ESTRUTURA GENÉTICA E SISTEMA DE CRUZAMENTO EM

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
MELHORAMENTO DE PLANTAS
ESTRUTURA GENÉTICA E SISTEMA DE
CRUZAMENTO EM Eugenia dysenterica DC.
(MYRTACEAE)
ANA CLARA DE OLIVEIRA FERRAZ BARBOSA
Orientadora:
Profa. Dra. Mariana Pires de Campos Telles
Coorientadora:
Profa. Dra. Rosane Garcia Collevatti
Goiânia, GO – Brasil
Março – 2014
2
ANA CLARA DE OLIVEIRA FERRAZ BARBOSA
ESTRUTURA GENÉTICA E SISTEMA DE
CRUZAMENTO EM Eugenia dysenterica DC.
(MYRTACEAE)
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Genética e Melhoramento de Plantas, da Universidade
Federal de Goiás, como requisito parcial à obtenção do
título de Doutor em Genética e Melhoramento de
Plantas.
Orientadora:
Profa. Dra. Mariana Pires de Campos Telles
Coorientadora:
Profa. Dra. Rosane Garcia Collevatti
Goiânia, GO – Brasil
2014
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Barbosa, Ana Clara de Oliveira Ferraz.
B238e
Estrutura genética e sistema de cruzamento em Eugenia
dysenterica DC. (Myrtaceae) [manuscrito] / Ana Clara de
Oliveira Ferraz Barbosa. - 2014.
126 f. : figs, tabs.
Orientadora: Profª. Drª. Mariana Pires de Campos Telles.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás,
Escola de Agronomia, 2014.
Bibliografia.
1. Cagaita (genética de populações) 2. Eugenia
dysenterica (cagaita) – Diversidade 3. Cagaita – Subpopulações I. Título.
CDU: 582.883
".-
sra~
UFG
sistema de bibliotecas ufg
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR
AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade
de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade
Federal de Goiás
(UFG) a disponibilizar,
gratuitamente,
por meio da Biblioteca
Digital de Teses e Dissertações
(BDTD/UFG),
sem ressarcimento
dos direitos autorais,
de acordo com a Lei nO 9610/98,
o documento conforme
permissões
assinaladas
abaixo, para fins de leitura, impressão
e/ou download, a título de divulgação
da produção científica brasileira,
a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico:
- d a Tese ou
2 Id entí icacao
Autor (a):
E-mail:
Seu e-mail
[ X ] Tese
rsser t açao
Ferraz Barbosa
I Ana Clara de Oliveira
I [email protected]
pode ser disponibilizado
Vínculo empregatício
Agência de fomento:
País:
[ ] Dissertação
na página?
[ X ]Sim
[ ] Não
do autor
Nenhum
Coordenação
de Aperfeiçoamento
de Sigla:
CAPES;
Pessoal de Nível Superior; Fundação de
FAPEG
Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás
UF:
I DF; I CNPJ: 100889834/0001-08;
GO
08156102/0001-02
e sistema de cruzamento
em Eugenia dysenterica De.
Brasil
Estrutura genética
Título:
(Mvrtaceae)
I cagaiteira, diversidade, estrutura genética, microssatélites, sistema misto
Palavras-chave:
I Genetic structure and mating system in Eugenia dysenterica De.
Título em outra língua:
(Myrtaceae)
Palavras-chave
em outra língua:
I cagaiteira, diversity, genetic structure, microsatellites,
mixed svstern
Area de concentracão:
I Genética e Melhoramento de Plantas
Data defesa: (dd/rnrn/aaaa)
2810312014
I
Proqrarna de Pós-Graduação:
I Genética e Melhoramento de Plantas
Orientador
(a): I Dra. Mariana Pires de Campos Telles
I [email protected]
E-mail:
Co-orientador(a):
* I Dra. Rosane Garcia Collevatti
I [email protected]
E-mail:
- constar no SISPG
*Necesslta do CPF quando nao
3. Informações de acesso ao documento:
Concorda
com a liberação
total
do documento
[ X ] SIM
Havendo concordância
com a disponibilização
eletrônica,
torna-se
imprescindível
o envio does) arquivo(s)
em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.
O sistema da Biblioteca
Digital de Teses e Dissertações
garante aos autores, que os arquivos contendo
eletronicamente
as teses e ou dissertações,
antes de sua disponibilização,
receberão
procedimentos
de segurança,
criptografia
(para não permitir
cópia e extração
de
conteúdo,
permitindo
apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.
___
---'~'JI"ZL""lJ)j)LlLII&) .
Assinatur~o
(a) autor
Data:
JL 1
06 1 MIl.,
(a)
este caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita
justificativa junto à coordenação do curso, Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de
embargo,
ANA CLARA DE OLIVEIRA
FERRAZ
BARBOSA
TÍTULO: "Estrutura Genética e sistema de cruzamento em Eugenia
dysenterica DC. (Myrtaceae)".
Tese DEFENDIDA em 28 de Março
2014, e APROVADA pela Banca
Examinadora constit ída pel
~
~p.1",--.'
Prof. Dr. Alexandre Siq eira Guedes Coelho
, EAlUFG
Goiânia - Goiás
Brasil
•......._------
-
_.-
3
Aos meus pais, Coraci, Eurípedes e Saulo
e irmãos, Juliano, André e Clara Juliene,
pelo amor incondicional.
Ofereço
Ao meu marido, José Luiz Ferraz
Barbosa, pelo amor, companheirismo e
inspiração sem medida. Aos demais
familiares, pelo carinho e apoio.
Dedico
4
“Como é feliz o homem que acha sabedoria, o homem que obtém
entendimento, pois a sabedoria é mais proveitosa do que a prata e rende mais
do que o ouro. É mais preciosa do que rubis; nada do que você possa desejar
se compara a ela. Na mão direita, a sabedoria lhe garante vida longa; na
mão esquerda, riquezas e honra. Os caminhos da sabedoria são caminhos
agradáveis, e todas as suas veredas são paz. A sabedoria é árvore que dá
vida a quem a abraça.”
Provérbios 3.13-18
5
AGRADECIMENTOS
Primeiramente eu agradeço a Deus e aos meus pais pela minha vida, e a todos
aqueles que de alguma forma contribuíram para minha formação até aqui. A todos os
professores, em especial à minha orientadora, Profa. Dra. Mariana Pires de Campos
Telles, pela oportunidade, pelos ensinamentos, pelos conselhos, pelo apoio, pela confiança
e por ter muita paciência comigo. Você é um belo exemplo de ser humano, pois consegue
conciliar muito bem todos os papéis que desenvolve (mãe, esposa, pesquisadora,
orientadora, chefe, amiga...), e me inspira por exercê-los com tanto amor e dedicação. Te
elejo a melhor orientadora do planeta!
Também agradeço à minha coorientadora, Profa. Dra. Rosane Garcia
Collevatti, pelos ricos ensinamentos nas aulas, no campo, pelas discussões, sugestões e
correções do presente trabalho e também pela amizade e confiança. Sua inteligência me
inspira e me faz ter vontade de estudar cada vez mais. Aos Professores Dr. Lázaro José
Chaves e Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho, os quais, juntamente com a Dra. Rosane,
fizeram parte da minha banca de qualificação, pelos conselhos, pelo apoio e por acreditar
que eu fosse capaz de concluir esse trabalho, apesar das circunstâncias. Obrigada por tudo!
Mais uma vez agradeço ao Prof. Dr. Lázaro e também à Profa. Dra. Thannya
Nascimento Soares, Prof. Dr. Ronaldo Veloso Naves e por todos aqueles que contribuíram
nas coletas das populações de Eugenia dysenterica que viabilizaram esse trabalho. Aos
membros da banca, Dra. Karina Martins (UFSCAR), Dr. Lúcio Flávio de Alencar
Figueiredo (UnB), Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho (UFG) e Dr. Lázaro José
Chaves (UFG), por terem aceitado o convite para participarem da banca examinadora
dessa tese e pelas valiosas contribuições ao trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG), pelas bolsas concedidas
durante o período de realização do curso de doutorado, e ao Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro concedido ao
projeto de pesquisa (475182/2009-0; GENPAC 10 - Proc. 563727/2010-1), sem os quais
seria impossível a realização desse trabalho.
6
Aos colegas e técnicas (também colegas!) do Laboratório de Genética &
Biodiversidade (LGBio) da Universidade Federal de Goiás, pela ajuda na bancada, pelos
ensinamentos, pelas discussões e também pelos momentos de amizade e descontração.
Agradeço em especial ao Eduardo, Edivaldo e Leciane, pelas discussões no nosso grupo
de estudo e auxílio em algumas análises da tese, as quais contribuíram bastante para esse
trabalho, e à Jacqueline (Jac), pela amizade e pela grande ajuda com alguns programas
difíceis e discussão dos resultados. Agradeço também ao Arthur pela valiosa ajuda na reta
final desse trabalho. Vocês são muito especiais pra mim! Agradeço também ao
Laboratório de Genética e Genômica de Plantas da Escola de Agronomia, pela
disponibilização do analisador automático de DNA, sem o qual este trabalho não teria sido
possível.
A todos os meus amigos pessoais e familiares, os quais compreenderam a
minha ausência em tantos momentos e compartilharam da minha ansiedade, pelo carinho,
pelo incentivo e pela torcida. Aos meus pastores e irmãos na fé em Jesus Cristo, pelo
apoio espiritual e pelas orações. Agradeço imensamente à minha mãe, Coraci, por seu
amor e apoio incondicional em TUDO. Amo muito todos vocês!
Ao meu amado marido, meu “porto seguro”, meu referencial, meu
companheiro, José Luiz, por cuidar de mim com tanto amor e paciência, pela confiança,
pelo incentivo e pelo companheirismo em TODOS os momentos... Você é a melhor parte
da minha vida!
MUITO OBRIGADA A TODOS!
7
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ 8
LISTA DE TABELAS.......................................................................................................... 10
LISTA DE APÊNDICES ..................................................................................................... 11
RESUMO GERAL ............................................................................................................... 12
GENERAL ABSTRACT ..................................................................................................... 13
1
INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................. 14
2
2.1
2.2
2.3
REFERENCIAL TEÓRICO ....................................................................................... 16
Eugenia dysenterica DC. ................................................................................................ 16
SISTEMA DE CRUZAMENTO EM PLANTAS E FLUXO GÊNICO ........................ 24
DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA ............................................................ 29
3 SISTEMA DE CRUZAMENTO, ENDOGAMIA E PATERNIDADE EM UMA
SUBPOPULAÇÃO DE Eugenia dysenterica DC. (MYRTACEAE) ................................ 35
RESUMO ............................................................................................................................... 35
ABSTRACT ........................................................................................................................... 36
3.1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 36
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 39
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 43
3.4 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 58
4 ESTRUTURA GENÉTICA INTRAPOPULACIONAL DE Eugenia dysenterica
DC. (MYRTACEAE) ........................................................................................................... 59
RESUMO ............................................................................................................................... 59
ABSTRACT ........................................................................................................................... 60
4.1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 60
4.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 62
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 66
4.4 CONCLUSÃO................................................................................................................ 68
5 DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA ENTRE SUBPOPULAÇÕES DE
Eugenia dysenterica DC. (MYRTACEAE)......................................................................... 69
RESUMO ............................................................................................................................... 69
ABSTRACT ........................................................................................................................... 70
5.1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 70
5.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 72
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 78
5.4 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 91
6
CONCLUSÕES GERAIS ............................................................................................ 93
7
REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 94
APÊNDICES ....................................................................................................................... 108
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Eugenia dysenterica (cagaita). Foto: Ana Clara de O. F. Barbosa, Santa
Terezinha – GO, em novembro de 2011 ........................................................... 16
Figura 2. Eugenia dysenterica. (A) tronco com casca grossa e fissurada; (B) folhas e
frutos maduros; (C) fruto aberto mostrando a semente; (D) folhas jovens e
flores. Fotos A e B: Ana Clara de O. F. Barbosa, Mimoso – GO, novembro
de
2011;
Foto
D:
http://www.flickr.com/photos/gilbertopalma/
4996643474/in/ photostream/ ........................................................................... 17
Figura 3. Ocorrência de cagaita vermelha em Senador Canedo – GO. Foto: Ana Clara
de O. F. Barbosa, novembro de 2011 ............................................................... 17
Figura 4. Alguns exemplos do uso do fruto da cagaita na culinária (Fontes:
http://revistacrescer.globo.com/Revista/Crescer/0EMI17902-10516,00.html;
http://improvisosnacozinha.blogspot.com/2010/07/sorvetes-frutos-docerrado.html)..................................................................................................... 18
Figura 5. Árvore de E. dysenterica (cagaiteira) com florescimento exuberante,
mostrando seu potencial para o paisagismo (Fonte: http://picasaweb.google.
com/lh/photo/J0P0-nLjmvO8JAkVBxxNxg) ................................................... 19
Figura 6. Esquema das fitofisionomias do bioma Cerrado (Ribeiro & Walter, 1998). ...... 20
Figura 7. Distribuição natural da cagateira em 110 localidades entre 376 levantamentos
realizados no Bioma Cerrado (adaptado de Ratter e colaboradores, 2000) ...... 21
Figura 8. Apis mellifera (A) e Bombus sp. (B) visitando uma flor de E. dysenterica.
(Fontes: http://picasaweb.google.com/lh/photo/2PtrTo89rL6RbSkgYWJjWA;
http://www.flickr.com/photos/72748940@N00/2296461547)......................... 22
Figura 9. Modelos propostos para fluxo gênico. As setas largas indicam fluxo gênico
mais frequente (adaptado de Medeiros, 2010) .................................................. 27
Figura 10. Frequências alélicas dos sete locos microssatélites analisados na população
de Mimoso – GO, estimados para 521 indivíduos de E. dysenterica ............... 45
Figura 11. Localização de Mimoso – GO no Brasil e destaque para a região de coleta,
mostrando a distribuição espacial dos 102 indivíduos adultos ......................... 63
Figura 12. Distribuição das distâncias par-a-par entre 102 indivíduos adultos da
subpopulação de E. dysenterica de Mimoso – GO ........................................... 66
Figura 13. Relação entre coancestria (Fij ± DP; DP: desvio padrão) e logaritmo da
distância para 102 indivíduos adultos de E. dysenterica em Mimoso – GO .... 67
Figura 14. Distribuição das 23 subpopulações de E. dysenterica avaliadas. Os
municípios referentes aos códigos no mapa estão na Tabela 10 ...................... 74
Figura 15. Frequências alélicas dos sete locos microssatélites analisados, estimados
para 736 indivíduos de E. dysenterica oriundos de 23 subpopulações
naturais .............................................................................................................. 80
Figura 16. Número de alelos de cada um dos sete locos microssatélites analisados,
estimados para 736 indivíduos de E. dysenterica ............................................. 80
9
Figura 17. Número de alelos privados (ou exclusivos) por subpopulação obtidos de um
total de 192 alelos de sete locos microssatélites em 23 subpopulações de E.
dysenterica ........................................................................................................ 81
Figura 18. Relação entre as distâncias genéticas (FST linearizado par-a-par) e o
logaritmo das distâncias geográficas entre 23 subpopulações de E.
dysenterica. A correlação matricial (r = 0,427; p < 0,001) foi significativa,
segundo teste de Mantel utilizando-se 5.000 permutações aleatórias .............. 89
Figura 19. Correlograma de Mantel (oito classes de distância) e os respectivos valores
de r (correlação de Pearson) para cada classe (r global = 0,427, p < 0,001;
5.000 permutações) ........................................................................................... 90
Figura 20. Número de K grupos que melhor se ajusta aos dados segundo método de
Evanno (2005b) ................................................................................................ 91
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Amostragem de famílias de polinização aberta de E. dysenterica coletadas de
uma subpopulação de Mimoso – GO .................................................................... 39
Tabela 2. Caracterização dos sete locos microssatélites baseado na genotipagem de 122
indivíduos de E. dysenterica da população de Mimoso – GO .............................. 46
Tabela 3. Caracterização do sistema de cruzamento de indivíduos de E. dysenterica
baseado em famílias de polinização aberta da população de Mimoso – GO ....... 47
Tabela 4. Caracterização do sistema reprodutivo em uma população de E. dysenterica ......... 48
Tabela 5. Atribuição de paternidade para 174 sementes de E. dysenterica da população de
Mimoso – GO, com confiança de 95 e 99%. ........................................................ 49
Tabela 6. Atribuição de paternidade para 399 sementes de E. dysenterica da população de
Mimoso – GO para diferentes níveis de confiança ............................................... 54
Tabela 7. Avaliação de paternidade múltipla para a espécie E. dysenterica em uma
subpopulação de Mimoso – GO............................................................................. 55
Tabela 8. Classes de distância usadas na análise de estrutura genética espacial
intrapopulacional de E. dysenterica em Mimoso – GO ........................................ 65
Tabela 9. Comparação da estrutura genética espacial (EGE) intrapopulacional e vizinhança
genética entre quatro subpopulações de espécies do cerrado. F1: valor de Fij
intra grupo; b: inclinação da regressão; Sp: parâmetro de força da EGE; Nb:
vizinhança genética ................................................................................................ 68
Tabela 10. Subpopulações naturais de E. dysenterica amostradas para análise genética......... 73
Tabela 11. Discriminação dos 26 alelos privados encontrados nas subpopulações de E.
dysenterica, respectivos locos, frequências e população na qual ocorrem ............ 82
Tabela 12. Caracterização genética de 23 subpopulações de E. dysenterica baseados em
sete locos microssatélites ....................................................................................... 83
Tabela 13. Riqueza alélica (por loco e população) de 23 subpopulações de E. dysenterica
para sete locos microssatélites, corrigida pelo método de rarefação (Hurlbert,
1971) para sete indivíduos ..................................................................................... 84
Tabela 14. Teste de aderência às proporções de Hardy-Weinberg. Probabilidades
calculadas dos desvios das proporções de Hardy-Weinberg de sete locos
microssatélites em 23 subpopulações de E. dysenterica, segundo teste de
permutação ............................................................................................................. 85
Tabela 15. Diversidade Genética de Nei (1973) em 23 subpopulações de E. dysenterica,
para sete locos microssatélites ............................................................................... 86
Tabela 16. Análise de variância de frequências alélicas, segundo Weir & Cockerham
(1984), em 23 subpopulações de E. dysenterica, para sete locos microssatélites . 87
Tabela 17. Diferenciação entre 23 subpopulações de E. dysenterica, estimado por FST
global e RST global, por loco e para o total dos locos. Teste unilateral (FST > RST) 88
Tabela 18. Classes de distâncias usadas no teste de Mantel e seus respectivos valores de N,
distâncias, r e p ...................................................................................................... 90
11
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice A. Relação dos pares de iniciadores de regiões microssatélites utilizados e
suas principais características ........................................................................... 108
Apêndice B. Composição dos dois multiplexes de injeção usados nas análises ................. 108
Apêndice C. Perfil do multiplex 1 (locos ED-04, ED-05, EMBRA-72 e EMBRA-210) ... 109
Apêndice D. Perfil do multiplex 2 (locos ED-09, EMBRA-14 e EMBRA-172) ................ 109
Apêndice E. Número de sementes por fruto em famílias de polinização aberta de E.
dysenterica da população de Mimoso – GO ..................................................... 110
Apêndice F. Frequência alélica dos sete locos microssatélites nas 23 subpopulações de
E. dysenterica, em um total de 192 alelos ........................................................ 119
Apêndice G. Teste de desequilíbrio de ligação para todas as possibilidades de pares de
locos. Probabilidades calculadas a partir de teste baseado em reamostragem,
segundo teste de permutação ............................................................................ 123
Apêndice H. Distâncias genéticas entre as 23 subpopulações de E. dysenterica. Acima
da diagonal: distância genética de Nei (1972); debaixo da diagonal: FST/1FST par-a-par (Rousset, 1997) ........................................................................... 124
Apêndice I. Padrão de divergência genética entre 23 subpopulações de E. dysenterica,
definido por UPGMA, usando distância genética de Nei (1972) como
identidade genética ........................................................................................... 125
Apêndice J. Distâncias geográficas (km) entre as 23 subpopulações de E. dysenterica .... 126
12
RESUMO GERAL
BARBOSA, A. C. O. F. Estrutura genética e sistema de cruzamento em Eugenia
dysenterica DC. (Myrtaceae). 2014. 126 f. Tese (Doutorado em Genética e
Melhoramento de Plantas) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás,
Goiânia, 2014.1
A estrutura genética de uma espécie corresponde à quantidade da
variabilidade genética e sua distribuição dentro e entre populações locais e indivíduos.
Os padrões de variabilidade entre indivíduos em uma população local são altamente
dependentes do sistema de cruzamento. O objetivo geral do trabalho foi avaliar o
sistema de cruzamento, a diversidade e a estrutura genética em populações de E.
dysenterica, em escala local e regional. A avaliação do sistema de cruzamento e a
análise da estrutura genética intrapopulacional foram realizadas em uma população do
município de Mimoso – GO e para a estrutura genética interpopulacional foram
analisadas 23 subpopulações naturais de E. dysenterica oriundas de seis estados
brasileiros. Para todos os estudos foram utilizados sete locos microssatélites
polimórficos. Considerando as 20 famílias analisadas, as taxas de fecundação cruzada
multiloco (tm = 0,918) e uniloco (ts = 0,797) foram altas. De um total de 399 sementes
avaliadas, foi possível determinar o doador de pólen para 218 sementes (55%) com
confiança de 90%, 174 sementes (44%) com confiança de 95% e 65 sementes (16%)
com confiança de 99%. Em 15 famílias avaliadas foi possível verificar a ocorrência de
paternidade múltipla, sendo que o número de doador de pólen por fruto variou de um a
três. Os resultados apresentados revelam que a espécie E. dysenterica apresenta sistema
de cruzamento misto e que existe paternidade múltipla nessa espécie. A estrutura
genética espacial intrapopulacional foi positiva (R2 = 0,01646, p < 0,001), o que era
esperado, uma vez que espécies vegetais geralmente possuem restrição espacial para se
dispersarem. A estrutura genética espacial foi significativa (Sp = 0,0143) e a vizinhança
genética (Nb) foi igual a 69,93 km. Em média, foram analisados aproximadamente 30
indivíduos por subpopulação para todos os locos. O número médio de alelos por loco foi
igual a 9, a diversidade genética foi alta (0,725) e a frequência observada de
heterozigotos (Ho) foi 0,610. Foram encontrados 18 alelos privados em 10
subpopulações. Os resultados obtidos para o índice de fixação (f) variaram nas
subpopulações entre -0,058 e 0,338, com valor global igual a 0,162, indicando excesso
de homozigotos em relação às frequências esperadas sob EHW. A diferenciação
genética entre as subpopulações pode ser considerada relativamente alta (θP = 0,161). O
teste de Mantel indica que a divergência genética das 23 subpopulações avaliadas está
estruturada no espaço geográfico (r = 0,427; p < 0,001), sugerindo que o modelo de
isolamento-por-distância ou stepping-stone são adequados para explicar o padrão
espacial de divergência genética entre as subpopulações de E. dysenterica avaliadas.
Palavras-chave: cagaiteira, diversidade, estrutura genética, microssatélites, sistema
misto.
________________
1
Orientadora: Profa. Dra. Mariana Pires de Campos Telles. EA-UFG
1
Coorientadora: Profa. Dra. Rosane Garcia Collevatti. EA-UFG
13
GENERAL ABSTRACT
BARBOSA, A. C. O. F. Genetic structure and mating system in Eugenia dysenterica
DC. (Myrtaceae). 2014. 126 s. Thesis (PhD in Genetic and Plant Breeding)–Escola de
Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2014.1
The genetic structure of a species corresponds to the amount of genetic
variability and its distribution within and among local populations and individuals. The
patterns of variability among individuals in a local population are highly dependent of
mating system. The goal of this study was to evaluate the mating system, the diversity
and genetic structure in populations of E. dysenterica in local and regional scale. The
assessment of the mating system and the analysis of genetic structure at the local scale
were performed in a population of Mimoso – GO and for the analysis of genetic
structure at the regional scale were analyzed 23 natural populations of E. dysenterica
derived from six Brazilian states (Goiás, Minas Gerais, Bahia, Mato Grosso, Tocantins
and Piauí). For all studies seven polymorphic microsatellite loci were used. Considering
the 20 families analyzed, the multilocus outcrossing rates (tm = 0.918) and single locus
(ts = 0.797) were high and significant. From a total of 399 seeds evaluated, it was
possible to determine the pollen donor to 218 seeds (55%) with confidence level of
90%, 174 seeds (44%) with confidence level of 95% and 65 seeds (16%) with
confidence level of 99%. In 15 families evaluated were possible to verify the occurrence
of multiple paternity, with the number of pollen donor per fruit ranged from one to
three. The results presented show that the species E. dysenterica presents mixed mating
system and that there is multiple paternity in this species. The intrapopulational spatial
genetic structure was positive (R2 = 0.01646, p < 0.001), which was expected since
species generally have spatial restriction to disperse. The spatial genetic structure was
significant (Sp = 0.0143) and genetic neighborhood (Nb) was equal to 69.93 km. On
average, about 30 individuals were analyzed by subpopulation for all loci. The average
number of alleles per locus was equal to 9, the genetic diversity was high (0.725) and
the observed frequency of heterozygotes (Ho) was 0.610. Were found 18 private alleles
in 10 subpopulations. The results for the fixation index ((f) in the subpopulations ranged
between -0.058 and 0.338, with an overall value of 0.162, indicating excess of
homozygotes in relation to the expected under HWE. The genetic differentiation
between subpopulations can be considered relatively high (FST = 0.161). The Mantel test
indicates that the genetic divergence of 24 subpopulations evaluated is structured in
geographic space (r = 0.427, p < 0.001), suggesting that the model of isolation by
distance or stepping-stone are adequate to explain the spatial pattern of genetic
divergence among subpopulations of E. dysenterica evaluated.
keywords: cagaiteira, diversity, genetic structure, microsatellites, mixed system.
________________
1
Adviser: Profa. Dra. Mariana Pires de Campos Telles. EA-UFG
1
Co-adiviser: Profa. Dra. Rosane Garcia Collevatti. EA-UFG
14
1
INTRODUÇÃO GERAL
O Cerrado ocupa aproximadamente 23,1% do território brasileiro (2 milhões
de km2) e é uma das regiões de maior biodiversidade do planeta (Faleiro & Farias Neto,
2008), sendo considerado um dos hotspots para a conservação da biodiversidade
mundial (Myers et al., 2000). O Cerrado possui a mais rica flora dentre as savanas do
mundo, com 12.669 espécies, sendo 4.215 endêmicas do Cerrado brasileiro (33,3%)
(Forzza et al., 2012). No entanto, a exploração de certas espécies nativas do Cerrado
brasileiro, em especial as fruteiras, tem sido feita de forma extrativista e predatória
(Avidos & Ferreira, 2000). O endemismo torna o extrativismo um risco para a
manutenção da variabilidade genética dessas espécies e, consequentemente, para a
conservação das suas áreas de ocorrência. Além disso, o cultivo em larga escala da
maioria destas fruteiras ainda não é recomendado devido ao pouco conhecimento sobre
a genética, produtividade, técnicas de cultivo, crescimento e desenvolvimento destas
espécies. Assim, estudos acerca das fruteiras do Cerrado são necessários.
A espécie Eugenia dysenterica (cagaiteira) é uma das fruteiras do Cerrado
que possui diversos usos (Ribeiro et al., 2008), fato atualmente mais difundido entre os
habitantes do Cerrado. Dentre as plantas nativas do Cerrado, poucas informações estão
disponíveis na literatura em relação ao sistema reprodutivo, incluindo para a espécie E.
dysenterica. O estudo de Proença & Gibbs (1994), realizado no Cerrado brasileiro, é um
dos poucos que abordam a biologia reprodutiva dessa espécie e de mais sete da mesma
família (Myrtaceae). Segundo Proença & Gibbs (1994) a cagaiteira é polinizada
preferencialmente por abelhas (melitofilia), completamente auto-compatível, apresenta
tanto autofecundação quanto fecundação cruzada, sendo considerada espécie de sistema
misto. Além disso, os frutos dessa espécie são dispersos por animais (zoocoria) (Sano et
al., 1995). Um estudo sobre o sistema reprodutivo e fluxo gênico (via pólen) na coleção
de germoplasma (in vivo) de E. dysenterica presente na Universidade Federal de Goiás
(UFG) foi realizado por Rodrigues (2012), onde foi verificado que os indivíduos dessa
coleção apresentam sistema de cruzamento misto, corroborando com a literatura, e o
15
alcance de dispersão de pólen máximo encontrado foi de 224 m, abrangendo quase toda
a área experimental da coleção.
Estudos acerca da diversidade e estrutura genética de populações naturais de
plantas do Cerrado são considerados recentes. No entanto, para algumas espécies do
Cerrado existem na literatura estudos genético-populacionais. Dentre eles pode-se citar:
Caryocar brasiliense (Collevatti et al., 2001b), Annona crassiflora (Telles et al.,
2003a), Dipteryx alata (Soares et al., 2008), Solanum lycocarpum (Moura et al., 2009),
Mauritia flexuosa (Resende et al., 2009), Tabebuia ochracea (Moreira et al., 2009),
Hymenaea stigonocarpa (Defavari et al., 2009; Moreno, 2009), Hancornia speciosa
(Moura et al., 2011), Tibouchina papyrus (Telles et al., 2010; Lima, 2011) e Eugenia
dysenterica (Telles et al., 2001; Telles et al., 2003b; Zucchi et al., 2003; Trindade &
Chaves, 2005). Porém, os estudos acerca da diversidade e estrutura genética da
cagaiteira descritos na literatura se restringem a populações do estado de Goiás.
O presente trabalho teve como objetivo geral avaliar o sistema de
cruzamento, a diversidade e a estrutura genética em populações de E. dysenterica. Os
objetivos específicos foram:
i) Avaliar o sistema de cruzamento em uma subpopulação de E. dysenterica;
ii) Investigar se existe paternidade múltipla na espécie E. dysenterica;
iii) Analisar o padrão espacial da variabilidade genética intrapopulacional
(escala local);
iv) Estimar a variabilidade genética em subpopulações de E. dysenterica,
com base em marcadores microssatélites;
v) Avaliar a distribuição da variabilidade genética entre e dentro de
subpopulações de E. dysenterica;
vi) Estimar a divergência genética entre subpopulações de E. dysenterica;
vii) Analisar o padrão espacial da variabilidade genética entre subpopulações
de E. dysenterica (escala regional).
Com este trabalho pretende-se contribuir para um melhor conhecimento
acerca do sistema de cruzamento e da variabilidade genética nas subpopulações de E.
dysenterica. Em relação aos trabalhos genético-populacionais já realizados com E.
dysenterica, o presente estudo traz uma ampliação da amostragem em relação ao
número de subpopulações, bem como sua abrangência geográfica em relação à
distribuição natural da espécie.
16
2
REFERENCIAL TEÓRICO
2.1
Eugenia dysenterica DC.
A espécie Eugenia dysenterica DC. (Figura 1), família Myrtaceae, é
popularmente conhecida como “cagaita” ou “cagaiteira” em razão das propriedades
laxativas de seu fruto (Lima et al., 2010). É uma árvore frutífera que mede até cerca de
10 m de altura, possui tronco e ramos tortuosos com casca grossa e fissurada (Figura
2A). As flores da cagaiteira são brancas e as folhas, quando jovens, apresentam cor
avermelhada (Figura 2B). Os frutos são globosos, bagáceos, cor geralmente amareloclara (Figura 2C e 2D), sabor agradável e levemente ácido, epicarpo membranoso (peso
14-20 g, 3-4 cm de comprimento e 3-5 cm de diâmetro) (Naves et al., 1995; Silva et al.,
2001). Foi observada a ocorrência de cagaita vermelha em Senador Canedo – GO,
apesar dessa cor não ser a cor típica do fruto (Figura 3).
Figura 1. Eugenia dysenterica (cagaita). Foto: Ana Clara de O. F. Barbosa, Santa
Terezinha – GO, em novembro de 2011
17
Figura 2. Eugenia dysenterica. (A) tronco com casca grossa e fissurada; (B) folhas
jovens e flores; (C) fruto aberto mostrando a semente; (D) folhas e frutos
maduros. Fotos A e B: Ana Clara de O. F. Barbosa, Mimoso – GO, novembro de
2011; Foto C: adaptado de http://pt.wikipedia.org/wiki/Cagaiteira; Foto D:
http://www.flickr.com/photos/gilbertopalma/4996643474/in/photostream/
Figura 3. Ocorrência de cagaita vermelha em Senador Canedo – GO. Foto: Ana Clara
de O. F. Barbosa, novembro de 2011
18
A semente da cagaita (Figura 2C) apresenta alto teor de umidade (47-53%) e
comportamento recalcitrante, perdendo completamente a viabilidade quando o teor de umidade
é reduzido a valores abaixo de 18-22% (Andrade et al., 2003). O número de sementes
observadas por fruto é variável. Silva e colaboradores (2001) avaliaram 1.344 frutos, sendo que
cerca de 97% deles apresentaram de uma a três sementes/fruto, dois frutos possuíam cinco
sementes, e, ainda, havia um fruto com seis sementes. E. dysenterica é uma espécie
monoembriônica (Salomão & Allem, 2001). De acordo com Atchinson (1947), o
número cromossômico básico para a família Myrtaceae é n = 11. Costa (2004) observou
um caso de poliploidia (três ou mais conjuntos cromossômicos por núcleo) em E.
dysenterica, com 2n = 33.
A espécie E. dysenterica é uma das fruteiras do Cerrado que possui diversos
usos (Ribeiro et al., 2008) e merece destaque dentre as espécies que apresentam
potencial de utilização em sistemas tradicionais de produção agrícola devido ao seu
potencial econômico (Ribeiro & Rodrigues, 2006). A cagaiteira é considerada uma
espécie de interesse econômico, principalmente devido ao aproveitamento de seus frutos
na culinária (in natura, doces em compota, geléias, pudins, sorvetes, licores e sucos),
fato bastante difundido entre os habitantes do Cerrado (Figura 4). Porém, quando
consumidos quentes ou em excesso, os seus frutos podem causar embriaguez e diarréia.
Esta propriedade se manifesta, principalmente, no fruto maduro e em início de
fermentação, mas há vários relatos de que, quando “de vez”, o fruto pode ser consumido
em quantidade sem provocar desconforto (Martinotto et al., 2008).
Figura 4. Alguns exemplos do uso do fruto da cagaita na culinária (Fontes:
http://revistacrescer.globo.com/Revista/Crescer/0EMI17902-0516,00.html;
http://improvisosnacozinha.blogspot.com/2010/07/sorvetes-frutos-docerrado.html)
19
A casca serve à indústria de curtume e as folhas têm propriedades
antidiarréicas e também são usadas no tratamento de icterícia e diabetes (Chaves &
Telles, 2006; Jorge et al., 2010). O óleo essencial hidrolisado das folhas da cagaiteira
possui alta atividade antifúngica no controle de Cryptococcus neoformans (Costa et al.,
2000). A cagaiteira é considerada uma planta melífera e ornamental, possuindo elevado
potencial paisagístico e apresentando florescimento exuberante (Figura 5), além de fazer
parte da flora medicinal do Cerrado (Silva & Proença, 2007; Oliveira, 2011).
Figura 5. Árvore de E. dysenterica (cagaiteira) com florescimento exuberante,
mostrando
seu
potencial
para
o
paisagismo
(Fonte:
http://picasaweb.google.com/lh/photo/J0P0-nLjmvO8JAkVBxxNxg)
Os frutos da cagaita apresentam alto teor de β-caroteno e o extrato etanólico
da semente apresenta poder antioxidante (Roesler et al., 2007; Rocha et al., 2013). Com
relação aos ácidos graxos poliinsaturados, a semente da cagaita apresenta maior teor do
ácido linoléico que oliva, dendê e côco, e maior teor de ácido linolênico que o milho,
girassol, amendoim, soja, oliva e dendê. A quantidade de vitamina C na cagaita (18,28
mg/100 g) é maior que o de muitas frutas cultivadas convencionalmente, como a maçã
argentina e a banana madura (Franco, 1992).
20
Eugenia dysenterica é uma espécie nativa da região de Cerrados brasileiros,
ocorrendo preferencialmente em formações de cerradão, cerrado sentido restrito (stricto
sensu) e campos sujos (Faleiro & Farias Neto, 2008) (Figura 6), com solo profundo e
bem drenado. No entanto, por ocorrer em áreas de cerrado e cerradão, essa espécie está
adaptada a solos pobres e, portanto, acredita-se que seja pouco exigente em fertilidade
(Naves, 1999). Em um levantamento realizado por Naves (1999) de algumas espécies
frutíferas nativas do Cerrado (cerradão e cerrado sentido restrito), em áreas pouco
antropizadas do estado de Goiás, verificou-se uma maior densidade de cagaita no
cerradão que no cerrado sentido restrito (densidade média de plantas de 60,5 indivíduos
por hectare no cerradão e 15,5 indivíduos por hectare no cerrado sentido restrito). Nesse
estudo, Naves ainda constatou que a cagaiteira apresenta distribuição espacial em
agregados.
Figura 6. Esquema das fitofisionomias do bioma Cerrado (Ribeiro & Walter, 1998).
A distribuição da espécie E. dysenterica é bastante ampla, sendo mais
comum nos estados de Goiás (GO), Minas Gerais (MG) e Bahia (BA), mas pode ser
encontrada também em Tocantins (TO), Mato Grosso (MT), Mato Grosso do Sul (MS),
São Paulo (SP), Pará (PA), Maranhão (MA), Piauí (PI) e Distrito Federal (DF) (Chaves
& Telles, 2006; Martinotto et al., 2008). A Figura 7 mostra a distribuição natural de E.
dysenterica no Cerrado brasileiro.
21
Figura 7. Distribuição natural da cagateira em 110 localidades entre 376 levantamentos
realizados no Bioma Cerrado (adaptado de Ratter e colaboradores, 2000)
Segundo Sano e colaboradores (1995), todas as atividades fenológicas
(mudança foliar, floração e frutificação) da cagaiteira ocorrem entre agosto e outubro,
no início do período das chuvas. A folhação ocorre durante todo o ano, mas com maior
intensidade no período de renovação das folhas. A maior frequência de floração, com
flores brancas e em grande número ocorre no mês de agosto. A frutificação é menor em
plantas mais jovens, enquanto as plantas mais velhas apresentam maior produção de
cagaita. O desenvolvimento e a maturação dos frutos ocorrem entre 30 a 40 dias da
antese das flores, coincidindo com o período chuvoso (Souza et al., 2008), com duração
de seis a oito semanas (Sano et al., 1995). A maturação dos frutos é relativamente rápida
e ocorre no início do período chuvoso, sendo que esse fenômeno pode ser uma
estratégia de estabelecimento da espécie devido à curta viabilidade (menor que 50 dias)
das sementes em condições naturais (Souza et al., 2008). A dispersão no início do
período chuvoso parece ser imprescindível para que após a germinação haja um período
favorável de estabelecimento e crescimento, podendo a plântula sobreviver no período
22
seco subsequente (Sano et al., 1995). Essa espécie apresenta estratégia de florescimento
tipo big bang, ocorrendo sincronização do florescimento abundante em um curto
período de tempo (Proença & Gibbs, 1994; Souza et al., 2008).
A cagaiteira possui flores hermafroditas e sistema misto de cruzamento,
apresentando tanto autofecundação quanto fecundação cruzada (Telles, 2000;
Rodrigues, 2012). Segundo Proença & Gibbs (1994), essa espécie se mostrou
completamente auto-compatível, estabelecendo números iguais de frutos após
polinização cruzada e autopolinização. É polinizada por abelhas (melitofilia),
especialmente da família Apidae, e oferece pólen como recompensa (Proença & Gibbs,
1994). As principais espécies observadas como visitantes e possíveis polinizadores
dessa espécie (uma vez que foi observado o contato com o estigma) foram: Bombus
atratus, Bombus morio, Ceratina sp., Melipona sp., Trigona sp. e Apis mellifera, sendo
a maior ocorrência de eventos de polinização realizada pelas mamangavas (Bombus
sp.), pela manhã (Proença, 1992; Proença & Gibbs, 1994; Almeida et al., 2003; Gressler
et al., 2006) (Figura 8). O padrão da distribuição em agregado dessa espécie (Naves,
1999) estimula a atração visual e olfativa dos agentes polinizadores. A dispersão dos
frutos da cagaita é realizada por animais (zoocoria) (Sano et al., 1995), sendo os dois
principais tipos de dispersão o primatocórico (macacos saguis) e antropocórico
(humanos), como ocorre a outras espécies da família Myrtaceae (Ferreira & Cunha,
1980). Há relatos também de que o fruto da cagaita é disperso por morcegos (Artibeus
lituratus e Micronycteris hirsuta) (Bredt et al., 2012).
Figura 8. Apis mellifera (A) e Bombus sp. (B) visitando uma flor de E. dysenterica.
(Fontes: http://picasaweb.google.com/lh/photo/2PtrTo89rL6RbSkgYWJjWA;
http://www.flickr.com/photos/72748940@N00/2296461547)
23
Há na literatura alguns estudos visando a domesticação de espécies,
incluindo E. dysenterica (Tombolato et al., 2004; Silva et al., 2010) e também visando a
o melhoramento genético dessa espécie (Aguiar et al., 2009; Camilo et al., 2013). Com
relação à conservação do germoplasma da espécie, o fato da semente não tolerar
armazenamentos por longos períodos devido à natureza recalcitrante (Andrade et al.,
2003) torna a conservação ex situ, in vivo, uma das poucas alternativas. Na
Universidade Federal de Goiás há uma coleção de germoplasma in vivo de E.
dysenterica que foi implantada em 2008 e complementada em 2013, a partir de coletas
no estado de Goiás. Há ainda alguns trabalhos sobre o cultivo in vitro para essa espécie
(Martinotto, 2004; Martinotto et al., 2007; Cabral et al., 2012). Esses estudos e a
implantação de coleções de germoplasma são importantes para o uso e a conservação da
variabilidade genética da espécie.
24
2.2
SISTEMA DE CRUZAMENTO EM PLANTAS E FLUXO
GÊNICO
O sistema de cruzamento representa a maneira como indivíduos, populações
ou espécies recombinam sua variabilidade genética a cada geração para formar sua
descendência e o seu conhecimento é de suma importância para a manipulação de
populações em programas de conservação e melhoramento genético (Sebbenn, 2005).
Nas Angiospermas, a reprodução sexuada pode ser classificada em três tipos, de acordo
com o sistema de cruzamento: (1) sistema autógamo (plantas que se autofertilizam), (2)
sistema alógamo (plantas que apresentam fertilização cruzada) e (3) sistema misto
(plantas que se autofecundam e que apresentam fertilização cruzada) (Fryxell, 1957;
Karasawa, 2009).
Uma revisão sobre as proporções de tipos de sistemas sugere que o sistema
misto seja comum entre angiospermas e gimnospermas (compreendendo em média,
80% ou mais das espécies) e que existem evidências de que o sistema misto de
cruzamento seja favorecido, uma vez que a forte depressão por endogamia se opõe à
evolução da autofecundação (Goodwillie et al., 2005). Estas espécies apresentam taxas
de cruzamento que variam entre 5 e 95%, dependendo das condições ambientais e da
frequência de polinizadores, sendo que, o sistema misto geralmente ocorre em espécies
polinizadas por insetos e que não apresentam sistema de auto-incompatibilidade
(Karasawa, 2009).
O modelo de equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) é um modelo
referencial, no qual não existem processos evolutivos atuando, a não ser aqueles
impostos pelo próprio processo de reprodução. Esse modelo dá uma base para a
comparação com modelos mais realistas, nos quais as frequências alélicas podem ser
modificadas por processos evolutivos (Hartl & Clark, 2010). Desvios do EHW podem
ser causados por muitos fatores, como erros de genotipagem ou fatores genéticos (Ex:
deriva genética) (Sha & Zhang, 2011). Dentre os testes de EHW, o teste de permutação
é particularmente útil quando existem alelos múltiplos e também o teste exato para
alelos múltiplos (Guo & Thompson, 1992; Hartl & Clark, 2010). Esses testes permitem
a detecção de desvios de acasalamento ao acaso para testar a ocorrência de seleção,
modelar os efeitos da endogamia e seleção e estimar frequências alélicas em locos que
mostram dominância (Frankham et al., 2008).
25
Em cruzamentos aleatórios, os alelos de qualquer gene são combinados ao
acaso em genótipos de acordo com as frequências dadas pelas proporções de HardyWeinberg. Alelos de genes que não estão em associação aleatória estão em desequilíbrio
de ligação (DL). Alguns autores preferem chamar o desequilíbrio de ligação de
desequilíbrio de fase gamética, uma vez que este não requer ligação física, ou seja, não
requer que os genes sejam fisicamente ligados, podendo então ocorrer para genes em
cromossomos distintos. O teste de equilíbrio e desequilíbrio de ligação é uma extensão
do teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg para dois ou mais locos (Hartl & Clark,
2010).
Vários fatores podem criar um DL, incluindo mutação, acasalamento
preferencial, tamanho populacional finito, seleção natural e fluxo gênico, ou seja, os
mesmos fatores que assumem-se não ocorrer no modelo de EHW (Templeton, 2011).
Além destes fatores, o DL também pode ser causado devido à recombinação reduzida e
à miscigenação de subpopulações que diferem na frequência de alelos. A frequência de
recombinação (r) entre os genes é importante em genética de populações, pois governa a
taxa de aproximação ao equilíbrio de ligação. A frequência de recombinação depende
dos genes estarem ou não no mesmo cromossomo e, quando no mesmo cromossomo,
depende da distância entre esses genes. Quando os genes estão em cromossomos
diferentes r = 0,5 (frequência de recombinação máxima) e quando os genes estão
ligados r pode variar de zero a 0,5, sendo que quanto mais distantes estes genes
estiverem no cromossomo maior será a frequência de recombinação (Hartl & Clark,
2010).
Uma das aplicações do DL é o mapeamento de associação, que tem sido
explorado para se encontrar QTL (Quantitative Trait Loci). O sistema de cruzamento
(autofecundação versus fecundação cruzada) de uma espécie e fenômenos como a
estrutura populacional e de recombinação podem influenciar fortemente os padrões de
DL (Flint-Garcia et al., 2003). As plantas normalmente apresentam alguma frequência
de autofecundação, que é a forma mais extrema de gerar endogamia. A endogamia
reduz a frequência de heterozigotos duplos, os quais são essenciais para a ocorrência de
recombinação. Assim, pode-se concluir que a endogamia aumenta o DL (Futuyma,
1992; Hartl & Clark, 2010).
O desvio mais comum do acasalamento ao acaso ocorre quando este é mais
provável entre indivíduos aparentados que entre aqueles que não o são, o que ocorre
principalmente devido à capacidade de dispersão limitada na maioria das espécies. As
26
populações verdadeiramente panmíticas são raras, sendo que a grande maioria das
populações são endogâmicas, pois seus indivíduos tendem a cruzar com seus parentes.
Uma população é considerada endogâmica quando a probabilidade da progênie herdar
duas cópias gênicas idênticas por descendência for maior que o esperado por
acasalamento inteiramente ao acaso. Essa probabilidade é conhecida como coeficiente
de endogamia (f) da população, sendo maior à medida que aumenta o grau de
parentesco entre os organismos reprodutores. O coeficiente de endogamia de uma
população pode variar de zero (população panmítca) a um (população completamente
endogâmica) (Futuyma, 1992). Segundo Hartl (2008), pode-se definir o coeficiente de
endogamia como a deficiência de heterozigotos em uma população endogâmica em
relação à população em EHW.
O modelo de EHW assume população completamente isolada, ou seja, todos
os indivíduos que contribuem para a geração seguinte vêm da mesma população, sem
contribuição alguma de indivíduos de outras populações. No entanto, a maioria das
espécies consiste de diversas populações locais ou subpopulações. A troca genética
entre essas populações locais ou entre indivíduos numa população corresponde ao fluxo
gênico, o qual diminui as diferenças em termos de variabilidade genética entre as
populações locais (Templeton, 2011). O fluxo gênico em populações de plantas é
limitado e ocorre pelo movimento do pólen e pela dispersão das sementes (Hardy et al.,
2006), podendo tornar uma espécie subdividida em populações locais geneticamente
distintas (Templeton, 2011).
Há quatro modelos que podem descrever o fluxo gênico em uma
metapopulação (conjunto de populações conectadas pela migração ou fluxo gênico): (1)
continente-ilha, (2) ilhas, (3) alpondras (stepping-stone) e (4) isolamento-por-distância
(Futuyma, 1992). Continente-ilha é o modelo no qual ocorre um movimento
unidirecional de uma população grande (continental) para uma menor e isolada. No
modelo de ilhas a migração ocorre ao acaso entre um grupo de pequenas populações.
Em stepping-stone cada população recebe somente migrantes de populações vizinhas. Já
no isolamento-por-distância a migração ocorre localmente entre vizinhos, em uma
população de distribuição contínua (Figura 9).
27
Figura 9. Modelos propostos para fluxo gênico. As setas largas indicam fluxo gênico
mais frequente
Wright (1951), admitindo a estrutura genética populacional sob o modelo de
ilhas e assumindo equilíbrio entre migração e deriva genética, sugere uma maneira de
estimar o fluxo gênico (Nm) entre populações de maneira indireta, por meio dos valores
de FST ou análogo. Slatkin (1981) e Govindaraju (1989) distinguiram três categorias de
fluxo gênico: baixo (Nm < 0,25 migrantes/geração), intermediário (0,25 ≤ Nm ≤ 0,99
migrantes/geração) e alto (Nm ≥ 1 migrantes/geração). Quando o fluxo gênico é restrito,
as subpopulações tenderão a ter um menor tamanho efetivo e mais endogamia e, como
resultado, uma maior probabilidade de se diferenciarem mais. Por outro lado, uma alta
taxa de fluxo gênico homogeneiza as frequências alélicas entre subpopulações, mesmo
em presença de uma pressão de seleção intensa (Slatkin, 1985; Ohsawa et al., 1993).
No entanto, o modelo de ilhas (Figura 9B) não é muito realista para várias
espécies devido à premissa de que todos os indivíduos (gametas) que estão se
dispersando possuem a mesma probabilidade de alcançar qualquer subpopulação. Na
maioria das espécies reais alguns pares de subpopulações possuem maior fluxo gênico
que outros, sendo o isolamento-por-distância (Wright, 1943) (Figura 9D) um tipo
comum de desvio do modelo de ilhas. Nesse modelo, subpopulações que estão mais
próximas trocam gametas com maior frequência do que as que estão geograficamente
distantes (Templeton, 2011). Modelos de isolamento-por-distância foram desenvolvidos
para espécies que apresentam distribuição contínua sobre um habitat, não estando
subdividida em subpopulações discretas (Malécot, 1975; Hartl & Clark, 2010). Padrões
espaciais de isolamento-por-distância são mais bem estudados usando medidas de
28
similaridade genética par-a-par ou correlação entre subpopulações, embora Wright
(1943) originalmente tenha usado medidas hierárquicas (Epperson, 2003). Segundo
Templeton (2011), a medida de distância mais conveniente para modelos de isolamentopor-distância é o FST par-a-par (Wright, 1951), que é a medida de diferenciação
populacional que utiliza frequências alélicas.
O fluxo gênico intra e interpopulacional depende da estrutura reprodutiva,
ocorrendo em populações que se reproduzem assexuadamente devido à migração de
propágulos e ocorrendo de diferentes modos e graus em populações com reprodução
sexuada. Portanto, é essencial obterem-se dados sobre a estrutura e comportamento
reprodutivo das populações, pois os padrões de distribuição da variabilidade genética
estão correlacionados com os sistemas reprodutivos (Martins, 1987). A avaliação do
sistema reprodutivo em populações de plantas tem sido realizada mediante estudos de
biologia floral e ecologia da polinização e, nos últimos anos, mediante marcadores
bioquímicos e moleculares, incluindo os microssatélites (Boaventura & Matthes, 1987;
Lopes et al., 2002; Martins et al., 2006; Rodrigues, 2012). Os dados desses marcadores
juntamente com o uso de programas genético-estatísticos possibilitam a estimação da
taxa de fecundação cruzada nas subpopulações, de modo que se possa inferir sobre o
sistema reprodutivo de uma espécie (Sebbenn, 2005; Rodrigues, 2012).
Em geral, existem duas maneiras de estimar as taxas de fecundação cruzada
e autofecundação; uma direta, na qual as progênies de cruzamentos são identificadas, e
outra indireta, na qual se assume que as proporções genotípicas observadas estão nas
proporções de equilíbrio com endogamia (Sebbenn, 2005). Ritland (1990) desenvolveu
um programa para estimar a taxa de fecundação cruzada a partir de dados de marcadores
genéticos, baseado no modelo de cruzamento misto de Ritland & Jain (1981). O modelo
de cruzamento misto assume que as progênies resultam de uma mistura de
autofecundação e fecundação cruzada. Os pressupostos desse modelo são (Ritland &
Jain, 1981): i) o conjunto de pólen é homogêneo para o cruzamento de todos os
genótipos maternos; ii) todas as plantas têm igual capacidade de gerarem descendentes;
iii) os alelos de diferentes locos segregam independentemente (equilíbrio de ligação);
iv) os locos avaliados não sofrem seleção ou mutação entre o período de fertilização e a
análise dos indivíduos. Ritland e Jain (1981), desenvolveram um algoritmo que permite
estimar os valores da taxa de cruzamento e da frequência de pólen simultaneamente,
usando informações simultâneas de vários locos (genótipos compostos).
29
2.3
DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA
Segundo Frankham e colaboradores (2008), variabilidade genética é a
variedade de alelos nos genótipos presente em um grupo sob estudo (populações,
espécies, grupo de espécies) e geralmente é descrita em termos de frequências alélicas,
número de alelos e heterozigosidade. Essa variabilidade é a matéria-prima sobre a qual a
seleção natural atua para permitir a adaptação e evolução dos organismos e sua
adequação às mudanças ambientais. Assim, a perda da variabilidade genética diminui o
potencial evolutivo e também está associada à redução do sucesso reprodutivo. A
variabilidade genética pode ser medida em diferentes níveis, incluindo variação
quantitativa, variação nas proteínas e variação nas sequências de DNA. O potencial
evolutivo é medido de forma mais direta estimando-se a variação genética quantitativa
para o sucesso reprodutivo. Essa estimativa é difícil de ser mensurada e as outras
medidas como a variação em aloenzimas e no DNA só refletem o potencial evolutivo se
forem correlacionadas com a variação genética quantitativa. No entanto, as correlações
entre as medidas moleculares e quantitativas da variabilidade genética geralmente são
baixas (Frankham et al., 2008).
A estrutura genética de populações de uma espécie refere-se à forma como a
variabilidade genética está distribuída entre e dentro dos níveis hierárquicos de
subdivisão de uma espécie (Brown, 1978; Sebbenn, 2005). Ou ainda, a estrutura
genética refere-se à distribuição heterogênea dos alelos e genótipos, no espaço e no
tempo, resultante da ação de processos evolutivos (mutação, migração, seleção e deriva
genética) que atuam dentro do contexto de cada espécie e população (Hamrick, 1982).
Conhecer a estrutura genética de uma população permite presumir, senão desvendar,
quais os fenômenos ecológicos e genéticos atuantes nela (Cruz et al., 2011). A
variabilidade fornece o material para a evolução. Os padrões da variabilidade genética
entre os indivíduos em uma população local são altamente dependentes do sistema de
cruzamento. Além disso, a distribuição dessa variabilidade dentro e entre as
subpopulações é influenciada pelo fluxo gênico e pela deriva genética. Assim, a
estrutura genética de uma população tem três componentes principais: (1) sistema de
acasalamento, (2) fluxo gênico e (3) deriva genética (Templeton, 2011).
30
Wright (1931) introduziu um estudo que se tornou referência na genética de
populações, no qual o impacto do tamanho populacional, da mutação e da migração
(fluxo gênico) sobre a abundância e distribuição da variação genética nas populações
foram quantitativamente descritos. A partir daí diversos outros trabalhos nesse contexto
foram publicados na literatura. Em geral, três metodologias podem ser usadas para
avaliar a estrutura genética de populações: estatísticas-F de Wright (Wright, 1951),
diversidade gênica (Nei, 1973) e coeficiente de coancestria (θ) (Cockerham, 1973;
Reynolds et al., 1983). As três metodologias possuem bases genéticas semelhantes e as
estimativas obtidas por elas são análogas.
Wright (1951) desenvolveu as estatísticas-F que descrevem a distribuição da
variação genética em subpopulações, medindo o déficit de heterozigotos em relação ao
esperado pelo Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). As estatísticas F permitem a
caracterização da distribuição da variabilidade genética entre as subpopulações (FST)
(Holsinger & Weir, 2009), da endogamia no nível subpopulacional (FIS) e da endogamia
total (FIT). A análise da estrutura genética geralmente é feita por meio do FST, o qual
avalia a divergência das frequências alélicas entre duas ou mais populações. A perda de
heterozigotos e o consequente excesso de homozigotos que ocorre em casos de
subdivisão é designado de Efeito Wahlund (Hartl & Clark, 2010). O FST, entretanto, tem
certas limitações, como resultados enviesados quando aplicado a locos multi-alélicos de
evolução rápida, não identificação de relação genealógica e resultados enviesados em
casos de populações ameaçadas, devendo, assim, ser utilizado apenas para locos neutros
(Pearse & Crandall, 2004).
A medida FST pode variar de zero (nenhuma divergência genética) a um
(fixação de alelos alternativos em diferentes subpopulações). Apesar do valor máximo
teórico ser um, o máximo observado geralmente é um valor muito menor que um (Hartl
& Clark, 2010). Segundo Hartl & Clark (2010), Wright sugere as seguintes orientações
para a interpretação dos valores de FST: valor de 0 a 0,05 indica pequena diferenciação
genética, 0,05 a 0,15 indica moderada diferenciação genética, 0,15 a 0,25 indica grande
diferenciação genética e valor acima de 0,25 indica uma diferenciação genética muito
grande. No entanto, Wright observa que mesmo valores de FST menores que 0,05 são
significativos para a diferenciação entre as subpopulações.
31
Devido aos avanços computacionais e tecnológicos, estatísticas análogas ao
FST têm sido desenvolvidas para diminuir suas limitações. Dentre elas destacam-se: GST
(Nei, 1973), que é a aplicação desta abordagem em locos multi-alélicos; ΦST (Excoffier
et al., 1992), desenvolvido originalmente para dados de marcadores moleculares de
haplótipos; RST (Slatkin, 1995), que corrige a elevada taxa de mutação de marcadores
microssatélites, seguindo o modelo mutacional de stepwise; e QST (Spitze, 1993), que
avalia dados de características quantitativas distinguindo a ação de seleção e deriva
sobre esses locos. Mesmo havendo diferenças de aplicação desses análogos ao FST,
todos podem ser usados como métodos de estimar a estrutura genética de populações.
Segundo Holsinger & Weir (2009), dentre essas quatro estatísticas relacionadas ao FST,
GST é a que mais se aproxima do FST e tem sido bastante usada para medir diferenciação
genética entre subpopulações. Entretanto, GST é uma medida de diferenciação genética
apropriada apenas quando a contribuição da deriva genética para as diferenças entre as
populações não é de interesse, uma vez que essa medida não considera a amostragem
genética, enquanto o FST considera. Assim, apesar de serem relacionados, FST e GST
medem coisas distintas (Holsinger & Weir, 2009).
Ainda no intuito de contornar certas limitações do FST, Nei (1973) estendeu
o conceito de FST aos alelos múltiplos e Hedrick (2005) sugeriu uma medida
padronizada de diferenciação genética (GST’), a qual corresponde a uma proporção da
máxima diferenciação possível para o nível observado de homozigosidade da
subpopulação. Essa medida padronizada permite a comparação entre locos com
diferentes níveis de variação genética, como isoenzimas e marcadores microssatélites, e
para a diferenciação genética de organismos com diferentes tamanhos efetivos de
população, ou ainda pode ser usada universalmente para comparar os níveis de
diferenciação genética de muitos organismos e locos diferentes. O GST’ de Hedrick é
análogo à medida de desequilíbrio de ligação, D’, de Lewontin (1964), que é D/Dmax,
em que D é a medida tradicional de desequilíbrio de ligação e Dmax é o valor máximo
possível, dada a frequência observada do alelo.
No entanto, ainda há muita controvérsia na literatura acerca das medidas de
diferenciação genética. Segundo Jost (2008), GST e seus “parentes” não podem ser
interpretados como medidas de diferenciação ou semelhança genética. Jost relata vários
casos na literatura de equívocos na abordagem padrão para a análise da diversidade.
Além disso, a crescente utilização de locos microssatélites com alta diversidade
32
tornaram as limitações de GST mais evidentes. Um dos exemplos citados pelo autor
envolve a diferenciação apresentada por locos microssatélites versus locos
isoenzimáticos. As taxas de mutação de microssatélites são conhecidas por serem
superiores às taxas de mutação dos locos isoenzimáticos. Microssatélites devem,
portanto, mostrar uma maior diferenciação entre as subpopulações que locos
isoenzimáticos em qualquer organismo. Porém, um padrão oposto é amplamente
relatado na literatura, GST (ou seus “parentes”) com base em microssatélites é
geralmente inferior ao GST com base em locos isoenzimáticos (Sanetra & Crozier,
2003). Esse é um dos problemas na definição de GST. Jost (2008) relata ainda que
muitos autores estão cientes destes problemas, mas não identificaram a sua origem, e
talvez tenham subestimado a sua importância. Nei (1973) reconheceu que em algumas
circunstâncias, o GST não é uma boa medida de diferenciação. Nagylaki (1998) mostrou
que a GST é uma medida adequada de diferenciação se, e somente se, a diversidade
genética for baixa. Já Charlesworth (1998) considera que mesmo quando a diversidade é
baixa o GST é inadequado como uma medida de diferenciação nas comparações entre
populações com diferentes heterozigosidades médias.
Jost (2008) identifica alguns equívocos do GST e sugere medidas (como HST
e D) para eliminar os paradoxos produzidos pelas medidas padrões. Estas novas
medidas podem ser diretamente relacionadas com as taxas de migração (m) e mutação
(µ) do modelo de ilha-finito. Segundo o autor, GST tem alguns usos legítimos, mas não é
uma medida de diferenciação. Quando uma descrição precisa da diversidade e
diferenciação é necessária, a diversidade deve ser equiparada ao número efetivo de
alelos de Kimura & Crow (1964), em vez de heterozigosidade, e GST deve ser
substituído pela real diferenciação D (Jost, 2008). Essas mudanças resolveriam os
paradoxos difundidos na literatura e alterariam muitas conclusões com base no GST. Já
as conclusões baseadas em GST padronizado de Hedrick (2005) são mais robustas, pois
abordam a verdadeira diferenciação D quando a diversidade é grande.
Apesar do que foi discutido até aqui e mostrado por meio do artigo de Jost
(2008), pode-se constatar que todas as medidas descritas na literatura são úteis, mas, no
entanto, nenhuma delas é perfeita. Isso pode ser bem ilustrado ao se analisar o que foi
descrito no artigo de Ryman & Leimar (2009), o qual discute acerca do D de Jost (2008)
e outras medidas como o GST. Esses autores mostraram que a medida D não pode ser
interpretada exclusivamente em termos de quantidades genéticas populacionais básicas,
33
tais como tamanho da população e fluxo gênico. Isto significa que D não é uma medida
útil quando o interesse está focado em processos demográficos, tais como deriva
genética e migração, mais do que as características particulares de mutação dos locos
amostrados. A avaliação dos efeitos dos processos demográficos da migração e deriva
deveriam idealmente ser efetuados por uma medida que não seja obscurecida por
processos genéticos, como a mutação. Da mesma forma, GST não é perfeito no sentido
de refletir os processos demográficos por causa de sua dependência de mutação e
heterozigosidade. Eles mostraram que o D de Jost sofre de problemas semelhantes e/ou
até mais acentuados do que o GST. Eles ainda consideram que o mesmo vale para a
medida padronizada de Hedrick (2005), considerando que ainda não haja atualmente
uma correção disponível que represente todos os efeitos da mutação no GST (Ryman &
Leimar, 2009).
A estrutura genética pode ser demográfica ou temporal. A estrutura genética
demográfica refere-se à distribuição espacial heterogênea dos indivíduos, sendo
característica de cada espécie e determinada principalmente pelo sistema de reprodução
e pelos padrões de dispersão de sementes, pólen e propágulos. Já a estrutura genética
temporal refere-se à subdivisão da diversidade genética entre gerações (Sebbenn, 2005).
A estrutura genética espacial (EGE) em populações naturais geralmente é resultado de
uma limitada dispersão de genes via pólen e sementes (Moura et al., 2009). A distância
efetiva de dispersão de pólen e o nível de fecundação cruzada podem mudar de um
evento de florescimento para outro, simplesmente em função da estrutura demográfica,
fenologia de florescimento, composição e abundância de polinizadores (Carneiro et al.,
2007). Segundo Hardy e colaboradores (2006), a dispersão limitada de sementes pode
indiretamente limitar a dispersão de pólen, por meio da criação de maior densidade de
árvores locais, favorecendo a agregação dessas árvores em estrutura de famílias.
A análise da estrutura genética espacial pode ser abordada por diferentes
metodologias, existindo algumas opções de medidas que a quantificam. O índice de
Moran (I) (Rousset, 2008) é uma das medidas mais utilizadas para esse fim, mas,
medidas multiloco de autocorrelação espacial baseada em distâncias genéticas foram
introduzidas mais recentemente. Essas duas metodologias geram distogramas inversos,
uma vez que um mostra correlação e o outro distância genética no nível de indivíduo ao
longo de diferentes classes de distância espacial. Nesse contexto, uma medida que tem
sido bastante usada na literatura usa o coeficiente de coancestria Fij, baseado em
34
Loiselle e colaboradores (1995). Esse coeficiente de coancestria define o nível de
parentesco entre indivíduos por classes de distâncias pelo cálculo da probabilidade de
dois alelos serem iguais por descendência entre pares de indivíduos, definindo se há ou
não EGE e em que nível ela ocorre.
35
3
SISTEMA
DE
PATERNIDADE
EM
CRUZAMENTO,
UMA
ENDOGAMIA
SUBPOPULAÇÃO
DE
E
Eugenia
dysenterica DC. (MYRTACEAE)
RESUMO
Eugenia dysenterica (Myrtaceae), popularmente conhecida como cagaiteira,
é uma árvore do Cerrado polinizada por abelhas, especialmente da família Apidae, e
dispersa por animais. O objetivo deste trabalho foi avaliar o sistema de cruzamento de
uma população de E. dysenterica e investigar se existe paternidade múltipla nessa
espécie, com base em marcadores microssatélites. Foram utilizados sete locos
microssatélites altamente polimórficos, com baixa probabilidade de identidade genética
e alto poder de exclusão de paternidade. Na análise combinada para todas as 20 famílias
analisadas, as taxas de fecundação cruzada multiloco (tm = 0,918) e uniloco (ts = 0,797)
foram altas, indicando que os indivíduos de E. dysenterica da população de Mimoso –
GO estão se reproduzindo predominantemente por fecundação cruzada. A correlação de
paternidade foi baixa (rp = 0,154), sugerindo que 15,4% dos indivíduos das progênies
são oriundos do mesmo grupo de doadores de pólen. Este valor de correlação de
paternidade indica que o número médio de árvores doadoras de pólen é igual a 6,494
(Nep = 1/rp), ou seja, aproximadamente sete árvores foram doadoras de pólen. Em média
14,1% das progênies são irmãos germanos e 77,7% foi formada por fecundação cruzada
entre meios-irmãos. Além disso, pode-se afirmar que somente 8,2% das progênies
foram formadas por autofecundação. De um total de 399 sementes avaliadas, foi
possível determinar o doador de pólen para 218 sementes (55%), considerando um nível
de confiança de 90%. Para uma confiança de 95% foi possível determinar o doador de
pólen para 174 sementes (44%) e para confiança de 99% foi possível determinar o
doador de pólen para 65 sementes (16%). Em 15 das 20 famílias avaliadas ocorreu
paternidade múltipla (considerando apenas as atribuições ao nível de confiança de
90%), sendo que o número de doadores de pólen por fruto variou de um a três. Os
resultados apresentados revelam que a espécie E. dysenterica apresenta sistema de
cruzamento misto e que a paternidade múltipla ocorre nos frutos dessa espécie.
Palavras-chave: Cagaita, microssatélites, paternidade múltipla, sistema misto.
36
ABSTRACT
Eugenia dysenterica (Myrtaceae), commonly known as cagaiteira, is a Savannah tree
pollinated by bees, especially the family Apidae, and dispersed by animals. The
objective of this study was to evaluate the mating system of a population of E.
dysenterica and investigate whether there is multiple paternity in this species, based on
microsatellite markers. Seven highly polymorphic microsatellite loci, with low
probability of genetic identity and high power of paternity exclusion were used. The
multilocus (tm = 0.918) and single locus (ts = 0.797) outcrossing rate were high,
indicating that individuals of E. dysenterica from Mimoso – GO are reproducing
predominantly by outcrossing. The paternity correlation was low (rp = 0.154),
suggesting that 15.4 % of progeny were from the same group of pollen donors. This
paternity correlation value indicates that the average number of tree pollen donor is
equal to 6.494 (Nep = 1/rp), or approximately seven trees were pollen donor. On average
14.1% of the progeny are full siblings and 77.7 % was formed by cross-fertilization
between half siblings. Moreover, it can be stated that only 8.2% of the progeny were
formed by self-fertilization . From a total of 399 seeds evaluated, it was possible to
determine the pollen donor to 218 seeds (55%), considering a confidence level of 90%.
For a confidence level of 95% it was possible to determine the pollen donor to 174
seeds (44%) and 99% confidence it was possible to determine the pollen donor for 65
seeds (16%). In 15 of the 20 families evaluated occurred multiple paternity (considering
only those assignments at a confidence level of 90%), and the number of parents per
fruit ranged from one to three. The results presented show that the species E.
dysenterica presents mixed mating system and that the multiple paternity occurs in the
fruits of this species.
Keywords: Cagaita, microsatellites, mixed system, multiple paternity.
3.1
INTRODUÇÃO
O sistema reprodutivo, a biologia da polinização e a história de vida de uma
espécie podem ter um papel fundamental na diferenciação genética de suas populações
(Gauer & Cavalli-Molina, 2000). O sistema reprodutivo pode ser considerado como o
fator que possui maior influência sobre a estrutura genética de espécies de plantas
(Loveless & Hamrick, 1984; Holsinger, 2000), uma vez que ele determina como as
informações genéticas serão transferidas de uma geração para a outra (Wright, 1921). A
análise de dados, principalmente de isoenzimas, mostrou que em espécies
predominantemente autógamas e de ciclo curto, há menos variação dentro de
populações e mais variação entre populações do que em espécies alógamas e de ciclo
longo (Loveless & Hamrick, 1984). Alguns estudos com marcadores moleculares e
37
isoenzimas revelaram que a maioria das plantas do Cerrado brasileiro são alógamas ou
apresentam sistema misto, mas a autofecundação também ocorre em plantas do Cerrado
(Collevatti et al., 2001a; Telles et al., 2001; Zucchi et al., 2003; Telles et al., 2010).
A família Myrtaceae é uma das famílias de maior importância no Brasil
(Mori et al., 1983). No entanto, poucas espécies desta família têm sido estudadas quanto
ao sistema reprodutivo (Vilela et al., 2012) e, além disso, pouco ainda foi estudado
sobre reprodução de plantas do Cerrado. Dentre os trabalhos publicados sobre o tema,
destaca-se o estudo de Proença & Gibbs (1994) realizado no Cerrado brasileiro sobre a
biologia reprodutiva de oito espécies da família Myrtaceae, incluindo Eugenia
dysenterica. A espécie E. dysenterica, popularmente conhecida como cagaiteira, é uma
árvore nativa do Cerrado polinizada por abelhas, especialmente da família Apidae,
sendo o gênero Bombus (abelha de médio porte) o principal grupo polinizador dessa
espécie, assim como de outras espécies de Myrtaceae ocorrentes na região central do
Brasil (Proença, 1992; Proença & Gibbs, 1994). Algumas evidências apontam para que
a cagaita seja auto-compatível e dispersa por animais, possuindo sistema de cruzamento
misto (Proença & Gibbs, 1994; Sano et al., 1995; Zucchi et al., 2003).
Ward e colaboradores (2005) apresentaram uma revisão sobre sistema de
cruzamento de espécies de plantas neotropicais autocompatíveis, na qual relatam
diversos estudos utilizando marcadores moleculares. Segundo esses autores, apesar da
baixa densidade populacional dessas plantas e da polinização geralmente ser mediada
por animais, cruzamento e dispersão de pólen de longa distância são comuns. Dos 36
estudos analisados, ocorreu mais de 90% de cruzamento (em 45 espécies hermafroditas
ou monóicas), sendo que as taxas de autofecundação variaram inversamente com a
densidade populacional e mostraram tendências filogenéticas e geográficas. Os estudos
com medidas diretas de fluxo de pólen (11 dos 36 estudos avaliados) sugeriram que a
dispersão de pólen varia de 200 m a mais de 19 km para espécies polinizadas por
pequenos insetos ou morcegos.
Os marcadores microssatélites são altamente polimórficos e, portanto,
bastante eficientes na estimativa de parâmetros do sistema reprodutivo e para a
atribuição de paternidade. Com relação à paternidade múltipla, há diversos trabalhos
que a relatam em animais nos diversos filos (Evanno et al., 2005a), mas, no entanto,
existem poucos trabalhos relacionados à paternidade múltipla em plantas. Alguns
38
estudos utilizando isoenzimas indicaram paternidade múltipla em frutos das espécies
Eucalyptus rameliana (Sampson, 1998) e Mimulus ringens (Mitchell et al., 2005). Já o
uso de marcadores microssatélites indicaram paternidade múltipla em frutos de
Caryocar brasiliense (Collevatti et al., 2009), uma espécie endêmica do Cerrado
brasileiro. Marcadores moleculares altamente polimórficos, como os microssatélites,
aumentam a probabilidade de detectar a paternidade múltipla e também a concorrência
potencial de pólen em populações naturais devido a sua alta resolução e porque esperase que sejam neutros em relação à seleção gametofítica ou preferência dos polinizadores
(Teixeira & Bernasconi, 2007). Já no uso de marcadores fenotípicos para atribuir
paternidade surge um problema potencial se eles não forem neutros, ou seja, se eles
estiverem associados com o sucesso de paternidade diferencial (Stanton et al., 1986).
Reusch (2000) foi pioneiro no uso de microssatélites para avaliar a
paternidade múltipla em populações de plantas de Zostera marina, uma angiosperma
marinha. Teixeira e Bernasconi (2007) encontraram alta prevalência de paternidade
múltipla em frutos de populações naturais de Silene latifolia, também com o uso de
marcadores microssatélites. Segundo esses autores, a variação na taxa de cruzamento e
competição de pólen para a fecundação dos óvulos em um único fruto pode ter
consequências evolutivas importantes.
A ocorrência de poliandria (número de doadores que contribuem para a
fertilização das sementes dentro de um fruto) em populações naturais tem implicações
diretas para a seleção de características florais que melhoram a exportação e importação
de pólen em plantas entomófilas e para a seleção na capacidade competitiva do pólen
(Janzen, 1977; Barrett, 2003; Wright & Meagher, 2004). Além disso, receber pólen de
vários doadores pode aumentar a aptidão da fêmea, melhorando a qualidade genética ou
a diversidade de sua progênie (Schlichting et al. 1987; Haig & Bergström 1995;
Bernasconi et al. 2,004 ). Entretanto, manter receptividade floral de modo a recolher o
pólen de vários doadores pode acarretar em custos, como tempo e energia para a
manutenção de estruturas florais receptivas e maior risco de contrair doenças
sexualmente transmissíveis causadas por fungos (Kaltz & Shykoff, 2001).
Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o sistema de
cruzamento de uma população de E. dysenterica e investigar se existe ocorrência de
39
eventos de paternidade múltipla nos frutos dessa espécie, com base em marcadores
microssatélites.
3.2
MATERIAL E MÉTODOS
LOCAL DE ESTUDO E COLETA
Esta análise foi realizada a partir de uma única subpopulação natural de E.
dysenterica oriunda do município de Mimoso – GO (latitude: -15,03154 e longitude: 50,11158). Foi delimitada uma área de 1,02 ha (10,200 m2), da qual foram coletados
521 indivíduos, sendo 20 matrizes (árvores mães), 399 juvenis e 102 indivíduos adultos.
A Tabela 1 mostra o número de frutos e sementes nas vinte famílias de E. dysenterica
avaliadas e o Apêndice E mostra o número de sementes por fruto.
Tabela 1. Amostragem de famílias de polinização aberta de E. dysenterica coletadas de
uma subpopulação de Mimoso – GO
Matriz (Família)
N0 de frutos
N0 de sementes
M1 (Fam1)
16
19
M2 (Fam2)
9
12
M3 (Fam3)
8
10
M4 (Fam4)
22
27
M5 (Fam5)
22
23
M6 (Fam6)
6
7
M7 (Fam7)
12
17
M8 (Fam8)
20
23
M9 (Fam9)
21
24
M10 (Fam10)
13
15
M11 (Fam11)
13
13
M12 (Fam12)
5
5
M13 (Fam13)
39
48
M14 (Fam14)
22
22
M15 (Fam15)
9
10
M16 (Fam16)
11
11
M17 (Fam17)
38
48
M18 (Fam18)
8
12
M19 (Fam19)
25
27
M20 (Fam20)
26
26
Total
345
399
Média
17
20
40
EXTRAÇÃO DO DNA E OBTENÇÃO DE DADOS MOLECULARES
Foi extraído o DNA a partir de tecido foliar e de semente segundo protocolo
descrito por Doyle & Doyle (1987), quantificado e diluído à concentração aproximada
de 2,5 ng de DNA genômico por µL, para posterior análise com marcadores
microssatélites. A amplificação dos fragmentos de DNA foi realizada por meio de
reação de PCR (Polimerase Chain Reaction). Foram usados sete locos microssatélites
polimórficos para obter os genótipos dos indivíduos coletados, sendo três pares de
iniciadores (primers) específicos para a espécie E. dysenterica (Telles et al., 2013), e
quatro pares desenvolvidos para Eucalyptus spp. e transferidos para E. dysenterica
(Zucchi et al., 2002). Os detalhes dos locos estão descritos nos Apêndices A e B.
As reações de PCR foram preparadas para um volume final de 15 µL, sendo
divididos nos seguintes componentes: 12,5 ng de DNA genômico, 0,018 mg de BSA
(10 mg/ml), 1X de Tampão da enzima 10X, 1,6 mM de MgCl2 (50 mM), 3,25 µM de
dNTPs, 1,98 µM de cada iniciador (forward e reverse), 1 unidade de Taq DNA
polimerase e o volume final foi completado com água Mili-Q esterilizada. As condições
de amplificação foram: (1º) desnaturação do DNA a 95°C por 5 minutos; (2º) 94°C por
1 minuto; (3º) temperatura específica de anelamento do iniciador por 1 minuto; (4º)
extensão da molécula pela enzima Taq DNA polimerase a 72°C por 1 minuto; (5º) 30
ciclos seguindo do 2º ao 4º passo; (6º) passo de extensão final a 72°C por 30 minutos.
Os iniciadores forward foram marcados com fluorocromos HEX (verde), NED
(amarelo) ou 6-FAM (azul) nas suas extremidades 5’ (detalhes nos Apêndices A e B).
Posteriormente, foi montada uma placa-mãe para cada conjunto de
marcadores, formando os painéis com diferentes locos ou multiplex (Apêndice B). A
placa-mãe foi preparada com 2 µL da reação de PCR de cada componente da multiplex,
formando uma mistura de reações de PCR. Em seguida, 0,25 µL do marcador de peso
molecular padrão (ROX) e 8,75 µL de formamida foram adicionados a 1 µL de amostra
da placa-mãe, totalizando uma volume final de 10 µL. Essa solução foi então
desnaturada em termociclador por 5 minutos em uma temperatura de 95ºC e
posteriormente imersa em gelo durante um período aproximado de 2 minutos.
Finalmente, as amostras foram injetadas em um analisador automático de DNA modelo
ABI-3100 (Applied Biosystems) para a análise dos fragmentos amplificados produzidos
41
pelas reações de PCR (amplicons). Os tamanhos dos fragmentos foram determinados
com o auxílio do programa GeneMapper 3.5 (Applied Biosystems), que permite a
obtenção dos genótipos dos indivíduos que estão sendo avaliados (Apêndices C e D).
VARIABILIDADE GENÉTICA E SISTEMA DE CRUZAMENTO
A partir da análise dos genótipos de todos os 521 indivíduos (20 matrizes,
399 juvenis e 102 adultos) para os sete locos microssatélites avaliados na população de
Mimoso – GO, foram obtidas as frequências alélicas e genotípicas de cada loco
utilizando o programa Fstat 2.9.3.2 (Goudet, 2002). Ainda utilizando esse mesmo
programa, essas frequências foram submetidas a um teste de permutação para verificar
se estão seguindo as proporções de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Posteriormente,
foram estimados os seguintes parâmetros para os indivíduos adultos e matrizes (122
indivíduos): número médio de alelos por loco (A), diversidade genética de Nei (Nei,
1973) (He) e heterozigosidade observada (Ho).
Para avaliar o poder de discriminação individual dos locos, para os
indivíduos adultos e matrizes (122 indivíduos), foram estimados ainda, para cada loco, e
para o conjunto de locos, os seguintes parâmetros utilizando o programa Identity 1.0
(Wagner & Sefc, 1999):
a) Probabilidade de identidade genética (I): probabilidade de dois
indivíduos escolhidos ao acaso em uma população apresentarem
genótipos idênticos. Esse índice foi calculado segundo Paetkau e
colaboradores (1995).
b) Probabilidade de exclusão de paternidade (Q): probabilidade de se
excluir uma falsa paternidade. Esse índice foi calculado segundo Weir
(1996).
O sistema de cruzamento foi avaliado utilizando o programa MLTR
(multilocus t and r) versão 3.4, descrito por Ritland (2000) e revisado em setembro de
2009. Esse programa se baseia nos modelos de cruzamento misto de Ritland & Jain
(1981) e cruzamentos correlacionados (Ritland, 1989) para estimar os seguintes
parâmetros:
42
a) Frequências alélicas dos óvulos e pólen;
b) Endogamia nos parentais;
c) Taxa de fecundação cruzada multiloco (tm) da população, por
máxima verossimilhança;
d) Taxa de fecundação cruzada uniloco (ts) da população;
e) Taxa de fecundação cruzada entre parentes (tm – ts)
f) Correlação de autofecundação (rs) entre dois filhos;
g) Correlação multiloco de paternidade (rp) entre dois irmãos.
O número médio de árvores doadoras de pólen (Nep) ou tamanho da
vizinhança reprodutiva, foi calculado a partir do valor de correlação multiloco de
paternidade pela expressão Nep = 1/rp. Posteriormente, foram estimados outros
parâmetros combinando as estimativas de tm e rp para se avaliar a proporção dos
diferentes tipos de progênies na descendência da população: proporção de irmãosgermanos (PIC = rptm), proporção de meios-irmãos (PMI = tm (1 - rp)) e proporção de
irmãos de autofecundação (PIA = 1 - tm).
A análise de paternidade foi realizada com o auxílio do programa CERVUS
3.0 (Marshall et al., 1998; Kalinowski et al., 2007). As análises foram conduzidas a
partir dos genótipos das árvores matrizes, de suas progênies e das demais árvores
adultas reprodutivas da população (candidatos a doadores de pólen). Admitiu-se que
cada semente tinha 122 prováveis doadores de pólen, uma vez que as matrizes foram
incluídas nesse cálculo. A proporção de árvores adultas amostradas considerada foi de
90%, a proporção de locos genotipados foi de 100% e a taxa de erro de genotipagem foi
de 0,01. Nas simulações de paternidade foram usadas 10.000 repetições e os níveis de
confiança restrito de 99% e relaxado de 95%, para determinar o verdadeiro doador de
pólen.
De acordo com o resultado da análise de paternidade em frutos nos quais
ocorreu mais de uma semente foi feita uma avaliação de paternidade múltipla. Essa
análise foi realizada para uma confiança de 90%.
43
3.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO
DISCUSS
VARIABILIDADE GENÉTICA
As frequências alélicas de cada um dos sete locos microssatélites analisados
foram representadas graficamente na Figura 10. O loco EMBRAEMBRA-172 foi o que
apresentou o menor número de alelos (13 alelos) e o loco EMBRA-14
EMBRA
foi o que
apresentou o maior número de alelos (36
( alelos). Em todos os locos
os houveram
houve
casos de
alelos com baixa frequência (< 0,01). Pode-se
Pode se observar que no loco EMBRA-72
EMBRA
houve
um alelo com frequência muito alta, alelo 133 com frequência de 0,79, o alelo 151
ocorreu com frequência de 0,05, sendo que os demais alelos desse loco ocorreram
o
com
frequência menor que 0,05. Nos demais locos ocorreram vários alelos com alta
frequência (> 0,05).
ED-04
Frequência
0.6
0.4
0.2
0
223 225 227 229 231 233 235 237 239 241 243 247 251 253 259
Alelo (pb)
Frequência
ED-05
0.4
0.3
0.2
0.1
0
185 193 203 209 213 219 223 227 231 235 239 251 255
Alelo (pb)
44
183
247
167
175
151
153
155
159
163
165
0.8
0.6
0.4
0.2
0
131
133
137
139
143
145
147
149
Frequência
EMBRA-72
Alelo (pb)
Frequência
EMBRA-210
0.3
0.2
0.1
0
181 189 195 205 209 215 225 231 235 239 243 247 259
Alelo (pb)
Alelo (pb)
241
233
231
229
221
219
217
215
213
211
209
207
205
203
197
193
191
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
189
Frequência
ED-09
45
EMBRA-14
0.3
Frequência
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
185
181
175
165
161
157
151
147
143
137
133
129
125
121
115
111
105
101
0
Alelo (pb)
EMBRA-172
Frequência
0.4
0.3
0.2
0.1
0
171 173 177 181 183 185 187 189 191 193 195 197 199
Alelo (pb)
Figura 10. Frequências alélicas dos sete locos microssatélites analisados na população
de Mimoso – GO, estimados para 521 indivíduos de E. dysenterica
Todos os locos utilizados no estudo foram polimórficos (Tabela 2). O
número médio de alelos por loco foi igual a 18.. Os valores médios de heterozigosidade
esperada (He) e observada (H
( o) foram, respectivamente, 0,776 e 0,742,, sugerindo que a
diversidade genética é relativamente alta. A probabilidade de exclusão de paternidade
combinada (QC)) foi igual a 0,9999
0,999 e a probabilidade de identidade combinada (IC)
(
foi
igual a 3,3x10-11 (Tabela 2). Estes valores
valores são considerados adequados para análises de
vínculo genético e sistema reprodutivo (Collevatti et al., 1999; Waits et al., 2001;
Moreira et al., 2009).
Foi observada diferença significativa entre os valores da heterozigosidade
observada (Ho) e heterozigosidade
ozigosidade esperada (H
( e) pelo EHW para a população de
46
Mimoso – GO, resultando em valor de f significativo (f = 0,091; p = 0,05), indicando
que os cruzamentos não ocorrem ao acaso nessa população. O resultado do teste de
desequilíbrio de ligação revelou que todos os pares de locos estão em desequilíbrio (p =
0,00238) para todas as comparações, baseado em 420 permutações.
Tabela 2. Caracterização dos sete locos microssatélites baseado na genotipagem de 122
indivíduos de E. dysenterica da população de Mimoso – GO
Loco
ED-04
ED-05
EMBRA-72
EMBRA-210
ED-09
EMBRA-14
EMBRA-172
A
13
19
16
19
13
30
13
He
0,804
0,834
0,455
0,789
0,777
0,911
0,861
Ho
0,681
0,680
0,824
0,767
0,831
0,669
0,742
I
0,027
0,082
0,035
0,081
0,013
0,011
0,039
Q
0,754
0,576
0,721
0,582
0,835
0,845
0,702
Média
18
0,776
0,742
IC = 3,3 x 10-11
QC = 0,9999
A: número médio de alelos por loco, He: frequência esperada de heterozigotos sob EHW, Ho: frequência
observada de heterozigotos, f: índice de fixação intrapopulacional, I: probabilidade de identidade, Q:
probabilidade de exclusão de paternidade, IC: probabilidade de identidade combinada e QC:
probabilidade de exclusão de paternidade combinada.
SISTEMA DE CRUZAMENTO E ENDOGAMIA
As taxas de cruzamento multiloco (tm) e uniloco (ts), considerando a análise
por família, foram altas e significativamente diferente da unidade, em média (Tabela 3).
A taxa de fecundação cruzada entre parentes (tm – ts) variou de –0,177 (Fam14) a 0,267
(Fam20), indicando que na família 20 ocorreu a maior taxa de cruzamento entre
indivíduos aparentados (26,7%).
Na análise combinada para todas as famílias, as taxas de fecundação cruzada
multiloco (tm = 0,918) e uniloco (ts = 0,797) foram altas (Tabela 4). A endogamia
biparental, representada pela diferença entre a taxa de fecundação cruzada multiloco e
uniloco, indicou a ocorrência de 12,2% de cruzamento entre indivíduos aparentados
(Tabela 4). Com isso, pode-se considerar que os indivíduos de E. dysenterica da
população de Mimoso – GO estão se reproduzindo predominantemente por fecundação
cruzada (tm = 0,918) (Tabela 4).
47
Tabela 3. Caracterização do sistema de cruzamento de indivíduos de E. dysenterica
baseado em famílias de polinização aberta da população de Mimoso – GO
Família
N
tm
ts
tm - ts
Fam1
19
0,948
0,773
0,175
Fam2
12
1,001
0,950
0,051
Fam3
10
1,000
0,869
0,131
Fam4
27
1,001
0,965
0,036
Fam5
23
1,000
0,770
0,230
Fam6
7
1,000
0,975
0,025
Fam7
17
1,000
0,984
0,016
Fam8
23
0,792
0,840
-0,048
Fam10
15
1,002
1,024
-0,022
Fam11
13
1,000
0,859
0,141
Fam12
5
1,000
1,110
-0,110
Fam13
48
0,604
0,583
0,021
Fam14
22
0,977
1,154
-0,177
Fam15
10
0,869
0,692
0,177
Fam16
11
0,998
0,863
0,135
Fam17
48
1,135
1,270
-0,135
Fam18
12
1,002
0,822
0,180
Fam19
27
0,982
0,940
0,042
Fam20
26
0,637
0,370
0,267
N: n0 de sementes; tm: taxa de cruzamento multiloco; ts: taxa de cruzamento uniloco; tm – ts: Taxa de
cruzamento entre parentes.
A correlação de paternidade foi baixa (rp = 0,154) (Tabela 4), sugerindo que
15,4% dos indivíduos das progênies são oriundos do mesmo grupo de doadores de
pólen. Este valor de correlação de paternidade indica que o número médio de árvores
doadoras de pólen é igual a 6,494 (Nep = 1/rp), ou seja, aproximadamente sete árvores
foram doadoras de pólen. Em média, 14,1% das progênies são compostas de irmãos
germanos e 77,7% são formadas por meios-irmãos. Além disso, pode-se afirmar que
somente 8,2% das progênies foram formadas por autofecundação (Tabela 4).
48
Esses resultados corroboram com os outros trabalhos que já foram
realizados para a espécie E. dysenterica (Proença & Gibbs, 1994; Zucchi, 2002; Telles
et al., 2003b; Rodrigues, 2012).
Tabela 4. Caracterização do sistema reprodutivo em uma população de E. dysenterica
Parâmetros
Estimativas (DP)*
Número total de árvores matrizes (m)
20
Número total de progênies (n)
399
Endogamia nos parentais
0,027 (0,049)
Taxa de fecundação cruzada multiloco (tm)
0,918 (0,033)
Taxa de fecundação cruzada uniloco (ts)
0,797 (0,044)
Taxa de fecundação cruzada entre parentes (tm – ts)
0,122 (0,020)
Taxa de autofecundação (s = 1 – tm)
0,082
Correlação de autofecundação (rs)
0,179 (0,138)
Correlação multiloco de paternidade (rp)
0,154 (0,036)
Número médio de árvores doadores (Nep = 1/rp)
6,494
Proporção de irmãos-germanos (PIC = rptm)
0,141
Proporção de meios-irmãos (PMI = tm (1 - rp))
0,777
Proporção de irmãos de autofecundação (PIA = 1 - tm)
0,082
* Entre parênteses está o desvio padrão da média (DP).
ATRIBUIÇÃO DE PATERNIDADE
Do total de sementes avaliadas, foi possível determinar o doador de pólen
para 218 sementes (55%), considerando um nível de confiança de 90%. Para uma
confiança de 95% foi possível determinar o doador de pólen para 174 sementes (44%) e
para confiança de 99% foi possível determinar o doador de pólen para 65 sementes
(16%) (Tabelas 5 e 6).
49
Tabela 5. Atribuição de paternidade para 174 sementes de E. dysenterica da população
de Mimoso – GO, com confiança de 95 e 99%.
Confiança
Semente Matriz Doador de pólen Trio LOD score Trio Delta
9M10
M10
100
14,99
14,99
99%
10M16
M16
M16
11,44
11,44
99%
18M13
M13
M13
10,00
10,00
99%
5M8
M8
M7
9,61
9,61
99%
19M13
M13
M13
9,27
9,27
99%
3M15
M15
M13
8,98
8,98
99%
9M13
M13
M13
8,78
8,78
99%
34S2M13
M13
M11
8,59
8,59
99%
5M13
M13
M13
8,45
8,45
99%
17M13
M13
M13
8,43
8,43
99%
25M13
M13
M13
8,26
8,26
99%
33S2M13
M13
M11
8,19
8,19
99%
35S2M13
M13
M13
8,16
8,16
99%
22M13
M13
M13
8,14
8,14
99%
1M10
M10
99
7,91
7,91
99%
8M13
M13
M13
7,75
7,75
99%
14M13
M13
M13
7,48
7,48
99%
12M13
M13
M13
7,35
7,35
99%
3M13
M13
M13
7,13
7,13
99%
31S1M13
M13
M13
7,04
7,04
99%
10S1M7
M7
7
11,26
7,04
99%
9S2M1
M1
M2
7,86
6,98
99%
2M15
M15
M15
7,94
6,85
99%
4M20
M20
65
6,63
6,63
99%
15M8
M8
M12
6,53
6,53
99%
30M13
M13
M15
7,15
6,39
99%
11M16
M16
M16
6,09
6,09
99%
3M7
M7
M8
7,85
6,00
99%
1M19
M19
M15
5,95
5,95
99%
8S1M7
M7
M8
6,35
5,93
99%
17M9
3M20
M9
100
5,85
5,85
99%
M20
M20
5,78
5,78
99%
[Type a quote from the document or the summary of an interesting point. You can position the
50
Semente Matriz Doador de pólen Trio LOD score Trio Delta
Confiança
1M7
M7
M8
7,90
5,73
99%
2M7
M7
M8
8,97
5,73
99%
8S2M18
M18
94
5,49
5,49
99%
20S3M8
M8
36
6,46
5,39
99%
3M9
M9
100
5,38
5,38
99%
16M8
M8
M8
5,34
5,34
99%
19S2M5
M5
74
6,13
5,29
99%
11S2M1
M1
M2
5,24
5,24
99%
4M3
M3
52
5,60
5,22
99%
9M8
M8
63
5,14
5,14
99%
6M1
M1
M1
5,07
5,07
99%
9M5
M5
100
5,73
4,92
99%
2M1
M1
52
5,28
4,92
99%
14S2M4
M4
80
4,89
4,89
99%
19S2M9
M9
22
4,73
4,73
99%
9M16
M16
M16
4,65
4,65
99%
6S2M18
M18
M20
4,64
4,64
99%
11M20
M20
M20
4,60
4,60
99%
21M20
M20
37
4,70
4,51
99%
5M15
M15
M11
4,51
4,51
99%
17M17
M17
70
4,27
4,27
99%
14M17
M17
55
4,13
4,13
99%
12M1
M1
M1
7,08
4,12
99%
10S2M7
M7
90
4,05
4,05
99%
20S2M9
M9
M9
4,04
4,04
99%
37S2M13
M13
23
3,95
3,95
99%
2M20
M20
M20
3,95
3,95
99%
11M13
M13
M11
3,93
3,93
99%
19M17
M17
M16
3,92
3,92
99%
14S1M4
M4
M4
4,21
3,85
99%
13M11
M11
M11
3,81
3,81
99%
5M19
M19
M19
3,79
3,79
99%
11M19
M19
74
5,66
3,78
99%
2M10
M10
40
3,54
3,54
95%
51
Semente Matriz Doador de pólen Trio LOD score Trio Delta
Confiança
14M5
M5
M8
5,18
3,53
95%
7M19
M19
85
3,51
3,51
95%
3M1
M1
11
3,49
3,49
95%
5M1
M1
M1
5,86
3,43
95%
15M13
M13
M13
3,41
3,41
95%
2M8
M8
M19
3,28
3,28
95%
12M17
M17
83
3,22
3,22
95%
36S2M13
M13
23
3,19
3,19
95%
29M13
M13
M13
3,17
3,17
95%
38S2M13
M13
23
3,10
3,10
95%
1M20
M20
M18
4,56
2,89
95%
18M20
M20
M18
4,88
2,89
95%
4M6
M6
43
2,89
2,89
95%
22M14
M14
M1
2,81
2,81
95%
6M3
M3
46
2,73
2,73
95%
8M19
M19
54
4,32
2,72
95%
17M20
M20
M18
3,59
2,71
95%
29S1M17
M17
60
2,68
2,68
95%
5M20
M20
M20
5,69
2,63
95%
3M19
M19
41
3,77
2,59
95%
2S2M17
M17
73
2,69
2,55
95%
8S2M3
M3
M13
2,44
2,44
95%
4M7
M7
M8
2,43
2,43
95%
9M2
M2
M2
2,35
2,35
95%
7M2
M2
M1
2,35
2,35
95%
6M11
M11
M13
2,26
2,26
95%
11M17
M17
M16
2,18
2,18
95%
28M13
M13
31
2,18
2,18
95%
3S1M17
M17
85
3,99
2,15
95%
37S1M13
M13
42
2,83
2,11
95%
25S2M19
M19
M19
2,08
2,08
95%
3M8
M8
18
2,02
2,02
95%
2M3
M3
38
4,06
2,01
95%
6M17
M17
M16
3,02
2,01
95%
52
Semente Matriz Doador de pólen Trio LOD score Trio Delta
Confiança
39S1M13
32S2M13
14M20
21S1M17
9M14
16M1
11M5
9S1M1
18M5
8M16
12M8
10M1
1S1M4
35M17
4M1
33S1M13
20M17
8S1M18
10M17
5M4
34M17
7M14
13M20
32M17
24M13
27M13
15S2M1
23M17
15M4
15M20
20S1M8
7M17
21M9
36M17
M13
M13
M20
M17
M14
M1
M5
M1
M5
M16
M8
M1
M4
M17
M1
M13
M17
M18
M17
M4
M17
M14
M20
M17
M13
M13
M1
M17
M4
M20
M8
M17
M9
M17
M11
M15
M20
85
75
M1
57
M2
38
65
63
M2
M13
67
M1
M13
22
1
34
52
89
58
M20
73
M11
82
28
72
33
21
M5
20
M10
74
1,98
2,54
5,60
4,19
2,96
1,77
2,35
2,04
3,05
1,53
1,52
1,51
1,48
2,44
1,41
1,40
4,18
1,91
3,80
1,28
1,28
4,08
3,34
3,24
1,74
1,16
1,14
1,14
1,14
5,18
1,41
4,24
3,10
3,03
1,98
1,96
1,94
1,93
1,90
1,77
1,74
1,69
1,54
1,53
1,52
1,51
1,48
1,43
1,41
1,40
1,38
1,36
1,34
1,28
1,28
1,27
1,26
1,24
1,22
1,16
1,14
1,14
1,14
1,12
1,12
1,11
1,11
1,10
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
4S2M2
M2
67
1,09
1,09
95%
2M13
M13
M15
1,80
1,09
95%
15M19
M19
54
1,48
1,08
95%
23M19
M19
M10
3,22
1,07
95%
53
Semente Matriz Doador de pólen Trio LOD score Trio Delta
3S3M2
13S2M10
21S2M17
7M20
20M14
20S2M5
3M3
6S1M18
21M13
9M20
22M20
23M20
4M17
1M13
22S2M17
25M17
15S1M17
10M13
8M1
1S2M17
14M8
12S1M7
8M8
8M14
7M1
26M13
20M13
34S1M13
15M14
16M20
6M8
19M19
12M19
5M17
11M8
15S2M11
M2
M10
M17
M20
M14
M5
M3
M18
M13
M20
M20
M20
M17
M13
M17
M17
M17
M13
M1
M17
M8
M7
M8
M14
M1
M13
M13
M13
M14
M20
M8
M19
M19
M17
M8
M11
M3
82
83
M20
88
80
38
25
M13
M20
M20
M20
33
M15
77
64
83
88
M13
33
M7
78
M8
M13
M2
M13
76
76
76
37
37
M15
56
56
M19
72
1,07
1,06
5,01
1,02
1,00
0,99
1,84
0,95
0,93
0,93
0,93
0,93
0,92
1,97
3,56
2,61
3,32
1,76
0,81
3,24
0,81
0,71
3,27
2,98
5,63
2,66
6,90
1,67
5,01
3,59
1,36
0,66
2,77
2,76
0,64
0,61
1,07
1,06
1,02
1,02
1,00
0,99
0,97
0,95
0,93
0,93
0,93
0,93
0,92
0,92
0,91
0,91
0,90
0,85
0,81
0,81
0,81
0,71
0,69
0,69
0,69
0,68
0,68
0,68
0,68
0,67
0,67
0,66
0,65
0,64
0,64
0,61
Confiança
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
95%
Paternidade determinada com 99% de confiança (∆crítico = 3,61 ; P < 0,01); Paternidade determinada
com 95% de confiança (∆crítico = 0,59 ; P < 0,05).
54
A Tabela 6 descrimina o número de atribuições para cada família avaliada
em diferentes níveis de confiança. O número de atribuições encontrado foi adequado e
de acordo com o esperado, uma vez que trata-se de uma população natural e não foi
possível realizar o censo dos candidatos a doadores de pólen.
Tabela 6. Atribuição de paternidade para 399 sementes de E. dysenterica da população
de Mimoso – GO para diferentes níveis de confiança
Família
N0 de sementes
99%
95%
90%
Fam1
19
5
14
14
Fam2
12
0
4
7
Fam3
10
1
5
5
Fam4
27
2
5
7
Fam5
23
2
6
8
Fam6
7
0
1
1
Fam7
17
6
8
10
Fam8
23
5
13
18
Fam9
24
4
5
9
Fam10
15
2
4
6
Fam11
13
1
3
3
Fam12
5
0
0
0
Fam13
48
18
36
37
Fam14
22
0
6
6
Fam15
10
3
3
4
Fam16
11
3
4
4
Fam17
48
3
25
40
Fam18
12
2
4
4
Fam19
27
3
11
15
Fam20
26
5
17
20
Total
399
65 (16%)
174 (44%)
218 (55%)
Das 20 famílias avaliadas, 15 apresentaram frutos com mais de uma
semente, totalizando 50 casos para a avaliação de paternidade múltipla (Tabela 7).
55
Considerando apenas as atribuições ao nível de confiança de 90%, pode-se concluir que
em 40% dos casos a paternidade múltipla foi verificada (20 casos de um total de 50).
Estes resultados revelam a paternidade múltipla na maioria das famílias da
população avaliada. O número de doadores de pólen por fruto variou de um a três. No
entanto, na literatura já foi relatado que podem existir frutos de cagaita com até seis
sementes (Silva et al., 2001), fazendo com que esse número possa ser ainda maior. A
alta ocorrência de paternidade múltipla nos frutos da cagaita sugere fortemente que a
concorrência de pólen nesta espécie pode acontecer. Esse fato pode afetar
substancialmente o sucesso reprodutivo dos parentais e, possivelmente, contribuir para o
aumento do fitness das matrizes e da progênie, seja por meio de seleção pós-polinização
ou pelo aumento da diversidade genética (Teixeira & Bernasconi, 2007). Devido ao fato
das sementes se dispersarem localmente (Wright & Meagher, 2004), os indivíduos mais
próximos tendem a ser mais estreitamente relacionados do que os indivíduos mais
distantes. Assim, evitar a endogamia por meio da seleção pós-polinização pode ser uma
característica importante para a espécie E. dysenterica.
Tabela 7. Avaliação de paternidade múltipla para a espécie E. dysenterica em uma
população de Mimoso – GO
Família
Fruto
Semente
Doador de pólen
Confiança
9S1 M1
M2
90%
Fruto 9
9S2 M1
M2
90%
Fam1
Fruto 11
Fruto 15
Fruto 3
Fam2
Fruto 4
Fruto 7
Fam3
Fruto 8
11S1 M1
M8
-
11S2 M1
M2
90%
15S1 M1
88
-
15S2 M1
28
90%
3S1M2
52
90%
3S2M2
101
-
3S3M2
M3
90%
4S1M2
M3
-
4S2M2
67
90%
7S1M3
M13
-
7S2M3
64
-
8S1M3
2
-
8S2M3
M13
90%
56
Família
Fruto
Fruto1
Fruto 14
Fam4
Fruto 16
Fruto 17
Fam5
Fruto 22
Fam6
Fruto 3
Fruto 8
Fruto 9
Fam7
Fruto 10
Fruto 11
Fruto 12
Fruto 19
Fam8
Fruto 20
Fruto 18
Fam9
Fruto 19
Fruto 20
Fruto 11
Fam10
Fruto 12
Semente
1S1M4
1S2M4
14S1M4
14S2M4
16S1M4
16S2M4
17S1M4
17S2M4
17S3M4
22S1M5
22S2M5
3S1M6
3S2M6
8S1M7
Doador de pólen
M13
31
M4
80
52
M13
74
101
102
M3
M5
81
36
M8
Confiança
90%
< 90%
90%
90%
< 90%
< 90%
< 90%
< 90%
< 90%
< 90%
< 90%
< 90%
< 90%
90%
8S2M7
M8
< 90%
9S1M7
22
< 90%
9S2M7
56
< 90%
10S1M7
7
90%
10S2M7
90
90%
11S1M7
M11
< 90%
11S2M7
M11
< 90%
12S1M7
78
90%
12S2M7
19S1M8
19S2M8
20S1M8
20S2M8
20S3M8
18S1M9
18S2M9
19S1M9
19S2M9
20S1M9
20S2M9
M8
M20
2
M5
M5
36
76
77
62
22
M20
M9
< 90%
< 90%
< 90%
90%
< 90%
90%
90%
90%
< 90%
90%
< 90%
90%
11S1M10
M7
< 90%
11S2M10
21
90%
12S1M10
M15
< 90%
12S2M10
M8
< 90%
57
Família
Fruto
Fruto 31
Fruto 32
Fruto 33
Fruto 34
Fam13
Fruto 35
Fruto 36
Fruto 37
Fruto 38
Fruto 39
Fam15
Fruto 9
Fruto 1
Fruto 2
Fruto 3
Fruto 15
Fam17
Fruto 21
Fruto 22
Fruto 29
Fruto 30
Fruto 31
Semente
31S1M13
31S2M13
32S1M13
32S2M13
33S1M13
33S2M13
34S1M13
34S2M13
35S1M13
35S2M13
36S1M13
36S2M13
37S1M13
37S2M13
38S1M13
38S2M13
39S1M13
39S2M13
9S1M15
Doador de pólen
M13
M15
81
M15
M13
M11
76
M11
76
M13
M13
23
42
23
M11
23
M11
65
M15
Confiança
90%
< 90%
90%
90%
90%
90%
90%
90%
< 90%
90%
< 90%
90%
90%
90%
< 90%
90%
90%
< 90%
9S2M15
1S1M17
1S2M17
2S1M17
2S2M17
2S3M17
3S1M17
3S2M17
15S1M17
15S2M17
21S1M17
21S2M17
22S1M17
22S2M17
29S1M17
29S2M17
47
26
33
67
73
46
85
54
83
74
85
83
33
77
60
95
90%
90%
90%
< 90%
90%
90%
90%
90%
90%
90%
90%
90%
90%
90%
90%
< 90%
30S1M17
M10
90%
30S2M17
67
90%
31S1M17
67
90%
31S2M17
21
90%
58
Família
Fruto
Fruto 5
Fruto 6
Fam18
Fruto 7
Fruto 8
Fruto 24
Fam19
Fruto 25
3.4
i.
Semente
Doador de pólen
Confiança
5S1M18
51
< 90%
5S2M18
68
< 90%
6S1M18
25
90%
6S2M18
M20
90%
7S1M18
1
< 90%
7S2M18
33
< 90%
8S1M18
1
90%
8S2M18
24S1M19
24S2M19
25S1M19
25S2M19
94
85
M19
85
M19
90%
< 90%
< 90%
90%
90%
CONCLUSÕES
A população de E. dysenterica de Mimoso – GO possui uma alta diversidade
genética;
ii.
A espécie E. dysenterica apresenta um sistema de cruzamento misto, com
predominância de cruzamentos;
iii.
Existe paternidade múltipla, por fruto, na espécie E. dysenterica.
59
4
ESTRUTURA
GENÉTICA
INTRAPOPULACIONAL
DE
Eugenia dysenterica DC. (MYRTACEAE)
RESUMO
Eugenia dysenterica (cagaiteira), família Myrtaceae, é uma árvore nativa da
região do Cerrado brasileiro que possui ampla distribuição no bioma no qual ocorre. A
estrutura genética espacial (EGE) em populações naturais, que corresponde à
distribuição espacial heterogênea de genótipos dentro de populações de plantas,
geralmente é resultado de uma limitada dispersão de genes via pólen e sementes. O
estudo da EGE em plantas do Cerrado é algo que tem se difundido na literatura, uma
vez que compreender a estrutura genética espacial de populações é fundamental para o
estabelecimento de estratégias de conservação da diversidade genética nas espécies. O
objetivo deste trabalho foi avaliar o padrão espacial intrapopulacional da variabilidade
genética entre plantas em uma subpopulação natural de E. dysenterica. Na análise foram
utilizados 102 indivíduos adultos georreferenciados e sete locos microssatélites. A
estrutura genética espacial intrapopulacional foi avaliada por meio de uma análise de
autocorrelação espacial, baseada no coeficiente de coancestria Fij entre as plantas
adultas em diferentes classes de distâncias geográficas. A distância geográfica máxima
exibida por par de indivíduos foi de 171,4 m, sendo a distância média de 61,3 m. A
maioria dos indivíduos exibiu uma distância par-a-par menor que 80 m
(aproximadamente 67%). A análise de autocorrelação espacial mostrou que a
coancestria está significativamente relacionada ao logaritmo da distância (R2 = 0,01646,
p < 0,001). O parentesco diminuiu de maneira expressiva após a primeira classe de
distância (< 12,08 m), mas foi significativo até a terceira classe de distância (30,89 m).
A estrutura genética espacial foi significativa (Sp = 0,0143) e a vizinhança genética (Nb)
foi igual a 69,93 km. A presença de autocorrelação espacial mostra a necessidade de se
respeitarem os limites de distância geográfica na amostragem de plantas para fins de
conservação. Com base nestes resultados, a melhor estratégia de amostragem para a
conservação da variabilidade genética dessa população seria a coleta de indivíduos
situados entre si a uma distância maior que 31 m, a fim de evitar a amostragem de
sementes de árvores aparentadas, o que reduziria o tamanho efetivo de variância.
Palavras-chave: autocorrelação espacial, cagaiteira, escala fina, microssatélite.
60
ABSTRACT
Eugenia dysenterica (cagaiteira), Myrtaceae, is a Savannah tree, that has
wide distribution in the biome in which occurs. The spatial genetic structure (EGE) in
natural populations, which corresponds to the non-random spatial distribution of
genotypes within populations of plants, is generally result in a limited dispersion of
genes by pollen and seeds. The study of EGE in Savannah plants is something that has
been widespread in the literature, because to understand the spatial genetic structure of
populations is crucial for the establishment of conservation strategies of genetic
diversity in the species. The goal of this study was to evaluate the intrapopulation
spatial pattern of genetic variability among plants within in a subpopulation of natural
E. dysenterica. In the analysis were used 102 georeferenced adults individuals and
seven microsatellite loci. The intrapopulation spatial genetic structure was assessed by
an analysis of spatial autocorrelation based on coefficient of coancestry Fij among adult
plants in different classes of geographic distances. The maximum pairwise geographic
distance presented was 171.4 m, with an average distance of 61.3 m. Most individuals
displayed a pairwise distance less than 80 m (approximately 67 %). The autocorrelation
analysis showed that the kinship is related to the logarithm of the distance (R2 =
0.01646, p < 0.001). Kinship decreased more significantly after the first distance class
(< 12.08 m), but it was significant until the third distance class (30.89 m). The spatial
genetic structure was significant (Sp = 0.0143) and genetic neighborhood (Nb) was equal
to 69.93 km. The presence of spatial autocorrelation shows the need to respect the
boundaries of geographic distance in sampling plants for conservation purposes. Based
on these results, the best sampling strategy for the conservation of the genetic variability
of this population would be collect individuals situated at a distance greater than 31 m
in order to avoid seed sampling of related trees, which would reduce the variance
effective size.
Keywords: cagaiteira, fine scale, microsatellite, spatial autocorrelation.
4.1
INTRODUÇÃO
A estrutura genética espacial (EGE) em populações naturais, isto é, a
distribuição espacial heterogênea de genótipos, pode ser resultado de diferentes
processos, incluindo endogamia, dispersão de sementes e pólen, deriva genética, seleção
e eventos históricos (Loiselle et al., 1995; Vekemans & Hardy, 2004). Assim, pode-se
conceituar EGE como uma distribuição espacial heterogênea dos alelos e genótipos, no
espaço e no tempo, resultante da ação de forças evolutivas (Hamrick, 1982). No entanto,
em uma escala espacial fina, a causa mais comum é, provavelmente, a formação de
estruturas de famílias locais como resultado da dispersão limitada de genes. Assim, é
61
comum a ocorrência de EGE dentro de populações de espécies de plantas, uma vez que
elas normalmente encontram restrição espacial para se dispersarem (Vekemans &
Hardy, 2004). A dispersão limitada de sementes pode ainda indiretamente limitar a
dispersão de pólen (maior densidade de árvores locais), contribuindo para a agregação
dessas árvores em estrutura de famílias (Hardy et al., 2006). Neste contexto, a
similaridade genética é maior entre os vizinhos do que entre os indivíduos mais
distantes, e o modelo de isolamento-por-distância prevê o padrão esperado de EGE em
equilíbrio dispersão-deriva (Vekemans & Hardy, 2004).
Vekemans & Hardy (2004) propuseram uma estatística para quantificar
EGE em escala fina, dentro das populações, com uma abordagem que se baseia em
modelos de isolamento-por-distância para um espaço bidimensional, utilizando
coeficientes de parentesco entre os pares de indivíduos. Eles analisaram dados da
literatura para comparar EGE entre 47 espécies de plantas e demonstraram que a EGE
está relacionada com o sistema de acasalamento e a densidade populacional.
A existência de um padrão espacial na variação genética é importante para a
compreensão de como ocorre a dinâmica dos alelos entre as subpopulações de uma
espécie, podendo essa informação ser utilizada para otimizar a amostragem da
variabilidade genética para estudos e usos futuros (Ribeiro & Rodrigues, 2006). Essa
estratégia auxilia no estabelecimento de medidas de conservação genética, indicando
maneiras de maximizar a variabilidade genética na coleta de sementes para programas
conservação ex situ, melhoramento genético, recuperação de áreas degradadas, bem
como inferir sobre tamanhos mínimos de área para a conservação in situ (Gusson et al.,
2005). Isso pode ser feito, por exemplo, evitando-se a coleta de sementes de árvores
próximas (sendo esse limite de distância determinado pela análise de autocorrelação
espacial), evitando-se a amostragem de indivíduos aparentados.
O estudo da EGE em escala fina para plantas é algo que tem se difundido na
literatura. Degen e colaboradores (2001) avaliaram a EGE em escala fina, baseada em
marcadores RAPD, de oito espécies de árvores tropicais da Guiana Francesa
(Chrysophyllum sanguinolentum, Carapa procera, Dicorynia guianensis, Eperua
grandiflora, Moronobea coccinea, Symphonia globulifera, Virola michelii, Vouacapoua
americana), as quais possuem diferentes dispersores, sistema reprodutivo, fenologia de
floração e exigências ambientais. Como resultado, eles encontraram EGE significativa
para quatro das oito espécies e, em contraste com a maioria das observações em
florestas temperadas, na qual a estrutura espacial não é geralmente detectada em
62
distâncias superiores a 50 m, estrutura genética significativa foi encontrada a uma
distância de até 300 m. Vieira e colaboradores (2010) avaliaram a EGE em escala fina
de Euterpe edulis (uma palmeira) em um fragmento no Campus da Universidade de
Lavras – MG, com uso de isoenzimas, encontrando EGE significativa. Barluenga e
colaboradores (2011) avaliaram a EGE em escala fina em Silene latifolia (planta nativa
da Europa) com o uso de marcadores microssatélites, sendo que a autocorrelação
espacial revelou alto parentesco entre indivíduos ao longo de centenas de metros.
Com relação à espécie Eugenia dysenterica (cagaiteira), existem alguns
trabalhos na literatura que relatam análises da EGE em subpopulações dessa espécie.
Telles e colaboradores (2001; 2003b) avaliaram a EGE em dez subpopulações naturais
de E. dysenterica do sudeste de Goiás com o uso de isoenzimas, enquanto Zucchi e
colaboradores (2004) avaliaram a EGE nas mesmas dez populações usando marcadores
microssatélites. Os resultados encontrados por esses autores sugerem que processos
estocásticos, tais como o modelo de isolamento-por-distância ou stepping-stone, são
mais adequados para explicar o padrão espacial de divergência genética entre as
subpopulações de E. dysenterica na região sudeste do estado de Goiás.
No entanto, a EGE em escala fina (local) para a espécie E. dysenterica ainda
não foi avaliada. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a estrutura genética
espacial intrapopulacional para a espécie E. dysenterica, com o uso de marcadores
microssatélites.
4.2
MATERIAL E MÉTODOS
ÁREA DE ESTUDO E COLETA
Esta análise foi realizada a partir de uma única subpopulação natural de E.
dysenterica oriunda do município de Mimoso – GO (latitude: -15.03154 e longitude: 50.11158). Foi delimitada uma área, de 1,02 ha (10.200 m2), da qual foram coletadas
folhas de 102 árvores adultas (Figura 11).
63
Figura 11. Localização de Mimoso – GO no Brasil e destaque para a região de coleta,
mostrando a distribuição espacial dos 102 indivíduos adultos
64
EXTRAÇÃO DO DNA E OBTENÇÃO DE DADOS MOLECULARES
O DNA foi extraído a partir de tecido foliar dos 102 indivíduos adultos,
segundo protocolo descrito por Doyle & Doyle (1987), quantificado e diluído à
concentração aproximada de 2,5 ng de DNA genômico por µL. A amplificação dos
fragmentos de DNA foi realizada por meio de reação de PCR (Polimerase Chain
Reaction). Foram usados sete locos microssatélites polimórficos para obter os genótipos
dos indivíduos coletados, sendo três pares de iniciadores (primers) específicos para a
espécie E. dysenterica (Telles et al., 2013), e quatro pares desenvolvidos para
Eucalyptus spp. e transferidos para E. dysenterica (Zucchi et al., 2002). Os detalhes dos
locos estão descritos nos Apêndices A e B.
As reações de PCR foram preparadas para um volume final de 15 µL, sendo
divididos nos seguintes componentes: 12,5 ng de DNA genômico, 0,018 mg de BSA
(10 mg/ml), 1X de Tampão da enzima 10X, 1,6 mM de MgCl2 (50 mM), 3,25 µM de
dNTPs, 1,98 µM de cada iniciador (forward e reverse), 1 unidade de Taq DNA
polimerase e o volume final foi completado com água Mili-Q esterilizada. As condições
de amplificação foram: (1º) desnaturação do DNA a 95°C por 5 minutos; (2º) 94°C por
1 minuto; (3º) temperatura específica de anelamento do iniciador por 1 minuto; (4º)
extensão da molécula pela enzima Taq DNA polimerase a 72°C por 1 minuto; (5º) 30
ciclos seguindo do 2º ao 4º passo; (6º) passo de extensão final a 72°C por 30 minutos.
Os iniciadores forward foram marcados com fluorocromos HEX (verde), NED
(amarelo) ou 6-FAM (azul) nas suas extremidades 5’ (detalhes nos Apêndices A e B).
Posteriormente, foi montada uma placa-mãe para cada conjunto de
marcadores, formando painéis com diferentes locos ou multiplex (Apêndice B). A placamãe foi preparada com 2 µL da reação de PCR de cada componente da multiplex,
formando uma mistura de reações de PCR. Em seguida, 0,25 µL do marcador de peso
molecular padrão (ROX) e 8,75 µL de formamida foram adicionados a 1 µL de amostra
da placa-mãe (volume final de 10 µL). Essa solução foi então desnaturada em
termociclador a 95ºC por 5 minutos e imersa em gelo durante um período aproximado
de 2 minutos. Finalmente, as amostras foram injetadas em um analisador automático de
DNA (ABI-3100, Applied Biosystems) para a análise dos fragmentos amplificados
produzidos pelas reações de PCR. O tamanho dos fragmentos foram determinados com
o auxílio do programa GeneMapper 3.5 (Applied Biosystems), que permite a obtenção
dos genótipos dos indivíduos que estão sendo avaliados (Apêndices C e D).
65
ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL INTRAPOPULACIONAL
A distribuição espacial dos indivíduos foi avaliada por meio da distribuição
de frequência das distâncias par-a-par. A estrutura genética espacial da população de
Mimoso – GO foi realizada com o auxílio do programa SPAGeDI 1.3d (Hardy &
Vekemans, 2002). A análise foi feita com base no coeficiente de coancestria Fij, de
acordo com Loiselle e colaboradores (1995), entre as 102 plantas adultas coletadas,
considerando diferentes classes de distâncias geográficas. As classes de distâncias
geográficas foram determinadas de forma automática pelo programa SPAGeDI, de
modo que todas representassem um número aproximado de pares de pontos (Tabela 8).
Tabela 8. Classes de distância usadas na análise de estrutura genética espacial
intrapopulacional de E. dysenterica em Mimoso – GO
Classe de distância (m)
1
Distância
máxima
2
3
4
5
6
7
8
9
10
12,08 21,54 30,89 40,82 53,37 67,60 82,76 101,24 123,91 171,42
Foi realizada uma análise de regressão linear dos valores de Fij em função
do logaritmo da distância espacial entre os indivíduos para testar a estrutura da
coancestria, sendo estimados os intervalos de confiança dos valores de Fij. A
significância do parentesco para cada classe de distância e da regressão foi avaliada por
teste de permutação (10.000 permutações).
A força da estrutura genética espacial foi quantificada pelo parâmetro Sp,
conforme a seguinte expressão (Vekemans & Hardy, 2004):
Sp = b/(F1-1), sendo
F1 : coeficiente médio de coancestria da primeira classe de distância;
b: inclinação da reta de regressão
Finalmente, foi estimada a dispersão de genes (pólen e sementes) baseada na
vizinhança genética (Nb) conforme a expressão proposta por Vekemans & Hardy
(2004): Nb = 1/Sp, sendo o Sp já definido anteriormente.
66
4.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO
DISCUSS
A distância máxima entre os pares de indivíduos foi de 171,4 m e a distância
média foi igual a 61,3 m. A maioria dos indivíduos exibiu uma distância par-a-par
par
menor que 80 m (aproximadamente 67%) (Figura 12).
Figura 12. Distribuição das distâncias par-a-par
par par entre 102 indivíduos adultos da
subpopulação de E. dysenterica de Mimoso – GO
A análise de autocorrelação espacial mostrou que a coancestria está
significativamente relacionada ao logaritmo da distância ((R2 = 0,01646, p < 0,001). O
parentesco diminuiu de maneira expressiva após a primeira classe de distância (< 12,08
m) e foi significativo até a terceira classe de distância (30,89 m) (Figura 13). A presença
de autocorrelação espacial mostra a necessidade de se respeitar os limites de distâncias
geográficas na amostragem de plantas para fins de conservação (Telles
(Telle et al., 2001;
Gusson et al., 2005; Soares et al., 2008).
2008) Baseado nos presentes resultados, a coleta de
sementes de E. dysenterica não deve ser realizada em árvores localizadas dentro de
distâncias inferiores a 31 m, a fim de evitar amostrar sementes de árvores
rvores aparentadas.
Isso reduziria o tamanho efetivo de variância (tamanho efetivo na população
67
descendente), mas, cabe ressaltar que mesmo utilizando esta estratégia, as sementes
coletadas podem reter algum grau de endogamia biparental se os cruzamentos
ocorrerem dentro das vizinhanças das árvores maternas (Gusson et al., 2005; Gusson et
al., 2006).
Figura 13. Relação entre coancestria (Fij ± DP; DP: desvio padrão) e logaritmo da
distância para 102 indivíduos adultos de E. dysenterica em Mimoso – GO
A estrutura genética espacial foi positiva e significativa (Sp = 0,0143) e a
vizinhança genética (Nb) foi igual à 69,93 km. Segundo Vekemans & Hardy (2004), a
estatística Sp permite comparações entre espécies. Assim, comparando o resultado
encontrado para E. dysenterica com algumas espécies do Cerrado, a estrutura genética
espacial foi mais forte que a encontrada para Caryocar brasiliense (pequi), Sp = 0,0116,
e Tibouchina papyrus (pau-papel), Sp = 0,0085, porém mais fraca que a de Dipteryx
alata (baru), Sp = 0,0172 (Collevatti et al., 2010) (Tabela 9). Esses valores corroboram
com o esperado de acordo com Vekemans & Hardy (2004), uma vez que espera-se que
Sp seja maior em espécies que se reproduzem predominantemente por autofecundação
68
do que em espécies auto-incompatíveis, com valores intermediários para espécies autocompatíveis com sistemas misto de reprodução.
Tabela 9. Comparação da estrutura genética espacial (EGE) intrapopulacional e
vizinhança genética entre quatro subpopulações de espécies do Cerrado.
F1: valor de Fij intra grupo; b: inclinação da regressão; Sp: parâmetro de
força da EGE; Nb: vizinhança genética
Espécie
Sistema de
cruzamento
Dispersor
de pólen
Dispersor
de semente
F 1*
(±DP)
b*
Sp
Nb
E. dysenterica
AC/M
abelhas
animais
0,103
(± 0,044)
-0,0129
0,0143
69,93
C. brasiliense
AC
morcegos
animais
0,149
(± 0,012)
-0,0099
0,0116
86,20
D. alata
AI
abelhas
animais
0,059
(± 0,057)
-0,0162
0,0172
58,09
T. papyrus
AC
abelhas
vento
0,032
(± 0,014)
-0,0088
0,0085
118,05
* Valores significativos (p < 0,05); DP: desvio padrão. AC: auto-compatível; AI: auto-incompatível; M:
misto.
4.4
i.
CONCLUSÃO
A coancestria está relacionada à distância entre os indivíduos, com a estrutura
genética espacial (EGE) positiva e significativa.
69
5
DIVERSIDADE
E
ESTRUTURA
GENÉTICA
ENTRE
SUBPOPULAÇÕES DE Eugenia dysenterica DC. (MYRTACEAE)
RESUMO
O conhecimento da variabilidade genética de subpopulações naturais e o
modo como essa variabilidade está estruturada dentro e entre essas subpopulações é um
dos principais temas da genética de populações de plantas. Tais estudos são importantes
porque permitem a avaliação de processos microevolutivos e também servem como
auxílio ao adotar estratégias de conservação (in situ e ex situ). Os marcadores
microssatélites (SSR) têm sido bastante usados para este fim devido a diversos fatores,
entre os quais a natureza codominante e o alto polimorfismo. O objetivo desse trabalho
foi estimar a variabilidade e estrutura genética, bem como avaliar o padrão espacial da
variabilidade entre subpopulações de Eugenia dysenterica. Neste estudo foram
avaliadas 23 subpopulações de cagaiteira com o uso de sete locos de marcadores
microssatélites. A partir da análise da variabilidade genética foram encontrados os
seguintes resultados: em média, foram analisados aproximadamente 32 indivíduos por
subpopulação, todos os locos foram polimórficos, o número médio de alelos por loco foi
de aproximadamente 9, a diversidade genética foi alta (0,725) e a frequência observada
de heterozigotos (Ho) foi de 0,610. De um total de 192 alelos dos sete locos
microssatélites avaliados, foram encontrados 18 alelos privados em 10 subpopulações.
Os resultados obtidos para o índice de fixação (f) para cada subpopulação variaram de 0,058 a 0,338, com um valor global de 0,162, indicando excesso de homozigotos em
relação às frequências esperadas sob EHW. As estatísticas F foram: FST = 0,161 (RST =
0,205), FIS = 0,147 e FIT = 0,285, mostrando que existe alta diferenciação genética entre
essas subpopulações, quando comparada com outras espécies tropicais. A análise do
padrão espacial entre as subpopulações foi realizada mediante técnicas de
autocorrelação espacial e teste de Mantel, mostrando que a divergência genética das 23
subpopulações avaliadas está estruturada no espaço (r = 0,427; p < 0,001), sugerindo
processos estocásticos de divergência genética entre populações, como o modelo de
isolamento-por-distância ou stepping-stone. Isso sugere maior similaridade genética
entre indivíduos mais próximos do que entre os indivíduos mais distantes, favorecendo
a agregação desses indivíduos em estrutura de famílias. Além disso, o modelo de
isolamento-por-distância sugere equilíbrio entre os processos de dispersão e deriva para
a estrutura genética espacial.
Palavras-chave: análise espacial, cagaiteira, microssatélite, variabilidade.
70
ABSTRACT
The knowledge of the genetic variability of natural subpopulations and how
this variability is structured within and among these subpopulations is a major theme of
plants population genetics. Such studies are important because they allow the evaluation
of microevolutionary processes and also serve as an aid to adopt conservation strategies
(in situ and ex situ). Microsatellite markers ( SSR ) have been widely used for this
purpose due to several factors, including the codominant nature and high
polymorphism. The aim of this study was to estimate the genetic variability and
structure, as well as evaluating the spatial pattern of variability among subpopulations
of Eugenia dysenterica. In this study 23 subpopulations of E. dysenterica were
evaluated, using seven microsatellite loci markers. From the analysis of genetic
variability the following results were found: on average, about 32 individuals were
analyzed by subpopulation, all loci were polymorphic, the average number of alleles per
locus was approximately 9, the genetic diversity was high (0.725) and the observed
frequency of heterozygotes (Ho) was 0.610. From a total of 192 alleles of the seven
microsatellite loci evaluated, 18 private alleles were found in 10 subpopulations. The
results for the fixation index (f) for each subpopulation ranged from -0.058 to 0.338,
with an overall value of 0.162, indicating homozygote excess in relation to the expected
under HWE. The F-statistics were: FST = 0.161 (RST = 0.205) , FIS = 0.147 and FIT =
0.285, showing that there is high genetic differentiation between these subpopulations
compared with other tropical species. The spatial pattern analysis among subpopulations
was performed using techniques of spatial autocorrelation and Mantel test, showing that
the genetic diversity of the subpopulations evaluated is structured in space (r = 0.427 , p
< 0.001), suggesting stochastic processes of genetic divergence between populations, as
isolation-by-distance model. This suggests greater genetic similarity between
individuals closer than that between the most distant individuals, favoring aggregation
of these individuals in families structure. In addition, the isolation-by-distance model
suggests balance between the processes of dispersion and genetic drift for spatial
genetic structure.
Keywords: cagaiteira, microsatellites, spatial analysis, variability.
5.1
INTRODUÇÃO
Diversidade genética é a variedade de alelos e genótipos presente nas
populações. A avaliação da diversidade genética sempre foi de interesse dos
geneticistas, os quais desenvolveram vários métodos para detectá-la e analisá-la, sendo
geralmente descrita em termos de frequências alélicas, número de alelos e
heterozigosidade (Ribeiro & Rodrigues, 2006; Frankham et al., 2008). Já a estrutura
genética de populações de uma espécie refere-se à forma como a variabilidade genética
71
está distribuída entre e dentro dos níveis hierárquicos de subdivisão de uma espécie
(Brown, 1978; Holsinger, 2000).
O sistema reprodutivo é um dos principais fatores na formação da estrutura
genética espacial e temporal, uma vez que determina como as informações genéticas
serão transmitidas entre as gerações (Wright, 1921). A determinação do grau de
diferenciação genética entre os grupos é de grande interesse em diversos campos,
incluindo a evolução biológica e a conservação de plantas. A expressão “diferenciação
genética” significa que as frequências alélicas entre as subpopulações são diferentes,
sendo, neste caso, considerada a subdivisão populacional (ou estrutura populacional), na
qual uma população total é dividida em subpopulações menores (Hartl & Clark, 2010).
Há uma série de abordagens utilizadas para quantificar e visualizar a
diferenciação genética. As estatísticas-F (Wright, 1951) descrevem a distribuição da
variação genética em populações com base no déficit de heterozigotos em relação ao
esperado sob Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). A análise da estrutura genética
geralmente é realizada por meio do FST e seus análogos, que avalia a divergência das
frequências alélicas entre duas ou mais populações. Os valores de FST podem variar de
zero, quando não há nenhuma divergência genética entre os grupos, a um, representando
grupos extremamente divergentes. Segundo Hartl & Clark (2010), Wright sugere que
valores de FST menores que 0,05 indicam pequena diferenciação genética, 0,05-0,15
indicam moderada diferenciação genética, 0,15-0,25 indicam grande diferenciação
genética e valores maiores que 0,25 indica uma diferenciação genética muito grande.
A estrutura genética espacial (EGE) em populações naturais de plantas
refere-se à distribuição espacial heterogênea dos genótipos nessas populações
(Vekemans & Hardy, 2004) e geralmente é resultado de uma limitada dispersão de
genes, via pólen e sementes (Moura et al., 2009). Estudos que avaliam os padrões
espaciais da variação genética de uma espécie permitem inferir os prováveis processos
microevolutivos que estão atuando na diferenciação genética dessas populações,
fornecendo subsídios para trabalhos futuros de conservação, manejo e programas de
melhoramento genético. A análise de autocorrelação espacial é uma das estratégias que
tem sido usada de maneira eficiente para avaliar a semelhança entre as frequências
alélicas de populações próximas e como essa semelhança se altera à medida que se
modifica a escala geográfica (Telles et al., 2001; Ribeiro & Rodrigues, 2006).
72
O teste de Mantel (Mantel, 1967) é bastante utilizado para a avaliação da
EGE em populações. Mantel (1967) desenvolveu um modelo geral para testar a
associação de conjuntos de pares de medidas, avaliando a correlação entre vetores de
pares de distâncias. Esse teste consiste de um procedimento de permutação utilizado
para testar a significância estatística das correlações de matrizes (Sokal, 1979) e, apesar
das recentes controvérsias acerca de seu desempenho estatístico (Legendre & Fortin,
2010; Guillot & Rousset, 2013), tem sido amplamente utilizado em genética de
populações (Telles & Diniz-Filho, 2005). O correlograma de Mantel corresponde a um
gráfico, no qual são plotados os valores de autocorrelação contra classes de distâncias
entre as observações (Legendre & Legendre 1998) e auxilia na análise da EGE.
Há na literatura alguns estudos genético-populacionais relacionados à
espécie Eugenia dysenterica, que avaliam a diversidade e estrutura genética de
populações dessa espécie no estado de Goiás. Telles (2000) analisou a diversidade e
estrutura genética de dez subpopulações naturais de E. dysenterica do sudeste de Goiás
mediante o uso de isoenzimas. Zucchi (2002) avaliou as mesmas subpopulações, porém
usando marcadores RAPD e SSR. Já Trindade & Chaves (2005) avaliaram a
variabilidade e estrutura genética de 13 subpopulações naturais de E. dysenterica do
nordeste de Goiás em marcadores RAPD. Em todos esses estudos foi encontrada alta
diversidade genética, estrutura de populações e uma forte correlação entre as distâncias
genéticas e geográficas, coerente com o modelo microevolutivo de isolamento-pordistância.
O objetivo desse trabalho foi avaliar a variabilidade genética dentro e entre
subpopulações de E. dysenterica, bem como verificar se existe padrão espacial da
variabilidade genética em uma escala regional, ao longo da área de distribuição
geográfica da espécie.
5.2
MATERIAL E MÉTODOS
ÁREA DE COLETA
Foram coletadas 23 subpopulações naturais de E. dysenterica oriundas dos
seguintes estados brasileiros: Goiás (GO), Minas Gerais (MG), Bahia (BA), Mato
73
Grosso (MT), Tocantins (TO) e Piauí (PI), totalizando 736 indivíduos (Tabela 10 e
Figura 14). As localidades de todas as subpopulações foram georreferenciadas.
Tabela 10. Subpopulações naturais de E. dysenterica amostradas para análise genética
Coordenadas
No de
Localidade
Estado
Código
Lat/Long
indivíduos
Faina
GO -15,903 -49,974
FGO
32
Santa Terezinha
GO
-14,393 -49,619
STGO
32
Mutunópolis
GO
-13,679 -49,228
MUGO
32
Vila Boa
GO
-15,097 -47,111
VBGO
32
Catalão
GO
-18,242 -47,989
CATAGO
33
Campo Alegre
GO
-17,676 -47,781 CAMALGO
22
Niquelândia
GO
-14,192 -48,310
NIQGO
34
Dois Irmãos
GO
-15,176 -48,541
DIRGO
33
Mimoso
GO
-15,027 -48,153 MIMGO 1
32
Balneário Santo Antônio
GO
-15,992 -50,112
BSAGO
32
Senador Canedo
GO
-16,626 -49,073
SCNGO
32
Bambuí
MG
-20,101 -45,957
BAMMG
32
Luz
MG
-19,778 -45,682
LUZMG
25
Paracatu
MG
-17,247 -47,077
PTUMG
33
Pirapora
MG
-17,392 -44,995
PIPMG
32
Brasilândia de Minas
MG
-16,748 -46,361
BRAMG
33
Coromandel
MG
-18,435 -47,209
CORMG
33
Barreiras
BA
-12,118 -45,198
BABA
25
Roda Velha
BA
-12,972 -45,990
RVBA
33
Barra do Garça
MT
-15,376 -51,734
BAGMT
41
Porto Nacional
TO
-10,715 -48,781
PNTO
33
Silvanópolis
TO
-11,211 -48,176
SITO
34
Gilbués
PI
-9,656 -45,463
GILPI
36
TOTAL
-
-
736
-
-
74
Figura 14. Distribuição das 23 subpopulações de E. dysenterica avaliadas. Os
municípios referentes aos códigos no mapa estão na Tabela 10
EXTRAÇÃO DO DNA E OBTENÇÃO DE DADOS MOLECULARES
Foi extraído o DNA a partir de tecido foliar dos 736 indivíduos coletados,
segundo protocolo descrito por Doyle & Doyle (1987), quantificado e diluído à
concentração aproximada de 2,5 ng de DNA genômico por µL. A amplificação dos
fragmentos de DNA foi realizada por meio de reação de PCR (Polimerase Chain
Reaction). Foram usados sete locos microssatélites polimórficos para obter os genótipos
dos indivíduos coletados, sendo três pares de iniciadores (primers) específicos para a
espécie E. dysenterica (Telles et al., 2013), e quatro pares desenvolvidos para
75
Eucalyptus spp. e transferidos para E. dysenterica (Zucchi et al., 2002). Os detalhes dos
locos estão descritos nos Apêndices A e B.
As reações de PCR foram preparadas para um volume final de 15 µL, sendo
divididos nos seguintes componentes: 12,5 ng de DNA genômico, 0,018 mg de BSA
(10 mg/ml), 1X de Tampão da enzima 10X, 1,6 mM de MgCl2 (50 mM), 3,25 µM de
dNTPs, 1,98 µM de cada iniciador (forward e reverse), 1 unidade de Taq DNA
polimerase e o volume final foi completado com água Mili-Q esterilizada. As condições
de amplificação foram: (1º) desnaturação do DNA a 95°C por 5 minutos; (2º) 94°C por
1 minuto; (3º) temperatura específica de anelamento do iniciador por 1 minuto; (4º)
extensão da molécula pela enzima Taq DNA polimerase a 72°C por 1 minuto; (5º) 30
ciclos seguindo do 2º ao 4º passo; (6º) passo de extensão final a 72°C por 30 minutos.
Os iniciadores forward foram marcados com fluorocromos HEX (verde), NED
(amarelo) ou 6-FAM (azul) nas suas extremidades 5’ (detalhes nos Apêndices A e B).
Posteriormente, foi montada uma placa-mãe para cada conjunto de
marcadores, formando os painéis com diferentes locos ou multiplex (Apêndice B). A
placa-mãe foi preparada com 2 µL da reação de PCR de cada componente da multiplex,
formando uma mistura de reações de PCR. Em seguida, 0,25 µL do marcador de peso
molecular padrão (ROX) e 8,75 µL de formamida foram adicionados a 1 µL de amostra
da placa-mãe, totalizando uma volume final de 10 µL. Essa solução foi então
desnaturada em termociclador por 5 minutos em uma temperatura de 95ºC e
posteriormente imersa em gelo durante um período aproximado de 2 minutos.
Finalmente, as amostras foram injetadas em um analisador automático de DNA modelo
ABI-3100 (Applied Biosystems) para a análise dos fragmentos amplificados produzidos
pelas reações de PCR (amplicons). O tamanho dos fragmentos foram determinados com
o auxílio do programa GeneMapper 3.5 (Applied Biosystems), que permite a obtenção
dos genótipos dos indivíduos que estão sendo avaliados (Apêndices C e D).
VARIABILIDADE GENÉTICA
A partir dos genótipos de todos os 736 indivíduos para os sete locos
microssatélites avaliados nas 23 subpopulações, foram obtidas as frequências alélicas e
genotípicas de cada loco utilizando o programa Fstat 2.9.3.2 (Goudet, 2002). Ainda
76
utilizando esse mesmo programa, essas frequências foram submetidas a um teste de
permutação para verificar se estão seguindo as proporções de equilíbrio de HardyWeinberg para cada subpopulação. Posteriormente foram estimados os seguintes
parâmetros para cada população: número médio de alelos por loco (A), riqueza alélica
(R), diversidade genética de Nei (Nei, 1973) (He), heterozigosidade observada (Ho) e
índice de fixação intrapopulacional (f).
ESTRUTURA GENÉTICA E PADRÃO ESPACIAL
As frequências alélicas e genotípicas de cada loco, as estatísticas de
diversidade genética de Nei, assim como os testes de equilíbrio de Hardy-Weinberg
(EHW) e desequilíbrio de ligação foram calculados mediante o programa Fstat 2.9.3.2
(Goudet, 2002). Os parâmetros de diversidade genética e os alelos privados foram
estimados pelos programas Fstat 2.9.3.2 e GDA 1.0 (Genetic Data Analysis II) (Weir,
1996).
Para a análise da estrutura genética entre as subpopulações foram estimadas
as estatísticas-F ou coeficientes de Wright (1951), segundo Weir & Cockerham (1984).
Foram estimados os seguintes parâmetros: endogamia dentro da população relacionada
ao sistema reprodutivo (FIS ou f), endogamia causada pela subdivisão populacional (FST
ou θ) e endogamia total (FIT ou F).
A análise da estrutura genética foi realizada por meio do FST, o qual avalia a
divergência das frequências alélicas entre duas ou mais populações. Também foi
estimado o RST, análogo ao FST, que considera a elevada taxa de mutação de marcadores
microssatélites, seguindo o modelo mutacional de stepwise (ou modelo de mutação por
passos) (Kimura & Ohta, 1978; Valdes et al., 1993). O programa SPAGeDI 1.3d (Hardy
& Vekemans, 2002) foi usado para testar se existe diferença significativa entre FST e
RST, por meio de teste de permutação.
A análise de variância das frequências alélicas, segundo Weir & Cockerham
(1984), com o cálculo das estimativas da estrutura genética populacional também foi
realizada com o auxílio do programa Fstat 2.9.3.2, assim como o RST. O padrão de
divergência genética entre as subpopulações, definido pelo método de UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean), foi gerado pelo programa
77
NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 2000), a partir da medida de distância genética de Nei (1972). A
consistência do agrupamento (valores dos nós, os quais representam sua confiança), foi
calculada pela técnica de bootstrapping por meio do programa BOOD 3.03 (Coelho,
2000), usando 100.000 bootstraps. A matriz de distância genética de Nei (1972) usada
na análise de agrupamento também foi calculada pelo programa BOOD 3.03.
A análise da estrutura genética espacial das subpopulações foi realizada
mediante técnicas de autocorrelação espacial e teste de Mantel (Mantel, 1967). O teste
de Mantel simples foi realizado pelo programa SAM (Spatial Analysis in
Macroecology) (Rangel et al., 2006; 2010), a partir de uma matriz de FST par-a-par
linearizado (FST/1-FST) (Rousset, 1997), calculada pelo programa GENETIX 4.05
(Belkhir et al., 2004), e uma matriz de distância geográfica entre as subpopulações,
calculada pelo programa Geographic Distance Matrix Generator 1.2.3 (Ersts, 2008). A
significância foi avaliada por teste de permutação (5.000 permutações).
O programa STRUCTURE 2.3.4 (Pritchard et al., 2000), que usa modelo de
agrupamento Bayesiano, foi utilizado para inferir o número de populações
geneticamente distintas (K). Esse modelo utiliza simulações de MCMC (Monte Carlo
via Cadeia de Markov) para estimar a associação de grupo de cada indivíduo,
assumindo equilíbrio de Hardy-Weinberg e de ligação dentro dos grupos, acasalamento
ao acaso dentro das populações e recombinação livre entre locos (Pritchard et al., 2000),
sem suposições a priori sobre os limites populacionais. Trinta corridas independentes
para cada K (1 a 23) foram realizadas para avaliar a consistência dos resultados,
utilizando o modelo de mistura (admixture model), o qual assume que cada indivíduo
pode ter ancestrais de mais de uma população, e frequências alélicas correlacionadas
entre as populações. As simulações foram feitas com um burn-in de 50.000 iterações,
para minimizar o efeito da configuração inicial, seguido por 1.000.000 iterações
MCMC. Posteriormente foi utilizado o programa STRUCTURE HARVESTER (Earl &
Vonholdt, 2012) para estimar o número mais provável de agrupamentos suportados
pelos dados (valor de K) baseado no método de Evanno (2005b).
78
5.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO
DISCUSS
VARIABILIDADE GENÉTICA
As frequências alélicas (Apêndice F) e número de alelos de cada um dos
sete locos microssatélites analisados foram representadas
representadas graficamente nas Figuras 15 e
16. O loco ED-09
09 foi o que apresentou o menor número de alelos (13 alelos) e o loco
EMBRA-14
14 foi o que apresentou o maior número de alelos (43 alelos). Em todos os
locos existiram casos de alelos com baixa frequência
frequênci (< 0,01). Pode-se
se observar que no
loco EMBRA-72
72 dois alelos com frequência expressiva apareceram,
apareceram, alelo 133 (0,52) e
alelo 109 (0,09). Nos demais locos ocorreram vários alelos com alta frequência (> 0,05).
Frequência
ED-04
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
223 227 231 235 239 243 247 251 255 261 267 273
Alelo (pb)
Frequência
ED-05
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
191 201 211 215 219 223 227 231 235 239 243 247 251 257
Alelo (pb)
79
171
175
181
251
243
247
251
259
167
163
159
155
151
147
143
139
135
131
127
121
115
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
109
Frequência
EMBRA-72
Alelo (pb)
EMBRA-210
Frequência
0.2
0.15
0.1
0.05
237
233
229
225
221
217
213
209
205
201
193
187
181
0
Alelo (pb)
ED-09
Frequência
0.4
0.3
0.2
0.1
0
207 209 211 213 215 217 219 221 223 231 233 237 239
Alelo (pb)
80
EMBRA-14
Frequência
0.15
0.1
0.05
0
99 105 111 117 123 129 135 141 147 153 159 165 171 185 213
Alelo (pb)
EMBRA-172
Frequência
0.2
0.15
0.1
0.05
171
173
175
177
181
183
185
187
189
191
193
195
197
199
201
203
207
211
0
Alelo (pb)
Figura 15. Frequências alélicas dos sete locos microssatélites analisados, estimados
para 736 indivíduos de E. dysenterica oriundos de 233 subpopulações
naturais
Número de alelos por loco
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Figura 16. Número de alelos de cada um dos sete locos microssatélites analisados,
estimados para 736
7 indivíduos de E. dysenterica
81
De um total de 192 alelos dos sete locos microssatélites avaliados, foram
encontrados 18 alelos privados em 10 subpopulações (Figura 17 e Tabela 11). Desses
alelos, quatro foram
oram encontrados na subpopulação de Gilbués – PI (GILPI). Em
E cinco
subpopulações foram encontrados dois alelos privados (Barreiras – BA, Pirapora – MG,
Silvanópolis – TO, Balneário Santo Antônio – GO e Dois Irmãos – GO) e em quatro
subpopulações foi encontrado apenas um alelo privado (Vila Boa – GO, Santa
Terezinha – GO, Faina – GO e Barra do Garça – MT). O número de alelos privados
encontrado é expressivo, sendo que a subpopulação de Gilbués – PI (GILPI) merece
considerável atenção, uma vez que apresentaram
apres
apresenta a maior parte dos alelos
privados.
Os alelos privados podem ser informativos para diversos tipos de estudos
genético-populacionais,
populacionais, em áreas como ecologia molecular e genética da conservação
(Szpiech & Rosenberg, 2011).
2011) Slatkin (1995) e Slatkin e Barton (1989) mostraram que
os alelos privados podem contribuir como indicadores de fluxo gênico, encontrando em
modelos teóricos de estrutura populacional que a ocorrência de alelos privados estava
relacionada ao número médio de migrantes trocados
trocados por geração entre populações. A
existência de alelos privados pode indicar redução de fluxo gênico e, consequentemente,
possível prejuízo para a estrutura metapopulacional.
5
4
3
2
1
0
Figura 17. Número de alelos privados (ou exclusivos) por subpopulação
população obtidos de um
total de 192 alelos de sete locos microssatélites em 23
2 subpopulações de E.
dysenterica
82
Tabela 11. Discriminação dos 18 alelos privados encontrados nas subpopulações de E.
dysenterica, respectivos locos, frequências e população na qual ocorrem
Loco
Alelo
Frequência
População
ED4
269
0,024
BABA
ED5
191
0,017
PIPMG
ED5
207
0,050
PIPMG
EM72
113
0,021
BABA
EM72
177
0,031
SITO
EM72
183
0,031
SITO
EM72
181
0,030
GILPI
EM72
169
0,094
BSAGO
EM72
129
0,016
VBGO
EM210
251
0,016
STGO
EM210
257
0,065
FGO
ED9
237
0,089
BSAGO
EM14
191
0,125
GILPI
EM14
195
0,188
GILPI
EM14
185
0,071
DIRGO
EM14
171
0,054
DIRGO
EM14
99
0,051
BAGMT
EM172
211
0,057
GILPI
Os resultados das análises de caracterização genética das 23 subpopulações,
estão na Tabela 12. Em média, foram analisados 32 indivíduos por subpopulação. Todos
os locos foram polimórficos, sendo que o número médio de alelos por loco variou de
4,143 (LUZMG) a 11,833 (STGO), com uma média de 8,868 alelos/loco. A riqueza
alélica (R) média foi de 5,477, sendo que o menor valor encontrado foi de 3,556 (LUZMG) e o maior foi de 6,874 (BSAGO). Pode-se observar que a maior riqueza alélica
ocorreu na subpopulação de Balneário Santo Antônio-GO, apesar do maior número de
alelos ter ocorrido na subpopulação de Santa Terezinha-GO (a Tabela 13 mostra a
riqueza alélica, por loco, em cada subpopulação). Os valores médios de
heterozigosidade esperada (He) e observada (Ho) foram, respectivamente, 0,725 e 0,610,
sendo que o menor índice de diversidade genética (He) ocorreu na subpopulação de
Bambuí-MG (0,569) e o maior ocorreu em Barreiras-BA (0,834). Esses valores indicam
que a espécie apresenta uma elevada diversidade genética para os marcadores avaliados
83
e foram maiores que os valores encontrados para a mesma espécie em estudos
anteriores. Em Telles (2000) a diversidade genética média para dez subpopulações
naturais de E. dysenterica do sudeste de Goiás foi de 0,282, sendo que esse baixo valor
se justifica em função do marcador genético que foi utilizado (isoenzimas), que possui
polimorfismo menor do que os microssatélites. Em Zucchi (2002) a diversidade
genética média baseada em sete marcadores microssatélites para as mesmas dez
subpopulações foi menor e igual a 0,442.
Tabela 12. Caracterização genética de 23 subpopulações de E. dysenterica baseados em
sete locos microssatélites
População
FGO
STGO
MUGO
VBGO
MIMGO
BSAGO
SCNGO
BAMMG
PIPMG
BAGMT
CAMALGO
CATAGO
DIRGO
GILPI
LUZMG
NIQGO
SITO
BABA
PTUMG
BRAMG
CORMG
RVBA
PNTO
Média
n
32
32
32
32
32
32
32
32
32
41
22
33
33
36
25
34
34
25
33
33
33
33
33
32
AP
9,429
11,833
10,143
10,143
9,571
11,286
8,286
6,000
7,286
11,000
6,429
6,857
11,286
8,429
4,143
9,429
9,714
10,000
7,000
8,571
6,429
8,714
9,571
8,868
R
5,961
5,915
6,234
5,659
5,499
6,874
5,494
3,834
4,617
6,549
4,901
4,512
6,601
5,764
3,556
5,884
6,183
6,635
4,261
4,891
4,086
5,438
5,914
5,477
He
0,782
0,709
0,779
0,767
0,746
0,829
0,767
0,569
0,643
0,829
0,674
0,621
0,798
0,785
0,576
0,785
0,792
0,834
0,608
0,668
0,606
0,703
0,774
0,725
Ho
0,522
0,595
0,525
0,667
0,629
0,613
0,740
0,520
0,530
0,667
0,573
0,506
0,579
0,600
0,415
0,739
0,680
0,694
0,624
0,706
0,590
0,676
0,522
0,610
f
0,338*
0,162*
0,331*
0,133*
0,159*
0,264*
0,035 NS
0,088 NS
0,178*
0,197*
0,152 NS
0,188*
0,278*
0,237*
0,290*
0,060 NS
0,143*
0,171*
-0,027 NS
-0,058 NS
0,026 NS
0,040 NS
0,330*
0,162
n: número médio de indivíduos analisados nas subpopulações, AP: número médio de alelos por loco
polimórfico, R: riqueza alélica média, He: frequência esperada de heterozigotos, Ho: frequência observada
de heterozigotos e f: índice de fixação intrapopulacional.
Foi observada diferença significativa entre os valores da heterozigosidade
observada (Ho) e heterozigosidade esperada (He) pelo EHW para a maioria das
populações analisadas, resultando em valores de f significativos (Tabela 12). Os
84
resultados obtidos para o índice de fixação (f) para cada subpopulação variaram de 0,058 a 0,338, com um valor global de 0,162, o que indica que os acasalamentos não
ocorrem ao acaso dentro das populações (Tabela 14). As populações com menores
índices de fixação (f) (SCNGO, PTUMG, BRAMG, CORMG e RVBA) foram aquelas
consideradas sob EHW no total de locos. Entretanto, apenas a população de Brasilândia
de Minas – MG (BRAMG) de fato apresentou todos os locos em EHW (apresentou
também o menor valor de f = -0,058, observado na Tabela 12). Além disso, pode-se
observar que todos os locos se encontraram fora do EHW em pelo menos três das 23
subpopulações avaliadas (Tabela 14).
Tabela 13. Riqueza alélica (por loco e população) de 23 subpopulações de E.
dysenterica para sete locos microssatélites, corrigida pelo método de
rarefação (Hurlbert, 1971) para sete indivíduos
População/Loco ED4
ED5
EM72 EM210
ED9
EM14 EM172
FGO
4,332 6,279
3,294
7,246
4,824
9,343
6,411
STGO
7,641 6,998
1,519
7,179
3,240
8,607
6,224
MUGO
6,166 8,659
2,658
7,244
3,580
9,328
6,004
VBGO
6,444 4,284
4,893
7,898
4,655
6,210
5,231
MIMGO
4,814 6,353
3,735
5,675
4,479
7,049
6,389
BSAGO
5,191 7,587
8,278
6,862
4,857
9,582
5,759
SCNGO
6,318 5,775
4,712
7,944
4,220
7,052
2,437
BAMMG
3,474 2,437
1,909
5,182
3,345
7,359
3,130
PIPMG
2,980 5,216
2,927
6,035
3,609
6,702
4,848
BAGMT
6,102 4,486
7,210
8,554
4,833
8,802
5,857
CAMALGO
7,133 4,091
2,012
7,943
3,548
6,608
2,973
CATAGO
3,642 5,632
2,141
5,487
4,116
7,826
2,738
DIRGO
4,091 8,133
5,948
6,679
4,422 10,919
6,014
GILPI
7,049 6,236
5,902
4,525
3,867
6,351
6,416
LUZMG
2,869 2,882
1,916
6,000
2,287
5,194
3,744
NIQGO
7,330 5,391
5,763
5,478
4,806
6,716
5,704
SITO
7,775 6,003
7,314
7,157
4,628
6,469
3,937
BABA
5,366 5,499
7,599
7,838
4,495
9,077
6,568
PTUMG
4,627 4,443
1,729
6,226
3,751
5,186
3,868
BRAMG
5,343 4,690
2,770
6,741
4,099
5,616
4,978
CORMG
3,988 3,302
2,585
6,095
3,281
6,008
3,342
RVBA
2,218 5,602
4,972
6,560
3,526 10,147
5,038
PNTO
5,933 5,543
4,816
6,768
4,493
8,445
5,400
Média
5,288 5,480
4,191
6,633
4,102
7,666
4,977
Pode-se observar que todos os pares de locos estão em desequilíbrio de
ligação (Apêndice G) em pelos menos uma das populações. Vale ressaltar que a
85
população de Barra do Garça – MT (BAGMT) é a que possui o maior número de pares
de locos em desequilíbrio de ligação (14 das 21 combinações) e a população de Vila
Boa – GO (VBGO) foi a única em que nenhum par de loco se encontrou em
desequilíbrio de ligação.
Tabela 14. Teste de aderência às proporções de Hardy-Weinberg. Probabilidades
calculadas dos desvios das proporções de Hardy-Weinberg de sete locos
microssatélites em 23 subpopulações de E. dysenterica, segundo teste de
permutação
População/Loco ED4
ED5 EM72 EM210 ED9 EM14 EM172 Total
FGO
0,166 <0,001 0,166 0,854 <0,001 <0,001 0,009 <0,001
STGO
0,002 0,001 0,022 0,873 0,030 0,004 0,523 <0,001
MUGO
0,001 <0,001 <0,001 0,103 0,001 0,056 0,363 <0,001
VBGO
0,029 0,607 0,604 0,559 0,002 <0,001 0,581 <0,001
MIMGO
0,023 0,903 0,046 0,289 0,360 <0,001 0,699 <0,001
BSAGO
<0,001 <0,001 0,027 0,260 0,030 <0,001 0,149 <0,001
SCNGO
0,597 <0,001 0,990 0,214 0,919 0,172 0,802 0,142
BAMMG
0,465 0,755 1,000 0,010 0,689 <0,001 0,770 0,021
PIPMG
0,088 0,095 0,525 0,004 0,631 <0,001 0,106 <0,001
BAGMT
<0,001 <0,001 0,757 0,019 0,020 <0,001 0,733 <0,001
CAMALGO
<0,001 0,986 0,072 0,058 0,444 0,170 0,749 0,001
CATAGO
0,001 0,001 0,074 0,403 0,216 0,498 0,580 <0,001
DIRGO
0,020 0,002 0,549 0,001 <0,001 0,001 0,014 <0,001
GILPI
0,012 0,001 0,938 <0,001 0,907 <0,001 0,943 <0,001
LUZMG
<0,001 0,422 1,000 0,610 0,032 0,005 0,009 <0,001
NIQGO
0,091 0,623 1,000 0,949 0,802 <0,001 0,133 0,024
SITO
0,001 0,349 0,956 0,167 0,364 <0,001 0,443 <0,001
BABA
0,004 0,353 0,504 <0,001 0,872 <0,001 0,910 <0,001
PTUMG
<0,001 0,709 1,000 0,998 1,000 0,017 0,976 0,760
BRAMG
0,902 0,548 0,419 0,995 0,988 0,217 0,885 0,968
CORMG
0,062 0,987 0,002 0,596 0,980 0,057 0,710 0,271
RVBA
0,007 0,881 0,125 0,167 0,645 0,204 0,922 0,135
PNTO
<0,001 0,255 0,002 0,556 <0,001 <0,001 0,843 <0,001
Células em destaque: Probabilidade ≤ 0,05 (fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg). Valores baseados em
3360 permutações.
Segundo a análise de diversidade genética de Nei (1973) (Tabela 15) podese observar que a maior proporção da diversidade genética ocorre dentro das
subpopulações. Os valores de GST', corrigidos para locos microssatélites, estimados por
86
loco variaram entre 0,091 e 0,272, com um valor global de 0,162. Assim, pode-se
concluir que aproximadamente 16% da diversidade genética ocorre entre as
subpopulações, sendo que o restante dessa diversidade (1 - G ST'), ou seja, 84%, ocorre
dentro das subpopulações. Este resultado corrobora com aquele encontrado por Telles
(2000), mediante a análise de dez subpopulações da mesma espécie do sudeste do
estado de Goiás com o uso de oito locos de izoenzimas (GST = 0,164). Zucchi (2005),
analisando as mesmas subpopulações, com 54 locos de marcadores RAPD, encontrou
um valor de ϕST de 0,270, verificado 27,03% da variabilidade genética entre as
subpopulações e 72,97% dentro delas. Trindade & Chaves (2005) encontraram um valor
de ϕST de 0,086, verificado 8,6% da variabilidade genética entre as subpopulações (13
subpopulações naturais do nordeste de Goiás), usando marcadores RAPD.
Tabela 15. Diversidade Genética de Nei (1973) em 23 subpopulações de E. dysenterica,
para sete locos microssatélites
Loco
HT'
HS
DST'
G ST'
1 - G ST'
ED4
0,901
0,718
0,182
0,202
0,798
ED5
0,890
0,762
0,128
0,144
0,856
EM72
0,720
0,517
0,202
0,281
0,719
EM210
0,938
0,835
0,102
0,109
0,891
ED9
0,793
0,679
0,114
0,143
0,857
EM14
0,950
0,860
0,090
0,095
0,905
EM172
0,889
0,720
0,169
0,190
0,810
Total
0,868
0,727
0,141
0,162
0,838
HT': diversidade total (HT' = HS + DST'); HS: diversidade dentro das subpopulações; DST':
diversidade entre as subpopulações; GST': proporção da diversidade que está entre as
subpopulações (GST' = DST' / HT') e 1 - GST': proporção da diversidade que está dentro das
subpopulações.
ESTRUTURA GENÉTICA E PADRÃO ESPACIAL
O índice de fixação dentro das subpopulações (f) variou de 0,017 a 0,308
nos locos, apresentando um valor global de 0,147 (Tabela 16). Esse resultado revela que
há excesso de homozigotos em relação as esperado pelo EHW. A endogamia total (F)
variou de 0,172 a 0,428 nos locos, apresentando um valor global de 0,285, o que indica
que estas subpopulações não estão se comportando como uma grande população
87
panmítica. A divergência genética entre as subpopulações (θp = FST) variou entre 0,095 e
0,267 nos locos, apresentando um valor global de 0,161, mostrando alta diferenciação
genética entre as subpopulações avaliadas (Hartl & Clark, 2010). Esse parâmetro mede
o nível de subdivisão do conjunto de subpopulações (Futuyma, 1992) e se aproxima do
valor de GST’ (Tabela 15) da análise de Diversidade Genética de Nei (1973). A perda de
heterozigotos e o consequente excesso de homozigotos que ocorre em casos de
subdivisão é designado de Efeito Wahlund (Hartl & Clark, 2010).
Tabela 16. Análise de variância de frequências alélicas, segundo Weir & Cockerham
(1984), em 23 subpopulações de E. dysenterica, para sete locos
microssatélites
Loco
f
F
θP
ED4
0,284
0,428
0,201
ED5
0,147
0,275
0,149
EM72
0,055
0,307
0,267
EM210
0,070
0,172
0,110
ED9
0,106
0,234
0,143
EM14
0,308
0,374
0,095
EM172
0,017
0,201
0,187
Total
0,147
0,285
0,161
Limite Inferior (IC95%)
0,068
0,221
0,125
Limite Superior (IC95%)
0,230
0,352
0,202
f: índice de fixação dentro das populações; F: endogamia total; θP: divergência entre as populações locais.
O intervalo de confiança (IC) a 95% para os valores totais foram obtidos segundo o procedimento de
bootstrap sobre os locos, utilizando 5000 reamostragens.
Os valores de FST (0,161) e RST (0,205) não apresentaram diferença
significativa (p = 0,0,063, Tabela 17). Esse resultado mostra que o processo de mutação
por passos (stepwise), característico dos marcadores microssatélites (Valdes et al., 1993;
Slatkin, 1995), não contribuíram de forma significativa para a diferenciação genética
dessas subpopulações.
88
Tabela 17. Diferenciação entre 23 subpopulações de E. dysenterica, estimado por FST
global e RST global, por loco e para o total dos locos. Teste unilateral (RST
> FST)
Loco
FST
RST
p*
ED4
0,201
0,103
0,818NS
ED5
0,149
0,292
0,042NS
EM72
0,267
0,447
0,039NS
EM210
0,110
0,106
0,494NS
ED9
0,143
0,123
0,689NS
EM14
0,095
0,221
0,003*
EM172
0,187
0,142
0,729NS
Total
0,161
0,205
* Significância de p baseada em teste unilateral (RST > FST) e IC95%.
0,063NS
A alta diversidade genética entre as subpopulações de E. dysenterica
avaliadas indica a necessidade de um número grande de áreas para a conservação in
situ. Considerando os valores de FST estimados nesse trabalho e em pesquisas anteriores
para a mesma espécie, pode-se recomendar um esforço na amostragem do maior
número possível de subpopulações, mesmo que para isso seja restrita a amostragem
dentro de populações (Trindade & Chaves, 2005; Chaves & Telles, 2006).
Os valores de FST par-a-par (Apêndice H) menores que 0,05 foram
observados entre STGO e MUGO (0,028), PIPMG e BAMMG (0,038), STGO e FGO
(0,039) e entre CORMG e BRAMG (0,047), mostrando que as subpopulações de Santa
Terezinha – GO e Mutunópolis – GO revelaram a menor distânica genética observada.
Já os maiores valores de FST par-a-par foram observados entre STGO e CORMG
(0,443), STGO e BAMMG (0,441), STGO e PTUMG (0,418) e entre STGO e LUZMG
(0,405), sendo a maior distância genética encontrada entre as subpopulações de Santa
Terezinha – GO e Coromandel – MG.
A análise de agrupamento (Apêndice I) realizada segundo o método de
UPGMA, com base em valores de identidade genética de Nei (1972) (Apêndice H)
permite a visualização do padrão de divergência genética entre as 23 subpopulações de
E. dysenterica avaliadas. Pode-se observar que alguns ramos (9 grupos) foram bem
sustentados, com valores de bootstraps maiores que 50%, indicando que há uma
estrutura hierárquica entre essas populações.
89
A análise do padrão espacial (Figura 18) mostrou que a divergência genética
das 23 subpopulações avaliadas está estruturada no espaço (r = 0,427; p < 0,001). A
correlação entre as matrizes de distâncias genéticas (FST linearizado par-a-par) e
logaritmo das distâncias geográficas foi positiva e significativa (Apêndices H e J),
sugerindo processos estocásticos de divergência genética entre as subpopulações, como
o modelo de isolamento-por-distância ou stepping-stone. O correlograma de Mantel
(Figura 19) mostrou relação significativa até a segunda classe de distância, ou seja, até
aproximadamente 227 km. Detalhes das classes de distância usadas no teste de Mantel
podem ser visualizados na Tabela 18.
Figura 18. Relação entre as distâncias genéticas (FST linearizado par-a-par) e o
logaritmo das distâncias geográficas entre 23 subpopulações de E.
dysenterica. A correlação matricial (r = 0,427; p < 0,001) foi significativa,
segundo teste de Mantel utilizando-se 5.000 permutações aleatórias
90
IC (95%)
r de Pearson
Figura 19. Correlograma de Mantel (oito classes de distância) e os respectivos valores
de r (correlação de Pearson) para cada classe (r global = 0,427, p < 0,001; 5.000
permutações)
Apesar das recentes controvérsias e críticas sobre o desempenho estatístico
do teste de Mantel (Legendre & Fortin, 2010; Guillot & Rousset, 2013), esse teste é
amplamente utilizados em genética de populações para comparar matrizes de distância,
testar hipóteses sobre estruturas espaciais, temporais ou ambientais em distâncias
genéticas (Telles & Diniz-Filho, 2005). O teste de Mantel é utilizado para verificar a
correlação entre duas matrizes de distância (Figura 18) e o correlograma de Mantel é
utilizado para avaliar a estrutura da correlação (Figura 19).
Tabela 18. Classes de distâncias usadas no teste de Mantel e seus respectivos valores de
N, distâncias (ln), r e p
Classe
N por classe Distância (ln) r (correlação de Pearson)
p
1
< 0,001*
68
2,345
0,347
0,007*
2
66
5,410
0,187
0,762
3
68
5,715
-0,020
0,850
4
68
5,895
-0,011
0,057
5
74
6,095
-0,119
0,004*
6
66
6,305
-0,169
0,012
7
60
6,510
-0,155
0,056
8
68
6,835
-0,156
Total
538
0,427
< 0,001*
Teste realizado com 5.000 permutações.
Segundo Gilbert e colaboradores (Gilbert et al., 2012), o programa
STRUCTURE (Pritchard et al., 2000) (Pritchard et al. 2000) é o aplicativo mais
utilizado para inferir estrutura de populações (Gilbert et al., 2012). A análise do
91
STRUCTURE encontrou um valor de K = 2 (Figura 20), ou seja, as 23 subpopulações
de E. dysenterica avaliadas foram agrupadas em dois grupos.
Figura 20. Número de K grupos que melhor se ajusta aos dados segundo método de
Evanno (2005b)
5.4
CONCLUSÕES
i.
A diversidade genética é alta nas subpopulações de E. dysenterica;
ii.
Existe estruturação genética entre e dentro de subpopulações, com a
diferenciação genética entre subpopulações de E. dysenterica se
apresentando alta, sugerindo baixo fluxo gênico entre elas;
iii.
Existe padrão espacial na variabilidade genética encontrada nas
subpopulações de E. dysenterica, sugerindo um modelo de diferenciação
de isolamento-por-distância ou stepping-stone;
92
iv.
A diferenciação genética relativamente alta encontrada entre as
subpopulações de E. dysenterica e o elevado número de alelos privados
sugerem que a amostragem deve ser conduzida em um grande número de
populações desta espécie como estratégia de conservação.
93
6
CONCLUSÕES GERAIS
i.
A espécie E. dysenterica apresenta um sistema de cruzamento misto, com
predominância de alogamia;
ii.
Existe paternidade múltipla em frutos na espécie Eugenia dysenterica;
iii.
A população de Mimoso – GO apresenta estrutura genética espacial (EGE);
iv.
Há alta diversidade genética nas subpopulações de E. dysenterica, com base em
marcadores microssatélites;
v.
Existe estruturação genética entre e dentro de subpopulações, com a
diferenciação genética entre subpopulações de E. dysenterica se apresentando
alta, sugerindo baixo fluxo gênico entre elas;
vi.
Existe padrão espacial na variabilidade genética encontrada nas subpopulações
de E. dysenterica, sugerindo um modelo de diferenciação de isolamento-pordistância ou stepping-stone.
94
7
REFERÊNCIAS
AGUIAR, A. V.; VENCOVSKY, R.; CHAVES, L. J.; MOURA, M. F.; MORAIS, L. K.
Genetics and expected selection gain for growth traits in Eugenia dysenterica DC.
populations. Bragantia, v. 68, n. 3, p. 629-637, 2009.
ALMEIDA, D.; MARCHINI, L. C.; SODRE, G. S.; D'AVILA, M.; ARRUDA, C. M. F.
Plantas visitadas por abelhas e polinização. Piracicaba: ESALQ - Divisão de
Biblioteca e Documentação, 2003. Série Produtor Rural - Edição Especial.
ANDRADE, A. C. S.; CUNHA, R.; SOUZA, A. F.; REIS, R. B.; ALMEIDA, K. J.
Physiological and morphological aspects of seed viability of a neotropical savannah
tree, Eugenia dysenterica DC. Seed Science and Technology, v. 31, n. 1, p. 125-137,
2003.
ATCHISON, E. Chromosome numbers in the Myrtaceae. American Journal of
Botany, v. 34, n. 3, p. 159-164, 1947.
AVIDOS, M. F. D.; FERREIRA, L. T. Frutos dos Cerrados. Biotecnologia, Ciência e
Desenvolvimento, v. 3, n. 15, p. 36-41, 2000.
BARLUENGA, M.; AUSTERLITZ, F.; ELZINGA, J.; TEIXEIRA, S.; GOUDET, J.;
BERNASCONI, G. Fine-scale spatial genetic structure and gene dispersal in Silene
latifolia. Heredity, v. 106, n. 1, p. 13-24, 2011.
BARRETT, S. C. H. Mating strategies in flowering plants: the outcrossing–selfing
paradigm and beyond. Philosophical Transactions of the Royal Society of London.
(Series B: Biological Sciences), v. 358, n. 1434, p. 991-1004, 2003.
BELKHIR, K.; BORSA, P.; CHIKHI, L.; RAUFASTE, N.; BONHOMME, F.
GENETIX 4.05, Population genetics software for Windows TM. Université de
Montpellier II. Montpellier, 2004.
BOAVENTURA, Y. M. S.; MATTHES, L. A. F. Aspectos da biologia da reproducao
em plantas ornamentais cultivadas no estado de São Paulo. I- Dichorisandra thyrsiflora
mikan (Commelinaceae). Acta Botanica Brasilica, v. 1, n. 2, p. 189-199, 1987.
BREDT, A.; UIEDA, W.; PEDRO, W. A. Plantas e morcegos: na recuperação de
áreas degradadas e na paisagem urbana. Brasília: Rede de sementes do Cerrado,
2012. 273 p.
BROWN, A. H. D. Isozymes, plant population genetic structure and genetic
conservation. Theoretical and Applied Genetics, v. 52, n. 4, p. 145-157, 1978.
CABRAL, J. S. R.; SOUSA, I. D.; PEREIRA, F. D.; SILVA, F. G.; MENEZES, C. C.
E.; SANTANA, J. D. G. Cultivo in vitro de cagaiteira: Utilização de antioxidantes e
BAP. In: I Congresso de Pesquisa e Pós-Graduação do Câmpus Rio Verde do IFGoiano.
2012, Rio verde. Resumos... p. 1-3. Disponível em:
<http://rioverde.ifgoiano.edu.br/?page_id=14867>.
95
CAMILO, Y. M. V.; SOUZA, E. R. B. D.; VERA, R.; NAVES, R. V. Fenologia,
produção e precocidade de plantas de Eugenia dysenterica visando melhoramento
genético. Revista de Ciências Agrárias, v. 36, n. 2, p. 192-198, 2013.
CARNEIRO, F. S.; SEBBENN, A. M.; KANASHIRO, M.; DEGEN, B. Low
interannual variation of mating system and gene flow of Symphonia globulifera in the
Brazilian Amazon. Biotropica, v. 39, n. 5, p. 628-636, 2007.
CHARLESWORTH, B. Measures of divergence between populations and the effect of
forces that reduce variability. Molecular Biology and Evolution, v. 15, n. 5, p. 538543, 1998.
CHAVES, L. J.; TELLES, M. P. C. Cagaita. In: VIEIRA, R. F.; AGOSTINI-COSTA,
T. S.; SILVA, D. B.; FERREIRA, F. R.; SANO, S. M. (Ed.). Frutas nativas da região
centro-oeste do Brasil. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2006.
cap. 7. p. 120-134.
COCKERHAM, C. C. Analyses of gene frequencies. Genetics, v. 74, n. 4, p. 679-700,
1973.
COELHO, A. S. G. BOOD: avaliação de dendrogramas baseados em estimativas de
distâncias/similaridades genéticas através do procedimento de bootstrap (software).
Goiânia: Laboratório de Genética Vegetal, ICB-UFG, 2000.
COLLEVATTI, R. G.; BRONDANI, R. V.; GRATTAPAGLIA, D. Development and
characterization of microsatellite markers for genetic analysis of a Brazilian endangered
tree species Caryocar brasiliense. Heredity, v. 83, n. 6, p. 748-756, 1999.
COLLEVATTI, R. G.; ESTOLANO, R.; GARCIA, S. F.; HAY, J. D. Seed abortion in
the bat pollinated Neotropical tree species, Caryocar brasiliense (Caryocaraceae).
Botany, v. 87, n. 11, p. 1110-1115, 2009.
COLLEVATTI, R. G.; GRATTAPAGLIA, D.; HAY, J. D. High resolution
microsatellite based analysis of the mating system allows the detection of significant
biparental inbreeding in Caryocar brasiliense, an endangered tropical tree species.
Heredity, v. 86, n. 1, p. 60-67, 2001a.
COLLEVATTI, R. G.; GRATTAPAGLIA, D.; HAY, J. D. Population genetic structure
of the endangered tropical tree species Caryocar brasiliense, based on variability at
microsatellite loci. Molecular Ecology, v. 10, n. 2, p. 349-356, 2001b.
COLLEVATTI, R. G.; LIMA, J. S.; SOARES, T. N.; TELLES, M. P. C. Spatial genetic
structure and life history traits in Cerrado tree species: inferences for conservation.
Natureza & Conservação, v. 8, n. 1, p. 54-59, 2010.
COSTA, I. R. Estudos cromossômicos em espécies de Myrtaceae Juss. no sudeste do
Brasil. 2004. 92 f. Dissertação (Mestrado: Biologia Vegetal)–Instituto de Biologia,
Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2004.
96
COSTA, T. R.; FERNANDES, O. F. L.; SANTOS, S. C.; OLIVEIRA, C. M. A.; LIÃO,
L. M.; FERRI, P. H.; PAULA, J. R.; FERREIRA, H. D.; SALES, B. H. N.; SILVA, M.
R. R. Antifungal activity of volatile constituents of Eugenia dysenterica leaf oil.
Journal of Ethnopharmacology, v. 72, p. 111-117, 2000.
CRUZ, C. D.; FERREIRA, F. M.; PESSONI, L. A. Biometria aplicada ao estudo da
genética da diversidade. Viçosa: Independente, 2011. 620 p.
DEFAVARI, G. R.; TARAZI, R.; MORENO, M. A.; FERRAZ, E. M.; GANDARA, F.
B.; KAGEYAMA, P. Y. Estrutura genética espacial intrapopulacional de Hymenaea
stigonocarpa Mart. Ex Hayne na Estação Ecológica de Itirapina, SP. Spatial genetic
structure of Hymenaea stigonocarpa Mart. Ex Hayne in the Ecological Station of
Itirapina, SP. Scientia Forestalis, Piracicaba, v. 37, n. 81, p. 89-98, 2009.
DEGEN, B.; CARON, H.; BANDOU, E.; MAGGIA, L.; CHEVALLIER, M. H.;
LEVEAU, A.; KREMER, A. Fine-scale spatial genetic structure of eight tropical tree
species as analysed by RAPDs. Heredity, v. 87, n. 4, p. 497-507, 2001.
DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of
fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, v. 19, n. 1, p. 11-15, 1987.
EARL, D. A.; VONHOLDT, B. M. STRUCTURE HARVESTER: a website and
program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method.
Conservation Genetics Resources, v. 4, n. 2, p. 359-361, 2012.
EPPERSON, B. K. Geographical Genetics. Princeton: Princeton University Press,
2003. 372 p.
ERSTS, P. J. American Museum of Natural History, Center for Biodiversity and
Conservation. Geographic Distance Matrix Generator(version 1.2.3). 2008.
Disponível em: <http://biodiversityinformatics.amnh.org/open_source/gdmg>. Acesso
em: 19 dez. 2013.
EVANNO, G.; MADEC, L.; ARNAUD, J. F. Multiple paternity and postcopulatory
sexual selection in a hermaphrodite: what influences sperm precedence in the garden
snail Helix aspersa? Molecular Ecology, v. 14, n. 3, p. 805-812, 2005a.
EVANNO, G.; REGNAUT, S.; GOUDET, J. Detecting the number of clusters of
individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology,
v. 14, n. 8, p. 2611-2620, 2005b.
EXCOFFIER, L.; SMOUSE, P. E.; QUATTRO, J. M. Analysis of molecular variance
inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human
mitochondrial DNA restriction data. Genetics, v. 131, n. 2, p. 479-491, 1992.
FALEIRO, F. G.; FARIAS NETO, A. L. (Ed.). Savanas: desafios e estratégias para o
equilíbrio entre sociedade, agronegócio e recursos naturais. Planaltina: Embrapa
Cerrados, 2008. 1198 p.
97
FERREIRA, M. B.; CUNHA, L. H. S. Dispersão de plantas lenhosas de cerrado germinação e desenvolvimento. Informe Agropecuário, v. 6, p. 27-32, 1980.
FLINT-GARCIA, S. A.; THORNSBERRY, J. M.; BUCKLER IV, E. S. Structure of
Linkage Disequilibrium in Plants. Annual Review of Plant Biology, v. 54, n. 1, p. 357374, 2003.
FORZZA, R. C.; BAUMGRATZ, J. F. A.; BICUDO, C. E. M.; CANHOS, D. A. L.;
CARVALHO, A. A.; COELHO, M. A. N.; COSTA, A. F.; COSTA, D. P.; HOPKINS,
M. G.; LEITMAN, P. M. New Brazilian floristic list highlights conservation challenges.
BioScience, v. 62, n. 1, p. 39-45, 2012.
FRANCO, G. Tabela de composição química dos alimentos. 9 ed. São Paulo:
Atheneu, 1992. 307 p.
FRANKHAM, R.; BALLOU, J. D.; BRISCOE, D. A. Fundamentos de genética da
conservação. Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética, 2008. 280 p.
FRYXELL, P. A. Mode of reproduction of higher plants. The Botanical Review, v. 23,
n. 3, p. 135-233, 1957.
FUTUYMA, D. J. Biologia evolutiva. 2 ed. Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de
Genética, 1992. 646 p.
GAUER, L.; CAVALLI-MOLINA, S. Genetic variation in natural populations of maté
(Ilex paraguariensis A. St.-Hil., Aquifoliaceae) using RAPD markers. Heredity, v. 84,
n. 6, p. 647-656, 2000.
GILBERT, K. J.; ANDREW, R. L.; BOCK, D. G.; FRANKLIN, M. T.; KANE, N. C.;
MOORE, J.-S.; MOYERS, B. T.; RENAUT, S.; RENNISON, D. J.; VEEN, T.
Recommendations for utilizing and reporting population genetic analyses: the
reproducibility of genetic clustering using the program STRUCTURE. Molecular
Ecology, v. 21, n. 20, p. 4925-4930, 2012.
GOODWILLIE, C.; KALISZ, S.; ECKERT, C. G. The evolutionary enigma of mixed
mating systems in plants: occurrence, theoretical explanations, and empirical evidence.
Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics, v. 36, p. 47-79, 2005.
GOUDET, J. FSTAT: a computer package for PCs which estimates and tests gene
diversities and differentiation statistics from codominant genetic markers (version
2.9.3.2). Lausanne: University of Lausanne, Department of Ecology & Evolution, 2002.
Disponível em: <http://www2.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm>. Acesso em: 25 set.
2011.
GOVINDARAJU, D. R. Variation in gene flow levels among predominantly selfpollinated plants. Journal of Evolutionary Biology, v. 2, n. 3, p. 173-181, 1989.
GRESSLER, E.; PIZO, M. A.; MORELLATO, L. P. C. Polinização e dispersão de
sementes em Myrtaceae do Brasil. Revista Brasileira de Botânica, v. 29, n. 4, p. 509530, 2006.
98
GUILLOT, G.; ROUSSET, F. Dismantling the Mantel tests. Methods in Ecology and
Evolution, v. 4, n. 4, p. 336-344, 2013.
GUO, S. W.; THOMPSON, E. A. Performing the exact test of Hardy-Weinberg
proportion for multiple alleles. Biometrics, v. 48, p. 361-372, 1992.
GUSSON, E.; SEBBENN, A. M.; KAGEYAMA, P. Y. Diversidade e estrutura genética
espacial em duas populações de Eschweilera ovata. Scientia Forestalis, n. 67, p. 123135, 2005.
GUSSON, E.; SEBBENN, A. M.; KAGEYAMA, P. Y. Sistema de reprodução em
populações de Eschweilera ovata (Cambess.) Miers. Revista Árvore, v. 30, n. 4, p.
491-502, 2006.
HAMRICK, J. L. Plant population genetics and evolution. American Journal of
Botany, v. 69, n. 10, p. 1685-1693, 1982.
HARDY, O. J.; MAGGIA, L.; BANDOU, E.; BREYNE, P.; CARON, H.;
CHEVALLIER, M. H.; DOLIGEZ, A.; DUTECH, C.; KREMER, A.; LATOUCHEHALLE, C. Fine-scale genetic structure and gene dispersal inferences in 10 Neotropical
tree species. Molecular Ecology, v. 15, n. 2, p. 559-571, 2006.
HARDY, O. J.; VEKEMANS, X. SPAGeDi: a versatile computer program to analyse
spatial genetic structure at the individual or population levels. Molecular Ecology
Notes, v. 2, n. 4, p. 618-620, 2002.
HARTL, D. L. Princípios de Genética de População. 3 ed. Ribeirão Preto: FUNPEC
Editora, 2008. 217 p.
HARTL, D. L.; CLARK, A. G. Princípios de genética de populações. 4 ed. Porto
Alegre: Artmed, 2010. 659 p.
HEDRICK, P. W. A standardized genetic differentiation measure. Evolution, v. 59, n.
8, p. 1633-1638, 2005.
HOLSINGER, K. E. Reproductive systems and evolution in vascular plants.
Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 97, n. 13, p. 7037-7042, 2000.
HOLSINGER, K. E.; WEIR, B. S. Genetics in geographically structured populations:
defining, estimating and interpreting FST. Nature Reviews Genetics, v. 10, n. 9, p. 639650, 2009.
HURLBERT, S. H. The nonconcept of species diversity: a critique and alternative
parameters. Ecology, v. 52, n. 4, p. 577-586, 1971.
JANZEN, D. H. A note on optimal mate selection by plants. American Naturalist, v.
111, n. 978, p. 365-371, 1977.
99
JORGE, N.; MORENO, D. M.; BERTANHA, B. J. Eugenia dysenterica DC: actividad
antioxidante, perfil de ácidos grasos y determinación de tocoferoles. Revista Chilena
de Nutrición, v. 37, n. 2, p. 208-214, 2010.
JOST, L. O. U. GST and its relatives do not measure differentiation. Molecular Ecology,
v. 17, n. 18, p. 4015-4026, 2008.
KALINOWSKI, S. T.; TAPER, M. L.; MARSHALL, T. C. Revising how the computer
program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity
assignment. Molecular Ecology, v. 16, n. 5, p. 1099-1106, 2007.
KALTZ, O.; SHYKOFF, J. A. Male and female Silene latifolia plants differ in percontact risk of infection by a sexually transmitted disease. Journal of Ecology, v. 89, n.
1, p. 99-109, 2001.
KARASAWA, M. M. G. Diversidade reprodutiva de plantas. Ribeirão Preto:
Sociedade Brasileira de Genética – SBG, 2009. 113 p.
KIMURA, M.; CROW, J. F. The number of alleles that can be maintained in a finite
population. Genetics, v. 49, n. 4, p. 725-738, 1964.
KIMURA, M.; OHTA, T. Stepwise mutation model and distribution of allelic
frequencies in a finite population. Proceedings of the National Academy of Sciences,
v. 75, n. 6, p. 2868-2872, 1978.
LEGENDRE, P.; FORTIN, M.-J. Comparison of the Mantel test and alternative
approaches for detecting complex multivariate relationships in the spatial analysis of
genetic data. Molecular Ecology Resources, v. 10, n. 5, p. 831-844, 2010.
LEWONTIN, R. C. The interaction of selection and linkage. II. Optimum models.
Genetics, v. 50, n. 4, p. 757-782, 1964.
LIMA, J. S. Diversidade genética e estrutura espacial intrapopulacional em
Tibouchina papyrus (Pohl) Toledo utilizando marcadores microssatélites. 2011. 64
f. Dissertação (Mestrado em Ecologia e Evolução)–Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2011.
LIMA, T. B.; SILVA, O. N.; OLIVEIRA, J. T. A.; VASCONCELOS, I. M.;
SCALABRIN, F. B.; ROCHA, T. L.; GROSSI-DE-SÁ, M. F.; SILVA, L. P.;
GUADAGNIN, R. V.; QUIRINO, B. F.; CASTRO, C. F. S.; LEONARDECZ, E.;
FRANCO, O. L. Identification of E. dysenterica laxative peptide: A novel strategy in
the treatment of chronic constipation and irritable bowel syndrome. Peptides, v. 31, n.
8, p. 1426-1433, 2010.
LOISELLE, B. A.; SORK, V. L.; NASON, J.; GRAHAM, C. Spatial genetic structure
of a tropical understory shrub, Psychotria officinalis (Rubiaceae). American Journal of
Botany, v. 82, n. 11, p. 1420-1425, 1995.
100
LOPES, R.; BRUCKNER, C. H.; LOPES, M. T. G. Estimação da taxa de cruzamento
da aceroleira com base em dados isoenzimáticos. Pesquisa Agropecuária Brasileira,
v. 37, n. 3, p. 321-327, 2002.
LOVELESS, M. D.; HAMRICK, J. L. Ecological determinants of genetic structure in
plant populations. Annual Review of Ecology and Systematics, v. 15, p. 65-95, 1984.
MALÉCOT, G. Heterozygosity and relationship in regularly subdivided populations.
Theoretical Population Biology, v. 8, n. 2, p. 212-241, 1975.
MANTEL, N. The detection of disease clustering and a generalized regression
approach. Cancer Research, v. 27, n. 2 Part 1, p. 209-220, 1967.
MARSHALL, T.; SLATE, J.; KRUUK, L.; PEMBERTON, J. Statistical confidence for
likelihood-based paternity inference in natural populations. Molecular Ecology, v. 7, n.
5, p. 639-655, 1998.
MARTINOTTO, C. Cultivo in vitro e aspectos morfofisiológicos de cagaiteira
(Eugenia dysenterica DC.). 2004. 84 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia:
Fisiologia Vegetal)–Escola Superior de Agricultura de Lavras, Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 2004.
MARTINOTTO, C.; PAIVA, R.; SANTOS, B. R.; SOARES, F. P.; NOGUEIRA, R. C.;
SILVA, A. Efeito da escarificação e luminosidade na germinação in vitro de sementes
de cagaiteira (Eugenia dysenterica DC.). Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 31, n. 6,
p. 1668-1671, 2007.
MARTINOTTO, C.; PAIVA, R.; SOARES, F. P.; SANTOS, B. R.; NOGUEIRA, R. C.
Cagaiteira (Eugenia dysenterica DC.). Lavras: Editora UFLA, 2008. 21 p. Boletim
Técnico nº 78.
MARTINS, K.; CHAVES, L.; BUSO, G.; KAGEYAMA, P. Mating system and finescale spatial genetic structure of Solanum lycocarpum St.Hil. (Solanaceae) in the
Brazilian Cerrado. Conservation Genetics, v. 7, n. 6, p. 957-969, 2006.
MARTINS, P. S. Estrutura populacional, fluxo gênico e conservação in situ. IPEF,
Piracicaba, v. 35, p. 71-78, 1987.
MEDEIROS, A. C. B. Fluxo de pólen e estrutura genética espacial em uma
população de Tabebuia aurea (Bignoniaceae) na estação ecológica de Águas
Emendadas, DF. 2010. 124 f. Tese (Doutorado: Ciências Genômicas e Biotecnologia)–
Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília, Brasília, 2010.
MITCHELL, R. J.; KARRON, J. D.; HOLMQUIST, K. G.; BELL, J. M. Patterns of
multiple paternity in fruits of Mimulus ringens (Phrymaceae). American Journal of
Botany, v. 92, n. 5, p. 885-890, 2005.
MOREIRA, P. A.; FERNANDES, G. W.; COLLEVATTI, R. G. Fragmentation and
spatial genetic structure in Tabebuia ochracea (Bignoniaceae) a seasonally dry
Neotropical tree. Forest Ecology and Management, v. 258, n. 12, p. 2690-2695, 2009.
101
MORENO, M. A. Estrutura genética e diversidade clonal de jatobá-do-cerrado
(Hymenaea stigonocarpa Mart. ex Hayne) em duas populações no Cerrado do
Estado de São Paulo. 2009. Dissertação (Mestrado em Recursos Florestais:
Conservação de Ecossistemas Florestais)–Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2009.
MORI, S. A.; BOOM, B. M.; CARVALINO, A. M.; SANTOS, T. S. Ecological
importance of Myrtaceae in an eastern Brazilian wet forest. Biotropica, p. 68-70, 1983.
MOURA, N. F.; CHAVES, L. J.; VENCOVSKY, R.; NAVES, R. V.; AGUIAR, A. V.;
MOURA, M. F. Genetic structure of mangaba (Hancornia speciosa Gomes) populations
in the cerrado region of central Brazil. Bioscience Journal, v. 27, n. 3, p. 473-481,
2011.
MOURA, T. M.; SEBBENN, A. M.; CHAVES, L. J.; COELHO, A. S. G.; OLIVEIRA,
G. C. X.; KAGEYAMA, P. Y. Diversidade e estrutura genética espacial em populações
fragmentadas de Solanum spp. do Cerrado, estimadas por meio de locos microssatélites.
Scientia Forestalis, Piracicaba, v. 37, n. 82, p. p. 143-150, 2009.
MYERS, N.; MITTERMEIER, R. A.; MITTERMEIER, C. G.; DA FONSECA, G. A.
B.; KENT, J. Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature, v. 403, n. 6772,
p. 853-858, 2000.
NAGYLAKI, T. Fixation indices in subdivided populations. Genetics, v. 148, n. 3, p.
1325-1332, 1998.
NAVES, R. V. Espécies frutíferas nativas dos cerrados de Goiás: caracterização e
influências do clima e dos solos. 1999. 206 f. Tese (Doutorado em Agronomia:
Produção Vegetal)–Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia,
1999.
NAVES, R. V.; ALMEIDA NETO, J. X.; ROCHA, M. R.; BORGES, J. D.;
CARVALHO, G. C.; CHAVES, L. J.; SILVA, V. A. Determinação de características
físicas em frutos e teor de nutrientes, em folhas e no solo, de três espécies frutíferas de
ocorrência natural nos cerrados de Goiás. Pesquisa Agropecuária Tropical, v. 25, n. 2,
p. 107-114, 1995.
NEI, M. Genetic distance between populations. American Naturalist, v. 106, n. 949, p.
283-292, 1972.
NEI, M. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the
National Academy of Sciences, v. 70, n. 12, p. 3321-3323, 1973.
OHSAWA, R.; FURUYA, N.; UKAI, Y. Effect of spatially restricted pollen flow on
spatial genetic structure of an animal-pollinated allogamous plant population. Heredity,
v. 71, n. 1, p. 64-73, 1993.
OLIVEIRA, D. L. Viabilidade econômica de algumas espécies medicinas nativas do
Cerrado. Estudos, Goiânia, v. 38, n. 2, p. 301-332, 2011.
102
PAETKAU, D.; CALVERT, W.; STIRLING, I.; STROBECK, C. Microsatellite
analysis of population structure in Canadian polar bears. Molecular Ecology, v. 4, n. 3,
p. 347-354, 1995.
PEARSE, D. E.; CRANDALL, K. A. Beyond FST: analysis of population genetic data
for conservation. Conservation Genetics, v. 5, n. 5, p. 585-602, 2004.
PRITCHARD, J. K.; STEPHENS, M.; DONNELLY, P. Inference of population
structure using multilocus genotype data. Genetics, v. 155, n. 2, p. 945-959, 2000.
PROENÇA, C. E. B. Buzz pollination-Older and more widespread than we think?
Journal of Tropical Ecology, v. 8, n. 1, p. 115-120, 1992.
PROENÇA, C. E. B.; GIBBS, P. E. Reproductive biology of eight sympatric Myrtaceae
from Central Brazil. New Phytologist, p. 343-354, 1994.
RATTER, J. A.; BRIDGEWATER, S.; RIBEIRO, J. F.; DIAS, T. A. B.; SILVA, M. R.
Estudo preliminar da distribuição das espécies lenhosas da fitofisionomia cerrado
sentido restrito nos estados compreendidos pelo bioma Cerrado. Boletim do Herbário
Ezechias Paulo Heringer, v. 5, n. 1, p. 5-43, 2000.
RESENDE, I. L. M.; SANTOS, F. P.; CHAVES, L. J. Estrutura de populações de
Mauritia flexuosa L.F. (Arecaceae) de veredas conservada e antropizadas em Bela Vista
de Goiás, GO. Anais do IX Congresso de Ecologia do Brasil, São Lourenço, 2009.
REUSCH, T. B. H. Pollination in the marine realm: microsatellites reveal high
outcrossing rates and multiple paternity in eelgrass Zostera marina. Heredity, v. 85, n.
5, p. 459-464, 2000.
REYNOLDS, J.; WEIR, B. S.; COCKERHAM, C. C. Estimation of the coancestry
coefficient: basis for a short-term genetic distance. Genetics, v. 105, n. 3, p. 767, 1983.
RIBEIRO, J. F.; DE OLIVEIRA, M. C.; GULIAS, A. P. S. M.; FAGG, J. M. F.;
AQUINO, F. G. Usos Múltiplos da Biodiversidade no Bioma Cerrado: estratégia
sustentável para a sociedade, o agronegócio e os recursos naturais. In: FALEIRO, F. G.;
FARIAS NETO, A. L. (Ed.). Savanas: desafios e estratégias para o equilíbrio entre
sociedade, agronegócio e recursos naturais. Planaltina: Embrapa Cerrados, 2008. cap.
11. p. 337-360.
RIBEIRO, J. F.; WALTER, B. M. T. Fitofisionomias do Bioma Cerrado. In: SANO, S.
M.; ALMEIDA, S. P. (Ed.). Cerrado: ambiente e flora. Planaltina: EMBRAPACPAC, 1998. p. 87-166.
RIBEIRO, R. A.; RODRIGUES, F. M. Genética da conservação em espécies vegetais
do Cerrado. Revista de Ciências Médicas e Biológicas, v. 5, n. 3, p. 253-260, 2006.
RITLAND, K. Correlated matings in the partial selfer Mimulus guttatus. Evolution, v.
43, n. 4, p. 848-859, 1989.
103
RITLAND, K. A series of FORTRAN computer programs for estimating plant mating
systems. Journal of Heredity, v. 81, n. 3, p. 236-237, 1990.
RITLAND, K. Marker-inferred relatedness as a tool for detecting heritability in nature.
Molecular Ecology, v. 9, n. 9, p. 1195-1204, 2000.
RITLAND, K.; JAIN, S. A model for the estimation of outcrossing rate and gene
frequencies using n independent loci. Heredity, v. 47, n. 1, p. 35-52, 1981.
ROCHA, M. S.; FIGUEIREDO, R. W.; ARAÚJO, M. A. M.; MOREIRA-ARAÚJO, R.
S. R. Caracterização físico-química e atividade antioxidante (in vitro) de frutos do
cerrado piauiense. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 35, n. 4, p. 933-941, 2013.
RODRIGUES, E. B. Sistema reprodutivo e fluxo gênico via pólen em uma coleção
de germoplasma de Eugenia dysenterica DC. 2012. 80 f. Dissertação (Mestrado em
Genética e Melhoramento de Plantas)–Escola de Agronomia e Engenharia de
Alimentos, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2012.
ROESLER, R.; MALTA, L. G.; CARRASCO, L. C.; HOLANDA, R. B.; SOUZA, C.
A. S.; PASTORE, G. M. Atividade Antioxidante de frutas do cerrado. Ciência e
Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 27, n. 1, p. 53-60, 2007.
ROHLF, F. NTSYS: Numerical Taxonomy and Multivariate analysis System (version
2.1). Exeter Software-Applied Biostatistic Inc., New York, 2000.
ROUSSET, F. Genetic differentiation and estimation of gene flow from F-statistics
under isolation by distance. Genetics, v. 145, n. 4, p. 1219-1228, 1997.
ROUSSET, F. Dispersal estimation: Demystifying Moran's I. Heredity, v. 100, n. 3, p.
231-232, 2008.
RYMAN, N.; LEIMAR, O. GST is still a useful measure of genetic differentiation — a
comment on Jost's D. Molecular Ecology, v. 18, n. 10, p. 2084-2087, 2009.
SALOMÃO, A. N.; ALLEM, A. C. Polyembryony in angiospermous trees of the
Brazilian Cerrado and Caatinga vegetation. Acta Botanica Brasilica, v. 15, n. 3, p. 369378, 2001.
SAMPSON, J. F. Multiple paternity in Eucalyptus rameliana (Myrtaceae). Heredity, v.
81, n. 3, p. 349-355, 1998.
SANETRA, M.; CROZIER, R. H. Patterns of population subdivision and gene flow in
the ant Nothomyrmecia macrops reflected in microsatellite and mitochondrial DNA
markers. Molecular Ecology, v. 12, n. 9, p. 2281-2295, 2003.
SANO, S. M.; FONSECA, C. E. L.; RIBEIRO, J. F.; OGA, F. M.; LUIZ, A. J. B.
Folhação, floração, frutificação e crescimento inicial da cagaiteira em Panaltina, DF.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 30, n. 1, p. 5-14, 1995.
104
SEBBENN, A. M. Análises de genética de populações em espécies arbóreas. 2005.
157 p.
SHA, Q.; ZHANG, S. A test of Hardy-Weinberg equilibrium in structured populations.
Genetic Epidemiology, v. 35, n. 7, p. 671-678, 2011.
SILVA, C. S. P.; PROENÇA, C. E. B. Flora medicinal nativa do bioma Cerrado
catalogada por estudos etnobotânicos no estado de Goiás, Brasil. Revista Anhanguera,
v. 8, n. 1, p. 67-88, 2007.
SILVA, J. V.; OLIVEIRA, R. J.; VIEIRA, L. S.; SILVA, M. L. Domesticação florestal:
técnicas, aspectos avaliados, propagação de espécies e sua importância para a
manutenção da biodiversidade. Revista Agrogeoambiental, v. 2, n. 2, p. 26-34, 2010.
SILVA, R. S. M.; CHAVES, L. J.; NAVES, R. V. Caracterização de frutos e árvores de
cagaita (Eugenia dysenterica DC.) no sudeste do Estado de Goiás, Brasil. Revista
Brasileira de Fruticultura, v. 23, n. 2, p. 330-334, 2001.
SLATKIN, M. Estimating levels of gene flow in natural populations. Genetics, v. 99, n.
2, p. 323-335, 1981.
SLATKIN, M. Gene Flow in Natural Population. Annual Review of Ecology and
Systematics, v. 16, p. 393-430, 1985.
SLATKIN, M. A measure of population subdivision based on microsatellite allele
frequencies. Genetics, v. 139, n. 1, p. 457-462, 1995.
SLATKIN, M.; BARTON, N. H. A comparison of three indirect methods for estimating
average levels of gene flow. Evolution, v. 43, n. 7, p. 1349-1368, 1989.
SOARES, T. N.; CHAVES, L. J.; TELLES, M. P. C.; DINIZ-FILHO, J. A. F.;
RESENDE, L. V. Distribuição espacial da variabilidade genética intrapopulacional de
Dipteryx alata. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 43, n. 9, p. 1151-1158,
2008.
SOKAL, R. R. Testing statistical significance of geographic variation patterns.
Systematic Zoology, v. 28, n. 2, p. 227-232, 1979.
SOUZA, E. R. B.; NAVES, R. V.; BORGES, J. D.; VERA, R.; FERNANDES, E. P.;
SILVA, L. Fenologia de cagaiteira (Eugenia dysenterica DC.) no estado de Goiás.
Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 30, n. 4, p. 1009-1014, 2008.
SPITZE, K. Population structure in Daphnia obtusa: quantitative genetic and allozymic
variation. Genetics, v. 135, n. 2, p. 367-374, 1993.
STANTON, M. L.; SNOW, A. A.; HANDEL, S. N. Floral evolution: attractiveness to
pollinators increases male fitness. Science, v. 232, n. 4758, p. 1625-1627, 1986.
SZPIECH, Z. A.; ROSENBERG, N. A. On the size distribution of private microsatellite
alleles. Theoretical Population Biology, v. 80, n. 2, p. 100-113, 2011.
105
TEIXEIRA, S.; BERNASCONI, G. High prevalence of multiple paternity within fruits
in natural populations of Silene latifolia, as revealed by microsatellite DNA analysis.
Molecular Ecology, v. 16, n. 20, p. 4370-4379, 2007.
TELLES, M. P. C. Diversidade genética e estrutura populacional de cagaiteira
(Eugenia dysenterica DC.) do sudeste de Goiás. 2000. 129 f. Dissertação (Mestrado
em Agronomia: Genética e Melhoramento de Plantas)–Escola de Agronomia e
Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2000.
TELLES, M. P. C.; DINIZ-FILHO, J. A. F. Multiple Mantel tests and isolation-bydistance, taking into account long-term historical divergence. Genetics and Molecular
Research, v. 4, n. 4, p. 742-748, 2005.
TELLES, M. P. C.; DINIZ-FILHO, J. A. F.; COELHO, A. S. G.; CHAVES, L. J.
Autocorrelação espacial das freqüências alélicas em subpopulações de cagaiteira
(Eugenia dysenterica DC., Myrtaceae) no sudeste de Goiás. Revista Brasileira de
Botânica, v. 24, n. 2, p. 145-154, 2001.
TELLES, M. P. C.; SILVA, J. B.; RESENDE, L. V.; VIANELLO, R. P.; CHAVES, L.
J.; SOARES, T. N.; COLLEVATTI, R. G. Development and characterization of new
microsatellites for Eugenia dysenterica DC (Myrtaceae). Genetics and Molecular
Research, v. 12, n. 3, p. 3124-3127, 2013.
TELLES, M. P. C.; VALVA, F. D.; BANDEIRA, L. F.; COELHO, A. S. G.
Caracterização genética de populações naturais de araticunzeiro (Annona crassiflora
Mart.-Annonaceae) no Estado de Goiás. Revista Brasileira de Botânica, v. 26, n. 1, p.
123-129, 2003a.
TELLES, M. P. D. C.; COELHO, A. S. G.; CHAVES, L. J.; DINIZ-FILHO, J. A. F.;
VALVA, F. D. A. Genetic diversity and population structure of Eugenia dysenterica
DC.("cagaiteira''–Myrtaceae) in Central Brazil: Spatial analysis and implications for
conservation and management. Conservation Genetics, v. 4, n. 6, p. 685-695, 2003b.
TELLES, M. P. D. E. C.; DA SILVA, S. P.; ROSA, J. Estrutura genética em populações
naturais de Tibouchina papyrus (pau-papel) em áreas de campo rupestre no cerrado.
Revista brasileira de Botânica, v. 33, n. 2, p. 291-300, 2010.
TEMPLETON, A. R. Genética de Populações e Teoria Microevolutiva. Ribeirão
Preto: Sociedade Brasileira de Genética, 2011.
TOMBOLATO, A. F. C.; VEIGA, R. F. A.; BARBOSA, W.; COSTA, A. A.;
BENATTI JÚNIOR, R.; PIRES, E. G. Domesticação e pré-melhoramento de plantas: I.
Ornamentais. O Agronômico, v. 56, n. 1, p. 12-14, 2004.
TRINDADE, M. D. G.; CHAVES, L. J. Genetic structure of natural Eugenia
dysenterica DC (Myrtaceae) populations in northeastern Goiás, Brazil, accessed by
morphological traits and RAPD markers. Genetics and Molecular Biology, v. 28, n. 3,
p. 407-413, 2005.
106
VALDES, A. M.; SLATKIN, M.; FREIMER, N. Allele frequencies at microsatellite
loci: the stepwise mutation model revisited. Genetics, v. 133, n. 3, p. 737-749, 1993.
VEKEMANS, X.; HARDY, O. New insights from fine-scale spatial genetic structure
analyses in plant populations. Molecular Ecology, v. 13, n. 4, p. 921-935, 2004.
VIEIRA, F. A.; CARVALHO, D.; HIGUCHI, P.; MACHADO, E. L. M.; SANTOS, R.
M. Spatial pattern and fine-scale genetic structure indicating recent colonization of the
palm Euterpe edulis in a Brazilian Atlantic forest fragment. Biochemical genetics, v.
48, n. 1, p. 96-103, 2010.
VILELA, R. C. F.; ASSIS, J. G. D. A.; NÓBREGA FILHO, L. N.; VIANA, B. F.
Sistema reprodutivo e diversidade genética de quatro espécies de Myrciaria (Myrtaceae,
jabuticabeiras). Acta Botanica Brasilica, v. 26, n. 4, p. 727-734, 2012.
WAGNER, H. W.; SEFC, K. M. Identity 1.0. Centre for Applied Genetics University of Agricultural Sciences Vienna, p. 1-5, 1999.
WAITS, L. P.; LUIKART, G.; TABERLET, P. Estimating the probability of identity
among genotypes in natural populations: cautions and guidelines. Molecular Ecology,
v. 10, n. 1, p. 249-256, 2001.
WARD, M.; DICK, C. W.; GRIBEL, R.; LOWE, A. J. To self, or not to self… A
review of outcrossing and pollen-mediated gene flow in neotropical trees. Heredity, v.
95, n. 4, p. 246-254, 2005.
WEIR, B. S. Genetic data analysis II. Sunderland: Sinauer Associates, 1996. 445 p.
WEIR, B. S.; COCKERHAM, C. C. Estimating F-statistics for the analysis of
population structure. Evolution, v. 38, n. 6, p. 1358-1370, 1984.
WRIGHT, J. W.; MEAGHER, T. R. Selection on floral characters in natural Spanish
populations of Silene latifolia. Journal of Evolutionary Biology, v. 17, n. 2, p. 382395, 2004.
WRIGHT, S. Systems of mating. V. General considerations. Genetics, v. 6, n. 2, p. 167178, 1921.
WRIGHT, S. Isolation by distance. Genetics, v. 28, n. 2, p. 114-138, 1943.
WRIGHT, S. The genetical structure of populations. Annals of Eugenics, London, v.
15, n. 1, p. 323-354, 1951.
ZUCCHI, M. I. Análise da estrutura genética de Eugenia dysenterica DC utilizando
marcadores RAPD e SSR. 2002. 130 f. Tese (Doutorado em Agronomia: Genética e
Melhoramento de Plantas)–Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz,
Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2002.
ZUCCHI, M. I.; BRONDANI, R. P. V.; PINHEIRO, J. B.; BRONDANI, C.;
VENCOVSKY, R. Transferability of microsatellite markers from Eucalyptus spp. to
107
Eugenia dysenterica (Myrtaceae family). Molecular Ecology Notes, v. 2, n. 4, p. 512513, 2002.
ZUCCHI, M. I.; BRONDANI, R. P. V.; PINHEIRO, J. B.; COELHO, A. S. G.;
VENCOVSKY, R. Genetic structure and gene flow in Eugenia dysenterica DC in the
Brazilian Cerrado utilizing SSR markers. Genetics and Molecular Biology, v. 26, n. 4,
p. 449-457, 2003.
ZUCCHI, M. I.; PINHEIRO, J. B.; AGUIAR, A. V.; CHAVES, L. J.; COELHO, A. S.
G.; VENCOVSKY, R. Padrão espacial de divergência em populações de Eugenia
dysenterica DC utilizando marcadores microssatélites. Floresta e Ambiente, v. 11, n. 1,
p. 29-38, 2004.
ZUCCHI, M. I.; PINHEIRO, J. B.; CHAVES, L. J.; COELHO, A. S. G.; COUTO, M.
A.; MORAIS, L. K.; VENCOVSKY, R. Genetic structure and gene flow of Eugenia
dysenterica natural populations. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 40, n.
10, p. 975-980, 2005.
108
APÊNDICES
Apêndice A. Relação dos pares de iniciadores de regiões microssatélites utilizados e
suas principais características
Motivo
SSR*
Fluorescência
Ta (0C)**
Amplitude
SSR desenvolvidos para E. dysenterica (Telles et al., 2013)
ED-4
(GA)14
azul (6-FAM)
62
223-267
ED-5
(GA)16
amarela (NED)
59
183-257
ED-9
(AG)10
azul (6-FAM)
60
191-241
SSR desenvolvidos para Eucalyptus spp. e transferidos para E. dysenterica (Zucchi et al., 2002)
EMBRA-14
(AG)8AAC(AG)25
verde (HEX)
54
091-197
EMBRA-72
(AG)14
azul (6-FAM)
54
113-177
EMBRA-172
(GA)19
amarela (NED)
54
171-215
EMBRA-210
(TC)25
verde (HEX)
54
181-251
*SSR: marcador microssatélite ou Simple Sequence Repeat; **Ta: temperatura de anelamento.
Apêndice B. Composição dos dois multiplexes de injeção usados nas análises
Iniciador forward
Amplitude
Fluorescêcia
ED-04F
223-267
6'FAM (azul)
ED-05F
183-257
NED (amarela)
EMBRA-72F
113-177
6'FAM (azul)
EMBRA-210F
181-251
HEX (verde)
ED-09F
191-241
6'FAM (azul)
EMBRA-14F
091-197
HEX (verde)
EMBRA-172F
171-215
NED (amarela)
Multiplex
Multiplex 1
Multiplex 2
109
Apêndice C. Perfil do multiplex 1 (locos ED-04, ED-05, EMBRA-72 e EMBRA-210)
Apêndice D. Perfil do multiplex 2 (locos ED-09, EMBRA-14 e EMBRA-172)
110
Apêndice E. Número de sementes por fruto em famílias de polinização aberta de E.
dysenterica da população de Mimoso – GO
Família
Fam1
Fam2
Fam3
Fruto
N0 de sementes
Fruto 1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
1
Fruto 4
1
Fruto 5
1
Fruto 6
1
Fruto 7
1
Fruto 8
1
Fruto 9
2
Fruto 10
1
Fruto 11
2
Fruto 12
1
Fruto 13
1
Fruto 14
1
Fruto 15
2
Fruto 16
1
Fruto 1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
3
Fruto 4
2
Fruto 5
1
Fruto 6
1
Fruto 7
1
Fruto 8
1
Fruto 9
1
Fruto 1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
1
Fruto 4
1
Fruto 5
1
Fruto 6
1
Fruto 7
2
Fruto 8
2
111
Fam4
Fam5
Fruto 1
Fruto 2
Fruto 3
Fruto 4
Fruto 5
Fruto 6
Fruto 7
Fruto 8
Fruto 9
Fruto 10
Fruto 11
Fruto 12
Fruto 13
Fruto 14
Fruto 15
Fruto 16
Fruto 17
Fruto 18
Fruto 19
Fruto 20
Fruto 21
Fruto 22
Fruto 1
Fruto 2
Fruto 3
Fruto 4
Fruto 5
Fruto 6
Fruto 7
Fruto 8
Fruto 9
Fruto 10
Fruto 11
Fruto 12
Fruto 13
Fruto 14
Fruto 15
Fruto 16
Fruto 17
Fruto 18
Fruto 19
Fruto 20
Fruto 21
Fruto 22
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
112
Fam6
Fam7
Fam8
Fruto 1
Fruto 2
Fruto 3
Fruto 4
Fruto 5
Fruto 6
Fruto 1
1
1
2
1
1
1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
1
Fruto 4
1
Fruto 5
Fruto 6
Fruto 7
Fruto 8
Fruto 9
Fruto 10
Fruto 11
Fruto 12
1
1
1
2
2
2
2
2
Fruto 1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
1
Fruto 4
1
Fruto 5
1
Fruto 6
1
Fruto 7
1
Fruto 8
1
Fruto 9
1
Fruto 10
1
Fruto 11
1
Fruto 12
1
Fruto 13
1
Fruto 14
1
Fruto 15
1
Fruto 16
Fruto 17
Fruto 18
1
1
1
Fruto 19
2
Fruto 20
3
113
Fam9
Fam10
Fruto 1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
1
Fruto 4
1
Fruto 5
1
Fruto 6
1
Fruto 7
1
Fruto 8
1
Fruto 9
1
Fruto 10
1
Fruto 11
1
Fruto 12
1
Fruto 13
1
Fruto 14
1
Fruto 15
1
Fruto 16
1
Fruto 17
1
Fruto 18
2
Fruto 19
2
Fruto 20
2
Fruto 21
1
Fruto 1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
1
Fruto 4
1
Fruto 5
1
Fruto 6
1
Fruto 7
1
Fruto 8
1
Fruto 9
1
Fruto 10
1
Fruto 11
2
Fruto 12
2
Fruto 13
1
114
Fam11
Fam12
Fam13
Fruto 1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
1
Fruto 4
1
Fruto 5
1
Fruto 6
1
Fruto 7
1
Fruto 8
1
Fruto 9
1
Fruto 10
1
Fruto 11
1
Fruto 12
1
Fruto 13
1
Fruto 1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
1
Fruto 4
1
Fruto 5
1
Fruto 1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
1
Fruto 4
1
Fruto 5
1
Fruto 6
1
Fruto 7
1
Fruto 8
1
Fruto 9
1
Fruto 10
1
Fruto 11
1
Fruto 12
1
Fruto 13
1
Fruto 14
1
Fruto 15
1
Fruto 16
1
Fruto 17
1
115
Fam14
Fruto 18
Fruto 19
Fruto 20
Fruto 21
Fruto 22
Fruto 23
Fruto 24
Fruto 25
Fruto 26
Fruto 27
Fruto 28
Fruto 29
Fruto 30
Fruto 31
Fruto 32
Fruto 33
Fruto 34
Fruto 35
Fruto 36
Fruto 37
Fruto 38
Fruto 39
Fruto 1
Fruto 2
Fruto 3
Fruto 4
Fruto 5
Fruto 6
Fruto 7
Fruto 8
Fruto 9
Fruto 10
Fruto 11
Fruto 12
Fruto 13
Fruto 14
Fruto 15
Fruto 16
Fruto 17
Fruto 18
Fruto 19
Fruto 20
Fruto 21
Fruto 22
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
116
Fam15
Fam16
Fam17
Fruto 1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
1
Fruto 4
1
Fruto 5
1
Fruto 6
1
Fruto 7
1
Fruto 8
1
Fruto 9
2
Fruto 1
1
Fruto 2
1
Fruto 3
1
Fruto 4
1
Fruto 5
1
Fruto 6
1
Fruto 7
1
Fruto 8
1
Fruto 9
1
Fruto 10
1
Fruto 11
1
Fruto 1
2
Fruto 2
3
Fruto 3
2
Fruto 4
1
Fruto 5
1
Fruto 6
1
Fruto 7
1
Fruto 8
1
Fruto 9
1
Fruto 10
1
Fruto 11
1
Fruto 12
1
Fruto 13
1
Fruto 14
1
Fruto 15
2
Fruto 16
1
117
Fam18
Fam19
Fruto 17
Fruto 18
Fruto 19
Fruto 20
Fruto 21
Fruto 22
Fruto 23
Fruto 24
Fruto 25
Fruto 26
Fruto 27
Fruto 28
Fruto 29
Fruto 30
Fruto 31
Fruto 32
Fruto 33
Fruto 34
Fruto 35
Fruto 36
Fruto 37
Fruto 38
Fruto 1
Fruto 2
Fruto 3
Fruto 4
Fruto 5
Fruto 6
Fruto 7
Fruto 8
Fruto 1
Fruto 2
Fruto 3
Fruto 4
Fruto 5
Fruto 6
Fruto 7
Fruto 8
Fruto 9
Fruto 10
1
1
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Fruto 11
1
118
Fam20
TOTAL
Fruto 12
Fruto 13
Fruto 14
Fruto 15
Fruto 16
Fruto 17
Fruto 18
Fruto 19
Fruto 20
Fruto 21
Fruto 22
Fruto 23
Fruto 24
Fruto 25
Fruto 1
Fruto 2
Fruto 3
Fruto 4
Fruto 5
Fruto 6
Fruto 7
Fruto 8
Fruto 9
Fruto 10
Fruto 11
Fruto 12
Fruto 13
Fruto 14
Fruto 15
Fruto 16
Fruto 17
Fruto 18
Fruto 19
Fruto 20
Fruto 21
Fruto 22
Fruto 23
Fruto 24
Fruto 25
Fruto 26
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
345
399
119
Apêndice F. Frequência alélica dos sete locos microssatélites nas 23 subpopulações de E. dysenterica, em um total de 192 alelos
pop1 pop2 pop3 pop4 pop5 pop6 pop7 pop8 pop9 pop10 pop11 pop12 pop13 pop14 pop15 pop16 pop17 pop18 pop19 pop20 pop21 pop22 pop23 pop24
Loco: ED4
223
0,000
225
0,000
227
0,000
229
0,000
231
0,433
233
0,133
235
0,000
237
0,267
239
0,000
241
0,000
243
0,000
245
0,000
247
0,133
249
0,000
251
0,033
253
0,000
255
0,000
259
0,000
261
0,000
263
0,000
267
0,000
269
0,000
273
0,000
Loco: ED5
191
0,000
197
0,000
201
0,000
207
0,000
211
0,109
213
0,000
215
0,000
217
0,000
219
0,000
221
0,087
223
0,000
225
0,283
227
0,000
229
0,043
231
0,261
233
0,109
235
0,065
237
0,022
239
0,000
241
0,022
243
0,000
245
0,000
247
0,000
249
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,226
0,177
0,048
0,129
0,000
0,065
0,000
0,113
0,000
0,000
0,065
0,048
0,032
0,048
0,016
0,032
0,000
0,000
0,000
0,026
0,000
0,000
0,000
0,184
0,079
0,237
0,000
0,026
0,000
0,000
0,105
0,105
0,000
0,000
0,237
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,047
0,047
0,031
0,016
0,016
0,141
0,000
0,000
0,031
0,328
0,000
0,063
0,063
0,219
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,031
0,000
0,000
0,234
0,328
0,016
0,031
0,000
0,297
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,047
0,000
0,000
0,000
0,234
0,094
0,078
0,094
0,344
0,047
0,000
0,000
0,047
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,156
0,172
0,000
0,422
0,109
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,047
0,000
0,016
0,078
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,359
0,203
0,016
0,125
0,047
0,063
0,016
0,016
0,000
0,031
0,000
0,078
0,047
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,141
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,672
0,141
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,109
0,000
0,000
0,000
0,000
0,047
0,031
0,000
0,797
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,237
0,000
0,039
0,145
0,105
0,276
0,000
0,039
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,105
0,000
0,000
0,000
0,000
0,039
0,000
0,013
0,000
0,000
0,000
0,063
0,094
0,000
0,000
0,156
0,000
0,063
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,281
0,000
0,000
0,000
0,063
0,125
0,000
0,125
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,065
0,217
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,217
0,500
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,375
0,458
0,042
0,042
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,021
0,042
0,000
0,021
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,045
0,227
0,030
0,000
0,061
0,258
0,091
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,045
0,015
0,000
0,030
0,136
0,030
0,000
0,000
0,000
0,000
0,030
0,214
0,000
0,000
0,000
0,119
0,000
0,000
0,000
0,667
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,132
0,176
0,015
0,176
0,088
0,000
0,029
0,000
0,000
0,000
0,088
0,059
0,044
0,162
0,029
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,017
0,138
0,172
0,034
0,069
0,121
0,000
0,103
0,000
0,000
0,000
0,000
0,172
0,000
0,034
0,086
0,017
0,000
0,000
0,017
0,000
0,000
0,017
0,000
0,214
0,167
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,381
0,000
0,000
0,048
0,000
0,000
0,000
0,000
0,071
0,000
0,000
0,000
0,095
0,024
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,152
0,000
0,000
0,318
0,394
0,030
0,000
0,045
0,015
0,000
0,000
0,000
0,000
0,030
0,000
0,000
0,000
0,000
0,076
0,015
0,000
0,000
0,091
0,015
0,000
0,030
0,606
0,015
0,030
0,000
0,045
0,015
0,015
0,000
0,000
0,000
0,045
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,015
0,000
0,000
0,045
0,061
0,000
0,000
0,712
0,106
0,000
0,000
0,015
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,030
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,036
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,875
0,089
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,185
0,093
0,259
0,000
0,000
0,000
0,000
0,056
0,000
0,074
0,000
0,000
0,204
0,000
0,130
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,017
0,000
0,000
0,017
0,000
0,017
0,150
0,017
0,050
0,150
0,167
0,250
0,033
0,083
0,000
0,050
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,125
0,000
0,000
0,063
0,156
0,125
0,031
0,000
0,094
0,031
0,156
0,000
0,063
0,063
0,063
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,533
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,183
0,017
0,000
0,000
0,150
0,033
0,083
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,194
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,081
0,290
0,000
0,113
0,065
0,113
0,113
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,094
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,078
0,469
0,000
0,078
0,063
0,109
0,063
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,050
0,050
0,000
0,000
0,133
0,050
0,183
0,050
0,050
0,150
0,150
0,117
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,078
0,000
0,000
0,000
0,047
0,031
0,344
0,203
0,203
0,000
0,000
0,016
0,047
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,391
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,578
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,017
0,017
0,000
0,050
0,217
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,033
0,067
0,500
0,067
0,000
0,000
0,017
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,017
0,000
0,000
0,000
0,000
0,041
0,000
0,027
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,257
0,365
0,257
0,027
0,000
0,000
0,000
0,027
0,000
0,000
0,000
0,000
0,048
0,000
0,190
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,452
0,262
0,000
0,000
0,048
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,136
0,000
0,227
0,023
0,023
0,000
0,000
0,000
0,000
0,023
0,409
0,000
0,045
0,045
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,068
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,063
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,156
0,125
0,094
0,188
0,063
0,031
0,094
0,125
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,034
0,103
0,086
0,000
0,086
0,000
0,345
0,103
0,172
0,000
0,000
0,000
0,069
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,286
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,595
0,000
0,119
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,182
0,000
0,000
0,000
0,045
0,000
0,000
0,242
0,273
0,000
0,182
0,030
0,015
0,000
0,030
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,047
0,000
0,000
0,156
0,000
0,000
0,000
0,406
0,016
0,109
0,047
0,063
0,000
0,125
0,000
0,016
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,318
0,000
0,000
0,000
0,045
0,068
0,023
0,000
0,341
0,114
0,045
0,000
0,000
0,000
0,000
0,045
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,000
0,015
0,212
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,045
0,515
0,136
0,061
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,061
0,394
0,000
0,000
0,000
0,015
0,030
0,015
0,379
0,015
0,061
0,000
0,000
0,015
0,015
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,364
0,076
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,030
0,515
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,304
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,087
0,000
0,304
0,109
0,087
0,043
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,321
0,000
0,000
0,036
0,000
0,071
0,000
0,125
0,000
0,054
0,321
0,036
0,018
0,000
0,000
0,000
0,018
0,000
0,000
120
251
0,000
255
0,000
257
0,000
Loco: EM72
109
0,600
113
0,000
115
0,300
119
0,000
121
0,000
123
0,000
127
0,033
129
0,000
131
0,000
133
0,017
135
0,017
137
0,033
139
0,000
141
0,000
143
0,000
145
0,000
147
0,000
149
0,000
151
0,000
153
0,000
155
0,000
157
0,000
159
0,000
161
0,000
163
0,000
165
0,000
167
0,000
169
0,000
171
0,000
173
0,000
175
0,000
177
0,000
181
0,000
183
0,000
251
0,000
Loco: EM210
181
0,000
183
0,032
187
0,000
191
0,000
193
0,000
195
0,000
201
0,000
203
0,274
205
0,032
207
0,210
209
0,000
211
0,000
213
0,000
215
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,016
0,000
0,000
0,000
0,016
0,017
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,065
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,963
0,000
0,019
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,019
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,676
0,000
0,059
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,265
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,500
0,250
0,031
0,031
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,031
0,078
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,781
0,000
0,016
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,063
0,016
0,016
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,734
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,094
0,031
0,000
0,000
0,016
0,000
0,016
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,047
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,094
0,000
0,016
0,000
0,141
0,016
0,031
0,000
0,016
0,047
0,047
0,234
0,109
0,031
0,016
0,016
0,031
0,063
0,094
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,453
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,078
0,266
0,078
0,000
0,000
0,063
0,000
0,063
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,141
0,859
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,125
0,797
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,016
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,138
0,000
0,000
0,000
0,200
0,050
0,188
0,063
0,063
0,000
0,013
0,013
0,150
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,075
0,000
0,000
0,000
0,013
0,000
0,038
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,023
0,000
0,000
0,909
0,068
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,906
0,031
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,047
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,000
0,000
0,015
0,000
0,015
0,591
0,061
0,000
0,000
0,030
0,000
0,015
0,000
0,000
0,030
0,045
0,030
0,015
0,000
0,000
0,030
0,061
0,000
0,000
0,015
0,000
0,030
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,409
0,076
0,015
0,000
0,000
0,000
0,045
0,030
0,045
0,227
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,091
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,000
0,000
0,030
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,060
0,000
0,000
0,000
0,020
0,920
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,455
0,000
0,091
0,000
0,000
0,000
0,121
0,000
0,015
0,061
0,000
0,091
0,121
0,000
0,015
0,015
0,015
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,172
0,000
0,281
0,078
0,031
0,000
0,047
0,000
0,000
0,109
0,000
0,031
0,031
0,000
0,000
0,000
0,016
0,125
0,000
0,000
0,000
0,016
0,031
0,000
0,031
0,000
0,000
0,021
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,104
0,188
0,021
0,000
0,000
0,000
0,208
0,125
0,000
0,083
0,021
0,104
0,021
0,042
0,063
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,939
0,015
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,045
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,818
0,000
0,000
0,106
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,000
0,000
0,045
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,258
0,697
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,030
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,040
0,000
0,000
0,000
0,040
0,540
0,000
0,000
0,000
0,000
0,220
0,040
0,000
0,020
0,000
0,000
0,020
0,040
0,040
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,516
0,047
0,172
0,016
0,000
0,156
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,047
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,422
0,063
0,016
0,000
0,078
0,000
0,000
0,000
0,017
0,017
0,000
0,000
0,000
0,000
0,466
0,034
0,000
0,000
0,034
0,000
0,017
0,000
0,109
0,000
0,000
0,266
0,047
0,016
0,000
0,000
0,016
0,031
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,219
0,000
0,016
0,047
0,125
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,172
0,016
0,016
0,156
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,188
0,000
0,000
0,000
0,125
0,250
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,063
0,000
0,031
0,000
0,000
0,188
0,094
0,078
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,113
0,000
0,161
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,313
0,125
0,000
0,125
0,000
0,031
0,063
0,000
0,016
0,000
0,000
0,063
0,000
0,000
0,025
0,000
0,088
0,200
0,000
0,000
0,000
0,050
0,038
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,275
0,100
0,025
0,100
0,000
0,000
0,000
0,000
0,025
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,148
0,056
0,000
0,222
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,025
0,000
0,000
0,000
0,000
0,050
0,225
0,075
0,000
0,175
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,225
0,000
0,000
0,075
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,071
0,214
0,000
0,214
0,000
0,000
0,071
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,078
0,359
0,016
0,000
0,109
0,000
0,000
0,000
0,048
0,000
0,177
0,000
0,000
0,000
0,177
0,177
0,016
0,032
0,065
0,000
0,065
0,063
0,229
0,000
0,021
0,146
0,000
0,000
0,104
0,000
0,167
0,000
0,000
0,063
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,150
0,117
0,017
0,167
0,017
0,017
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,000
0,000
0,242
0,121
0,000
0,061
0,000
0,136
0,000
0,000
0,061
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,136
0,258
0,000
0,106
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,348
0,000
0,022
0,174
0,000
0,000
0,000
0,000
0,109
0,000
0,043
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,100
0,100
0,000
0,000
0,000
0,150
0,000
121
217
0,000
219
0,016
221
0,000
223
0,113
225
0,048
227
0,048
229
0,000
231
0,032
233
0,097
235
0,016
237
0,000
241
0,000
243
0,016
245
0,000
247
0,000
249
0,000
251
0,000
257
0,065
259
0,000
Loco: ED9
207
0,121
209
0,241
211
0,466
213
0,034
215
0,069
217
0,000
219
0,034
221
0,034
223
0,000
231
0,000
233
0,000
237
0,000
239
0,000
Loco: EM14
99
0,000
101
0,188
103
0,016
105
0,078
107
0,031
109
0,047
111
0,000
113
0,078
115
0,000
117
0,016
119
0,031
121
0,031
123
0,063
125
0,109
127
0,063
129
0,000
131
0,094
133
0,000
135
0,047
137
0,047
0,047
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,031
0,125
0,047
0,016
0,016
0,031
0,000
0,000
0,016
0,016
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,017
0,017
0,000
0,017
0,034
0,017
0,034
0,103
0,069
0,017
0,034
0,000
0,034
0,017
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,063
0,016
0,016
0,031
0,016
0,063
0,109
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,156
0,000
0,000
0,000
0,078
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,344
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,141
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,422
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,078
0,000
0,000
0,000
0,016
0,063
0,078
0,031
0,000
0,016
0,094
0,125
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,125
0,000
0,016
0,156
0,000
0,047
0,125
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,113
0,081
0,000
0,032
0,000
0,000
0,032
0,000
0,468
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,109
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,203
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,038
0,075
0,038
0,013
0,025
0,075
0,088
0,150
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,038
0,000
0,000
0,000
0,125
0,000
0,000
0,000
0,100
0,075
0,000
0,000
0,050
0,000
0,025
0,000
0,000
0,000
0,050
0,050
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,093
0,148
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,019
0,315
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,050
0,000
0,000
0,225
0,125
0,000
0,000
0,000
0,050
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,450
0,125
0,125
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,214
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,214
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,125
0,016
0,031
0,000
0,250
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,161
0,065
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,021
0,000
0,000
0,063
0,021
0,042
0,000
0,042
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,021
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,017
0,317
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,083
0,100
0,000
0,000
0,000
0,015
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,212
0,061
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,076
0,000
0,000
0,000
0,000
0,121
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,197
0,076
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,106
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,130
0,000
0,065
0,043
0,000
0,022
0,043
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,133
0,033
0,333
0,017
0,000
0,050
0,000
0,033
0,000
0,000
0,017
0,017
0,017
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,152
0,326
0,500
0,000
0,022
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,184
0,395
0,368
0,000
0,000
0,000
0,053
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,047
0,172
0,203
0,328
0,234
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,422
0,063
0,234
0,219
0,016
0,000
0,016
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,078
0,406
0,094
0,172
0,141
0,000
0,078
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,036
0,321
0,393
0,000
0,000
0,071
0,018
0,000
0,071
0,000
0,000
0,089
0,000
0,000
0,188
0,234
0,000
0,031
0,000
0,000
0,422
0,000
0,000
0,000
0,000
0,125
0,016
0,328
0,500
0,141
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,234
0,469
0,234
0,063
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,075
0,463
0,088
0,250
0,038
0,063
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,025
0,000
0,273
0,136
0,023
0,545
0,000
0,023
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,268
0,250
0,036
0,393
0,018
0,036
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,136
0,394
0,333
0,045
0,000
0,000
0,030
0,000
0,000
0,061
0,000
0,000
0,000
0,043
0,143
0,200
0,043
0,571
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,021
0,000
0,708
0,271
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,603
0,059
0,074
0,103
0,015
0,088
0,015
0,000
0,044
0,000
0,000
0,000
0,033
0,483
0,083
0,183
0,167
0,000
0,000
0,000
0,000
0,050
0,000
0,000
0,000
0,000
0,391
0,217
0,109
0,217
0,000
0,065
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,106
0,318
0,152
0,424
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,152
0,273
0,197
0,364
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,045
0,242
0,091
0,621
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,317
0,050
0,200
0,000
0,433
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,086
0,052
0,621
0,000
0,052
0,000
0,000
0,000
0,086
0,000
0,103
0,000
0,000
0,000
0,328
0,063
0,047
0,016
0,047
0,031
0,000
0,047
0,016
0,000
0,000
0,109
0,031
0,047
0,031
0,031
0,031
0,031
0,000
0,000
0,097
0,129
0,097
0,065
0,000
0,129
0,000
0,032
0,065
0,065
0,032
0,000
0,000
0,113
0,000
0,032
0,000
0,016
0,032
0,000
0,125
0,375
0,234
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,031
0,016
0,000
0,031
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,188
0,063
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,031
0,031
0,297
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,141
0,047
0,000
0,000
0,078
0,250
0,047
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,031
0,000
0,125
0,047
0,031
0,016
0,047
0,000
0,031
0,016
0,016
0,000
0,155
0,000
0,069
0,034
0,034
0,000
0,000
0,000
0,000
0,069
0,052
0,052
0,086
0,034
0,000
0,034
0,052
0,138
0,017
0,000
0,081
0,065
0,000
0,000
0,000
0,000
0,129
0,000
0,000
0,000
0,097
0,097
0,161
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,047
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,016
0,000
0,031
0,078
0,266
0,156
0,031
0,016
0,188
0,016
0,000
0,000
0,000
0,065
0,016
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,113
0,000
0,129
0,355
0,113
0,032
0,000
0,097
0,032
0,000
0,000
0,051
0,064
0,192
0,013
0,000
0,000
0,000
0,051
0,013
0,000
0,026
0,026
0,064
0,000
0,064
0,013
0,000
0,192
0,038
0,064
0,000
0,048
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,143
0,286
0,095
0,000
0,000
0,000
0,167
0,095
0,095
0,000
0,000
0,000
0,032
0,000
0,032
0,000
0,016
0,000
0,000
0,113
0,081
0,258
0,081
0,048
0,000
0,016
0,145
0,097
0,000
0,000
0,000
0,054
0,089
0,018
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,054
0,018
0,018
0,000
0,000
0,018
0,000
0,018
0,071
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,125
0,000
0,063
0,000
0,188
0,000
0,000
0,000
0,250
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,261
0,000
0,000
0,065
0,239
0,239
0,000
0,022
0,152
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,103
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,029
0,000
0,029
0,000
0,000
0,000
0,118
0,324
0,000
0,029
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,043
0,000
0,000
0,022
0,261
0,043
0,043
0,000
0,304
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,050
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,050
0,000
0,000
0,075
0,050
0,025
0,000
0,075
0,000
0,275
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,063
0,000
0,625
0,016
0,016
0,063
0,047
0,016
0,031
0,078
0,000
0,000
0,000
0,000
0,030
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,152
0,000
0,485
0,106
0,015
0,045
0,091
0,030
0,015
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,091
0,030
0,000
0,000
0,030
0,091
0,030
0,515
0,045
0,000
0,015
0,000
0,091
0,015
0,000
0,015
0,000
0,000
0,017
0,017
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,069
0,000
0,000
0,069
0,017
0,000
0,000
0,017
0,086
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,078
0,063
0,250
0,000
0,000
0,000
0,031
0,016
0,047
0,125
122
139
0,016
141
0,000
143
0,031
145
0,016
147
0,000
149
0,000
151
0,000
153
0,000
155
0,000
157
0,000
159
0,000
161
0,000
163
0,000
165
0,000
167
0,000
169
0,000
171
0,000
175
0,000
177
0,000
185
0,000
191
0,000
195
0,000
213
0,000
Loco: EM172
171
0,000
173
0,028
175
0,000
177
0,056
181
0,000
183
0,167
185
0,250
187
0,167
189
0,000
191
0,000
193
0,056
195
0,167
197
0,111
199
0,000
201
0,000
203
0,000
207
0,000
211
0,000
0,016
0,016
0,031
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,016
0,000
0,032
0,016
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,016
0,063
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,094
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,047
0,000
0,016
0,000
0,016
0,016
0,016
0,031
0,047
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,016
0,017
0,052
0,000
0,000
0,052
0,000
0,000
0,000
0,000
0,052
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,032
0,226
0,000
0,113
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,047
0,063
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,032
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,026
0,000
0,000
0,000
0,038
0,026
0,038
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,071
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,048
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,054
0,000
0,018
0,000
0,071
0,054
0,036
0,036
0,036
0,018
0,000
0,000
0,089
0,054
0,000
0,018
0,054
0,036
0,000
0,071
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,125
0,188
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,022
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,176
0,029
0,000
0,015
0,000
0,000
0,000
0,000
0,103
0,000
0,000
0,000
0,000
0,029
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,087
0,000
0,000
0,000
0,065
0,000
0,022
0,109
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,050
0,025
0,050
0,000
0,000
0,000
0,075
0,050
0,025
0,075
0,000
0,000
0,000
0,050
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,030
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,030
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,103
0,052
0,069
0,121
0,052
0,086
0,034
0,052
0,017
0,017
0,000
0,052
0,017
0,000
0,000
0,017
0,000
0,017
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,016
0,094
0,000
0,047
0,047
0,000
0,016
0,094
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,071
0,000
0,321
0,054
0,125
0,089
0,000
0,036
0,125
0,179
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,344
0,125
0,250
0,063
0,000
0,000
0,031
0,094
0,000
0,000
0,063
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,234
0,031
0,422
0,125
0,016
0,047
0,000
0,016
0,094
0,000
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,047
0,203
0,156
0,109
0,141
0,219
0,000
0,094
0,016
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,031
0,297
0,156
0,109
0,094
0,109
0,016
0,141
0,000
0,047
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,000
0,048
0,016
0,113
0,500
0,081
0,000
0,065
0,113
0,016
0,016
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,016
0,000
0,469
0,500
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,703
0,000
0,031
0,094
0,172
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,391
0,094
0,078
0,203
0,203
0,000
0,000
0,000
0,031
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,015
0,000
0,000
0,000
0,250
0,015
0,118
0,265
0,015
0,000
0,000
0,088
0,074
0,162
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,250
0,000
0,200
0,000
0,550
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,100
0,000
0,060
0,020
0,820
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,288
0,000
0,000
0,000
0,000
0,167
0,030
0,182
0,000
0,030
0,106
0,136
0,061
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,229
0,000
0,000
0,000
0,057
0,000
0,000
0,171
0,029
0,000
0,000
0,000
0,271
0,071
0,029
0,071
0,014
0,057
0,000
0,000
0,000
0,000
0,341
0,000
0,000
0,159
0,091
0,000
0,000
0,000
0,409
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,018
0,036
0,161
0,000
0,339
0,036
0,196
0,089
0,125
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,028
0,000
0,000
0,194
0,611
0,000
0,083
0,000
0,000
0,000
0,083
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,087
0,043
0,043
0,022
0,043
0,174
0,000
0,000
0,000
0,000
0,065
0,239
0,000
0,261
0,022
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,234
0,000
0,078
0,078
0,578
0,000
0,000
0,000
0,016
0,016
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,212
0,061
0,061
0,091
0,500
0,000
0,030
0,015
0,030
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,288
0,000
0,000
0,096
0,577
0,000
0,019
0,000
0,000
0,019
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,018
0,000
0,089
0,018
0,000
0,268
0,125
0,000
0,000
0,000
0,000
0,357
0,000
0,125
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,048
0,194
0,000
0,226
0,032
0,081
0,355
0,000
0,000
0,000
0,016
0,048
0,000
123
Apêndice G. Teste de desequilíbrio de ligação para todas as possibilidades de pares de locos. Probabilidades calculadas a partir de teste
baseado em reamostragem, segundo teste de permutação
FGO
ED4/
ED5
1,000
ED4/
EM72
0,163
ED4/
EM210
1,000
ED4/
ED9
0,233
ED4/
EM14
0,016
ED4/
EM172
0,065
ED5/
EM72
0,466
ED5/
EM210
1,000
STGO
1,000
0,891
0,031
0,690
1,000
1,000
0,125
1,000
0,728
MUGO
1,000
1,000
1,000
0,650
1,000
1,000
0,352
1,000
1,000
População/Par de loco
ED5/
ED9
0,901
ED5/
EM14
1,000
ED5/
EM172
1,000
EM72/
EM210
0,827
EM72/
ED9
0,915
EM72/
EM14
0,337
EM72/
EM172
1,000
EM210/
ED9
0,795
EM210/
EM14
1,000
EM210/
EM172
1,000
ED9/
EM14
0,827
ED9/
EM172
0,161
EM14/
EM172
1,000
1,000
0,412
0,401
0,254
0,376
0,434
0,325
0,502
0,647
0,401
1,000
0,507
1,000
1,000
0,882
0,539
0,009
1,000
0,804
0,316
1,000
1,000
0,248
1,000
VBGO
0,976
0,095
0,085
1,000
0,351
0,876
0,978
0,794
0,492
0,990
0,130
0,307
0,222
0,264
0,228
1,000
0,670
1,000
0,129
0,524
0,244
MIMGO
0,390
0,400
<0,001
0,274
0,235
0,633
0,637
0,164
0,215
0,309
0,516
0,626
0,629
0,456
0,516
0,539
0,557
0,716
0,002
0,959
0,209
BSAGO
0,003
0,675
0,082
0,474
1,000
0,750
0,230
0,104
0,751
1,000
0,804
0,001
0,185
1,000
0,298
0,248
1,000
0,106
0,342
0,626
0,403
SCNGO
0,279
0,706
0,326
0,002
0,005
0,314
0,187
0,040
0,599
0,438
0,197
0,471
0,285
0,087
0,507
0,407
0,244
0,373
0,174
0,470
0,408
BAMMG
0,458
0,272
0,126
0,752
0,108
1,000
0,227
0,646
0,948
0,090
0,687
0,015
0,434
0,830
0,337
0,780
0,267
0,621
0,643
0,961
0,631
PIPMG
0,662
0,077
0,391
0,426
0,044
0,077
0,330
0,212
0,081
0,038
0,054
0,588
0,721
0,016
0,088
<0,001
0,009
0,002
0,012
0,649
0,002
BAGMT
0,368
0,053
<0,001
0,296
0,433
0,545
0,088
<0,001
0,170
0,004
0,007
0,001
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
0,001
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
CAMALGO
1,000
NA
1,000
0,828
1,000
0,149
0,487
0,004
0,838
1,000
0,362
0,429
0,623
0,430
0,898
1,000
1,000
0,552
0,237
0,229
0,680
CATAGO
0,201
0,436
0,001
0,703
0,116
0,258
0,595
0,353
0,548
1,000
0,176
0,318
0,349
0,005
0,577
0,389
0,473
0,124
0,670
0,468
0,047
DIRGO
0,290
0,011
0,175
0,832
1,000
0,834
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
0,707
0,134
1,000
0,531
0,691
1,000
1,000
1,000
0,111
1,000
GILPI
<0,001
0,018
0,052
0,013
0,254
<0,001
0,304
0,001
0,001
0,002
<0,001
0,859
0,140
0,370
<0,001
0,567
0,769
0,266
0,907
<0,001
0,333
LUZMG
0,604
0,349
1,000
0,482
0,745
0,975
0,401
1,000
0,589
0,748
0,120
0,755
0,318
0,975
0,949
0,389
1,000
1,000
0,022
0,881
1,000
NIQGO
0,691
0,009
0,001
0,690
0,378
0,001
0,802
0,688
0,225
0,019
0,246
<0,001
0,687
0,005
0,078
0,619
0,029
0,326
0,006
0,772
0,212
SITO
1,000
0,198
1,000
0,001
0,019
1,000
0,107
0,029
0,155
0,798
0,925
<0,001
0,043
0,188
0,044
0,619
0,648
0,045
0,259
0,574
0,819
BABA
0,457
1,000
1,000
0,511
1,000
1,000
0,441
0,060
0,227
1,000
0,222
0,126
1,000
1,000
0,231
1,000
1,000
0,032
1,000
1,000
0,022
PTUMG
0,310
0,153
0,008
0,083
0,854
0,167
0,146
0,476
0,057
0,220
0,075
0,681
0,090
0,052
0,232
0,046
0,329
0,368
0,020
<0,001
0,022
BRAMG
0,531
0,353
0,001
0,052
0,410
0,035
0,109
0,034
0,045
0,101
0,160
0,047
0,051
0,326
0,094
<0,001
0,028
<0,001
0,017
0,001
0,002
CORMG
0,313
0,278
0,259
0,807
0,981
0,717
0,002
0,045
0,027
0,485
0,093
0,382
0,102
0,393
0,036
0,769
0,122
0,147
0,327
0,468
0,741
RVBA
0,568
0,088
0,830
0,007
0,719
0,222
0,822
0,408
0,202
0,253
0,427
0,728
0,046
0,405
0,145
0,105
0,249
0,354
0,643
0,616
0,063
PNTO
0,700
0,360
0,067
0,209
0,280
0,169
0,992
0,762
0,529
0,330
0,951
0,217
0,121
0,514
0,451
0,554
0,004
0,086
0,956
0,004
0,780
Em destaque: Probabilidade ≤ 0,05 (em desequilíbrio de ligação). Valores baseados em 10080 permutações.
124
Apêndice H. Distâncias genéticas entre as 23 subpopulações de E. dysenterica. Acima da diagonal: distância genética de Nei (1972); debaixo da diagonal: FST/1-FST para-par (Rousset, 1997)
1
FGO
STGO
MUGO
VBGO
MIMGO
BSAGO
SCNGO
BAMMG
PIPMG
BAGMT
CAMALGO
CATAGO
DIRGO
GILPI
LUZMG
NIQGO
SITO
BABA
PTUMG
BRAMG
CORMG
RVBA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
0
0,039
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
0,231 0,354 1,353 0,996 0,845 0,866 1,487 1,393 0,851 1,398 1,511 0,720 1,296 1,320 1,090 0,992 1,320 1,691 1,573 1,874 1,743 1,005
0
0,046 0,028
0,194 1,459 1,091 0,814 1,209 1,578 1,470 0,902 1,666 1,531 0,772 1,220 1,405 1,286 1,286 1,591 1,711 1,704 1,933 2,021 1,055
0
0,199 0,260 0,189
1,206 0,867 0,833 1,059 1,213 1,107 0,977 1,305 1,176 0,658 1,161 1,224 1,119 1,011 1,382 1,325 1,336 1,587 1,499 1,075
0
0,182 0,240 0,152 0,141
0,691 1,159 1,277 1,066 0,988 0,827 0,916 0,847 1,159 1,140 1,173 1,202 1,310 0,840 0,984 1,058 0,761 0,864 1,459
0
0,118 0,154 0,104 0,150 0,148
0,891 0,723 0,666 0,631 0,753 0,436 0,409 0,432 0,779 0,784 0,549 0,732 0,810 0,394 0,549 0,649 0,893 0,873
0
0,150 0,231 0,166 0,196 0,142 0,106
0,737 1,271 1,169 0,603 1,195 1,200 0,599 1,111 1,426 0,917 1,018 1,063 1,397 1,505 1,731 1,641 0,893
0
0,378 0,441 0,337 0,322 0,232 0,310 0,323
1,203 1,001 0,765 1,069 1,144 0,631 1,159 1,174 1,030 1,017 1,465 1,121 1,081 1,406 1,360 0,938
0
0,296 0,354 0,258 0,244 0,185 0,237 0,248 0,038
0,107 1,037 0,504 0,568 0,978 1,332 0,207 1,012 1,317 0,650 0,450 0,395 0,319 0,556 0,991
0
0,111 0,157 0,124 0,123 0,123 0,068 0,109 0,262 0,209
0,965 0,498 0,529 0,865 1,130 0,173 1,026 1,207 0,615 0,370 0,230 0,282 0,438 0,869
0
0,261 0,348 0,249 0,211 0,106 0,220 0,231 0,246 0,182 0,186
0,972 0,937 0,642 0,625 0,933 1,060 1,111 1,028 0,932 0,989 1,069 1,090 0,676
0
0,320 0,384 0,280 0,237 0,126 0,258 0,283 0,275 0,215 0,219 0,055
0,183 0,921 0,816 0,734 0,782 0,929 0,870 0,259 0,357 0,313 0,802 0,887
0
0,116 0,160 0,097 0,172 0,074 0,079 0,105 0,275 0,209 0,084 0,186 0,204
0,801 0,799 0,661 0,901 1,080 0,980 0,240 0,327 0,333 0,872 0,822
0
0,170 0,219 0,158 0,166 0,130 0,133 0,172 0,316 0,244 0,088 0,173 0,206 0,090
0,655 0,836 0,675 0,983 1,202 0,930 0,913 1,248 1,264 0,689
0
0,328 0,405 0,320 0,320 0,243 0,297 0,294 0,080 0,057 0,231 0,281 0,291 0,228 0,256
1,006 0,867 1,066 0,917 0,741 0,700 0,783 0,990 1,170
0
0,162 0,229 0,153 0,186 0,103 0,129 0,175 0,282 0,234 0,145 0,177 0,233 0,108 0,145 0,272
1,006 1,559 0,804 0,518 0,393 0,417 0,572 0,801
0
0,147 0,223 0,141 0,194 0,149 0,135 0,169 0,346 0,274 0,141 0,209 0,269 0,144 0,164 0,342 0,113
0,647 0,670 1,060 1,012 1,217 1,064 1,057
0
0,154 0,224 0,146 0,126 0,140 0,116 0,174 0,202 0,143 0,114 0,184 0,233 0,139 0,131 0,206 0,103 0,124
0,831 1,281 1,192 1,485 1,462 1,137
0
0,349 0,418 0,315 0,271 0,111 0,288 0,291 0,208 0,152 0,237 0,105 0,105 0,237 0,213 0,228 0,269 0,309 0,232
0,917 0,784 0,691 0,380 1,389
0
0,295 0,364 0,268 0,244 0,147 0,253 0,251 0,158 0,075 0,210 0,118 0,131 0,205 0,180 0,155 0,228 0,259 0,168 0,051
0,130 0,170 0,607 0,813
0
0,372 0,443 0,349 0,238 0,192 0,316 0,328 0,161 0,104 0,259 0,137 0,158 0,289 0,221 0,196 0,295 0,329 0,191 0,076 0,047
0,139 0,474 0,775
0
0,276 0,355 0,255 0,188 0,208 0,228 0,242 0,208 0,127 0,190 0,227 0,275 0,223 0,199 0,202 0,215 0,258 0,072 0,210 0,136 0,135
0,409 1,078
0
PNTO
0,153 0,207 0,165 0,214 0,161 0,125 0,153 0,274 0,209 0,100 0,180 0,209 0,112 0,170 0,230 0,170 0,164 0,162 0,220 0,180 0,268 0,229
Em destaque: maiores e menores distâncias genéticas, baseado no FST linearizado.
1,276
0
125
Apêndice I. Padrão de divergência genética entre 23 subpopulações de E. dysenterica, definido por UPGMA, usando distância genética de Nei (1972) como identidade
genética
126
Apêndice J. Distâncias geográficas (km) entre as 23 subpopulações de E. dysenterica
População
FGO
STGO
MUGO
VBGO
MIMGO
BSAGO
SCNGO
BAMMG
PIPMG
BAGMT
CAMALGO
CATAGO
DIRGO
GILPI
LUZMG
NIQGO
SITO
BABA
PTUMG
BRAMG
CORMG
RVBA
PNTO
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
3
4
0,00
172,37
0,00
260,27 90,00
0,00
319,95 281,14 277,53
2
0,00
5
6
7
8
9
10
11
218,36
17,79
125,49
631,77
172,90
185,71
255,38
745,09
189,62
274,49
328,48
795,18
112,28
0,00
336,91 236,00
0,00
270,38 203,45 131,54
0,00
570,33 610,99 634,44 507,91
556,27
197,58
305,90
335,27
597,05
252,48
414,99
462,49
613,89
329,55
471,18
524,96
341,18
497,50
295,87
362,40
318,15
0,00
807,17 753,82
0,00
331,32 297,41 493,45
297,44 331,11 510,89
0,00
66,75
173,69
850,38
626,75
261,29
145,12
694,75
731,21
142,97
182,36
607,42
776,97
114,45
153,92 44,88 191,38 171,17 612,91 452,10 343,60
631,62 665,57 867,07 868,87 1163,94 862,65 932,43
542,72 590,39 630,69 501,66
46,05 275,32 807,66
163,78 94,48 278,67 283,05 703,75 502,94 391,39
289,89
927,26
322,05
391,95
557,35
665,96
343,39
397,27
387,30
541,82
418,38
436,76
297,58
470,54
459,34
459,93
447,72
390,90
239,36
200,56
428,07
386,64
297,55
358,32
424,80
455,07
272,60
271,13
567,41
186,87
311,16
337,25
571,93
683,69
352,59
409,37
442,39
316,92
180,41
213,58
12
13
14
15
346,34
0,00
993,90 699,62
0,00
296,96 595,43 1127,02
452,15 112,33 592,51
0,00
681,82
782,95
744,68
147,03
239,86
990,41
854,28
317,90
344,85
16
17
18
19
20
332,16
0,00
408,76 340,00
0,00
364,84 682,30 605,72
353,09 646,78 530,43
0,00
94,32
0,00
21
22
23
995,26 219,43 486,75 810,87 735,58 132,99 208,24
0,00
373,59 758,35 285,41 308,29 128,23 490,01 422,23 622,00
0,00
382,17 1062,24 390,43 86,14 420,99 750,05 720,72 875,89 394,43
0,00
0,00
610,53 1017,74 768,79 602,88 720,94
652,94 892,36 587,51 794,25 678,19
223,51 338,95 221,85 539,35 88,71
289,50 375,68 162,08 594,68 182,95
0,00
443,15
496,61
278,63
291,64
407,32 518,31 571,77 371,73 392,49 411,37 282,31 227,38 261,68 590,05 103,94 85,17 389,56
539,32 423,18 359,46 265,73 326,97 557,09 524,89 793,60 503,50 675,18 557,81 624,55 368,86
591,80 419,43 333,52 520,35 484,82 604,85 658,77 1087,79 848,17 609,68 782,36 842,23 497,28
343,77
275,60
862,87
795,45
0,00