Introdução

DIFERENCIAÇÃO GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE Anopheles darlingi
Root, 1926 (Diptera: Culicidae) DO ESTADO DO AMAZONAS, USANDO
MARCADORES RAPD-PCR
Ana Paula Barbosa da Silva; INPA/UEA – [email protected]
Wanderli Pedro Tadei; INPA – [email protected]
Joselita Maria Mendes dos Santos; INPA/UEA – [email protected]
Introdução
Anopheles darlingi Root, 1926 é o principal
vetor de malária humana no Brasil. Ocorre
desde o sul do México ao norte da Argentina,
e do leste dos Alpes andinos até a costa
atlântica da América do Sul (Forattini, 1962).
Atualmente, é considerada uma espécie
monotípica. Porém, estudos prévios sobre a
biologia indicaram a presença de populações
geograficamente distintas e diferentes padrões
na atividade de picar (Malafronte et al.,
1999).
Considerando esses aspectos e sua
importância em relação à saúde pública,
estudos visando comparar a variabilidade
genética das populações em sua área de
distribuição são necessários, principalmente,
porque podem fornecer subsídios para o
desenvolvimento de novas medidas de
controle para a malária.
Nesse sentido, a técnica de DNA
Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD)
vem demonstrando bons resultados. É uma
variação da técnica de Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR), e foi desenvolvida por
Williams et al. (1990).
Nela,
utiliza-se
somente
um
oligonucleotídeo de 10-15 bases, como
iniciadores para amplificar o DNA genômico.
Os produtos da amplificação são separados
por eletroforese em gel de agarose, onde os
fragmentos maiores migram mais lentamente.
Essa técnica não necessita do conhecimento
prévio da seqüência a ser amplificada,
possibilita um maior número de marcadores
possíveis de serem mapeados, aumentando a
possibilidade de identificar grupos de ligação
(linkage)
relacionados
a
caracteres
quantitativos (QTL’s). Permite identificar o
grau de similaridade entre os genótipos, aos
níveis inter e intra-específicos de DNA
(Williams et al., 1990).
Nesse trabalho, foi analisada a variabilidade
genética intra e interpopulacional de A. darlingi,
procedentes de localidades ao longo dos rios Negro e
Solimões (AM), utilizando marcadores moleculares
de RAPD-PCR.
Material e métodos
A. Procedência e Coleta das Amostras
A análise da variabilidade genética foi realizada
a partir da geração F1 de fêmeas capturadas em
campo. As capturas de anofelinos adultos foram
realizadas em quatro cidades do Estado do
Amazonas: Manaus e São Gabriel da Cachoeira
(localizadas às margens do Rio Negro); Coari e
Tabatinga (localizadas às margens do rio
Solimões-Amazonas). Em laboratório, as fêmeas
foram postas individualmente para desovar, e
identificadas posteriormente, usando as chaves de
Gorham et al. (1967) e Consoli & Lourenço-deOliveira (1994). Foram analisados 30 indivíduos
de cada população.
B. Extração e Amplificação do DNA – RAPD
A extração de DNA foi realizada segundo o
protocolo descrito em Wilkerson et al. (1995),
com algumas modificações.
A reação de amplificação foi conduzida em
volume total de 25µl, contendo 1µl de DNA,
2,5µl de PCR buffer, 1,5µl de MgCl2, 2,5µl de
dNTP, 2,5µl de primer (AM 05 - 5’GTGACGTAGC-3’,
AM
08
5’GTTGCGATCC-3’
e AM 09
- 5’GGACTGGAGT-3’, Operon Technologies Inc.
Alameda, CA.), 0,3µl de Taq DNA polimerase
(Invitrogen) e 14,7µl de água milli-q autoclavada.
A amplificação (RAPD) foi realizada em termociclador marca Perking-Elmer, progamado para
45 ciclos com as seguintes etapas: desnaturação
das fitas de DNA (1min. à 94ºC), anelamento do
primer (1min. à 36ºC), alongamentos das fitas
sintetizadas (2min. à 72ºC) e um ciclo de
alongamento final (7 min. à 72ºC).
C. Eletroforese e Fotodocumentação
Os produtos amplificados foram fracionados
em gel de agarose a 1,5% e corados com
solução de Brometo de Etídio (5ng/µL). Em
seguida, estes foram visualizados e
fotografados
em
um
aparelho
de
fotodocumentação de gel, modelo Eagle Eye
II (Stratagene), luz ultravioleta de 300nm de
comprimento de onda.
D. Análise Estatística
Para a análise da variabilidade genética
utilizou-se o Programa Tools for Population
Genetics Analyses (TFPGA). O dendrograma
de similaridade foi construído usando o índice
de distância (Nei, 1978).
Resultados e Discussão
A variabilidade genética é uma condição
fundamental para que haja evolução
adaptativa de uma espécie, uma vez que a
seleção natural atua entre as variantes que
ocorrem dentro das populações, em função da
adaptação ao ambiente (Hartl, 1981).
Estudos sobre a variabilidade genética em
mosquitos mostraram que neste grupo os
níveis de polimorfismo e heterozigosidade
média são bastante heterogêneos (Santos,
1992).
O perfil obtido da amplificação do DNA de
A. darlingi revelou vários fragmentos
polimórficos, sendo selecionados 13 locos
para as quatro populações (Figura 1), os quais
variaram de 400 a 2000pb.
A sensibilidade da RAPD na detecção de
polimorfismos é grande, sendo possível à
identificação de genótipos e obtenção de
“fingerprints” genômicos. Dessa forma, os
polimorfismos observados podem ser
resultantes de pequenas alterações na
seqüência
do
sítio
de
iniciação
(inserções/deleções/substituições)
ou
de
alterações que modifiquem o tamanho da
seqüência a ser amplificada (Williams et al.,
1990). Diferenças em apenas um par de bases
podem ser detectadas pela técnica e, por isso,
grande número de polimorfismos pode ser
revelado em indivíduos estreitamente
relacionados, como os demonstrados para A.
darlingi.
Os resultados mostraram elevada variabilidade,
sendo que a população de Coari (P= 90,90%;
Ho= 0,321) revelou maior variabilidade genética
(Tabela 1), enquanto que a de Manaus (P=
78,78%; Ho= 0,278) foi menor.
Os dados de estrutura genética dessas
populações foram testados com base no método θ
e mostraram o valor de Fst significativo (Fst=
0,107 ± 0,024), onde o índice de consistência
“bootstrapping” para 1000 replicações foi de
95%. Esses resultados indicam certa estruturação
microgeográfica, resultante de alguma barreira
nos acasalamentos aleatórios.
Analisando
caracteres
morfológicos,
isoenzimas, DNA mitocondrial e RAPD em
populações de A. darlingi procedentes de Belize,
Bolívia, Brasil, Guiana Francesa e Venezuela,
Manguin et al. (1999) observaram evidências de
divisão geográfica em muitas populações, porém,
condizente com uma espécie monotípica.
O teste de qui-quadrado para diferenciação das
populações (Raymond & Rousset, 1995) foi
significativo (χ 2=157,3317; GL=26; P<0,001).
A matriz de similaridade e distância genética
(Tabela 2) mostrou distâncias variando de 0,0105
a 0,9895. A maior distância foi observada entre
São Gabriel da Cachoeira e Coari, e a menor foi
entre esta e Tabatinga. Com base nesses dados, as
populações foram separadas em três clusters: o
primeiro formado por Coari e Tabatinga; o
segundo por Manaus; e o terceiro por S. Gabriel
da Cachoeira (Figura 2).
Análise da variabilidade genética em
populações de A. darlingi procedentes de
localidades ao longo dos rios Negro e Solimões
ainda não foi feita. Entretanto, trabalhos
realizados com primatas mostraram que os
principais rios da região amazônica em termos de
volume e fluxo (rios Negro, Solimões, Amazonas
e
Madeira)
dividem
a
Amazônia,
aproximadamente, em quatro quadrantes, e
servem como barreira de dispersão para as
espécies de primatas (Horta, 2003).
Nesse trabalho verificou-se que, Coari e
Tabatinga que se encontram localizadas às
margens do rio Solimões, são geneticamente mais
próximas, do que Manaus e S. Gabriel da
Cachoeira que estão situadas às margens do rio
Negro. Há certa correlação entre a distância
genética e a distância geográfica, mas os dados
ainda não são conclusivos.
Agradecimentos
Ao M.Sc. Juracy de Freitas Maia pelo
importante apoio técnico.
À Dra. Joselita M. Mendes dos Santos e ao Dr.
Wanderli Pedro Tadei pela orientação e
companheirismo.
À Universidade do Estado do Amazonas – UEA,
Pós-Graduação em Biotecnologia e Recursos
Naturais da Amazônia. À Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado do Amazonas – FAPEAM
pela concessão das bolsas.
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
– INPA (Coordenação de Pesquisas em Ciências
da Saúde-CPCS; Laboratório de Vetores da
Malária e Dengue) pela cessão do laboratório para
a realização das análises.
Bibliografia citada
Consoli, R.A.G.B.; Lourenço-de-Oliveira, R.
1994. Principais mosquitos de importância
sanitária no Brasil. Rio de Janeiro: Editora
Fiocruz. 225 p.
Forattini, O.P. 1962. Entomologia Médica.
São Paulo: Faculdade de Higiene e Saúde
Pública. 504 p.
Gorham, J.R.; Stojanovich, C.J.; Scott, H.G.
1967. Clave ilustrada para los Mosquitos
Anofelinos de Sudamérica Oriental. Atlanta:
Comunicable Disease Center, United States
Public Health Service. 64 p.
Hartl, D.L. 1981. A primer of populations
genetics. Sunderland: Inc. Publisher. 191 p.
Horta, M.R. 2003. A primeira teoria da
evolução de Wallace. Scientiae studia, 1: 519530.
Malafronte, R.S.; Marrelli, M.T.; Marinotti,
O. 1999. Analysis of ITS2 DNA sequences
from Brazilian Anopheles darlingi (Diptera:
Culicidae). Journal of Medicine and
Entomology, 36(5): 631-634.
Manguin, S.; Wilkerson, R.C.; Conn, J.E.;
Rubio-Palis, Y.; Danoff-Burg, J.A.; Roberts,
D.R. 1999. Population structure of the
primary malaria vector in South America,
Anopheles darlingi, using isozyme, random
amplified polymorphic DNA, internal
transcribed spacer 2, and morphologic
markers. American Journal of Tropical
Medicine and Hygiene, 60(3): 364-376.
Nei, M. 1978. Estimation of average
heterozigosity and genetic distance from a
small number of individuals. Genetics, 89: 583590.
Raymond, M.L.; Rousset, F. 1995. An exact test
for population differentiation. Evolution, 49:
1280-1283.
Santos, J.M.M. 1992. Variabilidade genética em
populações
naturais
de
Anopheles
(Nyssorhynchus) darlingi Root, 1926 (Diptera:
Culicidae). Tese de Doutorado, Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia /
Universidade Federal do Amazonas, Manaus,
Amazonas. 150P.
Wilkerson, R.C.; Parson, T.J.; Klein, T.A.;
Gaffgan, T.V.; Bergo, E.; Consolim, J. 1995.
Diagnosis by random amplified polymorphic
DNA polymerase chain reaction of four cryptic
species related to Anopheles (Nyssorhynchus)
albitarsis (Diptera: Culicidae) from Paraguay,
Argentina end Brazil. Journal of Medicine and
Entomology, 32(5): 697-704.
Williams, J.G.K.; Kubelik, A.R.; Livak, K.J.;
Tingy, S.V. 1990. DNA polymerase amplified by
arbitrary primers are used as genetic markers.
Nucleic Acids Research, 18(22): 6531-6535.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
13 14
15 16 17 18
C
M
2,072 pb
1,500 pb
600 pb
Figura 1. Perfil da variabilidade genética em populações de A. darlingi do Estado do
Amazonas. M=marcador molecular (Ladder 100pb) e C=Controle. Amostras: 1 a 5 (S.
Gabriel da Cachoeira), 6 a 10 (Coari), 11 a 14 (Tabatinga) e 15 a 18 (Manaus).
Tabela 1. Estimativa da variabilidade genética das populações de A. darlingi do Estado do
Amazonas.
Número médio de
Percentagem de locos
amostras por loco
polimórficos
Observada
Esperada
30
81,81
0,257
0,261
Coari
30
90,90
0,321
0,325
Tabatinga
30
81,81
0,285
0,289
Manaus
30
78,78
0,278
0,284
População
S.
Gabriel da
Cachoeira
Heterozigosidade média
Tabela 2. Matriz de similaridade e distância genética nas populações de A.
darlingi do Estado do Amazonas.
População
1
2
3
4
*****
0,9068
0,9167
0,9514
Coari
0,0979
*****
0,9895
0,9703
Tabatinga
0,0870
0,0105
*****
0,9787
Manaus
0,0498
0,0301
0,0215
*****
S. Gabriel da
Cachoeira
Figura 2. Dendrograma agrupando as populações de A. darlingi com base na
distância genética. Método não ponderado de agrupamento de pares de
populações com média aritmética - UPGMA (Nei, 1978).