Slide 1 - Biodados

BIOQUÍMICA DE “ DNA E CROMOSSOMOS ”
Estabelecimento da Eficiência de
Transcrição
durante as Fases S precoce e tardia
INTRODUÇÃO
O objetivo do trabalho é determinar em qual período da fase S ocorre
maior eficiência de transcrição.
O CICLO CELULAR
Em células animais, a replicação do DNA ocorre de maneira
programada num determinado tempo fixo na fase S.
 A Mitose e a divisão celular ocorrem durante a fase M, que é
relativamente curta.
 Essa é seguida pela fase G1, que cobre a parte mais longa do ciclo
celular.
 Após G1, ocorre a fase S,a qual ocorre a síntese do DNA.
 Durante a fase G2, a célula prepara-se para a mitose e então entra
na fase M novamente.
MÉTODOS:
 Foram usadas células de rato injetadas com genes
repórteres de plasmídeos S16-LacZ e Miogenina-LacZ
com marcador GFP.
 Para determinar em qual período da fase S houve maior
atividade de transcrição foram injetados gene em tempos
diferentes da fase S.
FASE S PRECOCE
S16-LacZ
Miogenina-LacZ
FASE S TARDIA
S16-LacZ
Miogenina-LacZ
 A injeção na fase S Tardia retêm uma baixa taxa de transcrição, ao
contrário da fase S Precoce, mantendo um alto nível de expressão.
 Para finalizar a idéia de que o tempo de injeção determina uma
melhor transcrição, foi projetada uma experiência para medir a
transcrição na fase S tardia e precoce em uma única célula.
FASE S PRECOCE
S16-LacZ
EF1-GFP
FASE S TARDIA
S16-LacZ
EF1-GFP

Enquanto a célula injetada com S16-LacZ na fase precoce expressão 63%
de atividade; só 19% desta mesma população expressão o plasmídeo de
EF1-GFP injetados na fase tardia.
 Foram obtidos resultados semelhantes quando trocaram a
ordem de injeção dos plasmídeos.
 Estes resultados mostram claramente que o DNA na fase S
tardia é relativamente inativo; ao passo que na fase S precoce
é altamente transcrito.
 Para avaliar diretamente a atividade de transcrição na S
precoce, foi usado o RT-PCR ( Reverse Transcription
Polymerase Chain Reaction).
Transcriptase Reversa é um RNA-dependente DNA
polimerase que catalisa a polimerização de nucleotídeos
usando templades de DNA, RNA ou híbridos RNA:DNA.
O Sistema está destinado para síntese do DNA
complementar (cDNA) a partir do RNA com AMV Reverse
Transcriptase e amplificação do DNA a DNA de dupla
hélice com tfl DNA polimerase.
Ambas as reações ocorrem num tampão específico em
um único tubo.
Mais uma vez fica evidente; com a amplificação do RNA e DNA
que a atividade de transcrição é maior na fase S precoce.
 Utilizando a análise de PCR quantitativa, a estrutura da
cromatina foi analisada, caracterizando acetilação da histona.
 O DNA injetado na fase precoce era mais enriquecido de
histonas acetiladas do que o DNA na fase tardia.
 A acetilação das histonas afrouxa a interação entre o DNA e
estas proteínas, favorecendo a transcrição gênica; a desacetilação
das histonas está associada ao bloqueio da transcrição de alguns
genes.
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