título: análise da presença e concentração de cobre, zinco e selênio

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TÍTULO: ANÁLISE DA PRESENÇA E CONCENTRAÇÃO DE COBRE, ZINCO E SELÊNIO NA URINA DE
INDIVÍDUOS COM CÂNCER DE PRÓSTATA
CATEGORIA: CONCLUÍDO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
SUBÁREA: BIOMEDICINA
INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS
AUTOR(ES): EDUARDO ERIYO HIRAI
ORIENTADOR(ES): MARIA HELENA BELLINI MARUMO, TANIA REGINA DE BORBA
COLABORADOR(ES): DANIEL RIANI GOTARDELO, JULIO TAKEHIRO MARUMO
1. RESUMO
Este trabalho visou observar se existem diferenças significativas entre
amostras de urina de indivíduos sadios e de indivíduos afetados pelo câncer de
próstata em relação às concentrações de cobre, zinco e selênio, assim observando
se a análise dessas concentrações na urina possui relevância no diagnóstico do
câncer de próstata. Amostras de urina de 27 indivíduos sadios e de 26 indivíduos
com câncer de próstata foram preparadas por digestão ácida e analisadas por
Espectrometria de Emissão Óptica por Plasma Acoplado Indutivamente. Não foram
encontradas diferenças significativas para os três elementos estudados.
2. INTRODUÇÃO
O câncer de próstata é o mais incidente entre os homens no Brasil e no
mundo. Em 2012, a última estimativa considerou 1,1 milhão de casos novos no
mundo. No Brasil, estimam-se 68.800 casos novos para o ano de 2014 e, nos
Estados Unidos, acredita-se que esse tipo de câncer tenha levado ao óbito 29.720
pessoas apenas no ano de 2013. (1,2)
A idade é o principal fator de risco para o desenvolvimento do câncer de
próstata, sendo que a etnia e a história familiar também podem contribuir para o
aparecimento da enfermidade. Acredita-se que dietas à base de frutas e vegetais,
ricas em fitoquímicos e antioxidantes, poderiam interferir no desenvolvimento desse
tipo de tumor por reduzirem potencialmente o dano genômico causado por espécies
reativas de oxigênio e pelo aumento de enzimas antioxidantes. A ingesta de
carotenoides, vitaminas C e E, polifenóis existentes em cafés e chás, flavonoides e
licopenos também tem sido estudada com resultados variáveis - ora positivos, ora
negativos, ora sem associação com o risco de desenvolvimento do tumor. (2,3,4)
Algumas investigações têm avaliado relações entre alguns microelementos e o
câncer, sendo que cobre, zinco e selênio são os mais estudados. (5,6,7)
Estudo recente verificou a associação entre os níveis de traços de metais em
espécimes de biópsia e a recorrência bioquímica do câncer de próstata, por meio da
1
dosagem do PSA. Encontraram-se baixos níveis de zinco e ferro relacionados à
recorrência do tumor. (8,9) A quantificação de traços de metais em cabelos foi
proposta como método complementar para o screening do câncer prostático em
outro estudo do tipo caso-controle. Nesse estudo, apesar dos níveis de 20
elementos terem sido identificados, comprovou-se que a dosagem de apenas 9
deles proporcionaria acurácia de 98,2%, sensibilidade de 100% e especificidade de
96,4% para o diagnóstico de câncer de próstata. (10)
Diante do exposto, ressalta-se a importância da realização de pesquisas que
permitam uma melhor compreensão de processos patogênicos possivelmente
relacionados ao câncer de próstata. Nesse
sentido, a determinação de
microelementos na urina de indivíduos com esse câncer pode ser relevante para o
desenvolvimento de novos métodos diagnósticos.
3. OBJETIVOS
Utilizar
Indutivamente
Espectrometria
(ICP-OES)
de
para
Emissão
avaliação
Óptica
por
qualitativa
e
Plasma
Acoplado
quantitativa
das
concentrações de cobre, zinco e selênio presentes em amostras de urina de
indivíduos com câncer prostático e de indivíduos sadios.
Comparar os valores encontrados nas amostras de indivíduos com câncer
prostático com os valores encontrados em amostras de indivíduos sadios, visando
observar se existe diferença significativa entre os valores.
4. METODOLOGIA
As amostras que foram utilizadas neste projeto estavam armazenadas no
laboratório de Biologia Celular e Molecular do Câncer do Centro de Biotecnologia do
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN). As mesmas foram obtidas
mediante aprovação do comitê de ética (N. 784.592 ).
2
A pesquisa utilizou amostras de urina de 26 pacientes com câncer prostático
e de 27 indivíduos sadios. Por se tratar de amostra orgânica a preparação das
amostras por digestão ácida foi realizada antes do início das análises por ICP-OES
para obter melhor qualidade de análise. (11) Entretanto, para a análise das
concentrações de selênio as amostras foram apenas diluídas e não passaram pelo
processo de digestão ácida, pois análises preliminares apresentaram redução na
qualidade das análises de selênio após a digestão.
O método de análise por ICP-OES foi escolhido por ser rápido, capaz de
analisar múltiplos elementos simultaneamente e por apresentar alta sensibilidade na
determinação de concentrações.
As comparações entre as concentrações foram realizadas pelo Teste T de
Student, usando o programa GraphPadPrism versão 5.0 do Windows (GraphPad
Software, San Diego, CA, USA). Em todos os testes os valores de probabilidade (P)
inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente diferentes.
5. DESENVOLVIMENTO
5.1. Preparo das amostras urinárias
5.1.1. Digestão ácida das amostras:
Para cada amostra 15 mL de urina foram transferidos para um béquer
em chapa aquecedora dentro de uma capela. Em seguida ácido nítrico 65% e
peróxido de hidrogênio 34% foram adicionados e a amostra foi aquecida a
200ºC até todo o líquido vaporizar. A adição de ácido nítrico e peróxido de
hidrogênio, seguida de aquecimento, foi repetida até o precipitado adquirir
coloração branca.
O precipitado foi então dissolvido em 10 mL de ácido nítrico 5%,
transferido para tubo cônico e analisado por ICP-OES para determinar as
concentrações de cobre e zinco.
3
5.1.2 Diluição:
Para a determinação das concentrações de selênio em cada amostra, 5
mL de amostra de urina foram misturados com 5 mL de ácido nítrico 10% em
tubo cônico e analisados por ICP-OES.
5.2. Análise por ICP-OES
5.2.1. Preparo de padrões:
Para a calibração do ICP-OES foram preparados quatro padrões de
calibração de 20 mL nas concentrações 0,1 ppm, 0,5 ppm, 1 ppm e 5 ppm.
Os padrões foram preparados a partir de uma solução-mãe (Merck)
contendo 30 elementos (cobre, zinco e selênio entre eles) em concentração de
10 ppm. Cálculos prévios determinaram o volume necessário da solução-mãe
para o preparo de 20 mL dos quatro padrões nas concentrações desejadas.
Para o preparo de cada padrão o volume necessário da solução-mãe foi
transferido com o uso de micropipeta para um tubo cônico em uma balança
analítica tarada, onde a massa foi observada. Em seguida ácido nítrico
suprapur (Merck) 5% foi pipetado ao tubo cônico até a massa da solução estar
o mais próximo possível de 20 g e a massa final da solução foi observada. Com
os valores das massas da solução-mãe pipetada e da solução final a
concentração real do padrão pôde ser calculada e utilizada na calibração do
espectrômetro para maior precisão.
5.2.2. Condições de análise:
As análises foram realizadas com o espectrômetro PerkinElmer Optima
7000 DV alimentado pelos gases argônio, nitrogênio e oxigênio e conectado a
um computador contendo o software WinLab32 for ICP-OES. As condições
instrumentais de operação encontram-se na Tabela 1.
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Tabela 1 - Condições de operação do ICP-OES
Fluxo de gás do plasma
15 L/min
Fluxo de gás auxiliar
0,2 L/min
Potência
1300 Watts
Fluxo de gás nebulizador
0,8 L/min
Vazão de amostra
1 mL/min
Visão do plasma
Axial
Os comprimentos de onda escolhidos para observação dos elementos
no espectrômetro estão representados na Tabela 2.
Tabela 2 - Comprimentos de onda escolhidos para as análises
Elemento
Comprimento de onda (λ)
Cobre
327,393
Zinco
206,200
Selênio
196,026
5.2.3. Processo de análise:
Primeiramente uma solução de ácido nítrico suprapur 5% foi analisada
no espectrômetro como solução branco, seguida por análise dos quatro
padrões de calibração para que uma curva de calibração seja formada. Por fim,
foram realizadas as análises das amostras de urina tratadas pelo processo de
digestão ácida, seguidas pelas análises das amostras que foram diluídas em
ácido nítrico 10%. Cada análise consumiu aproximadamente 1 mL de amostra.
5
6. RESULTADOS
As concentrações médias de cobre, zinco e selênio que foram observadas
nas análises estão representadas, respectivamente, nas tabelas 3, 4 e 5 em µg de
elemento por g de urina, juntamente com os desvios padrões.
Tabela 3 - Concentrações médias e desvios padrões das concentrações de cobre (µg/g)
Grupo
Concentração média
Desvio padrão
Indivíduos afetados
0,0382
0,0188
Indivíduos sadios
0,0432
0,0238
Tabela 4 - Concentrações médias e desvios padrões das concentrações de zinco (µg/g)
Grupo
Concentração média
Desvio padrão
Indivíduos afetados
0,2668
0,2023
Indivíduos sadios
0,2358
0,1509
Tabela 5 - Concentrações médias e desvios padrões das concentrações de selênio (µg/g)
Grupo
Concentração média
Desvio padrão
Indivíduos afetados
0,1286
0,0631
Indivíduos sadios
0,1208
0,0589
6
A tabela 6 apresenta os valores de probabilidade (P) obtidos no Teste T de
Student. Nenhuma das concentrações estudadas foi considerada estatisticamente
diferente com o câncer de próstata, pois todos os valores de probabilidade
encontrados foram superiores a 0,05.
Tabela 6 - Valores de probabilidade (P) encontrados no Teste T de Student
Elemento
Valor de P
Cobre
0,4037
Zinco
0,5288
Selênio
0,6436
As figuras 1, 2 e 3 apresentam as comparações entre as concentrações
médias do grupo de indivíduos com câncer de próstata (N) e do grupo de indivíduos
Concentração de Cobre (g/g)
sadios (CTL).
0.06
0.04
0.02
0.00
Cobre-N
Cobre-CTL
Figura 1 - Comparação entre as concentrações médias de cobre
7
Concentração de Zinco (g/g)
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Zinco-N
Zinco-CTL
Concentração de Selênio (g/g)
Figura 2 - Comparação entre as concentrações médias de zinco
0.15
0.10
0.05
0.00
Selênio-N
Selênio-CTL
Figura 3 - Comparação entre as concentrações médias de selênio
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Diversas pesquisas relacionam cobre, zinco e selênio com o câncer em geral,
no entanto as concentrações encontradas nesta pesquisa não foram consideradas
estatisticamente diferentes. Os resultados então sugerem que o câncer de próstata
não altera as concentrações desses elementos na urina, o que não tornaria essa
análise relevante no diagnóstico do câncer de próstata.
8
8. FONTES CONSULTADAS
1.
NATIONAL CANCER INSTITUTE. SEER Stat Fact Sheets: Prostate Cancer.
Estados Unidos, 2016. Disponível em:
<http://www.seer.cancer.gov/statfacts/html/prost.html>. Acesso em: 5 mar. 2016.
2.
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA.
Estimativa 2014: Incidência de Câncer no Brasil. INCA, Rio de Janeiro, 2014.
p.33. Disponível em:
<http://www.inca.gov.br/bvscontrolecancer/publicacoes/Estimativa_2014.pdf>.
Acesso em: 10 abr. 2016.
3.
VANCE, T.M. et al. Dietary antioxidants and prostate cancer: a review.
Nutrition and cancer, v. 65, n. 6, p. 793-801, ago. 2013. Disponível em: <
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state_Cancer_A_Review>. Acesso em: 13 abr. 2016.
4.
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insights from the selenium and vitamin E cancer prevention trial (SELECT).
Nutrients, v. 5, n. 4, p. 1122-1148, 1 abr. 2013. Disponível em:
<http://www.mdpi.com/2072-6643/5/4/1122/htm>. Acesso em: 15 abr. 2016.
5.
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em: 5 ago. 2016.
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minerals on the development of prostate cancer: a systematic review and metaanalysis. Family Practice, v. 28, p. 243-252, jan. 2011. Disponível em:
<https://fampra.oxfordjournals.org/content/early/2011/01/27/fampra.cmq115.full>.
Acesso em: 10 abr. 2016.
7.
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9
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