadores sorológicos do HBV. Posteriormente, essas amostras foram seqüenciadas utilizando a Plataforma Genômica
de Seqüenciamento de DNA/PDTIS – FIOCRUZ. A partir de análises filogenéticas implementadas pelos programas
SplitsTree4 e Simplot, reportamos pela primeira vez uma cepa brasileira recombinante entre os genótipos A e D e quatro
cepas recombinantes entre os subgenótipos A1 e A2 do HBV. Esses dados foram confirmados com análises filogenéticas
de Neighbor-Joining utilizando o programa MEGA com as diferentes regiões não-recombinantes. Os dados deste estudo
refletem a diversidade genética e a presença de cepas híbridas do HBV na população brasileira.
Apoio financeiro: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
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Toxicidade de Temefós sobre o crescimento,
esterases e superóxido desmutase de
Scenedesmus obliquus
Luiz, DP; Pereira, BB; De Campos Júnior, EO; Moreira Neto, JF; Brandeburgo, MAM; Kerr, WE
Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
Palavras-chave: Biomonitoramento, Crescimento, Esterases, Superóxido desmutase, Scenedesmus
Organofosforados têm sido amplamente utilizados no controle de diversas pragas agrícolas e de insetos vetores de doenças.
Os principais efeitos causados pelos organofosforados estão relacionados, primeiramente, à inibição da acetilcolinesterase,
uma importante enzima do sistema nervoso que, quando inibida, provoca acúmulo de acetilcolina nas sinapses com
conseqüente colapso do sistema nervoso, resultando na morte do organismo contaminado (Fulton e Key, 2001).
Entretanto, quando estes compostos são dispersos no ambiente aquático, por exemplo, podem atingir organismos não
alvos. O decréscimo na densidade de algas e outras espécies que atuam como produtores primários nas cadeias alimentares
afeta os ecossistemas aquáticos diretamente por reduzir a biodiversidade e a produção primária (Monteiro et al., 2005).
Neste estudo, foram avaliados os efeitos do organofosforado temefós sobre algas da espécie Scenedesmus obliquus pela
observação dos padrões de crescimento, da atividade das carboxilesterases e superóxido desmutase (SOD). Células de
algas em fase de crescimento exponencial foram coletadas das culturas estoque e transferidas para meios de cultura
com concentrações de temefós de 0,0; 10,0; 25,0; 50,0 e 100,0 mg/L. As células foram mantidas nesses meios por 96
horas. As taxas de crescimento das algas e a atividade das enzimas carboxilesterases e SOD foram mensuradas após a
exposição ao TE. Os resultados mostraram que a concentração de 50,0 e 100,0 mg/L de TE foram efetivas na inibição
do crescimento das células (p<0,001). A atividade das carboxilesterases e SOD das culturas expostas ao TE sofreram um
incremento significativo quando comparadas ao controle (p<0,001). O aumento da atividade metabólica destas enzimas
pode estar associado a processos de detoxificação. A aplicação dos parâmetros de crescimento e atividade enzimática em
Scenedesmus obliquus constitui um sensível biomarcador para a avaliação da toxicidade de organofosforados.
Apoio financeiro: Capes, FAPEMIG, CNPq e UFU.
Toxicity of Temephos on growth, esterases and superoxide dismutase of Scenedesmus obliquus.
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Estudos funcionais com a proteína Rho1
GTPase de Schistosoma mansoni
Aguiar, PHN; Machado, CR; Franco, GR
Lab. de Genética Bioquímica, ICB, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
Palavras-chave: Transdução de sinais, complementação funcional, GTPases, Schistosoma mansoni, SmRho1
A proteína Rho1 de Schistosoma mansoni é uma GTPase de baixo peso molecular que pode estar envolvida em vias de
transdução de sinais que ativam genes envolvidos na maturação da fêmea do verme. Em um estudo anterior, a proteína
SmRho1 foi capaz de complementar leveduras Saccharomyces cerevisiae nocaute para Rho1 em temperaturas restritivas
e estresse osmótico (Ca2+ 300 mM) melhor que seu homólogo humano (HsRhoA). Sabe-se que, em condições de
estresse osmótico a Rho1 de S. cerevisiae aciona duas vias distintas: ativação do complexo enzimático da 1,3-β-glucano
sintase e ativação da via de transdução de sinal de PKC, promovendo a transcrição de genes de resposta. Neste projeto
a proteína SmRho1 e seus mutantes smrho1E97P, smrho1L101T, e smrho1E97P, L101T foram usados para esclarecer a base para
a complementação diferencial da linhagem de levedura nocaute para Rho1 pelo gene humano e de S. mansoni. Sabe-se
que a cafeína é um inibidor da via de PKC, vermelho congo atua na síntese de β-glucano e sorbitol é um regulador
osmótico; sendo assim, para investigar o comportamento diferencial das linhagens de levedura complementadas com
SmRho1 e seus mutantes, experimentos de crescimento celular na presença de cafeína, vermelho congo e sorbitol foram
realizados. A Rho1 de S. mansoni e seus mutantes mostraram complementação diferencial das leveduras na presença de
cafeína e vermelho congo, pois os mutantes smrho1E97P e smrho1E97P, L101T mostraram um atraso no crescimento quando
comparados às leveduras complementadas com a proteína SmRho1 do tipo selvagem. No entanto, na presença de
sorbitol a proteína SmRho1 do tipo selvagem e seus mutantes mostraram um fenótipo de complementação similar,
pois permitiram o crescimento das leveduras em todas as concentrações de cafeína e vermelho congo testadas. Estes
resultados demonstram que a substituição de um glutamato na posição 97 por uma prolina prejudica o funcionamento
eficiente da proteína Rho1 na promoção da resposta ao estresse osmótico.
Apoio financeiro: CAPES, FAPEMIG, CNPq.
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Keaa, a Dictyostelium kelch - domain
protein that regulates the response to stress
and development
Mantzouranis, L1; Bagattini, R1; Ogata, FT2; Nishiyama Jr, MY1; Vêncio, RZN3; Souza, GM1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, USP, São Paulo
2
Departamento de Bioquímica, CINTERGEN, UNIFESP, São Paulo
3
Departamento de Estatística, IME, USP, São Paulo
1
The keaA gene codes a protein with six kelch repeats at the C-terminus, a zf-C3HC4 domain at the N-terminus,
also called ring-finger, and a cysteine-rich sequence located in the mid-portion of the protein. keaA was isolated as
suppressor of yakA in a screen targeted to reveal genes involved in the survival to nitrosoative stress. YakA is a protein
kinase required for the regulation of several stress responses in Dictyostelium and is a key effector of the transition
from growth to development. KeaA is necessary for the proper regulation of pkaC by yakA when the cells are in low
cell densities. PkaC is known for its role in the regulation of several developmental genes. Morphological analysis of
deficient cells in keaA during multicellular development indicated that KeaA is required for the cells to efficiently
participate in the process. Deficient cells in keaA express low levels of pkaC, acaA and carA mRNA during aggregation
in low cell densities, which may explain why these cells are delayed in the completion of their development process in
low densities. Cells deficient in keaA start the aggregation process after of 12 hours of starvation. At this point the levels
of mRNA are very close to those of wild-type cells. Cells over-expressing the cisteine-rich domain took the same time
as the wild-type cells to reach the aggregation stage. However, the cells presented smaller aggregates and, thus smaller
culminants and fruiting bodies. Cells over-expressing the Kelch domain express high levels of acaA e carA after 8 and
12 hours of starvation, but the levels of pkac maintain similar to those in wild-type cells. This could indicate that the
Kelch domain induces the activation of PKA. However, this interaction was not observed when we conducted tests in
a two-hybrid system.
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TVMULES, a heterogeneous group of
trichomonas vaginalis mutator-like
elements, are patchily distributed and
distinctly active in trichomonad species
Carareto, CMA1; Silva, JC2; Benchimol, M3; Costa, GGL4, Pereira, GAG4 Lopes, FR1
Departmento de Biologia, UNESP, Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto - SP, Brasil
2
Departamento de Microbiologia e Imunologia, Universidade de Maryland, Maryland, EUA
3
Instituto de Ciências Biológicas e Ambientais, USU, Universidade Santa Ursula, Rio de Janeiro - RJ, Brasil
4
Departamento de Genética e Evolução, UNICAMP, Universidade Estadual de Campinas, 13083-970, Campinas - SP, Brasil
[email protected]
1
Keywords: transposon, Mutator, protists, parabasalid, Trichomonas vaginalis
The recent sequencing of the Trichomonas vaginalis genome showed that about two-thirds of it is composed by repeats and
transposable elements (TEs). We focused the analysis of Mutator elements, one of the most thoroughly studied TEs in
plants but barely described in non-plant species. Using the draft sequence data ongoing from T. vaginalis strain G3 Genome
Sequencing Project (http://www.tigr.org/tdb.e2k1/tvg/) sequence similarity searches between four consensus sequences of
TvMULEs and T. vaginalis data set were performed using the High Scoring Pairs (HSPs) of BLAST algorithms. All copies of
the four canonical repeats (Tvmu1, Tvmu2, Tvmu3 and Tvmu4) whose Mutator-like (MULEs) profiles have been suggested
by previous analyses were identified. All copies of the four TvMULEs were found to be nearly identical in sequence, with
ITR absents. Only Tvmu1 is a bonafide Mutator superfamily member, since it shows significant similarity in their encoded
putative proteins with known Tpases and harbor some hallmarks of MULEs, while Tvmu2 to Tvmu4 display new and
distinct motifs of the transposase core. The four TvMULEs carry a putative ORF of the transposase, but smaller than the
known MULE Tpases; all of them display clear signal of transpositional activity. The phylogenetic relationships of the
four TvMULEs Tpases generated by an alignment with Tpases of EMULE Tpases from C. albicans and Entamoeba and
Mutator Tpases from bacteria, archea, fungi, and plants showed close association of Tvmu1 with plant MULEs. However,
Tvmu2, Tvmu3 and Tvmu4 and three C. albicans putative Tpases are different from other clades and are representative
of a new and quite distinct branch of the Mutator lineage evolutionary history. Facing the low sequence polymorphism
among the TvMULE copies we hypothesized a very recent expansion of these TEs in the T. vaginalis. To evaluate whether
this event occurred before or after the global expansion of T. vaginalis, isolates of T. vaginalis from different geographical
regions and of other Trichomonads were analyzed for the presence of TvMULEs homologs. All the geographic isolates
of T. vaginalis harbor the four TvMULEs but among the other Trichomonads a patchy distribution was observed. The
cDNA hybridization analyzes showed the presence of abundant mRNA of the four TvMULEs in T. vaginalis reinforcing
that they are transcriptionally active. On the other hand, the non-T. vaginalis species not only show differential loss of
these TvMULEs but a loss of the transcriptional activity. Additionally, the TvMULEs could represent of a novel type of
non-ITR-MULEs, similar to some MULEs identified in Arabidopsis thaliana, that are able to transpose in the absence of
long ITRs. Moreover, the low polymorphism levels strongly suggest that the sequences of these elements does represent
the ancestral copy whose has suffered a recent process of activation and amplification after speciation of T. vaginalis.
Financial Support: CNPq, NIAID, NIH.
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Taxa de infecção natural de lutzomyia
whitmani (psychodidae) por leishmania em
área endêmica de leishmaniose tegumentar
no maranhão, brasil
mendes Júnior, JF 1; Fonteles, RS2; Corrêa, RB1; Azevedo, PCB2; Morais, JLP2; Pereira, SRF1;
Kuppinger, O1; Pereira, YNO1; Rêbelo, JMM1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular - Universidade Federal do Maranhão
2
Mestrado em Biodiversidade e Conservação – UFMA
[email protected]
1
Palavras-chave: Lutzomyia whitmani, taxa de infecção, LTA
Os flebotomíneos são insetos incriminados como vetores da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), uma doença
causada por protozoários do gênero Leishmania que acomete a pele e a mucosa causando ulcerações e deformidades.
A determinação da taxa de infecção natural de flebotomíneos em áreas endêmicas e a identificação das espécies de
Leishmania que infectam uma determinada espécie de flebotomíneos são importantes para os estudos epidemiológicos
das leishmanioses. O desenvolvimento de técnicas de biologia molecular, como a reação em cadeia de polimerase (PCR),
possibilitou uma maior especificidade na identificação de material genético de Leishmania. Trabalhos utilizando a PCR
têm sido realizados no diagnóstico de leishmaniose bem como na identificação de reservatórios animais, detectando
parasitas independentemente da abundância, estágio, local e transmissibilidade. No Maranhão, a LTA é um problema de
saúde pública pela alta incidência em humanos, por isso, neste trabalho estudou-se a taxa de infecção natural de fêmeas
de Lutzomyia whitmani capturados no Município de Axixá, área endêmica de LTA no Maranhão, através da Reação em
Cadeia de Polimerase (PCR). A extração de Dna foi realizada individualmente, e a amplificação foi feita utilizando-se
primers RV1 e RV2 específicos para o gênero Leishmania. Todas as reações foram feitas concomitantemente com controle
positivo (DNA de leishmania) e com controle negativo (água estéril). Como resultado, de 1000 fêmeas analisadas, 4
apresentaram amplificação de fragmento de 120 pb, obtendo-se uma taxa de infecção real de 0,4%. Concluímos que
esta taxa de infecção é suficiente para a manutenção da endemicidade da doença, uma vez que o Municipio de Axixá
tem os maiores índices de doentes com LTA no estado do Maranhão. Estes dados podem servir de base para medidas
de controle do vetor.
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Diagnóstico molecular de Nosema ceranae
em Apis mellifera L. em apiários
da região Sudeste do Brasil
Coelho Júnior, RJ1; Message, D2; Dias, ACF1; Balmant KM1; De Paula, SO1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
Departmento de Biologia Animal, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Apis mellifera, Nosema, diagnóstico, RFLP, DCC
A desordem de colapso da colônia (DCC) têm chamado atenção do setor apícola nos últimos anos. Há a hipótese
que ela tenha origem em uma série de fatores que, combinados, poderiam provocar uma reação imunosupressiva nas
abelhas, tornando-as susceptíveis à patógenos conhecidos e a doenças emergentes como a nosemose resultante da
infecção por N. ceranae. Recentemente, com o aperfeiçoamento das técnicas de biologia molecular, constatou-se que
existem duas espécies de Nosema que infectam Apis mellifera na Europa e América do Norte: Nosema apis e N. ceranae.
Estudos demonstraram que há um risco relativo de despopulação em colônias de abelhas infectadas por ambas as
espécies de microsporídeo (Nosema apis e N. ceranae) ou somente por N. cerana. Estes achados indicam uma significativa
associação de despopulção com a presença da N. ceranae. Com o intuito de comprovar esta associação, 1.106 amostras
foram coletadas em 20 apiários localizados na região de Altinópolis, São Paulo. A presença de esporos de Nosema foi
analisada por microscopia de luz e PCR, sendo que a prevalência das espécies de protozoário foi realizada por RFLP.
O diagnóstico por PCR confirmou os resultados da microscopia de luz em que 100% das amostras foram positivas
para Nosema. Em seguida, a restrição enzimática dos produtos da PCR constatou uma prevalência de 100% de Nosema
ceranae. Portanto, neste trabalho foi observado que a nova espécie Nosema ceranae encontra-se amplamente distribuída
nos apiários em questão e pode ser um dos fatores que contribuem para a elevada mortalidade de abelhas observada
na região de Altinópolis.
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Identificação de possíveis parceiros
funcionais do fator de iniciação da tradução
EIF4G de tripanossomatídeos utilizando
ferramentas de bioinformática
Nunes, EC1; Freire, ER1; de Melo Neto, OP1
Departamento de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz
[email protected]
1
Palavras-chave: eIF4G, iniciação da tradução, bioinformática, tripanossomatídeos, alinhamentos múltiplos
Os tripanossomatídeos são agentes causadores de enfermidades de grande impacto mundial e destacam-se por apresentarem
características não encontradas em outros eucariotos. Dentre essas, estão os mecanismos pós-transcricionais de regulação
da expressão gênica, principalmente no controle da tradução. Dessa forma, presume-se que a etapa de iniciação da
tradução tenha um papel fundamental no controle global da expressão gênica nesses parasitos. Em eucariotos superiores,
a tradução se inicia a partir da montagem do ribossomo junto ao mRNA, com a participação de fatores de iniciação
da tradução (eIF). Dentre esses, se destacam aqueles que formam o complexo eIF4F (o eIF4A, eIF4E e eIF4G), que
permitem a associação da subunidade menor ribossomal ao mRNA e iniciam todo o processo. Dando continuidade à
caracterização funcional de homólogos do fator eIF4G, identificados em espécies de Leishmania e Trypanosoma, este
trabalho teve como objetivo utilizar ferramentas de bioinformática na identificação de possíveis parceiros funcionais
de eIF4G de tripanossomatídeos. Nesse sentido foram realizadas buscas, nas seqüências desses microrganismos, por
homólogos de proteínas já identificadas como parceiros de eIF4G em outros eucariotos. Foi dada ênfase ao eIF5, à
subunidade eIF3e, do complexo eIF3, e ao eIF4B. Os alinhamentos sugeriram que o eIF5, de tripanossomatídeos, tem
a extremidade N-terminal conservada. Isso é evidenciado pela conservação de resíduos importantes, como R15, K33,
K55, e quatro de cisteína, característicos de um domínio. Em contraste, a C-terminal mostrou-se divergente, apesar
da conservação dos resíduos fundamentais W354 e W381. Mudanças de carga ou deleções exclusivas também foram
verificadas. Já o eIF3e, que faz parte do eIF3 (um complexo multiprotéico de alto peso molecular), apresentou seus
domínios N-terminal e PCI, com conservação dos vinte primeiros aminoácidos. Também foram observadas pequenas
deleções. O eIF4B é divergente em plantas e leveduras e não havia sido identificado em tripanossomatídeos. A pesquisa,
além de identificá-lo, verificou conservação de resíduos importantes em seu domínio RRM, de ligação a RNAs, e
de outros responsáveis por interação com demais fatores. As seqüências desses eIFs serão utilizadas para se desenhar
estratégias de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, que servirão para a realização de ensaios funcionais.
Esses passos visam identificar como eles atuam na tradução e se as funções se assemelham, ou diferenciam, do que já
foi descrito em outros eucariotos.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Detecção molecular de infecção de
Lutzomya withmani por Leishmania
amazonensis em condições experimentais
Martins,ARP1; Fonteles, RS2; Azevedo, PCB2; Pereira, YNO3; Lobato, KS3; Morais, JLP3;
Pereira, SRF1; Rêbelo, JMM3; Kuppinger, O1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular - UFMA
2
Mestrado em Biodiversidade e Conservação – UFMA
3
Laboratório de Insetos Vetores – UFMA
[email protected]
1
Palavras-chave: L. whitmani, capacidade vetorial, L. amazonensis
A Leishmaniose Tegumentar (LT) é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por protozoários do gênero
Leishmania, que acomete pele e mucosas. No Brasil, a doença tem sido documentada em todos os Estados e o aumento
da incidência está associado à difusão da doença para novas áreas geográficas, inclusive urbanas, constituindo-se em
um grande problema de saúde pública. O surgimento e expansão dessa doença no Maranhão têm sido atribuídos às
condições ambientais e climáticas favoráveis, associadas aos desmatamentos constantes e progressivos em função da
implantação de projetos agrícolas, industriais, habitacionais e rodo-ferroviários. No Brasil a LT é causada principalmente
pela L.(V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (L.) amazonensis e, mais raramente, pela L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi e
L. (V.) shawi. Cada espécie apresenta particularidades concernentes às manifestações clínicas, a vetores, reservatórios
e padrões epidemiológicos, à distribuição geográfica e até mesmo à resposta terapêutica. A importância do controle
da LT reside não somente na sua alta incidência e ampla distribuição geográfica, mas também na possibilidade de
assumir formas que podem determinar lesões destrutivas, desfigurantes e também incapacitantes. A L. amazonensis é
agente etiológico de LT, incluindo a forma anérgica ou leishmaniose cutânea difusa (LCD), sendo os flebotomíneos
Lu. flaviscutellata e Lu. olmeca incriminados como os principais vetores. No entanto, no Maranhão, apesar de ser o
estado brasileiro com maior número de casos de LCD, a freqüência dessas espécies de flebotomíneos é muito baixa,
enquanto Lu. whitmani é o flebotomíneo de maior freqüência. Dessa forma, é justificável se investigar a capacidade de
Lu. whitmani de se infectar com Leishmania amazonensis. Assim, este trabalho teve por objetivo determinar a capacidade
vetorial de Lu. whitmani, capturados no município de Axixá (MA), área endêmica de leishmaniose, como vetor do
parasita L. amazonensis. Para isso, uma colônia de Lu. whitmani foi estabelecida, e as fêmeas geradas e, portanto,
livres de qualquer infecção, foram alimentadas em camundongo previamente infectado por L. amazonensis. Foi feita
extração de DNA de cada fêmea, individualmente, e a detecção do protozoário foi realizada por amplificação de DNA
do parasito (PCR) utilizando-se os primers RV1 e RV2. Houve amplificação de fragmentos específicos de 120 pb para
o gênero Leishmania nos experimentos realizados. Assim, podemos concluir que o vetor Lu. whitmani é capaz de se
infectar com o protozoário L. amazonensis e pode estar envolvido na transmissão natural da forma mais grave de LT,
a Leishmaniose Cutânea Difusa, causada pela L. amazonensis. Isso pode explicar a existência de casos dessa doença na
Amazônia maranhense sem a existência do seu principal vetor, o Lu. flaviscutelata.
APOIO: FAPEMA; CAPES.
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Quinureninase de Trypanosoma cruzi:
evidência de uma via alternativa para
o catabolismo do triptofano
Vernal, J1; Ecco, G1; Razzera, G2; Tavares, C1; Serpa, VI1; Krieger, MA3; Goldenberg, S3; Terenzi, H1
1
Laboratório de Expressão Gênica, Departamento de Bioquímica, Univesidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil
Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear – Jiri Jonas, Departamento de Bioquímica Médica, ICB/CCS/UFRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
3
Instituto de Biologia Molecular do Paraná, IBMP, Curitiba, Paraná, Brasil
[email protected]; [email protected]
2
Palavras-chave: quinureninase, via da quinurenina, Trypanosoma cruzi, doença de Chagas
O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, pertencente à Ordem Kinetoplastida. Ele é o agente etiológico da doença
de Chagas, enfermidade ainda sem cura que atinge milhões de pessoas desde os Estados Unidos até o sul da América
do Sul. Esse parasita possui no seu genoma uma janela de leitura que codifica para uma possível enzima quinureninase.
A estrutura primária traduzida possui alta similaridade com as quinureninases de diversos outros organismos, como
Saccharomyces cerevisiae e Pseudomonas fluorescens. Essa enzima, dependente de piridoxal-5’-fosfato, tem um importante
papel no catabolismo do triptofano, participando da via da quinurenina. A quinureninase eucariótica catalisa a clivagem
hidrolítica da 3-hidroxi-L-quinurenina em ácido 3-hidroxiantranílico e L-alanina. Nesse trabalho, nós descrevemos a
expressão em Escherichia coli, purificação e caracterização inicial da estrutura e função da enzima quinureninase de T.
cruzi. Obtiveram-se com o procedimento de purificação utilizado (cromatografia de afinidade por metal imobilizado)
2.9 mg da proteína pura, partindo-se de um cultivo bacteriano de 500 ml. Os dados da espectrometria de massa
confirmaram a identidade dessa proteína. A massa molecular aparente da quinureninase nativa de T. cruzi foi estimada
por gel filtração, sugerindo que a proteína nativa é um dímero composto de duas subunidades similares. A quinureninase
de T. cruzi utiliza tanto a L-quinurenina quanto a 3-hidroxi-L-quinurenina como substratos, com atividades específicas
de 137.61 U mg-1 e 203.46 U mg-1, respectivamente. Foi estudada a estrutura secundária da enzima por dicroismo
circular. Os dados obtidos sugerem um conteúdo de α-hélice de 44% e de folha β de 5%, estando o restante da proteína
aleatoriamente enovelada. Esses resultados estão de acordo com a estrutura da quinureninase humana (PDB 2HZP).
No T. cruzi, foi demonstrado que as enzimas tirosina aminotransferase e desidrogenase de 2-hidroxiácidos aromáticos
são responsáveis pelo catabolismo de aminoácidos aromáticos. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que o T.
cruzi poderia também catabolizar o triptofano através de uma via alternativa, a via da quinurenina – processo envolvido
na biosíntese de novo de NAD+.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, MCT, FINEP e FAPESC.
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Determinação da carga parasitária
em diferentes tecidos de cães naturalmente
infectados por Leishmania (Leishmania)
chagasi por PCR quantitativa
Pereira, SRF1; Carvalho, CC1; Silva, MH1; Castelo Branco, PA1; Nascimento, FRF2; Rebelo, JMM3; Goulart, LR4
Laboratório de Genética e Biologia Molecular-Universidade Federal do Maranhão.
2
Laboratório de Imunofisiologia – UFMA
3
Laboratório de Insetos Vetores – UFMA
4
Laboratório de Nanobiotecnologia - INGEB - UFU
[email protected]
1
Palavras-chave: Leishmaniose canina, carga parasitária, PCR
A Leishmaniose visceral, causada por Leishmania (Leishmania) chagasi, é uma zoonose de grande relevância na saúde
coletiva devido à sua heterogeneidade epidemiológica, alta letalidade em pacientes não tratados e soroprevalência. Os cães
são considerados reservatórios domésticos e o principal elo na manutenção do ciclo urbano da doença. Esse hospedeiro
apresenta variações no quadro clínico da doença, passando de animais aparentemente sadios a oligossintomáticos, podendo
chegar a estágios graves da doença. Devido à ausência de sinais clínicos, cães assintomáticos têm sido considerados
com pouca ou nenhuma importância epidemiológica, mas alguns trabalhos sugerem que a intensidade do parasitismo
não tem relação direta com a gravidade do quadro clínico, e podem ser observados cães muito parasitados com uma
sintomatologia leve. Assim, este trabalho teve como objetivo determinar a carga parasitária em cinco diferentes tecidos
(sangue, pele, linfonodo, baço e medula óssea) de cães naturalmente infectados e com diferentes manifestações clínicas
(assintomáticos, oligossintomáticos e polissintomáticos). Todos os cães eram provenientes do município de Raposa,
endêmico para leishmaniose visceral humana e canina, situado na Ilha de São Luís (Maranhão, Brasil). Iniciou-se o
estudo com coleta de sangue de 233 cães para diagnóstico sorológico da infecção. Dentre os cães examinados, 69 (29,6%)
apresentaram anticorpos anti-Leishmania no teste ELISA. Destes, 27 foram recapturados e estudados. Os animais foram
classificados de acordo com avaliação clínica em assintomáticos (n=10); oligossintomáticos (n=8) e polissintomáticos
(n=9). Um método de PCR quantitativo foi desenvolvido e padronizado para avaliar a carga parasitária nos cinco tecidos,
utilizando-se primers RV1 e RV2, específicos para a região conservada do minicírculo do cinetoplasto. O cálculo para
determinação da carga parasitária foi realizado com base na densidade óptica (D.O.) do amplicon alvo interpolado em
uma curva de densidade ótica de produtos amplificados a partir de uma série de diluições da cepa (controle positivo).
Com esse método, o parasito foi detectado em todas as amostras de linfonodo de todos os grupos clínicos, sendo
também o tecido com a maior carga parasitária, seguido por baço, sangue, medula e pele. Concluímos que o método de
quantificação padronizado neste estudo é sensível, rápido e econômico para determinar a carga parasitária de Leishmania
chagasi em locais que não possuem o PCR em tempo real. Em cães, linfonodo é o tecido mais sensível em análises por
PCR e pode ser considerado o tecido alvo para o monitoramento da leishmaniose canina.
Apoio financeiro: CNPq; FAPEMA.
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Análise da expressão de homólogos ao fator
de iniciação da tradução eIF4G durante
o ciclo de vida de Leishmania sp
Palma, ML; Pereira, MMC; Costa Lima,TDC; Moura, DMN; Rocha, PO; Reis, CRS; de Melo Neto, OP
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
[email protected]
Palavras-chaves: Leishmania, iniciação da tradução, eIF4G
Em eucariotos, o fator eIF4G se destaca por sua função na montagem do complexo de iniciação da tradução eIF4F que,
por sua vez, permite a interação entre o mRNA e a subunidade ribossomal menor e o início da síntese de proteínas. Em
tripanosomatídeos, protozoários responsáveis por diversas enfermidades de impacto mundial, foram descritos 5 homólogos
ao fator eIF4G (LmEIF4G1-5) cuja função na tradução ainda permanece desconhecida. Neste trabalho, fazendo uso de
soros policlonais específicos previamente obtidos, foi investigada, por meio de ensaios de “Western-blot”, a expressão
destes homólogos em extratos de diferentes espécies de Leishmania e Trypanosoma e em distintas fases do seu ciclo de
vida. Primeiramente, esta expressão foi quantificada na forma promastigota de L. major e observou-se que o eIF4G2
é o mais abundante, o eIF4G1 o menos abundante e os demais estão presentes em níveis intermediários. Pelo menos
quatro destes homólogos (eIF4G1,3-5) apresentaram duas isoformas, sugerindo modificações pós-traducionais como
fosforilação. Homólogos de eIF4G3-5 foram identificados em extratos de todas as espécies de Leishmania analisadas,
enquanto que o eIF4G2 se mostrou ausente em L. braziliensis. Em espécies de Trypanosoma, entretanto, o único a ter
ortólogo reconhecido foi o eIF4G5. A ausência de detecção foi interpretada como em decorrência da menor conservação
antigênica das proteínas. Em L. amazonensis e L. chagasi os eIF4G1,3-5 foram detectados em diferentes fases do seu
ciclo de vida, enquanto o eIF4G1 parece ser específico da fase exponencial de crescimento. Em L. chagasi observou-se
que onde houve diminuição dos níveis de eIF4G3, ocorreu aumento nos níveis do eIF4G4 e o recíproco também foi
observado. Experimentos de detecção dos eIF4G3-5 em frações celulares indicam que os eIF4G4-5 são citoplasmáticos
e o eIF4G3 é predominantemente citoplasmático, sugerindo um envolvimento no metabolismo de mRNAs ou sua
tradução. Estes resultados constituem um primeiro passo na caracterização desses fatores e sua continuação deve gerar
subsídios para um melhor entendimento da iniciação da tradução em tripanosomatídeos.
Orgão financiador: FACEPE.
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Análise do polimorfismo genético do gene
AQP1 em Leishmania braziliensis
e a correlação com o fenótipo
de resposta terapêutica
Torres, DC1,3; Romero, G2; Dávila, AMR3; Cupolillo, E1
Laboratório de Pesquisa em Leishmaniose e 3Laboratório de Biologia Molecular de Tripanosomatídeos e Flebotomíneos, Instituto Oswaldo Cruz,
FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil 2Universidade de Brasília
[email protected]
1
Palavras-chave: polimorfismo, AQP1, L. braziliensis, resposta terapêutica, resistência a drogas
Em áreas endêmicas das Américas, a espécie L. braziliensis é o principal agente causador da leishmaniose tegumentar,
podendo também provocar a forma mucocutânea da doença. Antimoniais pentavalentes vêm sendo utilizados como
a primeira linha de drogas. Entretanto, nos últimos anos, um grande número de casos clínicos que não respondem ao
tratamento vem sendo reportado. Acredita-se que o influxo da forma ativa da droga se realiza através do transportador
AQP1, uma aquagliceroporina. Estudos revelam uma diminuição na expressão gênica desse transportador em isolados
de Leishmania resistente a drogas. Portanto, este trabalho tem como objetivo realizar uma análise do polimorfismo
genético do gene AQP1 em isolados de pacientes com leishmaniose de forma a avaliar o seu potencial como marcador
molecular para o fenótipo de resistência a drogas. O estudo encontra-se em fase preliminar e até o momento apenas sete
cepas de L. braziliensis isoladas de pacientes que apresentaram cura terapêutica e quatro de pacientes que apresentaram
falha terapêutica foram analisadas. O gene AQP1 foi amplificado pela técnica de PCR a partir do DNA genômico
e, posteriormente, clonado no vetor pGEM-T easy e transformado em células de E. coli DH5α. As seqüências foram
geradas a partir do seqüenciador automático ABI3730 DNA analyzer e montadas com o auxílio do pacote Phred/Phrap/
Consed. Um alinhamento múltiplo foi gerado com o programa ClustalW, contendo 11 seqüências. O alinhamento
final continha 858 caracteres, com 5 sítios variáveis, nos quais 2 são compartilhados com mais de uma seqüência e 3
aparecem apenas em um isolado. Das mutações encontradas 3 foram não sinônimas. Em duas delas acontece mudança
de aminoácido de mesmo grupo, enquanto que na cepa IOC/L 2928, oriunda de um paciente com falha terapêutica,
ocorreu uma mudança de Q, cuja cadeia lateral polar é não carregada, para R, cuja cadeia lateral é básica. Uma árvore
foi gerada utilizando-se o método de UPGMA, e a estabilidade dos clados foi avaliada por bootstrap, com o programa
MEGA 4. Até o momento não foi possível agrupar as cepas em grupos relacionados com cura e falha terapêutica. É
importante destacar que a resposta clínica também está relacionada com o sistema imune do paciente, como fatores
farmacológicos. Na literatura, num estudo com 65 isolados de P. falciparum, observou-se apenas 2 mutações não
sinônimas. No entanto, no estudo atual, com apenas 11 isolados de L. braziliensis, foi possível observar um maior número
de mutações e uma em potencial que pode provocar mudanças na sua estrutura, demonstrando que o polimorfismo
genético observado em AQP1 pode potencialmente servir como marcador epidemiológico e para isso é fundamental
que mais isolados sejam analisados.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPERJ (Cientista do Nosso Estado), Comunidade Européia (INCO-DEV FP6).
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Análise da expressão de homólogos aos
fatores de iniciação da tradução eif4e e
eIF4G em Trypanosoma brucei
Malvezzi, MA1,2; Moura, DMN1,2 e de Melo Neto, OP1,2
Departamento de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - FIOCRUZ, Recife PE BRASIL
2
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE BRASIL
[email protected]
1
Palavras-chave: Trypanosoma brucei, síntese protéica, iniciação da tradução
O Trypanosoma brucei, protozoário unicelular, é o patógeno responsável pela doença do sono. Este microorganismo,
bem como outros representantes da família Trypanosomatidae, apresenta uma fraca regulação da expressão gênica
durante a transcrição e diferentes linhas de evidências indicam a biossíntese de proteínas como um ponto crítico desta
regulação, sendo a etapa de iniciação da tradução a mais sujeita a mecanismos regulatórios. O complexo eIF4F, o qual
é formado pelas subunidades eIF4A, eIF4E e eIF4G, juntamente com a proteína de ligação ao poli-A (PABP), atua no
reconhecimento do mRNA e facilita o recrutamento do ribossomo para iniciar a síntese de proteínas. A subunidade
eIF4E é a proteína de ligação ao cap, que reconhece o mRNA na sua extremidade 5’; o eIF4A é uma RNA helicase;
e o eIF4G é a proteína que estrutura o complexo e media sua interação com parceiros funcionais. Vários homólogos
destas proteínas já foram identificados nos três principais representantes da família Trypanosomatidae (Leishmania
major, T. brucei e T. cruzi), e tendo como referência os resultados previamente obtidos com a análise de expressão em
L. major, nosso trabalho visou comparar o padrão de expressão de alguns deles em T. brucei (TbEIF4E1, TbEIF4E3-4
e TbEIF4G4-5), em diferentes fases de seu ciclo de vida. Assim, a partir de pontos representativos das fases procíclica
e sanguínea desse tripanossomatídeo, estas proteínas foram analisadas por Western-blot. Foi observado que todas
estão presentes em ambas as fases do clico de vida e que possuem padrões de expressão distintos. O TbIF4E4 é mais
expresso na fase procíclica do que na sanguínea, TbEIF4E1 possui padrão de expressão similar em ambas as fases e o
TbEIF4E3 apresentou duas isoformas na fase procíclica, provavelmente devido a modificações pós-traducionais como
fosforilação. Os homólogos TbEIF4G4-5 também são expressos de forma constitutiva, sendo possível detectar, tanto
na fase sanguínea quanto na procíclica, níveis semelhantes de expressão de TbEIF4G5 e duas isoformas de TbEIF4G4.
Esses resultados preliminares indicam que as diferenças nos níveis de expressão desses homólogos e a possível fosforilação
de alguns deles possam desempenhar papel central na regulação da síntese protéica desses parasitas.
Financiamento: FACEPE/UFPE/FIOCRUZ.
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Diagnóstico molecular e sorológico
da toxoplasmose em gestantes atendidas
pelo sistema único de saúde de alagoas
Machado, RRS; Nascimento, VX; Neto, ER; Barros, EMLR; Morais, VMS; Orsi, AR; Castro, KCB; Silva, DW
Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Setor de Microbiologia, Universidade Federal de Alagoas
[email protected]
Palavras-chave: Toxoplasma gondii, PCR, Sorologia, Toxoplasmose, Quimioluminescência
A toxoplamose é uma protozoonose causada por Toxoplasma gondii, doença geralmente assintomática em seres humanos,
mas de grande importância para a gestante devido à possibilidade de transmissão congênita, podendo ocasionar abortos
e anomalias graves no feto, como retinite, epilepsia, retardo mental ou motor, além da tétrade de Sabin. Os métodos
sorológicos têm sido amplamente utilizados no diagnóstico pré-natal da toxoplasmose congênita, dentre os quais o
imunoensaio enzimático (ELISA), imunofluorimetria e quimioluminescência, cujas vantagens incluem a facilidade
técnica e rapidez na sua realização. Entretanto, elas podem falhar na detecção de níves mínimos de anticorpos IgM
circulantes, e apresentam limitações na detecção anticorpos IgG e IgM na fase ativa da infecção, os quais podem estar
ausentes no soro durante as primeiras semanas de parasitemia. Técnicas moleculares que utilizam a reação em cadeia da
polimenase (PCR), têm demonstrado maior sensibilidade e especificidade que os métodos sorológicos convencionais e
podem auxiliar na avaliação pré-natal da doença congênita. O presente trabalho teve como objetivo comparar o valor
do diagnóstico da PCR com a pesquisa de anticorpos anti-Toxoplasma gondii através da reação de quimioluminescência,
para detecção de IgG e IgM em soro de gestantes atendidas no Hospital Sanatório de Alagoas, pertencente ao Sistema
Único de Saúde (SUS). Foram submetidas ao estudo 55 gestantes com idades superiores a 18 anos. Duas coletas de
sangue foram efetuadas, uma para a dosagem sorológica de IgG e IgM, através do teste de quimioluminescência e
outra para a amplificação por PCR. O isolamento do DNA genômico foi efetuado com o kit comercial GFX Genomic
Blood DNA Purification (Amersham Biosciences) e a amplificação gênica de um fragmento de 194pb, correspondente
ao gene B1, com os iniciadores Toxo N1 e Toxo C1, para PCR simples e Toxo N2 e Toxo C2 para a PCR aninhada.
Os dados foram analisados através do programa EpiInfo 6.0, enquanto que a comparação entre proporções foi obtida
pelo odds raio (OR), intervalos de confiança (IC) de 95% e significância determinada através do teste do qui-quadrado
(χ2). Das gestantes avaliadas, 50 (91%) foram positivas para anticorpos IgG, enquanto apenas uma (2%) foi positiva
para a classe IgM. Quando as mesmas amostras foram submetidas à técnica de PCR, 16 (29%) amostras resultaram
positivas, indicando que houve parasitemia durante a fase crônica da doença, e uma amostra PCR-positiva em uma
paciente soronegativa. Os resultados obtidos sugerem que a PCR apresenta 22 vezes mais chances de detectar o gene B1
do parasita na circulação sanguínea do que naquelas que se utilizou a quimioluminescência como técnica de escolha.
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Antioxidantes indiretos aumentam a resistência
ao estresse oxidativo e a longevidade do
Caenorhabditis elegans através dos fatores de
transcrição skn-1 e daf-16
oliveira, RP1,4;Baker, J1; Dinkova-Kostova, A2; An JH1; Sporn, MB3, Talalay, P2; Blackwell, TK1
Joslin Diabetes Center and Harvard Medical School, Boston, MA 02215, USA
2
Johns Hopkins University, Baltimore, MD 21205, USA
3
Dartmouth Medical School, Hanover, NH 03755, USA
4
Depto. Ciências Biológicas, UFOP, Ouro Preto, MG 35.4000, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: longevidade, estresse oxidativo, Caenorhabdidtis elegans, antioxidante, SKN-1
A capacidade de resistir ao estresse oxidativo tem sido diretamente associada ao aumento da longevidade no nematodo
Caenorhabditis elegans assim como em outras espécies. O mecanismo da Fase 2 de detoxificação, responsável pela remoção
de radicais livres e compostos xenobióticos, é a principal linha de defesa contra o estresse oxidativo. Em mamíferos, os
compostos sulforafano (SFN), um isotiocianato isolado do broto de brócolis e o CDDO-Imidazol (CDDO-Im), um
triterpenóide sintético, são capazes de induzir as enzimas da Fase 2 de detoxificação através da ativação transcricional do
fator de transcrição Nrf2. Em C. elegans, a proteína SKN-1, o ortólogo das proteínas Nrf2, funciona como a principal
defesa contra o estresse. Neste trabalho, nós exploramos os efeitos benéficos destes dois antioxidantes indiretos no
aumento da resistência ao estresse oxidativo e longevidade do C. elegans. Nós observamos que o tratamento tanto com
SFN ou CDDO-Im induz a localização nuclear de SKN-1::GFP (Green Fluorescent Protein) e ativa a expressão de
genes de Fase 2 de detoxificação glutationa cisteína sintetase (gcs-1::gfp) e glutationa S-transferase (gst-25::gfp). A ativação
dos genes de Fase 2 de detoxificação, além de skn-1, também depende da via de sinalização da p38 MAPK (MitogenActivaded Protein Kinase). Nós também demonstramos pela primeira vez que estes antioxidantes indiretos induzem
FOXO/DAF-16 (DAF-16::GFP), o fator de transcrição inibido pela via de sinalização da insulina, a se acumular no
núcleo e ativar a expressão do gene alvo superóxido dismutase (sod-3::gfp) tanto no C. elegans como em cultura de
células. O tratamento com SFN aumenta significantemente os níveis de glutationa total e a resistência do C. elegans
ao estresse oxidativo de maneira skn-1, daf-16 e p38 dependente e possivelmente outros mecanismo de defesa ainda
não esclarecidos. Mais interessante, é que o tratamento com SFN prolonga o tempo de vida médio e máximo do C.
elegans. Este aumento da longevidade também é dependente de skn-1, daf-16 e da via de sinalização da p38 MAPK. Nós
podemos concluir que os antioxidantes indiretos testados induzem os fatores de resposta ao estresse SKN-1 e DAF-16
protegendo os animais contra o estresse oxidativo e xenobiótico e também aumentando a sua longevidade.
Apoio financeiro: National Institute of Health (NIH).
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Utilização de PCR-DGGE na análise
comparativa da diversidade microbiana
presente em ambientes naturais e
contaminados com petróleo através da
técnica de PCR-DGGE
Aleluia, MM; Santos, ACF; Dias, JCT; Rezende, RP
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Depto. de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
Palavras-chave: DGGE, Solos, Microrganismos, Mata Atlântica, Landfarming
A habilidade dos microrganismos para transformar formas de matéria orgânica (natural ou sintética) faz deles excelentes
agentes para a biorremediação. Porém, pouco se conhece sobre os microrganismos presentes na manutenção dos processos
biológicos. Apenas uma pequena fração dos microrganismos do solo (entre <0,1 a 1%) são cultiváveis através do emprego
de métodos microbiológicos convencionais. Perfis eletroforéticos de sequências do DNA ribossomal (rDNA) amplificados
por PCR têm sido bastante utilizados no estudo de comunidades microbianas ambientais. Desse modo, o presente
trabalho tem como objetivo comparar a microbiota presente em solos de clima tropical úmido através da técnica de
DGGE (denaturing gradiente gel electroforesis). Amostras de solo Mata Atlântica e Landfarming foram utilizados para
a extração do DNA total com o sistema PowerSoil™ DNA Isolation Kit (MoBio, UK) e utilizado na amplificações do
16S rDNA para os Domínios Bacteria e Archaea. Os produtos de amplificação foram, então, separados por eletroforese
em gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante (DGGE). O perfil das bandas do DGGE demonstrou que o solo
de um ambiente natural (Mata Atlântica) possui uma maior riqueza de diversidade microbianas do que a encontrada no
solo de Landfarming. Foi observada também uma pequena similaridade entre os dois ambiente, o que infere a presença
de organismos chave dos processos biodegradativos, mesmo em ambientes naturais sem histórico de contaminação.
Entretanto, os microrganismos presentes no Landfarming estão mais adaptados a degradação dos hidrocarbonetos
derivados do petróleo, deles retirando sua fonte de energia e desempenham um papel importante na atenuação natural
dos poluentes da indústria petrolífera.
Apoio Financeiro: FAPESB e CNPq CTPETRO processo: 502697/2003-2.
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Functional genomics of microrganisms in Brazil
Goldenberg, S
Instituto Carlos Chagas, ICC – Fiocruz
Rua Prof. Algacyr Munhoz Mader 3775
81350-010 Curitiba – PR
[email protected]
Functional genomics is an important increasing research field worldwide since it provides the tools for the characterization
of genes and their encoding products. The increasing number of genome projects in the last years has shown that an
important percentage of potential genes encode hypothetical proteins of unknown function. However transcriptome
profiling using microarrays, proteome analysis and bioinformatics tools can shed light to determining the function of
these genes. In the last few years an important effort was made in Brazil do determine the genome sequence of distinct
organisms. I will present an update of microorganism genome projects in Brazil and describe the role of functional
genome analysis in determining gene function.
Financial support from CNPq and Fiocruz.
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Planejamento bioinformático de anticorpos
de cadeia única sintéticos livres
de códon de terminação
Coelho-Jr, OS1; Alves, BJ1; Rodriguez, M1; Ortega, JM1
[email protected]
Depto. Bioquímica e Imunologia, UFMG, Brazil
2
Depto. Biologia Geral, UFMG, Brazil
1
Palavras-chave: ScFv, códons de terminação, síntese, anticorpo, bioinformática
A construção de genes sintéticos permitiu o desenvolvimento de uma tecnologia associada à construção de anticorpos de
cadeia única que se constitui na síntese de SScFv, definidos como Fração de Variabilidade de Cadeia Única Sintéticos.
Em um gene estão reunidas as frações Fv das cadeias pesada e leve de um anticorpo, onde os CDR são codificados por
códons degenerados. Tradicionalmente esses SScFv eram expressos em bactérias, utilizando para seleção o sistema “PhageDisplay”, assim era possível ocorrerem códons de terminação TAG pois eram utilizados supressores. Nós adaptamos o
sistema para seleção utilizando o sistema de duplo-híbrido em leveduras em triagem líquida. Nesse caso, a eliminação
do códon TAG é necessária na composição da região aleatória. Utilizando o alfabeto incluindo as bases A, C, G, T e as
representações de degeneração R, Y, C, A, W, S, B, D, H, V, N, criamos combinações de um a três códons consecutivos.
Com dois códons, 177161 combinações foram avaliadas e,dentre elas, 481636 não apresentavam códon de terminação.
Todavia, não foi possível selecionar nenhuma combinação que codificasse todos os aminoácidos. Mesmo assim, 240
combinações apresentavam todos aminoácidos exceto triptofano e eram livres de terminadores. Essas 240 combinações
foram recombinadas em combinações de três códons, dado o imenso tempo computacional que seria requerido para
analisar todas as possíveis combinações de três trincas. Foram obtidas 74088 combinações. A freqüência de ocorrência
de aminoácidos nelas foi comparada com a representada na base de dados UniProtKB. Seis combinações apresentaram
os melhores resultados: VNNDNYVWR, VNNVWRDNY, VWRVNNDNY, VWRDNYVNN, DNYVNNVWR e
DNYVWRVNN. Outras seis combinações (não mostradas) forneceram resultados bem próximos. Em conclusão, o
desenho de SScFv com regiões de codificação aleatória determinadas acima fornecerá uma distribuição de aminoácidos
suficientemente próxima da aleatoriedade sem a presença de códons de terminação, permitindo a seleção dos anticorpos
em leveduras com o sistema de duplo-híbrido de triagem líquida.
Agências financiadoras: CNPq e FAPEMIG.
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Atividade de patenteamento
em biotecnologia no brasil: avaliação
dos últimos 10 anos (1996 a 2006)
Drummond, I1; Kalapothakis, E1
Departamento de Biologia Geral – Genética, Instituto de Ciências Biológicas (ICB) Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
[email protected], [email protected]
1
Palavras-chave: Biotecnologia, Propriedade Intelectual
Nos últimos 50 anos, o Brasil desenvolveu habilidades acadêmicas competitivas e avançou significativamente na formação
de recursos humanos qualificados. O país está atualmente na 15ª posição na lista de países que mais publicam artigos
científicos no mundo: 1,92% da produção global. No campo de biotecnologia, especificamente, o país estabeleceu
massa crítica respeitável no decorrer das últimas décadas, estabelecendo relevância mundial em várias áreas, com
destaque para os estudos genômicos e de transgenia. Em fevereiro de 2007, o presidente da república decretou a
Política de Desenvolvimento da Biotecnologia que prevê, entre outras ações, a promoção da cultura da inovação e o
uso estratégico da propriedade intelectual a fim de assegurar maior competitividade à biotecnologia nacional. Neste
sentido, faz-se necessário diagnosticar o estado atual e a evolução da proteção intelectual em biotecnologia no Brasil
de forma a subsidiar ações de desenvolvimento para este setor. Este estudo consistiu no levantamento e análise dos
depósitos de patentes no INPI (Instituto Nacional de Propriedade Industrial) entre os anos de 1996 e 2006 através
do banco de dados on-line do instituto. Para identificação das patentes biotecnológicas foi utilizada a Classificação
Internacional de Patentes (IPC), sistema estabelecido pela OMPI (Organização Mundial da Propriedade Intelectual).
A subclasse C12N foi adotada como mais representativa da biotecnologia moderna, englobando, principalmente, a
engenharia genética e tecnologia do DNA recombinante. Os parâmetros analisados foram: número de depósitos por
ano, número de depósitos por país de origem e perfil dos principais depositantes. Foram depositadas cerca de 3000
patentes no período analisado (1996-2006), mantendo-se uma média de cerca de 300 patentes por ano. Os brasileiros
detêm apenas 5% das patentes nacionais em biotecnologia, indicando forte controle do conhecimento tecnológico
por estrangeiros. Entre os países que mais depositam patentes biotecnológicas no Brasil, o predomínio é dos Estados
Unidos da América, com 45% dos depósitos, seguido pela Alemanha (11%), Japão (7%), França (6%) e Suíça (5%). Em
relação aos depositantes nacionais, as universidades e institutos de pesquisa foram responsáveis pelo maior número de
depósitos, 35% das patentes. Apenas 7% dos depósitos estão em nome de empresas privadas. Este padrão de distribuição
difere enormemente dos depósitos de países como Estados Unidos e Alemanha, no qual as empresas privadas são as
principais detentoras de patentes biotecnológicas. São várias as implicações deste trabalho para o desenvolvimento
do setor brasileiro de biotecnologia, no entanto, dois pontos devem ser enfatizados: (1) o baixo registro de patentes
biotecnológicas domésticas frente à forte produção científica do país neste setor; (2) o confinamento do conhecimento
biotecnológico nas universidades e centros de pesquisa, o que indica a necessidade de desenvolvimento de mecanismos
eficientes de transferência tecnológica e cooperação público/privada.
Apoio Financeiro: Isabela Drummond é bolsista do CNPq ligada ao programa de Pós-Graduação em Genética, Prof.
Evanguedes Kalapothakis é pesquisador IC do CNPq.
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Análise do perfil de expressão de genes
associados à imunidade inata em canade-açúcar durante a interação com
Gluconacetobacter diazotrophicus
Mattos, LP1; Rangel, ALS1; Silva, VA1; Ferreira, BS1; Carneiro Jr., JB 2,; de Souza Filho, GA1
Laboratório de Biotecnologia-CBB-UENF-Campos dos Goytacazes-RJ
Biofábrica- UFRRJ- Campos Leonel Miranda- Campos dos Goytacazes-RJ
[email protected], [email protected]
1
2
A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância econômica devido à relevância de seus principais derivados, álcool
e açúcar. Estudos recentes mostram que plantas de cana-de-açúcar inoculadas com Gluconacetobacter diazotrophificus
apresentam um aumento de produção em torno de 60%. Os mecanismos envolvidos nessa associação ainda não foram
elucidados. Plantas são capazes de reconhecer padrões moleculares associados à microorganismos e ativar o sistema
de defesa. Contudo, microrganismos são capazes de subverter esse sistema para favorecer sua colonização. Análises
“in silico” evidenciam a ativação de genes de defesa em cana-de-açúcar durante a colonização por G. diazotrophicus.
No entanto, plantas de cana-de-açúcar colonizadas por G. diazotrophicus normalmente não apresentam sintomas de
doença. Nesse sentido, o presente trabalho avaliou se G. diazotroficus interfere com o sistema de defesa em cana-deaçúcar atuando na repressão de genes associados à imunidade inata. Para tanto, através de análises “in silico” no banco
de dados “AtGenExpress”, foi possível selecionar genes associados a imunidade inata em Arabidopsis thaliana. Tais genes
foram utilizados para a busca de seus ortólogos em cana-de-açúcar, no banco de dados do projeto SUCEST. Foram
realizados alinhamentos dessas seqüências gênicas utilizando o programa ClustalW e adicionalmente realizadas análises
dos domínios dessas proteínas codificadas com auxílio do programa Smart. Como resultados, foram selecionados os
genes que codificam para quitinase, proteínas quinase, fator de transcrição WRKY17, proteínas quinase ricas em
leucina, entre outros. Com base nas análises “in silico” realizadas dentro do banco de dados AtGenExpress e SUCEST
foram gerados gráficos de expressão gênica. Como resultado foi observado que em A.thaliana os referidos genes são
ativados em resposta a bactéria patogênica Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 após as duas primeiras horas de
infecção e suprimidas após 6 horas de infecção. Sendo também expressos em resposta à 1µM de flg22 e 10µM hrpz.
Contudo, tais genes não são suprimidos na presença da bactéria não hospedada Pseudomonas syringae pv. phaseolicola.
No banco dados SUCEST foi observado que alguns desses genes não apresentavam transcritos nas bibliotecas de cDNA
de plantas inoculadas com G.diazotrophicus. Assim, foram desenhados oligonucleotídeos para os referidos genes de A.
thaliana e seus respectivos ortólogos em cana-de-açúcar. As próximas etapas deste trabalho serão dedicadas à análise da
expressão desses genes através de PCR em tempo Real em plantas de cana-de-açúcar colonizadas com G.diazotrophicus,
Xanthomonas albilineans e Escherchia coli; plantas de A. thaliana infectadas com Pseudomonas syringae pv tomato,
G.diazotrophicus e E.coli.
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Bioinformática e bioquímica computacional
como ferramentas para desenvolvimento
racional de drogas para tratamento
de Leishmanioses
Santos, EA1; Gonzales, ADF1; Moreau, VH1
Núcleo de Biotecnologia -Faculdade de Tecnologia e Ciências – FTC
[email protected]
1
As leishmanioses tegumentar e visceral tiveram uma incidência de 2,123 casos e 543 casos no estado da Bahia em
2003. Sendo o tratamento para essas doenças muito agressivo, por causar muitos efeitos colaterais, o que configura uma
grande taxa de abandono ao tratamento, julgamos que será importante se buscar novos alvos para a ação de drogas que
possam provocar menos efeitos indesejáveis aos indivíduos. Produzir modelos moleculares de enzimas de Leishmania sp.,
importantes para a homeostase destes parasitas, que possam vir a ser utilizadas como alvo para quimioterapia. Produzir
modelos moleculares ab initio de drogas naturais e sintéticas com potencial utilização como inibidores das referidas
enzimas. Estudar, através de Modelagem Molecular e Dinâmica Molecular, a interação das drogas com os sítios ativos da
enzimas de estudo e dinâmica molecular, a interação das drogas com os sítios ativos da enzimas de estudo. Propor, um
estudo baseado nos potenciais de interação droga-enzima, alterações sintéticas nas drogas estudadas a fim de aumentar
a afinidade da droga possivelmente inibidora com o sítio ativo da enzima. Nesse sentido, a busca de proteínas relevantes
para o estudo foi realizada e pode-se notar que proteínas Tripanotiona redutase e Tripanotiona sintetase do protozoário
Leishmania sp. são de suma importância para o parasita, uma vez que estão envolvidas na neutralização de compostos
oxigenados tóxicos (mais especificamente, H2O2) liberados pelo macrófago, durante a infecção por Leishmania sp., o que
nos permitem associar a atividade da enzima à capacidade infectante do parasita. Tais enzimas não apresentam estruturas
armazenadas no banco central de dados utilizados para a busca, National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Essa consulta foi realizada no NCBI, onde a procura por proteínas arquivada é exportada como FASTA e este arquivo
é utilizado no programa de alinhamento de sequências (disponível no NCBI), conhecido como BLAST (Basic Local
Alignment and Search Tool), onde a busca de seqüências homólogas não foram identificadas. As proteínas do tipo
Tripanotiona redutase e Tripationa sintetase de Leishmania sp que já possuem sequências depositadas no NCBI, porém
não possuem estrutura tridimensional depositada: Tripanotiona redutase (TR) de Leishmania donovani, Leishmania
major, Leishmania amazonensis, Leishmania infantum e Leishmania braziliensis. As Tripanotiona sintetase (TS) de
Leishmania major, Leishmania donovani, Leishmania amazonensis, Leishmania infantum. Dessas proteínas listadas,
serão selecionadas das espécies de Leishmania sp que apresentam maior incidência na Bahia. No entanto verificamos que
já foram determinadas as estruturas tridimensionais da Tripanotiona redutase de parasitos do gênero Tripanossoma sp.,
importante dado, já que pertencem à mesma família da Leishmannia, e conseqüentemente, apresentam metabolismo
similar. Tendo a disposição no bancos de dados tais estruturas consiste então a possibilidade de sua utilização como
molde para realizar a modelagem molecular e a dinâmica de proteínas.
Apoio financeiro: FAPESB
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