DUPLICAÇÃO DO DNA OU REPLICAÇÃO DO DNA
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DUPLICAÇÃO DO DNA OU REPLICAÇÃO DO DNA 18/04/2017 1 MITOSE EM CÉLULAS EUCARIÓTICAS 2n A mitose ocorre em células somáticas 1. Intérfase 1.1 Prófase 1.2 Metáfase 1.3 Anáfase 1.4 Telófase 1.4.1 Citocinese 18/04/2017 2 Avaliando as etapas do ciclo celular… INTERFASE a célula não entrou ainda em divisão ! G1 S G2 G = gap (intervalo) S = synthesis (duplicação do DNA) 18/04/2017 3 cromossomo DNA sem histonas (protocélulas) com histonas (eucélulas) fio de cromatina duplicação do DNA espiralização CROMOSSOMO com duas cromátides-irmãs 18/04/2017 4 Os cromossomos contêm os genes que por sua vez são formados por DNA (ácido desoxirribonucleico). Estes genes permitem a transmissão das informações genéticas de geração a geração. 18/04/2017 5 Replicação ou duplicação DUPLICAÇÃO DO DNA ori-C O DNA que tem a sequência ori-C consegue desencadear uma autoduplicação sendo chamado de REPLICON 18/04/2017 7 Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação 18/04/2017 8 Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação Replicon: 1. Origem + Término 2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular 3. O genoma de uma célula procariótica constitue um único replicon 4. Cada cromossomo eucariótico constitue vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente 18/04/2017 9 O genoma eucariótico constitue vários replicons A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/min Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática 18/04/2017 10 A replicação em E. coli tem uma origem apenas Autoradiografias feitas por J. Cairns (1963) em DNA de E. coli tratadas com meio contendo Trimidina comprovaram que a replicação é semiconservativa, bidirecional e que o DNA e circular Nos eucariotos são abertos várias "bolhas de replicação" ou replicons MODELOS DE DUPLICAÇÃO DE TODOS OS MODELOS, O SEMI-CONSERVATIVO REPRESENTA MELHOR O PROCESSO DA TRANSMISSÃO DOS CARACTERES GENÉTICOS MANTENDO A INTEGRIDADE DA ESPÉCIE 18/04/2017 13 A DUPLICAÇÃO DO DNA É SEMICONSERVATIVA 18/04/2017 14 18/04/2017 15 18/04/2017 16 18/04/2017 17 A NATUREZA SEMI-CONSERVATIVA DA DUPLICAÇÃO DA MOLÉCULA DE DNA - Em cada ciclo de replicação, cada uma das duas fitas de DNA é usada como molde para formação da fita de DNA complementar. A fita original do início da replicação permanece intacta através de muitas gerações celulares. 18/04/2017 18 ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS: INÍCIO ALONGAMENTO TÉRMINO 18/04/2017 20 O SITIO DE INICIO DE REPLICAÇÃO DO DNA, DENOMINADO “ORIGEM DE REPLICAÇÃO” (ori-C). (APRESENTA SEQUENCIAS CONSENSO ESPECÍFICAS) 18/04/2017 21 Polimerases de DNA: As enzimas que sintetizam DNA A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3´OH da cadeia em crescimento. O precursor da síntese é o desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato Sentido da síntese sempre é 5’ 3’ A replicação é um processo extremamente fiel. As DNApolimerases tem atividade revisora 18/04/2017 22 AS DNApoli SÃO PRIMERS DEPENDENTES NA DUPLICAÇÃO DO DNA PARTICIPAM TRÊS DNApolimerases ►DNA polimerase I ►DNA polimerase II ►DNA polimerase III 5’ 3’ 3’ 5’ Desnaturação Primase: primers 18/04/2017 23 Fragmentos de OKAZAKI 1. Primers são segmentos de RNAs complementares à fita molde do DNA. 2. Os primers são sintetizados por uma enzima chamada PRIMASE. 3. Os primers têm função de fornecer uma OH livre no carbono 3’ do açúcar para que a DNApoli possa copiar a fita molde. 18/04/2017 24 A cadeia em formação crescer no sentido 5’ para 3’ UM NOVO NUCLEOTÍDEO SÓ PODE ENTRAR NA EXTREMIDADE 3’ 18/04/2017 25 Sentido da duplicação 18/04/2017 26 FUNÇÕES DAS DNApoli ►A DNApoli I – retira os primers da fita molde e polimeriza o local onde estavam os primers com nucleotídeos de DNA. Participa também do processo de reparação do DNA. ►A DNApoli II – a sua função ainda não é muito bem definida, porém consegue copiar fita molde de DNA quando é requisitada. ►A DNApoli III – age nas forquilhas de duplicação polimerizando de 5’ para 3 ’ e revisão editorial de 3’ para 5’. 18/04/2017 27 Proteínas presentes na forquilha de Replicação de E.coli SSB Liga a fita simples de DNA DnaB (helicase) Desenrola o DNA Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA DNA Polimerase III Sintese da fita nova DNA Polimerase I Preenche as lacunas e excisa os primers DNA Ligase Liga os fragmentos DNA girase Superenrolamento 18/04/2017 28 PROTEÍNAS SSB Proteínas Estabilizadoras de fita Simples 18/04/2017 29 Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas Pol I + + + PolII + + - Número de subunidades Tamanho em kDa 1 103 4 90 10 ~900 Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1000 Polimerização 5’ 3’ Exonuclease 3’ 5’ Exonuclease 5’ 3’ Processividade 3-200 (nt adicionados antes da dissociação do molde) 1500 PolIII + + - 500000 18/04/2017 30 DNA-polimerase III é uma holoenzima de mais de 10 cadeias de estrutura dimérica 18/04/2017 31 A subunidade Beta da DNApolimerase III envolve o duplex das fitas-filhas 18/04/2017 32 ORIGEM E SENTIDO DA DUPLICAÇÃO ● Unidirecional Uma forquilha ● Bidirecional Duas forquilhas 18/04/2017 33 A replicação do cromossomo circular 18/04/2017 34 18/04/2017 35 O complexo de replicação A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas O primossomo afasta uma das fitas molde Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas 18/04/2017 36 18/04/2017 37 Duplicação da fita lider e da retardada 18/04/2017 38 Forquilha de duplicação Ação das DNApoli Sentido da duplicação Desnaturação 3’ Primase 5’ A primase sintetiza os primers complementares à fita molde do DNA. Primer é um oligonucleotídeo de RNA complementar a fita molde. A função do primer é fornecer uma OH livre no C3 do açúcar para a DNApoli. 18/04/2017 39 Forquilha de duplicação Ação das DNApoli Sentido da duplicação Desnaturação 3’ DNApoli III 5’ A DNApoli III POLIMERIZA A PARTIR DA EXTREMIDADE 3’ DOS PRIMERS, ONDE TEM UMA OH LIVRE, A FITA CONTÍNUA E A DESCONTÍNUA 18/04/2017 40 Forquilha de duplicação Ação das DNApoli Sentido da duplicação Desnaturação 3’ 5’ A DNApoli I RETIRA OS PRIMERS DE AMBAS AS FITAS E POLIMERIZA OS ESPAÇOS COM NUCLEOTÍDEOS DE DNA 18/04/2017 41 Forquilha de duplicação Ação das DNApoli Sentido da duplicação Desnaturação 3’ 5’ A DNApoli I RETIRA OS PRIMERS DE AMBAS AS FITAS E POLIMERIZA OS ESPAÇOS COM NUCLEOTÍDEOS DE DNA 18/04/2017 42 Forquilha de duplicação Ação das DNApoli Sentido da duplicação Desnaturação 3’ 5’ A DNA ligase EMENDA OS SEGMENTOS SINTETIZADOS PELA DNApoli III COM OS SEGMENTOS SINTETIZADOS PELA DNApoli I 18/04/2017 43 Forquilha de duplicação Ação das DNApoli Sentido da duplicação Desnaturação 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ A DUPLICAÇÃO FOI COMPLETADA, TEMOS DUAS MOLÉCULAS DE DNA E A CÉLULA ENTRA NA FASE G2 DA MITOSE 18/04/2017 44 Seqüenciamento automático 18/04/2017 46 fragmentos com corante fluorescente 18/04/2017 47 18/04/2017 48 Ação Gênica Replicação Transcrição Tradução Incorporação de genes • inclusão de genes de um retrovírus (oncogenes) RNA Três tipos de RNA: Mensageiro Transferência, transportador ou solúvel Ribossômico Os diferentes tipos de RNA permitem a expressão fenotípica do DNA: • RNA mensageiro ou RNAm sintetizado nos eucarióticos a partir do DNA, que se encontra no núcleo. Passa ao mensagem do DNA. citoplasma levando a Complementaridade de bases RNAt RNA de transferência, transportador ou tRNA – São cadeias menores do que os RNAm ou RNAr, formados por cerca de 70 a 80 nucleotídios em seqüências fixas para cada AA. RNAt RNAm RNAr RNA ribossômico ou RNAr – atua como elemento estrutural básico e local de realização da síntese protéica (formam os ribossomos) Linguagem Genética: Informação genética •seqüência de nucleotídeos relacionada à expressão de um fenótipo qualquer Código Genético •modo pelo qual os aminoácidos se relacionam nucleotídeos e os Sinais genéticos –seqüências especiais de nucleotídeos •sinais de transmissão da informação genética: –origem de replicação -oriC –região do centrômero (segregação dos cromossomos) •sinais de expressão da informação genética - regiões promotoras –TATA boxes - regiões de regulação –códons de término ? Gosto de gente porque são seres inacabados. “Paulo Freire” CONTINUAREMOS.....APÓS UM INTERVALO...... 18/04/2017 61 VOLTAREMOS....... Transcrição • É a síntese do RNAm a partir do DNA por ação de enzimas específicas. • Para tal se faz necessário o respectivo estímulo à célula. Transcrição em Procariontes a) síntese de mRNA: Transcrito primário •procariotos Transcrição em Eucariontes a) síntese de mRNA Transcrito primário • eucariotos RNA Nuclear heterogêneo (hnRNA) Nos eucariotos, o RNAm deve ser processado no núcleo antes de ser transferido ao citoplasma: Exons – seqüências codificadoras que formarão o RNA maduro. Íntrons – seqüências não codificadoras removidas ainda dentro do núcleo. • Para formar o RNAm maduro, o nhRNA sofre ação de várias enzimas que realizam a retirada dos íntrons por um mecanismo conhecido como “emenda” ou “splicing”. 1. A TATA-binding protein liga-se à TATA-box. 2. O TFIIB liga-se à TATA-protein e recruta o complexo TFIIF-RNA polimerase II. 3. O TFIIF liga-se à RNA polimerase II e ao TFIIB, e alinha a polimerase no promotor. 4. O TFIIE recruta o TFIIH e possui atividade de helicase. 5. O TFIIH desenrola o DNA na região do promotor e fosforila a RNA polimerase, ativando-a. 6. Após a síntese de um polinucleotídeo (60-70pb), o TFIIH e o TFIIE se dissociam do complexo. 7. O RNA é alongado pela ação de fatores alongamentoe, após a término da transcrição, a RNA polimerase é defosforilada e inativada. Detalhe do quepe 7metil-GTP na terminação 5´ do RNAm Ao RNA recém sintetizado, é adicionado o quepe de 7-metil-GTP na extremidade 5’. A cauda poli(A) na extremidade 3´ do RNAm de eucariontes 5´-quepe AAAAAAAAAA(n) Entre 20 e200 nucleotídeos da adenina Ainda durante a transcrição, a molécula de RNA é clivada entre 10 e 20 nucleotídeos após uma seqüência de poliadenilação AAUAAA. Neste ponto, é adicionado ao RNA transcrito a cauda poli A O mRNA recém transcrito é denominado RNA nuclear heterogênio (hnRNA). Para ser convertido no mRNA propriamente dito, o hnRNA precisa ter os seus introns removidos. hnRNA 5´quepe mRNA 1 5´quepe 2 1 2 3 3 4 4 poli (A) poli (A) Os introns são seqüências de nucleotídeos que não codificam aminoácidos. Um intron inicia com uma seqüência 5’-GU e termina com uma seqüência 3’-AG exon 5’ quepe intron AGGU exon AGGU 3’-poli(A) O processo de emenda dos exons (retirada de introns) conta com a participação dos snRNA. Por serem ricos em uracila, são identificados com a letra U seguida de um número. U1 nhRNA Exon1 GU AG Exon2 A U2 U5 U4 U6 U1 U6 UG A U4 U5 AG U2 spliceossomo Exon1 Exon2 mRNA hnRNA Um spliceossomo O mRNA formado, liga-se a proteínas, sendo exportado para o citoplasma, através de poros na membrana nuclear. Inibidores da Transcrição Algumas drogas podem inibir a síntese de RNA: Rifampina: inibe a RNA polimerase bacteriana Actinomicina D: contém um pentapeptídeo que liga-se aos sulcos do DNA, impedindo que este sirva como molde para a replicação e transcrição A Transcriptase Reversa A transcripase reversa utiliza um RNA viral como molde para sintetizar um fita de DNA. A DNA polimerase da célula hospedeira sintetiza uma cópia do DNA formado. A RNA polimerase da célula hospedeira realiza a transcrição, e o RNA formado é o genoma do novo vírus. A transcrição, apesar de análoga à replicação, difere em alguns pontos: a replicação envolve toda a molécula de DNA; a transcrição envolve apenas a parte da molécula de DNA que necessita ser transcrita; na replicação, ocorre a abertura de toda a molécula do DNA; na transcrição ocorre abertura de parte da molécula de DNA que será transcrita; replicação, ambas as fitas do DNA servem de modelo; na transcrição apenas uma fita do DNA (a fita modelo ou molde) serve de modelo para a síntese do RNA. A outra não possui codificação genética. Processamento do RNA Após a transcrição, é desfeito o complexo transcricional e o RNA sintetizado irá rumar para o local de sua atividade fisiológica: mRNA e tRNA para o citoplasma e rRNA primeiramente para o nucléolo e após para o citoplasma, já como parte integrante do ribossomo. ATÉ A PRÓXIMA AULA SOBRE TRADUÇÃO. POR ENQUANTO AGRADEÇO A ATENÇÃO DE TODOS! E BOM ESTUDO!
