Replicação do DNA Prof. Dr. Francisco Prosdocimi Mitose / Meiose Como acontece a síntese do DNA? Meselson-Stahl experiment • 1957 • Cresceram E. coli em meio com N-15 e depois voltaram pra N-14 • Purificação do DNA das bactérias • Três tipos de DNA – N-15 + N-15 – N-15 + N-14 – N-14 + N-14 • Ao aquecer o N-15 + N-14 e separar as fitas ficava claro que uma fita continha N-15 e outra N-14 Replicação semi-conservativa Origens de replicação • Locais com um contexto de sequência específico • Ligam proteínas específicas • Quando acionadas, essas proteínas permitem o início da replicação Origens de replicação Replicação • DNA Polimerase III • Sentido 5’ → 3’ • Nucleotídeos 3P são adicionados – Liberação de Pirofosfato http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf Primase • Ribonucleoproteína • Liga-se à helicase em procariotos formando o chamado primossomo • Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases; fornece 3’ OH • DNA polimerase lenta e sujeita a erros • Evita a progressão da forquilha uma vez que a fita líder anda mais rápido Micrografia, bolha de replicação Forquilhas de replicação Forquilha de replicação Replicação das fitas • Fita líder – Primase age uma vez • Fita retardada – Primase age várias vezes – 1967, Fragmentos de Okasaki Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism of DNA replication possible discontinuity of DNA chain growth. Jpn J Med Sci Biol. 1967 Jun;20(3):255-60 Primase na fita retardada • Deslocamento da forquilha de replicação • Primase faz primer Direções de replicação na Forquilha Desenovelamento do DNA • Retirada das histonas • Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs) • DNA helicase – Quebra pontes de H • DNA topoisomerases – Tiram a tensão Forquilha de replicação Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua) DNA polimerase • Enzimas que catalisa a reação de síntese do DNA • Adiciona nucleotídeos trifosfato à extremidades 3’OH livre • Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’>3’ (endonuclease 5’>3’) • Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3’OH livre) • Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3’>5’) Tipos de DNA polimerase • DNA polimerase I – Descoberta em 1956 (Kornberg pai) – Função precisa descoberta apenas em 1969: remove o primer de RNA da fita descontínua • DNA polimerase III – Descoberta em 1970 (Kornberg filho) – Principal enzima que realiza a replicação em procariotos • DNA polimerase II – Lenta, envolvida em reparo do DNA DNA Replication • DNA Pol precisa de um molde inicial • Primase: gera um molde de RNA complementar • A DNA Pol III agora é capaz de adicionar bases à extremidade 3’OH Eliminação dos fragmentos de Okasaki DNA Pol I Mecanismo da enzima Ligase Visão geral Repare na posição do primer de RNA Reparo pela Polimerase • Mecanismo de verificação (Proof-reading) • DNA-polimerase possui – Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ – Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’ Reparo pela Polimerase • Mecanismo de verificação (Proof-reading) • DNA-polimerase possui – Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ – Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’ DNA Repair • Checagem de pareamento incorreto (eucariotos) • Proteínas especiais para reparo do erro E as extremidades dos cromossomos? Doenças causadas por problemas no mecanismos de replicação • Ataxia de Friedreich's – dano progressivo no sistema nervoso (problemas musculares, na fala e doenças no coração) – forma mais comum das ataxias herdadas – A seqüência GAATTC se repete, quando existem mais de 40 repetições, o indivíduo apresenta a doença. • Xeroderma pigmentosum – envelhecimento precoce – aumento na incidência de câncer – Falha no mecanismo de reparação do DNA causado pela luz UV Ciclo celular • A replicação do DNA é regulada temporalmente • Fase S do ciclo celular • Checkpoints do ciclo celular • Ciclinas Conclusões • • • • • • • • Replicação semi-conservativa Bolha de replicação avança em duas direções Fita líder e fita retardada Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA Primase faz o primer DNA polimerase III, DNA polimerase I DNA ligase Telomerase