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ENGENHARIA GENÉTICA
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Ácidos Nucleicos
James Watson
e
Francis Crick
Em 1953 Watson e
Crick
apresentaram
o
modelo de dupla
hélice
para
a
molécula de DNA –
duas
cadeias
polinucleotídicas
antiparalelas.
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Engenharia Genética
 Durante 25 anos, desde 1950 a 1975, a molécula de DNA
foi considerada “ intocável”.
 A partir da década de 70, a Ciência e a Tecnologia a
trabalhar em conjunto, têm fornecido importantes
conhecimentos sobre a vida, desde a altura que
começaram a manipular o DNA.
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Engenharia Genética
A partir da década de 70 do séc. XX foi desenvolvido um vasto conjunto de
técnicas de análise e manipulação do DNA, com implicações éticas e sociais.
A Engenharia Genética baseia-se num
conjunto de técnicas e ferramentas que
permite a intervenção no genoma de um
organismo construindo novos genomas
por recombinação de segmentos
genómicos de um mesmo ou de
diferentes cromossomas.
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Vírus - Bacteriófago
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Vírus atacar a Bactéria
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Enzimas de Restrição
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Enzimas de Restrição
Escherichia coli (Bactéria)
5´
3´
3´
5´
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Enzimas de restrição/ Ligases do
DNA
As enzimas de restrição fragmentam o DNA por hidrólise em locais
específicos. A especificidade é dada pela sequência de nucleótidos que a
enzima reconhece, fragmentando o DNA sempre que encontra essa
sequência.
Formam-se fragmentos de DNA, em hélice dupla, mas com uma
pequena extensão em cadeia simples em cada extremidade.
As extremidades (coesivas ) podem ligar-se, por complementariedade a
outro DNA, com intervenção de outras enzimas – ligases do DNA.
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Enzimas de restrição e DNA ligase
Organismo A
Organismo B
Os dois DNA estão
ligados
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Vectores
As enzimas de restrição e as ligases do DNA são ferramentas da
engenharia genética que permitem manipular e transferir genes de
uma molécula de DNA para outra, isto é, de um organismo para
outro.
Na transferência de genes é necessária a existência de um
“transportador”, isto é, um vector que leva o material genético de um
genoma para outro.
Há diversos tipos de vectores sendo
os plasmídeos das bactérias dos
mais utilizados.
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Plasmídeos
Muitas bactérias possuem, para além da molécula de DNA
principal, pequenas moléculas de DNA em cadeia dupla – os
plasmídeos.
Geralmente, os genes dos plasmídeos não são essenciais à
sobrevivência da bactéria, podendo ser retirados. Podem replicar-se
independentemente da molécula de DNA principal, podendo fundirse com ela.
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Plasmídeos
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Técnica do DNA recombinante
1.- “Abertura” da molécula de DNA do plasmídeo, num ponto específico,
pela enzima de restrição;
2.- Isolamento de genes de interesse noutras moléculas de DNA “dadoras “
recorrendo a enzimas de restrição do mesmo tipo;
3.- Junção do gene a inserir. Do plasmídeo e de ligases do DNA;
4.- Ligação do gene ao plasmídeo formando-se o DNA recombinante;
5.- Introdução do plasmídeo recombinante em bactérias, que funcionam
como células hospedeiras do novo gene;
6.- Produção da proteína desejada a partir do DNA recombinante.
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DNA recombinante
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DNA recombinante
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Técnica do DNA recombinante
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DNA recombinante ou rDNA
A técnica do DNA recombinante permite produzir moléculas de DNA a
partir da combinação de genes com proveniências diferentes.
É possível introduzir um gene humano em bactérias para que estas
produzam, em larga escala, uma determinada proteína humana.
Além disso, o gene com interesse é clonado permitindo a sua
conservação em diversas cópias para posteriores utilizações –
bibliotecas de genes.
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Biblioteca de genes
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DNA recombinante- Aplicações
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DNA complementar
mRNA
Enzima
que
existe em alguns
Vírus
DNA polimerase
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DNA complementar ou cDNA
Este DNA é obtido a partir do mRNA por complementaridade de bases,
um mRNA que já sofreu processamento ( não contém intrões ) .
A produção de cDNA é possível por ação da enzima transcriptase
reversa.
O mRNA funciona como molde para a síntese de uma cadeia de DNA, um
processo inverso do que se passa habitualmente na transcrição.
Após a formação da primeira cadeia de cDNA , a DNA polimerase forma a
cadeia complementar, constituindo-se uma molécula estável.
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DNA complementar - Técnica
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DNA complementar ou cDNA
A comparação entre o cDNA (sem intrões) e o DNA original permite
localizar as regiões codificantes (exões) e as não codificantes (intrões )
de um determinado gene.
O cDNA facilita a produção de proteínas de seres eucariontes em
bactérias uma vez que estas não possuem mecanismos de
processamento do mRNA, isto é, em presença de um DNA original
transcreveriam todo o gene, incluindo os intrões, obtendo-se
proteínas diferentes das que queríamos.
Ao ser inserido um clone de cDNA garante-se a produção de proteínas
normais.
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Reacção de polimerização em cadeia (PCR)
É uma das técnicas para clonar
DNA de modo a obter grandes
quantidades a partir de uma
pequena amostra.
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PCR - Fases
1º-Aquecimento do DNA para separar as duas cadeias ;
2º- Adição de nucleótidos e da enzima DNA polimerase
para que a dupla hélice seja reconstruída a partir de
cada uma das cadeias simples;
3º- Repetição do procedimento de modo a produzir
cópias suficientes do DNA em estudo.
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DNA fingerprint
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Impressões digitais genéticas
Cada indivíduo possui o seu próprio DNA, que é único.
No seio do DNA encontram-se zonas de restrição, sequências repetitivas
ao longo da molécula, cujo número, tamanho e localização são variáveis
de indivíduo para indivíduo.
Submetido à ação das enzimas de restrição o DNA fragmenta-se
em porções de diferentes tamanhos e pesos moleculares.
Estes pedaços de DNA, sujeitos a electroforese, revelam um
padrão de fragmentos de restrição que é único para cada
indivíduo, funcionando como um “código de barras “ genético.
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DNA fingerprint – aplicação forense
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DNA fingerprint – testes de paternidade
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