O Código de Barras da Vida: Barcoding of Life

O Código de Barras da Vida baseado no DNA “Barcoding of Life”:
Considerações e Perspectivas.
Ana Maria Lima de Azeredo- Espin
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética-CBMEG e Depto. de Genética e EvoluçãoDGE, Universidade Estadual de Campinas-UNICAMP. CEP 13083-970, Campinas, SP, Brasil.
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A diversidade da vida justifica todos os estudos biológicos, mas também é um grande desafio.
Enquanto os físicos lidam com um cosmo constituído de 12 partículas fundamentais, os biólogos
confrontam um planeta constituído por milhões de espécies. Essa discriminação não é uma
tarefa fácil. De fato, uma vez que poucos taxonomistas podem operacionalmente identificar
cerca de 0.01%, das 10-15 milhões de espécies que habitam o nosso planeta, seriam requeridos
cerca de 15.000 taxonomistas para identificar vida caso fossem mantidas as nossas esperanças
no diagnóstico morfológico. Entretanto, esta abordagem para a identificação de espécies, para
ser empregada como rotina, apresenta quatro limitações muito significativas.
1. Ambas, a plasticidade fenotípica e a variabilidade genética nos caracteres empregados para
o reconhecimento de espécies podem, levar a uma identificação incorreta,
2. Essa abordagem omite taxa morfologicamente crípticos, que são comuns em vários grupos.
3. chaves morfológicas freqüentemente são eficientes somente para um estágio do ciclo de
vida e assim muitos indivíduos não podem ser identificados.
4. embora versões interativas e modernas representem o principal avanço, o uso de chaves de
identificação muitas vezes demanda a necessidade de recorrer a um especialista para não
comprometer a identificação.
A limitação herdada no sistema de identificação baseada na morfologia e a escassez de
taxonomistas especializados nos diferentes grupos de organismos, sinalizam a necessidade de
uma nova abordagem para identificação de táxons.
Sistema de identificação microgenômica “DNA Barcoding”
Este sistema de identificação pretende realizar a discriminação de todas as espécies vivas do
planeta através da utilização de um pequeno segmento padronizado de DNA. Esta abordagem
representa uma estratégia extremamente promissora para o diagnóstico da biodiversidade.
A abordagem genômica para diagnóstico de táxon, explora a diversidade entre as seqüências
de DNA para identificar organismos. Em termos reais, essas seqüências podem ser vistas como
um “código de barras” que estão contidos em todas as células. Quando se considera a
discriminação da diversidade da vida a partir de uma perspectiva combinatorial, isto é um
problema modesto. O Código Universal de Produtos (código de barra universal dos produtos),
utilizado para identificar produtos do mercado varejista, emprega 10 números alternados em 11
posições para gerar 100 bilhões de identificadores únicos. Um código de barras genômico tem
somente quatro nucleotídeos alternados em cada posição, mas a cadeia de sítios disponíveis
para a inspeção é maior. À análise de apenas 15 dessas posições de nucleotídeos, criam 415,
portanto 1 bilhão de códigos, isto é, 100 vezes mais que o número requerido para discriminar
vida se cada táxon fosse unicamente marcado
Um sistema taxonômico global para o reino animal provavelmente incluirá pelo menos 10
milhões de espécies distribuídas em mais do que um milhão de gêneros. Devido a esta imensa
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diversidade, existe um consenso na comunidade científica sobre a necessidade de uma
assistência tecnológica para uma descrição inicial e um reconhecimento subseqüente.
Investigações mais recentes têm sugerido que a possibilidade de se criar um sistema seguro de
identificação consiste na análise de pequenos segmentos de DNA. Foi então proposto que um
sistema de código de barras do DNA para o reino animal poderia se basear na diversidade de
uma parte da seqüência do gene da subunidade I da citocromo oxidase (COI), um gene
mitocondrial (relacionada ao terminal 5’ deste gene). Esta nova iniciativa é conhecida como
DNA Barcoding ou “código de barras do DNA” (Herbert et al., 2003a; Blaxter, 2004). Um
exemplo prático foi obtido analisando 650 pb do gene COI de várias espécies de borboletas
(Leptodoptera) (Hebert et al. 2003). Foi verificado que a diversidade nas seqüências de
nucleotídeos de 650pb do gene COI permitiu a discriminação de espécies proximamente
relacionadas de borboletas, um grupo considerado com modestas taxas de evolução molecular
e alta diversidade de espécies. Além disso, esses insetos forneceram um teste desafiador para
verificar o potencial da diversidade de COI em resolver a barreira das espécies (discriminar as
espécies).
Argumento para a Taxonomia baseada no DNA: A idéia do DNA Barcoding
O “Consortium for the Barcode of Life” (CBOL) (www.barcoding.si.edu), foi estabelecido em
2004, com o objetivo de auxiliar no desenvolvimento de um sistema capaz de identificar todas as
espécies do planeta baseado na utilização de um pequeno fragmento padronizado de DNA,
codificador de um gene. O CBOL conta com o financiamento da Alfred P. Sloan Foundation e
da Moore Foundation e tem como objetivos estabelecer uma ferramenta acurada para a
pesquisa taxonômica em espécies animais e vegetais, auxiliar na identificação correta de
espécimens e de ampliar e estimular a taxonomia dos vários grupos de organismos vivos.
Para os animais, foi estabelecido como código de barras, DNA Barcode, uma região de um gene
mitocondrial denominado de citocromo c Oxidase Subunidade I (COI). A idéia em se utilizar um
gene mitocondrial, baseou-se nas características apresentadas pelo genoma mitocondrial tais
como, ser amplamente distribuído entre os animais, alto número de cópias por célula,
apresentar taxa de mutação diferente entre espécies, não sofrer recombinação, ter uma herança
predominantemente materna além de possuir baixo polimorfismo ancestral.
Em plantas a escolha de uma região adequada para representar o DNA Barcode ainda não esta
bem definida como nos animais devido ao genoma mitocondrial vegetal apresentar baixa
variação em seqüências para ser utilizado como código de barras. Para os vegetais, genes ou
regiões do genoma de plastídios e da região nuclear ITS, parecem ser os candidatos mais
promissores (Chase, 2005).
As vantagens em se estabelecer bancos de DNA barcodes completos dos principais grupos
taxonômicos é uma oportunidade para minimizar a atual situação sobre a caracterização da
diversidade biológica em grande escala, através de uma identificação de espécies baseada em
pequenas seqüências de DNA. Este sistema permite que um grande número de exemplares
seja estudado de modo eficiente e identificar os que apresentam código de barra do DNA
diferentes que poderiam ser indicativos de novas espécies. Estas seriam em seguida estudadas
e descritas por especialistas, os taxonomistas.
Um aspecto importante para estabelecer um banco de DNA barcodes de um determinado grupo
taxonômico consiste na necessidade de obter condições de infra-estrutura para a geração de
uma grande quantidade de informações de seqüências de DNA aliada ao trabalho dos
taxonomistas. Esta integração de dados ampliaria a escala de identificação e conhecimento da
biodiversidade.
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Esta iniciativa tem recebido apoio e grandes financiamentos indicando que nos próximos anos
esta abordagem integrada assumirá um papel de destaque em projetos envolvendo estudos
sobre a biodiversidade.
Procedimento Básico do DNA Barcoding:
O procedimento básico para a taxonomia baseada no DNA, DNA Barcoding, é direto. Uma
amostra de tecido seria retirada de um indivíduo coletado e seu DNA extraído. Este tipo de
abordagem tem a vantagem de poder ser realizada a partir de pequenas quantidades de tecido
biológico, eliminando em muitos casos o sacrifício do animal estudado. Este DNA serve como
uma amostra referência para que uma ou várias regiões gênicas possam ser amplificadas pela
técnica de PCR e em seguida seqüenciadas. As seqüências resultantes correspondem a uma
etiqueta de identificação para a espécie da qual a amostra de DNA foi retirada. Essa seqüência
se torna disponibilizada através de um banco de dados, junto com a descrição da espécie e
outras informações associadas, que idealmente incluem seu status taxonômico com referências
associadas. Esta seqüência se torna um padrão para referências futuras, junto com o espécime
tipo e a respectiva preparação do DNA, que será depositada em coleções de museus. Uma vez
que um banco de dados de seqüências tenha sido estabelecido, novas amostras podem ser
averiguadas contra estas seqüências existentes para auxiliar na re-identificação ou para acessar
se a descrição de uma nova espécie poderá ser confirmada.
A base de dados pode também servir para resolver questões sobre a identidade taxonômica de
espécimes que derivaram de estágios diferentes de vida larval, ou para identificação de
espécies ameaçadas de extinção, espécies invasoras, espécies pragas e assim por diante. Na
fase inicial desta iniciativa, esforços concentrados devem ser realizados para alcançar uma boa
cobertura de todas as espécies conhecidas (ou alguns subgrupos alvos específicos). Porém,
uma vez que a base de dados se tornar suficientemente completa, essas comparações,
incluindo as análises filogenéticas de seqüências examinadas, poderá rapidamente colocar
qualquer seqüência de novos espécimes.
A vantagem da informação de seqüências de DNA consiste em ser digital e não ficar
influenciada por uma análise subjetiva. Esta análise poderá ser reproduzida em qualquer tempo
e por qualquer pessoa, e de maneira universal. Conseqüentemente, poderá ser uma ferramenta
de comunicação universal e padronizada para auxiliar na taxonomia, a qual poderá estar
associada a qualquer tipo de informação biológica ou de biodiversidade. Embora a taxonomia
baseada no DNA tenha suas limitações ela tem a vantagem de ser uma ferramenta
universalmente aplicável.
Outra vantagem da análise do DNA consiste na facilidade de extração além de ser uma
molécula muito estável tanto em soluções tampão, como precipitado no etanol, ou congelado em
freezer.. Como as amostras de DNA de qualquer organismo têm os mesmos requerimentos para
preservação, as amostras poderão ser catalogadas e mantidas na ordem em que elas forem
sendo obtidas, simplificando deste modo à organização das coleções. Qualquer amostra deverá
ser separada em várias alíquotas que poderão ser assim distribuídas entre os vários museus e
pesquisadores para análises mais específicas.
A necessidade de se estabelecer protocolos padrões para as coleções de DNA tem crescido
rapidamente. Embora existam vários projetos utilizando a análise do DNA para estudos sobre
filogenia ou filogeografia de espécies, até muito recentemente não havia um esquema unificado
para depósito de “vouchers” (isto é, de espécies amostradas).
Assim, a principal meta a ser alcançada seria a proteção destas amostras potencialmente
valiosas para referências futuras.
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Outro objetivo do CBOL consiste em estabelecer uma biblioteca pública de ‘DNA barcodes’
possibilitando o acesso a esta informação, ampliando e democratizando
estudos e
conhecimentos sobre a biodiversidade.
Ao lado das vantagens do DNA Barcode como aliado para o conhecimento da biodiversidade é
necessário reconhecer alguns aspectos que precisam ser avaliados para minimizar
questionamentos relativos a processos evolutivos envolvendo: espécies crípticas; os limites
entre a variabilidade genética intra versus interespecíficas. Estes limites devem ser avaliados
através da análise de vários espécimes da mesma localidade para se detectar a possível
existência de haplótipos polimórficos cuja variação precede a divergência das espécies.
O desafio biológico do Código de Barra do DNA: DNA Barcoding
O “DNA barcoding” representa uma estratégia designada para satisfazer simultaneamente
várias questões que incluem; melhoria na identificação taxonômica incluindo os não
especialistas; diminuição de custo; praticidade, acesso rotineiro e rápido a informação e uma
aplicabilidade em amplo espectro filogenético e taxonômico de organismos, incluindo muitas
espécies novas, ainda não descritas.
A função essencial do “DNA barcoding”, isto é, do código de barras baseado no DNA, consiste
na habilidade em identificar corretamente um indivíduo dentro de uma espécie, ou de identificar
a amostra como pertencente a uma nova espécie, ainda não descrita.
O código de barra
baseado no DNA não tem intenção de fornecer dados precisos sobre as relações filogenéticas
entre as espécies, embora os esforços sejam compatíveis e idealmente, poderão complementar
os estudos filogenéticos. O nível de identificação taxonômico pretendido com esta nova
abordagem é o de espécie. A utilização de dados moleculares, e em particular de seqüências
diferentes de DNA para o reconhecimento de espécies, determinação e descrição taxonômica
não é uma abordagem nova. Mais propriamente, o diferencial da proposta do “DNA barcoding”
consiste em fornecer aos pesquisadores protocolos padronizados com relação à escolha de
genes, banco de dados eletrônicos, dados sobre coleção de espécimes, de documentação e etc,
além da sua utilização como um sistema para rápido reconhecimento de espécies e
identificação em vários contextos aplicados fora do inventário da espécie e da taxonomia.
Portanto, a identificação de espécies baseada em uma seqüência padronizada de DNA deve ser
considerada como um marcador molecular promissor. Talvez o maior desafio seja estimular a
integração da informação molecular, aliando os avanços técnico-científicos de acesso ao DNA
com a taxonomia para um melhor conhecimento da biodiversidade do nosso planeta.
Custo da análise baseada em DNA Barcode.
Seqüenciamento do DNA é uma tecnologia considerada complexa e cara. Parece que um
taxonomista pode identificar espécimes de uma maneira mais rápida e barata quando
comparada ao do seqüenciamento. Entretanto, essa percepção comum não é necessariamente
acurada. Atualmente nós vivemos numa época onde o custo do trabalho esta aumentando
rapidamente, enquanto o custo da automação diminui. Taxonomistas despendem tempo e
dinheiro consideráveis para treinamento e este tempo geralmente não é utilizado para realização
de identificação de rotina. De fato, taxonomistas utilizam seus conhecimentos especializados
para conduzir projetos científicos específicos e normalmente não atuam como prestadores de
serviços de identificação de espécimes (“facilitiy” de identificação de espécimes). Sob o
esquema de uma taxonomia baseada no DNA, a identificação rotineira de espécimes coletados
durante um projeto ecológico poderá ser realizada dentro de uma “facility” de sequenciamento
de DNA . Para esta análise, há a necessidade de um sequenciador automático que atualmente
se tornou mais acessível em diversos laboratórios devido aos vários projetos genomas em curso
e que poderão ser adquiridos pelos principais museus. Uma alternativa será a associação com
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outros laboratórios, já detentores destes equipamentos e da capacitação técnica necessária
para processar e analisar as amostras.
O estabelecimento de uma “facility de DNA” que poderia rotineiramente analisar
aproximadamente 1000 amostras por dia poderá custar um valor aproximado ao de, por
exemplo, uma análise através de microscópio de varredura. O custo em laboratórios europeus
do material para cada amostra, incluindo a extração do DNA e o sequenciamento de 2 regiões
independentes foi estimado ser em torno de 5 Euro por amostra em cada “facility”.
Ainda assim, o custo para 1000 amostras processadas por dia, parece ser muito para uma
escala de museu!, mas é ainda considerada bem modesto quando comparado com projetos
genomas que estão em curso. Evidentemente este custo não deverá ficar sob a
responsabilidade de cada museu e ou das instituições de pesquisas mantenedoras das coleções
biológicas, mas sim estimular as agências e fundações de financiamento através de parcerias
de longo prazo com Universidades e Centros de Biologia Molecular capacitados para
operacionalizar grande número de seqüências rotineiramente.
Finalmente, desenvolvimento de novas tecnologias fará o custo desta metodologia diminuir
ainda mais.
As principais vantagens de tais facilidades seriam duas:

Primeiro, ela pode fornecer um serviço de custo efetivo para os pesquisadores ou mesmo
amadores, que não tem acesso direto a seqüenciadores automáticos. Isto permitirá que
pesquisadores de países em desenvolvimento possam participar diretamente nesse
esquema.
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Segundo, eles podem estabelecer um padrão necessário para assegurar seqüências de
alta-qualidade das amostras.
Conclusão
A revolução genômica nas últimas décadas tem fornecido as ferramentas que permitem que um
sistema taxonômico universal baseado no DNA (DNA barcoding) se torne um objetivo
executável e desejável. Esse sistema permite dar um novo estímulo nas pesquisas sobre
biodiversidade, complementando várias outras iniciativas em curso para absorver os
conhecimentos taxonômicos atuais e estimular o treinamento e a capacitação em taxonomia.
Ainda mais importante, atualmente, é possível construir uma maneira de integrar o poder do
sistema tradicional de identificação de espécies com as novas possibilidades tecnológicas. Isto
permitirá uma utilização mais ampla e, de fato requerida, do valioso conhecimento dos
taxonomistas que tem sido acumulado durante séculos, além de torná-los amplamente
acessíveis. Também proporciona um novo papel aos Museus de História Natural, isto é, de um
acervo molecular (facilities”) e detentores da diversidade biológica e genômica. Atingimos uma
era em que os conhecimentos, molecular e morfológico, devem e podem ser formalmente e
construtivamente associados.
Perspectivas para o Brasil
A iniciativa internacional denominada “Consortium for the Barcode of Life-CBOL” destinada a
desenvolver o DNA Barcoding, tem recebido grande apoio financeiro na esfera internacional de
fundações privadas de fomento à pesquisa, merecendo destaque às iniciativas “Canadian
Barcode of Life Network” que pretende criar um banco de seqüências de todos os eucariotos do
Canadá. Outra ambiciosa iniciativa consiste na “Barcoding All Birds” que tem como objetivo
realizar o DNA barcode de todas as espécies de aves do mundo (www.barcodinglife.org).
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O Brasil possui a maior biodiversidade do nosso planeta, abrigando a maior diversidade
biológica entre os 17 países considerados megadiversos que reúnem 70% de espécies de
animais e vegetais catalogadas no mundo. Calcula-se que o país possua o maior número de
espécies endêmicas (Lewinsohn e Padro, 2002, Klazco e Vieira, 2003). A Mata Atlântica e o
Cerrado foram designados como “hotspots” de biodiversidade pelos estudos da Conservation
International (www.conservation.org). Com isso, o Brasil tem um importante papel na
preservação da biodiversidade do nosso planeta. No entanto, estima-se que apenas 10% das
cerca de 2 milhões de espécies da fauna e da flora brasileira já foram identificadas (Lewinsohn e
Prado, 2002). De acordo com estes autores, a cada ano, o total de espécies catalogadas cresce,
em média, 0.6%. Esta estimativa lenta é atribuída ao número reduzido de taxonomistas, técnicos
em atividade e em número suficiente nos diferentes grupos de organismos e nas diferentes
regiões do país, dificultando os inventários sobre a biodiversidade brasileira.
Considerando este cenário que inclui a alta taxa de endemismo, dificuldade de identificação de
muitas espécies, grande número de espécies não descritas associado à falta de especialistas
para a identificação dos inúmeros espécimes já coletados para assegurar a conservação e o
conhecimento da nossa biodiversidade, torna-se estratégico que o Brasil se associe a iniciativas
como a proposta pelo Consortium for the Barcode of Life-CBOL.
No Brasil, com a experiência adquirida na última década por vários grupos de pesquisa na área
de genômica e de bioinformática, associada a reconhecida competência de vários
pesquisadores na área de biodiversidade e da taxonomia, tem-se as condições essenciais para
liderar um inventário sobre a nossa biodiversidade, com um enfoque multidisciplinar e em
grande escala.
Promover a integração entre pesquisadores destas áreas estratégicas
incorporando os avanços e o acesso a ferramentas de informação tais como a do DNA
barcoding, através da elaboração de projetos em grande escala sobre a biodiversidade no Brasil
deve ser estimulada e fazer parte da agenda das agências brasileiras de fomento nos próximos
anos.
Bibliografia
Chase, M.W.. 2005. The problems with plants:issues and possible solutions. In: First
International Scientific Conference on DNA Barcoding. Natural History Museum, London.
Consortium for the Barcode of Life” (CBOL) (www.barcoding.si.edu),
Hebert, P. D. N., A. Cywinska, S. L. Ball and J. R. Dewaard, 2003. Biological identifications
through DNA barcodes. Proceeding of the Royal Society of London, 270:313-321.
Klaczko, L. B. & R. D. Vieira. 2003. Avaliação do estado do conhecimento da diversidade
biológica no Brasil-Genética. Ministério do Meio Ambiente, 68p.
Lewinshohn, T. M. & P. I. Prado. 2002. Biodiversidade Brasileira: Síntese do estado atual do
conhecimento. Ministério do Meio Ambiente- Conservation International do Brasil. Ed.
Contexto. 176p.
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