Aula 3-2012 - Setor de Virologia UFSM

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
DEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA
BIOLOGIA MOLECULAR
Aula 3 – topologia e propriedades
do DNA
As moléculas de DNA são muito longas
Algumas moléculas de DNA são
circulares
DNA circular ou linear com extremidades
restritas é superenrolado (supercoiled)
Relaxado
Supercoiled
Significado Biológico do
SUPERCOILING
Propriedades físicas:
ABSORVÂNCIA (UV)
ABSORVÂNCIA (UV)
-NTPs > oligonucleotídeos > ssDNA/RNA > dsDNA
1OD260: 50 ug/ml ds DNA
1OD260: 38-40 ug/ml ssDNA ou RNA
1OD260: 33 ug/ml oligonucleotídeos
A cadeia dupla de DNA pode ser “melted”
reversivelmente
ATCGCCTTAAGCGTAGC
''''''''''''''''''''''
TAGCGGAATTCGCATCG
Aumenta
temperatura
Reduz
temperatura
ATCGCCTTAAGCGTAGC
TAGCGGAATTCGCATCG
Absorbância: ssDNA > dsDNA
1.4
1.3
1.2
1.1
1
Temperatura (°C)
1.4
TATCGCCGTG
1.3
1.2
Tm
ATCGGG
TACCCC
1.1
ATAGCGGCAC
1
Temperatura (°C)
Tm:
- Definição
- Fatores que afetam
Melting in vivo
-Significado
-Executado por enzimas
O DNA é replicado por polimerases que
tomam instruções na cadeia-molde
Cada cadeia complementar serve de molde
para a outra na replicação
Separação
A replicação do DNA é semiconservativa
ORGANIZAÇÃO/COMPACTAÇÃO
DO DNA
Bactérias: DNA geralmente
circular, conjugado com
proteínas, compactado
(nucleoide)
Nucleoide ocupa a região
central da bactéria
Bactérias frequentemente possuem moléculas acessórias
de DNA – plasmídios
EUCARIOTAS
DNA conjugado com proteínas – cromatina
Nível de compactação varia muito nas fases do ciclo celular
-
Interfase
Mitose
Compactação: até 7.000 vezes maior
ORGANIZAÇÃO DA CROMATINA
Composição: DNA +
proteínas (1:2)
-
Histonas (50%)
Não histonas (50%)
RNA: < 10% (DNA)
Eucromatina e
heterocromatina
EMPACOTAMENTO DO DNA
Núcleo celular: 6μm de diâmetro
DNA cromossômico humano (6 x 106kb) : 1.8m de extensão
Três níveis de compactação
- NUCLEOSSOMA (6x)
- FIBRA DE 30 nm (40x)
-FIBRA/SCAFFOLD (1000-10.000)
Total: >10.000 -100.000
O NUCLEOSSOMA
HISTONAS
Digestão parcial
Com micrococcal
nuclease
Digestão total com micrococcal nuclease:
NUCLEOSSOMAS
- Unidades básicas da cromatina
-Octâmero histonas + ~200bp DNA + H1
-146bp (invariável) + linker (8-114bp)
-90% do DNA está organizado dessa forma
- CORE contém duas voltas de DNA -
FIBRA de 10nm
FIBRA de 30nm
-CHROMOSOME SCAFFOLD
- Fibras de 30nm
- Cada alça: 30- 90kb
- “Ancoradas” na
matriz protéica
Extremidades do DNA cromossômico: TELÔMEROS
(5 – 10kb)
Telômeros são replicados
TELOMERASES
TELOMERASES possuem
atividade RT
Adiciona oligonucleotídeos
TTAGGG a cada replicação –
Impede o encurtamento do
DNA
Inativada com a idade –
senescência
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