Detecção e Genotipagem do Papilomavírus Humano

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA
NÚCLEO DE PÓS GRADUAÇÃO E PESQUISA
Detecção e Genotipagem do Papilomavírus Humano (HPV) em
Mucosa Oral de Pacientes do Estado de Sergipe, Brasil
MARIANA GOVEIA MELO RIBEIRO
São Cristóvão
2014
MARIANA GOVEIA MELO RIBEIRO
___________________________________________________
ORIENTADOR: Prof. Dr. Silvio Santana Dolabella
Detecção e Genotipagem do Papilomavírus Humano (HPV) em
Mucosa Oral de Pacientes do Estado de Sergipe, Brasil
Projeto de Pesquisa apresentado ao Programa de
Pós-graduação
em
Biologia
Parasitária
da
Universidade Federal de Sergipe para obtenção
do título de Mestre.
São Cristóvão
2014
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
R484d
Ribeiro, Mariana Goveia Melo
Detecção e genotipagem do papilomavírus humano
(HPV) em mucosa oral de pacientes do Estado de
Sergipe, Brasil / Mariana Goveia Melo Ribeiro ;
orientador Silvio Santana Dolabella. – São Cristovão,
2014.
93 f. : il.
Dissertação (mestrado em Biologia Parasitária) –
Universidade Federal de Sergipe, 2014.
1. Papillomavírus humano. 2. Mucosa bucal Papilomavírus - Sergipe. I. Dolabella, Silvio Santana,
orient. II. Título.
CDU 616.31-006.52(813.7)
RIBEIRO, M.G.M.; DOLABELLA, S.S. Detecção e genotipagem do
Papilomavírus Humano (HPV) em mucosa oral de pacientes do estado de
Sergipe, Brasil.
RESUMO
A infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) é a doença viral sexualmente transmissível
mais prevalente no mundo. Suas infecções podem variar de assintomáticas à indução de
Carcinomas de Células Escamosas. Entre os agentes infecciosos associados ao câncer oral,
tem-se discutido a correlação da infecção por HPV em mucosa oral e o desenvolvimento
e/ou agravamento das lesões. O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência do HPV e
seus genótipos em pacientes com lesão oral e em mucosa oral saudável de usuários e nãousuários de drogas no estado de Sergipe, Brasil. Foram avaliados 39 pacientes com idade
entre 2 e 83 anos, com lesões clinicamente detectáveis na mucosa oral e 106 pacientes com
mucosa oral saudável entre 11 e 79 anos. As amostras foram coletadas por esfoliação da
mucosa oral. Para o controle de qualidade da extração de DNA foi utilizado PCR para
beta-globina. DNA-HPV foi detectado utilizando primers MY09/MY11 e GP5+/GP6+. A
genotipagem foi realizada através de multiplex-PCR com primers específicos para os tipos
virais 6, 16 e 18. Nosso estudo detectou DNA-HPV em todos os tipos de lesões avaliadas.
A prevalência do HPV foi de 76,92% (30/39) nos pacientes com lesões orais. O tipo viral
mais frequente foi o HPV-6, presente em 56,67% (17/30), seguido do HPV-18 em 26,67%
(8/30) e do HPV-16 em 6,67% (2/30). DNA-HPV foi encontrado em 83,02% (88/106) dos
pacientes com mucosa oral sadia. O tipo viral mais frequente foi o HPV-6, presente em
45,45% (40/88), seguido do HPV-18 em 35,23% (31/88) e do HPV-16 em 4,54% (4/88).
Entre usuários de múltiplas drogas 86,67% (52/60) foram positivos e infecções múltiplas
por mais de um tipo viral foram identificadas em 23,08% (12/52) dos indivíduos. Entre os
"não usuários" a taxa de infecção pelo HPV foi de 78,26% (36/46). Desta forma, foi
verificada uma alta ocorrência do HPV em nosso estudo, tanto em lesões orais quanto em
mucosas saudáveis. As taxas de detecção do vírus em cavidade oral variam
acentuadamente no mundo e tornam a relação do HPV com o processo de carcinogênese
oral ainda controversa. Isso faz necessária a realização de estudos adicionais que avaliem o
papel do Papilomavírus Humano no desenvolvimento de lesões na mucosa oral. Há poucos
dados disponíveis sobre a frequência de infecção oral por HPV na população brasileira e
especialmente entre usuários de drogas. Novos estudos sobre a prevalência do HPV entre
usuários de drogas são necessários para melhor compreensão da sua exposição ao vírus e o
desenvolvimento de estratégias de prevenção.
Palavras-chave: Papilomavírus Humano; lesões orais; mucosa oral; PCR; Brasil.
Orientador: Prof. Dr. Silvio Santana Dolabella, Universidade Federal de Sergipe.
RIBEIRO, M.G.M.; DOLABELLA, S.S. Detection and genotyping of
Human Papillomavirus (HPV) in oral mucosa of patients in Sergipe
State, Brazil.
ABSTRACT
Infection with Human Papillomavirus (HPV) is the sexually transmitted viral disease most
prevalent in world. The infections can range from asymptomatic establishment to induction
of squamous cell carcinomas. It has been discussed the correlation of HPV infection and
the development and/or aggravation of lesions in the oral mucosa. The aim of this study
was to evaluate the occurrence of HPV and its genotypes in patients with oral lesions and
in healthy oral mucosa of users and non-users of drugs in the state of Sergipe, Brazil.
Thirty-nine patients aged 2 to 83 years with clinically detectable lesions in the oral mucosa
and 106 patients with healthy oral mucosa between 11 and 79 years were evaluated.
Samples were collected by exfoliating the oral mucosa. For quality control of DNA
extraction beta-globin PCR was performed. HPV DNA was detected using primers
MY09/MY11 and GP5+/GP6+. Genotyping was performed by multiplex-PCR with
specific primers for HPV types 6, 16 and 18. Our study detected the virus in all types of
lesions evaluated. The occurrence of HPV was 76.92% (30/39) in patients with oral
lesions. The most common virus type was HPV-6 in 56.67% (17/30), followed by HPV-18
in 26.67% (8/30) and HPV-16 in 6.67% (2/30). Positive results were found in 83.02%
(88/106) of patients with healthy oral mucosa. The most common virus type was HPV-6 in
45.45% (40/88), followed by HPV-18 in 35.23% (31/88) and HPV-16 in 4.54% (4/88).
Between multiple drug users 86.67% (52/60) were positive and multiple HPV infections
were identified in 23.08% (12/52). At "non-users" the occurrence was 78.26% (36/46). A
high occurrence of HPV was found in the study, both in oral lesions and in healthy
mucosa. Rates of HPV detection in the oral cavity vary markedly in the world and make
the relationship between HPV and oral carcinogenesis still controversial. Additional
studies to evaluate the role of human papillomavirus in the development of lesions in the
oral mucosa are necessary. There are few data available on the frequency of oral HPV
infection in Brazilian population and especially among drug users. Other studies on HPV
prevalence among drug users are needed for a better understanding of their exposure to the
virus and for the development of prevention strategies.
Key-words: Human papillomavirus; oral lesions; oral mucosa; PCR; Brazil.
Orientador: Prof. Dr. Silvio Santana Dolabella, Universidade Federal de Sergipe.
AGRADECIMENTOS
Agradeço inicialmente a Deus por ter me dado forças a cada tropeçada ao longo
desse caminho, muitas vezes colocando pessoas em minha vida sem as quais esses anos
teriam sido muito mais árduos.
A meus pais, Ivanaldo e Sandra, por todo suporte e amor que me deram e por
torcerem confiantemente por cada nova conquista minha durante toda minha vida. Não
tenho dúvidas de que eu não teria conseguido sem vocês sempre me apoiando e
acreditando que eu conseguiria, mesmo muitas vezes sem nem entender direito os assuntos
que eu tanto estudava ou meus horários loucos. A meu irmão, Luiz Antônio, por, com seu
jeito brincalhão, torcer sempre pelos meus novos passos. Muito obrigada, amo muito
vocês!
Ao professor Dr. Silvio Dolabella, não só por ter aceitado me orientar e por ter
abraçado minha linha de pesquisa, mas principalmente por ter se tornado para mim um
exemplo de profissional dedicado e de orientador presente. Muito obrigada por cada
ensinamento e por todo o suporte que me deu ao longo desses anos!
A melhor turma de colegas que eu poderia ter tido no mestrado pela ajuda coletiva a
cada matéria e, sobretudo, pelos risos e brincadeiras que tornaram os exaustivos períodos
de aula algo mais leve e descontraído. Em especial Alda, Aline, Israel, Mércia e Tiago
pelos momentos de comilança e gargalhadas, pelas saudosas sessões de “cine trash” e pela
amizade formada dentro e fora das cercas da UFS.
A todos do Lepat (Laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical), em
especial às minhas queridas “Lab Girls” (Alda, Érica, Letícia, Lynna, Mércia, Polly e
Yrna), pela sempre agradável companhia diária, pelo carinho, pelos almoços e finais de
semana compartilhados na UFS, pelas inúmeras horas de descontração e até mesmo pelas
faxinas mais engraçadas de minha vida. Agradeço aqui a Israel também pela ajuda,
companhia, conversas e companheirismo constantes durante esses anos. Com vocês o
caminho foi mais sorridente e nossa convivência já deixa saudades, obrigada!
Ao professor Dr. Cleverson Trento por ter aberto as portas do Ambulatório de
Diagnóstico Oral do HU-UFS e pelas contribuições dadas ao meu trabalho, sempre
prestativo e sorridente. Agradeço também a toda a equipe e pacientes do ambulatório, em
especial à Vande e à Kátia, pelo acolhimento e por me tratarem de maneira tão afetuosa a
cada novo dia de coleta e a Fábio e Eduardo por toda ajuda e por estarem sempre
interessados em aprender.
À Elaine por ter sido o meu braço direito durante, e mesmo depois, do período de
coletas e por ter confiado em mim em seu turbilhonado período de conclusão de curso e
monografia. Você se tornou para mim um exemplo de carisma, responsabilidade e
dedicação. Obrigada, sobretudo, pela amizade.
Às equipes da Fazenda Bethesda, do Hospital de Cirurgia, do Hospital São José e
novamente do Ambulatório de Diagnóstico oral pela receptividade e por nos acolher em
suas rotinas. Agradeço aqui principalmente aos pacientes que tão prestativamente
aceitaram participar deste projeto e sem os quais este trabalho não existiria.
À professora Drª Márcia Guimarães por ter me recebido no Laboratório de
Imunopatologia da Relação Materno Fetal da Unesp de Botucatu e ter sido de extrema
importância para a conclusão deste trabalho e a todos do LabMatFet por terem me acolhido
tão bem. Agradeço especialmente à Larissa, não só por ter me acompanhado no laboratório
e dividido comigo ansiedades, angústias e comemorações a cada novo gel revelado, mas
por além de tudo ter transformado completamente a sua rotina, me acolhendo com tanto
carinho em sua casa e em sua família desde minha primeira chegada em Botucatu até os
momentos em que voltei para casa. Por esse acolhimento agradeço também ao Juliano, à
Japa, à Fofa e à família da Larissa por terem me feito sentir em casa mesmo quando ainda
nem me conheciam. Muito obrigada!
Ao professor Dr. Alexandre Onofre por ter religado meu interesse pelas análises
clínicas e por, ao me apresentar à citologia oncótica e à infecção celular pelo HPV, ter de
certa forma sido um dos responsáveis pelo caminho que trilhei de minha graduação até este
momento.
Agradeço também a algumas pessoas que indiretamente contribuíram para a
conclusão deste trabalho, mas que foram essenciais em mais essa etapa de minha vida.
À minha avó, Conceição, por todo carinho, por suas orações diárias e pela saudade
mais singela a cada viagem ou período de ausência meu, até mesmo nos mais curtos. A
meus tios e tias, em especial a tia Raquel, tia Lucinha, tio Carlinhos, tia Idália e tio Luiz
pela torcida constante pelo meu sucesso, pela comemoração a cada boa notícia e pela força
nos momentos em que tudo parecia não parar de dar errado. Aos meus primos e primas, em
especial a minhas maguinhas (Aurinha, Karlinha e Sandrinha) e a Riva por estarem sempre
comigo mesmo quando não fisicamente, por todo o amor compartilhado e pelo orgulho que
sempre tiveram a cada conquista minha. A meus priminhos Cadu, Biel, Arthur Felipe,
Lucas, Malu, Larinha e Marina pelo amor mais puro e pela capacidade de me arrancar
sorrisos mesmo nos momentos mais conturbados ao longo desses anos.
Aos amigos que estão comigo desde o Colégio de Aplicação e que se tornaram
parte de minha família, em especial a Jéssica, Geraldo, Alécia, Guilherme, Victor, Igor,
Christian e Bruno, por acompanharem de perto esse meu caminhar, torcendo sempre para
que tudo desse certo e pelo amor mantido desde nossos tempos de criança.
Aos amigos feitos durante a graduação em Farmácia e que até hoje se mantem
presentes em minha rotina pelos incontáveis risos, reuniões, festas e conversas das mais
sérias às mais bobas. Em especial à Carina, Lolô, Fábio, Paty e Glegle. À Cacá pelo
compartilhamento de tristezas e alegrias vividos pelas duas em seus respectivos mestrados
e também na vida e por todos os momentos em que fui acolhida em sua casa como se fosse
minha. À Lolô por estar presente em muitos dos meus momentos mais felizes, loucos e até
mesmo dos mais traumáticos. Aos amigos mais chatos e fofos que alguém pode ter, Paty e
Fabu, e a Glegle por nossos encontros gordos semanais, nossas viagens anuais, nosso riso
fácil, pelas incontáveis conversas sérias e até mesmo pelo direito de implicar com o outro
sem preocupação. Obrigada por sempre me acalmarem, mesmo quando nem era essa a
intenção.
A Diego pela amizade sempre presente em minha rotina, desde meus tempos de
graduação até o mestrado, mesmo com toda a distância geográfica. Obrigada pelas
inúmeras conversas aleatórias, pelos artigos baixados, pelas opiniões trocadas e até mesmo
pelas fotos editadas após pedidos de socorro.
À Larissa pela amizade antiga, pela torcida sincera e empolgada a cada nova notícia
minha ou possibilidade de novo passo, por tantas horas de conversa e inclusive por toda a
implicância com meus horários atípicos de sono e minha produtividade na madrugada.
A Edson, Leo, Gabi, Aldrey, Murilo e Mairla por muitas vezes terem me ajudado a
ficar mais calma quando um experimento ou quase tudo parecia dar problema, pela
companhia constante, pelos incontáveis momentos de gordices e de mazela coletiva e
também pelas comemorações compartilhadas ao longo desses anos.
Agradeço enfim a todos que de alguma forma participaram da construção direta ou
indireta deste trabalho. Muito obrigada!
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS .......................................................................................... x
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................... xi
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... xii
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
1.1. Papilomavírus Humano (HPV) ..................................................................................... 1
1.2. Epidemiologia da infecção por HPV oral ..................................................................... 3
1.3. Fisiopatologia do HPV ................................................................................................. 8
1.4. Diagnóstico do HPV .................................................................................................... 11
1.5. Lesões orais e HPV...................................................................................................... 15
2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 19
2.1. Geral ............................................................................................................................ 19
2.2. Específicos ................................................................................................................... 19
3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 20
3.1. Delineamento do estudo ............................................................................................. 20
3.2. Coleta .......................................................................................................................... 20
3.3. Pesquisa de HPV ........................................................................................................ 21
3.3.1. Extração de DNA .................................................................................................... 21
3.3.2. Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) ................................................................. 21
3.3.3. Visualização dos produtos amplificados ................................................................. 23
3.3.4. Genotipagem ............................................................................................................ 23
3.4. Análise estatística ........................................................................................................ 24
4. ARTIGO 1. ELEVADA OCORRÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO
(HPV) EM LESÕES DE MUCOSA ORAL EM HOSPITAL UNIVERSITÁRIO NO
ESTADO DE SERGIPE, BRASIL ................................................................................ 25
Introdução .......................................................................................................................... 27
Material e métodos ............................................................................................................. 29
Resultados .......................................................................................................................... 32
Discussão ............................................................................................................................ 32
Referências ......................................................................................................................... 35
5. ARTIGO 2. OCORRÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM
MUCOSA ORAL SAUDÁVEL DE USUÁRIOS E NÃO USUÁRIOS DE DROGAS
ILÍCITAS NO ESTADO DE SERGIPE, BRASIL ...................................................... 40
Introdução........................................................................................................................... 43
Material e métodos ............................................................................................................. 44
Resultados .......................................................................................................................... 47
Discussão ............................................................................................................................ 49
Referências ......................................................................................................................... 53
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 61
ANEXOS ........................................................................................................................... 68
Anexo A. Termo De Consentimento Livre Esclarecido – Usuários de drogas .................. 69
Anexo B. Termo De Consentimento Livre Esclarecido – Não usuários de drogas ........... 70
Anexo C. Formulário De Coleta De Dados ........................................................................ 71
Anexo D. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFS .............................................. 72
Anexo E. Normas para Publicação no Periódico Journal of Oral Pathology & Medicine . 73
Anexo F. Normas para Publicação no Periódico PLOS ONE ............................................ 77
x
LISTA DE ABREVIATURAS
CBL – Citologia em Base Líquida
CCE – Carcinoma de Células Escamosas
CCE-CP – Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e Pescoço
CCEO – Carcinoma de Células Escamosas Oral
DEIA – DNA Enzyme Immunoassay
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetracético
HPV – Papilomavírus Humano
HU-UFS – Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe
INCA – Instituto Nacional do Câncer
LEPAT – Laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical
LCR – Região Longa de Controle
NaCl – Cloreto de Sódio
ORF – Fase Aberta de Leitura
pb – Pares de Base
PCR – Reação em Cadeia de Polimerase
pRB – Proteína do Retinoblastoma
RT-PCR – Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
TBE – Tris Boro EDTA
TE-PCR - Reação em Cadeia de Polimerase Tipo Específica
Tris-HCl – Tris Ácido Clorídrico
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Epidemiologia do Papilomavírus Humano em lesões orais diversas ................ 5
Tabela 2 – Epidemiologia do Papilomavírus Humano em mucosa oral saudável fora do
Brasil .................................................................................................................................... 6
Tabela 3–Epidemiologia do Papilomavírus Humano em mucosa oral saudável no Brasil.. 7
Tabela 4 - Principais tipos de HPV relacionados a manifestações clínicas orais.............. 16
Tabela 5 – Sequências de bases dos primers RS42/KM29, GP5+/GP6+, MY09/MY11 e
primers HPV-6, HPV-16 e HPV -18 específicos................................................................ 22
Tabela 1 (Artigo 1) – Prevalências do HPV e seus tipos classificadas de acordo com dados
histopatológicos em pacientes com lesões em mucosa oral no estado de Sergipe, Brasil.. 39
Tabela 2 (Artigo 1) – Prevalências do HPV e seus tipos em pacientes com lesões em
mucosa oral no estado de Sergipe, Brasil, classificadas de acordo com dados clínicos..... 39
Tabela 1 (Artigo 2) – Prevalências do HPV e seus tipos em pacientes com mucosa oral
saudável classificadas de acordo com dados clínicos......................................................... 60
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Mapa genômico do HPV16 (7904 pb) apresentando os promotores precoces
(p97) e tardio (p670) identificados por setas......................................................................... 2
Figura 2 – Fluxograma da patogênese do carcinoma de células escamosas associado a
HPV de alto risco ............................................................................................................... 10
Figura 3 – Gel de agarose a 2% mostrando bandas positivas para HPV usando os primers
GP5+/GP6+ ........................................................................................................................ 13
Figura 4 – Gel de agarose a 2% mostrando amostras positivas para HPV-6 usando
multiplex com primers específicos para os tipos HPV-6, HPV-16 e HPV-18................... 14
Figura 5 – Exemplo do teste de genotipagem Linear Array HPV (Roche Diagnostics)... 15
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Papilomavirus Humano (HPV)
A infecção pelo Papilomavirus Humano (HPV) é uma das doenças sexualmente
transmissíveis virais mais incidentes no mundo (BHARTI et al., 2013, TRISTÂO et al.,
2012; CARVALHO et al., 2010). Nos Estados Unidos, estima-se que diariamente 12 mil
jovens entre 15 e 24 anos são infectados pelo HPV (BHARTI et al., 2013). No Brasil, a
incidência estimada é de 500 mil a 1 milhão de novos casos por ano (TRISTÂO et al.,
2012).
O HPV é um pequeno DNA vírus, não-envelopado, icosaédrico, epiteliotrópico,
que infecta pele e mucosas em diversas regiões do corpo (ZONTA et al., 2012;
ESQUENAZI et al., 2010; XAVIER et al., 2007). Classificado atualmente na família
Papillomaviridae (TRISTÃO et al., 2012), mede aproximadamente 55nm de diâmetro e
possui genoma de dupla fita circular com aproximadamente 8 mil pares de bases que pode
ser dividido em 3 regiões: a região longa de controle (LCR - Long Control Region), a
precoce (E - Early) e a tardia (L - Late) (Figura 1) (ESQUENAZI et al., 2010; ROCHA et
al., 2007; SIMONATO, MIYAHARA, 2007; DOORBAR, 2005) . Através da análise de
seu DNA, aproximadamente 200 tipos de HPV foram identificados de acordo com a
homologia de seu genoma e classificados em alto ou baixo risco oncogênico (XAVIER et
al., 2007; SOUZA JÚNIOR, 2006; SCHWARTZ et al., 1998).
Uma característica dos HPVs é que todas as fases abertas de leitura (ORFs - Open
Reading Frame) localizam-se na mesma fita de DNA, indicando que uma única fita serve
como molde para a transcrição (DOORBAR, 2005; OLIVEIRA et al., 2003).
A região E codifica proteínas regulatórias, incluindo aquelas envolvidas nos
processos de replicação viral e transformação celular (E1 a E7) (SIMONATO,
MIYAHARA, 2007; FEHRMANN, LAIMINS, 2003).
A região L é responsável por codificar as proteínas do capsídeo (L1 e L2)
(SIMONATO, MIYAHARA, 2007; FEHRMANN, LAIMINS, 2003; OLIVEIRA et al.,
2003). A L1 é a principal proteína do capsídeo e representa aproximadamente 80% do total
de proteínas virais. A proteína L2 é importante no processo de empacotamento seletivo do
DNA viral e aumenta a infectividade do vírion (FEHRMANN, LAIMINS, 2003).
2
A LCR não apresenta ORFs e contêm a origem da replicação do DNA e elementos
de controle da transcrição (FEHRMANN, LAIMINS, 2003; OLIVEIRA et al., 2003).
Figura 1- Mapa genômico do HPV16 (7904 pb) apresentando os promotores precoces
(p97) e tardio (p670) identificados por setas. As oito ORFs (open reading frame) estão
indicadas na figura (DOORBAR, 2006).
O vírus infecta a camada basal do epitélio, necessitando de lesões ou microlesões
no tecido epitelial para que ocorra a infecção (RAMSHANKAR, KRISHNAMURTHY,
2013; OLIVEIRA et al., 2003). O HPV foi um dos primeiros vírus a ser relacionado a
neoplasias em seres humanos (VIDAL et al., 2004). Seu mecanismo de integração ao
genoma hospedeiro permanece desconhecido, porém as proteínas E6 e E7 associadas aos
HPVs de alto risco oncogênico tem sido relacionadas à capacidade de transformação e
degradação celular através de ligação e inativação dos genes supressores de tumor p53 e
pRB em indivíduos infectados (TRISTÃO et al., 2012; GHITTONI et al, 2010).
A via sexual é o meio de transmissão mais comum do HPV; porém, acredita-se que
na infecção oral o contágio ocorra principalmente por auto inoculação a partir de lesões
cutâneas ou genitais já existentes, havendo também a possibilidade de transmissão vertical
3
materno-fetal (SIMONATO, MIYAHARA, 2007; XAVIER et al., 2007; SOUZA
JÚNIOR, 2006). Embora não se conheça por quanto tempo o vírus resiste fora do
hospedeiro, considera-se que a infecção por objetos contaminados possa ser viável por um
curto período de tempo e que mulheres e crianças sem atividade sexual também são alvos
para o desenvolvimento da infecção (GROSS, BARRASSO, 1999).
1.2. Epidemiologia da infecção por HPV oral
As taxas de detecção do HPV em lesões na cavidade oral reportadas na literatura
variam acentuadamente em todo o mundo, indo de 0% a 100%. Enquanto estudo
desenvolvido no Senegal detectou a presença do HPV em apenas 3,4% dos tumores
analisados, em revisão sistemática de 60 estudos que utilizaram a PCR para detecção do
HPV em cânceres de cabeça e pescoço, observou-se a presença do vírus em 25,9% dos
tumores avaliados, sendo 35,6% nos casos de acometimento da orofaringe e 23,5% nos de
cavidade oral (NDIAYE et al., 2013; QUINTERO et al., 2013). Essa variação acentuada
nas taxas de detecção de HPV em lesões orais é comum a vários estudos e se deve a
diferenças nos métodos utilizados, variações etnogeográficas entre as populações estudadas
ou até mesmo pequeno número de amostras analisadas, o que dificulta uma melhor
comparação entre os resultados apresentados (Tabela 1) (FELLER et al., 2010; VENTURI
et al., 2004). Uma predominância do HPV-16 nos tumores associados ao vírus também foi
consenso nos estudos realizados, com uma prevalência de 68,2% dos casos localizados na
cavidade oral, seguido pelo HPV-18 com prevalência de 34,1% em tumores nesta
localidade.
Em pesquisa realizada na Colômbia, o HPV foi encontrado em 18,9% dos casos de
Carcinomas de Células Escamosas (CCE) de cabeça e pescoço diagnosticados entre 1999 e
2008, sendo identificado em 23,9% dos tumores localizados na cavidade oral. Nesse
estudo, o HPV-16 foi o mais freqüente, sendo encontrado em 82% dos casos HPV
positivos (QUINTERO et al., 2013).
Trabalhos realizados na Europa encontraram taxas que vão de 25,3% a 87,5% de
casos HPV positivos em lesões cancerígenas e pré-cancerígenas. Na Inglaterra, Elamin et
al. (1998) detectaram material genético do HPV em 45% das amostras avaliadas em seu
estudo, sendo as prevalências relativas de 50% nos casos de CCEO e 33% em lesões précancerígenas. Pesquisa realizada na Itália por Termine et al. (2012) encontrou prevalência
4
de 25,3% em pacientes com CCEO, enquanto Morbini et al. (2012), neste mesmo país,
obtiveram 87,5% de positividade em amostras de CCE e displasias.
Nos Estados Unidos, taxas que variaram entre 26% e 78,3% de positividade para
HPV foram encontradas. Em 1998, Schwartz et al. encontraram 25,8% de positividade em
casos de CCEO com 67,2% das amostras HPV positivas possuindo DNA de HPVs de alto
risco. Black et al. (2010) obtiveram 56% de casos positivos em CCE de cabeça e pescoço,
com o HPV-16 como o tipo mais prevalente. Smith et al. (2012) encontraram prevalência
de HPV de 26% em tumores de cabeça e pescoço, com 35,9% de positividade em casos na
cavidade oral e de 64,2% na região orofaríngea. Em estudo realizado por Jordan et al.
(2012), detectou-se a presença de HPV em 78,3% de 233 amostras de CCEO e o HPV-16
em 90,8% dos casos HPV-positivos.
No Brasil, taxas que variam entre 0% e 80% tem sido relatadas no estado de São
Paulo. Rivero e Nunes (2006), utilizando somente os primers GP5+/GP6+, encontraram
todas as amostras negativas entre 40 casos de CCEO analisados. Já Acay et al. (2008)
obtiveram 24% de positividade utilizando a técnica de hibridização in situ em 50 casos de
lesões orais envolvendo leucoplasias, displasias e CCEO. Outro estudo, realizado neste
mesmo estado por Miyahara et al. (2011) detectou 33,7% de amostras positvas entre 83
casos de CCEO com material parafinado.
Assim como em casos de lesões orais, taxas variáveis da infecção pelo HPV tem
sido reportadas em trabalhos realizados em mucosa oral saudável (Tabela 2) sugerindo o
funcionamento
desta
como
reservatório
do
vírus
(GILLISON
et
al.,
2012;
KRISTOFFERSEN et al., 2012; DURZYHSKA et al., 2011; TURNER et al., 2011).
Em estudo populacional conduzido nos Estados Unidos entre 2009 e 2010, a
prevalência de HPV foi de 6,9%, com 3,7% das infecções assintomáticas por HPV de alto
risco e 3,1% por HPV de baixo risco oncogênico (GILLISON et al., 2012). Nesse mesmo
país, Turner et al. (2011) obtiveram 2,6% de positividade, todos para o HPV tipo 16, em
amostras de saliva. Por sua vez, Mbulawa et al. (2014) encontraram prevalência de 8,4%
ao pesquisar fatores de risco para o HPV oral em casais africanos. Trabalho realizado por
Durzunska et al. (2011) encontrou DNA de HPV em mucosas sadias de 1,08% de crianças
e adolescentes poloneses, enquanto em estudo conduzido no Paquistão 24,5% dos
indivíduos analisados foram HPV positivos (GICHKI et al., 2012).
5
Tabela 1 – Epidemiologia do Papilomavírus Humano em lesões orais diversas
AUTOR/ANO
País
Tipos de lesão
Material
avaliado
Técnica
detecção
de Nº total
Prevalência
Tipos de HPV
Rivero e Nunes, 2006
Brasil
CC EO
Tecido parafinado
Tecido fresco
GP-PCR
23
0%
-
Ndiaye et al, 2013
Mravak-Stipetic et al., 2013
Senegal
Croácia
Tecido parafinado
Raspado
Quintero et al., 2013
Colômbia
CCE-CP
Lesões variadas
em mucosa oral
CCE-CP
Acay et al., 2008
Brasil
Tecido parafinado
Termine et al., 2012
Itália
Leucoplasias e
CCEO
CCEO
PCR + DEIA
MY-PCR + TEPCR
GP-PCR
+
hibridização
Hibridização in
situ
Linear Array
17
117
254
0%
3,4%
17,7%
175
18,9%
16, 35, 45
6/11, 16, 31, 33, 52, 58, não
tipado
16, 18
50
24%
6/11, 16/18, 31/33, não tipado
83
25,3%
284
25,8%
Tecido parafinado
MY-PCR + TEPCR
MY/GP-PCR
6, 16, 18, 23, 33, 35, 39, 66,
não tipado
6/11, 16, 18, 31/33
Schwartz et al., 1998
Estados Unidos
CCEO
Raspado
Kristoffersen et al., 2012
Noruega
Elamin et al., 1998
Inglaterra
Sugiyama et al., 2003
Japão
Black et al., 2010
Jordan et al., 2012
Morbini et al., 2012
Estados Unidos
Estados Unidos
Itália
Leucoplasias e
CCEO
Displasias e
CCEO
Displasias e
CCEO
CCE-CP
CCEO
Displasias e
CCE-CP
100
40%
6, 11,não tipado
Tecido fresco
MY/GP-PCR
40
45%
6, 16
Tecido parafinado
TE-PCR
137
51,82%
16, 18
Tecido parafinado
Tecido parafinado
Raspado
Linear Array
Linear Array
Linear Array
16
233
56
56%
78,96%
87,5%
6, 16, 69
6/11, 16, 18, 33, 35, 51, 58
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39,
40, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 59,
66, 69/71, 74
Tecido parafinado
Raspado
CCEO - Carcinoma de Células Escamosas da Cavidade Oral; CCE-CP - Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e Pescoço; PCR - Reação em Cadeia da
Polimerase; DEIA - DNA Enzyme Immunoassay; TE-PCR - Reação em Cadeia de Polimerase Tipo Específica.
6
Tabela 2 – Epidemiologia do Papilomavírus Humano em mucosa oral saudável fora do Brasil
AUTOR/ANO
Durzynska et al., 2011
País
Polônia
Método de coleta
Enxaguatório bucal
Técnica de detecção
MY-PCR
Nº total
4.150
Prevalência
1,08%
Tipos de HPV
6, 11, 12, 57
Turner et al., 2011
Estados Unidos
Saliva
TE-PCR
151
2,6%
16, 18
Mravak-Stipetic et al., 2013
Croácia
Esfoliação
MY-PCR
73
6,8%
Não tipado
5.501
6,9%
6, 16, 18, 31, 33, 35, 39,
+ TE-PCR
Gillison et al., 2012
Estados Unidos
Enxaguatório bucal
Linear Array
42, 45, 51, 52, 53, 55, 56,
59, 61, 62, 66, 68, 72, 81,
84, 89
Mbulawa et al., 2014
África do Sul
Esfoliação
Linear Array
442
8,4%
11, 16, 31, 33, 35, 42, 51,
52, 53, 58, 59, 55, 61, 62,
69, 71, 72, 81, 84, 89
Kero et al., 2012
Finlândia
Esfoliação
MY/GP- PCR
131 - 106
18,6% - 31,1%
6, 11, 16, 18, 33, 43, 66,
70, 82
Gichki et al., 2012
Tailândia
Esfoliação
RT-PCR
192
24,5%
16, 18
Sugiyama et al., 2003
Japão
Tecido parafinado
TE-PCR
44
36%
16
Kristoffersen et al., 2012
Noruega
Esfoliação
MY/GP-PCR
50
56%
6, 11, 16, não tipado
RT-PCR – Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real; TE-PCR – Reação em Cadeia de Polimerase Tipo Específica.
7
Tabela 3 – Epidemiologia do Papilomavírus Humano em mucosa oral saudável no Brasil
AUTOR/ANO
Estado
Método de coleta
Técnica de detecção
Nº total
Prevalência
Tipos de HPV
Esquenazi et al., 2010
Rio de Janeiro
Esfoliação
MY/GP - PCR
100
0%
-
Machado et al., 2014
Mato Grosso do Sul
Esfoliação
PGMY-PCR + RFLP 514
1,3%
6, 11, 52, 53, 89
+ TE-PCR
Cavenaghi et al., 2013
São Paulo
Bochecho
Linear Array
145
2,4%
55, 58
Marques et al., 2013
Distrito Federal*
Esfoliação
GP-PCR
64
3,12%
Genotipagem não realizada
Tristão et al., 2012
São Paulo
Esfoliação
MY-PCR
125
23,2%
Genotipagem não realizada
Araújo et al., 2014
Pará
Esfoliação
MY-PCR + RT-PCR
166
24,1%
6, 18, 58
Brasil et al., 2013
Pernambuco
Esfoliação
MY-PCR
62
54%
Genotipagem não realizada
Zonta et al., 2012
São Paulo
Esfoliação
MY-PCR + RFLP
27
81,48%
16, 18, 39, 58, 59, não identificado
RT-PCR – Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real; TE-PCR – Reação em Cadeia de Polimerase Tipo Específica.
8
No Brasil (Tabela 3), pesquisa realizada com jovens universitários no Rio de
Janeiro não detectou infecção por HPV em nenhuma das amostras de raspado de mucosa
oral sadia (ESQUENAZI et al., 2010). Entretanto, estudo de Tristão et al. (2012) no estado
de São Paulo obteve prevalência de 23,2% em mucosas saudáveis. Araújo et al. (2014), no
estado do Pará, encontraram 24,1% de positividade em suas amostras utilizando apenas os
primers MY09/MY11.
Ao mesmo tempo, em estudo realizado em uma casa prisional de São Paulo com a
associação da técnica de PCR e enzimas de restrição, Zonta et al. (2012) detectaram o
HPV em 85,18% de amostras de mucosa oral saudável em mulheres presas que possuíam
lesões cervicais e, dessas, 81,48% apresentam-se infectadas por HPV de alto risco
oncogênico. Brasil et al. (2013) detectaram prevalência do vírus de 54% em mucosa oral
sadia de mulheres cujos parceiros possuíam lesões de pênis relacionadas ao HPV.
Pesquisas comparativas da presença do HPV em mucosas orais, com lesão e sadias
tem sido realizadas em todo o mundo. Sugiyama et al. (2003), avaliando apenas a presença
dos tipos virais 16 e 18, obtiveram 36%, 61% e 35% de casos positivos em amostras de
mucosa sadia, displásica e casos de CCEO, respectivamente, no Japão. Estudo realizado na
Noruega detectou prevalências de 64% em leucoplasias e de 16% e 56% em amostras de
CCEO e de mucosa saudável, respectivamente (KRISTOFFERSEN et al., 2012).
1.3. Fisiopatologia do HPV
As infecções pelo HPV podem variar do estabelecimento de formas assintomáticas
à indução de cânceres de células escamosas (ARIRACHAKARAN et al., 2013; UPILE et
al., 2012). Em sua maioria, os indivíduos infectados apresentam infecções subclínicas e
livram-se naturalmente do vírus sem saber sequer que já foram expostos a ele (BHARTI et
al., 2013; UPILE et al., 2012). Porém, uma pequena parcela de indivíduos desenvolve
desde lesões benignas até certos cânceres relacionados ao vírus (UPILE et al., 2012;
BEUTNER, TYRING, 1997).
Não se sabe ao certo qual a base molecular das infecções subclínicas, contudo
acredita-se a resposta imune do hospedeiro e a quantidade de proteínas virais produzidas
são fatores limitantes da infecção e contribuem significativamente para seu estado de
latência (ARIRACHAKARAN et al., 2013; BEUTNER, TYRING, 1997).
9
As replicações e transcrições virais estão diretamente relacionadas ao grau de
diferenciação da célula infectada (BEUTNER, TYRING, 1997). Inicialmente, uma
partícula viral penetra em células da camada basal e também em células indiferenciadas em
divisão do epitélio, nas quais apenas genes precoces são transcritos. Nas camadas mais
superficiais do epitélio ocorre a expressão de genes tardios do vírus, com replicação do
DNA e a produção de novas unidades virais (OLIVEIRA et al., 2003; BEUTNER,
TYRING, 1997).
A replicação do DNA viral ocorre exclusivamente no núcleo da célula hospedeira
para todos os tipos de HPV. Demonstrou-se que em lesões malignas associadas aos tipos
virais 16 e 18 de alto risco oncogênico, o DNA viral normalmente encontra-se integrado ao
genoma hospedeiro, enquanto em lesões benignas o DNA viral se apresenta e se replica na
forma episomal (FELLER et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2003; BEUTNER, TYRING,
1997).
Alguns fatores são essenciais ao início do desenvolvimento de tumores, como
alterações em genes que controlam a progressão do ciclo celular e genes que trabalham no
reparo do DNA (FELLER et al., 2010). Vários vírus são conhecidos por serem associados
ao desenvolvimento de tumores. Essa capacidade de transformação de alguns vírus está
relacionada à interferência de proteínas virais no controle de mecanismos de replicação
celular (UPILE et al., 2012).
Carcinomas de células escamosas associados aos HPVs de alto risco expressam em
suas células as proteínas virais E6 e E7 (FELLER, LEMMER, 2012; UPILE et al., 2012;
FELLER et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2003). As ações dessas oncoproteínas se
complementam e, quando associadas, promovem a instabilidade genômica que predispõe à
malignidade das células do hospedeiro através da inativação de mecanismos de controle do
ciclo celular e da apoptose (Figura 2) (FELLER et al., 2010).
10
Figura 2 – Fluxograma da patogênese do carcinoma de células escamosas associado a HPV
de alto risco (adaptado de FELLER et al., 2010).
A principal atividade da proteína E6 de HPVs de alto risco é a degradação do gene
supressor de tumor p53, o qual está diretamente relacionado à retenção da progressão do
11
ciclo celular da fase G1 para a fase S. Interferências no gene p53 levam ao acúmulo de
DNA danificado, elevação da proliferação celular e sobrevivência celular prolongada
(RAMSHANKAR, KRISHNAMURTHY, 2013; FELLER et al., 2010; OLIVEIRA et al.,
2003). A oncoproteína E7, por sua vez, se liga ao gene do Retinoblastoma (Rb), supressor
de tumor e apoptose, inativando-o e induzindo a transição do ciclo celular para a fase S.
Isso causa ativação de mecanismos de síntese de DNA e replicação celular que se
encontram inativos em células epiteliais maduras saudáveis, gerando crescimento celular
patológico (FELLER et al., 2010; SIMONATO, MIYAHARA, 2007; OLIVEIRA et al.,
2003).
Na ausência da proteína E6 de HPVs de alto risco, a proteína E7 causa índices
aumentados de p53, levando a respostas apoptóticas, sendo necessárias as atividades de
indução da sobrevivência celular da oncoproteína E6 para que os efeitos patológicos da
proteína E7 sejam mantidos (FELLER et al., 2010; MUNGER, HOWLEY, 2002).
1.4. Diagnóstico do HPV
O diagnóstico da infecção pelo HPV pode ser realizado através de métodos não
moleculares e moleculares. Os métodos não moleculares incluem a inspeção visual por
histopatologia, detectando alterações cito e histopatológicas resultantes da infecção pelo
vírus, sendo assim considerados métodos indiretos. Os métodos moleculares, denominados
métodos diretos, detectam a presença do genoma do HPV ou seus transcritos na amostra
clínica (IARC, 2007).
A citologia convencional foi introduzida na década de 1940 no screening do câncer
cervical, com 68% de sensibilidade na detecção de qualquer alteração citológica. No fim
do século passado, a Citologia em Base Líquida (CBL) começou a ser utilizada, possuindo
vantagens sobre a citologia convencional como diminuição do número de amostras
insatisfatórias e aumento na taxa de detecção de anormalidades citológicas (SANGKARAT
et al., 2014). Apesar de inicialmente utilizada apenas na ginecologia, a CBL tem sido
usada na avaliação patológica de diversos outros órgãos, assim como para outros métodos
não citológicos como testes de biologia molecular e genotipagem de HPV (IMURA et al.,
2014).
Atualmente não há normas estabelecidas internacionalmente de detecção do HPV
em cânceres de cabeça e pescoço para uso em diagnóstico e ensaios clínicos
12
(RAMSHANKAR, KRISHNAMURTHY, 2013; JORDAN et al., 2012). A avaliação de
casos destes cânceres inclui desde a avaliação histológica clássica até testes moleculares
para a detecção do vírus (WIERZBICKA et al., 2013).
Diversos métodos de biologia molecular, como Southern blotting, Hibridização in
situ, Captura Híbrida e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido utilizados na
detecção do HPV. O método da PCR é o mais sensível para detecção do vírus em amostras
biológicas (QUINTERO et al., 2013; VIDAL et al., 2012; CARVALHO et al., 2010;
RIVERO, NUNES, 2006; HUBBARD et al., 2003). Por possuir melhor sensibilidade e
baixos valores preditivos negativos, a PCR é considerada o padrão ouro para identificação
desse vírus (ACAY et al., 2008).
Para a amplificação de segmentos-alvo são necessários iniciadores, denominados
primers, que podem ser gerais ou específicos (CASTRO et al., 2009; RIVERO, NUNES,
2006). Os primers consensus GP5+/GP6+ e MY09/MY11 são os iniciadores gerais mais
utilizados (VIDAL et al., 2012; CASTRO et al., 2009; WINDER et al., 2009; HUBBARD
et al., 2003; IFTNER, VILLA, 2003). Esses iniciadores amplificam sequências-alvo do
segmento L1 do genoma do HPV, sendo capazes de identificar diversos tipos do vírus
(VIDAL et al., 2012; IFTNER, VILLA, 2003; QU et al., 1997). O capsídeo do HPV é
composto por proteínas codificadas pelos genes L1 e L2 da região tardia. O L1 é o mais
conservado e parece ser o mais polimórfico no DNA do HPV. Devido a isso, esse
segmento é um dos mais analisados para sua detecção e genotipagem (CARVALHO et al.,
2010; ESQUENAZI et al., 2010; HUBBARD et al., 2003).
A detecção do DNA viral pode ser feita utilizando-se os primers gerais
MY09/MY11 ou GP5+/GP6+ em uma reação de PCR convencional, na qual apenas um
par de primers é utilizado (VIDAL et al., 2012; CASTRO et al., 2009; WINDER et al.,
2009; IFTNER, VILLA, 2003). Porém reações de nested PCR, caracterizadas pelo uso de
pares de primers diferentes em reações consecutivas, tornam a técnica ainda mais sensível
(CARVALHO et al., 2010; WINER et al., 2009; BRITTO et al., 2005). Nessa técnica, o
amplicon gerado na primeira reação é reamplificado com outro par de primers, específico
para uma sequência interna presente neste produto (BRITTO et al., 2005). Para a detecção
do HPV, comumente é utilizado o par MY09/MY11 na primeira reação e GP5+/GP6+ na
etapa nested (VIDAL et al., 2012) (Figura 3).
13
Figura 3 – Gel de agarose a 2% mostrando bandas positivas para HPV usando os primers
GP5+/GP6+; P.M. – Peso Molecular; + - Controle Positivo; NEG- Controle Negativo.
A PCR em tempo real (RT-PCR) é uma variação da PCR tradicional que é também
empregada para a detecção do HPV. A RT-PCR fornece resultados quantitativos dos
produtos de amplificação através da captação de fluorescência emitida à medida que os
ciclos da reação ocorrem e diretamente proporcional ao número de fragmentos
amplificados (BRITTO et al., 2005).
Devido à grande diversidade de tipos virais existentes e sua relação com diferentes
manifestações clínicas, fez-se necessário o desenvolvimento de técnicas para a
identificação de tipos de HPV presentes em amostras biológicas (Figura 4). Com este fim,
PCR primer-específicos baseada em polimorfismos das proteínas E6 e E7 tem seu uso
fortemente relatado na literatura e vão desde reações para tipagem de apenas um tipo de
HPV até reações de multiplex, nas quais um pool de primers permite a identificação
concomitante de dois ou mais tipos virais (CARVALHO et al., 2010).
14
Figura 4 – Gel de agarose a 2% mostrando amostras positivas para HPV-6 usando
multiplex com primers específicos para os tipos HPV-6, HPV-16 e HPV-18. P.M.- Peso
Molecular; 6+ - Controle Positivo para o HPV-6; 16+ - Controle Positivo para o HPV-16;
18+ - Controle Positivo para o HPV-18.
Métodos de identificação simultânea de diversos tipos de HPV em uma única
reação tem sido desenvolvidos para uso em amostras clínicas. A técnica do Linear Array é
qualitativa e se baseia na amplificação do DNA viral por PCR e posterior hibridização dos
amplicons com detecção colorimétrica da ligação destes a sondas oligonucleotídicas
(ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, 2012; BLACK et al., 2010). Alguns kits baseados
nesse método encontram-se disponíveis no mercado, como o teste de genotipagem Linear
Array HPV (Roche Diagnostics) que é capaz de detectar trinta e sete tipos de HPV
anogenitais (Figura 5) (ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, 2012; BLACK et al., 2010).
15
Figura 5 – Exemplo do teste de genotipagem Linear Array HPV (Roche Diagnostics).
Controles internos e sinal de hibridização para HPV 16 são mostrados (BLACK et al.,
2010).
1.5. Lesões orais e HPV
Considerado o fator mais importante no desenvolvimento do câncer de colo uterino,
estudos tem investigado o papel do HPV na carcinogênese oral e encontrado evidências de
seu envolvimento no processo, chegando o Instituto Nacional do Câncer (INCA), órgão do
Ministério da Saúde responsável pelo combate ao câncer, a apontá-lo como um dos
principais fatores de risco para o câncer oral (INCA, 2011). Mudanças no comportamento
sexual de homens e mulheres podem estar associadas ao aumento dos casos da infecção
por HPV na cavidade oral (RAGIN et al., 2011). Entretanto, a detecção do HPV em
epitélio de mucosa oral normal ainda não permite inferências mais precisas quanto ao seu
papel na carcinogênese, ou seja, se o vírus é o principal agente etiológico, se é um
coadjuvante ou se apenas está presente no epitélio oral, atuando como um comensal que
pode vir a se tornar patogênico (ESQUENAZI et al, 2010).
16
Alguns tipos de HPV podem infectar o trato aerodigestivo superior e causar lesões
benignas, como papilomas de células escamosas, condiloma acuminado, hiperplasia
epitelial focal e verruga vulgar (ESQUENAZI et al., 2010; CASTRO et al., 2009;
SCHWARTZ et al., 1998). Como pode ser observado na Tabela 4, essas lesões estão
associadas principalmente aos tipos 2, 4, 6, 7, 11, 13 e 32, considerados de baixo risco
oncogênico. Outros tipos, como os de alto risco oncogênico 16, 18, 31, 33, 35, 39, 42, 45,
51, 52, 56, 58, 59 e 66, são associados a lesões malignas da cavidade oral, principalmente
ao carcinoma de células escamosas (ESQUENAZI et al, 2010; CASTRO et al., 2009;
ACAY et al., 2008).
Tabela 4. Principais tipos de HPV relacionados a manifestações clínicas orais
Manifestação clínica
Principais tipos relacionados
Hiperplasia epitelial focal
13, 32
Papiloma escamoso oral
6, 11
Condiloma acuminado oral
6, 11
Verruga vulgar
1, 2, 4, 6, 7, 11, 16
Líquen plano
11, 16
Carcinoma verrucoso oral
6, 11, 16, 18
Leucoplasia oral
6, 11, 16
Carcinoma de células escamosas oral
16
Papilomatose oral recorrente
6, 11
Fonte: (BHARTI et al., 2013; CASTRO et al., 2004)
Fatores químicos, físicos e biológicos estão relacionados ao desenvolvimento de
lesões orais. O consumo de álcool e de tabaco é considerado o fator mais importante na
carcinogênese oral, sendo associado à maioria dos casos desse tipo de câncer. Porém,
discute-se a necessidade de coexistência entre esses e outros fatores como alimentação
pobre em nutrientes, higiene bucal precária, exposição à radiação ultravioleta e presença de
agentes infecciosos, além da existência de predisposição genética, para que o câncer oral se
desenvolva. Entre os agentes infecciosos associados ao câncer oral, tem-se discutido a
correlação da infecção por HPV em mucosa oral e o desenvolvimento e/ou agravamento
17
das lesões (ACAY et al., 2008, CAMPOS et al., 2007; ROCHA et al., 2007; SIMONATO,
MIYAHARA, 2007; SOUZA JÚNIOR, 2006; VIDAL et al., 2004).
Dados recentes mostram que consumo de álcool/tabaco e a presença do HPV são
fatores de risco independentes, não estando associados às mesmas lesões. Tem sido
sugerida uma divisão desses cânceres em dois grupos distintos e demonstrado que
pacientes que apresentam lesões HPV-positivas possuem melhor prognóstico e maiores
taxas de sobrevivência (SMITH et al., 2012; TURNER et al., 2011).
O câncer oral é um dos tipos de câncer mais comuns no mundo, apresentando
elevadas taxas de incidência no centro-sul asiático, Europa oriental e central, África e
América Central (INCA, 2011; CAMPOS et al., 2007; VIDAL et al., 2004). Estima-se a
ocorrência mundial, em 2012, de 264 mil novos casos e 128 mil óbitos em decorrência da
doença (INCA, 2011). No Brasil, o câncer oral encontra-se entre os dez tipos mais
incidentes e é considerado um grave problema de saúde pública (HONORATO et al.,
2009; SIMONATO, MIYAHARA, 2007; VIDAL et al., 2004). Segundo estimativas do
INCA para o ano de 2012, excluindo-se o câncer de pele não-melanoma, no nordeste o
câncer oral foi o quarto mais frequente em homens e o oitavo em mulheres, com 14.170
novos casos. No estado de Sergipe foi o quinto mais frequente, com incidência estimada de
130 casos (INCA, 2011).
Pacientes com câncer oral apresentam baixas taxas de sobrevida, o que se acredita
ser devido a sua detecção comumente tardia (HONORATO et al., 2009; SOUZA JÚNIOR,
2006). Isso causa também altos índices de deformações maxilofacial e bucal nos pacientes
em tratamento de quadros mais evoluídos, o que leva a marcantes impactos psicológicos
nos mesmos (VIDAL et al., 2011; CAMPOS et al., 2007; SOUZA JÚNIOR, 2006).
Atualmente, estima-se a presença do HPV em 60% dos casos de câncer de cabeça e
pescoço nos Estados Unidos (UPILE et al., 2012). Hoje essa relação está bem estabelecida
e evidências crescentes reforçam seu papel em um subtipo desse câncer, o Carcinoma de
Células Escamosas Oral (CCEO) (NDIAYE et al., 2013; QUINTERO et al., 2013; SMITH
et al., 2012; UPILE et al., 2012; ROCHA et al., 2007; VENTURI et al., 2004).
Pesquisas tem sido realizadas visando avaliar a capacidade de proliferação celular
entre CCEO HPV-positivos e HPV-negativos e aumento progressivo e significativo dessa
capacidade tem sido encontrado quando comparados com mucosa oral normal, indicando
participação viral no estabelecimento dessa doença (ROCHA et al., 2007).
18
O CCEO é o tipo de tumor maligno que mais afeta a cavidade oral, representando
cerca de 90% de todos os casos e é mais comum em pacientes do sexo masculino, com
idade mais baixa e que apresentam comportamento sexual de risco (QUINTERO et al.,
2013; VENTURI et al., 2004). Estudos tem associado o HPV principalmente a cânceres de
cabeça e pescoço que se desenvolvem na base da língua e nas tonsilas palatinas, mas
apontam também para a sua presença em casos de cavidade oral e de laringe (QUINTERO
et al., 2013; UPILE et al., 2012).
O achado da presença do HPV em mucosas orais normais e de prevalências
variáveis do mesmo em estudos que avaliaram lesões orais tornam sua relação com o
processo de carcinogênese oral ainda mais controversa (HONORATO et al., 2009;
MOSELE et al., 2009; ACAY et al., 2008; CAMPOS et al., 2007; ROCHA et al., 2007;
SIMONATO, MIYAHARA, 2007). Novos estudos que busquem uma melhor compreensão
da relação entre o desenvolvimento dessas lesões e a infecção por HPV são necessários.
19
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
 Detectar e genotipar o Papilomavirus Humano (HPV) em mucosas orais de
pacientes do estado de Sergipe.
2.2. Específicos
 Detectar e genotipar o HPV presente em amostras colhidas por esfoliação de lesões
orais através da técnica de PCR;
 Detectar e genotipar o HPV presente em amostras colhidas por esfoliação de
mucosas orais saudáveis através da técnica de PCR;
 Avaliar na população estudada os tipos de HPV encontrados em relação às
diferentes lesões orais identificadas;
 Comparar a ocorrência do HPV encontrada através de PCR com os índices de
detecção das atipias celulares obtidos pela histopatologia.
 Comparar a ocorrência do HPV e seus tipos em mucosa oral saudável de pacientes
usuários e não usuários de múltiplas drogas.
20
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Delineamento do estudo
Foi realizado estudo transversal no período de janeiro de 2013 a março de 2014. A
população do estudo caracterizou-se por todos os pacientes atendidos no ambulatório de
Odontologia do Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe (HU-UFS) que
apresentavam lesões em mucosa oral clinicamente detectáveis; por pacientes selecionados
randomicamente que possuíam mucosa oral saudável atendidos neste ambulatório e por
todos os usuários de múltiplas drogas internos nas clínicas e instituições de recuperação de
usuários de álcool e drogas do estado de Sergipe localizadas nas cidades de Aracaju e São
Cristóvão que foram avaliadas. Foram excluídos da pesquisa apenas pacientes que não
tiveram seu Termo de Consentimento Livre Esclarecido assinado pelo próprio paciente ou
responsável (Anexos 1 e 2). Dados clínicos associados a fatores de risco para o
desenvolvimento do câncer oral e dados socioeconômicos foram coletados do prontuário
do paciente e um questionário para avaliação mais detalhada foi aplicado (Anexo 3).
3.2. Coleta
Para análise histopatológica, pequenos fragmentos do tecido lesionado foram
retirados manualmente com bisturi. O material coletado foi fixado em formalina e
embebido em parafina e cortes posteriores foram realizados em micrótomo, corados com
hematoxilina/eosina e analisados através de microscopia ótica por profissional patologista
no Departamento de Odontologia do HU-UFS.
Para os estudos moleculares, as amostras foram coletadas por esfoliação da mucosa
oral utilizando escovas citológicas estéreis nas regiões dos palatos mole e duro, assoalho
oral, mucosa jugal bilateralmente e superfícies dorsal e ventral da língua (ESQUENAZI et
al., 2010; CASTRO et al., 2009; XAVIER et al., 2007; RIVERO, NUNES, 2006;
SCHWARTZ et al., 1998).
O material coletado dos pacientes através de esfoliação de mucosa foi armazenado
em tubos contendo etanol 70% e as amostras encaminhadas ao Laboratório de Entomologia
e Parasitologia Tropical (LEPAT) da Universidade Federal de Sergipe, onde seu DNA foi
21
extraído, amplificado para detecção do gene da beta-globina e armazenado até realização
da PCR para HPV. O material coletado foi armazenado a 4ºC até a extração do DNA e,
após extração, o DNA purificado foi mantido em freezer a -20ºC até a realização da PCR
(MELO et al., 2010).
As reações de nested PCR e genotipagem do HPV foram realizadas no LEPAT e no
Laboratório de Imunopatologia da Relação Materno-Fetal, do Departamento de Patologia
da Faculdade de Medicina-UNESP em Botucatu/São Paulo.
3.3. Pesquisa de HPV
3.3.1. Extração de DNA
As amostras coletadas em álcool 70% foram armazenadas em tubos Falcon a 4ºC
por no máximo 15 dias até o seu processamento. Os tubos foram centrifugados por 5min a
3500rpm e o sobrenadante desprezado. Diluiu-se o pellet em 500µL de solução de lise
(NaCl 5M; Tris-HCl 0,5M pH7,6; EDTA 0,5M pH8,0; SDS 10%; Proteinase K 0,5mg/mL)
e transferiu-se para tubos Eppendorf® que foram incubados em banho-maria a 60ºC por
5h. Adicionou-se 67µL de NaCl em cada amostra e estas foram levadas ao vórtex por 30s e
então centrifugadas por 20min a 14000rpm a 4oC. O sobrenadante foi transferido para um
novo tubo e adicionado 400µL de isopropanol gelado e as amostras foram armazenadas
overnight a -20ºC. Após esse período, foram retiradas do freezer e centrifugadas por 20min
a 14000rpm a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e adicionaram-se 400µL de etanol 70%,
homogeneizando então no vórtex. As amostras foram centrifugadas por 10min a 14000rpm
a 4oC e o sobrenadante descartado. Então, 30µL de TE foram adicionados,
homogeneizando com a pipeta, e o DNA extraído permaneceu armazenado a -20ºC.
3.3.2. Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)
Inicialmente, em sala de pré-PCR, em capela de fluxo laminar previamente
esterilizada por luz ultravioleta durante 15 minutos, foram preparados todos os mixes em
volume de 18L compostos por 10L PCR Buffer Go Taq Green (Promega); 0,6L de
cada primer na concentração de 10M; 6,8L de água Milli-Q autoclavada (Milli Q Plus,
22
Milipore). Após preparo dos mixes, em bancada previamente higienizada, adicionou-se
2L da amostra pesquisada, obtendo-se volume final de reação de 20L.
Como controle de qualidade da extração de DNA das amostras foi utilizado o par
de primers RS42/KM29 (Tabela 5) para amplificação do gene da β-globina, constitutivo do
DNA humano, gerando uma banda de aproximadamente 550 pares de base. As
amplificações foram realizadas em termociclador Veriti® Thermal Cycler (Applied
Biosystems), seguindo as condições de reação: 95ºC durante 5 minutos para a desnaturação
inicial; 94ºC por 1 minuto, 60ºC por 1 minuto para anelamento dos primers e 72ºC durante
1 minuto para a amplificação, seguido por outros 35 ciclos idênticos ao descrito acima,
finalizando com extensão de 10 minutos a 72ºC e manutenção das amostras a 4ºC. Um
controle negativo foi utilizado em todas as reações, no qual o ácido nucléico foi substituído
por 2L de água Milli-Q. Para todas as análises foram consideradas apenas as amostras
que foram positivas para β-globina.
Tabela 5 – Sequências de bases dos primers RS42/KM29, GP5+/GP6+, MY09/MY11 e
primers HPV-6, HPV-16 e HPV -18 específicos.
PRIMERS
SEQUÊNCIA DE BASES
RS42
5’-GCTCACTCAGTGTGGCAAAG-3’
KM29
5’-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3’
GP5+
5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’
GP6+
5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’
MY09
5’-CGTCCMAARGGAWACTGATC-3’
MY11
5’-GCMCAGAWCATAAYAATGG-3’
6F
5’-GCTAAAGGTCCTGTTTCGAGGCGGCTA-3’
6R
5’-GGCAGCGACCCTTCCACGTACAAT-3’
16L F
5’-CGCACAAAACGTGCATCGGCTACC-3’
16L R
5’-TGGGAGGCCTTGTTCCCAATGGA-3’
16U F
5’-TCCTGCAGGTACCAATGGGGAAGAGG-3’
16U R
5’-TGCCATACCCGCTGTCTTCGCTTT-3’
18 F
5’-AACAGTCCATTAGGGGAGCGGCTGGA-3’
18 R
5’-TGCCGCCATGTTCGCCATTTG-3’
M = A/C; R = A/G; W = A/T; Y = C/T.
AMPLICON (pb)
550
190
450
263
217
397
187
23
Para a amplificação do genoma do HPV foi utilizada a técnica de nested PCR
utilizando os primers gerais GP5+/GP6+ e MY09/MY11 que amplificam sequências de
pares de base da região L1 do DNA do HPV (SMITH et al., 2012; RIVERO, NUNES,
2006; SCHWARTZ et al., 1998). Os primers MY09/MY11 amplificam uma sequência
aproximada de 450pb e o par GP5+/GP6+ amplifica uma sequência de aproximadamente
150pb (QU et al., 1997).
Inicialmente 2L de cada amostra foram amplificados com os primers
MY09/MY11 (GILLISON et al., 2012), com as condições de reação seguintes: 95ºC
durante 5 minutos para a desnaturação inicial; 94ºC por 1 minuto, 50ºC por 1 minuto para
anelamento dos primers e 72ºC durante 1 minuto para a amplificação, seguido por outros
35 ciclos idênticos ao descrito acima, finalizando com extensão de 10 minutos a 72ºC e
manutenção das amostras a 4ºC. A segunda PCR consistiu na amplificação de 2L do
produto da primeira PCR utilizando-se os primers GP5+/6+ (DURZYHSKA et al., 2011).
A ciclagem para amplificação (GP5+/GP6+) seguiu os seguintes parâmetros: 95ºC durante
45 segundos para a desnaturação, 47,7ºC por 45 segundos para anelamento dos primers e
72ºC durante 1 minuto para a amplificação, seguido por outros 44 ciclos idênticos ao
descrito acima, finalizando com extensão de 7 minutos a 72ºC e armazenamento das
amostras a 4ºC. Um controle negativo foi utilizado em todas as reações, no qual o ácido
nucléico foi substituído por 2L de água Milli-Q. Como controle positivo utilizou-se em
todas as reações DNA-HPV extraído de células HeLa, que são células de adenocarcinoma
cervical.
3.3.3. Visualização dos produtos amplificados
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%
(Invitrogen) preparada em tampão Tris-Ácido Bórico-EDTA (TBE) 1X e corada Gel
RedTM (BioLabs). O tamanho dos produtos amplificados foi comparado com o padrão de
100pb (GE Healthcare) e visualizados sob transiluminação ultra-violeta e as amostras
positivas posteriormente encaminhadas para genotipagem.
3.3.4. Genotipagem
24
Para a genotipagem dos HPVs presentes nas amostras que foram positivas para
DNA-HPV nas nested PCR foi utilizada a técnica de PCR multiplex por primers tipo
específico. Os tipos virais 6, 16 e 18 foram detectados através da amplificação com
primers específicos (Tabela 5) conforme descrito anteriormente por Marcolino et al.
(2008). As reações foram realizadas em termociclador Eppendorf Mastercycle Personal
com volume final de 20L compostos por 10L PCR Buffer Go Taq Green (Promega);
0,6L de cada primer na concentração de 10M; 5,2L de água Milli-Q autoclavada (Milli
Q Plus, Milipore) e 2L da amostra pesquisada. As condições de reação utilizadas foram:
desnaturação inicial a 94ºC durante 1 minuto; 37 ciclos de 94ºC por 1 minuto, anelamento
a 53,5ºC por 30 segundos e amplificação a 72ºC durante 1 minuto; finalizando com
extensão por 7 minutos a 72ºC e manutenção das amostras a 4ºC.
3.4. Análise estatística
A análise descritiva foi realizada sob a forma de tabelas e os dados observados
expressos pela frequência absoluta (n) e relativa (%). Para verificar a força de associação
entre variáveis dependentes e independentes foram utilizados os recursos dos estudos
analíticos empregando-se as técnicas de análises de correlação e de regressão. Estas
permitiram, em uma segunda fase do processo de avaliação dos dados que compuseram o
estudo descritivo, inferir sobre a associação entre exposição a fatores de risco para a
infecção pelo vírus HPV e o achado de DNA viral nas amostras dos pacientes.
25
4. ARTIGO 1
Título: Elevada ocorrência do Papilomavírus Humano (HPV) em lesões de mucosa oral
em Hospital Universitário no estado de Sergipe, Brasil.
Revista: Journal of Oral Pathology & Medicine (Anexo 5)
Situação: Em preparação
26
ELEVADA OCORRÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM LESÕES
DE MUCOSA ORAL DE PACIENTES ATENDIDOS EM AMBULATÓRIO
ESPECIALIZADO EM SERGIPE, BRASIL
Título curto: Alta ocorrência do HPV em lesões orais no Brasil
Palavras-chave: Papilomavírus humano; lesões orais; PCR; Brasil
Autor para correspondência:
Endereço:
Email:
Fax:
27
ELEVADA OCORRÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM LESÕES
DE MUCOSA ORAL DE PACIENTES ATENDIDOS EM AMBULATÓRIO
ESPECIALIZADO EM SERGIPE, BRASIL
RESUMO
INTRODUÇÃO: As taxas de detecção de HPV na cavidade oral relatadas na literatura
variam consideravelmente em todo o mundo e fazem da relação entre o HPV e a
carcinogênese oral algo ainda controverso. OBJETIVO: Avaliar a ocorrência da infecção
pelo HPV e de seus genótipos em pacientes com lesões orais atendidos no Ambulatório de
Diagnóstico Oral do Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe (HU-UFS).
MÉTODOS: Foram avaliados 21 pacientes com idade entre 2 e 83 anos, com lesões
clinicamente detectáveis na mucosa oral. As amostras foram coletadas por esfoliação da
mucosa oral e a pesquisa de DNA-HPV foi realizada utilizando os primers MY09/MY11 e
GP5+/GP6+. A genotipagem foi realizada através de multiplex-PCR com primers
específicos. RESULTADOS: Foram diagnosticadas histopatologicamente lesões benignas,
pré-malignas e malignas da cavidade oral. . A ocorrência do DNA-HPV foi de 80.95%. O
HPV-6 esteve presente em 47.62% das amostras positivas, seguido por HPV-18 em
19.05% e do HPV-16 em 4.76%. A detecção relativa de HPV de acordo com o tipo de
lesão foi de 66,67% nos casos de papiloma; 83,33% em carcinomas; 100% em hiperplasia
e 81.82% nos casos que apresentavam displasia. CONCLUSÕES: A elevada ocorrência de
HPV em lesões orais encontrada em nosso estudo difere das encontradas em outros
realizados no Brasil. A presença do HPV em todos os tipos de lesões avaliadas torna
necessário estudos adicionais relativos à distribuição do HPV em lesões orais para auxiliar
no entendimento da história natural da doença.
INTRODUÇÃO
O câncer oral é um dos tipos de câncer mais comuns no mundo (1-3). Em 2012,
estimou-se a ocorrência mundial de 264 mil novos casos e 128 mil óbitos em decorrência
da doença (1). No Brasil, o câncer oral encontra-se entre os dez tipos mais incidentes e é
28
considerado um grave problema de saúde pública (3-5). Segundo estimativas do INCA
para o ano de 2014, excluindo-se o câncer de pele não-melanoma, o câncer oral é o quarto
mais frequente em homens e o nono em mulheres no nordeste do Brasil (6).
Fatores químicos, físicos e biológicos estão relacionados ao desenvolvimento de
lesões orais. O consumo de álcool e de tabaco é considerado o fator mais importante na
carcinogênese oral, estando associado à maioria dos casos desse tipo de câncer. Entre os
agentes infecciosos associados ao câncer oral, tem-se discutido a correlação da infecção
pelo Papilomavírus Humano (HPV) em mucosa oral e o desenvolvimento e/ou
agravamento das lesões (2,5,7,8). Dados recentes mostram que o consumo de álcool/tabaco
e a presença do HPV são fatores de risco independentes, não estando associados às
mesmas lesões (9,10). Tem sido sugerida uma divisão desses cânceres em dois grupos
distintos e demonstrado que pacientes que apresentam lesões HPV positivas possuem
melhor prognóstico e maiores taxas de sobrevivência (9).
Diversos tipos de HPV podem infectar o trato aerodigestivo superior e causar
lesões benignas. Essas lesões estão associadas principalmente aos tipos 2, 4, 6, 7, 11, 13 e
32, considerados de baixo risco oncogênico. Outros tipos, como os de alto risco
oncogênico 16, 18, 31, 33, 35, 39, 42, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 66 são associados a lesões
malignas da cavidade oral, principalmente ao carcinoma de células escamosas (7,11,15).
As taxas de detecção do HPV em cavidade oral reportadas na literatura variam
acentuadamente em todo o mundo, indo de 0% a 100%. Em revisão sistemática de 60
estudos que utilizaram a PCR para detecção do HPV em cânceres de cabeça e pescoço,
observou-se a presença do vírus em 25.9% dos tumores avaliados, sendo 35.6% nos casos
de acometimento da orofaringe e 23.5% nos de cavidade oral (16,17). Nos Estados Unidos,
estudo realizado por Jordan et al. (18) detectou-se a presença de HPV em 78.3% de 233
amostras de Carcinoma de Células Escamosas Oral ( CCEO). No Brasil, Rivero e Nunes
(19) encontraram 100% de negatividade entre 40 casos de CCEO analisados.
Essas taxas de prevalência variáveis tornam a relação do HPV com o processo de
carcinogênese oral ainda controversa (2,4,7,20). O objetivo deste estudo foi avaliar a
prevalência do HPV e de seus genótipos em pacientes com lesão oral atendidos no
Ambulatório de Diagnóstico Oral do Hospital Universitário da Universidade Federal de
Sergipe, Brasil.
29
MATERIAL E MÉTODOS
Pacientes e Métodos
Foi conduzido um estudo transversal, com amostragem realizada por conveniência,
envolvendo homens, mulheres e crianças atendidos no Ambulatório de Diagnóstico Oral
do Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe, Brasil, entre os meses de
janeiro de 2013 a março de 2014. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Federal de Sergipe (parecer nº 76317). Todos os participantes
tiveram seu Termo de Consentimento Livre Esclarecido assinado pelo próprio paciente ou
responsável. Foram avaliados todos os indivíduos que apresentavam lesões clinicamente
detectáveis em mucosa oral, sem fatores clínicos de exclusão.
Coleta e processamento
As lesões orais clinicamente detectadas foram submetidas à biópsia para
confirmação histopatológica. Após antissepsia do local e anestesia infiltrativa da base da
lesão usando lidocaína 2%, foi realizada a ressecção pela base com lâmina de bisturi
número 15, compressão da ferida com gaze cirúrgica por alguns minutos e, quando
necessário, foi realizada a sutura da mucosa sangrante com fio de micronylon 3.0. O
material coletado foi fixado em formalina e embebido em parafina e cortes posteriores
foram realizados, corados com hematoxilina/eosina e analisados por microscopia ótica.
À microscopia, as lesões foram classificadas em 4 grupos: Hiperplasia (01),
Papiloma (03), Carcinoma de Células Escamosas (CCE) (06) e Displasias (11). Ao exame
histopatológico, 33.34% das lesões (7/21) apresentaram coilócitos no tecido avaliado.
Para os estudos moleculares, as amostras foram coletadas por esfoliação da mucosa
oral lesionada utilizando escovas citológicas estéreis nas regiões dos palatos mole e duro,
assoalho oral, mucosa jugal bilateralmente e superfícies dorsal e ventral da língua
(11,12,15). O material coletado de cada paciente foi armazenado em etanol 70% a 4ºC por
até 15 dias antes do processamento.
O DNA das amostras foi extraído através de digestão enzimática utilizando solução
de lise contendo proteinase K. As amostras foram centrifugadas por 5min a 3500rpm e o
sobrenadante desprezado. Diluiu-se o pellet em 500µL de solução de lise (NaCl 5M; Tris-
30
HCl 0.5M pH7.6; EDTA 0.5M pH8; SDS 10%; Proteinase K 0.5mg/mL) e transferiu-se
para tubos Eppendorf® de 1.5mL que foram incubados em banho-maria a 60ºC por 5h.
Adicionou-se 67µL de NaCl em cada tubo e estes foram submetidos a agitação vigorosa
em vórtex por 30s e então centrifugados por 20min a 14000rpm a 4oC. O sobrenadante foi
transferido para novo tubo e adicionado 400µL de isopropanol gelado, armazenando
overnight a -20ºC. Após esse período, foram centrifugadas por 20min a 14000rpm a 4ºC. O
sobrenadante foi descartado e adicionaram-se 400µL de etanol 70%, homogeneizando no
vórtex. As amostras foram centrifugadas por 10min a 14000rpm a 4oC e o sobrenadante foi
novamente descartado. O DNA extraído foi ressuspendido em 30µL de TE e armazenado a
-20ºC até o momento de uso.
Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)
Para o preparo do pré-mix foi utilizada capela de fluxo laminar previamente
esterilizada por luz ultravioleta durante 15 minutos, em sala de pré-PCR. Todos os mixes
possuíam volume de 18L compostos por 10L PCR Buffer Go Taq Green (Promega);
0.6L de cada primer na concentração de 10M e 6.8L de água Milli-Q autoclavada
(Milli Q Plus, Milipore). Posteriormente, adicionou-se 2L do DNA pesquisado, obtendose volume final de 20L.
Como controle de qualidade da extração do DNA das amostras foi utilizado o par
de primers RS42/KM29 para amplificação do gene da β-globina (21). As amplificações
foram realizadas em termociclador Veriti® Thermal Cycler (Applied Biosystems), com as
seguintes condições de reação: 95ºC durante 5 minutos para a desnaturação inicial; 35
ciclos de 94ºC por 1 minuto, anelamento a 60ºC por 1 minuto e amplificação a 72ºC
durante 1 minuto; finalizando com extensão por 10 minutos a 72ºC e manutenção das
amostras a 4ºC. Para todas as análises posteriores foram consideradas apenas as amostras
positivas para β-globina.
Para a amplificação do genoma do HPV foram utilizados os primers degenerados
MY09/MY11 e os gerais GP5+/GP6+ que amplificam sequências de pares de base da
região L1 do DNA do HPV (9,19). Inicialmente 2L de cada amostra foram amplificados
com os primers MY09/MY11, com as condições de reação seguintes: 95ºC durante 5
minutos para a desnaturação inicial; 94ºC por 1 minuto, 50ºC por 1 minuto para
anelamento dos primers e 72ºC durante 1 minuto para a amplificação, seguido por outros
31
35 ciclos idênticos ao descrito acima, finalizando com extensão de 10 minutos a 72ºC e
manutenção das amostras a 4ºC. A segunda PCR consistiu na amplificação de 2L do
produto da primeira PCR utilizando-se os primers GP5+/GP6+, seguindo os parâmetros:
desnaturação a 95ºC por 5 minutos; 44 ciclos de 95ºC durante 45 segundos, 47,7ºC por 45
segundos para anelamento e amplificação a 72ºC por 1 minuto; e 7 minutos a 72ºC para
extensão final. Como controle positivo utilizou-se em todas as reações DNA de HPV-16
extraído de células HeLa.
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%
(Invitrogen) corado com Gel RedTM (BioLabs) sob 100v por 1 hora. O resultado foi
visualizado em transiluminador com luz ultra-violeta e as amostras positivas
posteriormente encaminhadas para genotipagem.
Genotipagem
Para a genotipagem foi utilizada a técnica de multiplex PCR com primers
específicos para os genótipos 6, 16 e 18. As reações foram realizadas em termociclador
Eppendorf Mastercycle Personal com volume final de 20L compostos por 10L PCR
Buffer Go Taq Green (Promega); 0.6L de cada primer na concentração de 10M; 6.8L
de água Milli-Q autoclavada (Milli Q Plus, Milipore) e 2L da amostra pesquisada. As
condições de reação utilizadas foram: desnaturação inicial a 94ºC durante 1 minuto; 37
ciclos de 94ºC por 1 minuto, anelamento a 53.5ºC por 30 segundos e amplificação a 72ºC
durante 1 minuto; finalizando com extensão por 7 minutos a 72ºC.
Análise estatística
A análise descritiva foi realizada sob a forma de tabelas e os dados observados
expressos pela frequência absoluta (n) e relativa (%). Para verificar a força de associação
entre variáveis dependentes e independentes foram utilizados os recursos dos estudos
analíticos empregando-se as técnicas de análises de correlação e de regressão. Estas
permitiram, em uma segunda fase do processo de avaliação dos dados que compuseram o
estudo descritivo, inferir sobre a associação entre exposição a fatores de risco para a
infecção pelo vírus HPV e o achado de DNA viral nas amostras dos pacientes. O programa
32
utilizado para esta finalidade foi o BioEstat 5.1 (Sociedade Civil Mamirauá, Manaus,
Brasil).
RESULTADOS
Características dos pacientes
As características dos pacientes avaliados neste estudo são apresentadas na Tabela
2. A maioria dos pacientes era do sexo feminino (71.43%), parda ou negra (90.47%),
alfabetizada (52.38 %) e não fumantes e não etilistas (52.38 %).
Pesquisa de HPV
A ocorrência do HPV nas amostras foi de 80.95% (/21). O tipo viral mais frequente
foi o HPV-6, presente em 47.62% (10/21) das amostras positivas, seguido do HPV-18 em
19.05% (4/21) e do HPV-16 em 4.76% (1/21). Infecção múltipla foi detectada em 19.05%
das amostras (4/21). Em 28.57% (6/21) das amostras o tipo viral presente não foi
identificado.
As ocorrências do HPV relativas ao laudo histopatológico das amostras foram de
66.67% (2/3) nos casos Papiloma; 83.33% (5/6) em CCE; 100% nos casos de Hiperplasia
(01) e 81.82% (9/11) nas amostras que possuíam apenas displasia. As freqüências dos tipos
virais identificados através da genotipagem estão demonstradas na Tabela 1.
Através do use de técnicas de análises de correlação e de regressão, não foram
encontrados valores significativos (p<0.05) para nenhuma das variáveis analisadas.
DISCUSSÃO
Entre os agentes infecciosos associados ao câncer oral, tem-se discutido a
correlação da infecção por HPV em mucosa oral e o desenvolvimento e/ou agravamento
das lesões (2,7,8).
O presente estudo detectou a presença do HPV em 80.95% (17/21) das lesões
clinicamente detectáveis em mucosa oral. Os resultados se aproximam daqueles
33
encontrados em pesquisas realizadas na Itália por Morbini et al. (22), que obtiveram 87.5%
de positividade de HPV em amostras de Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e
Pescoço (CCE-CP) e displasias, e em estudo de Jordan et al. (18) nos Estados Unidos, que
detectou a presença do vírus em 78.3% de 233 amostras de Carcinoma de Células
Escamosas Oral (CCEO).
Por outro lado, esses dados divergem de outros trabalhos realizados no Brasil onde
se observaram taxas de HPV que variaram aproximadamente entre 0% e 30% em lesões
orais (3,7,19,23). No estado de São Paulo, Rivero e Nunes (19), utilizando somente os
primers GP5+/GP6+, encontraram todas as amostras negativas entre 40 casos de CCEO
analisados. Já Acay et al. (7) obtiveram 24% de positividade utilizando a técnica de
hibridização in situ em 50 casos de lesões orais envolvendo leucoplasias, displasias e
CCEO. Outro estudo realizado neste mesmo estado por Miyahara et al. (23) detectou
33.7% de amostras positivas entre 83 casos de CCEO com material parafinado.
Poucos estudos foram realizados na região nordeste do país para avaliar a presença
do vírus em lesões orais. Em trabalho realizado no estado de Pernambuco, Vidal et al. (3)
obtiveram uma taxa de positividade de HPV de 27.5% em amostras de CCEO através de
captura híbrida. Nosso estudo foi o primeiro no estado de Sergipe a avaliar a presença do
DNA do vírus em lesões de mucosa oral, não havendo na literatura nenhum estudo prévio
semelhante. Novos dados sobre a infecção pelo vírus em lesões orais em Sergipe são
necessários para uma melhor compreensão da distribuição do HPV no estado e também na
população brasileira.
Essas variações acentuadas encontradas nas taxas de detecção de HPV em lesões
orais são comuns a vários trabalhos, independentemente do país onde foram realizados,
variando marcadamente até mesmo dentro de um mesmo país, como visto em dados
encontrados em diferentes regiões da Itália utilizando técnicas semelhantes em que
Termine et al. (24) encontraram prevalência de 25.3% e em outro estudo Morbini et al.
(22) obtiveram 87.5% de amostras positivas para o vírus. Dados como esses são freqüentes
na literatura e sugerem uma forte influência de variabilidades geográficas nas taxas de
HPV associadas a lesões orais encontradas em todo o mundo (17,25). Diferenças nos
métodos utilizados e até mesmo pequeno número de amostras também influenciam na
obtenção de resultados tão variáveis, o que dificulta uma melhor comparação entre os
resultados apresentados (17,26,27).
34
Para potencializar a detecção do vírus, utilizamos mais de um par de primers e a
técnica de nested PCR, permitindo a detecção de cargas virais mais baixas. Porém, para o
bom funcionamento desta técnica, uma boa qualidade do DNA presente na amostra é
necessária. Acay et al. (7) obtiveram quantidades insatisfatórias de DNA viral a partir de
amostras de material parafinado e sugerem o uso desta fonte de material genético como
uma das possíveis causas para o achado de prevalências extremamente baixas em lesões
pré-malignas e malignas encontradas em alguns estudos, mesmo utilizando uma técnica de
detecção tão sensível.
A presença de coilócitos é considerada como a principal alteração celular indicativa
da presença do HPV em um tecido (3,23). Recentemente, avaliando-se a questão da
coilocitose e o HPV cervical, estabeleceu-se um consenso de que o DNA do vírus está
presente em 75% das lesões com coilócitos desta região (28). Resultado semelhante em
lesões de mucosa oral foi encontrado em nosso trabalho, no qual das biópsias em que se
detectou coilocitose, 71.42% foram HPV-positivas.
A presença de HPV em lesões orais é detectada em todo o mundo independente de
malignidade (23,24). Nosso estudo avaliou casos de lesões malignas (CCEO), prémalignas (Displasias) e benignas (Hiperplasias e Papilomas), tendo encontrado o vírus em
todos estes grupos.
O HPV-6 foi o tipo viral mais frequente neste trabalho, identificado em 47.62% das
amostras HPV-positivas. Bharti et al. (29) e Castro et al. (30) demonstraram que o HPV-6
está relacionado a seis em cada nove tipos de lesões de mucosa oral. Este tipo viral,
juntamente com o HPV-16, tem sido um dos genótipos mais encontrados até mesmo em
casos de câncer oral. Elamin et al. (25), trabalhando com lesões malignas e pré-malignas,
encontraram 50% de suas amostras positivas para HPV-16 e/ou HPV-6 e uma de suas
amostras de lesão maligna foi positiva apenas para o HPV-6, tipo viral de baixo risco
oncogênico. Kristoffersen et al. (31) identificaram a presença de HPV-6 em 48% das
amostras de lesões pré malignas.
Diferente de Sugiyama et al. (32) que, através da técnica de PCR com primers
Tipo-Específicos, obtiveram 61% e 35% de amostras positivas para HPV-16 em casos de
displasia e de CCEO, respectivamente, e encontraram HPV-18 em apenas duas amostras
(3.5%) de CCEO, identificamos HPV-18 em 19.05% de nossas amostras HPV-positivas e
HPV-16 em apenas 4.76% destas.
35
Os tipos virais não foram identificados em 28.57% de nossas amostras positivas.
Isso se deve possivelmente ao fato destes se tratarem de outros tipos virais que não aqueles
abrangidos na multiplex-PCR. Resultados semelhantes foram encontrados por MravakStipetic et al. (33) que tiveram genótipos não identificados em 50% de suas amostras HPVpositivas. Já Kristoffersen et al. (31) obtiveram 100% das amostras positivas de CCEO não
genotipadas.
A vacinação contra o HPV já se encontra disponível como medida preventiva do
câncer de colo de útero em diversos países e no Brasil a vacina quadrivalente faz parte de
estratégia do Ministério da Saúde, tendo sido incorporada ao Sistema Único de Saúde de
maneira gratuita a partir de março de 2014. Com o crescimento de informações sobre o
papel do HPV em lesões não cervicais, tem-se questionado a efetividade da vacinação
profilática contra o vírus na prevenção também de lesões de cabeça e pescoço (34).
Sugere-se que uma redução de casos de cânceres orais em mulheres após a implementação
desses programas de vacinação auxiliaria em melhor compreensão sobre o papel do HPV
na malignidade destas lesões (30).
Pesquisas comparativas da presença do vírus em ambos os tipos de mucosa tem
sido realizadas em todo o mundo. A presença de DNA de HPV tem sido detectada em
mucosa oral saudável e lesionada e também em todos os tipos de lesões orais investigadas,
porém ainda são poucos os trabalhos realizados no Brasil, sobretudo no Nordeste do país
onde a infecção oral pelo vírus permanece tão pouco estudada. Isso torna necessária a
elaboração de novos estudos que avaliem o papel do Papilomavírus Humano no
desenvolvimento de lesões na cavidade oral e suas características epidemiológicas na
população brasileira, especialmente na região Nordeste.
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39
Tabela 1 – Prevalência de HPV e seus tipos classificadas de acordo com dados histopatológicos em pacientes com lesões em mucosa oral
atendidos no ambulatório de Odontologia do Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe (HU-UFS), Sergipe, Brasil.
TIPO DE LESÃO
TOTAL
OCORRÊNCIA
HPV-6
HPV-16
Hiperplasia
Papiloma
Carcinoma de células escamosas
Displasias
TOTAL
1
3
6
11
21
100% (1/1)
66.67% (2/3)
83.33% (5/6)
81.82% (9/11)
80.95% (17/21)
1
3
2
6
1
HPV-6/18
Não identificado
1
2
3
6
4
4
1
Tabela 2 - Prevalência de HPV e seus tipos em pacientes com lesões em mucosa oral atendidos no ambulatório de Odontologia do Hospital
Universitário da Universidade Federal de Sergipe (HU-UFS), Sergipe, Brasil, classificadas de acordo com dados clínicos.
CARACTERÍSTICAS
GÊNERO
Feminino
Masculino
IDADE
2 |--- 50
50 |--- 65
65 |---| 83
TABACO e/ou ÁLCOOL
Sim
Não
TOTAL
OCORRÊNCIA
HPV-6
HPV-16
15
6
80% (12/15)
83.34% (5/6)
3
3
1
6
9
6
66.67% (4/6)
77.78% (7/9)
100% (6/6)
3
3
10
11
70% (7/10)
90.9% (10/11)
3
3
1
1
HPV-6/18
Não identificado
4
5
1
1
3
2
1
3
1
3
3
3
40
5. ARTIGO 2
Título: Ocorrência do Papilomavírus Humano (HPV) em mucosa oral saudável de
usuários e não usuários de drogas ilícitas no estado de Sergipe, Brasil
Revista: PLOS ONE (Anexo 6)
Situação: Em preparação
41
OCORRÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM MUCOSA ORAL
SAUDÁVEL DE USUÁRIOS E NÃO USUÁRIOS DE DROGAS ILÍCITAS
NO ESTADO DE SERGIPE, BRASIL
Autor para correspondência:
Endereço:
Email:
Fax:
42
OCORRÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM MUCOSA ORAL
SAUDÁVEL DE USUÁRIOS E NÃO USUÁRIOS DE DROGAS ILÍCITAS
NO ESTADO DE SERGIPE, BRASIL
RESUMO
INTRODUÇÃO: A infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) é a doença viral
sexualmente transmissível mais prevalente no mundo. Suas infecções podem variar de
assintomáticas à indução de Carcinomas de Células Escamosas. O objetivo deste estudo foi
avaliar e comparar a ocorrência de HPV e seus genótipos em mucosa oral saudável de
usuários e não-usuários de drogas ilícitas em um estado no Nordeste do Brasil.
MÉTODOS: 106 pacientes com mucosa oral saudável, entre 11 e 79 anos foram avaliados.
As amostras foram coletadas por esfoliação da mucosa oral. Para o controle de qualidade
da extração de DNA foi utilizado PCR para beta-globina. DNA-HPV foi detectado
utilizando primers MY09/MY11 e GP5+/GP6+. A genotipagem foi realizada através de
multiplex-PCR com primers específicos para os tipos virais 6, 16 e 18. RESULTADOS:
Tabagismo e consumo de álcool foram relatados por 69,8% (74/106) dos pacientes e
56,6% (60/106) usavam outras drogas. Resultados positivos foram encontrados em 83%
(88/106). Uma ocorrência de HPV de 90,24% foi detectada em pacientes com idade entre
11 e 30 anos. Entre usuários de múltiplas drogas 86,67% (52/60) foram positivos e
múltiplas infecções por HPV foram identificadas em 23,08% (12/52). Entre os "não
usuários" a ocorrência foi de 78,26% (36/46) e dois tipos de HPV foram identificados em
13,89%. CONCLUSÕES: A ocorrência de HPV encontrada neste estudo difere
marcadamente de estudos realizados ao redor do mundo, em que foram relatadas taxas
mais baixas. Há poucos dados disponíveis sobre a frequência de infecção oral por HPV na
43
população brasileira, especialmente entre usuários de drogas ilícitas. Sabe-se que estes,
notadamente os de crack, apresentam comportamento sexual de risco para a exposição a
Doenças Sexualmente Transmissíveis. Estudos adicionais sobre a prevalência do HPV
entre usuários de drogas são necessários para melhor compreensão da sua exposição ao
vírus e o desenvolvimento de estratégias de prevenção.
INTRODUÇÃO
A infecção pelo Papilomavirus Humano (HPV) é uma das doenças sexualmente
transmissíveis virais mais incidentes no mundo [1,2]. Suas infecções podem variar do
estabelecimento de formas assintomáticas à indução de cânceres de células escamosas [3].
Em sua maioria, os indivíduos infectados apresentam infecções subclínicas e livram-se
naturalmente do vírus sem saber sequer que já foram expostos a ele [1,3].
O HPV é um pequeno DNA vírus, não-envelopado, icosaédrico, epiteliotrópico,
que infecta pele e mucosas em diversas regiões do corpo [4-6]. De acordo com a
homologia de seu genoma, aproximadamente 200 tipos de HPV foram identificados e estes
foram classificados em alto ou baixo risco oncogênico de acordo com sua relação com a
oncogênese cervical [6-8].
Nos Estados Unidos, estima-se que diariamente 12 mil jovens entre 15 e 24 anos
são infectados pelo HPV [1]. No Brasil, a incidência estimada é de 500 mil a 1 milhão de
novos casos por ano [2]. Mudanças no comportamento sexual de homens e mulheres
podem estar associadas ao aumento dos casos da infecção por HPV na cavidade oral [9];
porém, acredita-se que na infecção oral o contágio ocorra principalmente por auto
inoculação a partir de lesões cutâneas ou genitais já existentes, havendo também a
possibilidade de transmissão materno-fetal [6,7,10].
44
Atualmente, evidências crescentes reforçam o papel do HPV em um subtipo de
câncer de cabeça e pescoço, o Carcinoma de Células Escamosas Oral (CCEO) [11-13].
Porém, taxas variáveis da infecção pelo HPV tem sido reportadas em trabalhos realizados
em mucosa oral saudável, sugerindo o funcionamento desta como reservatório do vírus
[14-16]. Em estudo populacional conduzido nos Estados Unidos entre 2009 e 2010, a
prevalência de HPV foi de 6,9%, com 3,7% das infecções assintomáticas ocasionadas por
HPV de alto risco e 3,1% por de baixo risco oncogênico [17]. Tristão et al. (2012), no
estado de São Paulo obtiveram prevalência de 23,2%, também em mucosas saudáveis [2].
Sua detecção em epitélio de mucosa oral normal ainda não permite inferências mais
precisas quanto ao seu papel na carcinogênese desta região, ou seja, se o vírus é o principal
agente etiológico, se é um coadjuvante ou se apenas está presente no epitélio oral, atuando
como um comensal que pode vir a se tornar patogênico [5].
O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar avaliar e comparar a ocorrência de
HPV e seus genótipos em mucosa oral saudável de usuários e não-usuários de drogas
ilícitas em um estado no Nordeste do Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS
Pacientes
Foi conduzido um estudo transversal, com amostragem realizada por conveniência,
envolvendo homens, mulheres e crianças, atendidos no ambulatório de Odontologia do
Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe (HU-UFS) e em clínicas e
instituições de recuperação de usuários de álcool e drogas do estado de Sergipe, localizadas
nas cidades de Aracaju e São Cristóvão, de janeiro de 2013 a março de 2014. Este estudo
45
foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Sergipe
(parecer nº 76317). Todos os participantes tiveram seu Termo de Consentimento Livre
Esclarecido assinado pelo próprio paciente ou responsável. Dados clínicos associados a
fatores de risco para o desenvolvimento do câncer oral e dados socioeconômicos foram
coletados do prontuário do paciente.
Coleta e processamento
As amostras foram coletadas por esfoliação da mucosa oral utilizando escovas
citológicas estéreis nas regiões dos palatos mole e duro, assoalho oral, mucosa jugal
bilateralmente e superfícies dorsal e ventral da língua [5,6,18]. O material coletado foi
armazenado em etanol 70% a 4ºC por até 15 dias antes do processamento.
O DNA das amostras foi extraído através de digestão enzimática utilizando solução
de lise contendo proteinase K. As amostras foram centrifugadas por 5min a 3500rpm e o
sobrenadante desprezado. Diluiu-se o pellet em 500µL de solução de lise (NaCl 5M; TrisHCl 0,5M pH7,6; EDTA 0,5M pH8; SDS 10%; Proteinase K 0,5mg/mL) e transferiu-se
para tubos Eppendorf® de 1,5mL que foram incubados em banho-maria a 60ºC por 5h.
Adicionou-se 67µL de NaCl em cada tubo e estes foram submetidos a agitação vigorosa
em vórtex por 30s e então centrifugados por 20min a 14000rpm a 4oC. O sobrenadante foi
transferido para novo tubo e adicionado 400µL de isopropanol gelado, armazenando
overnight a -20ºC. Após esse período, foram centrifugadas por 20min a 14000rpm a4ºC. O
sobrenadante foi descartado e adicionaram-se 400µL de etanol 70%, homogeneizando no
vórtex. As amostras foram centrifugadas por 10min a 14000rpm a 4oC e o sobrenadante foi
novamente descartado. O DNA extraído foi ressuspendido em 30µL de TE e permaneceu
armazenado a -20ºC até o momento de uso.
46
Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)
Para o preparo do pré-mix foi utilizada capela de fluxo laminar previamente
esterilizada por luz ultravioleta durante 15 minutos, em sala de pré-PCR. Todos os mixes
possuíam volume de 18L compostos por 10L PCR Buffer Go Taq Green (Promega);
0,6L de cada primer na concentração de 10M e 6,8L de água Milli-Q autoclavada
(Milli Q Plus, Milipore). Posteriormente, adicionou-se 2L do DNA pesquisado, obtendose volume final de 20L.
Como controle de qualidade da extração de DNA das amostras foi utilizado o par
de primers RS42/KM29 para amplificação do gene da β-globina [19]. As amplificações
foram realizadas em termociclador Veriti® Thermal Cycler (Applied Biosystems), seguindo
as condições de reação: 95ºC durante 5 minutos para a desnaturação inicial; 35 ciclos de
94ºC por 1 minuto, anelamento a 60ºC por 1 minuto e amplificação a 72ºC durante 1
minuto; finalizando com extensão por10 minutos a 72ºC e manutenção das amostras a 4ºC.
Para todas as análises foram consideradas apenas as amostras positivas para β-globina.
Para a amplificação do genoma do HPV foram utilizados os primers degenerados
MY09/MY11 e os gerais GP5+/GP6+ que amplificam sequências de pares de base da
região L1 do DNA do HPV [13,20]. Inicialmente 2L de cada amostra foram amplificados
com os primers MY9/MY11. A segunda PCR consistiu na amplificação de 2L do produto
da primeira PCR utilizando-se os primers GP5+/GP6+. As reações seguiram os
parâmetros: desnaturação a 95ºC por 5 minutos; 44 ciclos de 95ºC durante 45 segundos,
47,7ºC por 45 segundos para anelamento e amplificação a 72ºC por 1 minuto;e 7 minutos a
72ºC para extensão final. Como controle positivo utilizou-se em todas as reações DNA de
HPV-16 extraído de células HeLa.
47
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%
(Invitrogen) corado com Gel RedTM (Bio Labs) sob 100v por 1 hora. O resultado foi
visualizado em transiluminador com luz ultra-violeta e as amostras positivas
posteriormente encaminhadas para genotipagem.
Genotipagem
Para a genotipagem foi utilizada a técnica de multiplex-PCR com primers
específicos para os tipos virais 6, 16 e 18. As reações foram realizadas em termociclador
Eppendorf Mastercycle Personal com volume final de 20L compostos por 10L PCR
Buffer Go Taq Green (Promega); 0,6L de cada primer na concentração de 10M; 6,8L
de água Milli-Q autoclavada (Milli Q Plus, Milipore) e 2L da amostra pesquisada. As
condições de reação utilizadas foram: desnaturação inicial a 94ºC durante 1 minuto; 37
ciclos de 94ºC por 1 minuto, anelamento a 53,5ºC por 30 segundos e amplificação a 72ºC
durante 1 minuto; finalizando com extensão por7 minutos a 72ºC.
Análise estatística
A análise descritiva foi realizada sob a forma de tabelas e os dados observados
expressos pela frequência absoluta (n) e relativa (%).
RESULTADOS
Características dos pacientes
48
As características dos pacientes avaliados neste estudo estão apresentadas na Tabela
1. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (67,92%). Tabagismo e consumo de
álcool foi relatado por 85,13% (74/106) dos pacientes e 56,6% (60/106) utilizavam outras
drogas que não tabaco e álcool. Entre estes, 48,33% (29/60) usavam três ou mais drogas
ilícitas, 70% (42/60) eram usuários de crack e 80% (48/60) de maconha.
Pesquisa de HPV
A positividade de DNA de HPV nas amostras foi de 83,02% (88/106). O tipo viral
mais frequente foi o HPV-6, presente em 45,45% (40/88) das amostras positivas, seguido
do HPV-18 identificado em 35,23% (31/88) e do HPV-16 em 4,54% (4/88). Infecção por
dois tipos virais foi detectada em 17 amostras, representando uma taxa de 19,32%. Em
34,09% (30/88) das amostras o tipo viral presente não foi identificado. Todas as 106
amostras pesquisadas foram positivas para beta-globina.
Uma ocorrência de HPV de 90,24% (37/41) foi detectada em pacientes jovens com
idade entre 11 e 30 anos, passando para 78,72% (37/47) nos pacientes entre 30 e 50 anos e
chegando a 77,78% (14/18) de positividade naqueles com faixa etária de 50 a 79 anos.
A taxa de positividade de DNA de HPV nas amostras de pacientes que relataram o
consumo de álcool, tabaco ou outras drogas foi de 85,13% (63/74) com a presença de
infecção múltipla por HPV-6 e HPV-18 em 20,63% (13/63) das amostras. Estas
prevalências foram maiores do que as encontradas no grupo de pacientes que relatou o não
consumo de nenhuma dessas substâncias, no qual foram detectadas 78,12% (25/32) de
amostras positivas para a presença do HPV e 12% (3/25) destas contendo infecção múltipla
por HPV-6 e HPV-18.
49
Entre os pacientes usuários de múltiplas drogas, 86,67% (52/60) foram positivos
para a presença de HPV, como visto na Tabela 2. O HPV-6 foi o tipo mais frequente tendo
sido detectado em 48,08% (25/52) dessas amostras, seguido do HPV-18 em 42,31%
(22/52) e do HPV-16 em 3,85% (2/52). Em 23,08% (12/52) das amostras infecções
múltiplas foram identificadas e em 28,85% (15/52) o tipo viral não foi identificado.
Enquanto entre pacientes não usuários a ocorrência do HPV foi de 78,26% (36/46)
e as frequências dos tipos virais foram de 41,67% (15/36) para o HPV-6, 25% (9/36) para o
HPV-18 e 5,55% (2/36) para o HPV-16. Nestes pacientes, dois tipos virais foram
identificados em 13,89% (5/36) das amostras e uma taxa de 41,67% (15/36) das amostras
teve seus tipos virais não identificados.
DISCUSSÃO
Assim como em casos de lesões orais, taxas variáveis da infecção pelo HPV em
mucosa oral saudável tem sido reportadas na literatura, sugerindo o funcionamento desta
como reservatório do vírus [14,16,17].
Neste estudo, 83% dos pacientes apresentaram positividade para o HPV em mucosa
oral clinicamente sadia no estado de Sergipe, estado localizado na região nordeste do
Brasil. Essa taxa se assemelha à encontrada por Terai et al. (1999) no Japão (81%) [21],
porém diverge acentuadamente de trabalhos realizados em todo o mundo, os quais
apresentaram uma prevalência mais baixa do vírus [16, 22, 23].
Poucos dados sobre a frequência de infecção oral por HPV na população brasileira
estão disponíveis. Pesquisa realizada com jovens universitários no Rio de Janeiro não
detectou infecção por HPV em nenhuma das amostras de raspado de mucosa oral sadia [5].
Entretanto, estudo de Tristão et al. (2012) no estado de São Paulo obteve uma prevalência
de 23,2% em mucosas saudáveis [2]. Araújo et al. (2014) no estado do Pará, encontraram
50
24,1% de positividade em suas amostras utilizando apenas os primers MY09/MY11 [24] e
Brasil et al. (2013) detectaram uma prevalência de 54% em mucosa oral sadia de mulheres
cujos parceiros possuíam lesões de pênis relacionadas ao HPV [25].
Em nosso trabalho, uma maior ocorrência (90,24%) do vírus foi encontrada entre
jovens de 11-30 anos, decrescendo até 77,78% entre adultos com faixa etária de 50 a 79
anos. Tal fato está de acordo com Mbulawa et al. (2014), que indicam um risco de infecção
por HPV inversamente proporcional à idade dos indivíduos analisados [22] e com
Esquenazi et al. (2010), que relatam uma maior prevalência da infecção entre jovens [5].
Diferente de Durzynska et al. (2011) que não encontraram HPV de alto risco oncogênico
em adolescentes de 10 a 18 anos, identificamos o HPV-18 em 4 amostras de pacientes
nesta faixa etária [15].
Diferenças geográficas e/ou populacionais tem sido relacionadas às diferentes
prevalências comumente encontradas para a infecção pelo HPV [15,26]. As diferenças
metodológicas são outro fator importante para essas variações e, como exposto por Cason
et al. (2005), as taxas de detecção do DNA viral variam de acordo com o método de coleta
e transporte das amostras, além do protocolo de extração de DNA, sendo a escolha das
técnicas utilizadas de extrema importância para evitar resultados falso negativos e
assegurar taxas mais próximas das reais [27]. A coleta de material por esfoliação de
mucosa oral tem com vantagens um fácil transporte, baixo custo, facilidade no
processamento e também uma melhor aceitação por parte dos pacientes por seu caráter não
invasivo [28]. Kero et al. (2012) apontam uma otimização dos resultados como
justificativa para a escolha deste método de coleta associado à purificação do DNA
extraído e ao uso da técnica de nested PCR em seu trabalho [29].
Diversos tipos de HPV tem sido relatados em mucosa oral sem lesão aparente em
todo o mundo. Na África, Mbulawa et al. (2014) encontraram 22 tipos de HPV em mucosa
51
oral sadia de casais heterossexuais [22]. Em estudo populacional conduzido nos Estados
Unidos entre 2009 e 2010, Gillison et al. (2012), obtiveram uma prevalência da infecção
por HPV de 6,9% e encontraram 37 diferentes tipos virais utilizando Linear Array, com
3,7% das infecções assintomáticas por HPV de alto risco e 3,1% por HPV de baixo risco
oncogênico [17].
No presente estudo detectamos, através do multiplex-PCR tipo-específico, a
presença de HPV-6 em 45,45% de nossas amostras HPV-positivas, HPV-18 em 35,23% e
HPV-16 em 4,54%. Infecções múltiplas entre HPV de baixo e alto risco oncogênico foram
encontradas em 19,32% dos casos e em 34% os tipos virais presentes não foram
identificados. Esses resultados diferem de trabalhos como o de Turner et al. (2011), em
que foi detectada a presença do HPV-16 em todas as suas amostras positivas, enquanto o
HPV-18 não esteve presente em nenhuma das amostras analisadas [16]. Em pesquisa
realizada por Gillison et al. (2012), o tipo viral mais frequente também foi o HPV-16,
estando presente em 48 de suas 408 amostras positivas, enquanto o HPV-18 esteve em 12 e
o HPV-6 em 21 casos [17]. Porém, nossos resultados se assemelham a dados de Gichki et
al. (2012) que identificaram o HPV-18 em 25% de suas amostras e o HPV-16 em 9% [23].
No Brasil, Araújo et al. (2014), no estado do Pará, encontraram como tipo viral mais
frequente o HPV-18 com prevalência de 12,5% [24].
Altas taxas de co-infecção por mais de um tipo viral em mucosa oral sadia foram
encontradas por Terai et al. (1999) que identificaram mais de um tipo viral em 56,7% dos
indivíduos HPV-positivos avaliados [21] e por Machado et al. (2014) que obtiveram
prevalência de infecção múltipla em 42,8% de suas amostras positivas no Brasil, no estado
do Mato Grosso do Sul [26]. Em nosso trabalho, uma maior taxa de co-infecção foi
encontrada entre indivíduos que relataram consumo de álcool, tabaco e/ou múltiplas drogas
52
(22,23%) do que entre aqueles que relataram não possuir nenhum destes três hábitos de
consumo (12%).
Estudos tem relacionado o tabaco a uma supressão imunológica do indivíduo que
permite o estabelecimento de uma infecção persistente pelo HPV [17,23,30]. Em trabalho
de Gichki et al. (2012), 72,8% das pessoas com mucosa oral sadia infectada pelo vírus
eram tabagistas [23]. Assim como em nosso trabalho, Gillison et al. (2012) demonstraram
maior prevalência do HPV entre tabagistas e consumidores de álcool, com prevalência
ainda maior naqueles que consumiam as duas substâncias. Eles observaram também um
risco aumentado de infecção oral por HPV entre usuários de maconha, consumida por 80%
de nossos pacientes usuários de múltiplas drogas [17].
Está bem estabelecido na literatura que usuários de múltiplas drogas, marcadamente
os de crack, apresentam comportamento sexual de risco, como múltiplos parceiros, baixos
índices de uso de preservativos e até mesmo prostituição, o que eleva a probabilidade de
exposição a doenças sexualmente transmissíveis [31,32]. Mudanças no comportamento
sexual de homens e mulheres na população em geral podem estar associadas ao aumento
dos casos da infecção por HPV na cavidade oral [9]. Diversas pesquisas tem relacionado
múltiplos parceiros no sexo oral e também no beijo “de boca aberta” a um aumento no
risco de infecção pelo vírus [22,25,26]. Estudos relatam a conduta sexual desprotegida
como um comportamento de risco muito prevalente entre jovens sexualmente ativos no
Brasil [33]. Pesquisa realizada no Brasil por Barbosa et al. (2008) indicou que no
Norte/Nordeste do país encontra-se uma maior proporção de homens que relatam ter tido
mais de uma parceira sexual no período de um ano e que, tanto para homens como para
mulheres, houve um aumento no relato de sexo oral entre 1998 e 2005 de acordo com a
escolaridade em todo o país, tendo sido mais relatado também por homens que vivem no
Norte/Nordeste [34].
53
Tendo em vista que a infecção pelo HPV antecede o desenvolvimento das lesões
HPV-relacionadas, estudos sugerem a vacinação contra o HPV como estratégia para
prevenção da infecção pelo vírus e do desenvolvimento destas lesões [27]. Acredita-se que
a vacina profilática contra o vírus reduzirá o número de lesões na cavidade oral,
principalmente pela proteção contra os tipos virais HPV-16 e HPV-18, de alto risco
oncogênico [35].
O achado da presença do HPV em mucosas orais normais e de prevalências
variáveis do mesmo em estudos que avaliaram lesões orais, além de certa dificuldade no
estabelecimento do papel individual de seus fatores de risco, torna sua relação com o
processo de desenvolvimento de lesões orais ainda controversa. Novos estudos que
busquem uma melhor compreensão da relação entre a presença do vírus e o
desenvolvimento dessas lesões se fazem necessários. Poucos dados estão disponíveis sobre
a infecção oral por HPV na população brasileira e em especial em usuários de múltiplas
drogas. Estudos adicionais sobre a prevalência do HPV entre usuários de drogas são
essenciais para um melhor conhecimento sobre sua exposição ao vírus e para o
desenvolvimento de estratégias de prevenção.
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60
Tabela 1 – Prevalências do HPV e seus tipos em pacientes do estado de Sergipe, Brasil, com mucosa oral saudável classificadas de acordo com
dados clínicos.
HPV
CARACTERÍSTICAS
TOTAL
PREVALÊNCIA
HPV-6
HPV-16
HPV-18
HPV-6/16
HPV-6/18
Não identificado
GÊNERO
Feminino
Masculino
TOTAL
34
72
106
79,41% (27/34)
84,72% (61/72)
83,02% (88/106)
8
15
23
1
2
3
4
11
15
1
1
3
13
16
11
19
30
IDADE
11 |--- 30
30 |--- 50
50 |---| 79
41
47
18
90,24% (37/41)
78,72% (37/47)
77,78% (14/18)
7
10
6
1
1
1
8
5
2
7
7
2
14
13
3
14
32
60
78,57% (11/14)
78,12% (25/32)
86,67% (52/60)
3
7
13
1
2
2
3
10
1
3
12
4
11
15
1
Só TABACO / ÁLCOOL
Sim
Não
TABACO / ALCOOL / OUTRAS DROGAS
1
61
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68
ANEXOS
69
Anexo A. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Usuários de drogas
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA
NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
O Sr.(a) está sendo convidado(a) como voluntário(a) a participar do estudo
“Pesquisa e Genotipagem do Papilomavirus Humano (HPV) em Lesões Presentes na
Cavidade Oral de Usuários de Crack do Estado de Sergipe”, o qual tem por objetivo
detectar a presença do vírus HPV em lesões da boca de usuários de crack no estado de
Sergipe.
Para participar deste estudo você não terá nenhum custo, nem receberá qualquer
vantagem financeira. Você será esclarecido(a) sobre o estudo em qualquer aspecto que
desejar e estará livre para participar ou recusar-se a participar, mesmo tendo aceitado e
assinado este termo, conforme assegura a legislação vigente. Poderá retirar seu
consentimento ou interromper a participação a qualquer momento. A sua participação é
voluntária e a recusa em participar não acarretará qualquer penalidade ou modificação na
forma em que é atendido pelo pesquisador. Sua identidade será tratada com padrões
profissionais de sigilo e os resultados da pesquisa estarão à sua disposição quando
finalizada. Seu nome ou o material que indique sua participação não será liberado sem a
sua permissão e o(a) Sr(a) não será identificado em nenhuma publicação que possa resultar
deste estudo.
Este termo de consentimento encontra-se impresso em duas vias, sendo que uma
cópia será arquivada pelo pesquisador responsável no Laboratório de Entomologia e
Parasitologia Tropical, localizado no Departamento de Morfologia, Centro de Ciências
Biológicas e da Saúde, da Universidade Federal de Sergipe e a outra será fornecida a você.
Eu, ____________________________________________, portador do documento de
Identidade ____________________ fui informado (a) dos objetivos do estudo “Pesquisa e
Genotipagem do Papilomavirus Humano (HPV) em Lesões Presentes na Cavidade
Oral de Usuários de Crack do Estado de Sergipe” de maneira clara e detalhada e
esclareci minhas dúvidas. Sei que a qualquer momento poderei solicitar novas informações
e modificar minha decisão de participar se assim o desejar. Declaro que concordo em
participar desse estudo. Recebi uma cópia deste termo de consentimento livre e esclarecido
e me foi dada à oportunidade de ler e esclarecer as minhas dúvidas.
Aracaju/SE, _____ de________ _____ de 20___
_____________________________________________
Assinatura do paciente ou responsável
____________________________________________
Mariana Goveia Melo Ribeiro
Responsável pela Pesquisa
contato: 79 98279668
e-mail: [email protected]
70
Anexo B. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Não usuários de drogas
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA
NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
O Sr.(a) está sendo convidado(a) como voluntário(a) a participar do estudo
“Pesquisa e Genotipagem do Papilomavirus Humano (HPV) em Lesões Presentes na
Cavidade Oral de Usuários de Crack do Estado de Sergipe”, o qual tem por objetivo
detectar a presença do vírus HPV em lesões da boca de usuários de crack no estado de
Sergipe, como membro do grupo controle composto por pacientes não usuários da
droga, para fins comparativos.
Para participar deste estudo você não terá nenhum custo, nem receberá qualquer
vantagem financeira. Você será esclarecido(a) sobre o estudo em qualquer aspecto que
desejar e estará livre para participar ou recusar-se a participar, mesmo tendo aceitado e
assinado este termo, conforme assegura a legislação vigente. Poderá retirar seu
consentimento ou interromper a participação a qualquer momento. A sua participação é
voluntária e a recusa em participar não acarretará qualquer penalidade ou modificação na
forma em que é atendido pelo pesquisador. Sua identidade será tratada com padrões
profissionais de sigilo e os resultados da pesquisa estarão à sua disposição quando
finalizada. Seu nome ou o material que indique sua participação não será liberado sem a
sua permissão e o(a) Sr(a) não será identificado em nenhuma publicação que possa resultar
deste estudo.
Este termo de consentimento encontra-se impresso em duas vias, sendo que uma
cópia será arquivada pelo pesquisador responsável no Laboratório de Entomologia e
Parasitologia Tropical, localizado no Departamento de Morfologia, Centro de Ciências
Biológicas e da Saúde, da Universidade Federal de Sergipe e a outra será fornecida a você.
Eu, ____________________________________________, portador do documento de
Identidade ____________________ fui informado (a) dos objetivos do estudo “Pesquisa e
Genotipagem do Papilomavirus Humano (HPV) em Lesões Presentes na Cavidade
Oral de Usuários de Crack do Estado de Sergipe” de maneira clara e detalhada e
esclareci minhas dúvidas. Sei que a qualquer momento poderei solicitar novas informações
e modificar minha decisão de participar se assim o desejar. Declaro que concordo em
participar desse estudo. Recebi uma cópia deste termo de consentimento livre e esclarecido
e me foi dada à oportunidade de ler e esclarecer as minhas dúvidas.
Aracaju/SE, _____ de________ _____ de 20___
_____________________________________________
Assinatura do paciente ou responsável
____________________________________________
Mariana Goveia Melo Ribeiro
Responsável pela Pesquisa
contato: 79 98279668
e-mail: [email protected]
71
Anexo C. Formulário de coleta de dados
DADOS PESSOAIS
Nome do paciente
Instituição
Gênero
Cadastro
Feminino
Masculino
/
Data de nascimento
/
DADOS SÓCIO-ECONÔMICOS
Cor
Branca
Parda
Negra
Outra. Qual? _________________
Grau de
Analfabeto (a)
Ensino médio
Escolaridade
Ensino fundamental
Ensino superior
Estado civil
Solteiro (a)
Divorciado (a)
Casado (a)
Viúvo (a)
Renda familiar
< 1 salário mínimo
De 1 a 3 salários mínimos
>3 salários mínimos
DADOS DE SAÚDE
Número de gravidezes
Não lembra/não sabe
Número de parceiros (as) sexuais que teve
Não lembra/não sabe
Idade da primeira relação sexual
Não lembra/não sabe
Sim
Costuma usar camisinha?
Sim
Teve/tem alguma DST?
Não sabe
Sim
Não
Sim
Consome bebidas alcoólicas?
Consome outras drogas?
Não sabe
Não
Qual(is)?
Fuma cigarro?
Não
Sim
Quais?
CARACTERÍSTICAS DA LESÃO
Não
Não
72
Anexo D. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFS
73
Anexo E. Normas para publicação no periódico Journal of Oral Pathology &
Medicine
JOURNAL OF ORAL PATHOLOGY & MEDICINE
AUTHOR GUIDELINES
Content of Author Guidelines:
5. Manuscript Format and Structure
5. MANUSCRIPT FORMAT AND STRUCTURE
5.1. Page Charge
Articles exceeding 6 published pages are subject to a charge of USD 163 per additional
page. One published page amounts approximately to 5,500 characters (excluding figures and
tables).
5.2. Format Language
The language of publication is English. Authors for whom English is a second language
may choose to have their manuscript professionally edited before submission to improve the
English. A list of independent suppliers of editing services can be found
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arranged by the author, and use of one of these services does not guarantee acceptance or
preference for publication.
Abbreviations, Symbols and Nomenclature: Use only standard abbreviations (Vancouver
System). All units will be metric. Use no roman numerals in the text. In decimals, a decimal point,
and not a comma, will be used. Avoid abbreviations in the title. The full term for which an
abbreviation stands should precede its first use in the text unless it is a standard unit of
measurement. Useful is Baren DN, ed. Units, symbols, and abbreviations. A guide for biological
and medical editors and authors. 4. ed. London: Royal Society of Medicine.
Font: When preparing your file, please use only standard fonts such as Times, Times New Roman
or Arial for text, and Symbol font for Greek letters, to avoid inadvertent character substitutions. In
particular, please do not use Japanese or other Asian fonts. Do not use automated or manual
hyphenation.
5.3. Structure
All papers submitted to Journal of Oral Pathology & Medicine should include: title page,
abstract, main text, references and tables, figures, figure legends and conflict of interest statement
where appropriate. Manuscripts must conform to the journal style. Manuscripts not complying with
the
journal
format
will
be
returned
to
the
author(s).
Title Page: Should be part of the manuscript document uploaded for review and include: The title
of the article, a running title of no more than 50 letters and spaces, 2-5 keywords, complete names
and institution for each author, corresponding author's name, address, email address and fax
number.
Abstract: is limited to 250 words in length and should contain no abbreviations. The abstract
should be included in the manuscript document uploaded for review as well as inserted separately
74
where specified in the submission process. The abstract should convey the essential purpose and
message of the paper in an abbreviated form. For original articles the abstract should be structured
with the following headings in accordance with Index Medicus (Medical Subject Headings):
background, methods, results and conclusions. For other article types, please choose headings
appropriate for the article.
Main Text of Original Articles: should be divided into introduction, material and methods, results
and discussion.
Introduction: should clearly state the purpose of the article. Give only strictly pertinent references.
Exhaustive literature reviews are inappropriate.
Materials and Methods: must contain sufficient detail such that, in combination with the
references cited, all clinical trials and experiments reported can be fully reproduced. As a condition
of publication, authors are required to make materials and methods used freely available to
academic researchers for their own use. This may for example include antibodies etc. Other
supporting data sets must be made available on the publication date from the authors directly.
(i) Clinical trials: Clinical trials should be reported using the CONSORT guidelines available
atwww.consort-statement.org. A CONSORT checklist should also be included in the submission
material.
Journal of Oral Pathology & Medicine encourages authors submitting manuscripts
reporting from a clinical trial to register the trials in any of the following free, public clinical trials
registries:www.clinicaltrials.gov, http://clinicaltrials-dev.ifpma.org/, http://isrctn.org/. The clinical
trial registration number and name of the trial register will then be published with the paper.
(ii)Experimental subjects: Experimentation involving human subjects will only be published if
such research has been conducted in full accordance with ethical principles, including the World
Medical Association Declaration of Helsinki (version, 2002 www.wma.net/e/policy/b3.htm) and
the additional requirements, if any, of the country where the research has been carried out.
Manuscripts must be accompanied by a statement that the experiments were undertaken with the
understanding and written consent of each subject and according to the above mentioned principles.
A statement regarding the fact that the study has been independently reviewed and approved by an
ethical board should also be included. Editors reserve the right to reject papers if there are doubts as
to whether appropriate procedures have been used.
When experimental animals are used the methods section must clearly indicate that
adequate measures were taken to minimize pain or discomfort. Experiments should be carried out
in accordance with the Guidelines laid down by the National Institute of Health (NIH) in the USA
regarding the care and use of animals for experimental procedures or with the European
Communities Council Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC) and in accordance with local
laws and regulations.
(iii) Suppliers: Suppliers of materials should be named and their location (town, state/county,
country) included.
Results: Present your results in logical sequence in the text, tables, and illustrations. Do not repeat
in the text all the data in the tables, illustrations, or both: emphasize or summarize only important
observations.
Discussion: Emphasize the new and important aspects of the study and conclusions that follow
from them. Do not repeat in detail data given in the Results section. Include in the Discussion the
implications of the findings and their limitations and relate the observations to other relevant
studies.
75
Main Text of Review Articles comprise an introduction and a running text structured in a suitable
way according to the subject treated. A final section with conclusions may be added.
Acknowledgements: Under acknowledgements please specify contributors to the article other than
the authors accredited. Acknowledge only persons who have made substantive contributions to the
study. Authors are responsible for obtaining written permission from everyone acknowledged by
name because readers may infer their endorsement of the data and conclusions. See also above
under
Ethical
Guidelines.
Conflict of Interest Statement: All sources of institutional, private and corporate financial support
for the work within the manuscript must be fully acknowledged, and any potential grant holders
should be listed. Please see Conflicts of Interest for generally accepted definitions on conflict of
interest? See also above under Ethical Guidelines.
5.4. References
References should be kept to the pertinent minimum and numbered consecutively in the
order in which they appear in the text. Identify references in text, tables, and legends by Arabic
numerals (in parentheses). References cited only in the tables or figure legends should be numbered
in accordance with a sequence established by the first identification of that figure or table in the
text. Use the style of the examples below, which are based on the formats used in Index Medicus.
Try to avoid using abstracts as references. Include manuscripts accepted, but not published;
designate the abbreviated title of the journal followed by (in press). Information from manuscripts
not yet accepted, should be cited in the text as personal communication. The references must be
verified by the author(s) against the original documents. Titles should be abbreviated in accordance
with the style used in Index Medicus and the Vancouver System.
We recommend the use of a tool such as Reference Manager for reference management and
formatting.
Reference
Manager
reference
styles
can
be
searched
for
here:www.refman.com/support/rmstyles.asp
Examples of the Journal's reference style:
(1) Standard journal article (List all authors when 6 or less; when 7 or more, list only the first 3
and add et al.)
BUCHNER A, SCIUBBA JJ. Peripheral epithelial odontogenic tumors: a review. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol 1987; 63: 688-97.
HEINIC GS, GREENSPAN D, MACPHAIL LA, et al. Oral Histoplasma capsulatum infection in
association with HIV infection: a case report. J Oral Pathol Med 1992; 21: 85-9.
(2) Corporate author
European Collaborative Study. Risk factors for mother-to-child transmission of HIV-1. Lancet
1992; 339: 1007-12.
(3) No author given
Anonymous. `The importance of being early' [leader]. Br Dent J 1991; 170: 167.
(4) Journal supplement
MØLLER-PETERSEN J. Evaluation of diagnostic tests. Design and phases. Scand J Clin Lab
Invest 1992; 52: suppl. (208): 35-50.
CROSS SS, SCHOLFIELD JH, KENNEDY A, COTTON DWK. Measuring the fractal dimension
of
tumour
borders.
J
Pathol
1992;
168:
117A
(abstr).
76
(5) Journal paginated by issue
HILLAM C. Dentistry in Europe in the 1790's. Dent Historian 1992; 22: (May): 31-4.
(6) Book
PINDBORG JJ. Atlas of diseases of the oral mucosa. Copenhagen: Munksgaard, 1992: 50-66.
(7) Chapter in a book
VAN DER WAAL I. Salivary gland neoplasms. In: PRABHU SR, WILSON DF, DAFTARY DK,
JOHNSON NW, eds. Oral diseases in the tropics. Oxford: Oxford Medical, 1992; 478-86.
(8) Published proceedings paper
DRINNAN AJ. Review of the literature: educational aspects of oral medicine. In: MILLARD HD,
MASON DK, eds. World workshop on oral medicine. Chicago: Year Book Medical, 1989; 5-11.
(9) Agency publication
MUIR C, WATERHOUSE J, MACK T, POWELL J, WHELAN S. Cancer incidence in five
continents: Vol. 5. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 1987; IARC Scientific
Publications No. 88.
(10) Dissertation or thesis
CHUNGPANICH S. The diagnostic and prognostic potential of nucleolar organizer regions in oral
epithelial
dysplasia.
MMedSci
Thesis,
University
of
Sheffield,
1989.
5.5. Tables, Figures and Figure Legends
Tables: should be numbered consecutively with Arabic numerals. Type each table on a separate
sheet, with titles making them self-explanatory. Due regard should be given to the proportions of
the printed page.
Figures: All figures should clarify the text and their number be kept to a minimum. Text on figures
should be in CAPITALS. Line drawings should be professionally drawn; half-tones should exhibit
high contrast.
All figures and artwork must be provided in electronic format. Figure legends should be a
separate section of the manuscript, and should begin with a brief title for the whole figure and
continue with a short description of each panel and the symbols used: they should not contain any
details of methods.
Submit your figures as EPS, TIFF or PDF files. Use 300 dpi resolution for photographic
images and 600 dpi resolution for line art.Full details of the submission of artwork are available at
http://authorservices.wiley.com/bauthor/illustration.asp.
77
Anexo F. Normas para publicação no periódico Plos ONE
Article II.
MANUSCRIPT GUIDELINES
1. Guidelines for Standard Sections
Title
Authors and Affiliations
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Results, Discussion, and Conclusions
Acknowledgments
References
Tables
Figure Legends
(a) Manuscript Organization
(b) PLOS ONE considers manuscripts of any length. There are no explicit restrictions for the
number of words, figures, or the length of the supporting information, although we
encourage a concise and accessible writing style. We will not consider monographs.
(c) All manuscripts should be double-spaced and include line numbers and page numbers.
Manuscripts should begin with the ordered sections:





Title
Authors
Affiliations
Abstract
Introduction
and end with the sections of:





Acknowledgments
References
Figure Legends
Tables
Figures should not be included in the main manuscript file. Each figure must be prepared
and submitted as an individual file.
The title, authors, and affiliations should all be included on a title page as the first page of the
manuscript file.
There are no explicit requirements for section organization between these beginning and ending
sections. Articles may be organized in different ways and with different section titles, according to
the authors' preference. In most cases, internalsections include:




MaterialsandMethods
Results
Discussion
Conclusions (optional)
PLOS ONE has no specific requirements for the order of these sections, and in some cases it may
be appropriate to combine sections. Guidelines for individual sections can be found below.
78
Abbreviations should be kept to a minimum and defined upon first use in the text. Non-standard
abbreviations should not be used unless they appear at least three times in the text.
Standardized nomenclature should be used as appropriate, including appropriate usage of species
names and SI units.
PLOS articles do not support text footnotes. If your accepted submission contains footnotes, you
will be asked to move that material into either the main text or the reference list, depending on the
content.
Section 2.02
Section 2.03 1. Guidelines for Standard Sections
(a)
(b) Title
Manuscripts must be submitted with both a full title and a short title, which will appear at the top of
the PDF upon publication if accepted. Only the full title should be included in the manuscript file;
the short title will be entered during the online submission process.
The full title must be 250 characters or fewer. It should be specific, descriptive, concise, and
comprehensible to readers outside the subject field. Avoid abbreviations if possible. Where
appropriate, authors should include the species or model system used (for biological papers) or type
of study design (for clinical papers).
Examples:

Impact of Cigarette Smoke Exposure on Innate Immunity: A Caenorhabditiselegans Model

Solar Drinking Water Disinfection (SODIS) to Reduce Childhood Diarrhoea in Rural
Bolivia: A Cluster-Randomized, Controlled Trial
The short title must be 50 characters or fewer and should state the topic of the paper.
(c)
(d) Authors and Affiliations
All author names should be listed in the following order:

First names (or initials, if used),

Middle names (or initials, if used), and

Last names (surname, family name)
Each author should list an associated department, university, or organizational affiliation and its
location, including city, state/province (if applicable), and country. If the article has been submitted
on behalf of a consortium, all author names and affiliations should be listed at the end of the article.
This information cannot be changed after initial submission, so please ensure that it is
correct.
To qualify for authorship, a researcher should contribute to all of the following:
1.
Conception and design of the work, acquisition of data, or analysis and interpretation of
data
2.
Drafting the article or revising it critically for important intellectual content
3.
Final approval of the version to be published
All persons designated as authors should qualify for authorship, and all those who qualify should
be listed. Each author must have participated sufficiently in the work to take public responsibility
for appropriate portions of the content. Those who contributed to the work but do not qualify for
authorship should be listed in the acknowledgments.
When a large group or center has conducted the work, the author list should include the individuals
whose contributions meet the criteria defined above, as well as the group name.
One author should be designated as the corresponding author, and his or her email address or other
contact information should be included on the manuscript cover page. This information will be
published with the article if accepted.
79
(e)
(f) Abstract
The abstract should:


Describe the main objective(s) of the study
Explain how the study was done, including any model organisms used, without
methodological detail

Summarize the most important results and their significance

Notexceed 300 words
Abstracts should not include:


Citations
Abbreviations, if possible
(g)
(h) Introduction
The introductionshould:

Provide background that puts the manuscript into context and allows readers outside the
field to understand the purpose and significance of the study

Define the problem addressed and why it is important

Include a brief review of the key literature

Note any relevant controversies or disagreements in the field

Conclude with a brief statement of the overall aim of the work and a comment about
whether that aim was achieved
(i)
(j) Materials and Methods
This section should provide enough detail to allow suitably skilled investigators to fully replicate
your study. Specific information and/or protocols for new methods should be included in detail. If
materials, methods, and protocols are well established, authors may cite articles where those
protocols are described in detail, but the submission should include sufficient information to be
understood independent of these references.
We encourage authors to submit detailed protocols for newer or less well-established methods as
Supporting Information. Further information about formatting Supporting Information files, can be
found here.
Methods sections of papers on research using human or animal subjects and/or tissue or field
sampling must include required ethics statements. See the Reporting Guidelines for human
research, clinical trials, animal research, and observational and field studies for more information.
Methods sections of papers with data that should be deposited in a publicly available
database should specify where the data have been deposited and provide the relevant accession
numbers and version numbers, if appropriate. Accession numbers should be provided in
parentheses after the entity on first use. If the accession numbers have not yet been obtained at the
time of submission, please state that they will be provided during review. They must be provided
prior to publication. A list of recommended repositories for different types of data can be
found here.
Methods sections of papers using cell lines must state the origin of the cell lines used. See
the Reporting Guidelines for cell line research for more information.
Methods sections of papers adding new taxon names to the literature must follow the Reporting
Guidelines below for a new zoological taxon, botanical taxon, or fungal taxon.
80
(k)
(l) Results, Discussion, and Conclusions
These sections may all be separate, or may be combined to create a mixed Results/Discussion
section (commonly labeled "Results and Discussion") or a mixed Discussion/Conclusions section
(commonly labeled "Discussion"). These sections may be further divided into subsections, each
with a concise subheading, as appropriate. These sections have no word limit, but the language
should be clear and concise.
Together, these sections should describe the results of the experiments, the interpretation of these
results, and the conclusions that can be drawn. Authors should explain how the results relate to the
hypothesis presented as the basis of the study and provide a succinct explanation of the
implications of the findings, particularly in relation to previous related studies and potential future
directions for research.
PLOS ONE editorial decisions do not rely on perceived significance or impact, so authors should
avoid overstating their conclusions. See the PLOS ONEPublication Criteria for more information.
(m)
(n) Acknowledgments
People who contributed to the work but do not fit the PLOS ONE authorship criteria should be
listed in the acknowledgments, along with their contributions. You must ensure that anyone named
in the acknowledgments agrees to being so named.
Funding sources should not be included in the acknowledgments, or anywhere in the manuscript
file. You will provide this information during the manuscript submission process.
(o)
(p) References


Authors may cite any and all available works in the reference list.
Authors may not cite unavailable and unpublished work, including manuscripts that have
been submitted but not yet accepted (e.g., “unpublished work,” “data not shown”).

If an article is submitted to a journal and also publicly available as a pre-print, the pre-print
may be cited.

If related work has been submitted to PLOS ONE or elsewhere, authors should include a
copy with the submitted article as confidential supplementary information, for review purposes
only.

Authors should not state 'unpublished work' or 'data not shown,' but instead include those
data as supplementary material or deposit the data in a publicly available database.

Authors should not state 'unpublished work' or 'data not shown,' but instead include those
data as supplementary material or deposit the data in a publicly available database.
Reference formatting
References must be listed at the end of the manuscript and numbered in the order that they appear
in the text. In the text, citations should be indicated by the reference number in brackets. Journal
name abbreviations should be those found in the NCBI databases. A number of reference software
companies supply PLOS style files (e.g., Reference Manager, EndNote).
References should be formatted as follows:

Published papers. Hou WR, Hou YL, Wu GF, Song Y, Su XL, et al. (2011) cDNA,
genomic sequence cloning and overexpression of ribosomal protein gene L9 (rpL9) of the giant
panda
(Ailuropodamelanoleuca).
Genet
Mol
Res
10:
1576-1588.
Note: Use of a DOI number for the full-text article is acceptable as an alternative to or in addition
to traditional volume and page numbers.
81

Accepted, unpublished papers. Same as above, but “In press” appears instead of the page
numbers.

Electronic journal articles. Huynen MMTE, Martens P, Hilderlink HBM (2005) The
health impacts of globalisation: a conceptual framework. Global Health 1: 14. Available:
http://www.globalizationandhealth.com/content/1/1/14. Accessed 25 January 2012.

Books. Bates B (1992) Bargaining for life: A social history of tuberculosis. Philadelphia:
UniversityofPennsylvania Press. 435 p.

Book chapters Hansen B (1991) New York City epidemics and history for the public. In:
Harden VA, Risse GB, editors. AIDS and the historian. Bethesda: NationalInstitutesof Health. pp.
21-28.

Published media, not peer-reviewed. Examples: print or online newspapers and
magazine articles. Fountain H (29 Jan 2014). For Already Vulnerable Penguins, Study Finds
Climate
Change
Is
Another
Danger.
The
New
York
Times.
Available:http://www.nytimes.com/2014/01/30/science/earth/climate-change-taking-toll-onpenguins-study-finds.html. Accessed 17 March 2014.

New media, unregulated. Examples: blogs, websites, and other written works. Allen L
(01 Sept 2010) Announcing PLOS Blogs. Available:http://blogs.plos.org/plos/2010/09/announcingplos-blogs/. Accessed 17 March 2014.

Master of Science and Doctor of Philosophy theses. Wells A (1999) Exploring the
development of the independent, electronic, scholarly journal. M.Sc. Thesis, The University of
Sheffield. Available: http://cumincad.scix.net/cgi-bin/works/Show?2e09. Accessed 17 March 2014.

Databases and repositories. Examples: figshare, archive.com. Roberts SB (2013) QPX
Genome
Browser
Feature
Tracks.
Database:
figshare.
http://figshare.com/articles/QPX_Genome_Browser_Feature_Tracks/701214. Accessed 17 March
2014.

Multimedia. Examples: videos, movies, and TV shows. Hitchcock A, producer and
director (1954) Rear Window [Film]. Los Angeles: MGM.
(q) Tables
Tables should be included at the end of the manuscript. All tables should have a concise title.
Footnotes can be used to explain abbreviations. Citations should be indicated using the same style
as outlined above. Tables occupying more than one printed page should be avoided, if possible.
Larger tables can be published as Supporting Information. Please ensure that table formatting
conforms to our Guidelines for table preparation.
(r)
(s) Figure Legends
Figures should not be included in the manuscript file, but figure legends should be.
Figure legends should describe the key messages of a figure. Legends should have a short title of
15 words or less. The full legend should have a description of the figure and allow readers to
understand the figure without referring to the text. The legend itself should be succinct, avoid
lengthy descriptions of methods, and define all non-standard symbols and abbreviations.
(t)
(u) Human Subject Research
82
Methods sections of papers on research using human subject or samples must include ethics
statements that specify:

The name of the approving institutional review board or equivalent committee(s). If
approval was not obtained, the authors must provide a detailed statement explaining why it was not
needed

Whether informed consent was written or oral. If informed consent was oral, it must be
stated in the manuscript:
o
Why written consent could not be obtained
o
That the Institutional Review Board (IRB) approved use of oral consent
o
How oral consentwasdocumented
For studies involving humans categorized by race/ethnicity, age, disease/disabilities, religion,
sex/gender, sexual orientation, or other socially constructed groupings, authors should:



Explicitly describe their methods of categorizing human populations
Define categories in as much detail as the study protocol allows
Justify their choices of definitions and categories, including for example whether any rules
of human categorization were required by their funding agency

Explain whether (and if so, how) they controlled for confounding variables such as
socioeconomic status, nutrition, environmental exposures, or similar factors in their analysis
In addition, outmoded terms and potentially stigmatizing labels should be changed to more current,
acceptable terminology. Examples: "Caucasian" should be changed to "white" or "of [Western]
European descent" (as appropriate); "cancer victims" should be changed to "patients with cancer."
For papers that include identifying, or potentially identifying, information, authors must download
the Consent Form for Publication in a PLOS Journal (PDF), which the individual, parent, or
guardian must sign once they have read the paper and been informed about the terms of PLOS
open-access license. The signed consent form should not be submitted with the manuscript, but
authors should securely file it in the individual's case notes and the methods section of the
manuscript should explicitly state that consent authorization for publication is on file, using
wording like:
The individual in this manuscript has given written informed consent (as outlined in PLOS
consent form) to publish these case details.
For more information about PLOS ONE policies regarding human subject research, see
the Publication Criteria and Editorial Policies.