juliana laurito summa – 496

Introdução à tecnologia do DNA recombinante e suas aplicações na
citogenética
1. Através da utilização de enzimas de restrição, que digerem fragmentos
do DNA genômico, dividindo-o.
As extremidades dos fragmentos ficam aderentes, podendo ser unidas
com outras moléculas (fragmentos) de outras fontes diferentes, como um
plasmídeo, com o auxílio de outra enzima denominada de DNA-ligase.
Desta maneira é criada uma molécula de DNA recombinante.
2. Vetor é a molécula de DNA na qual é clonado o gene ou outro
fragmento de DNA capaz de se replicar num determinado hospedeiro.
Podem ser plasmídeos, bacteriófagos , cosmídios e cromossomos
artificiais de leveduras. Estes últimos são os mais apropriados para
clonar fragmentos de 500 – 1000 kb, pois sua faixa de inserção é de
aproximadamente 100 – 1000 kb.
3. Sim, é possível clonar. São cópias de DNA complementar do RNA
mensageiro que não apresentam íntrons ou outras sequências não
codificadoras encontradas no DNA genômico.
4. Sim, esta técnica é padrão para a análise da estrutura de um DNA após
a digestão com enzimas de restrição.
Por esta técnica o DNA genômico de qualquer célula (exceto hemáceas,
que não possuem núcleo) é digerido por uma enzima de restrição e os
fragmentos são separados, conforme o tamanho, por eletroforese em gel
de agarose (fragmentos menores se movem mais rapidamente que os
maiores)
Depois de corados é possível encontrar e examinar os fragmentos
desejados para o estudo, então estes são desnaturados para que os dois
filamentos de DNA se separem e as moléculas de DNA de filamento
único sejam transferidas do gel para um pedaço de papel-filtro de
nitrocelulose ou nailon. Para identificar um único ou mais fragmentos
importantes usa-se uma sonda marcada radioativamente, que é
incubada junto com o filtro em solução com condições favoráveis para a
formação de moléculas de DNA de fita dupla. A sonda se reassocia ao
seu filamento complementar no filtro (hibridização).
5. RFLPs são variações nos sítios de restrição do DNA decorrentes de
mutações ou deleções/ inserções hereditárias de DNA, detectadas
através do Southern blotting. Como as mutações são hereditárias é
possível detectar se a origem é paterna ou materna.
6. São muito importante na identificação individual, como a verificação da
paternidade, pois são uma série de fragmentos alélicos hereditários,
portanto não existem em dois indivíduos que não sejam aparentados.
7. É uma técnica que amplia seletivamente uma única molécula de DNA ou
RNA várias vezes em poucas horas, permitindo a detecção e análise de
sequências de genes específicos sem clonagem e sem a necessidade
do Southern ou Northern blotting, em que é preciso montar uma
biblioteca genômica, necessitando preparar grandes quantidades de
DNA ou RNA.
Com a PCR as análises podem ser feitas com uma única célula (obtida
de um fio de cabelo, de células da mucosa ou de uma gota de sangue
seco). Enfim, a PCR é mais rápida e mais sensível, menos dispendiosa e
menos exigente de amostras.
8. É a técnica equivalente à técnica de Southern blotting, mas para analisar
amostras de RNA.
9. São àqueles derivados de uma célula cujo genoma foi modificado
adicionando um DNA purificado, exógeno. O gene operacional da
amostra deste DNA é chamado de transgene.
10.
Sim. É praticamente o mesmo procedimento utilizado para a
visualização de dandas nos cromossomos através das técnicas de
bandas C e G. Nos três casos o material é corado com o corante
Giemsa, onde os cromossomos visualizados estão em metáfase. Pela
hibridização “in situ” é possível localizar os sítios de DNA ribossomal e
DNA satélite (este último constituído, geralmente por heterocromatina
constitutiva, que é corada pela técnica de bandas C).