Octâmero de histonas: forma um cerne proteico com duas cópias H

Octâmero de histonas: forma um cerne proteico com duas cópias H2A, H2B, H3 e H4 em
volta do qual o DNA é enrolado 2x – 146 nucleótidos – cada nucleossoma é separado do
seguinte por uma região de DNA ligação – 80 nucleótidos.
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Os nucleossomas permanecem fixos já que a forte de ligação ao DNA impede que se
movimentem do local onde se estabelecem depende:
o Da dificuldade do DNA dar duas voltas em volta do octâmero (requer grande
compressão de sulco menor hélice – sequencias ricas em A-T são mais
facilmente comprimidas que C-G e daí a tendência a maximizar o número de
sulcos menores com A-T enrolado na parte interna da hélice)
o Outras proteínas ligadas ao DNA impedem a formação de nucleossomas ficando
o DNA não organizado e por compactar – sequências regulatórias.
Como cada nucleossoma se posiciona de acordo com os factores acima referidos as
DNA ligação podem variar em extensão.
o Flexibilidade da hélice de DNA
o Distribuição de outras proteínas, ligadas a sequências nucleotídicas específicas
Numa célula viva raramente a cromatina adopta a forma de contas de rosário. Assim, os
nucleossomas estão ainda em arranjos nucleares que permitem maior compactação. É a
histona H1 que permite esta justaposição de nucleossomas em fibras de 30 nm.
o A histona H1 tem uma porção globular que se liga a um único sítio no
nucleossoma e, os seus braços estendem-se contactando com outros sítios,
como p.e. os núcleos das histonas dos nucleótidos adjacentes. Assim, os
nucleossomas são justapostos num arranjo repetido e regular.
* O DNA não é só compactado pelas histonas e depois em arranjos regulares, também é
flexionado e organizado por outras proteínas.
Cromossomas plumosos
Em interfase a maioria dos cromossomas encontram-se muito emaranhados, com
algumas excepções. Os cromossomas plumosos são muito activos na síntese de RNA e
forma alças de cromatina rígidas e estendidas cobertas com RNA recém-transcrito e que
os tornam muito visíveis na forma de grandes alças de cromatina que saem dum eixo
linear central. Nestas alças existe sempre a mesma sequencia de DNA estendida da
mesma maneira e, a maior parte DNA é activamente transcrito. A maior parte da
cromatina não está nas alças mas sim condensada nos cromômeros que são transcritos.
A cromatina quando está a ser transcrita está distendida e, quando está condensada
apresenta-se inactiva.
Domínios ordenados de cromatina interfásica também são vistos em
cromossomas politénicos de insectos
 Células com quantidades de DNA muito mais superior que o normal (obtidas por
ciclos de síntese sem divisão) são poliplóides.
 Nas larvas criam-se cromossomas politénicos gigantes (todas as cópias dos
cromossomas homólogos estão lado a lado criando um cromossoma politénico
gigante) facilmente visíveis por possuírem um padrão de bandas escuras
(cromatina muito mais condensada) e interbandas claras (sequência de DNA
idênticas lado a lado)
Uma mudança na compactação do DNA acompanha a transcrição genica – quando
activo distendem e depois recondensam-se quando inactivos; as regiões transcritas mais
activas estão distendidas e formam puffs cromossómicos, sendo estes formados e depois
quando inactivos regridem. A maioria dos puffs origina-se na descompactação de uma
só banda.
Puffs cromossómicos: à medida que as unidades de transcrição são activadas e
inactivadas e diferentes mRNA e proteínas são produzidos, novos puffs são formados e
os antigos regridem.
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Regiões cromossómicas mais activas estão descondensadas
Origina-se na descompactação de uma única banda cromossomal
A cromatina tanscricionalmente activa é menos condensada
Quando o DNA é sujeito à DNAase apenas uma pequena fracção é degradada
(cerca de 10%); embora algumas zonas sejam os sítios hipersensíveis onde existem
sequências regulatórias, estes locais têm cromatina descondensada activa. Embora estes
10% correspondam também a sítios hipersensíveis, a maioria dos genes degradados
corresponde a genes em processo de transcrição. Durante este processo há uma
descondensação da cromatina sendo esta mais facilmente removida.
A cromatina activa (cromatina mais acessível a ser removida) é diferente da
inactiva.
 Na activa:
o A histona H1 está ligada mais frouxamente nas zonas activas
o As histonas nucleossómicas estão acetiladas de forma diferente
o H2B está menos fosforilada
o Existe maior quantidade H2A
o Estão ligadas aos nucleossomas das proteínas do grupo de alta
mobilidade (HMG 14; HMG 17)
Qualquer uma desta modificações pode ter um papel fundamental na descompactação
da cromatina de genes activos, de modo a tornar o DNA disponível para servir de molde
na síntese de RNA
 Existem dois tipos de cromatina nos núcleos interfásicos: eucromatina, menos
condensada, e heterocromatina, altamente condensada.
o Heterocromatina: é muito condensada e transcricionalmente inactiva –
(10%) do genoma, forma altamente condensada
 Em volta do centrómero existe DNA satélite (sequências de
nucleótidos repetidos e relativamente simples) que é
heterocromatina
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o Eucromatina: menos condensada; existem em duas formas: 10% menos
condensada, activa, e o resto mais condensada, menos que
heterocromatina, inactiva
Em interfase os cromossomas são muito finos e distendidos mas, durante a
mitose enrolam-se formando estruturas condensadas o que torna possível a
segregação dos cromossomas para as células filhas por acção do fuso mitótico
sem que ocorra a quebra dos mesmos
Devido ao facto da H1 auxiliar na compactação dos cromossomas, suspeita-se
que a sua fosforilação na mitose, tenha alguma função na condensação dos
cromossomas.
Durante a fase S é replicado o DNA que formam separadamente as cromátides
unidas pelo centrómero. Estes cromossomas estão cobertos de
ribonucleoproteínas. Pensa-se que esta forma condensada é semelhante à
heterocromatina, sendo estes cromossomas transcricionalmente inactivos,
provavelmente a condensação impede o acesso da RNA polimerase e
consequentemente a transcrição. Toda a síntese de RNA cessa quando os
cromossomas condençam.
O cariótipo humano é o conjunto dos 46 cromossomas
Quando corados, os cromossomas mitótico contém centenas de milhares de
genes. Bandas de A-T são escuras (mais facilmente comprimidas – maior
compressão – duas voltas) e de C-G são claras.
Replicação dos cromossomas
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Antes da divisão celular, durante, fase S são replicados os cromossomas (8h+/- )
Esta síntese ocorre de forma semiconservativa através da forquilha de replicação de
DNA
Para que se inicie a replicação existem sequências específicas de DNA – origens de
replicação que permitem a formação de forquilhas de replicação através da formação
duma bolha de replicação sendo os componentes necessários montados e dando-se
inicio.
Nos eucariontes temos uma DNA polimerase alfa catalisa e sintetiza a cadeia
descontínua e uma DNA polimerase delta que catalisa e sintetiza a cadeia contínua.
No DNA dos eucariontes e, devido ao seu tamanho,
 Muitas forquilhas de replicação movem-se simultaneamente
 Muitas forquilhas de replicação encontram-se muito próximas umas das outras e
outras regiões não tem nenhuma
 As origens de replicação são activadas em Srp’s -> unidades de replicação
 Ao longo da fase S novas unidades de replicação são activadas
 Na mesma unidade de replicação as origens de replicação são separadas para
intervalos de 30000 a 300000 pares de bases
 Como nas bactérias, as forquilhas aparecem aos pares a partir de uma bolha, em
direcções opostas e param quando colidem com outra forquilha no final do
cromossoma.
Regiões diferentes do mesmo cromossoma replicam-se em diferentes momentos. As
origens de replicação não estão todas activas simultaneamente e, cada unidade de
replicação é replicada apenas numa pequena parte do intervalo de duração da fase S,
usando a BrdU (nucleósido sintético análogo à timina) pode-se verificar que diferentes
regiões do cromossoma são replicadas numa ordem reprodutível na fase S e, o padrão
temporal de reprodução é coordenado ao longo das regiões do cromossoma.
As diferentes unidades de replicação são activadas aleatoriamente ou existe uma ordem
específica na qual diferentes regiões do genoma são replicadas?
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A ordem de activação pode depender do estudo da cromatina -> a cromatina activa tem
uma forma descondensada que permite a transcrição enquanto que, a heterocromatina é
transcrita numa fase mais avançada devido ao seu estado altamente condensado (maior
dificuldade na acção da maquinaria da replicação).
Para além disto, o nível de condensação influencia a formação das forquilhas
Os genes housekeeping (genes que estão sempre activos) replicam-se no inicio
da fase S e as outros só mais tarde.
Cromossoma X: um permanece tanscricionalmente activo (é transcrito ao longo
de toda a fase S1 porque é menos condensado) e o outro não (formado por heterocromatina, é
replicado mais tarde)
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A maioria das bandas ricas em G-C replicam-se na fase inicial, sendo por isso sugerido
que os genes housekeeping se situam nessas bandas, já as T-A replicam-se muito
depois, onde se encontram genes específicos que permanecem a maior parte do tempo
inactivos (+condensados).
NOTA: Corpúsculo de Barr, cromossoma X inactivo – o homólogo é activo (indicador
do sexo feminino)
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A replicação está sujeita a um sistema de regulação que reprime a iniciação das
forquilhas de replicação determinando que genoma é que é replicado em determinado
momento. Pensa-se que a cromatina que se replica inicialmente incorpora proteínas que
auxiliam a manutenção deste estado conformacional.
Factores que se ligam à cromatina asseguram que cada região de DNA seja replicada só
uma vez
Normalmente o genoma só se replica uma vez; como as origens têm diferentes tempos, então
em determinadas alturas algumas partes do cromossoma já se replicaram e outras ainda não;
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Ao fundir uma célula em fase S e outra em G1, a síntese é induzida em G1, pelo
contrário ao fundir uma célula em S e uma em G2, a síntese não é induzida (já foi feita);
outra possibilidade é a existência de proteínas iniciadoras que, são necessárias para a
replicação e, após a passagem da forquilha são removidas.
Novas histonas são montadas na cromatina à medida que ocorre a replicação: durante a fase S
são sintetizadas histonas (o nível de mRNA de histonas muito superior a 50x devido a um
aumento da transcrição e degeneração) mas após a paragem da síntese o mRNA de histonas fica
muito instável – quando montadas nos nucleossomas, as histonas raramente se desligam. Assim,
à medida que a forquilha avança para passar pelos nucleossomas estes desnaturam rapidamente
permitindo a cópia do DNA pela polimerase. Como se faz a cópia são necessárias mais histonas
que se juntam às pré-existentes.
Telómeros: são repetições ricas em G presentes nas extremidades do cromossoma. Nas
extremidades existem sequências especiais de DNA – telómeros – que consistem em repetições
que tendem de uma sequência curta e com um bloco de nucleótidos G adjacentes (GGGTTA). A
replicação nas extremidades faz-se pela telomerase, que reconhece a sequência e a alonga na
direcção 5’ – 3’. Caso não exista DNA complementar o enzima usa um molde de DNA seu
componente. Depois da extensão pela telomerase, a replicação da extremidade é completa pela
DNA polimerase que usa as extensões como molde. Devido ao facto dos processos de
replicação e restauração serem apenas aproximadamente equilibrados, cada extremidade de um
cromossoma contém um número variável de repetições.
Replicação é um processo assíncrono!
Síntese e processamento do RNA
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Os cromossomas funcionam de molde para a síntese do RNA – transcrição é um
processo altamente selectivo
 1º - somente parte da sequência de DNA é que é transcrita – exões,
genoma codificante
 2º - somente uma pequena porção de sequências nucleótidicas de RNA
sobrevive às etapas de processamento antes de ir para o citosol.
RNA polimerase
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A transcrição inicia-se quando a RNA polimerase se liga ao promotor sendo as 2
moléculas DNA abertas – complexo aberto – ficando a cadeia molde exposta
A polimerase move-se no sentido 3’-5’ sintetizando a nova cadeia RNA no sentido 3’-5’
Dá-se a polimerização até atingir o sinal de terminação libertando-se o RNA e a
polimerase e permitindo a reunião da dupla hélice de DNA
Cada RNA é uma cópia duma cadeia de DNA – unidade de transcrição
Existem três tipos de RNA polimerase – I, II e III, com subunidades em comum e
exclusivas cada uma com 10 ou mais cadeias polipeptídicas e, por si só é capaz de se
ligar ao promotor e iniciar a transcrição, no caso dos procarióticos, no caso dos
eucariontes precisa de proteínas iniciadoras que se ligam ao promotor.
o Diferenças entre as três:
 Diferenças químicas e sensibilidade à alfa-amanitina (veneno): I – não é
afectada; II – muito afectada; III – pouco afectada.
 A sensibilidade de síntese de RNA à alfa-amanitina é ainda utilizada
para determinar qual a polimerase que transcreve cada gene:
 RNA pol II – transcreve genes cujo RNA são traduzidos em
proteínas (forma snRNPs)
 RNA pol I – produz grandes RNA’s ribossomais
 RNA pol III – produz RNA’s estáveis e muito pequenos (ex: 5S
e RNA transferência)
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Moléculas de RNA polimerases a transcrever visualizam-se como partículas globulares
com uma cauda que é uma molécula RNA; a RNA pol II aparece como partículas
isoladas o que indica que a maioria dos genes é transcrita em precursores mRNA com
muito baixa frequência de modo que uma polimerase termina a transcrição antes que
outra inicie; às vezes vêem-se genes associados. Na tradução é que há vários ribossomas
simultaneamente.
A extensão de moléculas de RNA ligada a esses grupos aumenta na direcção da
transcrição formando um padrão característico do sítio e da direcção da transcrição.
1. Moléculas RNA polimerase iniciam a transcrição em locais específicos do cromossoma
(promotores)
2. A extensão média de RNA completo produzida é de +/- 7000 nucleótidos
3. Diferentes locais de iniciação da pol II tem diferentes sequências e por isso a velocidade
de alongamento das cadeias são diferentes.
Precursores do mRNA são modificados covalentemente em ambas as extremidades: CAP –
5’; 200 nucleótidos adenilados – 3’ (poliA)
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O RNA recém sintetizado é o transcrito primário sendo o conjunto dos transcritos
primários designado por RNA nuclear heterogéneo (hnRNA) devido à grande variação
de tamanho das componentes que contrasta com o tamanho menor e mais uniforme das
sequências de RNA realmente necessárias para codificar as proteínas.
À medida que são transcritas as extremidades 3’ e 5’ são modificadas para que possam
ser diferenciadas das outras transcritas por outras RNA polimerases. Essas modificações
serão usadas depois no citosol como sinais que indicam que devem ser traduzidas em
proteínas.
o Extremidades 5’: adição de nucleótido G metilado CAP (condensação do grupo
fosfato de uma molécula de GTP com o fosfato deixado na extremidade 5’ do
transcrito inicial) vai permitir o inicio da tradução, participa na síntese proteica,
e vai proteger o transcrito de RNA nascente da degradação.
o Extremidade 3’: é clivada a extremidade e adicionada uma cauda poliA (a
extremidade é cortada quando surge AAUAAA e uma sequência downstream);
após a clivagem a poli-A-polimerase adiciona poliA formando o mRNA;
 A cadeia continua a ser sintetizada mas como não tem um CAP é
degradada, uma vez que é ele que protege o RNA contra a degradação.
poliA: * auxilia o transporte do mRNA maduro para o citosol
* afecta a estabilidade de algum mRNA no citosol
* serve como sinal reconhecido pela subunidade menor do ribossoma – junto
com o CAP permite determinar se o RNA está intacto antes da tradução.
NOTA: só as transcrições da RNA polimerase II possuem CAP (5’) e poliA (3’); a
existência de CAP e poliA combinadas, permitem ao ribossoma determinar se um RNA
está intacto antes de começar a desperdiçar energia.
INTRÕES: sequências presentes no DNA mas omitidas no RNA
O RNA primário transcrito uma cópia fiel do gene (exões+intrões) sendo depois os
intrões removidos de região interna do RNA transcrito formando o mRNA que codifica
directamente proteínas, após o splicing que ocorre no núcleo as sequências RNA codificantes
são unidas. O splicing é resposta pela conversão hnRNA muito longo em mRNA citoplasmático
que apenas apresenta exões.
Os hnRNA transcritos são imediatamente cobertos por proteínas e snRNP’s
O RNA recém sintetizado pode logo ser condensado em partículas (parecidas com
nucleossomas); as partículas hnRNA são maiores que os nucleossomas e têm um núcleo mais
complexo composto por 8 diferentes proteínas.
 Spliceossoma: complexo que catalisa o splicing, ligado ao pré-mRNA por vários
componentes separados – vários componentes como os snRNP’s (liga o spliceossoma
ao pré-mRNA, permite verificar várias vezes), os snRNA’s: U1/U2/U5/U4 ou U6
(reconhecem o limite exão-intrão)
 O núcleo possui complexos – proteínas-RNA (snRNP’s) – com proteínas e pequenos
RNA – ribonucleoproteínas nucleares pequenas (snRNP’s) que reconhecem sequências
de ácidos nucléicos específicas através do pareamento RNA-RNA: medeiam o splicing;
clivam a extremidade 3’ do RNA de histonas recém formados.
Sequências de intrões são removidas como moléculas de RNA em forma de laço
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Os intrões variam muito de tamanho e a sua sequência não é importante mesmo sendo
afectados por mutações
As sequências flanqueadoras presentes no sítio de splice 5’ (sítio dador) e no sítio de
splice 3’ (sítio aceptor) são altamente conservadas e permitem a sua remoção; é também
necessário o ramo do intrão que vai fazer de base do laço
Os intrões são excisados na forma de laço de acordo com o processo splicing
 1º - é montado o spliceossoma
 2º - o nucleotídeo do ponto de ramificação do intrão próximo do
splice 3’ cliva o local splice 5’; a extremidade 5’ liga-se a esse
nucleotídeo
 3º - a extremidade OH do exão criado é adicionado ao outro
exão sendo clivado o local splice 3’
 4º - são assim ligados 2 exões e o intrão é libertado como um
laço
Estas reacções de splicing ocorrem no núcleo e geram moléculas mRNA a
partir dos transcritos primários de RNA (hnRNA’s)
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Para evitar a perda de sequencias funcionais que poderia ocorrer se, sítios de splice 5’ e
3’ fossem pareados incorrectamente, cada sítio splice 5’ só pareia com um sítio 3’ na
direcção downstream (5’-3’)
Talassémia ou anemia mediterrânea: anemia hereditária causada pela redução ou ausência da
síntese da cadeia de hemoglobina
No seu estudo foram detectadas alterações em nucleótidos que inactivam locais de
splice, no entanto, estes erros não inviabilizam o splicing, este é feito noutro sítio, o que permite
que o gene mutante produza proteínas alteradas num só lugar.
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O splicing catalisado pelo spliceossoma provavelmente evoluiu de mecanismos de autosplicing: porque não aproximar os locais de splice dando-se depois a clivagem e ligação
das mesmas? Pensa-se que células primitivas usavam RNA e não proteínas como
agentes catalíticos e, armazenavam a sua informação genética no RNA e não no DNA –
as reacções de splicing catalisadas por moléculas de RNA eram muito importantes
sendo alguns intrões (removidos por auto-splicing) mantidos até hoje:
o Sequências de intrões com auto-splicing:
 Sequências de intrões grupo I – ligam um nucleótido G à sequência de
intrão, quando este é activado forma um grupo de ataque que vai clivar
o splice 3’
 Sequência de intrão grupo II – um resíduo A do intrão é que vai clivar;
sai e depois forma-se o laço; usa-se, actualmente, o mesmo mecanismo
mas só que com outras sequências intervenientes.
O transporte do mRNA pelo citosol é retardado antes que o splicing esteja
completo
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Após a síntese do mRNA, proteínas do núcleo reconhecem as moléculas e permitem o
seu transporte;
As principais proteínas da hnRNA e moléculas processadoras ligadas ao RNA estão
confinadas ao núcleo e quando passam com o mRNA ao citosol retornam ao núcleo
após a sua libertação.
Antes do seu transporte para o citosol, os mRNA são retidos no núcleo pelos
spliceossomas em estruturas como “ilhas de splicing” semelhantes ao nucléolo (local
onde as moléculas de RNA ribossomal * são processadas, a partir de um RNA
precursor, e montadas no ribossoma pela ligação de proteínas ribossomais)
* muitas proteínas (Hb, Mb) são sintetizadas a partir de genes num só cromossoma mas, o RNA
ribossomal tem várias cópias que estão que estão presentes num cromossoma numa série
arranjada em tandem. Nesta série cada gene é separado por uma região não transcrita – RNA
espaçador (o facto de existirem em grande quantidade permite a sua fácil visualização).
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A transcrição dos genes rRNA é feita pela RNA pol I sendo depois cada transcrição
primária clivada para originar uma cópia rRNA 28S, rRNA 13S e rRNA 5,8S;
o facto de derivarem da mesma transcrição inicial permite que sejam transcritos nas
mesmas quantidades
o resto da transcrição primária é depois degradada no núcleo

a transcrição primária, rRNA 45S, é clivada em rRNA 28S, rRNA 13S e
rRNA 5,8S que são os rRNA’s ribossomais finais
Nucléolo: máquina produtora de ribossomas
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As cópias dos genes de rRNA são compactadas no núcleo com proteínas ribossomais
para formarem os ribossomas – nucléolo que contém algas de DNA que saem de
cromossomas contendo grupos de genes rRNA – regiões organizadoras nucleares.
Os genes dão transcritos pelo RNA pol I, sendo a cauda 5’ de cada transcrição
envolvida por um grânulo de proteínas.
O RNA transcrito é compactado com muitas proteínas citosólicas num complexo (no
núcleo existem também outras proteínas (snRNA U3) e ribonucleoproteínas pequenas
que ajudam na formação do ribossoma)
o Enquanto estão no nucléolo, vão sendo descartadas algumas porções
seleccionadas levando à formação dos precursores das subunidades maior e
menor que depois de maduras saem para o citoplasma – as subunidades são
transportadas através de poros e, no citoplasma a montagem de ribossomas
continua.
 O atraso permite que os ribossomas funcionais não tenham acesso a
moléculas hnRNA incompletamente sintetizadas.
O nucléolo não tem uma membrana – é construído pela ligação específica de
precursores ribossomais que formam uma rede com:
o Centro fibrilar – DNA que não é transcrito activamente
o Componente fibrilar denso – moléculas de RNA a serem sintetizadas
o Componente granuloso – contém partículas ribossómicas precursoras maduras.
À medida que a célula avança para a mitose, o nucléolo diminui e desaparece durante a
condensação dos cromossomas, não há síntese de RNA, logo não existe nucléolo em
metáfase; no final, na telofase reaparecem uma vez que a síntese de proteínas sobe.
Os componentes do nucléolo (RNA e proteínas) durante a mitose ficam distribuídos
pela superfície dos cromossomas metafásicos sendo assim transportados para as células
filhas onde vão ajudar a estruturar os nucléolos
Antes da divisão celular os cromossomas condensados são puxados para os pólos pelo
fuso mitótico (microtúbulos) que se ligam ais centrómeros – orientação de Rabl:
centrómeros à frente e os telómeros (nas extremidades) a apontar para o pólo oposto.
Cada cromossoma ocupa uma pequena porção do núcleo interfásico logo permanece
compacto e organizado enquanto determinadas porções são transcritas.
A cromatina associada à membrana interna não existe em baixo e em volta da cada poro
nuclear permitindo um espaço livre entre o núcleo e o citosol, possibilitando assim a
saída do rRNA.
A matriz nuclear é o material insolúvel deixado no núcleo após várias extracções
bioquímicas – as proteínas que o constituem ligam-se a sequências específicas de DNA
auxiliando a organização dos cromossomas, posicionamento de genes e regulação,
transcrição e replicação DNA
Organização e evolução do genoma nuclear
Sequências de DNA duplicadas e unidas de maneira orientada formam repetições em
tandem que podem ser rapidamente estendidas (crossing-over) levando à amplificação do
DNA (p. 386)