Cat. No. 6407

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INSTRUÇÕES DE USO
HEMAGEN®
DNA - Hemaglutinação
Cat. No. 6407
USO DO PRODUTO
O kit de anti DNA é utilizado para detecção qualitativa e semiquantitativa de anticorpos contra o ácido desoxirribonucléico de dupla
hélice (nDNA ou dsDNA) em soro humano. Para uso diagnóstico “in
vitro”.
RESUMO, EXPLICAÇÃO E PRINCÍPIO DO TESTE
Os anticorpos que reagem com o dsDNA são indicativos de lúpus
eritematoso sistêmico (LES). Estes anticorpos frequentemente aparecem
de forma espontânea no soro de pacientes de LES. A formação de
imunocomplexos DNA/ anti-DNA, os quais podem se depositar em
diferentes tecidos, possuem importância na patogênese do LES. A
avaliação de anticorpos ao dsDNA tem mostrado importância no
diagnóstico e acompanhamento do LES. Estudos mostraram uma
correlação entre títulos de anti-DNA e doença renal lúpica, bem como
medidas seriadas dos seus níveis têm mostrado valor no diagnóstico de
doença ativa e na avaliação da resposta terapêutica.
Muitas técnicas para detecção de anti-DNA estão sujeitas a
interferências. Como exemplo, o DNA pode ligar-se a proteínas séricas
não anticórpicas como o Clq.
Algumas preparações de DNA contém DNA de simples hélice, ou
algumas de suas regiões, que podem se ligar a anticorpos com esta
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especificidade. O kit de DNA utiliza uma preparação de dsDNA que
não mostra interferência contra anticorpos dirigidos contra ácidos
nucléicos de simples hélice. É um kit de fácil utilização e que mostra
resultados rápidos e reprodutíveis com altos níveis de sensibilidade e
especificidade.
Princípio do Teste
Hemaglutinação, radioimunoensaio, ELISA e imunofluorescência são
atualmente os métodos utilizados para detectar os anticorpos anti DNA.
A hemaglutinação oferece altos níveis de sensibilidade e especificidade
na detecção destes anticorpos. Recentemente, a utilização de eritrócitos
humanos associados aos métodos atuais de preparação antigência e
liofilização possibilitaram uma melhora significativa na sensibilidade e
reprodutibilidade deste teste. O teste é baseado na aglutinação de
eritrócitos humanos especificamente sensibilizados com dsDNA.
MATERIAIS FORNECIDOS
 Controle Negativo: 01 (um) frasco de soro humano processado e
liofilizado contendo 0,1% de azida como preservativo.
 Diluente de Células: 01 (um) frasco com 10 ml de água purificada
contendo 0,1% de azida sódica como preservativo. Utilizado para a
reconstituição dos eritrócitos liofilizados e soros controles.
 Diluente de Soros: 01 (um) frasco com 50 ml de solução salina
contendo eosina e 0,1% de azida sódica como preservativo.
 Reagente Celular : 04 (quatro) frascos liofilizados de eritrócitos
humanos O Rh negativo sensibilizados com dsDNA e 0,1% de azida
sódica como preservativo.
 Controle Positivo: 01 (um) frasco de soro humano processado e
liofilizado, contendo 0,1% de azida sódica como preservativo.
 Placas de microtitulações com orifícios em V.
MATERIAIS REQUERIDOS MAS NÃO FORNECIDOS
 Tubos de ensaios para diluição
 Micropipetas de 10 µl a 1,0 ml - variáveis ou fixas.
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Estes materiais podem ser obtidos nas lojas e/ou empresas que vendem
produtos e acessórios para laboratório.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
 Controles Negativo e Positivo: Estáveis em temperaturas de 2 a 8oC
durante 30 dias. As alíquotas podem ser armazenadas congeladas a 20oC por seis meses.
 Diluente de Células: Pode ser estocado à temperatura ambiente ou
refrigerado entre 2 a 8 oC.
 Diluente de Soros: Pode ser estocado em temperatura ambiente ao
abrigo da luz, ou refrigerado entre 2 a 8 oC.
 Reagente Celular: Pode ser estocado em temperatura ambiente ou
refrigerado entre 2 a 8 oC. O material reidratado pode ser estocado
por até sete dias entre 2 a 8 oC.
 Placas de microtitulação: Pode ser estocado em temperatura
ambiente.
CUIDADOS E PRECAUÇÕES
1. Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro.
2. Cada doador utilizado na preparação deste material foi testado por
método aprovado e apresentou-se negativo para anticorpos ao HIV1 e antígeno de superfície da hepatite B. Como nenhum método
pode assegurar completamente a inexistência destes ou qualquer
outro agente infeccioso, o material deve ser manuseado como “capaz
de transmitir doença”.
3. Os reagentes contém azida sódica. Esta pode reagir com chumbo ou
cobre formando azidas metálicas que podem ser explosivas. Quando
desprezar os reagentes, lave com um farto volume de água corrente
para prevenir a formação desta ocorrência.
COLETA, ARMAZENAMENTO E MANUSEIO DA AMOSTRA
As amostras séricas devem ser coletadas sob condições assépticas.
Deixe o sangue total coagular, centrifugue e guarde as amostras de soro
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em refrigerador (2 a 8oC) por sete dias ou congelador (-20oC) por 6
meses. Repetidos congelamentos e descongelamentos das amostras não
são recomendáveis.
Como o soro humano é uma fonte potencial de HIV, vírus da hepatite e
outros agentes infecciosos, todas as amostras devem ser manuseadas
como “capazes de transmitir doença”.
PROCEDIMENTO DO TESTE
O kit de DNA pode ser utilizado para testes qualitativos ou semiquantitativos (titulação). A única diferença nos dois procedimentos é o
número de diluições seriadas feitas para cada amostra. Três cavidades
são utilizadas no teste qualitativo (1:20, 1:40 e 1:80) e 12 cavidades
(1:20 a 1:20.480) para titulações.
A - PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
 Controle Negativo: Reconstituir com 0,3 ml de diluente de células,
pelo menos 30 minutos antes do uso.
 Controle Positivo: Reconstituir com 0,3 ml de diluente de células,
pelo menos 30 minutos antes do uso.
 Reagente Celular: Reconstituir com 1,0 ml de diluente de células.
As células devem ser rehidratadas pelo menos uma hora antes de sua
utilização.
 Estabilize à temperatura ambiente os reagentes previamente
reidratados.
B - TESTE QUALITATIVO
1. Marque cada placa a ser utilizada em grupos de 3 cavidades. Cada
um destes grupos é utilizado para um paciente e cada placa pode ser
usada para até 32 amostras. Para diminuir os efeitos de eletricidade
estática, esfregue o fundo da placa com um pano úmido.
2. Prepare diluições a 1:20 das amostras e controles. 10 µl da amostra
mais 190 µl de diluente de soros ou 20 µl da amostra mais 380 µl de
diluente de soros são esquemas de diluições apropriados.
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3. Coloque 50 µl de diluente de soros nas cavidades 2 e 3 de cada
grupo.
4. Utilizando uma micropipeta de 50 µl, dispense 50 µl de amostra
diluída na cavidade 1. Pipete novamente 50 µl da diluição na
cavidade 2, misture e transfira 50 µl para a cavidade 3, misture e
despreze 50 µl desta cavidade.
5. Repita o passo no.4 para cada amostra ou controle.
6. Resuspenda o reagente celular por agitação leve do frasco (não use
agitador mecânico). Adicione 25 µl do reagente celular às cavidade
designadas para cada ensaio (utilize o gotejador acoplado à seringa).
7. Misture o conteúdo das cavidades por agitação leve da placa,
batendo cada lado da placa contra a palma da mão aberta. Deixe a
placa em repouso em uma superfície horizontal branca e isenta de
movimentos por 90 minutos, leia e expresse os resultados como o
indicado em “Interpretação dos Resultados”.
C - TITULAÇÃO
O procedimento para titulações é similar àquele utilizado para testes
qualitativos. Entretanto, uma fila de 12 cavidades deve ser empregada
para cada ensaio. As diluições seriadas realizadas acima (item 5) devem
ser continuadas até a cavidade de n. 12.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Os resultados são obtidos por observação visual da sedimentação do
reagente celular. O seguinte critério deve ser observado:
 Reação Negativa: Na ausência de anticorpos aglutinantes, os
eritrócitos sedimentam no fundo da cavidade, formando um botão
compacto em um meio claro.
 Reação Positiva: A aglutinação das células por anticorpos presentes
no soro do paciente resulta na formação de um manto que cobre o
fundo da cavidade.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
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1. Os controles positivos e negativos incluídos devem ser empregados
em cada ensaio para confirmar a eficácia dos reagentes celulares.
2. A utilização dos reagentes celulares durante a primeira hora após a
reconstituição pode levar à auto-aglutinação e leituras falsamente
positivas.
3. Os testes aqui descritos requerem uma diluição inicial do soro de
1:20. Resultados obtidos com diluições menores (ex.: 1:5, 1:10) não
possuem significado clínico.
4. Uma proporção anticorpo-antígeno muito alta pode causar
resultados negativos, seguidos por positivos em diluições mais altas.
Este fenômeno é chamado de “prozona” e é bastante raro neste kit
DNA.
5. O significado clínico de qualquer teste depende de sua correlação
com outros dados do paciente. O diagnóstico e acompanhamento de
doenças devem ser baseados em todas as informações relevantes
sobre o paciente.
PROCEDIMENTOS DE CONTROLE DE QUALIDADE
Os controles positivos e negativos incluídos devem ser empregados em
cada ensaio para confirmar a eficácia dos reagentes celulares.
RESULTADOS ESPERADOS
Os níveis de anticorpos circulantes ao dsDNA em pacientes com LES
varia com o curso da doença e com o tratamento. De 60 a 70% dos
pacientes com LES podem apresentar anticorpos ao dsDNA durante as
fases iniciais da doença. Em contraste, pacientes com LES em remissão
ou com tratamento imunossupressor geralmente apresentam um declínio
significante nos níveis deste anticorpo.
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
A - Especificidade:
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Para demonstrar a especificidade do antígeno, o kit de DNA foi testado
contra um painel de soros de referências secundários contendo outros
auto-anticorpos que não anti dsDNA, mostrando resultados negativos.
B - Dados Comparativos:
Amostras de 105 indivíduos normais mostraram resultados negativos
quando testados com o kit de DNA. Amostras de 74 pacientes com LES
mostraram uma correlação com Crithidia luciliae de 94%.
C -A análise de precisão do ensaio revelou um CV interensaio de 5,8%
e intraensaio de 8,2%.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Clin. Pathol. 34:1032-1035.
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Clinical usefulness of Crithidia luciliase assay, “Ann Interm
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7 - Sharp GC, Irvin WS, LaRoque RL, Velez C, Daly V, Kaiser AD,
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nuclear antigens with clinical patterns of rheumatic disease
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responsiveness to therapy, “J. Clin. Invest. 50:350-359.
8 - Scott ML, Merrell TG, Ishizaka K. Thornely MJ, Coombs, RRA,
1982, “Comparison of reverse
passive
antiglobulin
hemagglutination with double antibody radioimunoassay for estimation
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9 - Siddle K, Gard T, Thomas D, Granage MP, Coombs RRA, 1984,
Red cell-labelled monoclonal
antibodies for assay of human
chrionic gonadotropin and luteinising hormone by reverse passive
hemagglutination, “J. Immunol. Methods”. 73:169-176.
TERMO DE GARANTIA
Este kit como um todo tem garantia de troca, desde que esteja dentro do
prazo de validade e seja comprovado pela Assessoria Científica da
HEMAGEN DIAGNÓSTICOS de que não houve falhas técnicas na
execução, manuseio do teste e na conservação do produto.
Importado e Distribuído por:
HEMAGEN DIAGNÓSTICOS COM. IMP. EXP. LTDA.
Rua Doutor Diogo de Faria, 109 – Vila Clementino
São Paulo - SP - CEP 04037-000
Fone: (011) 3819-5222. Fax: (011) 3816-7623
CGC: 64.002.686/0001-32
Resp. Técnico: Dhália Gutemberg CRF 07.183 - SP
Fabricado por:
HEMAGEN DIAGNOSTICS ,INC.
9033 Red Branch Road
Columbia, MD 21045 - USA
Fone: (800) 436-2436 ou 617-890-3748
DATA DA REVISÃO DAS INSTRUÇÕES DE USO
Documento Revisado em: - Março de 2014.
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