universidade estadual de feira de santana
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SILVIA LETICIA BISPO DOS SANTOS Variabilidade genética em populações de Agave sisalana Perrine (Agavaceae) detectada pela técnica Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) FEIRA DE SANTANA - BAHIA 2011 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS Variabilidade genética em populações de Agave sisalana Perrine (Agavaceae) detectada pela técnica Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) SILVIA LETICIA BISPO DOS SANTOS Dissertação apresentada ao programa de PósGraduação em Recursos Genéticos Vegetais, da Universidade Estadual de Feira de Santana, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Recursos Genéticos Vegetais. Orientadora: Profa. Dra. Sandra Regina de Oliveira Domingos Queiroz Co-orientador: Prof. Dr. Cássio van den Berg FEIRA DE SANTANA - BAHIA 2011 Ficha Catalográfica - Biblioteca Central Julieta Carteado - UEFS Santos, Silvia Letícia Bispo dos S238v Variabilidade genética em populações de Agave sisalana Perrine (Agavaceae) detectada pela técnica Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)./ Silvia Letícia Bispo dos Santos. – Feira de Santana, 2011. 85 f : il. Orientadora: Sandra Regina de Oliveira Domingos Queiroz Co-orientador: Cássio van den Berg Dissertação (mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais. Universidade Estadual de Feira de Santana, 2011. 1.Sisal – Diversidade genética. 2.Agavaceae. 3.Clonalidade. 4.ISSR. I.Queiroz, Sandra Regina Oliveira Domingos. II.Berg,, Cássio van der. III.Universidade Estadual de Feira de Santana. IV. BANCA EXAMINADORA _________________________________________________________ Professora Doutora Rejane Patrícia de Oliveira Universidade Estadual de Feira de Santana - UEFS _________________________________________________________ Professor Doutor Eddy José Francisco de Oliveira Universidade Estadual de Feira de Santana - UEFS _________________________________________________________ Professor Doutor Cássio van den Berg – Co-orientador Universidade Estadual de Feira de Santana - UEFS. FEIRA DE SANTANA – BA 2011 A todos que acreditaram em minha vitória, mesmo diante dos obstáculos e dificuldades. i AGRADECIMENTOS Durante o desenvolvimento desse trabalho, várias pessoas estiveram ao meu lado as quais foram importantes para o meu êxito. Algumas já eram companheiras de longas datas, outras se somaram a essas. Esforçar-me-ei para não esquecer ninguém, e, independente da ordem em que aparecerão aqui, a todas só tenho a agradecer. À Deus por estar ao meu lado em cada instante e por ter me amparado e me dado forças em todos os momentos. À minha avó Perolina (in memorian), pessoa ímpar em minha vida, que me acolheu em seus braços e me ensinou tudo o que hoje sou. À minha tia Zelinha por ter me acompanhado nos primeiros passos rumo a essa conquista. A meus primos Giselle e Maurício, pela contribuição sempre no que foi possível. À minha orientadora Sandra Regina, por ter me apresentado o sisal. Ao meu co-orientador Cássio van den Berg, por ter me proporcionado todas as condições ideais no LAMOL para a realização de meus experimentos me orientando, de forma decisiva à conclusão deste trabalho. A Eneida Cerqueira, minha professora, amiga que sempre acreditou em mim apostando em meu sucesso, a quem admiro como pessoa e profissional. À minha grande amiga Joceli, que esteve sempre ao meu lado nos melhores e piores momentos, sempre me dando apoio e força e acreditando em minha vitória. Às minhas colegas de trabalho do 13° Centro de Saúde, Elijane, Maria e Janete que me entenderam e me ajudaram cada uma do seu jeitinho. Às minhas amigas Viviane, Jecineide e Ana Cristina que me acolheram em seus lares com muito carinho, me proporcionando momentos de descanso físico. A Paty Luz, que pacientemente me ajudou a resolver as mais diversas dificuldades encontradas durante o desenvolvimento de meus experimentos. ii A Tarciso Maia, pela paciência e disposição em me ajudar sempre. A todos os colegas do LAMOL; em especial ao funcionário Ricardo, pela presteza, até mesmo aos finais de semana. A Fernando Carneiro, amigo e companheiro de expedição pelo semiárido baiano. Não consigo imaginar como teria feito minhas coletas sem sua ajuda. A Sabrina Lambert, que muito me ajudou na conclusão do meu trabalho. A todos os donos de campos de sisal, por terem permitido a coleta dos bulbilhos em suas propriedades. Aos vigilantes do LABIO, pelo cuidado e atenção. A UEFS, que me recebeu com toda infra-estrutura necessária ao desenvolvimento do meu trabalho. Agradeço ao programa RGV, pelo apoio sempre e pela oportunidade. Ao secretário do RGV, Alberto Vicente, pela paciência e por estar sempre atento às necessidades dos alunos do programa. Ao IDR-Sisal por ter financiado o meu projeto, apoio imprescindível. Agradeço à banca examinadora pelas preciosas contribuições e correções. Espero não ter esquecido ninguém, mas se por acaso minha memória tenha falhado, peço desculpas, na certeza de que não foi por falta de consideração. Agora é hora de comemorar e nada mais justo do que repartir a minha felicidade com vocês. Obrigada, obrigada, muito obrigada a todos vocês! iii “ Na sobrevivência dos indivíduos e raças favorecidas, durante a luta constante e recorrente pela existência, vemos uma forma poderosa e incessante de seleção.” Charles Darwin. iv RESUMO O sisal (Agave sisalana Perrine) pertence à família Agavaceae e é uma planta cultivada resistente à seca cuja principal utilização é a extração das fibras contidas em suas folhas, contribuindo com mais da metade da produção comercial desse produto no mundo. Dada a sua importância econômica ao Estado da Bahia, despertou-se o interesse em conhecer melhor o comportamento genético da espécie, avaliando a variabilidade genética entre e dentro de populações de Agave sisalana. Para isso, foram analisados 140 genótipos de sisal coletados em seis municípios baianos: Campo Formoso, Jacobina, Ourolândia, Santaluz, São Domingos e Valente. Após a extração do DNA foi escolhido o marcador molecular dominante ISSR (inter simple sequence repeats) para amplificação. Dos nove Primers utilizados, obtiveram-se 143 lócos polimórficos. A análise de agrupamento foi feita utilizando a distância genética. O percentual médio de polimorfismo nas populações de Agave sisalana foi de 64%. A média de heterozigosidade (He) e do índice de Shannon-Wiener (I) foram de 0, 180 e 0, 279 respectivamente. Os dados de AMOVA mostraram que 73% da variância molecular pode ser atribuída às diferenças intrapopulacionais. Verificou-se que as populações foram divididas em dois grupos, mostrando uma tendência de se agruparem de acordo com sua localização geográfica, evidenciando uma estruturação da variabilidade genética no espaço. O GST de 0,235, suficiente para evitar que exista uma forte diferenciação populacional. A estruturação genética do sisal pode ser explorada para a criação de bancos de germoplasma visando à conservação in situ e ex situ para a obtenção de indivíduos de boa qualidade comercial. PALAVRAS-CHAVE: Agavaceae; Clonalidade; Diversidade genética; ISSR; Sisal. v ABSTRACT Sisal (Agave sisalana Perrine) belongs to Agavaceae, and is a drought resistant crop plant whose main use is the extraction of the fibers contained in the leaves, contributing more than 50% to the commercial production of this product in the world. Given its economic importance to in the Bahia State, there is the interest in learning more about the genetic behavior of the species, and assessing the genetic variation between and within populations of Agave sisalana. For this, we analyzed 140 genotypes collected in six municipalities of Bahia: Campo Formoso, Jacobina, Ourolândia, Santaluz, São Domingos and Valente. After DNA extraction we chose dominant molecular markers of ISSR (inter simple sequence repeats) for amplification. Of the nine Primers, we obtained 143 polymorphic loci. Cluster analysis was performed using the Nei genetic distance. The mean percentage of polymorphism in populations of Agave sisalana was 64%. The average heterozygosity (He) and Shannon-Wiener index (I) were 0.180 and 0.279 respectively. An AMOVA showed that 73% of molecular variance can be attributed to intrapopulation differences. We verified that the populations are divided into two groups, showing a tendency to group together according to their geographical location, showing genetic variation a structured of in space. GST was 0.235, in agreement with the strong genetical structuring found. Genetic structuring the sisal can be exploited for creating germplasm banks aiming the in situ and ex situ conservation to obtain individuals of good commercial quality. KEYWORDS: Agavaceae; Clonality; Genetic diversity; ISSR; Sisal. vi LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - Mapa do Território de Identidade Sisal SEAGRI 2011 ........................................................................................... 5 FIGURA 2 - Mapa de Identidade sisal. Piemonte da Diamantina SEAGRI (2011) ......................................................................................................................6 FIGURA 3 - Produção de sisal por hectare nas localidades de coleta das seis populações amostral IBGE (2009) .......................................................................7 FIGURA 4 - Produção de sisal na região nordeste do Brasil – IBGE (2009) ..8 FIGURA 5A - Altura da planta de Agave sisalana Perrine.............................. 11 FIGURA 5B - Disposição em roseta das folhas .................................................11 FIGURA 5C - Poste ou pendão de Agave ........................................................... 11 FIGURA 5D - Ramificações tricotômicas com inflorescência .........................11 FIGURA 5E - Flores de Agave sisalana Perr .....................................................11 FIGURA 6A – Bulbilhos de sisal ........................................................................13 FIGURA 6B – Rebentos de sisal .........................................................................13 FIGURA 6C - Corte das folhas de sisal no campo ............................................13 FIGURA 6D - Folhas de sisal coletadas ............................................................. 13 FIGURA 7 - Regiões escolhidas para coleta dos genótipos de sisal – Adaptada de SEI (2011).........................................................................................................29 FIGURA 8 (A e B) - Demarcação do espaço amostral em uma das áreas de coleta ......................................................................................................................32 FIGURA 8C – Coleta de bulbilhos .....................................................................32 FIGURA 8D - Marcação de uma planta fornecedora de genótipos ................32 FIGURA 9 - Dendrograma mostrando as relações fenéticas entre as populações de Agave sisalana de seis localidades: JAC, CF, VAL, SD, STL e OUR, com base em UPGMA. ..............................................................................42 vii FIGURA 10 - Análise de coordenadas principais (PCoA) de 6 populações de Agave sisalana. Eixo 1 ˟ 2 correspondendo a 22,69% .......................................43 FIGURA 11 - Análise de coordenadas principais (PCoA) de 6 populações de Agave sisalana. Eixo 1 ˟ 3, correspondendo a 20,61% ......................................44 FIGURA 12 - Gráfico de estruturação genética a partir da analise dos dados de marcadores dominantes de ISSR com o software STRUCTURE nas seis populações de sisal cultivadas na Bahia ............................................................. 45 viii LISTA DE TABELAS TABELA 1 - Coordenadas geográficas e altitudes dos l ocais de coleta das seis populações de sisal ( Agave sisalana ) cultivadas no semiárido da Bahia .................................................................. 30 TABELA 2 - Distância em Km, entre os municípios de coleta das populações de Agave sisalana ..................................................................................................31 TABELA 3 - Relação dos Primers de ISSR amplificados e suas respectivas sequências iniciadoras..........................................................................................35 TABELA 4 - Primers utilizados sequências e número de bandas amplificadas . ................................................................................................................................ 39 TABELA 5 - Diversidade genética de seis populações de Agave sisalana do semiárido baiano com base em nove iniciadores de ISSR ................................ 41 TABELA 6 - Resumo da análise de variância molecular (AMOVA) .............46 TABELA 7 - Valores de GST, Nm, Ht e Hs para as seis populações estudadas e para os dois grupos de população .......................................................................46 TABELA 8 - Variabilidade genética em grupos de Agavaceae e média utilizando marcadores moleculares ....................................................................50 TABELA 9 - Estimativas de variações dentro das populações e / ou variações entre as populações, obtidas com marcadores moleculares diferentes ...........52 ix SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 1 2. REVISÃO DE LITERATURA 4 2.1 Considerações gerais sobre o semiárido e a região sisaleira da Bahia 4 2.2 Produção de sisal no estado da Bahia 6 2.3 O Agave sisalana Perr. (sisal) 8 2.4 Diversidade genética em populações naturais 13 2.5 Marcadores moleculares 15 2.6 Estudos com Marcadores Moleculares em Agave 17 2.6.1 RAPD 17 2.6.2 AFLP 19 2.6.3 ISSR 20 2.6.4 Análise da diversidade e estrutura genética a partir de marcadores moleculares dominantes (ISSRs) 3. OBJETIVOS 22 26 3.1 Objetivo geral 26 3.2 Objetivos específicos 26 4. HIPÓTESES 27 5. MATERIAL E MÉTODOS 28 5.1 Área de estudo e amostragem 28 5.2 Coleta de campo – Material vegetal 31 5.3 Extração de DNA genômico 33 5.4 Verificação da integridade do DNA 33 5.5 Condições de amplificação 34 x 5.5.1 Seleção de Primers 34 5.6 Estudo de variabilidade 36 6. RESULTADOS 40 7. DISCUSSÃO 47 8. IMPLICAÇÕES PARA A CONSERVAÇÃO DA ESPÉCIE 54 9. CONCLUSÕES 56 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 57 ANEXOS 69 1 1. INTRODUÇÃO Agave, o maior gênero da família Agavaceae, é endêmico nas Américas, sua freqüência vai desde o sul dos Estados Unidos, Colômbia e Venezuela. (GARCIA-MENDOZA & GALVAN, 1995). Propõe-se que este gênero possua em média 166 espécies das quais 125 estão no México (GARCIA-MENDOZA 2002). Agave sisalana Perrine, também conhecida como sisal, é um vegetal eminentemente tropical, que engloba um grupo bem definido de plantas de consistência herbácea e escapo floral saliente, podendo atingir doze ou mais metros de altura (SILVA & BELTRÃO, 1999). É considerada uma espécie altamente produtora de fibras e extremamente resistente à seca (DAS, 1992). O sisal, originário da península de Yucatán (México), foi introduzido no Brasil primeiramente na Bahia no início do Século XX. No entanto, só se configurou como possibilidade econômica a partir de 1939 se firmando como a principal fonte comercial de fibras, substituindo a indústria de fios de caroá a Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez (CAR, 1994). O cultivo do sisal no Brasil ocorre principalmente na região semiárida que se caracteriza por apresentar precipitação pluvial entre 300 mm3 e 800 mm3, concentrada em poucos meses do ano, gerando períodos de chuva e estiagem. Esta região costumeiramente conta com temperaturas altas, acima de 26°C, com poucas variações. Assim, a evaporação é intensa, causando a precipitação de sais no solo (AB’SABER, 1996). O Brasil é o maior produtor de sisal no mundo, sendo a Bahia e Paraíba os estados com produção mais expressiva. Na Paraíba o sisal se constitui no principal produto da pauta de exportação e, na Bahia, em 2007 destacou-se no ranking nacional (SEAGRI, 2009). A fibra do sisal, beneficiada ou industrializada, rende divisas internas, além de gerar mais de meio milhão de empregos diretos e indiretos por meio de sua cadeia produtiva, sendo o cultivo dessa planta um dos principais motivos de 2 fixação do homem à região semiárida nordestina (SUINAGA et al. 2006a). O sisal tem utilização muito vasta, sua fibra é empregada para confecção de cordas, barbantes, papel, papelão, sacos e diversos outros artefatos como tapetes e bolsas. Gera ainda como produtos secundários graxa, cera, glucosídeos, álcool e ácidos (APAEB, 2010). Mais recentemente passou a ser utilizado na indústria automobilística, substituindo a fibra de vidro. A agricultura do semiárido tem o sisal como importante cultivar. Diante disso, é importante que se conheça melhor sua estrutura genética. Estudar o sisal através da genética de populações pode facilitar a classificação correta dos acessos, favorecendo a seleção de amostras representativas que capturem a diversidade genética detectando padrões de diferenciação. A genética de populações tem sido utilizada como uma ferramenta importante no estudo da diversidade genética, descrevendo variabilidade em populações e estudando os mecanismos de manutenção desta variabilidade (NEI, 1987). O estudo de genética de populações engloba os processos e mecanismos pelos quais a evolução ocorre em populações naturais, determinando a variação genética existente nas mesmas, qual é a origem, manutenção e distribuição de tal variação, bem como a sua importância evolutiva (HARTL & CLARK, 1989). Os objetos desse estudo são as frequências alélicas, a deriva gênica e adaptação de genótipos de populações naturais. Enquanto as freqüências alélicas são relativamente fáceis de medir, suas mudanças não são, porque a escala de tempo da mudança na maioria das variantes genéticas é muito grande, milhões de anos (GILLESPIE, 1998). Para o estudo da variabilidade genética em uma população, o uso de técnicas de genética molecular é de fundamental importância. Dentre os marcadores mais utilizados estão as Isoenzimas, os RAPDs (Random Amplified polymorphic DNA, WILLIAMS et al. 1990), AFLPs (Amplified polimorfismo fagment, VOS et al. 1995), Microssatélites (HAMADA & KAKUNAGA, 1982) e ISSRs (Inter Simple Sequence Repeats) (GUPTA et al. 1994; ZIETKIEWICZ et al. 1994). 3 Vários estudos sobre o nível de variabilidade genética das Agaves têm utilizado diferentes marcadores moleculares, incluindo: isoenzimas em Agave fourcroydes Lem.. (COLUNGA-GARCÍAMARÍN et al. 1999), Agave victoriaereginae (MARTÍNEZ-PALACIOS et al. 1999) e Agave lechuguilla Torr. (SILVA-MONTELLANO & EGUIARTE, 2003); microssatélites em Agave cupreata e Agave potatorum (EGUIARTE et al. 2003); RAPD em Agave tequilana Weber (GIL-VEGA et al. 2001, 2006) e em Agave deserti (NAVARRO et al. 2003); AFLP em Agave fourcroydes Lem. (GONZÁLEZ et al. 2003); DEMEY et al. (2004) e Agave angustifolia Haw. (BARRAZA-MORALES et al. 2006); (SÁNCHEZ-TEYER et al. 2009) e ISSR em Agave angustifolia e Agave tequilana (VARGAS-PONCE et al. 2009). Considerando a importância econômica do sisal para a região do semiárido baiano e levando em conta que a principal forma de reprodução da cultivar na região é vegetativa, além do fato de que não há estudos utilizando marcadores moleculares para identificação da variabilidade genética em Agave sisalana, o objetivo desse estudo foi investigar a variabilidade genética desta espécie a partir de plantas coletadas em seis municípios da região sisaleira do estado da Bahia, com o uso do marcador Inter Simple Sequence Repeats (ISSR). 4 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 – Considerações gerais sobre o semiárido e a região sisaleira da Bahia De acordo com AB´SABER (1999), o sertão nordestino é uma das regiões semiáridas mais povoadas do mundo. De acordo com o IBGE, 27 milhões de pessoas vivem atualmente no polígono das secas (IBGE, 2010). Apesar das características gerais reconhecidas, como a irregularidade de distribuição das chuvas, temperatura elevada e limitações hídricas, o semiárido brasileiro é uma realidade complexa, tanto no que se refere aos aspectos geofísicos, quanto à ocupação humana e à exploração dos recursos naturais. Sendo sempre limitada às condições topoclimáticas e edáficas, sua vegetação característica, a caatinga, reflete as inter-relações entre fatores naturais e os fatores antrópicos e se apresenta com fisionomia variada, o que dá origem a muitas controvérsias quando se tenta classificá-la (AUBRÉVILLE, 1965). De um modo geral, as espécies da caatinga estão adaptadas para enfrentarem a estação seca, seja por modificações do ritmo biológico, seja por mudanças no metabolismo da água: espinescência, acumulação da água nos tecidos e nas raízes, esclerofilia e emurchecimento das folhas, redução do tamanho das folhas e dos folíolos, sem atingir uma verdadeira microfilia que caracteriza muitas espécies de outras regiões semiáridas do mundo tropical, excetuando-se os gêneros Caesalpinia echinata Lam. e Mimosa caesalpiniaefolia Benth. (KOECHLIN et al. 1980). A região sisaleira baiana encontra-se inserida no semiárido do estado da Bahia, possuindo uma estrutura fundiária caracterizada de um lado pelo grande latifúndio e de outro pelo processo de minifundialização. Desta dicotomia resultam distorções graves na sustentabilidade da agricultura familiar. O governo do estado da Bahia, inspirado no conceito de Território de Identidade descrito pelo geógrafo Milton Santos como áreas geográficas formadas por unidades dinâmicas, indivisíveis dos seres humanos e de suas ações, criou um programa com base na territorialidade subdividindo o estado em 26 partes. Este 5 programa assimila princípios básicos da democratização das políticas públicas como à descentralização das decisões, a regionalização das ações e a coresponsabilidade na aplicação de recursos, e na execução e avaliação de projetos. Os territórios Identidade Sisal e Identidade Piemonte da Diamantina ocupam uma área de 21.256,50 Km2, com 552.713 habitantes, dos quais 348.222 (63%) vivem na área rural. (SEAGRI, 2011) (Fig. 1 e 2). O Índice de Desenvolvimento Humano (IDH) médio do território é 0,60. Segundo dados do Instituto de Desenvolvimento da Região do Sisal (IDR-SISAL) trabalham na lavoura 64.350 agricultores familiares, 2.344 famílias estão assentadas e 413 famílias são de pescadores, além de uma comunidade quilombola e um agrupamento indígena (IDR-SISAL, 2010). O território de Identidade Piemonte da Diamantina é formado por 24 municípios, nove se destacam como os mais representativos em termos de produção de sisal (Fig.2). Figura 1. Mapa do território de Identidade Sisal (SEAGRI, 2011). 6 Figura 2. Mapa de Identidade Piemonte da Diamantina (SEAGRI, 2011). 2.2 - Produção de sisal no estado da Bahia A produtividade média de sisal no estado, em 2009, após alguns investimentos, chegou a 1.200 quilos por hectare, indicando um crescimento em relação a 2009, que alcançou 1.033 kg/ha. Dessa forma, o sisal mostra ser um grande potencial econômico para o Estado, e, em particular, para a agricultura familiar. A espécie apresenta potencial genético de produção que pode chegar a 2.500 kg/ha. Nos últimos dez anos, a produtividade de sisal variou muito na Bahia. A mais baixa foi verificada nos anos de 2002 e 2003 com 852 kg/ha. Em 2010, o estado da Bahia, mais uma vez se destacou no cenário produtor de sisal, a região dos municípios estudados tiveram uma produção em kg/ha expressiva: Campo Formoso 78.610; Jacobina 12.000; Ourolândia 10.000; Santaluz 30.000; 7 São Domingos 6.000; Valente 12.000. Esse resultado foi atribuído ao fato de o governo federal, através da CONAB, instituir políticas de preço mínimo, que melhor remunera os custos de produção da cultura, ampliando a capacidade de investimento do agricultor. (IBGE, 2010) (Fig. 3). Campo Formoso 78.610 Jacobina 12.00 Ourolândia 10.000 Santaluz 30.000 São Domingos 6.000 Valente 12.000 Figura 3. Produção de sisal por hectare nas seis localidades de coleta das populações amostrais. Dados: IBGE 2009. Adaptado ao clima semiárido do nordeste brasileiro, a produtividade nacional de fibra de sisal (Agave sisalana), em 2007, foi em média 245 mil toneladas (FAO, 2009). De acordo com os dados do (IBGE) no Brasil, o estado da Bahia detém 95% da produção brasileira (233 mil toneladas de fibra de sisal) seguido pelos estados da Paraíba (4,1%), Rio Grande do Norte (0,6%) e Ceará (0,3%) IBGE (2010) (Fig. 4). 8 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% MA PI CE RN PB PE AL SE BA Figura 4. Produção de sisal na região nordeste do Brasil, classificada por estado. Dados: IBGE, 2009. 2.3 - O Agave sisalana Perr. (Sisal) Originário da Península de Yucatán, no México o Agave sisalana foi trazido da Florida por volta de 1903, pelo engenheiro agrônomo Horácio Urpia Júnior, que introduziu os primeiros bulbilhos no Brasil. Em 1911, mudas foram enviadas para a Bahia e Pernambuco. Porém, somente a partir do final da década de 1930 passou a ser visto como uma alternativa econômica (SUINAGA, 2006). Introduzido nos estados da Paraíba, Bahia e Rio Grande do Norte, em virtude das condições climáticas propícias, por ser uma planta semixerófila, que requer clima quente e grande luminosidade, o sisal se adaptou bem às regiões semiáridas, sendo altamente resistente a estiagens prolongadas, pois apresenta estruturas peculiares de defesa contra as condições de aridez (SILVA & BELTRÃO, 1999; CNA, 2010). A espécie é uma monocotiledônea de elevada complexidade morfofisiológica, apresentando via fotossintética CAM e uma baixa taxa de crescimento (GENTRY, 1982). A planta pode atingir mais de 1,70 cm de altura (Fig.5A). As folhas podem chegar a quase dois metros de comprimento e 10 cm de largura, são destituídas de pecíolos, apresentam sua superfície abaxial côncava e a adaxial, 9 convexa, com superfície serosa, moldadas com um espinho terminal com 20 a 25 mm de comprimento, apresentam forma lanceolada, com parênquima espesso e esponjoso suculento, permitindo o armazenamento de água e uma camada de cera que impede a perda dessa água. A disposição em roseta das folhas é vista como um mecanismo de defesa contra herbívoros, bem como um meio para obter água de forma mais eficiente (GENTRY, 1982, Fig.5B). Nos Agaves o sistema vascular se alonga através das folhas criando as fibras, que no Agave sisalana é um produto de importância econômica (IRISH & IRISH, 2000). A espécie apresenta sistema radicular fibroso e em forma de tufo, é destituída de raiz principal, possuindo dois tipos de raízes designadas por transportadoras e alimentadoras, sendo as primeiras responsáveis pela fixação da planta ao solo (SILVA & BELTRÃO, 1999). O Agave sisalana apresenta um ciclo perene, podendo se reproduzir tanto assexuadamente como sexuadamente. Na reprodução assexuada existem dois mecanismos, através de rizomas produzindo rebentos que formarão novos indivíduos ou por bulbilhos os quais se desenvolvem a partir de células estaminais na flor (NOBEL, 1988; ARIZAGA & EZCURRA, 1995). Pelo fato de ser uma planta monocárpica, o sisal floresce apenas uma vez, no final do ciclo vegetativo após cerca de oito a dez anos do plantio, emitindo o que os agricultores denominam de “flecha” “poste” ou “pendão de Agave” formado por folhas atrofiadas, ou brácteas justapostas, semelhantes a “escamas”, estreitas, com ápice provido de espinhos, atingindo de 6 a 9 metros de altura (Fig.5C). A metade superior do pedúnculo apresenta-se com 22 a 40 ramificações tricotômicas com flores (Fig.5D) que, podem formar frutos sementes, ou apenas bulbilhos, enquanto vai ocorrendo a morte do sisal (LOCK, 1962; SILVA et al. 1999; SILVA et al. 2008; SUINAGA et al. 2006). As flores do sisal são perfeitamente normais e o pólen viável, mas os frutos não são formados devido ao desenvolvimento de uma “camada de abscisão” entre a base do ovário e o pedicelo, ou pedúnculo da flor, logo após as flores terem murchado (LOCK, 1962). A flor é bissexuada, sendo encontrada agrupada em cachos situados no final de cada ramo da panícula. Cada flor possui seis estames que estão inseridos na base da corola, sendo os estames constituídos por anteras trilobadas (Fig. 5E). 10 Apresenta um estigma trilobado, com ovário ínfero trilocular (SILVA & BELTRÃO, 1999). 11 Figura 5. (A) Altura da planta de Agave sisalana Perr. ; (B) Disposição das folhas; (C) Pendão de Agave; (D) Ramificações tricotômicas com inflorescência; (E) Flores de Agave sisalana Perr. 12 Após a queda das flores desenvolvem-se, na panícula os “bulbilhos” novas plantinhas (Fig.6A) que são utilizados como mudas de propagação vegetativa (SILVA & BELTRÃO, 1999; SUINAGA et al. 2006a). Os “filhotes” ou “rebentões”, como normalmente são chamados pelos agricultores, são mudas que nascem ao lado das plantas-mãe e se ligam a elas através de caules subterrâneos (Fig.6B). Os rebentos desenvolvem-se com a assimilação de substâncias nutritivas elaboradas pela planta mãe. O crescimento desordenado dos rebentões acarreta problemas na lavoura, dificultando a circulação dos trabalhadores e a limpeza (capina) da roça de sisal. Além disso, para evitar competição por fotoassimiladores é importante que seja feita a retirada dos rebentos após a colheita das folhas, deixando apenas um ou dois que substituirão a planta-mãe (CNPA/EMBRAPA). Em alguns casos ocorre a esporádica formação de frutos, que podem aparecer isolados, ou em produção simultânea aos bulbilhos na panícula. SALGADO et al. (1979) demonstraram que todos os trabalhos visando ao melhoramento genético de Agave sisalana foram infrutíferos por meio da propagação sexual. O fruto do sisal é pouco conhecido dos produtores nordestinos, estudantes e técnicos, devido a sua rara produção pelas plantas. O corte é feito bem rente à base, para evitar perda de fibra e ataque de patógenos, devendo-se ter o cuidado de deixar aproximadamente entre cinco e dez folhas na planta (Fig.6C). A colheita é feita manualmente, uma ou duas vezes por ano, a partir do terceiro ano (Fig.6D). 13 Figura 6. (A) Bulbilhos de sisal; (B) Rebentos de sisal; (C) Coleta de folhas de sisal; (D) Folhas de sisal coletadas. 2.4 - Diversidade genética em populações naturais O estudo da diversidade genética compreende a descrição dos níveis de variabilidade genética mantida dentro das populações e como esta se distribui entre as mesmas (HAMRICK, 1989). Fatores evolutivos como a deriva genética e seleção natural são afetados pela dinâmica populacional de plantas, proporcionando modificações na estrutura genética e das populações (GAIOTTO et al. 2003). 14 Estudar a diversidade genética entre acessos de uma cultura, além de possibilitar a identificação de materiais genéticos muito próximos ou duplicados, indica aqueles genótipos mais distantes geneticamente, os quais poderão ser recomendados para futuros programas de policruzamentos no desenvolvimento de cultivares melhorados (SCAPIM et al. 1999). Populações naturais de animais e plantas raramente são compostas de alelos distribuídos aleatoriamente, mas refletem um complexo mosaico de genótipos. (HAMRICK, 1990; ASPINWALL & CHRISTIAN, 1992; LYNCH & MILLIGAN, 1994; HÄNFLING & BRANDL, 1998; SCHLÄPFER & FISCHER, 1988; AYRES & RYAN, 1998). A abundância relativa desses genótipos não é fixa, mas pode variar ao longo do ciclo de vida da espécie. Assim, as populações naturais de plantas e animais são geneticamente estruturadas no tempo e no espaço (HOSSAERT-MCKEY et al. 1996). Essas afirmações surgiram com o avanço das técnicas de biologia molecular ao longo das últimas décadas, que possibilitaram quantificar a variabilidade genética. Ao longo do tempo a estrutura genética tem se mostrado resultante de processos como reprodução e dispersão e da sobrevivência dos indivíduos de uma população. LOVELESS & HAMRICK (1994) analisaram várias características em espécies de plantas, a fim de analisar a variabilidade genética. Dentre estas estão o efeito de sistemas de acasalamento, morfologia floral, mecanismos de polinização, modos de dispersão, ciclos de vida e o tamanho das populações. Em plantas clonais, que possuem um sistema misto de reprodução sexual e assexual, a clonalidade pode afetar a variação genética e a estrutura das populações. Um crescimento clonal não produz qualquer variação genética a menos que ocorra uma mutação (HARPER, 1977; ABRAHAMSON, 1980). Os padrões espaciais e genéticos resultam geralmente da heterogeneidade ambiental e pressões seletivas diferenciais. Enquanto os padrões espaciais frequentemente têm implicações genéticas, os padrões genéticos podem existir sem uma distribuição espacial não aleatória dos indivíduos. De forma contrária, uma população pode ter uma distribuição espacial sem qualquer acompanhamento de estrutura genética (LOVELESS & HAMRICK 1984). 15 A heterogeneidade temporal e um fator importante que deve ser levado em conta quando se estuda a diversidade genética de populações naturais, já que mudanças podem ocorrer ao longo do tempo na população pela ação natural ou antrópica. Estudos já demonstraram que este fator pode influenciar a variação genética dentro e entre populações (HOSSAERT-MCKEY et al. 1996). Segundo HAMRICK (1990), os padrões de colonização e os eventos estocásticos que afetam o estabelecimento e a mortalidade também são importantes, juntamente com a heterogeneidade ambiental, para explicar a ocorrência agrupada das plantas em locais distintos. Vários trabalhos evidenciam que a variabilidade genética em populações de plantas está distribuída não aleatoriamente. Similarmente às próprias plantas, os genes e genótipos tendem a estar agrupados, com diferentes marcadores genéticos ocorrendo a pequenas distâncias. 2.5 - Marcadores Moleculares Até meados da década de 60, os estudos genéticos eram desenvolvidos com marcadores morfológicos de fácil identificação no organismo e geralmente regidos por um único gene. Suas principais vantagens residiam no fato de serem simples rápidos e com baixo custo de análise (BRETTING & WIDRLECHENER, 1995). Apesar dos marcadores morfológicos terem contribuído significativamente para o estabelecimento dos princípios teóricos do mapeamento genético e das análises de ligação gênica (KNAPP, 1991), um pequeno número de marcadores morfológicos diferentes em uma mesma linhagem diminui a probabilidade de se encontrar associações significativas entre esses, e caracteres de importância para programas econômicos ou estudos teóricos (BORÉM, 1998). Além disso, tais marcadores frequentemente são afetados pela ação gênica de dominância, efeito ambiental, pleiotropia e epistasia (PATERSON et al. 1991). O surgimento da reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) foi um dos passos revolucionários nos estudos genéticos, pois possibilitou a produção de múltiplas cópias de seqüências específicas de DNA 16 sem a necessidade de clonar esses segmentos (ALBERTS et al. 1994). A metodologia usada para a amplificação in vitro de sequências de DNA (pequenas moléculas de DNA de fita simples) iniciadores de sequência conhecida e complementar às extremidades do segmento a ser amplificado (Primers), direcionando a síntese de DNA alvo em ciclos repetidos. As variações (polimorfismos) são geradas pela variação existente no genoma do organismo, que são identificadas através do uso de Primers que flanqueiam regiões de interesse, auxiliando nos estudos de genética de população (MULLIS, 1990; BARCACCIA et al. 2003). Com a PCR, o DNA passou a ser o ponto focal na genética de populações, aprimorando as técnicas de biologia molecular (BORÉM, 1998). As tecnologias de análise molecular da variabilidade do DNA permitiram determinar pontos de referência nos cromossomos, que passaram a ser chamados “marcadores moleculares” (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Qualquer sequência genômica proveniente de um segmento específico de DNA correspondente a regiões expressas ou não do genoma é chamada de Marcador Molecular. O desenvolvimento desses marcadores veio dar um impulso à pesquisa genética, propiciando a detecção de polimorfismo de DNA com comportamento Mendeliano, passível de ser utilizado em diferentes áreas da genética e do melhoramento de plantas (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Os marcadores moleculares fornecem ferramentas únicas capazes de identificar a variação genética existente entre e dentro de populações, em função do alto grau de precisão e informação que pode ser obtido pelo “fingerprinting” molecular ou genotipagem que é a impressão digital de um determinado genótipo, permitindo a obtenção de seu perfil genético e sua diferenciação inequívoca de outro genótipo (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998; BREDEMEIJER et al. 2002; MAGALHÃES et al. 2003; VIJAYAN et al. 2004). Os distintos tipos de marcadores moleculares hoje disponíveis diferenciam-se pela tecnologia utilizada para revelar variabilidade no DNA, polimorfismo molecular, expressão gênica, distribuição no genoma, custo de implementação e operação (GRIFFITH et al., 2000). 17 Para FERREIRA & GRATTAPAGLIA (1998), os marcadores moleculares se caracterizam pela: a) Unicidade: cada indivíduo tem um perfil de DNA único com exceção de clones de uma planta ou gêmeos univitelinos no caso de animais; b) Mutabilidade extremamente baixa: o DNA de um indivíduo é o mesmo em todas as células e este é estável ao longo de sua vida; c) Estabilidade física: moléculas de DNA podem ser recuperadas, purificadas e analisadas com sucesso a partir de praticamente todo e qualquer material biológico; d) Variabilidade: apesar do fato de que a maior parte do genoma é muito conservada entre indivíduos, algumas regiões genômicas específicas são altamente variáveis permitindo uma discriminação altamente precisa. Os métodos que utilizam diretamente o DNA apresentam grandes vantagens por não serem afetados pelo ambiente e por apresentarem um elevado poder de discriminação. Além disso, o polimorfismo de DNA pode ser muito útil na definição de um grupo de acessos geneticamente representado pelo germoplasma do qual ele é originado. Uma coleção nuclear representa um subgrupo derivado de uma coleção inteira que é composta de um pequeno número de acessos que juntos devem representar o máximo possível da diversidade genética existente em toda a coleção (FRANKEL & BROWN, 1984). 2.6 - Estudos com Marcadores Moleculares em Agave 2.6.1 - RAPD Uma das técnicas de análise genética muito utilizada em estudos populacionais consiste na utilização de marcadores moleculares RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, WILLIAMS et al.1990). Esta tecnologia é muito utilizada na obtenção de informações na análise genômica. Utiliza um único Primer em vez de um par, e esse tem sequência arbitrária de modo que o alvo é 18 desconhecido e irrelevante. Os marcadores RAPD se baseiam na amplificação de fragmentos de DNA sendo vantajosa pela simplicidade e rapidez a baixos custos. Assim, grande quantidade de polimorfismo e de segmentos de DNA é obtida em curto espaço de tempo, apresentando-se de forma binária, ou seja, pela presença ou ausência da banda. ROJAS et al. (2007) estudaram seis populações de variedades de Agave: "Manso" (Agave salmiana var. "Salmiana"), "Ayoteco" (Agave salmiana var. "Ayoteco"), "Verde", "Carrizo" (Agave mapisaga Trel), "Negro" e "Xilometl" no Nordeste do Estado do México, para determinar a diversidade genética entre e dentro delas, obter a impressão digital genética relevante, e fazer comparações para diferenciar suas variantes genéticas, usando RAPD e variáveis morfológicas. A análise de variância mostrou diferenças significativas (P ≤ 0,01) entre as populações para a altura da planta, número de folhas, comprimento da folha, largura da folha, número de espinhos laterais e comprimento da coluna principal. O percentual total de locos polimórficos foi de 73,2%, mas dentro de populações a variabilidade genética foi reduzida, com percentagens de locos polimórficos que variaram de 12,2% para o maguey "Verde" e 32,5% no maguey "Manso" e "Ayoteco". A diversidade genética média de Nei (H) foi de 0,28 ± 0,20, confirmando a baixa diversidade dentro das populações. O grau de fluxo gênico foi baixo (Nm = 0,24), indicando a ocorrência de menos de um migrante por geração entre as seis populações. RODRÍGUES-GARAY et al. (2008) avaliaram por meio de caracteres morfológicos e por RAPD, a diversidade genética em 49 espécies de Agave tequilana Weber var. azul de diferentes regiões produtoras de tequila, e dezoito de Agave angustifolia Haw var. Lineño do sul do estado de Jalisco no México. Treze caracteres morfológicos e três diferentes Primers de RAPD aleatórios foram utilizados. Os resultados indicaram que diferenças existem em nível genômico, onde a diversidade foi maior quando comparada com dados morfológicos. Embora a correlação entre os dados morfológicos e RAPD tenha sido baixa, ambos os métodos permitiram a diferenciação entre Agave angustifolia de Agave tequilana. NAVARRO-QUEZADA et al (2003) estudaram através da técnica de RAPD a diferenciação genética do complexo Agave desertii var. desertii, Agave 19 cerulata Trel. e Agave subsimplex Trel. no deserto de Sonora. A diferenciação genética e o status taxonômico em relação à distribuição espacial de 14 populações do complexo foram analisados para compreender a evolução e o processo de especiação dentro do gênero. Frequências alélicas, níveis de variação genética, heterozigosidade esperada (HS), proporção de lócus polimórficos (P), e diferenciação genética foram estimadas utilizando 41 loci RAPD. Todas as três espécies apresentaram altos níveis de variação genética. 2.6.2 - AFLP Em 1993, os pesquisadores ZABEAU & VOS, desenvolveram e divulgaram outro marcador molecular denominado AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados). Esta técnica combina os alvos para estudo do polimorfismo pelos marcadores RFLP e RAPD: a distribuição aleatória de sítios de restrição entre genomas e a amplificação aleatória de fragmentos empregando-se Primers de sequências arbitrárias. A característica fundamental desta técnica é a capacidade de revelar simultaneamente muitas regiões diferentes distribuídas aleatoriamente ao longo do genoma (MUELLER & WOLFENBARGER, 1999). GIL-VEGAS et al. (2006), estudaram nove variedades de Agave tequilana Weber utilizando a técnica de AFLP, visando determinar a proximidade genética entre elas e a Agave tequilana var. “Azul”. Nesse trabalho encontraram um nível significativo de diversidade entre Agave tequilana var. “Azul” cultivadas quando comparadas com outras coletadas em Guanajuato no estado do México. Para as nove variedades de Agave tequilana, um total de 333 bandas foram analisadas das quais 203 foram polimórficas (61%) sobre todas as variedades e 78 de 301 foram polimórficas em Agave tequilana var. “Azul” (26%). A análise de AFLP revelou diferenças nos padrões genotípicos de bandas entre diferentes Agave tequilana var. “Azul” de amostras coletadas em campos diferentes em Guanajuato, indicando um nível significativo de diversidade na Agave tequilana var. “Azul” de germoplasmas cultivados nesta região. 20 HERNANDEZ & FLORES (2004) fizeram um inventário das espécies de Agave, no estado de Jalisco no México, utilizando AFLP, revelando uma ampla diversidade genética entre os genótipos estudados. INFANTE et al. (2003) fizeram uma análise com marcadores moleculares, usando AFLP para estudo da variabilidade genética assexuada em Agave fourcroydes Lem. Demonstrando as diferenças no padrão de amplificação em uma população natural, enquanto esse padrão é conservado em amostras da mesma planta. Uma análise de cinco diferentes populações mostrou diferenças ao nível de população. A comparação do padrão de bandas AFLP entre duas plantasmãe com seus descendentes mostra que nesta espécie a variabilidade genética é gerada e transmitida aos descendentes através da reprodução assexuada. Consequentemente é possível selecionar os indivíduos de uma população clonal para a melhoria populacional. 2.6.3 – ISSR ISSRs são marcadores semiarbitrários, ampliados por PCR em presença de um oligonucleotídeo complementar para um microssatélite designado. Como um marcador com base em PCR, o ISSR tem algumas vantagens quando comparado aos outros marcadores. A amplificação não requer informações de sucessão do genoma e de padrões altamente polimórficos (ZIETKIEWICZ et al. 1994). Cada faixa corresponde a uma sequência de DNA delimitada por dois microssatélites invertidos. Também, as sequências-alvo dos ISSRs são abundantes ao longo do genoma de eucariontes e evoluem rapidamente (FANG et al. 1997; ESSELMAN et al.1999). Os ISSRs têm provado serem úteis no estudo de genética de populações, especialmente em detecção clonal, diversidade e revelação de indivíduos proximamente relacionados (SALIMATH et al. 1995; OLIVEIRA et al. 1996). Esta técnica de amplificação, visando a marcação de genes dominantes em múltiplos locos, tem-se revelado consistente na identificação de cultivares e espécies estreitamente relacionadas (GODWIN et al. 1997; BORNET & BRANCHARD, 2001) e para estimar a diversidade genética, estrutura 21 populacional e processos evolutivos em plantas (WOLFF & MORGANRICHARDS, 1998; ZIZUMBO-VILLARREAL et al. 2005). Além disso, tem sido desenvolvida e utilizada em estudos similares de Agave (AGUIRRE, 2004; ROCHA, 2006). DÁVILA et al. (2007) usaram marcadores ISSR para avaliar sua utilidade em estabelecer relações genéticas entre Agave cocui Trel. e outras espécies do mesmo gênero, bem como a variabilidade genética existente entre os indivíduos da espécie Agave cocui Trel., Agave angustifolia Haw. e Agave tequilana . A técnica mostrou-se muito útil para determinar variações genéticas inter e intra-populacional em espécies de Agave. GOTTDIENER (2008) utilizou marcadores ISSR pra estudar a diversidade genética e estrutura de populações selvagens e cultivadas de Agave cupreata e Agave potatorum. No trabalho foram estimadas as distâncias genéticas que separavam as populações estabelecendo-se as relações genéticas entre elas. Noventa lócus polimórficos foram amplificados por meio de quatro Primers de ISSR. Em ambas as espécies foram encontradas baixa diversidade genética entre as populações. GONZÁLEZ & HAMRICK (2005) estudaram a Biologia reprodutiva e genética de populações cultivadas e selvagens de Agave garciae-mondozae da região de Chilapa, Gro. México, através da técnica de ISSR encontrando níveis de variação genética e fluxo gênico relativamente alto e diferenciação genética moderada. Estudando doze populações de Agave striata Zucc. utilizou marcadores ISSR, encontrando altos níveis de variação genética HERNANDEZ (2006). EGUIARTE et al. (2003) analisaram a variação genética dentro e entre populações de duas espécies produtoras de mezcal Agave potatorum e Agave cupreata Trel. selvagens e de herbário, através da técnica de ISSR, com intuito de avaliar os seus recursos genéticos, os relacionamentos de parentesco entre as populações e o impacto que a extração excessiva desses recursos, o desmatamento e as diferentes práticas de gestão podem trazer. 22 2.6.4 - Análise da diversidade e estrutura genética a partir de marcadores moleculares dominantes (ISSRs). O método de ISSR foi escolhido para esse estudo por ser uma técnica simples, eficiente, possuir alta reprodutibilidade e gerar altos índices de polimorfismo (REDDY et al., 2002). Vários estudos têm apresentado alto conteúdo de informação genética revelado por estes marcadores, que parecem ser especialmente apropriados para estudos filogenéticos, de avaliação da diversidade genética e identificação de cultivares (RAKOCZY-TROJANOWSKA & BOLIBOK, 2004). Os estudos de genética de populações pretendem determinar a variação genética existente em populações naturais e explicar quais as suas origens, manutenção e importância evolutiva (HARTL & CLARK, 1997). Estas variações são quantificadas em função da estrutura genética da população, o que permite determinar e predizer o estado atual das populações, fazer conjecturas e reconstruir a história evolutiva da espécie (HEDRICK, 2000). As forças evolutivas afetam a variação genética nas populações naturais. A fonte principal do aumento da variação é a mutação. A endogamia e a deriva gênica diminuem a variação. A seleção e o fluxo gênico podem aumentar ou diminuir os níveis de variação dependendo da situação e da espécie (HEDRICK, 2000). O resultado final da variação genética nas populações se deve em grande parte, à ação de uma ou de várias forças evolutivas. A diversidade genética é introduzida continuamente nas populações e pode ser perdida por deriva genética, endocruzamentos e pela maior parte dos tipos de seleção natural (NEI, 1987). As forças que geram e amplificam a variabilidade genética são fundamentais para o processo evolutivo, pois a adaptação de cada espécie ao longo das gerações depende da existência da variabilidade sobre a qual a seleção natural possa atuar (BRAMMER, 1993). Entre um grupo de progenitores, a diversidade genética tem sido avaliada com o objetivo de identificar as combinações hibridas de maior efeito heterótico e maior heterozigose de tal forma que, em suas gerações segregantes, se tenha 23 maior possibilidade de recuperação de genótipos superiores (CRUZ & REGAZZI, 2001). NODARI & GUERRA (2004) associaram o conceito de diversidade à variação genética propondo que a heterozigosidade esperada é uma medida para quantificar a diversidade. Considera-se que, a nível genético, qualquer diferença alélica na presença ou ausência de "loci" é causada por um códon. Portanto, a partir de dados de freqüência de alelos, é possível calcular estatisticamente o número médio de diferenças nos codons ou bases de nucleotídeos por loco, uma vez que este número é uma medida direta de diferenças genéticas entre duas populações, e é considerado como uma medida de distância genética (NEI, 1987). A estrutura genética de uma população desempenha um papel preponderante na sua evolução, podendo influenciar nos níveis de seleção, na quantidade de variação genética e na manutenção da capacidade de explorar as oportunidades do ambiente. O uso do termo estrutura genética tem sido feito de várias maneiras, entre as diversas definições, uma das mais abrangentes e ao mesmo tempo sucinta diz que: e a distribuição não ao acaso de alelos ou genótipos no tempo e no espaço. Esta pode apresentar-se estruturada espacialmente em diferentes escalas, tais como: populações, subpopulações ou entre indivíduos vizinhos devido aos sistemas de reprodução e dispersão, e também da história de vida das espécies, gerando um maior grau de parentesco dentro dos grupos do que entre os grupos (LOVELESS & HAMRICK 1984). A determinação da estrutura e da variação genética entre e dentro de populações, por marcadores dominantes, tornou-se possível a partir da introdução da estatística ɸ, por EXCOFFIER et al. (1992) e usada pela primeira vez por HUFF et al. (1993). EXCOFFIER et al. (1992) desenvolveram uma análise de variância que incorporava informações sobre a divergência de DNA de dados provenientes de haplótipos. Esta nova abordagem denominada análise de variância molecular (AMOVA), possibilitou a produção de estimativas dos componentes de variância das análogas estatísticas F, chamada pelos autores de estatística Fst ɸ, que mostra a correlação da diversidade dos haplótipos em diferentes níveis de subdivisão hierárquica. Na estatística de F de Wright (Wright), o haplótipo de um indivíduo é 24 representado por um vetor p, com valores (1), caso a banda esteja presente e (0), quando não estiver presente (EXCOFFIER et al. 1992). A estrutura genética é estimada por meio do GST ou pela análise de variância molecular (AMOVA), ambos produzindo resultados semelhantes (NYBOM & BARTISH, 2000). Outros parâmetros observados são o número de alelos efetivos e a porcentagem de lócus polimórficos. O método de AMOVA ajusta variados tipos de matrizes de entrada fornecida por diversos tipos de marcadores moleculares e diferentes tipos de pressuposições evolutivas, sem modificar a estrutura básica da análise. A base dessa análise de variância está na forma de tratamento das distâncias genéticas como desvios da média de um grupo utilizando os quadrados dos desvios como variância, permitindo a partição da variação genética entre e dentro das populações analisadas. A correlação entre os pares de haplótipos aleatórios dentro da população é feita tomando em consideração os pares de haplótipos ao acaso da espécie como um todo, associada à diversidade entre os pares de indivíduos tomados ao acaso dentro de uma região (EXCOFFIER et al., 1992). Outro tipo de análise em genética de populações é a utilização do índice de Shannon Wainer (LEWONTIN, 1972), usado em estudos de genética de populações para indicar a diversidade da espécie por área. O uso desse índice é importante como medida de diversidade populacional, quando se tem dados dominantes, quando não é possível detectar os genótipos heterozigotos. Os coeficientes de Similaridade, disponíveis para dados binários, baseiam-se na comparação entre o número de atributos comuns para um par de objetos e o número total de atributos envolvidos. Tais coeficientes podem ser facilmente convertidos para coeficientes de dissimilaridade: se a similaridade for denominada s, a medida será o seu complementar (1-s). Os coeficientes de similaridade podem ser divididos em dois grupos: os que consideram a ausência conjunta e os que não consideram a ausência conjunta (MEYER, 2002; CARLINI-GARCIA, 1998). Segundo CLIFFORD & STEPHENSON (1975), a escolha dos coeficientes, que estão restritos ao intervalo [0,1] é mais adequada, pois índices que tendem ao infinito são sensíveis a pequenas mudanças, especialmente em a. O 25 Coeficiente de Jaccard compara o número de bandas comuns presentes e o número de bandas envolvidas, excluindo o número de ausências conjuntas (MEYER, 2002). O coeficiente de similaridade de Jaccard de acordo com SNEATH & SOKAL (1973) é determinado a partir da expressão: Sij= a/(a+b+c) Onde a é o número de vezes que ocorre a presença de bandas nos dois indivíduos (i e j) simultaneamente, b é o número de vezes que ocorre a presença de banda apenas no indivíduo i e c é o número de ocorrências de banda somente no indivíduo j. Valores de similaridade igual a um foram utilizados para identificação de indivíduos com o mesmo perfil de bandas, e estes foram determinados como clones. O complemento do índice de Jaccard (1-S) foi utilizado para descrever a dissimilaridade (D) entre indivíduos. A dissimilaridade média entre grupos de indivíduos como um índice descritivo para comparação da diversidade entre diferentes grupos e populações (RIBEIRO, 2009). Dentre os métodos de agrupamento mais utilizados, estão os hierárquicos e os de otimização. Nos métodos hierárquicos, o agrupamento dos genitores é realizado por meio de um processo que se repete em vários níveis até que seja construído o dendrograma, que permitirá estabelecer a relação entre esses genitores (CRUZ & SCHUSTER, 2004). 26 3. OBJETIVOS 3.1 - Objetivo geral Analisar a diversidade genética em acessos de Agave sisalana (sisal), da região sisaleira baiana, visando conhecer a variabilidade intra e interpopulacional existente em seis municípios de maior representatividade no cultivo do sisal no estado da Bahia, por meio de marcadores moleculares dominantes do tipo ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). 3.2 - Objetivos específicos Calcular os níveis de variação genética. Estudar a estrutura genética das populações através da estatística GST e calculando a divisão da variação genética por meio da análise de AMOVA (Analysis of Molecular Variance). Estimar as distâncias genéticas que separam as populações e estabelecer relações genéticas entre as mesmas, através de métodos de distância e agrupamento, e métodos de inferência bayesiana. Comparar os índices de diversidade genética obtidos em Agave sisalana em relação a outras plantas cultivadas através de propagação assexuada e populações naturais em geral. 27 4. HIPÓTESES Este trabalho teve como base as seguintes hipóteses: 1. O Agave sisalana é uma espécie predominantemente de reprodução clonal, e por isso deve apresentar baixa diversidade e estruturação genética. 2. Devido ao fato de Agave sisalana ser uma espécie introduzida, a variabilidade e a divergência genética entre as populações deve ser baixa devido ao efeito do fundador na introdução dos indivíduos originais. 28 5. MATERIAL E MÉTODOS 5.1 - Área de estudo e amostragem A pesquisa foi realizada em áreas do semiárido baiano, caracterizadas pela alternância de duas estações bem marcadas: a das chuvas e a da seca. A vegetação é representada pela caatinga hipoxerófila. Os municípios escolhidos para fornecimento dos indivíduos (bulbilhos e rebentos) para o desenvolvimento do presente trabalho (Fig.7) compõem a área de Identidade do Sisal e Piemonte da Diamantina, demonstrados nas figuras (Fig.1 e 2). Justifica-se a escolha de: JAC, CF, VAL, SD, STL, e OUR, conforme as coordenadas geográficas relacionadas (Tab. 1), por apresentarem a agricultura sisaleira e atividades a ela relacionadas como sua mais importante atividade econômica, em cada município foi coletada uma única população. As distâncias entre as cidades estão demonstradas na (Tab.2). A amostragem constitui-se em uma etapa de grande importância no delineamento da pesquisa, pois é capaz de determinar a validade dos dados obtidos. Sua idéia básica refere-se "à coleta de dados relativos a alguns elementos da população e a sua análise, que pode proporcionar informações relevantes sobre toda a população". A amostragem probabilística foi escolhida para a realização do projeto, pois é importante que cada elemento da população tenha uma chance conhecida e diferente de zero de ser selecionado para compor a amostra (MATTAR, 1996). 29 Figura 7. Regiões escolhidas para coleta dos genótipos de sisal – Adaptado de SEI (2011). 30 Tabela 1. Coordenadas geográficas e altitudes dos locais de coleta das seis populações de sisal (Agave sisalana) cultivadas no estado da Bahia. Municípios Número de indivíduos Coordenadas por município geográficas Altitude (m) S 11° 01’ 19,4’’ Jacobina (JAC) 25 742 W 40° 46’ 07,6’’ S 11° 25’ 49,5’’ Campo Formoso (CF) 25 580 W 40° 35’ 38,8’’ S 11° 20’ 29,3’’ Valente (VAL) 25 358 W 39° 27’ 30,3’’ S 11º 27’ 56’’ São Domingos (SD) 25 310 W 39º 31’ 34’’ S 11° 15’ 21’’ Santaluz (STL) 25 370 W 39° 22’ 29’’ S 10° 48’ 09.0’’ Ourolândia (OUR) 25 667 W 41° 16’ 11,9’’ 31 Tabela 2. Distâncias em Km, entre os municípios de coleta das populações de Agave sisalana. Municípios JAC CF VAL SD STL JAC - - - - - CF 101 - - VAL 137 203 - - - SD 123 189 14 - - STL 158 224 20 35 - OUR 69 170 206 192 227 - - Legenda: Municípios: Ver tabela 1 para o nome das populações. 5.2 - Coleta de campo - Material vegetal Nas seis localidades escolhidas, o espaço amostral em cada fazenda foi determinado medido em quadrados (Fig. 8A e 8B), um maior com 100 m2 subdividido em cinco menores de 25m2 cada (ANEXO 1). Os bulbilhos e os rebentos foram coletados com cuidado para não haver mistura de genótipos (Fig. 8C). Em cada município coletou-se 25 indivíduos de forma aleatória, visando obter uma amostra randômica, proporcionando a todos os indivíduos da população a mesma chance de serem coletados. As plantas fornecedoras dos genótipos foram enumeradas e marcadas para facilitar outras coletas caso fossem necessárias (Fig.8D). 32 Figuras 8. (A e B) Demarcação do espaço amostral em uma das áreas de coleta; (C) Coleta de bulbilhos; (D) Marcação de uma planta fornecedora de genótipos. 33 5.3 - Extração de DNA genômico Logo após as coletas, os materiais foram levados ao Laboratório de Sistemática Molecular de Plantas (LAMOL) da Universidade Estadual de Feira de Santana- BA (UEFS), onde todas as etapas experimentais foram realizadas. Para extração de DNA do material fresco, foi seguido o protocolo de DOYLE & DOYLE (1987) fazendo adaptações a microtubos em substituição aos tubos. (Conforme Anexo 2). 5.4 – Verificação da integridade do DNA A amostragem inicial foi de 150 indivíduos, mas observou-se que na população de SD, dez indivíduos apresentaram baixa qualidade do DNA, reduzindo assim, o tamanho amostral a 140 indivíduos, não foi feita uma nova recoleta na população por não haver bulbilhos disponíveis por ocasião na fazenda, já que a emissão dos bulbilhos ocorre apenas uma vez durante todo o ciclo reprodutivo da planta. As amostras de DNA foram aplicadas em gel de agarose a 1,2%. Após a migração do DNA no gel por eletroforese, visualizando em trans-iluminador com luz ultravioleta/365 Nm e fotografado, possibilitando a avaliação da qualidade e integridade geral do DNA das amostras. Esta avaliação, algumas vezes, revelou a necessidade de novas extrações para que fosse obtida uma amostra de melhor qualidade. 34 5.5 - Condições de amplificação 5.5.1 - Seleção dos Primers Foram testados 18 Primers através de uma reação de PCR, em seis indivíduos, um de cada população, escolhidos de forma aleatória para a verificação do perfil de amplificação. A visualização de cada Primer foi feita em gel de agarose após eletroforese. Dos 18 Primers de ISSR testados nove demonstraram maiores índices de variabilidade os quais foram utilizados na realização do experimento (Tab.3). Como os ISSRs constituem marcadores dominantes multilocos o uso de um número pequeno de Primers é suficiente para fornecer informações relevantes para os estudos de polimorfismos dentro e entre populações de plantas (GE et al. 2005; 2006; XIA et al. 2007; LI & JIN, 2008). Os volumes dos componentes do mix de amplificação foram testados um a um a fim de encontrar concentrações que melhor produzissem os resultados esperados de amplificação. As amplificações do DNA foram realizadas em termociclador, para cada reação, foi preparado um volume maior de 30 μl caso houvesse uma eventual necessidade de correr um novo gel. Cada mix de amplificação foi composto por: Tampão 10X; MgCl2 (1,25mM); DNTP (1,25mM); Primer a 10 pmol; aditivo Betaína (0,005mM); Taq DNA polimerase (5U); H2O (q.s.p.) e 0,8 μl de DNA total, com concentração de 80ng. O programa utilizado no termociclador para as reações de PCR obedeceu às seguintes condições: 94ºC por 1,5 minutos de Pré-melt, a seguir, a 35 ciclos de amplificação. Em cada ciclo os passos foram: 94ºC por 40 segundos para desnaturação; anelamento em 46ºC por 45 segundos e extensão 72ºC, por 1,5 minutos. Após os ciclos, as amostras foram mantidas a 72ºC por 7 minutos, para extensão final. 35 Tabela 3: Relação dos Primers de ISSR amplificados e suas respectivas sequências iniciadoras. Primer Sequência iniciadora UBC 814 (CT)8-TG UBC 902 (GT)6-AY UBC 844 (CT)8-RC UBC 899 (CA)6-RG MAO (CTC)4-RC OMAR (GAG)4-RC JOHN (AG)7-YC GOOFY (GT)7-YG MANNY (CAC)4-RC Os produtos da reação foram separados em eletroforese em gel de agarose 1,8 % em Tampão SB 1X, corados com brometo de etídio e fotografados sob luz UV. 36 5.6 - Estudo de variabilidade As análises estatísticas foram realizadas através de programas computacionais utilizados em estudos genético-populacionais. Na interpretação e análise dos géis, apenas as bandas mais visíveis para cada indivíduo foram selecionadas como marcadores moleculares. Esses dados foram inseridos no programa GelCompar II versão 5.1 (Applied Maths, EUA), o qual fez a análise e associação entre todos os géis dos diversos Primers para todas as populações, obtendo-se assim uma matriz binária de valores zero e um, relacionando ausência ou presença dos marcadores nos diferentes loci selecionados, nas seis populações de Agave sisalana. Como houve dados faltantes a análise foi feita duas vezes; uma vez considerando esses dados e outra vez sem levá-los em consideração. As bandas amplificadas em pares de base tiveram o tamanho de seus fragmentos estimados comparando-os com o marcador ladder 100 pb (Ludwig). A partir dos resultados obtidos, uma matriz binária foi construída pelo programa GelCompar II, observando a presença de bandas exclusivas dentro de uma população ou entre populações, o número e a porcentagem de bandas polimórficas por Primers, determinando assim, a quantidade de lócus polimórficos para cada população. A análise dos perfis genéticos dos dados permitiu fazer estimativa dos componentes de variância atribuindo às diferenças existentes entre as seis populações, entre as regiões e entre indivíduos dentro das regiões utilizando o coeficiente de similaridade de Jaccard (1908), através dos programas GenAlEx (PEAKALL & SMOUSE, 2006), PopGene 2.2 (ROHLF, 2002) e Structure 2.3.3 (PRITCHARD et al., 2000). A matriz de similaridade construída a partir do índice de Jaccard foi aplicada à análise de agrupamento segundo o método das médias aritméticas de grupos não ponderados UPGMA - Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean e utilizada para a construção de um dendrograma. Segundo o recomendado pelo método UPGMA, considerou-se as seis populações, que foram agrupadas de forma sucessiva, baseando-se em sua proximidade. 37 O dendrograma construído representou graficamente os agrupamentos, sob a forma de diagrama de árvore nos quais o eixo das abcissas está representando as populações e o eixo das ordenadas representa os níveis em que os indivíduos foram agrupados. O programa PopGene (Population Genetic Analisys) Versão 1.31 (YEH et al. 1999) foi usado para estimar a partir das frequências alélicas os seguintes parâmetros de Diversidade Genética: Índice Shannon-Wiener (I), Heterozigose Esperada (He), diferenciação genética intrapopulacional (GST), porcentagem de locos polimórficos (P%) e Número de migrantes (Nm) (NEI, 1973); Distância Genética (NEI, 1978) e Número de Alelos por Loco. A diferenciação genética e a distribuição da variabilidade genética entre e dentro da espécie foi estimada através da Análise de Variância Molecular (AMOVA) (EXCOFFIER et al, 1992), utilizando o programa PopGene, Versão 1.31 (YEH et al., 1999). Os componentes de variância utilizados foram: o ST análogo ao GST, estima a variabilidade genética que existe entre as populações e a sua significância, considerando o conjunto como um todo; o PR estima a diversidade entre as populações; o PT estima a diversidade dentro e entre as populações e o RT que mensura a diversidade apenas entre as regiões. Como os marcadores moleculares ISSR’s são marcadores dominantes, os heterozigotos não podem ser distinguidos. Por isso, foram estimados com base na frequência dos alelos recessivos a partir de indivíduos sem presença de determinada banda. Partindo do pressuposto de que cada faixa da matriz corresponde a um locus genético (banda), as frequências alélicas foram estimadas em q = raiz quadrada da frequência de '0' fenótipos, utilizando a correção de (LYNCH & MILLIGAN, 1994), aplicado pelo software AFLPsurv (VEKEMANS, 2002). O software AFLPsurv produz matrizes de pares de distâncias genéticas entre populações (com bootstraps) e os coeficientes de parentesco entre os indivíduos em pares, fazendo vários testes de significância baseado em permutações aleatórias (VEKEMANS, 2002). O cálculo da relação genética entre pares de indivíduos, através do estimador de relação genética (rxy) de RITLAND (1996) foi feito através do 38 programa GenAlEx 6.0, o qual permitiu que fosse medida a proporção de alelos idênticos por descendência entre dois indivíduos. O programa calculou também, o número de alelos efetivos (Ae), ou seja, aqueles que efetivamente passarão à geração seguinte (PEAKALL & SMOUSE, 2006). A análise dos dados utilizando o programa GenAlEx Versão 6.0, permitiu determinar os parâmetros abaixo (PEAKALL & SMOUSE, 2006) - Tamanho da amostra: Número de acessos analisados. - Frequência de alelos: A proporção de uma forma alélica de um gene entre todas as cópias de um gene na população. - Número de alelos: número de alelos gerada pelo locus. - Número de alelos privados e de partilha de alelos. O programa GenAlEx Versão 6.0 (PEAKALL & SMOUSE, 2006) foi utilizado também para fazer a análise de coordenada principal (PCoA), que é uma técnica de ordenação multivariada que procura reduzir a dimensionalidade da matriz de dados através da localização de eixos que representem as maiores extensões da população no espaço N-dimensional, resumindo a composição de indivíduos das populações. Os resultados foram plotados usando software Microsoft Excel 2007. Esta análise produziu estimativas de componentes de variância e valores similares para as estatísticas F, refletindo a correlação da diversidade haplotípica em diferentes níveis de subdivisão hierárquica (EXCOFFIER et al. 1992). O software Structure 2.3.3 (FALUSH et al 2009), implementa uma abordagem bayesiana a partir de dados de genótipo. Seu uso permitiu inferir a existência de populações distintas, estudando as zonas híbridas, os migrantes, identificando a presença de indivíduos miscigenados e estimando as frequências alélicas da população pressupondo que cada indivíduo possa ter ascendência de uma única população. O algoritmo básico foi descrito por PRITCHARD et al. (2000). As extensões para o método foram publicadas por (FALUSH et al. 2003, 2007; HUBISZ et al. 2009). O software Structure não só é capaz de detectar a estrutura de conjuntos de dados simulados de acordo com um modelo de ilha, mas também desempenha muito bem quando confrontado com mais complexos 39 esquemas de migração hierárquica. Em tais situações, o nível superior hierárquico da estrutura da população é detectado (EVANNO, 2005). 40 6. RESULTADOS Os Primers utilizados geraram um total de 143 bandas, variando de 13 a 19 por Primer (Tab.4). Tabela 4. Primers utilizados, seqüências e número de bandas amplificadas. Nome do Primer N° de bandas Polimórficas MAO (CTC)4-RC 15 GOOFY (GT)7- YG 15 JOHN (AG)7-YC 16 MANNY (CAC)4-RC 17 OMAR (GAG)4-RC 19 UBC 814 (CT)8-TG 13 UBC 844(CT)8-RC 18 UBC 899(CA)6-RG 16 UBC 902 (GT)6-AY 14 Total 143 Onde: R = purina (A ou G) e Y = pirimidina (C ou T). Dos 143 locos obtidos, 136 foram polimórficos (95,1%). A porcentagem de locos polimórficos (%P) variou, de 57,34% nas populações de (CF e STL) a 82,52% na população de (VAL). A média de locos polimórficos nas populações foi 63,63% (Tab. 5). Esses resultados obedecem ao critério de polimorfismo de 95% de frequência adotada pelo software. A heterozigosidade média esperada (He) nas populações variou de 0, 150 (STL) a 0, 259 (VAL) com valor médio de 0, 180. A heterozigosidade esperada (He), não apresentou diferença significativa entre as populações. Para o índice de Shannon (I), também não foi observada diferença significativa, os valores variaram de 0, 235 (STL) a 0, 394 (VAL), a 41 média para esse Índice foi: I = 0, 279. Foram observadas bandas específicas nas populações de VAL e OUR (Tab. 5). Tabela 5. Diversidade genética de seis populações de Agave sisalana do semiárido baiano, com base em nove marcadores de ISSR. Diversidade genética População %P He I Ae N° de bandas privadas JAC 59,44 0,167 0,258 1,276 0 CF 57,34 0,164 0,254 1,269 0 VAL 82,52 0,259 0,394 1,437 3 SD 59,44 0,167 0,261 1,267 0 STL 57,34 0,150 0,235 1,246 0 OUR 65,73 0,175 0,273 1,281 4 Valor Médio 63,63 0,180 0,279 1,296 1,16 Legenda: Populações: Ver tabela 1 pra o nome das populações. P = Porcentagem de lócus polimórficos; He = heterozigosidade esperada; I = Índice de Shannon; Ae – Alelos efetivos. O dendrograma observado na figura 9 demonstra a estrutura de agrupamento que indica a existência de dois grupos reunindo as populações amostrais. No primeiro grupo as populações JAC e CF estão agrupadas com alto suporte (100% de bootstrap) e em seguida ligadas à população OUR (94% BS). O outro grupo inclui as populações VAL, SD e STL (100% BS), porém as relações entre elas demonstraram ser pouco definida, já que o suporte do agrupamento entre as populações VAL e SD é baixo (65%) 42 Pop 2 CF Pop 6 OUR Pop 1 JAC Pop 3 VAL Pop 4 SD Pop 5 STL 0,016 0,032 100 0,048 Distância de Nei 0,064 0,08 65 0,096 94 100 0,112 0,128 0,144 0 Figura 9. Dendrograma mostrando as relações fenéticas entre as populações de Agave sisalana de seis localidades: JAC, CF, VAL, SD, STL e OUR, com base em UPGMA. Nas figuras 10 e 11 são apresentadas as análises de coordenadas principais (PCoA) de todos os indivíduos das populações, indicando a porcentagem de variação explicada pelos três primeiros eixos. As três coordenadas explicam 14%, 8,69% e 6,61% da variação genética, respectivamente. No primeiro eixo (14%) observa-se uma clara separação de dois grupos, apesar de haver uma pequena sobreposição de alguns poucos indivíduos. O primeiro grupo foi composto pelas populações de JAC, CF e OUR, estando as mesmas relacionadas positivamente com o eixo; o segundo grupo formado pelas 43 populações de VAL, SD e STL (Fig.11), associadas negativamente a este eixo. No segundo eixo (8,69%) é possível perceber uma leve sepação dentro do primeiro grupo entre as três populações. 0,32 0,24 0,16 Coordinate 2 0,08 0 -0,08 -0,16 -0,24 -0,32 -0,4 -0,4 -0,32 -0,24 -0,16 -0,08 0 0,08 0,16 0,24 0,32 Coordinate 1 Figura 10. Análise de coordenadas principais (PCoA) de 6 populações de Agave sisalana. Eixo 1 ˟ 2 correspondendo a 22,69%. 44 O terceiro eixo (6,61%) permitiu ainda, dentro do grupo 2, a separação da população de OUR das de JAC, CF (Fig. 11). O restante percentual de variação em eixos subsequentes são as diferenças de indivíduos dentro das populações. 0,32 0,24 Coordinate 3 0,16 0,08 0 -0,08 -0,16 -0,24 -0,4 -0,32 -0,24 -0,16 -0,08 0 0,08 0,16 0,24 0,32 Coordinate 1 Figura.11. Análises de coordenadas principais (PCoA) de seis populações de Agave sisalana Eixo 1 ˟ 3,correspondendo a 20,61%. Os grupamentos das populações foram compatíveis com a origem geográfica das mesmas. As populações foram separadas de acordo com os territórios de Identidade propostos pelo governo do Estado. As populações de JAC, de CF e de OUR denominadas de grupo 1 estão localizadas no território de Identidade Piemonte da Diamantina (Fig. 2) e as populações de VAL, SD e de STL denominadas de grupo 2 estão localizadas no território de Identidade Sisal (Fig. 1). A análise da estrutura populacional confirmou a existência de diferenças genéticas entre os dois grupos. O K obtido nos métodos indicou a maior probabilidade para divisão do conjunto de populações em dois grupos (K=2). Os 45 gráficos com k=2 (Fig. 12) mostraram que apesar de haver uma separação em dois grupos, houve também uma leve sobreposição de indivíduos dos municípios de JAC, CF e OUR (região 1), dos de VAL, SD e STL ( região 2). A utilização de modelo indutivo permitiu identificar as relações de parentesco entre os indivíduos avaliados. A partir da análise do gráfico produzido pelo programa, pode-se observar que os indivíduos das populações VAL, SD e STL (respectivamente VAL, SD e STL) podem ter sido inseridos nas populações de JAC, na qual se observou que para alguns indivíduos a variação genômica flutuou de 15% a 98% com relação aos das populações VAL, SD e STL. Em relação ao município de CF também foi observada uma pequena mistura genômica variando entre 5% e 95% com esses municípios. Já para a população de OUR observou-se uma discreta mistura genômica também com as populações VAL, SD e STL. (Fig. 12). Figura 12. Gráfico de estruturação genética partir da analise dos dados de marcadores dominantes de ISSR com o software STRUCTURE em seis populações de sisal cultivados no estado da Bahia 1JAC. 2CF. 3VAL. 4SD. 5STL e 6OUR. A diversidade genética obtida foi significativa (P<0,001) dentro das populações. Do total de variância genética molecular encontrada para a espécie, 27% se deve às divergências entre populações, enquanto que 73% é atribuida às diferenças entre indivíduos. 46 A análise de variância molecular das populações levando em consideração sua subdivisão entre as regiões (11,44%), entre populações (18,11%) e dentro das populações (70,44%) confirmou a variabilidade (Tab. 6 ). Tabela 6. Resumo da análise de variância molecular (AMOVA). População FV % Total Entre populações 27 Dentro de populações 73 Todas Todas Estatística PT = 0,272** Entre regiões 11,44 RT=0,114** Entre populações 18,11 PR=0,205** Dentro das populações 70,44 PT= 0,296** Os valores de GST e Nm médio encontrado para as populações foram respectivamente 0,235 e 1,63. Considerando-se os dois grupos de populações produzidos pela análise de agrupamento, verifica-se que o grupo 1 apresentou GST e Nm iguais a 0,145; 2,96 e o grupo 2 apresentou respectivamente 0,172; 2,41. O nível de heterozigosidade total (Ht), para as análises a nivel de espécie (global) foi de 0,236. O grupo 2 apresentou uma média de heterozigosidade 0,192, maior que a do grupo 0,169. (Tab 7). Tabela 7. Valores de GST, Nm, Ht e Hs para as seis populações estudadas e para os dois grupos de população. Populações GST Nm Ht He Todas 0,235 1,63 0,236 0,180 Grupo 1 0,145 2,96 0,197 0,169 Grupo 2 0,172 2,41 0,232 0,192 Grupo 1 – Populações (JAC; CF e OUR; Grupo 2 – Populações (VAL; SD; STL). Nm=0,5 (1-GST)/ GST. 47 7. DISCUSSÃO Este é o primeiro estudo feito para se avaliar os níveis de diversidade genética e sua distribuição em populações de Agave sisalana, cultivadas. Segundo COLOMBO et al. (1998), para estimar relações genéticas entre populações com resultados confiáveis, é necessário usar entre sete e 30 Primers – RAPD gerando de 50 a 200 lócus polimórficos. Nesse trabalho foram utilizados nove Primers gerando 143 lócus polimórficos. Estudando genética espacial de soja selvagem, foram utilizados 15 Primers ISSR, obtendo-se 182 fragmentos (JIN et al. 2006). ALMEIDA et al. (2009), utilizaram oito Primers de ISSR para caracterizar molecularmente cultivares de cana-de-açúcar, produzindo 95% de polimorfismo. ARNAU et al. (2003) na diferenciação de 30 cultivares de morango, utilizaram cinco Primers de ISSR, gerando um total de 390 bandas das quais 113 foram polimórficas demonstrando o alto poder de discriminação dessa técnica. OKUN et al. (2008) utilizaram cinco marcadores ISSR, que foram usados para analisar a diversidade genética dentro e entre populações de eucaliptos obtendo 41 bandas polimórficas. Dessa forma, comparados os resultados obtidos nesse trabalho, com os encontrados na literatura para RAPD, por serem marcadores semelhantes, confirma-se a validação do número de Primers e locos polimórficos necessários para o desenvolvimento de um trabalho de genética de populações produzindo resultados confiáveis. Em alguns trabalhos com populações naturais (GE & SUN, 2001; ALEXANDER et al. 2004; XIA et al. 2007), a porcentagem de locos polimórficos tem sido utilizada como medida de diversidade genética. Utilizando marcadores dominantes ISSR, GEORGE et al. (2009) encontraram 99% de locos polimórficos para Piperia yadonii (Orchidaceae). LOUSADA et al 2010 utilizaram nove Primers ISSR, produzindo 89 fragmentos, apresentando uma diversidade genética de 56,6% de locos polimórficos. Esses resultados fortalecem os encontrados neste trabalho. Neste trabalho foram encontrados níveis de heterozigosidade esperada relativamente altos, tanto para análise ao nível de espécie total quanto para média das populações. Os valores encontrados neste estudo são semelhantes aos 48 encontrados por alguns autores para outras Agaves utilizando a técnica de ISSR (Tab. 8). Os resultados obtidos a partir da análise de agrupamento demonstram que as distâncias genéticas dentro dos grupos são menores, o que pode ser explicado pela menor distância geográfica entre as populações que compõem cada grupo. A tendência das populações em se agruparem de acordo com sua localização geográfica evidencia uma estruturação espacial da variabilidade. As proporções de mistura genômica observadas na análise do gráfico (Fig.12) podem ser atribuídas à introdução de mudas dessas três localidades aleatoriamente, por fazendeiros, ou mesmo por trabalhadores rurais, já que se observa uma grande distância geográfica entre as regiões. Em estudos realizados por GONZALEZ et al. (2004), em Agave garciaemendozae, foi observado que 86,05% da variação ocorria dentro das populações e 2,64% da diversidade entre as regiões, sugerindo que para esta espécie de Agave há um isolamento por distância. Nesse trabalho, com relação à diversidade genética total detectada para cada população, os resultados indicaram que a população de VAL apresenta maior diversidade entre as seis populações analisadas, seguida da população de JAC. Isso pode ser observado tanto através das porcentagens de bandas polimórficas, quanto através do Índice de Diversidade de Shannon-Wiener. Essa maior diversidade observada para a população de VAL pode ter tido inicio com o transporte de mudas por parte dos agricultores e atualmente mantida por conta do modo reprodutivo. Os valores encontrados demonstram altos níveis de diversidade genética dentro das populações de Agave sisalana. Esses valores obtidos apresentaram o mesmo padrão que os propostos por NYBOM (2004) na avaliação da diversidade entre e dentro de populações de angiospermas e gimnospermas (Tab.8). As espécies vegetais diferem marcadamente quanto ao modo como a diversidade genética é particionada entre as populações. O padrão de divisão está correlacionado com os sistemas de reprodução e os parâmetros da história de vida (HAMRICK & GODT, 1989). Espécies que são principalmente de longa duração como é o caso do Agave sisalana, apresentam maior diversidade genética dentro 49 das populações do que entre. No presente estudo pudemos observar que os dois grupos de populações foram formados levando em consideração as altitudes. Em espécies que se reproduzem preferencialmente por fecundação cruzada, espera-se em geral encontrar alta diversidade dentro de populações e baixa divergência entre populações, exatamente o contrário do esperado para espécies que se reproduzem preferencialmente por autofecundação (LOVELESS & HAMRICK, 1984; HAMRICK & GODT, 1996). Isso pode indicar uma suposta alogamia para o sisal. Plantas que se reproduzem com eficiência também por via assexuada são consideradas por alguns autores como portadoras de menor variabilidade genética (CHEN et al.,2006). Estudos com plantas de reprodução sexuada e assexuada mostram que a diversidade não é necessariamente reduzida dentro das populações quando comparadas com plantas de reprodução exclusivamente por via sexuada (ELLSTRAND & ROOSE (1987), WIDEN et al.1994 apud SARTHOU et al. 2001; HAN et al. 2007). Em Bromeliaceae, por exemplo, verifica-se que um sistema misto de reprodução sexuada e assexuada, pode promover altos níveis de diversidade para populações de algumas espécies (SARTHOU et al. 2001, GONZÁLES-ASTORGA et al. 2004; CAVALLARI, 2004). Em termos gerais, propõe-se que tanto a família Agavaceae quanto o gênero Agave parecem ser auto-compatíveis por conta do padrão reprodutivo com isso, genes recessivos deletérios são expressos em forma homozigótica reduzindo a adequação das sementes, impedindo o seu desenvolvimento ou impedindo a formação de frutos (EGUIARTE et. al., 2000). 50 Tabela 8. Variabilidade genética em grupos de Agavaceae e média utilizando marcadores moleculares. Trabalho %P He I Técnica Referência Agave sisalana 63,6 0,24 0,28 ISSR Este trabalho Agave striata 81,0 0,27 0,19 ISSR Agave cupreata 89,0 0,26 - ISSR AGUIRRE (2004) Agave potatorum 83,0 0,25 - ISSR AGUIRRE (2004) Agave victoriaereginae HERNÁNDEZ (2006) MARTINEZ83,0 0,33 - Isoenzimas PALACIOS et al.(1999) Yucca filamentosa 68,0 - 0,20 Isoenzimas Agave subsimplex 76,0 0,14 - RAPD Agave deserti 78,0 0,19 - RAPDs Perenes longevas - 0,24 - RAPDs Monocotiledôneas - 0,19 - RAPDs MASSEY & HAMRICK (1998) NAVARRO et al.(2003) NAVARRO et al. (2003) NYBOM & BARTISH (2000) NYBOM (2004) Legenda: %P = Porcentagem de lócus polimórficos He=Heterozigose esperada I=Índice de Shannon. 51 O fluxo gênico é o principal componente da estrutura de populações. Se há altos níveis de fluxo gênico entre as populações, eles evoluem juntas, mas se os níveis estão baixos, cada população evolui quase independente. Como o fluxo de genes é necessário para impedir a evolução independente de populações de uma espécie, esta vai depender de outras forças evolutivas presentes e de sua estrutura (modelo espacial que se enquadra na espécie). (SLATKIN, 1994). Segundo SLATIKN (1987) apud HAN et al. (2007), em genética de populações uma diferenciação significativa da população ocorre quando o fluxo gênico (Nm) é menor que um migrante por geração dentro de uma população ou ainda quando o GST, análogo ao Fst é maior que 0, 25. Comparando os valores deste trabalho (Nm=1,63) com aqueles encontrados em outras espécies de Agaves, nota-se que Agave cupreata e Agave garcia-mendozae apresentaram valores semelhantes (Nm= 1,49; 1,3 respectivamente, ISSRs), enquanto a estimativa para Agave potatorum (Nm= 2,99, ISSRs) foi maior, nesse caso o fluxo de genes supera os efeitos da deriva genética e previne a diferenciação local. A diferenciação genética da Agave sisalana quando comparada com valores obtidos em outras espécies ISSR demonstrou que são geneticamente próximas. Por exemplo, Agave sisalana (ɸST = 0,12), Agave cupreata (ɸST=0,14) Agave potatorum (ɸST = 0.08) (AGUIRRE, 2004; EGUIARTE et.al. 2003), Agave garciae-mendozae (ɸST = 0,10) (GONZÁLEZ & HAMRICK, 2005). (Tab. 8). Resultados obtidos através de RAPD em agaváceas foram parecidos com os encontrados com ISSR; Agave cerulata (ɸST = 0,1), Agave subsimplex (ɸST = 0,08) e Agave deserti (ɸST = 0,14) (NAVARRO et al. 2003). No caso do Agave lechuguilla (ɸST = 0, 083), SILVA & EGUIARTE (2003b), utilizando isoenzimas obtiveram resultados indicadores de baixa diferenciação genética. No entanto, são muito mais baixos que os apresentados em Agave subsimplex (ɸST = 0,31) e Agave victoriae-reginae (ɸST = 0,33) usando isoenzimas (MARTINEZ-PALACIOS et al. 1999). Comparando com Perenes longevas NYBOM, (2004), encontrou ɸST = 0,25 e GST = 0,19 (Tab.8). 52 Tabela 9. Estimativas de variação dentro das populações e / ou variação entre as populações, obtidas com marcadores moleculares diferentes. ɸST GST Técnica Referência Agave sisalana 0,12 0,235 ISSRs Este trabalho Agave cupreata 0,14 0,294 ISSRs Espécie AGUIRRE (2004) EGUIARTE et.al.(2003) AGUIRRE (2004) Agave potatorum 0,08 0,269 ISSRs EGUIARTE et.al.(2003) Agave garciae-mendozae 0,10 - ISSRs Agave subsimplex 0,31 - Isoenzimas Agave lechuguilla 0,39 - Isoenzimas Agave victoriae-reginae 0,33 - Isoenzimas Agave subsimplex 0,08 0,070 RAPDs NAVARRO et al.(2003) Agave striata 0,26 - RAPDs TREJO (2006) Agave cerulata 0,10 0,095 RAPDs NAVARRO et al.(2003) Agave deserti 0,14 0,149 RAPDs NAVARRO et al.(2003) Perenes longevas 0.25 0,19 RAPDs NYBOM (2004) Monocotiledôneas 0,38 - RAPDs Legenda: ɸST = Variância total entre as populações; GST subpopulações. = GONZÁLEZ (2005) MARTINEZPALACIOS et al.(1999) SILVA & EGUIARTE (2003b) MARTINEZPALACIOS et al.(1999) NYBOM & BARTISH (2000) Diferenciação genética entre as 53 Em Agave sisalana, os estudos com marcadores moleculares ainda são incipientes, não havendo até o momento qualquer informação sobre trabalhos com uso de marcadores ISSR. VARGAS-PONCE et al. (2009), utilizaram a técnica de ISSR para comparar populações selvagens de Agave angustifolia, com plantações comerciais de Agave tequilana. Os resultados através da AMOVA foram utilizados para confirmar que populações de Agave angustifolia tradicionais apresentam uma diversidade genética (HT = 0, 442) similar à suas populações selvagens (HT = 0, 428) e maior estrutura genética (ɸST= 0, 405; ɸST = 0, 212). Em contraste, a diversidade genética de Agave azul comercial (He = 0,118) foi 73% menor. Esses resultados são indicativos de que a maior variação ocorria dentro das populações, mas que, nas espécies cultivadas sob a agricultura tradicional, a variação entre as populações é quase tão alta quanto a variação dentro das populações e quase o dobro da variação entre as populações selvagens. A análise desses dados, podem ser de grande importância na certificação da Agave (mezcals) para permitir a conservação da diversidade genética, ecológica e cultural atual podendo desempenhar um papel fundamental na preservação dos agroecossistemas tradicionais. 54 8. IMPLICAÇÕES PARA A CONSERVAÇÃO DA ESPÉCIE A variabilidade genética dentro de uma espécie constitui uma importante fonte de genes que devem ser considerados na formação de bancos de germoplasma para uso no melhoramento, na transformação gênica com intento da obtenção de maior produtividade e outras características almejadas, pois genótipos divergentes enriquecem a variabilidade natural da espécie, o que confere maiores possibilidades de adaptação a diferentes ambientes (NODARI & GUERRA, 2004). A caracterização genética é importante para os programas de conservação de recursos genéticos, pois avalia a distância entre as populações em estudo e pode auxiliar na escolha dos indivíduos a serem utilizados na conservação ex situ e in situ, mediante a estimativa de índices de similaridade entre os indivíduos analisados. Além disso, possibilita a indicação de acasalamentos ou cruzamentos que favorecerão a manutenção da máxima variabilidade genética. A Agave sisalana é propagada de forma assexuada e sexuada. Desde a sua chegada ao Brasil, a reprodução vegetativa por meio de rebentões sempre predominou. Este estudo confirma relatos de variação genética em plantas propagadas assexuadamente como a Agave tequilana e mostra que a variação elevada também pode ser encontrada entre os indivíduos obtidos a partir de uma única planta-mãe. A propagação in vitro poderá ser explorada como uma alternativa para a produção de plantas com boas características genéticas para plantios comerciais. Para isso será necessário determinar os níveis de variabilidade genética produzida por este processo, a fim de determinar e controlar a natureza molecular das mutações subjacentes e os mecanismos que as causam. 55 9. CONCLUSÕES O estudo da variabilidade genética em Agave sisalana, por meio de dados obtidos com marcadores ISSR possibilitou chegar às seguintes conclusões: Os marcadores ISSR mostraram ser uma alternativa de detecção de variabilidade genética em espécies ainda pouco conhecidas e que não dispõem de marcadores espécie-específicos. A diversidade genética encontrada para a espécie Agave sisalana com os nove iniciadores ISSR avaliados foi considerada alta, diferente do esperado no início da pesquisa, por conta do sistema reprodutivo. O estudo da estrutura genética das seis populações mostrou que a maior diversidade genética encontra-se dentro de suas populações. Fatores biológicos e geográficos podem estar influenciando na dinâmica populacional de Agave sisalana no estado da Bahia. A caracterização genética de populações e espécies de plantas , é um passo complementar importante para o delineamento de estratégias de conservação in situ ou ex situ. 56 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AB'SABER, A.N. 2003. Os domínios de natureza no Brasil: potencialidades paisagísticas. 1 ed. São Paulo: Ateliê Editorial. 159 p. ABRAHAMSON, W. G. 1980. Demography and vegetative reproduction. In Demography and the evolution of plant populations. Solbrig, O.T. Ed. Oxford, England. Blackwell Scientific. p.89-106. AGUIRRE, D. X. 2004. Genética de Poblaciones de Agave. cupreata y Agave. potatorum: Aportaciones para el manejo y conservación de dos especies mezcaleras. Dissertação de mestrado - Faculdade de Ciencias UNAM. México. 73 p. ALBERTS, B.; BRAY, D., LEWIS, J.; RALF, M., ROBERTS, K.; WATSON, J.D. 1994. Molecular biology of the cell. 3 ed. New York. 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Incubar por 10 minutos ( 60-64°C; 4. Adicionar 800µl de Clorofórmio/ álcool isoamilico; 5. Levar ao Shaker por 1h; 6. Centrifugar a 13000 rpm por 10 minutos (temperatura ambiente); 7. Retira sobrenadante para novo tubo de 1,5 ml; 8. Adicionar isopropanol gelado (2/3 ou mais do volume) – levar ao freezer overnight; 9. Centrifugar por 5 minutos (13000 rpm); 10. Descartar a parte líquida; 11. Lavar com álcool etílico 70%; 12. Centrifugar por 5 minutos (13000 rpm) – repetir esse procedimento 2 ou 3 vezes; 13. Secar over-night; 14. Ressuspender em 100µl de TE por 48h na bancada (ou até que o “pellet” esteja totalmente ressuspendido); 15. Quantificar.
