Universidade de Coimbra • Faculdade de Medicina BIOLOGIA
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Universidade de Coimbra • Faculdade de Medicina BIOLOGIA MÉDICA Biologia Celular e Molecular Docentes: -1- Professora Doutora Isabel Maria Marques Carreira Professora Doutora Maria Joana Lima Barbosa Melo Professora Doutora Sandra Isabel Morais de Almeida Costa Cardoso ÍNDICE I Estudo das Células ..................................................................................................................... 2 1. Microscopia .................................................................................................................. 2 II Mecanismos Genéticos Básicos ................................................................................................. 6 1. Síntese Proteica ............................................................................................................ 6 2. Reparação do DNA ...................................................................................................... 9 3. Replicação do DNA ................................................................................................... 11 4. Vírus, Plasmídeos e Elementos Genéticos Transponíveis ......................................... 12 III Tecnologia do DNA Recombinante ........................................................................................ 16 1. Tecnologia do DNA Recombinante ........................................................................... 16 2. Sequenciação e Hibridização ..................................................................................... 18 3. Clonagem do DNA ..................................................................................................... 22 IV O Núcleo da Célula .................................................................................................................. 24 1. DNA Cromossómico e sua Compactação .................................................................. 24 2. Síntese e Processamento de RNA .............................................................................. 29 fwqwefwqsdgsd I. ESTUDO DAS CÉLULAS 1. Microscopia Dado que as células são pequenas e complexas (diâmetro 10 a 20 µm), a visualização das suas estruturas, a descoberta da sua composição e do seu modo de funcionamento seria impossível sem ajuda de equipamentos como os microscópios ópticos. No entanto, como as células animais são também incolores e translúcidas, é preciso recorrer à ajuda de corantes para poder visualizar as estruturas celulares, podendo-se ainda empregar outra técnica microscópica – a microscopia electrónica. A qualidade das observações na microscopia depende, assim, das técnicas de preparação das amostras, do tipo de microscopia utilizado e também do poder de resolução do microscópio em si. Entende-se por resolução (ou limite máximo de resolução) a distância linear mínima entre dois pontos adjacentes dos quais a microscopia fornece imagens distintas e é o diâmetro aparente da mais pequena partícula visível. Quanto menor for o limite de resolução, maior é o poder de resolução. No caso da microscopia óptica, a resolução não ultrapassa os 0,2 µm. A resolução é directamente proporcional ao comprimento de onda da luz e inversamente proporcional à abertura numérica das lentes objectiva e condensadora. A abertura numérica é a -2- capacidade das lentes convergirem a luz; não ultrapassa o valor 1 nas lentes secas, mas pode atingir o valor 1,4 no caso das lentes de imersão. Quanto maior for a AN, maior será a resolução e a luminosidade, mas mais luz será necessária para uma boa observação. A AN depende da largura angular do cone de raios, apanhado pela objectiva, de um ponto (relacionada com o diâmetro da lente frontal da objectiva), e ainda do índice de refracção do meio entre a amostra e a lente frontal. Tipos de microscopia de luz • microscopia óptica › sistema mecânico: ◦ pé ou base – placa pesada que dá estabilidade ao microscópio ◦ braço – parte vertical e oblíqua, fixa à base, que suporta as restantes componentes do microscópio ◦ tubo ou canhão – tem duas partes que servem de suporte ao sistema de ampliação; parte superior é tubo binocular com dois tubos porta-oculares reguláveis ◦ suporte do condensador, do diafragma e do porta-filtros – fixo à parte inferior do suporte da platina ◦ botões de comando de movimentos: parafuso macrométrico – para focagem rápida parafuso micrométrico – para focagem lenta e precisa parafusos de deslocação das pinças da platina – para deslocação da preparação ◦ revólver – suporta as objectivas; roda-se de modo a colocar a objectiva pretendida em prolongamento do tubo ◦ platina – peça onde se desloca a lâmina; com abertura para deixar passar a luz ◦ pinça sobre a platina – para imobilizar a lâmina › sistema óptico: ◦ sistema de iluminação – fornece e regula a quantidade de luz fonte luminosa – lâmpada de baixa voltagem, na base do microscópio, que emite feixe de raios luminosos; com interruptor de intensidade regulável filtros – para aumentar a resolução (diminuindo λ) e o contraste, diminuir a intensidade da luz e o brilho e absorver o excesso de calor diafragma – controla campo luminoso, regulando a abertura do feixe luminoso condensador – duas lentes que fornecem à objectiva um cone de luz uniforme ◦ sistema de ampliação sistema das objectivas – formado por uma lente frontal (mais inferior) e uma lente correctora; fornece uma imagem real mas invertida do objecto objectivas a seco – quando têm ar entre a lente frontal e o objecto objectivas de imersão – quando é necessário um líquido para convergir os raios luminosos no objecto (aumenta o poder de resolução) sistema da ocular – funciona como uma lupa ampliando a imagem fornecida pelas lentes objectivas as lentes apresentam efeitos inerentes (aberrações) que prejudicam a nitidez da imagem: aberração esférica – a esfericidade da lente provoca a existência de vários focos -3- aberração cromática – a decomposição da luz provoca uma imagem irisada curvatura do campo provoca falta de nitidez nas margens quando o centro está focado, e vice-versa microscópio invertido › utilizado para observar células vivas em cultura › semelhante ao microscópio óptico, mas onde as posições das objectivas e da fonte luminosa se encontram trocadas microscopia de contraste de fases › utilizada para visualizar células vivas ou sem coloração › aproveita efeitos de interferência produzidos pela recombinação de dois conjuntos de ondas, criando assim uma imagem da estrutura celular ◦ a fase do λ é alterado quando atravessa uma célula, de acordo com o índice de refracção da célula microscopia de fundo escuro › os raios de luz são direccionados para o lado de maneira que só a luz difundida passe pelas lentes › a estruturas observada aparece iluminada sobre um fundo escuro microscopia de fluorescência › utilizada para detectar proteínas ou moléculas específicas em células ou tecidos › utilizam-se moléculas fluorescentes (fluorocromos) para “corar” determinadas estruturas e para monitorar mudanças de concentração de determinadas substâncias › as moléculas fluorescentes podem ser acoplados a anticorpos, funcionando como reagentes altamente versáteis e específicos ◦ e.g. fluoresceína – emite fluorescência verde quando excitada com luz azul › microscópio de fluorescência difere do óptico pois possui: ◦ uma fonte luminosa muito poderosa (e.g. de mercúrio) com tempo de vida limitado ◦ um filtro para filtrar a luz antes dela atingir a amostra – permite somente a passagem de luz do λ que excita os fluorocromos ◦ outro filtro para filtrar a luz emitida – bloqueia a passagem de luz excepto do λ emitido pelo fluorocromo microscopia confocal › permite a focagem de um determinado plano de uma amostra espessa, rejeitando a luz proveniente de regiões desfocadas › a partir de uma série destas secções nítidas é possível reconstruir a forma tridimensional da amostra observada - • • • • • Sistemas electrónicos de imagem associados a tecnologias de processamento de imagens permitem intensificar as imagens obtidas pela microscopia de luz. Estas técnicas tornam possível superar limitações relacionados com imperfeições dos sistemas ópticos e com o olho humano. Possibilitaram realçar pormenores difíceis de distinguir e alcançar o limite teórico de resolução, permitindo a observação de estruturas ínfimas. Por outro lado, evitam-se também os efeitos prejudiciais provocados pela exposição prolongada das amostras a luz e calor intensos. -4- Tipos de microscopia electrónica Como o comprimento de onda de um electrão é muito pequeno, diminuindo com a sua velocidade, o limite de resolução da microscopia electrónica é muito menor que o da óptica, sendo o poder de resolução teórico dos microscópios electrónicos modernos de 1 Å. Efectivamente este valor é superior devido a problemas de preparação da amostra, de contraste e de danos provocados por radiações. • microscopia electrónica de transmissão (TEM) › a fonte de iluminação consiste num filamento ou cátodo que emite electrões do topo de uma coluna de 2 m de altura › a amostra é colocada em vácuo através de uma câmara compressora para evitar choques dos electrões com as partículas do ar › bobines magnéticas ao longo da coluna convergem o feixe de electrões acelerados › os electrões atravessam a amostra em locais pouco densos que aparecem mais claros • microscopia electrónica de varrimento (SEM) › permite obter imagens tridimensionais mais rápida e facilmente que através das secções finas bidimensionais em série obtidas pela microscopia confocal › a amostra é coberta por uma camada fina de metal pesado e posteriormente varrida por um feixe de electrões estreito › a quantidade de electrões dispersos depende do ângulo do feixe, criando brilhos e sombras que conferem à imagem uma aparência tridimensional › a SEM tem uma resolução não muito alta e permite somente a observação de características superficiais Preparação do material biológico para observação ao microscópio óptico • colheita – realizada a partir de biópsias ou de material cadavérico › deve ser realizada rapidamente, em condições de assepsia › amostra deve ser fragmento pequeno na ordem dos centímetros • fixação – para imobilizar, matar, endurecer e preservar a amostra (evitar a autólise) › por agentes físicos (frio, calor, dessecação (desidratação por evaporação)) ou químicos ◦ antigamente usavam-se ácidos e solventes orgânicos; actualmente utilizam-se aldeídos › torna as células permeáveis a corantes e permite a formação de ligações cruzadas entre as macromoléculas, o que faz com que fiquem estabilizadas nas suas posições naturais • desidratação – substituição da água por substância em que o meio de inclusão seja solúvel › geralmente efectuada através de uma série crescente de álcoois • impregnação/inclusão e corte › diafanização – etanol é substituído por xilol ou benzeno; peças tornam-se translúcidas › impregnação/embebição – as peças são mergulhadas em parafina fundida e depois colocadas num molde para ocorrer o arrefecimento da parafina › corte em secções extremamente finas (1 a 10 µm) através de um micrótomo e colocação das secções numa lâmina de vidro alternativamente pode recorrer-se ao congelamento rápido que evita alterações devidas à -5- • • • embebição, mas os cristais de gelo podem destruir a estutura fina da célula coloração › desparafinização e diafinização – remoção da parafina e mergulho em xilol › hidratação – em série decrescente de álcoois (devido à natureza aquosa dos corantes) › coloração – moléculas de corante ligam-se a determinadas moléculas, corando-as ◦ os corantes podem ser ácidos (citoplasmáticos) ou básicos (nucleares) conforme as estruturas que eles coram ◦ é possível que não se consiga observar uma molécula corada ao microscópio, o que pode ser superado aumentando o número de moléculas de corante que se associam a uma macromolécula ◦ outra possibilidade é a coloração com fluorocromos montagem – adicionar meio conservador que não altere as estruturas do material › os meios de montagem endurecem o material e conferem-lhes um índice de refracção homogéneo em relação ao vidro da lâmina rotulação – indicações sobre procedimentos e dados do paciente e da amostra Preparação do material biológico para observação ao microscópio electrónico • colheita › amostra deve ser fragmento pequeno na ordem dos centímetros • fixação › com glutaraldeído para formação de ligações cruzadas entre as macromoléculas › pós-fixação com OsO4 para estabilização das bicamadas lipídicas e as proteínas • desidratação – em série crescente de álcoois • inclusão – por polimerização de resinas • corte – secções com ultramicrótomo (50 a 100 nm de espessura) e colocação das secções em grelhas de cobre • contrastação – contraste depende do número atómico dos átomos presentes na amostra › amostras são impregnadas com sais de metais pesados (urânio, chumbo) II. MECANISMOS GENÉTICOS BÁSICOS 1. Síntese Proteica A biossíntese de proteínas ocorre nos ribossomas e depende da colaboração de várias moléculas. Primeiro, uma molécula de mRNA é copiada a partir do DNA, enquanto que no citoplasma cada um dos aminoácidos se associa à sua molécula específica de tRNA e as subunidades ribossómicas são carregadas com factores proteicos acessórios. Todos estes componentes juntam-se no citoplasma e formam um ribossoma funcional, dando início à síntese propriamente dita. A molécula de mRNA desloca-se pausadamente no ribossoma, produzindo-se ao mesmo tempo uma cadeia de aminoácidos correspondentes aos codões codificadores. -6- Transcrição do DNA • é o processo que produz a molécula de RNA mensageiro a partir da cadeia de DNA • uma molécula de RNA polimerase colide aleatoriamente com o DNA, ligando-se fracamente a este › há 3 tipos de RNA polimerase nos eucariontes, mas somente um tipo nos procariontes • a enzima desliza ao longo da cadeia de DNA até encontrar o gene promotor que é uma sequência específica que marca o início da sequência a transcrever • a polimerase abre uma região específica da dupla hélice de DNA, expondo os nucleótidos de um curto segmento • a enzima emparelha monómeros de ribonucleósidos trifosfato complementares às bases do DNA, formando uma cadeia de RNA • a polimerase usa somente uma das duas cadeias de DNA como molde para a transcrição › qual das duas cadeias será usada é determinado pela orientação do gene promotor › a transcrição realiza-se sempre no sentido 5’ – 3’ › a cadeia de RNA cresce no sentido 3’ – 5’ • a enzima continua a percorrer o DNA, abrindo a dupla hélice à sua frente para continuar a síntese do RNA › logo após a passagem por um segmento de DNA, a polimerase volta a reenrolar a dupla hélice, provocando a separação do RNA e do DNA • o alongamento da cadeia de RNA acaba quando a polimerase encontrar uma sequência de terminação › a cadeia de RNA é libertada e a RNA polimerase dissocia-se do DNA • sequências consenso – sequências de nucleótidos presentes num tipo particular de região de DNA (e.g. promotores) › genes transcritos em grandes quantidades possuem promotores com sequências muito semelhantes às consenso, enquanto que genes transcritos em menor quantidade possuem promotores com sequências menos semelhantes às consenso › nos eucariontes, uma sequência consenso é a TATA box (5’-TATAA-3’) que leva à ligação de factores de transcrição à RNA polimerase, dando início à transcrição Splicing Nas moléculas de mRNA dos eucariontes existem sequências não codificadoras – intrões – que precisam de ser removidas antes de se proceder à tradução, num processo denominado splicing. Tradução do DNA • corresponde à síntese da proteína a partir da molécula de mRNA • é o processo biológico que requer maior gasto energético • tem várias moléculas intervenientes › tRNA – RNA transportador ◦ é o intermediário entre os aminoácidos e os ribossomas ◦ apresentam uma sequência específica (anticodão) complementar ao codão que codifica determinado aminoácido -7- - • • esse aminoácido liga-se ao tRNA para ser transportado até ao ribossoma cada tRNA liga-se apenas a um aminoácido específico, mas um aminoácido pode ter várias moléculas de tRNA associadas (degenerescência do código genético) ◦ o aminoácido liga-se ao tRNA através da enzima aminoacil-tRNA-sintetase, formando uma molécula de aminoacil-tRNA › ribossoma – local onde ocorre a tradução ◦ controla o movimento da molécula de mRNA ◦ a subunidade maior que catalisa a formação de ligações peptídicas ◦ a subunidade menor que estabelece a correspondência entre o tRNA e os codões do mRNA ◦ apresenta na sua composição um grande número de proteínas e RNA ribossomal (rRNA) que é responsável pelas actividades catalíticas dos ribossomas ◦ apresenta 3 sítios de ligação: um sítio para a ligação do mRNA o sítio de ligação peptidil-tRNA (sítio P) – liga o tRNA da extremidade crescente da cadeia polipeptídica o sítio de ligação aminoacil-tRNA (sítio A) – liga o tRNA com um novo aminoácido a acrescentar à cadeia apresenta ainda o sítio E (exit) para a libertação de moléculas de tRNA degenerescência do código genético › existem 64 codões diferentes – 61 codificam aminoácidos; 3 são codões de terminação › como há 61 codões para 20 aminoácidos diferentes, a maioria dos aminoácidos é codificada por mais de um codão › um aminoácido pode ter vários tRNAs, ou o tRNA pode emparelhar com mais do que um codão – emparelhamento oscilante ◦ somente os dois primeiros nucleótidos determinam o aminoácido; o último nucleótido tem importância reduzida na codificação de certos aminoácidos etapas da tradução › iniciação ◦ a subunidade menor do ribossoma está carregada com factores de iniciação e está ligada a um tRNA iniciador no sítio P factores de iniciação – proteínas específicas que ajudam a localizar o codão de iniciação e que controlam a taxa de síntese de proteínas tRNA iniciador – tRNA ligado ao aminoácido metionina, o qual é frequentemente removido da cadeia polipeptídica ◦ este complexo desliza ao longo da molécula de mRNA até encontrar um codão de iniciação AUG nos procariontes, este codão é sinalizado por uma sequência específica de até 6 nucleótidos que se encontra 4 a 7 nucleótidos antes do AUG nos eucariontes, uma estrutura específica, denominada 5’ cap, indica a posição do codão de iniciação ◦ os factores de iniciação dissociam-se do complexo e a subunidade maior liga-se à menor, formando um ribossoma funcional -8- ◦ › › o tRNA iniciador encontra-se no sítio P, deixando o sítio A livre, pronto para ser ocupado por outro aminoacil-tRNA, dando início à síntese da proteína alongamento – processo cíclico ◦ uma molécula de aminoacil-tRNA liga-se ao sítio A livre, emparelhando com o codão ◦ o terminal carboxílico da cadeia polipeptídica desliga-se do peptidil-tRNA e liga-se ao grupo amina livre do aminoácido do sítio A, formando uma ligação peptídica a formação da ligação ocorre devido à proximidade dos sítios A e P e é catalisada pela enzima peptidil transferase ◦ o novo peptidil-tRNA é translocado para o sítio P e o ribossoma avança 3 nucleótidos ao longo do mRNA (no sentido 5’ – 3’) o tRNA livre do sítio P passa para o sítio E onde é libertado a translocação envolve gastos energéticos o sítio A está novamente desocupado para aceitar outro aminoacil-tRNA terminação ◦ quando um codão de terminação (UAA, UAG, UGA) alcança o sítio A, um factor de libertação liga-se àquele codão isto leva a peptidil transferase a catalisar a adição de uma molécula de água ao terminal carboxilo da cadeia polipeptídica ◦ a cadeia polipeptídica é libertada para o citoplasma e o ribossoma dissocia-se nas suas subunidades Polirribossomas • quando um ribossoma traduziu uma quantidade suficiente da sequência de aminoácidos, outro ribossoma começa frequentemente a sintetizar uma nova cadeia polipeptídica a partir da mesma molécula de mRNA • a estrutura de um mRNA com vários ribossomas associados é denominada polirribossoma › os ribossomas encontram-se a cerca de 80 nucleótidos de distância • os polirribossomas levam a um aumento da velocidade da síntese de proteínas pois provocam a síntese simultânea de várias cadeias polipeptídicas a partir do mesmo mRNA Mecanismos de ‘proofreading’ • existem mecanismos de verificação para corrigir os erros que eventualmente possam surgir na síntese proteica › ocorre a incorporação de um aminoácido errado em cada 104 aminoácidos polimerizados • um mecanismo de proofreading é responsável pela correcção da ligação de cada aminoácido ao seu tRNA correspondente, pela aminoacil-tRNA sintetase • outro mecanismo é responsável pela correcção do emparelhamento codão-anticodão › através da factores de alongamento que atrasam a formação da ligação peptídica, permitindo a saída de tRNAs incorrectamente emparelhados 2. Reparação do DNA -9- A sobrevivência de um indivíduo depende da estabilidade do seu genoma. A manutenção da estabilidade genética pressupõe não só a existência de mecanismos exactos de replicação, mas também mecanismos de reparação dos erros acidentais que ocorrem no DNA. A maioria das mudanças espontâneas são temporárias pois são imediatamente corrigidas. No entanto, raramente os mecanismos de reparação do DNA falham e a alteração torna-se permanente, (mutação), e pode ser letal para o indivíduo se ocorrer numa sequência vital do DNA, ou pode não originar efeito nenhum. Taxas de mutação • é a taxa na qual mudanças estáveis (mutações) ocorrem numa sequência de DNA • pode ser estimada indirectamente comparando a sequência de aminoácidos de uma mesma proteína (não essencial) em espécies diferentes › pode calcular-se o tempo que passa em média para que uma mudança da sequência de aminoácidos se torne permanente • pode ser estimada mais objectivamente através da observação da taxa de aparecimento de alterações genéticas espontâneas numa grande população de células e num espaço de tempo pequeno • aplicação – pode ser usada para estimar há quanto tempo atrás duas espécies divergiram › quanto mais longo for o tempo decorrido desde a divergência, mais diferenças existem entre as proteínas das espécies › quanto mais importante for uma proteína, menos mutações compatíveis com a vida ocorrem, i.e., mais tempo decorre até aparecer uma mutação viável › baixas taxas de mutação significam que organismos evolutivamente próximos são compostos essencialmente a partir das mesmas proteínas • células germinativas com altas taxas de mutação põem em risco a sobrevivência da espécie • células somáticas com altas taxas de mutação pões em risco a sobrevivência do indivíduo (aparecimento de cancros) Mecanismos de reparação • o genoma sofre alterações devido a influências térmicas, radiações, acidentes metabólicos • sem mecanismos de correcção, as alterações espontâneas mudariam rapidamente o DNA • só cerca de uma em cada mil alterações provoca uma mutação; as restantes alterações são eliminadas pelos mecanismos de reparação do DNA • processo – depende da existência de uma cadeia de DNA intacta (cadeia molde) › a porção alterada da cadeia danificada é reconhecida e retirada por nucleases de reparação do DNA através da hidrólise das ligações fosfodiéster › a DNA polimerase insere a sequência correcta de nucleótidos na falha produzida › a DNA ligase catalisa o restabelecimento das ligações fosfodiéster • reparação por excisão de bases › empregado quando ocorre um erro num único nucleotídeo ◦ DNA glicosilases removem a base azotada mal emparelhada ◦ AP endonuclease e fosfodiesterase removem o açúcar fosfato da cadeia lesada - 10 - ◦ • DNA polimerase e DNA ligase preenchem a falha originada reparação por excisão de nucleotídeos › usado para corrigir uma alteração que provoca uma mudança extensa da dupla hélice ◦ um complexo multienzimático localiza a alteração e cliva as ligações fosfodiéster de ambos os lados do local em questão ◦ DNA helicase remove a porção da cadeia que contém a lesão (um oligonucleotídeo, com 2 a 30 nucleótidos) ◦ DNA polimerase e DNA ligase preenchem a falha originada 3. Replicação do DNA Todas as células têm de replicar o seu DNA antes de entrarem em divisão. Para a replicação é necessária a presença de uma cadeia molde de DNA a partir da qual se possa efectuar a cópia. Como cada dupla hélice nova de DNA é formada por uma cadeia nova e por uma cadeia velha, o método de replicação do DNA é um processo semiconservativo. Forquilhas de replicação • a replicação do DNA ocorre a partir das duas cadeias de DNA abertas, em forma de Y, numa estrutura denominada forquilha de replicação • a síntese dos novos segmentos de DNA através da DNA polimerase efectua-se sempre no sentido 5’ – 3’ • devido à estrutura antiparalela do DNA, a síntese da nova cadeia não ocorre de maneira igual › cadeia líder – aquela onde o DNA é sintetizado continuamente › cadeia lagging – aquela onde o DNA é sintetizado descontinuamente, em segmentos (fragmentos de Okazaki) • o processo de replicação é de alta fidelidade, só ocorrendo um erro em cada 109 pares de bases › esta fidelidade deve-se à natureza auto-correctora da DNA polimerase (a enzima é capaz de corrigir os próprios erros de polimerização) ◦ a RNA polimerase não tem função auto-correctora pois os erros inseridos no RNA não são transmitidos à descendência Processo de replicação • a enzima DNA helicase abre a dupla hélice numa bolha de replicação › as bolhas de replicação são locais específicos, formados a partir de sequências especiais denominadas origens de replicação, onde as duas cadeias de DNA foram separadas › proteínas iniciadoras ligam-se à origem de replicação, catalisando a formação de forquilhas de replicação que se deslocam em direcções opostas • single strand binding proteins (SSB) ligam-se às cadeias abertas de DNA para impedir o seu enrolamento e possibilitar a replicação • a DNA primase sintetiza cadeias curtas de moléculas iniciadoras de RNA, com cerca de 10 nucleotídeos, na cadeia lagging - 11 - › • • • • essas moléculas funcionam como iniciadores para a síntese dos fragmentos de Okazaki › a DNA primase está ligada à DNA helicase formando um complexo chamado primossoma na cadeia líder, a DNA polimerase III sintetiza a cadeia complementar de modo contínuo (no sentido 5’ – 3’) na cadeia lagging, a DNA polimerase III sintetiza os fragmentos de Okazaki (também no sentido 5’ – 3’) › a DNA polimerase I remove as sequências iniciadoras de RNA e substitui-as por sequências de DNA › a DNA ligase estabelece ligações fosfodiéster para juntar os diferentes fragmentos existe uma proteína acessória que forma um anel deslizante › o anel liga-se à DNA polimerase para impedir a sua dissociação das cadeias de DNA, mas sem impedir o seu rápido deslizamento ao longo da cadeia as DNA topoisomerases são importantes para impedir que o DNA se enrole e emaranhe › quebram as ligações fosfodiéster ligando-se reversivelmente a um grupo fosfato do DNA › topoisomerase I ◦ provoca uma quebra de uma cadeia simples ◦ constitui um suporte giratório na cadeia oposta àquela onde ocorreu a quebra ◦ permite a rotação independente dos segmentos que se encontram dos dois lados da quebra, para aliviar tensões existentes › topoisomerase II ◦ provoca uma quebra transitória das duas cadeias do DNA ◦ permitem a passagem de uma outra dupla cadeia de DNA que se cruze com a primeira ◦ impede problemas de emaranhamento pois permite a separação de duas cadeias entrelaçadas Mecanismos de verificação • exonuclease de verificação 3’-5’ › subunidade enzimática da DNA polimerase › elimina uma extremidade 3’-OH não emparelhada que bloqueia o alongamento • sistema de verificação de emparelhamentos incorrectos › reconhece uma distorção do lado externo da dupla hélice resultante da presença de bases não complementares › remove uma parte da cadeia recém-sintetizada › repara a falha produzida através da DNA polimerase e DNA ligase Diferenças na replicação do DNA em células eucarióticas • existem duas DNA polimerases diferentes › DNA polimerase α – sintetiza os fragmentos de Okazaki › DNA polimerase δ – sintetiza a cadeia contínua a DNA primase não está associada à DNA helicase, mas é uma subunidade da DNA pol α4. Vírus, Plasmídeos e Elementos Genéticos Transponíveis - 12 - Os vírus, os elementos genéticos transponíveis e os plasmídeos pertencem ao grupo dos elementos genéticos que agem como parasitas, i.e., que utilizam os mecanismos genéticos e metabólicos das células hospedeiras para o seu próprio benefício. Os vírus possuem uma capa proteica protectora que lhes confere uma certa independência pois permite o seu deslocamento de célula para célula. Os plasmídeos e os elementos transponíveis não possuem tal capa, o que os torna mais dependentes das suas células hospedeiras. No entanto, qualquer um destes elementos genéticos é capaz de duplicar o seu genoma independentemente do DNA do hospedeiro. Vírus • • • • são elementos genéticos envolvidos por uma capa proteica protectora (capsídeo) › permite o seu deslocamento entre células os vírus infectam uma célula, introduzem o seu material genético e reproduzem-se em grande número › a multiplicação pode ser letal para a célula hospedeira quando ocorre a lise da célula › os vírus podem sair por budding da membrana plasmática do hospedeiro ◦ permite-lhe adquirir uma bicamada lipídica que envolve o nucleocapsídeo (vírus com envelope) ◦ isto não rompe a membrana da célula infectada e, portanto, não provoca a sua morte o seu material genético pode ser composto por RNA ou DNA › RNA – de cadeia linear simples ou dupla › DNA – de cadeia linear simples ou dupla; cadeia circular simples ou dupla; cadeia com a extremidade covalentemente fechada ou ligada a uma proteína › o genoma viral codifica as enzimas necessárias para a sua replicação › o capsídeo pode envolver também enzimas necessárias para dar início à replicação (quando a célula hospedeira não possui aquelas enzimas) › a replicação do genoma viral, quer de DNA quer de RNA, ocorre através da formação de cadeias complementares ◦ nos vírus de RNA de cadeia negativa, o RNA não codifica proteínas, mas a sua cadeia complementar possui as sequências codificadoras as replicases necessárias para originar a cadeia complementar são incorporadas no capsídeo ◦ nos vírus de RNA de cadeia positiva, o próprio RNA é infeccioso e funciona como mRNA para a produção de proteínas › a replicação do genoma de vírus de RNA começa na extremidade 3’ do RNA molde › a replicação do genoma de vírus de DNA começa na origem de replicação ciclo de vida de um vírus com envelope › é formado por um nucleocapsídeo (genoma + capsídeo) envolvido por uma bicamada lipídica que contém cadeias polipeptídicas (proteínas do envelope) ◦ as proteínas do envelope interagem com as proteínas do capsídeo para juntar a membrana ao nucleocapsídeo › a infecção viral começa quando uma proteína do envelope se liga a uma proteína da - 13 - • • • • membrana da célula hospedeira › o vírus entra na célula através do mecanismo de endocitose › dentro do endossoma, o pH ácido provoca a fusão do envelope viral com a membrana do endossoma › o nucleocapsídeo liberta-se para o citoplasma › o RNA viral é libertado e traduzido pelos ribossomas da célula hospedeira para formar uma RNA polimerase codificada pelo próprio vírus › produzem-se cópias do RNA viral que funcionam como mRNA ◦ os ribossomas ligados ao retículo endoplasmático sintetizam as proteínas do envelope essas proteínas são transportadas para a membrana plasmática da célula hospedeira após passagem pelo RE e pelo aparelho de Golgi ◦ os ribossomas livres sintetizam as proteínas do capsídeo essas proteínas ligam-se ao RNA recém-replicado formando novos nucleocapsídeos › os nucleocapsídeos saem da célula por budding, ficando envolvidos por segmentos da membrana celular do hospedeiro que contém as proteínas do envelope provírus – cromossomas virais integrados no genoma do hospedeiro (por transdução) › muitos vírus passam por um período de latência (o seu genoma está presente, mas inactivo) – células lisogénicas › o genoma viral pode ser activado (e.g. através de radiação UV ou ionizante) e levar a multiplicação do vírus e consequentemente à lise da célula – infecção lítica › ciclo de vida de um provírus: bacteriófago lambda ◦ injecta o seu genoma (DNA) na célula hospedeira ◦ DNA sofre circularização (as extremidades juntam-se para formar um DNA circular) ◦ pode seguir duas vias via lítica síntese das proteínas virais necessárias para a replicação do vírus a rápida multiplicação dos vírus provoca a lise da célula via lisogénica o DNA integra-se no genoma circula do hospedeiro a célula lisogénica resultante multiplica-se normalmente ◦ em caso de exposição a radiação UV ou ionizante, o DNA viral desintegra-se do genoma hospedeiro e o vírus segue a via lítica as células permissivas permitem a entrada de um vírus e a morte por lise as células não permissivas permitem a entrada do vírus, mas não a duplicação por via lítica › o genoma viral integra-se no genoma hospedeiro ou forma plasmídeos, multiplicando-se de forma controlada › vírus tumorais podem provocar a ocorrência de mudanças genéticas no genoma do hospedeiro, num processo denominado transformação neoplásica ◦ isto estimula a produção de proteínas que alteram o controlo da proliferação celular – a célula torna-se cancerosa ◦ os genes que codificam aquelas proteínas são designadas por oncogenes retrovírus - 14 - › › › › › são vírus tumorais de RNA utilizam a enzima transcriptase reversa para sintetizar DNA complementar que é integrado no genoma do hospedeiro ◦ a enzima já se encontra dentro da cápsula ◦ depois da libertação do RNA, a transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar utilizando a cadeia simples de RNA como molde ◦ a seguir a transcriptase produz uma dupla hélice DNA/DNA a partir do cDNA o DNA é integrado no cromossoma da célula hospedeira o DNA é transcrito e traduzido para produzir proteínas do capsídeo, do envelope e transcriptase reversa ◦ estes elementos são montados com o RNA para originar novas partículas virais que saem da membrana plasmática por budding exemplo de um retrovírus – vírus da imunodeficiência humana (HIV) ◦ o vírus mata os linfócitos T ◦ o provírus pode ficar inactivo durante muito tempo até ser activado por um acontecimento ainda desconhecido isto dificulta o tratamento da SIDA Elementos Genéticos Transponíveis • são sequências genéticas localizadas dentro do genoma de um hospedeiro • são incapazes de produzir cápsulas proteicas e que, portanto, não podem deixar as células • são elementos móveis que se podem mudar ocasionalmente para outro sítio do DNA da mesma célula através de um processo chamado transposição › as transposases, codificadas pelo próprio elemento, integram o elemento no novo local › esta transposição ocorre muito raramente › a longos períodos de inactividade podem seguir-se longos períodos de intensa movimentação – surtos de transposição • os retrotransposões utilizam um processo de transposição que se assemelha ao ciclo de vida dos retrovírus › transcrição do elemento para uma cadeia de RNA › produção de uma cadeia dupla de DNA através da transcriptase reversa › integração num sítio diferente do DNA do hospedeiro • outros elementos transponíveis transpõem-se directamente de um local para outro • são possíveis antecessores dos vírus • podem afectar a transcrição de um gene sem alterar a sequência génica em si › as sequências podem funcionar como enhancers, que pode contribuir beneficamente para a evolução ou pode promover a transcrição descontrolada de oncogenes Plasmídeos • são pequenos fragmentos de ácidos nucleicos independentes do DNA do hospedeiro • são geralmente circulares e de cadeia dupla, de DNA ou de RNA • não são capazes de produzir cápsulas proteicas - 15 - • • • codificam as proteínas necessárias para a sua própria replicação são utilizados na tecnologia do DNA recombinante são possíveis antecessores dos vírus III. TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 1. Tecnologia do DNA Recombinante Os avanços tecnológicos do DNA recombinante tiveram um grande impacto nas ciências biomédicas. Hoje em dia é possível excisar uma região específica do DNA e produzir inúmeras cópias da mesma. Podem alterar-se genes isolados que serão introduzidos em células em cultura para se tornarem funcionais e serem herdados como parte do genoma. Estas técnicas permitiram um estudo pormenorizado das células e macromoléculas, levando à descoberta de novas classes de genes e proteínas, fornecendo meios para a determinação das funções das proteínas e possibilitaram a obtenção de proteínas em grandes quantidades, o que viabilizou a produção eficiente de vacinas e hormonas proteicas. Para além disso, as novas técnicas conduziram a uma melhor percepção dos mecanismos complexos da expressão génica. Tecnologias do DNA recombinante • clivagem do DNA em sítios específicos por endonucleases de restrição › facilita o isolamento e a manipulação de genes individuais • sequenciação dos nucleotídeos › permite determinar os limites de um gene e os aminoácidos que um gene codifica • hibridização de ácidos nucleicos › possibilita encontrar sequências específicas de ácidos nucleicos • clonagem de DNA › permite a obtenção de inúmeras cópias idênticas a uma única molécula de DNA inicial • engenharia de DNA › possibilita a produção de versões modificadas de genes que são reintroduzidas em células Isolamento do DNA • para se poder analisar uma molécula de DNA, esta primeiro tem de ser isolada • as moléculas de DNA são iguais em todas as células do mesmo organismo • o DNA pode então ser extraído de qualquer célula nucleada • isolamento directo de uma molécula de DNA: › separação do núcleo da célula através de meios enzimáticos › separação do DNA das proteínas por meios químicos Endonucleases ou enzimas de restrição • são enzimas produzidas por bactérias • protegem as bactérias dos vírus, pois degradam o DNA viral • reconhecem e cortam a dupla hélice do DNA em sítios específicos, determinados pelas - 16 - • • • • sequências nucleotídicas o genoma bacteriano, que também possui as sequências nucleotídicas reconhecidas pelas endonucleases, protege-se a degradação através da metilação de resíduos A e C › no genoma viral esses resíduos não são metilados, permitindo a acção das endonucleases as endonucleases produzem fragmentos da cadeia dupla de DNA com extremidades: › simétricas (blunt) › assimétricas (sticky) os fragmentos com extremidades assimétricas podem unir-se a outros fragmentos com uma extremidade assimétrica, desde que as duas extremidades sejam iguais › a molécula formada pela união de dois fragmentos clivados chama-se DNA recombinante › quando uma união de dois fragmentos específicos é desejada, deve utilizar-se a mesma enzima de restrição para obter as mesmas extremidades assimétricas mapas de restrição › a partir da comparação dos tamanhos dos fragmentos de restrição (obtidos pela clivagem do DNA por diferentes endonucleases) é possível construir um mapa em que sejam assinalados os sítios de restrição › permitem a comparação de determinadas regiões de DNA em indivíduos de espécies diferentes, sem que a necessidade do conhecimento da sequência nucleotídica específica Electroforese de moléculas de DNA • a electroforese é um processo que permite a separação de moléculas consoante os seus tamanhos • permite avaliar a extensão e a pureza do DNA • processo da electroforese: › os fragmentos de DNA, carregados negativamente (devido à natureza dos nucleótidos), são colocados num gel › é aplicado um campo eléctrico no gel › os fragmentos movem-se para o pólo positivo do campo eléctrico › quanto mais pequeno for o tamanho de um fragmento, maior distância percorrerá no gel • géis utilizados: › gel de poliacrilamida – para fragmentos com até 500 pares de bases › gel de agarose – para fragmentos com 300 a 10.000 pares de bases • as bandas de DNA no gel são invisíveis, pelo que é preciso corá-las ou marcá-las › coloração com brometo de etídio, o qual fluoresce sob luz UV › marcação das bandas com radioisótopos (32P) visíveis por auto-radiografia Sondas de DNA ou RNA • são pequenos fragmentos de DNA ou RNA, de cadeia única, marcadas radioactivamente (e.g. com 32P) através de meios químicos ou enzimáticos • são utilizados para hibridizarem com regiões complementares de DNA, permitindo deste modo localizar uma sequência específica de nucleotídeos numa molécula de DNA - 17 - • • podem ser de 3 tipos: › sondas de cDNA ◦ derivam do mRNA por acção da transcriptase reversa ◦ não apresentam intrões › sondas genómicas ◦ derivam de qualquer segmento de DNA › sondas oligonucleotídicas ◦ são sintetizadas de acordo com a sequência de DNA que se pretende localizar ◦ são de tamanho pequeno (geralmente com 20 a 30 bases) métodos de marcação das sondas › nick translation ◦ a enzima DNase I é utilizada para introduzir quebras intervaladas no DNA ◦ a DNA polimerase I remove os nucleótidos e substitui-os por nucleotídeos marcados › marcação aleatória de primers ◦ endonucleases dividem o DNA em fragmentos ◦ o DNA é desnaturado a 100 °C e mantido em gelo para impedir a sua renaturação ◦ oligonucleotídeos são adicionados aos fragmentos, hibridizando com o DNA ◦ a DNA polimerase incorpora nucleotídeos marcados nas cadeias híbridas, utilizando os oligonucleotídeos como iniciadores (primers) › end labelling (marcação de pontas) ◦ a polinucleotídeo-quinase marca a extremidade 5’ da cadeia de DNA com 32P ◦ endonucleases partem o DNA ◦ o DNA é separado por electroforese ◦ somente os fragmentos de DNA com a extremidade 5’ marcada são visíveis por auto-radiografia 2. Sequenciação e Hibridização Sequenciação do DNA • possibilita a determinação de sequências de DNA completas e, consequentemente, da sequência de aminoácidos de uma proteína codificada por um determinado gene • fragmentos isolados de DNA podem facilmente ser sequenciados através de métodos: › químicos (método de Maxam-Gilbert) ◦ uma base azotada é aleatoriamente destruída num fragmento marcado (end labelling) como a destruição é aleatória, pode afectar a base específica em qualquer sítio do fragmento ◦ os fragmentos são separados por electroforese e detectadas por auto-radiografia o tamanho do fragmento (observado pela distância percorrida) indica a posição da base destruída – quanto maior for o fragmento, mais longe da extremidade 5’ marcada encontrava-se a base ◦ utilizando reagentes diferentes para as 4 bases é possível obter a sequência toda dos fragmentos de DNA › enzimáticos (método de Sanger) - 18 - ◦ › um oligonucleotídeo iniciador é hibridizado com uma cadeia molde de DNA ◦ adicionam-se desoxirribonucleotídeos trifosfato e uma pequena quantidade de didesoxirribonucleotídeos trifosfato (ddNTPs) com uma determinada base azotada ◦ a DNA polimerase sintetiza a cadeia complementar à cadeia molde, utilizando os dNTPs adicionados ◦ quando um ddNTP é adicionado, a ligação de um próximo nucleotídeo é impedida o ddNTP não possui um grupo -OH na extremidade 3’ o que impede a formação de uma ligação fosfodiéster ◦ os fragmentos são separados por electroforese e os resultados são interpretados de maneira semelhante à do método químico a marcação pode ser efectuada no oligonucleotídeo iniciador ou no ddNTP automáticos Hibridização molecular • aquecimento acima dos 100 °C ou valores de pH muito elevados (pH>13) provocam a desnaturação do DNA, i.e., a separação das suas cadeias • a desnaturação não é irreversível › em condições favoráveis pode ocorrer a renaturação ou hibridização, ou seja, a formação de uma dupla hélice a partir de duas cadeias simples complementares de DNA • permite determinar a quantidade de cópias de uma sequência de nucleotídeos numa cadeia de DNA › através da hibridização de fragmentos de DNA com oligonucleotídeos marcados e posterior degradação de todas as cadeias simples existentes • permite verificar se um gene está activo ou inactivo e se a expressão génica está alterada › através da hibridização de sondas com moléculas de RNA Métodos de blotting • Southern blotting › moléculas de DNA são fraccionadas por endonucleases › os fragmentos são separados através de electroforese em gel de agarose › os fragmentos são desnaturados através da aplicação de uma solução alcalina › os fragmentos são transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon ◦ transferência por sucção de tampão através do gel e da membrana › os fragmentos fixos na membrana são hibridizados com sondas › as sondas não hibridizadas são removidas › as bandas hibridizadas são detectadas por auto-radiografia ou por métodos químicos › o resultado mostra qual dos fragmentos de DNA contém a sequência pretendida • Northern blotting › é um método análogo ao Southern blotting, mas que analisa a composição do RNA em vez do DNA • Western blotting › é um método semelhante ao Southern blotting que analisa a quantidade de proteína - 19 - › › presente numa determinada amostra proteínas desnaturadas são separadas por electroforese e transferidos para uma membrana anticorpos marcados específicos ligam-se às proteínas RFLPs e análise genética • o mapeamento de genomas é possível física ou geneticamente › mapeamento físico ◦ baseia-se na análise directa das moléculas de DNA ◦ inclui mapas de restrição e bancos de clones de DNA › mapeamento genético de ligação ◦ baseia-se na frequência com que marcadores genéticos são co-herdados quando indivíduos são intercruzados › marcador genético – qualquer sítio no genoma onde existe uma variação na sequência de DNA que é detectável como diferença entre indivíduos de uma população (sequências curtas de DNA que diferem entre indivíduos normais) ◦ mutação – diferença ocorre raramente ◦ polimorfismo – diferença é comum entre os indivíduos • RFLPs – restriction fragment length polymosphisms › ocorrem quando há uma pequena diferença numa sequência de DNA ◦ a diferença de um único par de bases pode eliminar um sítio de restrição ◦ pequenas inserções ou delecções mudam o tamanho dos fragmentos de restrição onde elas ocorrem › as diferenças de tamanho dos fragmentos de restrição são facilmente detectáveis por Southern blotting (com sondas complementares a uma sequência específica do DNA) ◦ a eliminação de sítios de restrição ou a inserção de bases aumenta o tamanho dos fragmentos de restrição › co-herança de dois marcadores genéticos ◦ não-ligados – se estiverem em cromossomas diferentes ou muito afastados no mesmo cromossoma (50% de hipóteses de transmissão) ◦ ligados – quanto mais próximos estiverem, maior a probabilidade de serem herdados em conjunto (marcadores espaçados por 106 pares de nucleótidos são co-herdados em 99 % dos casos) ◦ a co-herança de um marcador de RFLP e um gene específico permite encontrar a localização desse gene • detecção de diferenças génicas (estringência) › variações de temperatura fazem variar a estringência da hibridização ◦ a temperaturas elevadas, pertas da temperatura de desnaturação do DNA, somente duplas hélices perfeitamente emparelhadas são estáveis possibilita o encontro de um gene mutante (e.g. doença genética no DPN) Southern blotting e hibridização com oligonucleotídeos marcados, em condições de estringência, indicam somente as sondas complementares à sequência mutante - 20 - ◦ a temperaturas mais baixas, as sondas também hibridizam com fragmentos não perfeitamente complementares (estringência reduzida) permite o isolamento de genes da mesma família em indivíduos Sequências não codificantes do genoma • exões › são segmentos codificadores de DNA › são geralmente adjacentes a intrões › juntam-se no splicing para formar um mRNA funcional • intrões › são regiões não codificantes de genes eucarióticos › são transcritos na molécula de pré-mRNA › são removidos pelo processo de splicing sem afectar a função do gene › as suas sequências são necessárias para permitir a sua excisão • tandem repeats › VNTRs (variable number tandem reapeats) – sequências repetitivas de até 100 nucleotídeos › STRs (short tandem repeats) e microsatélites – sequências curtas de DNA repetitivas › repetem-se 4 a 40 vezes (número de repetições varia entre os loci) › aplicações ◦ DNA fingerprint – e.g. determinação do grau de parentesco baseia-se na comparação de sequências de repetição entre amostras genéticas de indivíduos (através de electroforese) ◦ ciência forense – e.g. identificação de indivíduos ◦ determinação de gene flow (transferência de alelos) e distância genética entre populações Hibridização in situ – FISH (fluorescent in situ hibridization) • utilizam-se sondas marcadas, e.g., com fluorocromos para localizar determinado gene ou moléculas de mRNA numa célula ou tecido • a molécula de DNA é desnaturada e hibridizada com a sonda fluorescente (precisa de células em interfase ou metafase, não necessariamente vivas) • os resultados obtidos por microscopia de fluorescência indicam a localização do gene ou do mRNA • é uma técnica direccionada › só é usada quando a informação clínica suspeita de um síndrome específico › é necessário saber o que se pretende analisar para conhecer o tipo de sonda a utilizar e a região cromossómica a analisar • tipos de sondas de hibridização in situ › sondas centroméricas ◦ formadas por sequências repetitivas de DNA que hibridizam a nível do centrómero de um cromossoma específico ◦ aplicam-se na identificação de marcadores, identificação de mosaicismos e - 21 - › › › aneuploidias, determinação rápida do sexo sondas de sequência única ◦ sequências de DNA com 110-150 kb que detectam regiões específicas sob a forma de pontos cujo tamanho e intensidade variam com o tamanho da sonda sondas subteloméricas ◦ sondas de 60-175 kb utilizadas para detectar micro-delecções (e.g., em crianças com atraso mental de origem desconhecida ou familiar) sondas de pintura cromossómica ◦ usa-se um conjunto de fragmentos de DNA que hibridizam especificamente com um par de cromossomas ◦ podem ser usadas para cromossomas diferentes para esclarecer rearranjos estruturais subtis ou complexos que envolvem vários cromossomas 3. Clonagem do DNA Processo de clonagem • a clonagem de DNA tem como objectivo criar uma quantidade grande de fragmentos de DNA que contenham um gene pretendido • endonucleases cortam uma molécula de DNA em fragmentos • os fragmentos são inseridos num vector › o genoma do vector é clivado com a mesma endonuclease utilizada na fragmentação do DNA • molécula formada de DNA recombinante é selada pela DNA ligase e transfectada para uma célula bacteriana • constitui-se uma biblioteca de DNA genómico › colecção de fragmentos de DNA clonados › fragmentos contêm sequências não codificantes › como o DNA genómico é clivado ao acaso, muitos fragmentos não contêm genes ou contêm somente partes de genes • pode constituir-se uma biblioteca de DNA complementar › colecção de sequências de cDNA transcritas a partir de mRNA › não possuem intrões, constituindo sequências codificantes não interrompidas Tipos de vectores • são veículos de transporte de segmentos de DNA na forma de DNA recombinante • permitem a obtenção de inúmeros clones de um segmento de DNA através da transfecção e multiplicação em bactérias • tipos de vectores › plasmídeos ◦ são pequenas moléculas circulares de DNA de dupla cadeia (poucas kb) ◦ devido à sua dimensão reduzida só se podem introduzir segmentos de DNA até 10 kb - 22 - ◦ › › › › › possuem uma origem de replicação ◦ têm sítios de restrição para a introdução de DNA exógeno ◦ contém marcadores seleccionáveis (e.g. resistência aos antibióticos) ◦ são transfectados para bactérias, multiplicando-se ◦ os plasmídeos recombinantes são isolados das bactérias por tratamento com antibióticos e centrifugação fagos e bacteriófagos ◦ vírus bacterianos com DNA de cadeia dupla (45 kb) ◦ permite introdução de fragmentos grandes de DNA exógeno cosmídeos ◦ são um tipo de plasmídeos com DNA de cadeia simples ◦ podem carregar DNA exógeno até ~ 45 kb ◦ têm a capacidade de infecção de fagos YACs (yeast artificial chromosome) ◦ cromossomas artificiais de levedura ◦ permitem introdução de DNA com 100 kb ◦ são inseridos em hospedeiros eucarióticos BACs (bacterial artificial chromosome) ◦ são semelhantes aos plasmídeos ◦ contêm genes para ORI binding proteins ◦ permitem a inserção de DNA exógeno com 100 a 400 kb ◦ aplicam-se choques de alta voltagem (electroporação) para acelerar a absorção do BAC pela bactéria ◦ são incorporados em regiões associadas a síndromes HACs (human artificial chromosome) e MACs (mammalian artificial chromosome) ◦ são cromossomas autónomos ◦ aplicam-se em muitas técnicas, e.g. para compreender a função e estrutura dos cromossomas Síntese de cDNA para bibliotecas de cDNA • extracção do mRNA • produção de uma dupla hélice RNA/DNA a partir da enzima transcriptase reversa › a enzima utiliza oligo-dT emparelhado com a cauda poli-A da extremidade 3’ do mRNA como iniciador • degradação do RNA • síntese da dupla hélice de cDNA pela DNA polimerase Chromosome walking • um RFLP próximo do gene pretendido é utilizado como primer para sintetizar um clone de sobreposição parcial • porção terminal do clone é utilizada como primer para sintetizar o próximo clone de sobreposição parcial - 23 - • permite identificação, clonagem e mapeamento do genoma Clonagem posicional • permite o isolamento de um único gene • é um processo muito demorado › mapeamento do genoma (identificação de RFLPs próximos do gene) › construção de um grupo de clones ordenados com sobreposição parcial › procura de sequências de DNA conservadas (sequências importantes mantêm-se ao longo da evolução) › procura de mRNAs apropriados (em tecidos que expressam o fenótipo associado) › identificação das diferenças na sequência dos genes mutados PCR – polymerase chain reaction • técnica que permite a clonagem in vitro de um segmento seleccionado de uma única molécula de DNA • processo › aquecimento para desnaturação da dupla hélice › arrefecimento para hibridização de primers (segmentos flanqueadores sintetizados sob a forma de oligonucleotídeos em laboratório) › incubação com Taq polimerase (termoestável) e dNTPs para síntese das cadeias complementares › repetição dos passos para obtenção de maior número de clones • aplicações › DNA fingerprinting (ciência forense, testes de paternidade) › clonagem de genes › análise de DNA antigo e determinação da evolução do DNA IV. O NÚCLEO DA CÉLULA 1. DNA Cromossómico e sua Compactação O núcleo das células eucarióticas é delimitado pelo envelope nuclear composto por duas membranas concêntricas. O envelope apresenta poros que são responsáveis pelo transporte activo de moléculas de e para o citosol. O envelope é contínuo com as membranas do RE e é sustentado por uma rede de filamentos intermediários na face interna (lâmina nuclear) e na face externa da membrana nuclear. O envelope nuclear é responsável pela protecção das moléculas frágeis de DNA. Cromossomas • cada molécula de DNA sofre vários processos de condensação, formando uma estrutura designada por cromossoma • o conjunto dos cromossomas de um indivíduo, i.e., o conjunto das moléculas de DNA - 24 - • • • constitui o genoma do indivíduo (2×3×109 np no Homem) a compactação torna-se necessária para conseguir manter toda a informação genética dentro do núcleo, com dimensões muito pequenas cada cromossoma apresenta: › origens de replicação – sequências nucleotídicas específicas responsáveis pela iniciação da replicação do DNA › centrómero – mantém dois cromossomas duplicados juntos e liga cada um ao fuso mitótico durante a divisão celular › telómeros – sequência repetida de nucleótidos presente em cada extremidade de um cromossoma linear; periodicamente estendida pela enzima telomerase para compensar perdas de nucleótidos em cada ciclo celular compactação dos cromossomas › dupla hélice de DNA › enrolamento sobre octâmeros de histonas, formando nucleossomas › empacotamento dos nucleossomas com ajuda das histonas H1 › flexão e organização da cromatina condensada por outras proteínas, em subdomínios de características distintas Regiões cromossómicas não codificantes • quanto maior o número de genes, maior é a probabilidade de ocorrer uma mutação em pelo menos um deles • um número elevado de mutações afectará negativamente a função de um gene • a taxa de mutação estabelece o limite superior para o número de genes essenciais • somente uma pequena parte do genoma codifica então genes essenciais para a sobrevivência • não é uma desvantagem para uma célula eucariótica ser portadora de uma grande quantidade de DNA não codificante Relação gene-RNA • a função primária do genoma é a codificação de moléculas de RNA • os genes (regiões do DNA que produzem uma molécula de RNA funcional) podem ser copiados para RNAs que codificam proteínas (mRNA) ou para RNAs estruturais (tRNA, rRNA) • os transcritos primários de RNA contêm sequências codificantes (exões) interrompidas por sequências não codificantes (intrões) • cada gene está ainda associado a uma sequência de DNA regulatória que regula a sua transcrição • genes essenciais são geralmente muito semelhantes em espécies evolutivamente próximas, constituindo regiões conservadas do genoma • regiões não conservadas representam normalmente DNA não codificante, pois a sua mutação não afectará a função dos genes - 25 - Histonas e nucleossomas • o DNA cromossómico é compactado com ajuda de proteínas especiais – histonas e proteínas cromossómicas não histónicas • o complexo formado pela interacção destas proteínas com o DNA nuclear chama-se cromatina • as histonas são proteínas relativamente pequenas com muitos a.a. positivamente carregados (Lis, Arg), o que ajuda na sua ligação ao DNA (com carga negativa) • dividem-se em dois grupos › histonas nucleossómicas (H2A, H2B, H3, H4) ◦ proteínas pequenas responsáveis pelo enrolamento do DNA nos nucleossomas › histonas H1 (seis subtipos) • nem todo o DNA é compactado da mesma maneira, sendo que o modo como uma certa região é condensada influencia a actividade dos genes nessa região particular • a unidade básica da compactação do DNA é o nucleossoma › em cromossomas descondensados conferem um aspecto de contas de rosário à cromatina › nucleases (e.g. DNases) podem degradar o DNA de ligação (até 80 np de extensão) entre os nucleossomas, mas o DNA associado a um octâmero de histonas é protegido da degradação ◦ cada octâmero e composto por duas moléculas de cada histona nucleossómica, apresentando uma estrutura em forma de disco em volta do qual o DNA se é enrolado duas vezes › um gene eucariótico de 10 kb contém cerca de 50 nucleossomas • posicionamento dos nucleossomas na cadeia de DNA › devido à sua ligação forte à molécula de DNA, os octâmeros de histonas permanecem fixos nas sua posição natural, sem deslizar ao longo da cadeia › o DNA tem dificuldade em dar duas voltas às histonas ◦ sequências ricas em A-T são mais facilmente comprimidas ◦ cada octâmero tende a posicionar-se de modo a maximizar o número de sulcos menores ricos em A-T no lado interno da dupla hélice › outras proteínas fortemente ligadas ao DNA impedem a formação de nucleossomas ◦ daí que algumas regiões de DNA, mesmo com centenas de np de extensão, não estão organizadas em nucleossomas ◦ esses locais são sítios hipersensíveis à nuclease e estão frequentemente posicionadas nas regiões regulatórias dos genes › como cada nucleossoma se posiciona de acordo com a flexibilidade da cadeia de DNA, o DNA de ligação entre os nucleossomas tem extensão variável › os nucleossomas são compactados uns sobre os outros em arranjos regulares, provocando uma condensação ainda maior do DNA ◦ as histonas H1 são responsáveis pela justaposição dos nucleossomas ◦ as H1 possuem uma região globular central que contacta com o nucleossoma, e duas extensões que contactam com outros sítios nos nucleossomas adjacentes Cromossomas plumosos - 26 - • • muitos cromossomas em interfase encontram-se numa forma fina e emaranhada, pouco condensada os cromossomas plumosos formam alças de cromatina rígidas e estendidas, cobertas com RNA recém-transcrito, compactado em complexos densos de RNA-proteína › uma série de grandes alças de cromatina emana de um eixo cromossómico linear › experiências de hibridização mostram que uma alça contém sempre a mesma sequência de DNA e permanece estendida da mesma maneira durante o crescimento da célula › a maioria da cromatina não está nas alças, mas permanece altamente condensada nos cromómeros que geralmente não são transcritos › ilustram que quando a cromatina é activamente transcrita tem uma estrutura estendida, enquanto que quando estiver condensada ela está inactiva Domínios individuais da cromatina • cromossomas politénicos › algumas células (e.g. larvas de moscas) aumentam de tamanho através da replicação do seu genoma, sem que ocorram divisões celulares › os cromossomas agrupam-se lado a lado e formam estruturas enormes chamadas cromossomas politénicos › estes cromossomas também são activos na síntese de RNA › apresentam um padrão de bandas escuras (85 %) e interbandas claras (15 %) ◦ qualquer uma destas bandas contém provavelmente genes • bandas individuais expandem-se muitas vezes quando os genes nelas contidos tornam-se activos, e recondensam quando os genes voltam a um estado inactivo • as regiões cromossómicas mais activas estão descondensadas e formam puffs cromossómicos › durante o desenvolvimento de um organismos formam-se novos puffs enquanto que os antigos regridem › isto activa e inactiva unidades de transcrição, o que leva à produção de mRNAs e proteínas diferentes › a maioria dos puffs origina-se de uma única banda cromossomal Cromatina transcripcionalmente activa e inactiva • as regiões que contêm genes activos são descondensados para que possa ocorrer transcrição • em núcleos isolados de vertebrados expostos à DNase I, verifica-se uma degradação de cerca de 10 % do genoma • diferentes sequências de DNA são degradadas em células distintas do mesmo organismo, dependendo dos genes que estão a ser transcritos • a cromatina descondensada, acessível à transcrição e à degradação por nucleases, designa-se por cromatina activa, enquanto que a cromatina condensada é cromatina inactiva • diferenças entre a cromatina activa e inactiva (relativo à cromatina activa): › a H1 está ligada mais frouxamente › a H1 apresenta subtipos específicos para a cromatina activa - 27 - › › › os quatro tipos de histomas nucleossómicas estão altamente acetiladas a H2B está menos fosforilada está enriquecida com uma forma variante da H2A Heterocromatina e eucromatina • em núcleos interfásicos distinguem-se dois tipos de cromatina › heterocromatina – altamente condensada › eucromatina – menos condensada • a heterocromatina permanece numa forma compactada durante a interfase pois é transcripcionalmente inactiva › constitui uma forma especial da cromatina inactiva com funções distintas, e.g. sequências nucleotídeos repetidas simples em volta do centrómero • a eucromatina existe na forma activa, menos condensada (10%), e na forma inactiva, mais condensada Cromossomas mitóticos • os cromossomas interfásicos são muito estendidos e emaranhados • durante a mitose os cromossomas enrolam-se e formam estruturas muito mais condensadas › a condensação é acompanhada pela fosforilação das histonas H1 • num cromossoma mitótico, as duas moléculas de DNA filhas, produzidas na fase S, estão compactadas separadamente formando duas cromátides irmãs unidas pelos centrómeros › estão normalmente cobertos por moléculas como ribonucleoproteínas › cada cromátide é formada por domínios em alça que emanam de um eixo helicoidal • o conjunto dos 46 cromossomas humanos na mitose chama-se cariótipo • através de métodos de coloração (e.g. tripsina/giemsa) identificam-se bandas diferentes › bandas escuras ricas em pares A-T › bandas claras ricas em pares G-C › uma banda típica no cariótipo humano contém várias centenas de genes › no início da mitose o genoma haplóide contém cerca de 2000 bandas escuras › essas bandas coalescem à medida que a condensação progride, formando menos bandas escuras, mas mais espessas › o padrão exacto de bandas de cada cromossoma permaneceu inalterado durante longos períodos evolutivos, e é característico para cada cromossoma Replicação dos cromossomas • cada cromossoma é duplicado na fase S do ciclo celular • no final da fase S, que dura cerca de 8 horas, cada cromossoma deu origem a duas cópias completas unidas pelos seus centrómeros • a replicação cromossómica efectua-se através de forquilhas de replicação que são iniciadas em sequências nucleotídicas específicas, as origens de replicação • o padrão de replicação foi determinado através da marcação com 3H-timidina, tornando o DNA recém-sintetizado radioactivo - 28 - › • • • • muitas forquilhas de replicação movem-se simultaneamente em cada cromossoma › as origens de replicação tendem a ser activadas em grupos de 20 a 80 origens (unidades de replicação) › novas unidades são activadas até que todo o DNA seja replicado › dentro de uma unidade, as origens estão separadas por intervalos de 30 a 300 knp › as forquilhas de replicação, formadas em pares, só param quando chegam à extremidade do cromossoma ou quando colidem com outra forquilha as zonas de heterocromatina, altamente condensadas, replicam-se muito tarde na fase S › nos indivíduos femininos, um cromossoma X é aleatoriamente inactivado ◦ em caso de rearranjo cromossómico (e.g. translocações) é o cromX normal que é inactivado › o cromX activo é replicado ao longo de toda a fase S › o cromX inactivo, condensado em heterocromatina, é replicado somente no final da fase S genes housekeeping, activos em todas as células, são replicados logo no início da fase S os genes activos em apenas alguns tipos de células são replicados cedo nas células em que estão activos e mais tarde noutras células › a maioria das bandas claras ricas em G-C é replicada na primeira metade da fase S ◦ muitos genes housekeeping situam-se provavelmente nas bandas escuras › a maioria das bandas escuras ricas em T-A é replicada na segunda metade dessa fase ◦ muitos genes específicos para determinado tipo de célula situam-se nestas bandas nos eucariotas, a DNA polimerase não é capaz de replicar as extremidades das moléculas lineares de DNA › em cada ciclo de replicação ocorre a perda de alguns np (perda de informação genética) › isto levou à evolução dos telómeros ◦ sequências repetitivas de DNA, ricas em G, nas extremidades dos cromossomas › a enzima telomerase reconhece a cadeia rica em G da sequência telomérica ◦ alonga a cadeia no sentido 5’ – 3’ ◦ cada extremidade tem um número variável de repetições que se estendem por centenas de np ◦ em ausência de DNA complementar sintetiza uma nova sequência usando um molde de RNA que faz parte da enzima a DNA polimerase sintetiza a cadeia complementar à telomérica a DNA pol α (no caso da cadeia lagging) possui a DNA primase para iniciar a síntese › pensa-se que o encurtamento dos telómeros possa ser uma razão do envelhecimento ◦ os cromossomas perdem informação genética ◦ os órgãos deterioram devido à morte de cada vez mais células 2. Síntese e Processamento de RNA A síntese de RNA, também chamada transcrição, é um processo altamente selectivo, pois somente cerca de 1 % da da sequência nucleotídica do DNA dá origem a RNAs funcionais. A - 29 - selectividade ocorre a dois níveis, pois somente uma parte da sequência do DNA é transcrita para RNAs nucleares, e só pequenas porções dessas moléculas sobrevivem ao processo do splicing. Na transcrição, uma molécula de RNA polimerase liga-se a um promotor e expões as duas cadeias do DNA. De seguida a enzima desliza ao longo da molécula de DNA, sintetizando um RNA no sentido 5’ – 3’, até encontrar um sinal de terminação. Aí a polimerase dissocia-se da cadeia de DNA e liberta a molécula de RNA recém-sintetizada (vd. síntese proteica). RNA polimerases • são enzimas grandes, formadas por várias cadeias polipeptídicas • cataliza a formação de ligações fosfodiéster entre rNTPs para formar cadeias de RNA • não necessita de primers para iniciar a transcrição › leva a uma maior ocorrência de erros, mas isto é de importância reduzida pois os erros não são transmitidos à descendência • nos procariontes existe somente um tipo de RNA polimerase › a subunidade σ da RNA polimerase bacteriana é específica para a ligação ao promotor › o factor σ é substituído por factores de alongamento essenciais para o alongamento e terminação da cadeia • nos eucariontes existem três tipos de RNA polimerases › RNA pol I – produz rRNA › RNA pol II – produz precursores de mRNA e snRNA (importantes no splicing) › RNA pol III – produz tRNA e pequenos rRNAs Precursores do mRNA • as moléculas recém-sintetizadas de RNA chama-se transcritos primários ou RNA nuclear heterogéneo (hnRNA) devido à grande variedade de tamanhos • os transcritos são modificados nas extremidades para impedir a sua degradação › as modificações indicam que os transcritos devem ser traduzidos em proteínas › na extremidade 5’ é adicionado um nucleótido G metilado – cap 5’ (capping) ◦ a adição ocorre após a síntese de cerca de 30 nucleótidos de RNA ◦ o cap é importante na iniciação da síntese proteica e na protecção do hnRNA › na extremidade 3’ é adicionado uma cauda poli-A (poliadenilação) ◦ quando a RNA pol transcreve a sequência AAUAAA mais uma sequência downstream, o transcrito é clivado e são-lhe adicionados 100 a 200 resíduos de ácido adenílico ◦ a RNA pol continua a transcrever uma molécula, a qual é degradada por não possuir o cap 5’ ◦ a cauda poli-A é importante: na exportação do mRNA maduro para o citosol para a estabilidade do mRNA no citosol como sinal de reconhecimento pelo ribossoma (determina se mRNA está intacto) Splicing do RNA - 30 - • • • • • • • exões – sequências codificantes do DNA intrões – sequências não codificantes do DNA que se encontram entre os exões splicing – processo através do qual as sequências dos intrões num transcrito de RNA são removidas › caracterizado pela excisão dos intrões e junção dos exões › é responsável pela conversão do hnRNA em mRNA maduro nas células eucariotas existem complexos enzimáticos associados a pequenas moléculas de RNA – snRNPs (ribonucleoproteínas nucleares pequenas) – importantes no splicing processo do splicing › um intrão apresenta 3 sequências nucleotídicas específicas para a ocorrência do splicing ◦ sítio de splice 5’ ou sítio doador (na extremidade 5’ do intrão) ◦ sítio de splice 3’ ou sítio aceitador (na extremidade 3’ do intrão) ◦ sítio de ramificação do intrão › vários snRNPs associam-se e formam o spliceossoma que catalisa o splicing do RNA ◦ o snRNP U1 liga-se ao sítio de splice 5’ e o U2 ao ponto de ramificação ◦ U4/U6 aproxima U1 e U2 ◦ o ponto de ramificação cliva o sítio de splice 5’ e liga-se à extremidade 5’ do intrão 1ª reacção de transesterificação ◦ U5 aproxima as duas extremidades dos exões, as quais se juntam 2ª reacção de transesterificação é libertado o intrão em forma de laço, com o spliceossoma ligado › existem mecanismos responsáveis para que o sítio de splice 5’ se junte ao 3’ mais próximo ◦ isto evita a excisão de segmentos que contêm exões somente as sequências específicas para o splicing são geralmente conservadas nos intrões pois determinam os sítios de splice › uma mutação nestas sequências pode levar a um novo padrão de splicing › pode levar à extensão ou encurtamento de exões ou ao surgimento de novos exões › daí pode resultar uma mutação benéfica que provoca a evolução de uma espécie › ou pode levar a uma mutação prejudicial: ◦ por eliminação de um sítio de splice (e.g. talassémia) ◦ por introdução de um novo sítio de splice (sítio críptico) as células ancestrais usavam RNA como principais agentes catalíticos e para armazenamento da informação genética › as reacções de splicing eram catalisadas pelo próprio RNA da sequência intrónica (auto-splicing) › a sequência do intrão precisava de adquirir uma conformação tridimensional para poder aproximar as extremidades dos exões › sequências de intrões do grupo I ◦ um nucleótido G livre liga-se à sequência do intrão ◦ o G provoca a quebra da ligação no sítio de splice 5’ › sequências de intrões do grupo II ◦ um nucleótido A especialmente reactivo do intrão ataca a ligação no sítio 5’ e o - 31 - • intrão é excisado em forma de laço, semelhante ao processo actual somente moléculas de mRNA que apresentem o cap 5’ e a cauda poli-A e que, ao mesmo tempo, não tenham sítios de splice é que podem sair do núcleo › o transporte é activo e afectua-se através dos poros nucleares › proteínas nucleares ligadas ao mRNA são rapidamente retornados para o núcleo Nucléolo • o nucléolo é a estrutura mais facilmente visível dentro do núcleo de uma célula • é o sítio onde ocorre a compactação de moléculas de rRNA com proteínas para formar ribossomas • contém alças de DNA dos braços curtos dos cromossomas acrocêntricos (13, 14, 15, 21, 22), RNAs e proteínas • apresenta várias zonas › centro fibrilar pouco corado que contém DNA inactivo › componente fibrilar denso que contém moléculas de RNA a serem sintetizadas › componente granuloso que contém partículas ribossomais precursoras maduras • o tamanho do nucléolo reflecte a sua actividade • não existe nucléolo na metafase, mas no final da mitose voltam a aparecer pequenos nucléolos que se vão juntar para formar um único nucléolo grande › os RNAs e proteínas nucleolares ficam distribuídos na superfície dos cromossomas metafásicos, sendo assim transportados para a célula filha • síntese de ribossomas › o rRNA é transcrito pela RNA pol I › o transcrito é compactado numa partícula de RNP ◦ a partícula é formada por proteínas ribossomais e de processamento recicladas ou importadas do citoplasma › porções seleccionadas da partícula de RNP são descartadas e o rRNA é processado › formam-se as subunidades ribossomais maior e menor imaturas ◦ são transportadas individualmente para o citoplasma ◦ é aí que adquirem a sua forma funcional final O CITOESQUELETO 1. A Natureza do Citoesqueleto • • • rede complexa e dinâmica de filamentos que se estende por todo o citoplasma responsável por contracção muscular, segregação dos cromossomas e transporte de organelos, movimentos celulares coordenados, deslocamento de células formado por filamentos de actina (actina), microtúbulos (tubulina) e filamentos intermediários (prots fibrosas) – polimerização dos monómeros - 32 - Microtúbulos • extremidade “+” (crescimento rápido, livre no citoplasma) • extremidade “-” (crescimento lento, estabilizada pelo centrossoma) • centrossoma é responsável pela (des)polimerização dos microtúbulos • - 33 -
