Tese_14032004 - Estudo Geral
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Margarida Luísa Baptista Aparício Amaral Santiago Monteiro Grilo EFEITO DA CICLOSPORINA A NA VIA DA L-ARGININA:NO:GMPc VASCULAR E PLAQUETAR NUM MODELO EXPERIMENTAL Coimbra 2004 ANIMAL Dissertação de Mestrado submetida à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra, sob orientação científica do Professor Doutor Frederico Teixeira, no âmbito do Curso de Mestrado em Tecnologias do Medicamento, na área de Farmacologia Trabalho experimental realizado na Unidade de Terapêutica do Instituto de Farmacologia e Terapêutica Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Aos meus pais Ao Tiago À Maria Miguel Ao Miguel Agradecimentos Ao Professor Doutor Frederico Teixeira, desejo expressar a minha sincera gratidão e o meu profundo reconhecimento pela sua orientação científica, os seus ensinamentos indispensáveis para a concretização deste trabalho, pelo seu apoio e pelas facilidades laboratoriais e experimentais que disponibilizou e pela oportunidade concedida para a realização deste mestrado. Ao Professor Doutor Luís de Almeida desejo agradecer pela sua valiosa colaboração, pela amizade pessoal, pelo estímulo e pelas contínuas palavras de incentivo e pela permanente disponibilidade com que sempre me apoiou e acompanhou o desenvolvimento deste trabalho. Ao Mestre Flávio Reis manifesto um especial apreço pela pronta e desinteressada colaboração e auxilio prestados, além da sua amizade pessoal. À Mestre Teresa Alcobia pela colaboração dispensada e pela amizade. Aos restantes colegas e funcionários do Instituto de Farmacologia e Terapêutica Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra, agradeço o ambiente de trabalho proporcionado. Ao Dr. Joaquim Dionísio agradeço a elevada competência, empenho e espírito de sacrifício na realização do trabalho experimental. Ao Dr. Adamo Caetano agradeço o apoio na administração dos ratos e na composição desta tese. Ao Sr. Paulo Borges agradeço a sua valiosa ajuda na preparação do trabalho experimental. À Dra. Helena Teixeira pela motivação e palavras amigas de incentivo. À Sra. Professora Doutora Luísa Leitão agradeço os conhecimentos transmitidos, o seu valioso apoio e a colocação à nossa disposição os meios técnicos do Departamento de Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia, indispensável à realização das determinações espectofotométricas. Ao senhor Dr. Ferrer Antunes, desejo expressar o meu agradecimento pelo apoio dispensado na realização dos estudos efectuados nos Laboratório de Hematologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra. À Dra. Margarida Lourenço o meu agradecimento pela colaboração dispensada durante a realização daqueles estudos. Ao senhor Manuel Gomes Almeida agradecemos toda a ajuda prestada na montagem final deste trabalho. Ao PRAXIS desejo agradecer o apoio financeiro concedido através da atribuição de uma bolsa de mestrado PRAXIS XXI/BM/14666/97 e pelo financiamento obtido do Programa PRAXIS (PRAXIS/PSAU/C/SAU/57/96), os quais me permitiram realizar este trabalho. À NOVARTIS Farmacêutica, pela gentil cedência da ciclosporina. À Cristina e à Sofia obrigado pela vossa amizade e apoio. A todos os que directa ou indirectamente tornaram possível este trabalho, obrigado. ÍNDICE ABREVIATURAS ............................................................................................................. 15 RESUMO............................................................................................................................ 21 CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO GERAL A HIPERTENSÃO ARTERIAL ...................................................................................... 29 O ENDOTÉLIO VASCULAR.......................................................................................... 33 Regulação do tónus vascular dependente do endotélio ................................................... 37 1. Factores constritores .................................................................................................... 38 1.1. Endotelina ............................................................................................................. 38 1.2. Factores constritores derivados da cicloxigenase ................................................. 40 1.3. Sistema renina-angiotensina ................................................................................. 40 1.4. Sistema adrenérgico .............................................................................................. 42 2. Factores relaxantes ...................................................................................................... 43 2.1. Factor hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) ....................................... 44 2.2. Prostaciclina ......................................................................................................... 45 2.3. Monóxido de azoto (NO) ...................................................................................... 50 2.3.1.Perspectiva histórica ....................................................................................... 50 2.3.2.Biossíntese de NO .......................................................................................... 51 2.3.3. Isoformas da sintase do NO ........................................................................... 53 2.3.4.Transporte e moléculas alvo do NO ............................................................... 56 GMPc. O principal sistema efector da acção do NO. .......................................... 58 2.3.5. Funções do NO endógeno.............................................................................. 63 a) Sistema imunitário e inflamatório ................................................................... 63 b) Sistema nervoso central e periférico ............................................................... 64 c) Sistema cardiovascular. O papel do NO na homeostase vascular. .................. 65 1. Acções vasculares do NO ............................................................................ 65 2. Acções do NO na homeostase e na função das plaquetas ........................... 68 3. Acções do NO nos leucócitos ...................................................................... 72 O PAPEL DAS PLAQUETAS NA FISIOPATOLOGIA DA HIPERTENSÃO ......... 75 1. Introdução .................................................................................................................... 75 2. Estrutura das plaquetas ................................................................................................ 76 3. Funções ........................................................................................................................ 78 4. A plaqueta como unidade de produção e libertação de NO ........................................ 85 A CICLOSPORINA A ...................................................................................................... 91 1. Introdução .................................................................................................................... 91 2. Propriedades farmacodinâmicas. Mecanismo de acção .............................................. 92 3. Propriedades farmacocinéticas .................................................................................... 95 3.1. Absorção ............................................................................................................... 95 3.2. Distribuição .......................................................................................................... 95 3.3. Metabolismo e excreção ....................................................................................... 96 4. Efeitos secundários ...................................................................................................... 98 4.1. A ciclosporina como agente indutor de hipertensão arterial ................................ 99 4.2. A influência da ciclosporina na reactividade vascular ....................................... 101 4.3. A influência da ciclosporina na função plaquetar .............................................. 106 CAPÍTULO II – OBJECTIVOS .................................................................................... 109 CAPÍTULO III – PARTE EXPERIMENTAL I Modelo animal e protocolo experimental ................................................................... 119 1. Modelo animal........................................................................................................... 119 2. Protocolo Experimental ............................................................................................. 120 2.1 Grupo de ratos ..................................................................................................... 120 2.2 Doses administradas ............................................................................................ 121 2.3 Caracterização do modelo animal experimental ................................................. 122 A) Peso dos ratos ................................................................................................... 122 B) Parâmetros hematológicos................................................................................ 124 1 - Metodologia ................................................................................................. 124 2 - Resultados e comentários ............................................................................. 124 C) Pressão arterial ................................................................................................. 127 1 - Metodologia ................................................................................................. 127 2 - Resultados e comentários ............................................................................. 128 II O sistema NO:GMP .................................................................................................... 138 A - Introdução ............................................................................................................... 138 B - Metodologia ............................................................................................................ 142 1. Determinação dos teores arteriais de NO .............................................................. 142 2. Determinação dos teores arteriais de GMPc ......................................................... 145 3. Determinação dos níveis plaquetares de NO......................................................... 147 3.1 Ensaios ex vivo ................................................................................................ 147 3.2 Ensaios in vitro ................................................................................................ 149 4. Determinação dos níveis plaquetares de GMPc .................................................... 150 C - Reagentes ................................................................................................................ 151 D - Resultados ............................................................................................................... 152 1. Determinação dos teores arteriais de NO .............................................................. 152 2. Determinação dos teores arteriais de GMPc ......................................................... 161 3. Determinação dos níveis plaquetares de NO......................................................... 164 3.1 Ensaios ex vivo ................................................................................................ 164 3.2 Ensaios in vitro ................................................................................................ 168 4. Determinação dos níveis plaquetares de GMPc .................................................... 172 E - Comentários ............................................................................................................. 175 III PGI2 – factor vasorelaxante e inibidor da agregação plaquetar ........................... 186 A - Introdução ............................................................................................................... 186 B - Metodologia ............................................................................................................. 187 1. Determinação dos teores arteriais de 6-ceto-PGF1 ............................................ 187 2. Determinação dos teores plasmáticos de 6-ceto-PGF1 ...................................... 188 C - Reagentes ................................................................................................................. 188 D - Resultados ............................................................................................................... 189 1. Determinação dos teores arteriais 6-ceto-PGF1 ................................................. 189 2. Determinação dos teores plasmáticos 6-ceto-PGF1 ........................................... 190 E - Comentários ............................................................................................................. 192 CAPÍTULO IV - SÍNTESE E CONCLUSÕES ............................................................ 194 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 202 ABREVIATURAS Abreviaturas _________________________________________________________________________ AA - Ácido araquidónico ACD - Ácido-citrato-dextrose ADP - Adenosina difosfato ADN - Ácido desoxiribonucleico AMPc - 3’, 5’-monofosfato de adenosina cíclico ANG I - Angiotensina I ANG II - Angiotensina II ARNm - Ácido ribonucleico mensageiro ATP - 5’-trifosfato de adenosina ATPase - Trifosfatase de adenosina BH4 - Tetrahidrobiopterina [Ca2+]i - Concentração de cálcio livre intracelular CAM - Calmodulina 6-ceto-PGF1α - 6-ceto-prostaglandina F1α COX - Cicloxigenase COX-1 - Cicloxigenase (tipo 1) COX-2 - Cicloxigenase (tipo 2) CsA - Ciclosporina A DAG - Diacilglicerol DMSO - Dimetilsulfóxido ADN - Ácido desoxiribonucleico EDHF - Factor hiperpolarizante derivado do endotélio EDRF - Factor de relaxamento derivado do endotélio EDTA - Ácido etilenodinitrilotetracético ELISA - Ensaio imunoadsorvente de ligação enzimática FAD - Flavina adenina dinucleótido FC - Frequência cardíaca FMN - Flavina adenina mononucleótido GC - Guanilciclase GCs - Guanilciclase solúvel GDP - 5’-Difosfato de guanosina 17 Abreviaturas _________________________________________________________________________ 18 GMPc - 3’,5’- monofosfato de guanosina cíclico GTP - 5’-trifosfato de guanosina HEPES - (N-[2-hidroxietil] piperazina- N’- [2- ácido etanosulfónico]) HDL - Lipoproteína de alta densidade 5-HT - 5-hidroxitriptamina (serotonina) IBMX - Isobutilmetilxantina IF-γ - Interferon γ IL-1 - Interleucina-1 IL-1b - Interleucina-1b IL-2 - Interleucina-2 IL-3 - Interleucina-3 IL-4 - Interleucina-4 IL-β - Interleucina β Ins - Inositol InsP3 - Inositol-1,4,5- trifosfato LDL - Lipoproteína de baixa densidade LPS - Lipopolissacarídeo MAO - Monoaminoxidase NA - Noradrenalina NADH - Nicotinamida adenina dinucleótido (forma reduzida) NADPH - Nicotinamida adenina dinucleótido (forma oxidada) L-NNA - NG-nitro-L-arginina NO - Monóxido de azoto NOS - Sintase do NO NOSc - Forma constitutiva da sintase de NO NOSe - Forma constitutiva da sintase de NO endotelial NOSi - Forma indutível da sintase do NO NOSn - Sintase do NO neuronial PA - Pressão arterial PAD - Pressão arterial diastólica PAF - Factor activador das plaquetas PAM - Pressão arterial média Abreviaturas _________________________________________________________________________ PAS - Pressão arterial sistólica PBS - Solução tampão de fosfato PDGF - Factor de crescimento derivado das plaquetas PGD2 - Prostaglandina D2 PGE2 - Prostaglandina E2 PGF1α - Prostaglandina F1α PGG2 - Prostaglandina G2 PGH2 - Prostaglandina H2 PGI2 - Prostaglandina H2 (prostaciclina) PI - Fosfatidilinositol PI-P2 - Fosfatidilinositol- 4,5-bifosfato PKC - Proteína cinase C PLA2 - Fosfolipase A2 PLC - Fosfolipase C PPP - Plasma pobre em plaquetas PRP - Plasma rico em plaquetas R - Receptor RVP - Resistência vascular periférica SNC - Sistema nervoso central SNP - Sistema nervoso periférico SNS - Sistema nervoso simpático TGF-β - Factor β transformador do crescimento TNF - Factor de necrose tumoral TXA2 - Tromboxano A2 TXB2 - Tromboxano B2 VS - Volume sistólico vWF - Factor de von Willebrand 19 Abreviaturas _________________________________________________________________________ 20 RESUMO 21 22 Resumo _________________________________________________________________________ A CsA foi introduzida como fármaco imunossupressor na década de 70 em transplantes renais humanos e ainda hoje é aceite como um dos fármacos de eleição no transplante de orgãos e no tratamento de algumas doenças auto-imunes. Esta possui uma potente acção imunossupressora selectiva nos linfócitos e não apresenta actividade citostática relevante. Contudo, o seu uso terapêutico tem estado associado ao aparecimento de efeitos secundários graves, como a nefrotoxicidade, o desenvolvimento de hipertensão e o aumento do risco de complicações tromboembólicas. Apesar da intensa investigação que tem ocorrido ao longo dos anos, o mecanismo fisiopatológico subjacente à resposta hipertensora que ocorre tanto em doentes como em modelos animais experimentais tratados com a CsA continua por esclarecer, pelo menos na sua totalidade. Contudo, têm sido desenvolvidos esforços substanciais para tentar compreender estes efeitos e têm sido propostos variados mecanismos. Mas, a identificação dos mediadores biológicos responsáveis pelo aumento da pressão sanguínea e a precisa implicação de alguns destes mediadores continua em aberto. Além disso, continua o debate em relação à relativa contribuição de diferentes tecidos alvo para a patogénese da hipertensão induzida pela CsA. Têm sido implicados mecanismos renais, vasculares e neuroniais e estes não são mutuamente exclusivos. A contribuição relativa de cada um destes deve variar consideravelmente dependendo de variados factores, incluindo a espécie, a dose e a duração do tratamento. Em relação aos mecanismos vasculares, hoje está estabelecido que a CsA pode inibir as vias vasodilatadoras e/ou activar as vias vasoconstrictoras. Um dado consensual é o aumento da vasoconstrição e têm sido propostos variados mecanismos para explicar essa vasoconstrição induzida pela CsA, nomeadamente: um efeito directo sobre a contractilidade do músculo liso vascular, através do aumento da concentração do cálcio livre intracelular; um efeito indirecto através da potenciação da resposta contráctil a certos agentes vasoconstrictores como a noradrenalina e a angiotensina II; uma interferência com a produção local de substâncias hemodinâmicas vasoactivas, nomeadamente o aumento da vasoconstrictores e/ou a diminuição de vasodilatadores e um aumento da actividade do sistema nervoso simpático e/ou da libertação de neurotransmissores das terminações nervosas do músculo liso vascular. 23 Resumo _________________________________________________________________________ Variados estudos clínicos sugerem que a patologia cardiovascular estará associada, entre outras, a disfunções no sistema L-arginina:NO:GMPc. Assim, as alterações nesta via poderão ser uma das principais causas do aumento da reactividade vascular e plaquetar associada à hipertensão arterial induzida pelo tratamento com a CsA. Assim, com este trabalho pretendeu-se avaliar qual ou quais as alterações que podem ocorrer nos mecanismos vasodilatadores, em especial na via da Larginina:NO:GMPc, visto ser o monóxido de azoto o principal factor relaxante derivado do endotélio e o GMPc o seu principal sistema efector. Fomos também estudar as alterações que a PGI2 poderia apresentar quer a nível vascular quer a nível plasmático, uma vez que esta é também um importante factor vasodilatador derivado do endotélio e um potente inibidor da activação plaquetar, contribuindo assim igualmente para a fisiologia e fisiopatologia cardiovascular. Uma vez que existe a possibilidade das plaquetas estarem também envolvidas no aumento da pressão arterial induzida pela CsA, com base nos variados mecanismos propostos para o aumento da vasoconstrição e visto que as plaquetas também possuem uma via da L-arginina:NO que regula a sua agregabilidade, fomos também estudar se estaria alterada a via da L-arginina:NO:GMPc das plaquetas. Nos estudos realizados em trabalhos anteriores verificou-se que no nosso modelo experimental a lesão morfológica arterial ainda insipiente, já comprometia, sobretudo a camada da íntima (edema endotelial, esporões, ruptura da lâmina elástica), cujas lesões atingiam essencialmente as células endoteliais e não o músculo liso vascular. Apesar disso, nós encontrámos um aumento da síntese de colagénio. Nos estudos morfológicos das plaquetas identificaram-se alguns sinais, como a formação de pseudópodos, a alteração da forma e a modificação da estrutura membranar, que sugerem uma activação plaquetar nos ratos tratados com CsA (estudos realizados em trabalhos anteriores). Apesar de discretas, tais alterações são relevantes porque são acompanhadas por evidentes distúrbios da pressão arterial e por nítidas alterações bioquímicas. De facto, a administração de CsA, na dose de 5 mg/Kg/dia, induziu hipertensão arterial no nosso modelo animal experimental, reproduzindo o que sucede em doentes 24 Resumo _________________________________________________________________________ sujeitos ao tratamento clínico com a CsA. Tal hipertensão arterial caracteriza-se por um aumento da pressão arterial média, mas também da sistólica e diastólica, sem alteração da frequência cardíaca. Tais factos deixam antever alterações na resistência vascular periférica e, consequentemente, na reactividade vascular. A CsA actua sobre a via da L-Arg:NO:GMPc já que se constatou que a nível arterial o tratamento com a CsA levou a um decréscimo de cerca de 30% no conteúdo de NO acompanhado de uma diminuição mais elevada, de cerca de 66% no conteúdo de GMPc. Tal facto deverá ser devido a um efeito combinado da CsA nos processos de síntese no endotélio e nos processos de formação de GMPc a partir de NO, contribuindo para a elevada perda de GMPc a nível arterial. Assim, a CsA actuará quer a nível endotelial quer a nível do músculo liso vascular. A diminuição de NO e de GMPc a nível vascular deverá contribuir para o aumento da resistência vascular periférica encontrada no nosso modelo. Estas alterações foram acompanhadas por uma diminuição do teor de PGI2 a nível arterial, o que também deverá contribuir de forma efectiva para o aumento da resistência vascular periférica que caracteriza o nosso modelo experimental. Nos estudos bioquímicos das plaquetas dos ratos tratados com CsA encontramos um aumento do conteúdo de NO e de GMPc plaquetar o que provavelmente lhes induz um estado não reactivo ou “antihiperreactivo”. De facto, nas condições de disfunção endotelial, como as por nós verificadas, a própria produção de NO pelas plaquetas pode tornar-se importante na regulação da resposta das plaquetas, nomeadamente na modulação e inibição da sua activação. O aumento do NO e consequentemente o do GMPc encontrado irá levar à diminuição dos níveis de Ca2+ intracelular e assim actuar como mecanismo de retrocontrolo negativo intraplaquetar que previne a activação e agregação excessiva das plaquetas. O aumento da concentração de PGI2 plasmática poderá também actuar na contraregulação do estado hiperactivo das plaquetas. 25 Resumo _________________________________________________________________________ A administração conjunta de L-arginina e CsA apesar de prevenir as alterações relacionadas com os níveis de NO e de GMPc não preveniu o desenvolvimento da hipertensão arterial, o que sugere o envolvimento de outras alterações a nível da via NOGMPc, que deverão também ser avaliadas. Além disso, a simples administração de Larginina não parece constituir a solução para tais alterações e outras estratégias clínicas poderão ser equacionadas, nomeadamente o recurso a dadores de NO com outras propriedades que não apenas o de substrato da NOS, como o é a L-arginina. 26 CAPÍTULO I INTRODUÇÃO GERAL Introdução geral ___________________________________________________________________________ A HIPERTENSÃO ARTERIAL Para a O.M.S. a hipertensão arterial essencial pode ser definida como uma elevação dos valores da pressão arterial sistólica e/ou diastólica acima de 140 e 90 mmHg, respectivamente, para pessoas que não tenham tomado qualquer medicação para a hipertensão. No entanto, os valores considerados normais para a pressão arterial variam com o sexo e a idade: os homens apresentam valores mais elevados do que as mulheres e os idosos valores mais altos do que indivíduos mais jovens. As alterações hemodinâmicas da hipertensão arterial iniciam mudanças adaptativas nos vasos de condução e de resistência caracterizadas por hipertrofia e hiperplasia do músculo liso da média, aumento da matriz extracelular, diminuição da “compliance”, e aumento da resistência. A resposta remodeladora adaptativa tende a normalizar o “stress” na parede e confere um aumento da reactividade vascular. Todavia, as próprias alterações vasculares podem contribuir para a amplificação da vasoconstrição, perpetuação da hipertensão e promoção do desenvolvimento de complicações vasculares como a aterosclerose. Variados factores parecem estar envolvidos no aumento observado da resistência vascular periférica total: a) Alterações histológicas nos leitos vasculares: endotélio, íntima e média. b) Alteração do metabolismo do cálcio que leva a um aumento do Ca2+livre intracelular, facto que facilita a contracção desencadeada pelas substâncias vasoconstritoras. c) Aumento da permeabilidade da membrana ao Na+ e ao Ca2+. d) Redução da actividade da Ca2+-ATPase da membrana celular e do retículo sarcoplasmático e da troca Na+-Ca2+, aumentando o Ca2+ livre intracelular. e) Modificação da actividade da bomba de Na+ da membrana plasmática. f) Aumento do tónus adrenérgico periférico com um aumento da libertação de NA. g) Alterações no sistema renina-angiotensina, essencialmente o existente nos tecidos extrarrenais. 29 Capítulo I ___________________________________________________________________________ h) Aumento da reactividade vascular dos adrenoreceptores 1 pós-sinápticos e atenuação da resposta -adrenérgica. i) Aumento da densidade do adrenoreceptor renal (sobretudo ao nível dos túbulos proximais). j) Alteração do endotélio vascular com produção de substâncias vasoconstritoras e facilitando a produção de mitogénios. k) Presença de substâncias endógenas que inibem a bomba de Na+ presente nas células musculares lisas vasculares e nos terminais nervosos noradrenérgicos. Esta inibição aumenta os níveis intracelulares de Ca2+nos dois locais, ao facilitar o influxo de Ca2+através do trocador Na+-Ca2+, aumento do tónus vascular e da libertação de NA, respectivamente. A acção das substâncias endógenas em ambos os locais parece ser modulada por factores libertados pelo endotélio. Todos estes mecanismos causam um aumento no tónus vascular e na resistência arterial, produzindo hipertensão (Marín, 1993). A hipertensão arterial, ela própria, provoca também alterações morfológicas que afectam não só o endotélio mas também a íntima e as células musculares lisas vasculares. Têm sido referenciadas alterações no citoplasma, tamanho e forma das células endoteliais (Haudenschild, Prescott e Chobanian, 1980), assim como na replicação endotelial (Huttner e Gabbiani, 1982). A íntima e a média sofrem alterações estruturais e bioquímicas que produzem hipertrofia e provavelmente hiperplasia (Bachmann e col., 1992). Também tem sido descrita a aceleração da aterosclerose e a deposição subendotelial de macrófagos (Clozel e col., 1991). Além disso, as interacções das plaquetas e dos monócitos com o endotélio também se apresentam aumentadas nos vasos dos hipertensos quando comparados com os vasos controlo dos normotensos. As alterações das células endoteliais são consideradas como os principais factores para o aumento da resistência vascular sistémica total, levando ao aumento da pressão sanguínea arterial (Shepherd, 1990). 30 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Também é sugerido que alterações genéticas possam gerar uma formação predominante de factores constritores derivados do endotélio e mitogénicos, os quais aumentam as respostas desencadeadas pelos vasoconstritores e reduzem a área do lúmen. Todos estes mecanismos e substâncias vasoconstritoras limitam a vasodilatação e perpetuam a hipertensão (Shepherd, 1990). Assim, as alterações da função ou funções endoteliais podem contribuir para a patogénese, assim como para a progressão e complicações da hipertensão. 31 Capítulo I ___________________________________________________________________________ 32 Introdução geral ___________________________________________________________________________ O ENDOTÉLIO VASCULAR Todo o sistema vascular é revestido internamente por uma monocamada celular contínua de endotélio. Durante muito tempo, o endotélio foi encarado como uma simples “alcatifa” actuando como mera barreira mecânica, sendo-lhe atribuída apenas a função de proteger internamente os vasos e de permitir a passagem de diversas substâncias de e para a circulação sanguínea. Mas hoje sabe-se que o endotélio é uma estrutura complexa e heterogénea com capacidade para reagir a estímulos humorais e hemodinâmicos, que desempenha um papel chave na regulação da parede dos vasos quer em condições fisiológicas quer patológicas e está envolvido em funções tão importantes e variadas como as que se encontram resumidas no Quadro 1 e que serão descritas ao longo do texto. Quadro 1 - Funções do endotélio _____________________________________________________ barreira selectivamente permeável entre a circulação e a parede vascular actividades coagulantes/anti-coagulantes vasoconstrição/vasodilatação promotor/inibidor do crescimento síntese/degradação adesão/não adesão fenómenos inflamatórios e resposta imunitária _____________________________________________________ 33 Capítulo I ___________________________________________________________________________ As células endoteliais ocupam uma posição anatómica estratégica entre o sangue e o músculo liso vascular desempenhando um importante papel não só como “sensor” mas também como “modulador” da biologia da parede arterial, sendo o endotélio quer um alvo quer um mediador da doença cardiovascular. As células endoteliais desempenham um papel fundamental na manutenção da estrutura normal da artéria e da sua integridade funcional. O endotélio não só forma uma barreira permeável que controla as trocas de nutrientes e fluidos entre o plasma e as diversas estruturas da parede do vaso mas também providencia uma superfície não aderente para os leucócitos, os eritrócitos e as plaquetas; superfície não trombogénica também através da formação de moléculas como a ectoADPase (ecto-nucleotidase ADP difosfohidrolase), a PGI2 e o sulfato de heparina (Ross, 1995). As células endoteliais produzem substâncias constituintes da lâmina basal, nomeadamente colagénio tipo IV e V, elastina, fibronectina, mucopolissacáridos e condroitina; participam na formação e secreção de uma série de moléculas reguladoras do crescimento e citocinas e possuem a capacidade de modificar substâncias como as lipoproteínas a partir do plasma (Ross, 1995). O endotélio desempenha um papel chave na coagulação. Em relação ao sistema solúvel da coagulação, as células endoteliais podem ter um papel pró-coagulante ou um papel anti-coagulante (Ross, 1995). As células endoteliais também segregam um activador do plasminogénio que actua na lise dos coágulos sanguíneos e o factor von Willebrand (factor VIII) que é um importante componente nas interacções entre as plaquetas e a parede vascular (Ross, 1995). O endotélio controla a proliferação das células do músculo liso vascular subjacente e regula a adesão e extravasão de neutrófilos, de monócitos e de linfócitos. Ao nível da agregação plaquetar, o endotélio também desempenha um papel de relevo: liberta substâncias que apresentam um efeito anti-agregante plaquetar como é o caso da PGI2 (Moncada e col., 1976; Tateson, Moncada e Vane, 1977) e do NO (Radomski, Palmer e Moncada, 1990a) sendo importantes factores para a manutenção da homeostase e para a prevenção da trombose. 34 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Para manter a regulação do tónus vascular e a fluidez do sangue, as células endoteliais sintetizam diversas substâncias vasoconstritoras e vasodilatadoras: a) moléculas de elevado peso molecular como a fibronectina, o sulfato de heparina, a IL-1 e diversos factores promotores de crescimento; b) moléculas de baixo pequeno peso molecular como o factor activador das plaquetas, a endotelina-1, a PGI2 e o NO. A produção destas substâncias é regulada através de alterações na concentração de diversos mensageiros intracelulares tais como o AMPc, o GMPc ou o ião cálcio e através da interacção das células endoteliais com diferentes tipos de leucócitos, com as plaquetas ou com compostos constituintes do plasma (Vane, Änggard e Botting, 1990). Além disso, o NO parece ser um factor inibidor do crescimento que se opõe aos factores promotores do crescimento, como a angiotensina II, a endotelina-1 e os radicais livres derivados do oxigénio. As substâncias constritoras derivadas do endotélio são diversas e incluem os aniões superóxido ou os metabolitos do ácido araquidónico sintetizados através da via da cicloxigenase, como o TXA2 e a PGH2 (Katusic e Shepherd, 1991). Para este efeito vasoconstritor a superfície das células endoteliais contém também a enzima conversora da angiotensina, que catalisa a formação do composto vasoconstritor angiotensina II a partir do seu percursor inactivo angiotensina I. Esta mesma enzima também tem a capacidade de inactivar a bradicinina, um potente vasodilatador. Além disso, as células endoteliais possuem sistemas de transporte específicos para a serotonina e para a adenosina para o seu interior, onde são depois metabolizadas pela monoaminoxidase e pela desaminase da adenosina endoteliais respectivamente (Vane, Änggard e Botting, 1990). Mas a actividade vasoconstritora mais potente é devida à endotelina-1. As substâncias vasodilatadoras derivadas do endotélio mais relevantes são a PGI2 e o NO (Vane, Änggard e Botting, 1990). A síntese de uma determinada substância derivada do endotélio pode estar dependente de diversos factores que podem actuar independentemente mas em simultâneo. Assim, o endotélio modula o tónus vascular ao participar na formação de substâncias vasoconstritoras e vasodilatadoras. Em condições normais, os factores relaxantes, em especial o NO são libertados de forma predominante pelas células endoteliais. Um desequilíbrio no balanço entre vasopressores e vasodepressores tem sido identificado em vária doenças cardiovasculares, incluindo a hipertensão arterial, a aterosclerose e a diabetes (Lüscher e Vanhoutte, 1990; Shepherd e Vanhoutte, 1991). 35 Capítulo I ___________________________________________________________________________ Por tudo isto, a disfunção endotelial parece desempenhar um dos principais papéis na alteração da resposta vascular (Kaul e col., 1993). Quadro 2 - Factores derivados do endotélio. Factor Papel NO (EDRF) Inibição plaquetar PGI2 Vasodilatação Inibição plaquetar Hormonas/Autocóides Noradrenalina (receptores 2) Serotonina Bradicinina Histamina Estimulação da libertação de NO Coagulação / Trombose Trombina ADP ATP Estimulação da libertação de NO Factores de Crescimento TGF-B PDGF Heparina Sulfatos de heparina Inibição do crescimento Pró-coagulantes Coagulação Endotelina Promoção da vasoconstrição Agente de proliferação (actua através de mediadores) Substâncias derivadas da cicloxigenase Tromboxano A2 Prostaglandina H2 Aniões superóxido Promoção de vasoconstrição Adaptado de Lüscher, 1995. 36 Inibição da proliferação Estimulação da proliferação de células do músculo liso Promoção de vasoconstrição Introdução geral ___________________________________________________________________________ Regulação do tónus vascular dependente do endotélio Fig.1. Substâncias vasoactivas derivadas do endotélio. O endotélio é uma fonte de factores relaxantes (lado direito) e de factores constrictores (lado esquerdo): AA- ácido araquidónico; AI- angiotensina I; AIIangiotensina II; ECA- enzima de conversão da angiotensina; Ach- acetilcolina; ADP- adenosina difosfato; bET“grande”- endotelina-1; Bk- bradicinina; AMPc- monofosfato de adenosina cíclico; GMPc- monofosfato de guanosina cíclico; EDHF- factor hiperpolarizante derivado do endotélio; ECE- enzima conversora da endotelina; ET-1- endotelina-1; NO- monóxido de azoto; 5-HT- serotonina; L-arg - L-arginina; NOS- sintase do monóxido de azoto; PGH2- prostaglandina H2; PGI2- prostaciclina; TGFβ1- factor β1 transformador do crescimento; Thr- trombina; TXA2- tromboxano A2. Os círculos representam os receptores. (Adaptado de Vanhoutte, 1997). 37 Capítulo I ___________________________________________________________________________ 1. Factores constritores As contracções dependentes do endotélio podem ser explicadas quer pela supressão da libertação de factores de relaxamento dependentes do endotélio quer pela produção de substâncias vasoconstritoras difusíveis. Os factores vasoconstritores derivados do endotélio incluem: um peptídeo, a endotelina; os prostanóides vasoconstritores como o TXA2 e a prostaglandina H2, os derivados do sistema renina-angiotensina e os aniões superóxido. 1.1. Endotelina As endotelinas têm efeitos biológicos potentes a nível vascular, regulando por exemplo a vasoconstrição, a vasodilatação, a potenciação de outros agentes vasoconstritores e a mitogénese. Existem 3 isoformas de endotelina com diferente estrutura e actividade farmacológica: a endotelina-1 (ET-1), a endotelina-2 (ET-2) e a endotelina-3 (ET-3). A ET-1 é a única isoforma sintetizada pelas células endoteliais, sendo um potente vasoconstritor tanto in vivo como in vitro. É um peptídeo linear com 21 aminoácidos e com 2 pontes de cisteína que na sua estrutura tridimensional apresenta uma forma espiral cónica. A ET-1 resulta da proteólise de um percursor de 203 aminoácidos, a pré-proendotelina-1, por endopeptidases específicas, com formação de um resíduo intermédio de 39 aminoácidos chamado proendotelina-1, a qual é provavelmente segregada pelas células endoteliais e posteriormente convertida em endotelina (Shimada, Takahashi e Tanzawa, 1994; Xu e col., 1994). A conversão da proendotelina-1 em ET-1 é mediada por uma das duas isoformas da enzima conversora da endotelina (ECE1 e ECE2). A regulação da secreção de ET-1 pelas células endoteliais processa-se a nível da síntese do peptídeo (transcrição, translação e processamento). A célula endotelial não contém grânulos secretórios densos para o armazenamento e libertação da ET-1 em resposta a estímulos (Sakurai e Goto, 1993). Nas células endoteliais, como na maior parte das células, as endotelinas são sintetizadas por uma via constitutiva, podendo essa síntese ser aumentada por estímulos de 38 Introdução geral ___________________________________________________________________________ natureza físico-química ou por agonistas que operam através de receptores. São exemplos as hormonas (a angiotensina II e a arginina-vasopressina), os factores de coagulação (a trombina), as citocinas (a IL-1) e os factores de crescimento (o factor transformador de crescimento -TGF-), assim como a bradicinina, a endotoxina e o TNF. A hipóxia é também um importante estímulo para a produção de endotelina (Simonson, 1994). Os níveis circulantes da endotelina-1 são de um modo geral extremamente baixos, sendo possível que em condições fisiológicas a estimulação basal da produção de endotelina seja reduzida e/ou existam potentes mecanismos inibitórios que evitem a sua produção excessiva ou tal facto também pode ser devido a que este péptideo seja libertado preferencialmente em direcção às células do músculo vascular liso (Lüscher, 1994). Já foram delineados três mecanismos inibitórios reguladores da produção de ET-1: 1) inibição dependente do GMPc (Boulanger e Lüscher, 1990); 2) inibição dependente do AMPc (Yokokawa e col., 1991); e 3) um factor inibidor produzido pelas células musculares lisas vasculares (Stewart e col., 1990). Quando libertada, a ET-1 actua em receptores selectivos presentes no músculo liso e também no próprio endotélio. Já foram identificados e clonados dois subtipos de receptores da endotelina, o ETA e o ETB, os quais pertencem à superfamília dos receptores de sete hélices, acoplados a proteínas G, embora pareça existir outros subtipos de receptores (Masaki, Vane e Vanhoutte, 1994). As células endoteliais expressam receptores ETB ligados à formação de NO e de PGI2. Assim, a ET-1 pode libertar NO e de PGI2 a partir das células endoteliais que, como mecanismo de feedback negativo, reduzem a produção de ET no endotélio e a sua acção vasoconstritora no músculo liso. No músculo liso, os receptores ETA e em parte os ETB medeiam a constrição e a proliferação (Warner, 1993). A ET-1 em baixas concentrações causa vasodilatação e em concentrações elevadas causa uma constrição marcada e sustentada (Kiowski e col., 1991; Yanagisawa e col., 1988). A acção mais marcante da ET-1 é a sua actividade hipertensora prolongada e parece ser mais um factor de regulação local do que sistémico (Vane, Änggard e Botting, 1990). O mecanismo pelo qual as endotelinas intervêm nos fenómenos de vasoconstrição parece envolver a ligação da ET-1 ao receptor ETA presente nas células musculares lisas vasculares, com a subsequente activação da via celular dos fosfatos de inositol resultando no aumento da 39 Capítulo I ___________________________________________________________________________ concentração de cálcio intracelular e activação da proteína cinase C (Simonson e Dunn, 1990). A ET-1 é vista como um mediador de eventos patológicos, ao contrário do NO e da PGI2 cuja produção é de um modo geral essencial para a manutenção de um estado de “saúde” do sistema cardiovascular (Battistini, D’Orleans-Juste e Sirois, 1993). Ao contrário do NO e da PGI2, a ET-1 parece não exercer efeitos directos nas plaquetas circulantes, se bem que possa afectar a actividade das plaquetas de um forma indirecta ao estimular a libertação de NO e de PGI2 a partir do endotélio vascular (Thiemermann e col., 1990) e ao aumentar a libertação do activador plasminogénico de tecidos (Filep e col., 1991). 1.2. Factores constritores derivados da cicloxigenase A acetilcolina e a histamina induzem uma contracção dependente do endotélio através da produção dependente da cicloxigenase de TXA2 e de endoperóxidos PGH2, respectivamente, os quais activam as células musculares lisas vasculares. O TXA2 e a PGH2 activam o receptor do tromboxano nas células musculares lisas e nas plaquetas e assim apresentam uma acção contrária à do NO e da PGI2. A via da cicloxigenase também produz aniões superóxido, os quais ao inactivar o NO aumentam a contractilidade, mas que apresentam também efeitos directos no músculo liso (Lüscher e col., 1993; Rubanyi, 1993). A libertação de factores constritores dependentes do endotélio provenientes da via da cicloxigenase parece ser mais importante nas veias do que nas artérias. 1.3. Sistema renina-angiotensina Hoje está bem estabelecido que o sistema renina-angiotensina desempenha um importante papel na fisiologia cardiovascular, na homeostase dos fluidos e no funcionamento celular. 40 Introdução geral ___________________________________________________________________________ A renina é uma enzima proteolítica que é sintetizada, armazenada e secretada essencialmente pelo rim (nas células justaglomerulares, localizadas nas paredes das arteríolas aferentes quando entram no glomérulo). As consequências fisiológicas da libertação da renina resultam de uma série de reacções enzimáticas que levam à formação de uma hormona polipeptídica activa. A renina cinde o percursor proteico angiotensinogénio, uma globulina 2 sintetizada pelo fígado para produzir o decapeptídeo angiotensina I. A enzima de conversão, uma dipeptidilcarboxilpeptidase, remove já depois o carboxilo terminal His-Leu da Angiotensina I para produzir o octapeptídeo Angiotensina II. A ANG II é a principal hormona efectora do sistema renina-angiotensina que por acção sobre os receptores AII da ANG II se apresenta como uma substância vasoconstritora potente, um acelerador da síntese proteica (hipertrofia) nos tecidos vasculares, um acelerador da síntese e da libertação de aldosterona [e através desta, da recaptação renal de Na + (retenção de Na+) e água ] e estimula a síntese e libertação de catecolaminas a partir dos terminais nervosos simpáticos. De acordo com os dados in vitro e in vivo, a ANG II é produzida localmente na parede vascular (Admiraal e col., 1990). A ANG liga-se a dois tipos de receptores, o AT1 e o AT2. O AT1 é encontrado no músculo liso vascular e potencialmente medeia a vasoconstrição, a proliferação, a fibrose, a angiogénese e apresenta efeitos pró-oxidantes; o AT2 apresenta efeitos opostos. A ANG II activa o metabolismo celular nas células musculares lisas através de 3 diferentes vias, a via de síntese do IP3 e DG através da cisão de PI-P2, activação dos canais de Ca2+dependentes da voltagem e reduzindo a síntese de GMPc através da inibição da adenilciclase (Gardner e col., 1992). Estas acções da ANG II são praticamente as mesmas do que as observadas com os outros agentes vasoconstritores. A ANG II tem uma semi-vida curta (10-12 s) sendo rapidamente destruída nos leitos capilares periféricos pelas angiotensinases e o passo limitante da sua formação local é a libertação de renina que está sujeita a um feedback de controlo directamente pela ANG II e indirectamente através do efeito da angiotensina no volume sanguíneo, na pressão sanguínea e no balanço do sódio. A ANG II, ao induzir vasoconstrição e proliferação das células musculares lisas vasculares, desempenha um importante papel nos mecanismos patológicos da hipertensão e consequente evolução fisiopatológica. 41 Capítulo I ___________________________________________________________________________ Além disso, a ANG II ao ligar-se aos receptores da superfície das células endoteliais activa o ARNm para a endotelina e assim induz a libertação de endotelina a partir do endotélio vascular. Assim, a ANG II também pode ser considerada como um factor constritor dependente do endotélio. Uma vez que, a ECA é idêntica à cininase II, a qual cinde a bradicinina (degradação hidrolítica em metabolitos inactivos), um nonapeptídeo endógeno circulante que causa relaxamento dependente do endotélio através da estimulação dos receptores B2 para a bradicinina, sendo um potente estimulante da libertação endotelial de NO, a ECA tecidular pode diminuir os níveis locais de NO e reduzir o efeito vasodilatador da bradicinina no músculo liso vascular (Lüscher, 1993; Rubanyi, 1993). 1.4. Sistema adrenérgico O sistema adrenérgico é o protótipo de um sistema neuro-hormonal. O principal neurotransmissor deste sistema é a noradrenalina (NA), a qual é libertada a partir dos axónios terminais dos neurónios simpáticos pós-ganglionares e depositada directamente nas células alvo enervadas. A medula adrenal também liberta alguma NA e pode mesmo, em certas situações patológicas ser a principal fonte de NA plasmática. Contudo, a NA plasmática parece derivar essencialmente dos nervos simpáticos, uma vez que a excreção urinária desta catecolamina não sofre alteração após adrenalectomia (Sigurdsson, 1995). A NA é libertada por exocitose, a partir das vesículas das terminações nervosas simpáticas e estimula os receptores - e -, sobretudo os , desencadeando vasoconstrição e um aumento da pressão sanguínea (Guyton, 1993). A adrenalina (AD) é uma hormona, segregada pela medula adrenal para a circulação sanguínea e transportada até aos vários orgãos alvo. A AD é um potente estimulante dos receptores - e -, e tal como a NA, é um vasoconstritor, embora em alguns casos a AD possa causar alguma vasodilatação (Guyton, 1993), consoante a dose e tipo de receptores adrenérgicos presentes nos diferentes territórios vasculares. A dopamina (DA), o percursor da NA, é um neurotransmissor em muitas partes do cérebro, podendo também desempenhar essa função em certos neurónios periféricos, produzindo geralmente vasodilatação (Rang e Dale, 1993). 42 Introdução geral ___________________________________________________________________________ 2. Factores relaxantes O relaxamento dependente do endotélio ocorre tanto in vitro como in vivo (Furchgott e Zawadzki, 1980; Linder e col., 1990; Yang e col., 1991). Estas respostas podem ser causadas por factores dependentes do endotélio, hormonas, substâncias derivadas das plaquetas e pelo sistema da coagulação (Lüscher e Vanhoutte, 1990). Além disso, também o estímulo físico, como o “shear stress” (exercido pelo sangue circulante) desencadeia uma vasodilatação dependente do endotélio (Rubanyi, Romero e Vanhoutte, 1986). Fig.2. Libertação de factores relaxantes derivados do endotélio. A activação do receptor endotelial (R) induz um influxo de Ca 2+ para o citoplasma das células endoteliais. Quando os agonistas activam as células endoteliais, um aumento no IP 3 pode contribuir para o aumento do Ca2+ citoplasmático através da libertação deste a partir do retículo sarcoplasmático (SR). Após a interacção com a calmodulina, o Ca2+ activa a NOS e leva à libertação de factor hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF); o aumento do Ca2+ também acelera a formação de PGI2 a partir do ácido araquidónico (AA) pela cicloxigenase. O NO causa relaxamento através da activação da formação de GMPc a partir de GTP; a PGI2 causa relaxamento através da activação da formação de AMPc a partir do ATP; o EDHF causa hiperpolarização e relaxamento através da abertura dos canais de K+. Qualquer aumento do Ca2+ citosólico (incluindo o induzido pelo ionófero A23187), desencadeia a libertação de factores de relaxamento derivados do endotélio. (Adaptado de Vanhoutte, 1997). 43 Capítulo I ___________________________________________________________________________ 2.1. Factor hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) O EDHF é uma substância ainda não identificada que hiperpolariza as células musculares lisas vasculares e causa relaxamento (Nagao e Vanhoutte, 1993; Shimokawa e Takeshita, 1995). Os estudos electrofisiológicos em diversas artérias, incluindo a artéria coronária humana, demonstram que a acetilcolina e outros vasodilatadores dependentes do endotélio desencadeiam hiperpolarizações e relaxamentos dependentes do endotélio, os quais são devidos a um factor hiperpolarizante endotelial difusível (EDHF) distinto do NO e da PGI2 (Féletou e Vanhoutte, 1988; Vanhoutte, 1996). De facto, a observação de que nas artérias coronárias de porco, o relaxamento dependente do endotélio induzido pela bradicinina apenas era inibido de forma parcial pelos inibidores da formação de NO ou da cicloxigenase sugere que uma substância relaxante derivada do endotélio, distinta do NO e da PGI2 fosse formada ao mesmo tempo (Richards, Poston e Hilton, 1990). A identidade química do EDHF não é conhecida e podem mesmo existir variados EDHFs. Em certos vasos sanguíneos, os ácidos epieicosanóides (EET) formados a partir do ácido araquidónico por acção da citocromo P450 podem corresponder ao EDHF (Campbell e col., 1996; Vanhoutte, 1996). A hiperpolarização das células do músculo liso vascular induzida pelo EDHF é mediada por um aumento do efluxo dos iões K+. O tipo de canal de K+ implicado não foi ainda completamente definido, mas provavelmente serão os de K+ dependentes do Ca2+ e não os dependentes do ATP (Cohen e Vanhoutte, 1995; Vanhoutte, 1996). A libertação de EDHF, tal como o que acontece para o NO, requer que ocorra um aumento do Ca2+ intracelular nas células endoteliais. A sua acção é independente do GMPc e causa o fecho dos canais dependentes do Ca2+. A contribuição da hiperpolarização no relaxamento vascular dependente do endotélio varia consoante o tamanho das artérias, sendo mais importante nos vasos de resistência do que nas artérias de condução e deve desempenhar um papel importante no controlo endotelial da resistência vascular periférica e da pressão sanguínea (Campbel e col., 1996). Nos grandes vasos, tanto o NO como o EDHF podem contribuir para o relaxamento dependente do 44 Introdução geral ___________________________________________________________________________ endotélio, mas em condições normais o papel do NO é predominante. Nestas artérias, se a síntese de NO se encontrar inibida, o EDHF poderá ser o responsável pelo facto do relaxamento dependente do endotélio se encontrar praticamente normal (Kilpatrick e Cocks, 1994; Vanhoutte, 1996). Em certas patologias, como a aterosclerose na qual a produção ou a actividade do NO estão reduzidas, a contribuição do EDHF pode ser importante na regulação do tónus vascular. Ao contrário do NO, o qual é produzido de forma contínua pela NOSc, o EDHF provavelmente não apresenta uma libertação basal. A sua libertação pode ser desencadeada não só pela acetilcolina, mas também pela bradicinina, pelos nucleótidos da adenina, pela histamina, pela trombina e pela substância P. Os efeitos do NO e do EDHF são aditivos, mas não sinérgicos (Nagao e Vanhoutte, 1993). 2.2. Prostaciclina A prostaciclina (PGI2) é um prostanóide e foi descoberta em 1976 (Moncada e col., 1976), sendo o principal membro da família das prostaglandinas produzido pelas células endoteliais. A formação de PGI2 é iniciada pela enzima fosfolipase A2 que liberta ácido araquidónico a partir dos fosfolipídeos da membrana. Assim, a PGI2 é um metabolito do ácido araquidónico (AA), formada a partir da prostaglandina PGH2 (o mesmo percursor do TXA2 ) através da acção PGI2 sintetase. A conversão do AA em prostaglandinas endoperóxidos H2 é mediada pelas sintases da PGH ou cicloxigenase. A isomerização ou redução, específica do tipo celular, da PGH2 a prostanóides biologicamente activos é mediada por isomerases ou redutases. Este passo apresenta duas actividades distintas, a actividade endoperóxido que oxigena e cicliza o ácido gordo percursor não esterificado a formar o endoperóxido cíclico PGG2 e a actividade peroxidase que converte a PGG2 em PGH2 mediante uma redução de dois electrões. Foram identificadas duas isoenzimas da PGH sintase designadas por sintase da PGH (PGHs ou COX), a COX-1 e a COX-2. Estas duas isoenzimas são idênticas em 60% dos resíduos de aminoácidos, apresentando a mesma afinidade e capacidade de conversão do AA em PGH2. As diferenças mais importantes entre as duas isoenzimas são a nível da regulação 45 Capítulo I ___________________________________________________________________________ e da expressão (DeWitt, Meade e Smith, 1993). A COX-1 é expressa de forma constitutiva e está presente em grande parte das células, embora o nível de expressão seja variável entre as diferentes células. São encontrados elevados níveis de COX-1 nas células endoteliais e nas plaquetas. Os seus níveis são constantes, embora estes possam ser aumentados através da estimulação hormonal ou por factores de crescimento. A COX-2 em condições fisiológicas é quase indetectável em muitos tecidos, mas é rapidamente induzida em resposta a variados mediadores pró-inflamatórios, endotoxinas, factores de crescimento, IL-1b, TNFa. A indução da transcrição da COX-2 é rápida, transitória e selectivamente inibida pelos glucocorticóides. A COX-1 não é induzida pelos mediadores inflamatórios, nem a sua expressão é alterada pelos glucocorticóides (Kujubu e col., 1993). Existem dados que apoiam o conceito de que a produção de prostaglandinas pela enzima constitutiva contribui para os efeitos benéficos e fisiológicos atribuídos às prostaglandinas (citoprotecção no estômago e rim, homeostase vascular) enquanto que a produção de prostaglandinas pela enzima indutível contribui para os efeitos pró-inflamatórios e/ou mitogénicos (Isakson e col., 1995). A PGI2 é sintetizada (figura 3) e libertada pelas células endoteliais em consequência de uma grande variedade de alterações mecânicas e químicas sofridas pela membrana celular, não sendo armazenada nas células, tal como as outras prostaglandinas (Piper e Vane, 1989). Assim, a pressão pulsátil, variados mediadores endógenos e alguns fármacos estimulam a formação de PGI2. Alguns dos estímulos químicos endógenos englobam substâncias derivadas do plasma, como a bradicinina e a trombina e as libertadas a partir das plaquetas activadas como a serotonina, o factor de crescimento derivado das plaquetas, a IL-1 e os nucleótidos de adenina (Forsberg e col., 1987). Os prostanóides não são armazenados no interior das células pois após a sua síntese intracelular, são libertados por difusão facilitada, actuando na própria célula de origem e/ou nas células vizinhas por interacção com os respectivos receptores, os quais estão ligados a proteínas G específicas, estimulando ou inibindo alterações a nível dos segundos mensageiros. A curtíssima semi-vida e os baixos níveis plasmáticos sugerem que a PGI2 é uma hormona local que actua após a libertação abluminal e luminal a partir do endotélio, sobre a média dos vasos quando passa para as células do sanguíneas (Blair e col., 1982). 46 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Após a sua libertação na circulação sanguínea, a PGI2 é rapidamente hidrolizada, por via não enzimática, em 6-ceto-prostaglandina F1 (6-ceto-PGF1).Esta substância é metabolizada enzimaticamente dando origem a dois metabolitos: 2,3-dinor-6-cetoprostaglandina F1 e 2,3-dinor-6,15-diceto-prostaglandina F1. Ambas as substâncias, assim como a 6-ceto-PGF1 são quimicamente estáveis e são os principais metabolitos da PGI2 excretados na urina (Vane, Änggard e Botting, 1990). As principais acções farmacológicas da PGI2 incluem a inibição da activação plaquetar, a vasodilatação e efeitos citoprotectores (Moncada e col., 1976; Tateson, Moncada e Vane, 1977). A PGI2 também deprime a proliferação vascular e para tal inibe a libertação de mitogénios a partir das plaquetas, das células endoteliais e dos macrófagos (Willis e col., 1986). Assim, como é notado para outras respostas, o NO e a PGI2 podem actuar conjuntamente para suprimir a proliferação do músculo liso, por exemplo nas placas ateroscleróticas. A PGI2 é o mais potente inibidor endógeno da agregação plaquetar, sendo por isso um importante regulador da função das plaquetas. O facto de ser menos forte na inibição da adesão das plaquetas, sugere que a PGI2 permite às plaquetas aderirem ao tecido vascular e interagir com este, embora ao mesmo tempo previna e limite a formação de trombos (Moncada, 1982). De modo contrário, o NO é um fraco inibidor da agregação das plaquetas, o que sugere que os dois possuem papéis complementares na regulação da reactividade plaquetar. De facto, parece que o NO não é um importante inibidor da agregação dentro do lúmen do vaso, já que ele se liga avidamente à hemoglobina e não se pode difundir numa forma activa para longe da superfície endotelial (Moncada, Palmer e Higgs, 1991). Nas plaquetas, o NO e a PGI2 actuam através de vias de sinalização diferentes para produzir efeitos semelhantes. Baixas doses de NO e de PGI2 somados conjuntamente produzem um efeito anti-agregante mais elevado do que poderia ser esperado de uma associação puramente aditiva (Radomski, Palmer e Moncada, 1987a). No músculo liso vascular e nas plaquetas, a PGI2 actua através da ligação a receptores específicos da membrana, os quais estão ligados a proteínas G ligadoras de guanina nucleótido que estimulam a adenilciclase. Tal ligação leva à conversão do ATP em AMPc e ao aumento dos níveis intracelulares de AMPc e à subsequente fosforilação dependente do AMPc de proteínas específicas, como a rap 1B e a fosfoproteína estimulada pela proteína 47 Capítulo I ___________________________________________________________________________ vasodilatadora 50-Kd (VASP) nas plaquetas (Siess, Winegar e Lapetina, 1990; Nolte e col., 1991). Esta acção desencadeia vasodilatação no músculo liso e ao nível das plaquetas a inibição de todos os passos e consequências da activação plaquetar, tais como a mudança de forma, agregação, reacções de libertação e adesão, independentemente do tipo de estímulo da activação plaquetar (Schillinger e Losert, 1980). Parece que a sua libertação basal não é importante no controlo fisiológico do tónus vascular, já que a pressão sanguínea parece ser pouco afectada pela aspirina ou por outros fármacos anti-inflamatórios não esteróides, os quais inibem a actividade da cicloxigenase e assim reduzem a produção de PGI2. Pelo contrário, a produção basal de NO parece ser da maior importância no controlo da função local do músculo liso vascular, já que a inibição da formação de NO pela aplicação de inibidores da NOS como a NG-monometil-L-arginina causa um imediato aumento na pressão sanguínea e vasoconstrições locais (Gardiner e col., 1990). A COX-1 e a COX-2, ao conterem um centro heme-Fe no seu local activo, são alvos possíveis da activação pelo NO. 48 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Fig. 3. Metabolismo do ácido araquidónico nas células endoteliais. (Adaptado de Vane, Änggard e Botting, 1990). 49 Capítulo I ___________________________________________________________________________ 2.3. Monóxido de azoto (NO) O NO (NO) é uma molécula pequena (Peso molecular 30Da), com uma estrutura simples de apenas dois átomos, um de nitrogénio e outro de oxigénio, que formam ligações covalentes com grande facilidade, sem carga, mas que apresenta um electrão não emparelhado, apresentando propriedades paramagnéticas. O NO é um radical na forma gasosa. É relativamente instável, apresentando nos sistemas biológicos uma semi-vida inferior a 30 segundos. O NO é menos reactivo do que vários radicais livres já que não é capaz de reagir com ele próprio. O NO é uma importante molécula mensageira e está envolvido em diversas funções fisiológicas como a neurotransmissão, a regulação do tónus vascular, a integridade da parede vascular, a reactividade plaquetar e a citotoxicidade mediada pelo sistema imunitário, sendo o activador endógeno da forma solúvel da guanilciclase. O NO é também considerado como “componente incómodo” da chuva ácida e do buraco do ozono. 2.3.1.Perspectiva histórica O conhecimento exacto acerca dos mecanismos moleculares envolvidos na constrição e no relaxamento vascular só foi possível depois da identificação do EDRF (endothelium derived relaxing factor), cujas propriedades químicas, bioquímicas e farmacológicas são idênticas às do NO. A descoberta do NO como mediador biológico nas células dos mamíferos ficou a dever-se aos trabalhos de Furchgott e Zawadzki (1980) ao demonstrarem que só se verificava uma resposta vascular relaxante ao agente muscarínico, acetilcolina, quando o endotélio estava presente e que aquela não era mediada pelas prostaglandinas. Mais tarde, verificou-se que esse comportamento se devia à formação de NO pelas células endoteliais. A natureza química do EDRF só foi descrita em 1987. Inicialmente pensou-se que o EDRF correspondia a um produto da lipoxigenação do ácido araquidónico (Singer e Peach, 1983), ou a um produto da oxigenação deste ácido gordo catalisado por uma enzima dependente do citocromo P450 (Pinto, Abraham e Mullane,1986), ou a um aldeído, a uma cetona ou a uma 50 Introdução geral ___________________________________________________________________________ lactona instável (Griffith e col., 1984). A identificação do NO com o EDRF foi baseada na verificação da semelhança de efeitos entre os nitratos vasodilatadores e aquele factor relaxante: tanto o NO como os nitratos orgânicos activam a guanilciclase solúvel (Kukovetz e col., 1979; Schultz, Schultz e Schultz, 1977) com o consequente aumento do GMPc intracelular, enquanto a oxihemoglobina e o azul de metileno inibem o relaxamento vascular e o aumento do GMPc induzidos por aquelas substâncias (Rapoport e Murad, 1983). Assim, com base na semelhança dos efeitos farmacológicos do EDRF e do NO, Furchgott (1988) e Ignarro e col. (1987), de forma independente, sugeriram que o EDRF podia ser o NO. Palmer, Ferrige e Moncada (1987), usando um método químico de identificação do NO, baseado na formação de um produto quimiluminescente resultante da reacção com o ozono e um método de doseamento biológico na aorta do coelho, mostraram que o NO explicava a actividade biológica do EDRF e que a L-arginina era o seu percursor (Palmer, Ashton e Moncada, 1988). Embora muitos estudos sugiram que o NO é o principal produto libertado por diversas células por acção da sintase do NO, nenhum demonstrou até agora que a sua produção é independente de outros óxidos de azoto os quais são igualmente mais reactivos que os nitritos. A contribuição destes óxidos de azoto reactivos na actividade do EDRF ainda aguarda um esclarecimento. Assim, a utilização do termo NO é simplista, porque, provavelmente, as células que contêm NOS libertam para o meio extracelular uma mistura de NO, NO2, N2O3, NO2-, NO3-, nitrosaminas, nitrosotiois não-proteicos e proteína Snitrosiladas. A descoberta da participação da função endotelial na dilatação arterial, a caracterização do NO como molécula responsável por este fenómeno e a identificação de enzimas com capacidade para produzir NO levaram à atribuição, em 1998, do prémio Nobel a R. Furchgott, F. Murad e Louis Ignarro. 2.3.2.Biosíntese de NO A formação biológica de NO deve-se a uma via metabólica relativamente simples, a qual se encontra esquematizada na figura 4. A reacção envolve 5 electrões, a L-arginina, o 51 Capítulo I ___________________________________________________________________________ oxigénio e o NADPH como co-substratos, o FAD, o FMN, o heme, a BH4 reduzida e a calmodulina como co-factores ou grupos prostéticos e o NO e a L-citrulina como co-produtos (Knowles e Moncada, 1994; Nathan, 1992). O átomo de N do NO deriva do nitrogénio guanidina da L-arginina e o átomo de O deriva do O2 molecular. Os electrões requeridos para conduzir este processo derivam do NADPH. Embora não sejam ainda conhecidos os mecanismos moleculares da reacção química, a biossíntese parece ocorrer em duas reacções sucessivas de oxidação: a fase 1, envolve a hidroxilação do átomo de N do grupo guanidina da L-arginina (molécula percursora), formando-se L-NG-hidroxiarginina (ArgOH). Na segunda fase, o ArgOH é oxidado a NO e L-citrulina. Fig.4. Síntese de NO a partir da L-arginina. A L-citrulina é reciclada em L-arginina. (Adaptado de Änggard, 1994). Normalmente, os níveis tecidulares de L-arginina são suficientes para a secreção contínua de NO, mas a L-citrulina pode ser reciclada em L-arginina pela incorporação de um átomo de N. Existe uma via metabólica que permite reciclar a L-arginina a partir da L- citrulina por incorporação de um grupo NH2 (Hecker e col., 1990). Este ciclo da ureia 52 Introdução geral ___________________________________________________________________________ modificado apresenta duas funções: por um lado, constitui um papel de regeneração da Larginina a partir do processo de síntese do NO e, por outro lado, é uma forma de eliminação do excesso de nitrogénio formado pelo metabolismo celular (Ängard, 1994). A reacção é catalisada enzimaticamente por uma das isoformas da sintase do NO (NOS), uma dioxigenase dependente do NADPH (Nathan, 1992). 2.3.3. Isoformas da sintase do NO A sintase do NO é uma enzima que contém o grupo heme e apresenta uma sequência semelhante à citocromo P450 redutase. Desde que a sua existência foi originalmente descrita em 1989, em mamíferos, têm sido identificadas várias isoformas da sintase do NO (Lowenstein, Dinerman e Snyder, 1994; Nathan, 1992). Foram purificadas, clonadas e sequenciadas três enzimas envolvidas na síntese de NO, distribuídas por duas classes de sintases do NO: a chamada forma constitutiva da enzima (NOSc) que está presente em condições fisiológicas, no endotélio e no tecido neuronial, e a indutível (NOSi) que é funcionalmente independente do Ca2+, localizada nos macrófagos activados, nas células musculares lisas e endoteliais. Pelo menos duas das enzimas constitutivas já clonadas exibem propriedades muito semelhantes: a enzima endotelial (NOSe) e a enzima neuronial (NOSn), localizada em alguns neurónios centrais e nos neurónios periféricos não-adrenérgicos e não-colinérgicos (NANC). A distribuição de cada uma das isoformas pelos tecidos é diferente mas parece que o mesmo tipo de célula pode expressar mais do que um tipo de NOS (Nathan, 1992). De facto, a NOSi pode estar presente de forma constitutiva em certos tecidos como no epitélio brônquico humano e além disso, a NOSn tem sido localizada em variados tipos de células não neuroniais e já foi demonstrada a NOSe em alguns neurónios. Estudos recentes evidenciaram que as enzimas expressas de forma constitutiva também podem ser induzidas em certas condições (Knowles e Moncada, 1994), como durante o exercício crónico ou durante a gravidez, na qual tanto a NOSe como a NOSi podem ser induzidas (Weiner e col., 1994). A isoforma constitutiva produz pequenas quantidades de NO que participam na transmissão neuronial e activam a guanilciclase solúvel do músculo liso vascular e das 53 Capítulo I ___________________________________________________________________________ plaquetas, provocando vasodilatação e com uma acção antiagregante plaquetar. Por outro lado, a isoforma indutível é induzida em algumas células por estímulos imunológicos ou inflamatórios, como a IL-1, o IF- ou o TNF ou por compostos produzidos por microorganismos e produz quantidades elevadas e um fluxo contínuo de NO até o substrato se esgotar, as quais podem ser citotóxicas para as células tumorais, microorganismos como as bactérias e fungos e para as próprias células endoteliais (Palmer, Ferrige e Moncada, 1987). Além disso, esta isoforma tem sido responsabilizada na patogénese do choque séptico, de doenças imunológicas e inflamatórias. A forma indutível está essencialmente presente nas células que participam nos processos imunitários, nomeadamente nos processos inflamatórios, mas a distribuição não se limita apenas a estes tecidos. A nível da regulação existem diferenças significativas. Ambas as isoformas NOSc são activadas a nível pós-transcricional pela calmodulina por estímulos que levam a um aumento do cálcio intracelular. Este liga-se à calmodulina, resultando a formação de um complexo que se liga à enzima. Pelo contrário, a NOSi é regulada a nível da transcrição apresentando uma ligação permanente à calmodulina o que permite que a enzima permaneça num estado activado e seja insensível à concentração de cálcio intracelular (Cho, Xie e Calaycay, 1992). No Quadro 3 são apresentadas, em resumo, as características comuns e as diferenças entre as duas classes de sintases do NO. 54 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Quadro 3 Características comuns Substrato Co-factores L-arginina NADPH,FAD,FMN,BH4 protoporfirina IX NO, L-citrulina Citosólica Grupo heme Co-produtos Localização Diferenças NOSc permanente reduzida e intermitente liberta picomoles (pmol) de NO acetilcolina,glutamato trombina,ADP,ATP PAF,bradicinina NMDA,leucotrieno pressão sanguínea, ionóforos de Ca2+ NOSe NOSn exercício trauma físico neuronial Expressão Produção Activação Indução “shear stress” lisofosfatidilcolina (Lyso PC) Dependência do Ca Função Alvos moleculares 2+ Localização cromossómica no humano sim regulação proteínas heme tióis guanilciclase solúvel NOSe NOSn 7 12 NOSi requer indução elevada e sustentada liberta nanomoles (nmol) de NO como agente único: INF, INF, LPS, TNF, IL-1 em combinações sinérgicas: INF+TNF INF+TNF INF+LPS INF+IL-1 IL-1+LPS INF+LPS INF+LPS LDL oxidadas não defesa tióis proteínas Fe-S 17 NMDA- N-metil-D-aspartato, INF- interferon. (Adaptado de Änggard, 1994). 55 Capítulo I ___________________________________________________________________________ 2.3.4.Transporte e moléculas alvo do NO O NO é marcadamente lipofílico, o que lhe permite atravessar as membranas por um processo de difusão simples não utilizando transportadores de membrana específicos. As características químicas da molécula de NO não permitem que este possa exercer acções em locais distantes da sua formação, já que é rapidamente consumido e inactivado quer em circulação quer no espaço intracelular. Assim, a maioria das acções do NO são observadas a nível local. É o caso do NO formado a nível das células endoteliais que se difunde fácil e rapidamente para as células musculares lisas subjacentes, activando a guanilciclase por ligação ao grupo heme daquela enzima. No espaço extracelular, o NO é inactivado ao reagir com o oxigénio e com os aniões superóxido. Mas, tem-se observado que o NO pode circular no plasma dos mamíferos através da formação de aductos com a albumina, formando S-nitroso-albumina (Keaney e col.,1993; Stamler e col., 1992). De facto, em condições fisiológicas, os óxidos de azoto reagem facilmente com os grupos tiol das proteínas, formando S-nitroso-compostos estáveis e biologicamente activos. Os tióis parecem ter, em certa medida, a função de armazenar o NO, prolongando a sua acção (Änggard, 1994). Imediatamente após a sua síntese, o NO exerce efeitos biológicos na célula em que foi formado ou nas células subjacentes. A este conceito de formação e utilização imediata tem sido sugerida a possibilidade de armazenamento do NO. Esta hipótese é fundamentalmente aplicável ao NO formado por via indutível, ou seja, em situação em que o NO se encontra em excesso. O NO pode reagir com o ferro ferroso a nível intracelular formando com as proteínas complexos dinitrosil-ferro ferroso, que o protegem da inactivação. Mas ainda não foi demonstrado se os complexos dinitrosil-ferro podem libertar NO (Busse e col., 1993). O NO também pode nitrosar moléculas que contenham o grupo sulfidrilo, como o glutatião, a cisteína e a albumina. A cinética da associação e dissociação destas moléculas, retendo ou libertando o NO, torna-as potenciais depósitos ou transportadores de NO que prolongam a sua acção (Änggard, 1994). 56 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Os alvos conhecidos do NO são diversos e incluem tanto substâncias de baixo peso molecular como macromoléculas, nomeadamente a guanilciclase solúvel (GCs), a hemoglobina (Hb), a mioglobina e os aniões superóxido (Fig. 5). GC-s Regulação dos mecanismos de transdução O2 - Alteração na actividade biológica do NO Dano oxidativo Hb Decréscimo na actividade biológica do NO Monóxido de Azoto Enzimas Modulação da função ADN Citostase/citólise Mutação? Tióis Modulação das proteínas que contêm tiol Função de transporte do NO Fig. 5. As interacções do NO com biomoléculas. (Adaptado de Radomski e Salas, 1995). O NO interage com variadas enzimas. Tal resulta numa inibição selectiva da 12lipoxigenase das plaquetas e numa diminuição da conversão do ácido araquidónico nos seus derivados 12-hidroperoxi/hidroxi bioactivos (Nakatsuka e Osawa, 1994). A capacidade do NO para interagir com os complexos I (NADH:oxiredutase da ubiquinona) e II (oxiredutase do succinato-ubiquinona) envolvidas no transporte de electrões na respiração mitocondrial, e com a cis-aconitase no ciclo do ácido cítrico, tem sido relacionado com as sua propriedades citostáticas/citotóxicas direccionadas não apenas contra os microorganismos mas também para as células e tecidos do hospedeiro (Hibbs e col., 1990). Está demonstrado que o NO derivado dos macrófagos inibe a síntese de ADN. Tal pode dever-se à inibição da indução 57 Capítulo I ___________________________________________________________________________ pelo NO da redutase do ribonucleótido, a enzima limitadora da biossíntese de ADN (Lepoivre e col., 1991). Tem-se verificado que o NO exógeno e alguns compostos geradores de NO quando aplicados em elevadas concentrações podem causar mutagenicidade por desaminação do ADN (Wink e col., 1991). Contudo, tal facto ainda não foi demonstrado com o NO endógeno. As reacções de S-nitrosilação dos tióis levam á formação de S-nitrosiltióis. A Snitrosilação de alguns tióis como a albumina e a glutamina pode prolongar a vida biológica do NO (Stamler e col., 1992), mas a S-nitrosilação de tióis associada com os canais iónicos e com os receptores pode modificar as funções destas estruturas. GMPc. O principal sistema efector da acção do NO O grupo heme da forma solúvel da guanilciclase é claramente um dos mais sensíveis e importante local de acção do NO, baseado no bem estabelecido papel do GMPc em variadas respostas mediadas pelo NO. Antes da descoberta do NO como um produto do metabolismo, já se sabia que os agentes libertadores de NO estimulavam a guanilciclase através de um mecanismo que requeria heme (Craven e DeRubertis, 1978). O NO exerce muitos dos seus efeitos através da acumulação intracelular do GMPc o qual, por sua vez, actua em variadas proteínas alvo intracelulares (Ignarro, 1991; Murad e Ishii, 1990). Tanto a acção inibidora do NO sobre a adesão das plaquetas ao colagénio e às células endoteliais como a agregação plaquetar são mediadas por um mecanismo dependente do GMPc (Moncada, Palmer e Higgs, 1991). A inibição da mitogénese e da proliferação do músculo liso vascular pelo NO também é realizada através do aumento de GMPc (Garg e Hassid, 1989). 58 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Em várias células, a acumulação de GMPc é despoletada por hormonas e neurotransmissores que aumentam a concentração de cálcio livre intracelular (Waldman e Murad, 1987). O GMPc medeia a resposta intracelular destes sinais extracelulares e contribui para a regulação de variados processos biológicos, como o relaxamento do músculo liso, a inibição plaquetar e talvez também regule a libertação de neurotransmissores cerebrais. Os alvos moleculares do GMPc incluem as proteínas cinases estimuladas pelo GMPc que fosforilam substratos específicos, os canais iónicos regulados pelo GMPc e as fosfodiesterases (Butt e col., 1993; Schimidt, Lohmann e Walter, 1993; Walter, 1989). A formação de GMPc a partir de magnésio guanosina 5’-trifosfato (Mg2+-GTP) é catalisada por uma família de guanilciclases, as quais existem em duas grandes formas: uma ligada à membrana e a guanilciclase solúvel. Ambas as formas têm sido purificadas, clonadas, sequenciadas e expressas como enzimas funcionalmente intactas. A guanilciclase solúvel (GCs) representa o receptor para o NO e existe predominantemente nas fracções citoplasmáticas (Koesling, Böhme e Schultz, 1991). O NO liga-se ao complexo heme da GCs, talvez deformando o anel porfirínico, e a deformação resultante da estrutura terciária da enzima resulta no aumento de 400 vezes a actividade da enzima e assim na formação do segundo mensageiro intracelular, o GMPc. As isoformas da GCs são proteínas heterodiméricas constituídas por duas subunidades diferentes, e , com peso molecular de aproximadamente 70 e 73 kDa, respectivamente. Até à data foram identificadas quatro subunidades (1, 2, 1 e 2) (Koesling, Böhme e Schultz, 1991 ). Todas as subunidades da GCs possuem um domínio catalítico ciclase C-terminal comum, o qual está também presente na GC ligada à membrana e nas adenilciclases. A GCs contém dois domínios catalíticos diferentes. O NO activa a guanilciclase solúvel por nitrosação do seu heme ligando-se ao Fe2+, aumentando os níveis intracelulares do GMPc nas células do músculo liso ( Angus e Cock, 1989; Furchgott, 1984). Este aumento do GMPc medeia a acção relaxante do NO pela redução dos níveis do Ca2+intracelular nestas células (Schini, Malta e Miller, 1987). Têm sido propostos variados mecanismos para explicar o relaxamento desencadeado pelo GMPc: 59 Capítulo I ___________________________________________________________________________ 1. Interferência com os sistemas de influxo/extrusão do Ca2+ ao nível da membrana celular: a) por activação da ATPase dependente de Ca2+ (Fiscus, 1988): por fosforilação de proteínas do citoesqueleto, as quais promovem a mobilização da enzima a partir de fontes intracelulares; por fosforilação do fosfatidil inositol (PI) da membrana em fosfato de fosfatidil inositol (PIP). b) por fosforilação e consequente inibição dos canais de cálcio dependentes de receptor (ROC) ou da voltagem (VOC) (Godfraind, 1986); c) por fosforilação e consequente estimulação de canais de potássio dependentes do Ca2+, resultando uma hiperpolarização da célula com inibição do influxo de Ca2+(Komori e Suzuki, 1987). 2. Interferência com os sistemas de influxo/extrusão do Ca2+ ao nível do retículo sarcoplasmático: a) inibição da fosfolipase C (PLC) com redução da formação de trifosfato de inositol (IP3) e consequente diminuição da libertação de Ca2+a partir do retículo sarcoplasmático (Rapoport e Murad, 1986); b) fosforilação do receptor do IP3 com diminuição da afinidade para aquele segundo mensageiro; c) por activação da ATPase dependente de Ca2+através da fosforilação da proteína fosfolamban. 3. Aumento da desfosforilação das cadeias leves de miosina (Rapoport, Draznin e Murad, 1983). Ainda não está esclarecido quando é que o relaxamento é apenas desencadeado pelo aumento do GMPc ou por outras acções do EDRF que possam contribuir para a vasodilatação. Como nem todas as acções do NO são mediadas pelo GMPc, também no relaxamento vascular podem estar envolvidas outras proteínas alvo. As concentrações elevadas de GMPc activam a proteína cinase dependente do GMPc e a fosforilação de variadas proteínas alvo. Entre as proteínas fosforiladas em resposta ao GMPc (Walter, 1989), a melhor caracterizada é a fosfoproteína estimulada pelo vasodilatador 60 Introdução geral ___________________________________________________________________________ (VASP), de 46/50 kDa. A associação da VASP com o citoesqueleto plaquetar deve ser importante para o efeito inibitório no receptor do fibrinogénio (Horstrup e col., 1994). A fosforilação proteica induzida pelo GMPc também deve estar envolvida na captação de serotonina pelas plaquetas (Launay e col., 1994). O GMPc diminui as concentrações basais e estimuladas do cálcio intracelular (Johansson e Hayness, 1992). Em certas condições o GMPc ao inibir a fosfodiesterase do AMPc inibida pelo GMPc pode impedir a hidrólise do AMPc e aumentar os efeitos biológicos deste último nucleótido (Maurice e Haslam, 1990). O metabolismo dos fosfolípidos da membrana também pode ser modificado pelo GMPc. De facto, tem sido referenciado que o GMPc inibe a actividade quer da fosfolipase C, quer da fosfolipase A2 nas plaquetas (Sane e col., 1989). Por fim, o GMPc inibe a função de alguns receptores plaquetares, incluindo o receptor IIb/IIIa do fibrinogénio e a P-selectina (Salas e col., 1994). As acções biológicas do GMPc são terminadas pela fosfodiesterase do GMPc assim como pelo seu efluxo das células (Walter, 1989; Wu e col., 1993). Como já foi referido, o NO é o mais potente e efectivo activador da GCs. Mas além do NO, a GCs também é regulada por uma família de factores activadores da guanilciclase (GAF), formados por via enzimática, os quais incluem o CO e o OH (Schmidt e col., 1991). O CO é formado a partir de dois percursores, os ácidos gordos ou o heme. A formação de OH pode ser enzimática ou não enzimática. O mecanismo pelo qual o CO activa a GCs é provavelmente idêntico ao do NO (Brune e Ullrich, 1987). Além do mais, o CO e o NO têm efeitos similares na agregação plaquetar (Brune e Ullrich, 1987), na função do músculo liso vascular (McFaul e McGrath, 1987) e nos níveis intracelulares de GMPc (Firgaira, Cotton e Danks, 1981). O mecanismo de activação da GCs pelo OH ainda não está esclarecido, mas parece ser diferente do do NO e do CO. O OH deve interagir com os grupos tióis reguladores da GCs (Wu e col., 1992), os quais funcionam como um sistema sensor redox celular e como proteína efectora. O CO e o OH de forma semelhante ao NO, dependendo das suas concentrações podem apresentar funções sinalizadoras ou podem ser altamente citotóxicos. 61 Capítulo I ___________________________________________________________________________ GMPc Canais ligados ao GMPc Fosfodiesterases (III) do AMPc inibidas pelo GMPc Fosfodiesterases do AMPc estimuladas pelo GMPc da resposta do AMPc Fluxo iónico da resposta do AMPc AMPc Cinases proteicas dependentes do GMPc Fosforilação proteica Cinases proteicas dependentes de AMPc Fosforilação proteica Fig. 6. Acções subsequentes à síntese de GMPc. (Adaptado de Schmidt, Lohmann e Walter, 1993). 62 Introdução geral ___________________________________________________________________________ 2.3.5. Funções do NO endógeno Os estudos efectuados têm demonstrado a natureza ubiquitária do NO, apresentando este efeitos importantes em muitos sistemas como o cardiovascular, o gastrintestinal, o respiratório, o geniturinário, o imunológico e também a nível do sistema nervoso central e periférico. Variadas situações patológicas estão associadas quer a um déficit de NO, como a hipertensão arterial e a impotência sexual masculina, quer a um excesso de NO como o choque séptico, desordens neurodegenerativas e a inflamação. a) Sistema imunitário e inflamatório Os efeitos citotóxicos e/ou citostáticos do NO são importantes na defesa do hospedeiro contra numerosos agentes patogénicos incluindo bactérias (Mayer, Brunner e Schmidt, 1993), fungos (Alspaugh e Granger, 1991), virus (Croen, 1993) e parasitas metazoários, como sobre células do próprio organismo, nomeadamente as células tumorais (Hibbs e col., 1988). As células do sistema imunitário, incluindo os macrófagos, os monócitos e as células de Kupffer apresentam a capacidade de produzir NO em quantidades muito superiores à formada pelo endotélio ou pelos neurónios, o que sugere um papel daquele mediador na regulação da imunidade e da inflamação. O NO formado por este tipo de células tem origem na actividade da sintase do NO indutível. A produção de NO pela NOSi ocorre em grandes quantidades e durante um longo período de tempo e está muitas vezes associada a consequências patológicas como a sepsis, a diabetes e a cirrose hepática(Moncada, Palmer e Higgs, 1991; Nathan, 1992). As acções citostáticas/citotóxicas do NO parecem resultar das suas acções inibitórias em enzimas chave da cadeia respiratória e na síntese de ácido desoxiribonucleico nas células alvo (Hibbs e col. 1990; Nguyen e col., 1992). O NO também pode interagir com radicais derivados do oxigénio o que leva à formação de outras substâncias tóxicas (Hibbs, 1992) como o peroxinitrito (Beckman e col., 1990). 63 Capítulo I ___________________________________________________________________________ Este é um poderoso oxidante, contudo parecem existir mecanismos muito efectivos para a sua remoção e inactivação (Moro e col., 1994). b) Sistema nervoso central e periférico O NO é sintetizado nos neurónios do SNC, onde actua como neuromediador com variadas funções fisiológicas, incluindo a formação da memória, a coordenação entre a actividade neuronal e o fluxo sanguíneo e a modulação da dor (Garthwait, 1991; Snyder e Bredt, 1992). No SNP, sabe-se agora que o NO é o mediador libertado por uma vasta rede nervosa, conhecida como não-adrenérgica e não-colinérgica (NANC). O NO, actuando como neurotransmissor e/ou neuromodulador, medeia algumas formas de vasodilatação neurogénica e regula várias funções gastrintestinais, respiratórias e geniturinárias (Gillespie, Liu e Martin, 1990; Rand, 1992; Toda, 1995). Parecem ser os neurónios NANC os responsáveis pela mediação do relaxamento muscular a nível gastrintestinal cujo neurotransmissor está descrito como sendo o NO (Stark e Szurszewski, 1992). A formação do NO a partir dos neurónios NANC parece ser a responsável pela dilatação gástrica adaptativa e pelo peristaltismo (Desai, Sessa e Vane, 1991). Também tem sido descrita a neurotransmissão dependente do NO nos esfíncteres esofágico, ileocólico e anal (Ängard, 1994). A nível pulmonar o NO é libertado pelos nervos nitrérgicos exercendo uma actividade broncodilatadora (Belvisi e col., 1992). O NO parece estar relacionado com a modulação de canais de potássio que intervêm na regulação da transmissão neuronial (Katayama, 1995). 64 Introdução geral ___________________________________________________________________________ c) Sistema cardiovascular. O papel do NO na homeostase vascular Fig. 7. Processos de transdução de sinal que ocorrem numa célula endotelial normal. A activação da célula endotelial leva à libertação do factor de relaxamento derivado do endotélio EDRF-NO, o qual apresenta importantes acções protectoras na parede vascular. 5-HT1D -receptor da serotonina; α2 –adrenoreceptor α2; ETB receptor da endotelina; B2 -receptor da bradicinina; P2Y -receptor purinérgico; G -proteína G; LDL-lipoproteína de baixa densidade. (Adaptado de Vanhoutte, 1997). 1. Acções vasculares do NO A história do NO na biologia vascular começa na segunda metade do Século XIX com o uso dos nitratos orgânicos no tratamento da angina. O NO é considerado como o nitrovasodilatador endógeno. A identificação em 1987 do NO como mediador responsável pelas acções do EDRF levou a uma explosão na quantidade de trabalhos de investigação tentando definir o papel daquele mediador na homeostase cardiovascular. 65 Capítulo I ___________________________________________________________________________ O sistema cardiovascular está num constante estado de vasodilatação activa dependente da formação de NO. A manutenção do tónus vascular normal resulta, para além da intervenção do sistema nervoso simpático, da interacção dos mediadores vasodilatadores (NO e a PGI2) e vasoconstritores (endotelina-1) derivados do endotélio. Em condições fisiológicas basais, este balanço resulta a favor da vasodilatação (Furchgott e Vanhoutte, 1989). O NO libertado pelas células endoteliais e pelos nervos nitrérgicos é o sistema vasodilatador endógeno mais importante que contrabalança a vasoconstrição produzida pelo sistema nervoso simpático e pelo sistema renina-angiotensina. O NO e a prostaciclina parecem actuar sinergicamente, embora utilizando diferentes segundos mensageiros: a prostaciclina actua através do AMPc e o NO através do GMPc. Mas, embora a prostaciclina apresente um tempo de semi-vida mais longo do que o NO, este parece ser o principal mediador determinante do tónus vascular basal (Rodeberg e col., 1995). O NO é libertado continuamente pela circulação arterial, parecendo ser o mediador mais importante na regulação do tónus vascular basal. A nível endotelial a enzima responsável pela formação do NO é a sintase do NO constitutiva endotelial. Esta enzima controla dois tipos de libertação do NO: a libertação basal e a libertação estimulada. Durante a libertação basal contínua, a síntese endotelial de NO pode ser aumentada pela estimulação de receptores (por exemplo, acetilcolina, ATP, ou a bradicinina) ou independentemente de receptores (por exemplo, ionóforos de Ca2+, policatiões ou inibidores da ATPase dependente de Ca2+). Os estímulos físicos como o shear stress do fluido ou o estiramento pulsátil da parede do vaso também estimulam a libertação de níveis de NO acima do valor basal e podem representar o mecanismo mais importante de libertação do NO no endotélio vascular. Busse e col. (1993) consideram que a libertação de NO induzida pelo shear stress do fluido parece ser o factor mais importante de regulação do tónus vascular, enquanto que a libertação de NO mediada por agonistas funciona como um mecanismo de reserva para aumentar as concentrações de NO aquando das necessidades transitórias e locais como, por exemplo, durante a formação de microtrombos. O aumento da síntese do NO nas células endoteliais induzido por agonistas ou independentemente de receptores tem como pré-requisito o aumento da concentração de Ca2+livre intracelular ([Ca2+]i). A elevação de [Ca2+]i é mediada 66 Introdução geral ___________________________________________________________________________ por um aumento transitório de IP3 que promove a libertação de Ca2+do retículo sarcoplasmático e por um influxo transmembranar sustentado de Ca2+ a partir do espaço extracelular. Enquanto o papel do IP3 (resultante da hidrólise do fosfoinositol da membrana por activação da fosfolipase C pelos agonistas como a vasopressina, a angiotensina II e a endotelina) na libertação de Ca2+ está bem documentada nas células endoteliais, a regulação do influxo de Ca2+ transmembranar ainda é mal compreendida (Busse e col., 1993). O mecanismo através do qual o NO relaxa os vasos sanguíneos consiste na interacção deste com o centro heme da guanilciclase solúvel resultando na formação de GMPc (Ignarro e col., 1981; Katsuki e col., 1977). A acumulação de GMPc resulta na activação da proteína cinase dependente do GMPc, na diminuição da fosforilação das cadeias leves de miosina e no relaxamento (Fiscus, Rapoport e Murad, 1984). Esta acção do GMPc é desencadeada através da diminuição do Ca2+ livre intracelular (Cornwell e Lincoln, 1988; Johnson e Lincoln, 1985). Através de estudos realizados com análogos da L-arginina inibidores da sintase do NO, foi demonstrado que a resposta vasodilatadora ao NO ocorre predominantemente no sistema arterial, sugerindo que as artérias apresentam uma produção basal superior de NO e que estão assim mais dependentes do mediador para a regulação do tónus vascular do que as veias. Mas, embora as veias apresentem uma produção inferior de NO do que as artérias, estas possuem níveis de GMPc mais elevados como mecanismo compensatório (Rodeberg e col., 1995). Estes dados poderão explicar a observação clínica de que as veias são mais susceptíveis à acção vasodilatadora dos fármacos nitrovasodilatadores, os quais estimulam directamente a guanilciclase do músculo liso. O desenvolvimento do fenómeno característico de tolerância aos nitrovasodilatadores administrados exogenamente parece dever-se a um decréscimo no metabolismo do NO ou a uma dessensibilização da guanilciclase ao NO (Ignarro e col., 1981). O contributo do NO diminui à medida que o tamanho dos vasos se torna menor tanto em condições basais como durante a estimulação (Shimokawa e Takeshita, 1995). O NO também intervém na regulação da permeabilidade das células endoteliais (Kubes e Granger, 1992). 67 Capítulo I ___________________________________________________________________________ O NO inibe a síntese de ADN, a mitogénese e a proliferação das células musculares lisas subjacentes (Nakaki e col., 1990), tal acção pode ser devida quer à capacidade do NO em diminuir a libertação de factores mitogénicos a partir das plaquetas (Barrett, Willis e Vane, 1989), quer através de um evento directo mediado pelo GMPc dentro do músculo liso vascular (Garg e Hassid, 1989). O NO inibe a formação de endotelina (Boulanger e Lüscher, 1990). O NO pode também influenciar a produção e/ou a libertação de outros mediadores associados à regulação do tónus vascular, como por exemplo, a produção endógena de NO no rim inibe a libertação de renina. Os níveis de produção basal de NO parecem ser responsáveis pela regulação do débito sanguíneo no cérebro (Faraci e Brian, 1994), no coração (Chu e col., 1990), nos pulmões (Fineman, Heymann e Soifer, 1991), no tracto gastrintestinal (Iwata e col., 1992) e no rim (Deng e Baylis, 1993; Yukimura e col., 1992). As alterações na formação de NO podem contribuir para estados de doença vascular ou serem consequência de processos patológicos a nível vascular. De facto, uma diminuição da síntese de NO endotelial apresenta consequências importantes: por um lado, leva a uma diminuição do relaxamento vascular, podendo contribuir para o desenvolvimento de hipertensão arterial, por outro lado, como consequência da perda de capacidade em prevenir a agregação plaquetar e a proliferação das células musculares lisas, pode ocorrer o desenvolvimento de lesões e disfunção vascular progressiva como a que se observa em situações patológicas como a aterosclerose ou a diabetes melitus. Mas, a formação de quantidades excessivas de NO também pode ser prejudicial como se verifica na hipotensão associada ao choque séptico. 2. Acções do NO na homeostase e na função das plaquetas O NO formado pelas células endoteliais não apresenta apenas um papel como vasodilatador. Ao formar-se no endotélio das células do leito vascular, pode interagir directamente com as plaquetas. Assim, o NO também previne a agregação e a adesão plaquetar (Ignarro, 1990; Moncada, Palmer e Higgs,1991), acção essa, desencadeada 68 Introdução geral ___________________________________________________________________________ através da estimulação da guanilciclase solúvel plaquetar (Mellion, Ignarro e Ohlstein, 1981; Nishikawa e col., 1982; Salvemini e col., 1990). A inibição da agregação plaquetar dependente do endotélio é controlada através de dois mecanismos diferentes: através da prostaciclina com o consequente aumento do AMPc e do NO com o aumento do GMPc. Estes dois mediadores actuam de forma sinérgica embora pareça que o NO desempenhe um papel preponderante, já que a adesão das plaquetas ao endotélio ou ao colagénio pode ser completamente bloqueada pelo NO, enquanto que a prostaciclina apenas inibe parcialmente este fenómeno. Fig. 8. Efeitos do NO na função das plaquetas. PDE-III-fosfodiesterase; VASP-fosfoproteína estimulada por vasodilatador. (Adaptado de Body, 1996). 69 Capítulo I ___________________________________________________________________________ O mecanismo molecular subjacente às propriedades do NO que determinam a prevenção da adesão e agregação plaquetar não está ainda esclarecido, mas as hipóteses propostas são a activação das enzimas adenilciclase e guanilciclase plaquetares pelo NO (Radomski, Palmer e Moncada, 1987a), a inibição da fosfolipase C plaquetária (Durane e col., 1992) ou a promoção da ligação da ADP-ribose à enzima plaquetar desidrogenase do 3-fosfato-gliceraldeído (Brune, Molina y Vedia e Lapetina, 1990). Um dos mecanismos através do qual o NO endotelial pode regular a função das plaquetas já foi elucidado por Murohara e col. (1995). A P-selectina encontra-se normalmente presente nos corpos de Weibel-Palade existente nas células endoteliais e também nos grânulos das plaquetas. Quando estas são activadas, os grânulos fundem com a membrana plasmática e a P-selectina é rapidamente translocada para a superfície extracelular. Os inibidores da NOS, como o L-NAME, induzem a expressão de P-selectina na superfície das células endoteliais na circulação mesentérica do rato in vivo. Este dado sugere que o NO regula a adesão das plaquetas ao endotélio ao diminuir a expressão da Pselectina requerida para a “ligação” inicial das plaquetas ao endotélio. A inibição da libertação de NO (resultante de doenças como a hipertensão ou a aterosclerose ou após bloqueio com inibidores da NOS) a partir das células endoteliais promove a adesão e agregação plaquetar (Radomski, Palmer e Moncada, 1987a; Sneddon e Vane, 1988); contudo, quando as plaquetas agregam, elas libertam, entre outros mediadores, a 5-HT e o ADP, substâncias que podem causar constrição vascular por actuação directa na camada de células de músculo liso. No entanto, em condições normais de saúde das artérias humanas, as plaquetas agregadas causam dilatação porque a 5-HT e o ADP actuam em receptores presentes nas células endoteliais, os receptores 5-HTiD e P2y, respectivamente, que estão em ligação com o sistema de NOS (Vanhoutte, 1991). Mas, em condições normais, as plaquetas não aderem à superfície do endotélio e, se ocorrer a formação de agregados plaquetares, a libertação de NO abre de imediato o vaso sanguíneo e liberta o microagregado. Assim, os estudos em humanos já demonstraram que o NO inibe: 1) a agregação plaquetar (Lieberman, O’Neill e Mendelsohn, 1991; Radomski, Palmer e Moncada, 1987a); 2) a ligação do fibrinogénio às plaquetas (Mendelsohn e col., 1990); 3) a adesão das plaquetas ao endotélio lesado (Radomski, Palmer e Moncada, 1987b; Sneddon e Vane, 1988) 70 Introdução geral ___________________________________________________________________________ e 4) a secreção dos grânulos densos plaquetares (Broekman, Eiroa e Marcus, 1991; Lieberman, O’Neill e Mendelsohn, 1991). Contudo, ainda não são conhecidos os efeitos do NO: 1) na P-selectina da superfície das plaquetas ( que reflecte a secreção dos grânulos ) (McEver, 1990); 2) no CD63 (que reflecte a secreção lisossomial) (Nieuwenhuis e col., 1987); 3) no complexo glicoproteíco GPIb-IX (receptor para o factor vW envolvido na adesão das plaquetas ao endotélio lesado) (Ruggeri, 1991) e 4) no complexo GPIIb-IIIa (receptor para o fibrinogénio, necessário para a agregação das plaquetas) (Phillips e col., 1988). Apenas se sabe que o GMPc regula de forma negativa a exposição à superfície das plaquetas da P-selectina, do CD63 e o complexo GPIIb-IIIa, mas não a exposição à superfície do complexo GPIb-IX (Michelson e col., 1996). De forma semelhante às células endoteliais, as plaquetas conseguem produzir NO (Radomski, Palmer e Moncada, 1990a). A NOS das plaquetas fica activada durante a adesão das plaquetas ao colagénio (Polanowska-Grabowska e Gear, 1994), a agregação induzida pelo colagénio, o ADP e o ácido araquidónico (Malinski e col., 1993; Radomski, Palmer e Moncada, 1990a; Radomski, Palmer e Moncada, 1990b; Zhou, Hellermann e Solomonson, 1995). O mecanismo desta activação não é claro; contudo, o NO gerado durante estas reacções actua como contraregulador da extensão da activação das plaquetas. Assim, uma acção concertada da NOS das plaquetas e da NOS endotelial regula a activação das plaquetas, causando inibição da adesão e da agregação e indução da desagregação. 71 Capítulo I ___________________________________________________________________________ Fig. 9. Interacção entre os produtos das plaquetas, a trombina e o endotélio. Se o endotélio se encontrar intacto, variadas substâncias libertadas a partir das plaquetas (em particular o ADP, o ATP e a 5-HT) causam a libertação de EDRF e de PGI 2. Aplica-se o mesmo mecanismo quando a trombina é formada. O EDRF libertado irá relaxar o músculo liso subjacente, “abrindo” o vaso sanguíneo e dispersando assim os microagregados formados; o EDRF também é libertado para o lúmen do vaso para prevenir a adesão das plaquetas ao endotélio e de forma sinérgica com a PGI2, inibirá a agregação plaquetar. Além disso, a MAO (monoaminoxidase) e outras enzimas irão degradar a 5-HT, limitando a quantidade de monoamina que se poderá difundir para o músculo liso. Por fim, o endotélio actua como uma barreira física que previne o acesso ao músculo liso dos produtos vasoconstrictores plaquetares, como a 5-HT e o TxA2. Estas diferentes funções do endotélio desempenham um papel chave na prevenção da coagulação não “desejável” e de episódios vasospásticos nos vasos sanguíneos que apresentem uma íntima normal. Se as células endoteliais forem destruídas (por ex. por traumatismo), o papel protector do endotélio é localmente “perdido”, as plaquetas podem aderir e agregar-se, seguindo-se um fenómeno vasoconstrictor, que contribui para a fase vascular da homeostase. (+) → activação; (-) → inibição. (Adaptado de Vanhoutte, 1997). 3. Acções do NO nos leucócitos O NO afecta as interacções entre os leucócitos polimorfonucleares (PMN) e as células endoteliais. Já foi demonstrado que a inibição da formação de NO resulta num profundo aumento na adesão dos PMN às vénulas pós-capilares. Assim, o NO também deve estar implicado na regulação da adesão dos leucócitos às células endoteliais. Esta acção do NO pode ser desencadeada pela estimulação da GCs ou pela interferência com a capacidade da molécula de adesão dos leucócitos CD11/CD18 para formar uma ligação com a superfície celular endotelial ou ainda pela supressão da expressão de CD11/CD18 nos leucócitos (Kubes, Suzuki e Granger, 1991). 72 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Ainda não está claro quando é que as acções reguladoras do NO na adesão dos PMN às células endoteliais são directas ou são mediadas via modulação da reactividade de intermediários como os mastócitos. O NO ao regular a adesão dos PMN contribui também para a manutenção da integridade da barreira microvascular e pode actuar na diminuição da inflamação, da permeabilidade vascular e na formação de edema (Gaboury e Kubes, 1995). 73 Capítulo I ___________________________________________________________________________ 74 Introdução geral ___________________________________________________________________________ O PAPEL DAS PLAQUETAS NA FISIOPATOLOGIA DA HIPERTENSÃO 1. Introdução Desde o final dos anos 70, que as plaquetas têm merecido uma atenção crescente nos estudos relacionados com a hipertensão arterial. Tal deve-se a que, por um lado, as plaquetas são um elemento de fácil e rápido acesso, que se encontra “equipado” com receptores para variados tipos de substâncias e possui mecanismos de secreção e de recaptação, assim como elementos contrácteis semelhantes aos das células musculares lisas vasculares. Estas propriedades funcionais e bioquímicas, que se demonstrou estarem alteradas em tecidos específicos e diferentes de animais hipertensos, muitas vezes inacessíveis, em especial no homem, podem ser estudadas in vitro nas plaquetas obtidas a partir de uma simples amostra de sangue. Por outro lado, a função plaquetar é fundamental para manter a integridade anatómica da parede vascular e para garantir a funcionalidade de todo um conjunto de reacções químicas e de interacções celulares que asseguram a fisiologia dos vasos sanguíneos. Assim, as plaquetas podem estar directamente implicadas na génese da hiperreactividade vascular e/ou das alterações secundárias como a proliferação das células do músculo liso vascular, devido ao seu potencial de crescimento, à produção de prostaglandinas e de NO e às interacções plaquetas-endotélio-músculo liso vascular (Sixma, 1981). As plaquetas são mediadores das complicações trombóticas, vectores do tónus vascular e promotores da aterosclerose. 75 Capítulo I ___________________________________________________________________________ 2. Estrutura das plaquetas As plaquetas (figura 10) são produzidas pelos megacariócitos por invaginação da sua membrana plasmática (Pennington, 1981) e possuem aproximadamente 3 m de diâmetro. Em condições normais circulam no sangue durante cerca de 10 dias e apresentam uma forma discóide, achatada, não sendo aderentes entre elas ou ao endotélio. A membrana plasmática das plaquetas é trilamelar, semelhante à de outras células, coberta por uma capa amorfa (glicocálix) com 10 a 20 nm de espessura, sendo rica em glicoproteínas, as quais formam a base do sistema de receptores para a activação (Hourani e Cusak, 1991). A membrana plasmática invagina em determinados pontos de modo a formar uma rede de canais tortuosos no citoplasma plaquetar. Este sistema de canais (sistema tubular aberto) alarga significativamente a superfície membranar e serve como condutor para substâncias recém formadas no citoplasma e para a extrusão de substâncias secretadas pelos grânulos. A plaqueta possui um sistema tubular denso que é sugerido como sendo derivado do retículo endoplasmático, sendo um local de armazenamento do cálcio (Skaer, Peters e Emmines, 1974). As plaquetas contêm bandas circulares com uma estrutura semelhante a cilindros com a aparência dos microtúbulos encontrados nas outras células cuja principal função deve ser, provavelmente, a de manter a alta assimetria de forma das plaquetas em circulação (White, 1968). Além disso, possuem um sistema fibrilar contráctil que permite as alterações da forma, a formação de pseudópodes e a contracção. A matrix plaquetária é constituída por um sol/gel com conteúdo granular diversificado e estes grânulos contêm um grande número de compostos que tornam as plaquetas participantes activos em múltiplas reacções. Nas plaquetas foram identificados três tipos de grânulos: densos, e lisossomiais. Os grânulos densos contêm elevadas concentrações de aminas biogénicas (sobretudo serotonina), nucleótidos de adenosina (ATP e ADP) e cálcio. A libertação do conteúdo destes grânulos pode afectar o tónus vascular assim como a capacidade de outras plaquetas em formar trombos. Os grânulos contêm essencialmente proteínas que podem influenciar a função dos vasos sanguíneos e a cascata da coagulação como o factor plaquetar 4, o factor de crescimento derivado das plaquetas e a -tromboglobulina. Estes grânulos contêm fibrinogénio, que é importante para a agregação plaquetar. Os grânulos lisossomais só 76 Introdução geral ___________________________________________________________________________ libertam o seu conteúdo após as plaquetas serem estimuladas com agentes agregantes fortes como a trombina ou elevadas concentrações de colagénio. Além destes três tipos de grânulos, as plaquetas activadas podem libertar substâncias farmacologicamente activas, as quais são essencialmente sintetizadas e não armazenadas, como as prostaglandinas, o TXA2 e o PAF que afectam o tónus vascular e a permeabilidade e que activam outras plaquetas (Hourani e Cusak, 1991). As mitocôndrias são poucas e de estrutura simples. Existem também de forma abundante no citoplasma, grânulos de glicogénio. A energia provém essencialmente da glicólise (Holmsen, 1977). As plaquetas não têm núcleo ou ADN e estruturas próximas de ribossomas raramente são encontradas, no entanto existem pequenas quantidades de ARN, tendo já sido demonstrada a síntese de proteínas (Weiss, 1975). As plaquetas contém actina e miosina e podem ser consideradas como células contrácteis (Salganicoff e Sevy, 1985; Yamakado e col., 1983). Fig. 10. Representação esquemática da estrutura das plaquetas, onde se mostram os seus principais componentes morfológicos: G-grânulos; M–mitocôndrias; std– sistema tubular denso; SCO – sistema canicular aberto. Retirado de Morian et al. Blood Platelets, 1990. 77 Capítulo I ___________________________________________________________________________ 3. Funções As plaquetas sanguíneas têm manifestamente várias funções no nosso organismo, sendo sem dúvida as melhor conhecidas as relativas à sua participação na homeostase e trombose. De facto, as plaquetas desempenham um papel fundamental na homeostase, devido à formação do tampão plaquetar que impede a hemorragia nos vasos lesados. Contudo, elas também participam noutros processos sistémicos, como a reacção inflamatória aguda ou crónica e as reacções imunes ou imunoalérgicas. Assim, são elementos importantes em muitos processos fisiológicos e fisiopatológicos. Em condições normais a activação das plaquetas encontra-se suprimida, e estas não interagem com a superfície endotelial nem com as outras células sanguíneas. O endotélio e as próprias plaquetas libertam mediadores que atenuam a resposta homeostática (Figura 13). Existem três produtos endoteliais conhecidos que inibem a activação plaquetar: os metabolitos da cicloxigenase e da lipoxigenase, a PGI2e o ácido 13-hidroxioctadecadienóico (13-HODE), respectivamente; a ecto-nucleotidase ADP difosfohidrolase (ecto-ADPase) e o NO (Buchanan e Brister, 1991; Moncada, 1982; Radomski, Palmer e Moncada, 1987b). A PGI2 inibe a agregação plaquetar (Radomski, Palmer e Moncada, 1987b) enquanto que o 13HODE regula a adesividade da parede vascular, modulando a expressão do receptor da integrina (Buchanan e Brister, 1991). As ecto-nucleotidases metabolizam o ADP em AMP e adenosina, o que resulta no decréscimo do recrutamento das plaquetas e da actividade do agonista dinucleótido (Marcus e Safier, 1993). Em relação aos efeitos do NO, os quais se encontram resumidos no Quadro 4, os estudos em humanos já demonstraram que o NO inibe a agregação das plaquetas (Lieberman, O’Neill e Mendelsohn, 1991; Radomski, Palmer e Moncada, 1987a), a ligação do fibrinogénio às plaquetas (Mendelsohn e col., 1990), a adesão das plaquetas ao endotélio lesado (Radomski, Palmer e Moncada, 1987b; Sneddon e Vane, 1988) e a secreção dos grânulos densos das plaquetas (Broekman, Eiroa e Marcus, 1991; Lieberman, O’Neill e Mendelsohn, 1991). 78 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Quadro 4 Efeitos do NO na função das plaquetas __________________________________________ Inibição da alteração da forma mobilização do Ca2+ adesão libertação de PAI-1 agregação reversível + + + ++ ++ - agregação irreversível libertação de TXA2 __________________________________________ Adaptado de Body, 1996 Mas, quando as plaquetas são expostas a situações em que o vaso se encontra lesado, num sistema reologicamente activo, elas aderem às estruturas sub-endoteliais expostas e ficam activadas . O estímulo fundamental para a activação das plaquetas é a ligação de uma agonista (trombina, fibrina (ogéneo), colagénio, vWF, TXA2) ao receptor ligado à membrana das plaquetas. 79 Capítulo I ___________________________________________________________________________ Fig. 11. Contribuição das plaquetas para a homeostase. Os componentes da membrana importantes, numa plaqueta não estimulada incluem: (R) receptor para agonistas; complexo gpIa/IIa, receptor constitutivo para o colagénio; complexo membranar gpIb/IX, receptor constitutivo para o factor de von Willebrand da parede do vaso; receptor gpIIb/IIIa, receptor induzido induzido pelo agonista fibrinogénio e para o factor de von Willebrand. Os organelos citoplasmáticos importantes incluem os grânulos α, que contém muitas proteínas, incluindo o fibrinogénio, o factor de von Willebrand e a trombospondina e os grânulos densos, que contém pequenas moléculas, incluindo o ADP e Ca 2+. A adesão inicial à matrix subendotelial, como a que ocorre através da interacção do gpIa/IIa com o colagénio ou do gpIb/IX com o factor de von Willebrand não requerem uma activação prévia das plaquetas. A activação plaquetar pode ocorrer em resposta a estímulos de agonistas solúveis como o ADP ou a trombina, com os seus receptores de membrana (R) ou através do contacto das plaquetas com a matrix subendotelial. As principais respostas das plaquetas à activação são as apresentadas no desenho da plaqueta estimulada: a plaqueta transforma-se, de disco compacto numa esfera com longos pseudópodes, estendidos pela a matrix subendotelial. O TXA2 formado a partir do ácido araquidónico libertado dos fosfolípidos da membrana, difunde-se das plaquetas, liga-se a receptores da membrana e amplifica as reacções de activação das plaquetas. O gpIIb/IIIa transforma-se num receptor para o fibrinogénio (FG), fibronectina e para o factor de von Willebrand. Os grânulos α secretam fibrinogénio, o vWF e trombospondina (TSP), os quais medeiam e “reforçam” a adesão e a agregação plaquetar. Os grânulos densos secretam ADP e Ca2+, os quais “consolidam” a activação das plaquetas. Os fosfolípidos da membrana rearramjam-se e as vesículas da membrana largam-se, facilitando a formação de trombina e a formação de fibrina por “aceleração” da conversão do factor X da coagulação do plasma em Xa e de protrombina em trombina. (Adaptado de George e Shattil, 1991). 80 Introdução geral ___________________________________________________________________________ As respostas plaquetares podem ser divididas em duas categorias: 1) respostas reversíveis , as quais englobam a adesão, a alteração da forma e a agregação primária e 2) respostas irreversíveis como a resposta de libertação e a agregação secundária. Parece existir uma verdadeira “diferenciação” da resposta plaquetar, que depende em elevado grau da concentração local dos agonistas. Uma concentração fraca pode provocar libertação e secreção plaquetar com citotoxicidade para parasitas ou elementos celulares, enquanto que concentrações mais elevadas são responsáveis pela agregação plaquetar (Tran, 1992). Fig. 12. Metabolismo de activação e secreção plaquetária. Os fenómenos de adesão e agregação plaquetária possuem base estrutural e anatómica, identificada como a formação de ligações moleculares entre glicoproteínas da membrana plaquetária e moléculas de adesão celular. As plaquetas aderem ao subendotélio vascular, particularmente ao colagénio, fibronectina e laminina através da formação de ligações moleculares. Para estas, o factor von Willebrand assume particular importância, estabelecendo pontes entre o colagénio subendotelial e o complexo de glicoproteínas 81 Capítulo I ___________________________________________________________________________ plaquetárias Ib/IX/V. O factor vW tanto promove a adesão das plaquetas ao endotélio lesado, como a agregação das plaquetas entre si, ligando-se ao complexo de glicoproteínas IIb/IIIa (Janes e col., 1995). A agregação das plaquetas entre si produz-se através da formação de pontes entre os complexos de glicoproteínas membranares IIb/IIIa e as moléculas de fibrinogénio. Assim é que a membrana das plaquetas possui um complexo sistema de reconhecimento de estruturas adesivas que justifica esta sua função (Clemetson, 1995). Mas, este sistema não é exclusivo das plaquetas, já que a maioria destas moléculas são comuns a outros elementos celulares como os linfócitos, os granulócitos, os monócitos e os macrófagos, determinando portanto uma similitude de funções entre estas células. As mais importantes pertencem à família das integrinas, como o receptor do fibrinogénio, a integrina alfa IIb/beta3, que simultaneamente fixa também a fibronectina, o factor vW e a vibronectina (Shattil, 1995). A glicoproteína alfaV/beta3 também fixa, além de todas as anteriores, a trombospondina e as glicoproteínas alfa2/beta1, o colagénio, a alfaV/beta a fibronectina e a alfa6/beta1 a laminina. Após a sua adesão inicial, as plaquetas apresentam um metabolismo de activação muito complexo e importante. Através de complexos mecanismos bioquímicos, produz-se um aumento da concentração intracelular de cálcio que leva à activação enzimática necessária à degradação de fosfolípidos de membrana. O metabolismo subsequente é responsável pela activação progressiva das plaquetas, com a formação de potentes agonistas plaquetários, como os leucotrienos e as prostaglandinas. Da posterior degradação destas últimas forma-se o ácido araquidónico, talvez o mais potente agonista plaquetário. A activação metabólica plaquetária conduz subsequentemente à contracção das plaquetas, com exocitose granular, modificação da forma e activação irreversível (Cerlettie e col., 1995). As plaquetas também possuem a capacidade para se activarem mutuamente. De facto, as suas membranas possuem receptores para os produtos do seu próprio metabolismo, funcionando portanto a secreção plaquetária como uma actividade autócrina que permite a amplificação de todo o processo. As plaquetas libertam assim o seu conteúdo granular diversificado, apresentando também secreção parácrina que implica a activação de plaquetas adjacentes (Furie e Furie, 1995). 82 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Existem várias vias bioquímicas e fisiológicas possíveis de autoactivação das plaquetas, sendo as três vias mais estudadas: 1) libertação de ADP; 2) libertação de TXA2 formado por uma cascata dependente do ácido araquidónico e da actividade da cicloxigenase; 3) síntese do factor agregante das plaquetas (PAF). Cada uma destas vias gera compostos que actuam como mediadores intercelulares para propagar a rápida activação de todas as plaquetas. Pensa-se que o mecanismo de estimulação das vias endógenas ocorre através de um “disparo” intracelular comum, possivelmente o cálcio. Nas fases finais da homeostase, as plaquetas servem de superfície activadora para os complexos enzimáticos da coagulação plasmática, nos complexos designados por “tenase” (activação do factor X) e “protrombinase” (activação da protrombina). A activação plaquetar é mediada pela interacção sinérgica de vias dependentes e independentes do cálcio. No primeiro caso, o agonista estimulador das plaquetas leva à 2+ elevação do cálcio livre citosólico [Ca]i. No caso da via independente do Ca , o agonista estimulante leva à formação de 1,2-diacilglicerol (DAG), o activador endógeno da proteína cinase C (Rink, Sanchez e Hallam, 1983). O aumento do [Ca]i e da formação de DAG resulta de um processo comum de transdução pela activação do receptor : hidrólise dos fosfolípidos de inositóis em fosfatidilinositóis (PtdIns), PtdIns 4-fosfato (PtdIns 4P) ou mais provavelmente PtdIns 4,5-bifosfato (PtdIns 4,5P2) (Berridge, 1984). A hidrólise do PtdIns 4,5P2 catalisada pela fosfolipase C pode mobilizar o Ca2+ a partir dos locais de armazenamento intracelular (O’Rourke e col., 1985). 83 Capítulo I ___________________________________________________________________________ Fig. 13. Mecanismo de activação das plaquetas. IP3 → aumenta a libertação de Ca2+ a partir do sistema tubular denso das plaquetas; activação DAG → activa a proteína cinase C → fosforilação proteica → secreção de grânulos e expressão do receptor do fibrinogénio na membrana plaquetar. Fosfolipase A2 → quebra do ácido araquidónico a partir da membrana. No citosol este é metabolizado pela cicloxigenase e pela 12-lipooxigenase em PGH2 e depois em TxA2. DAGdiacilglicerol; G- proteína ligadora de nucleótido de guanina; PIP 2- fosfatidilinositol 4,5- bifosfato; IP3trifosfato de inositol; TxA2- tromboxano A2. (Adaptado de Body, 1996). 84 Introdução geral ___________________________________________________________________________ 4. A plaqueta como unidade de produção e libertação de NO As plaquetas não são apenas alvos do NO produzido nas células endoteliais (Radomski, Palmer e Moncada, 1987a), nos neutrófilos (Salvemini e col., 1989) ou nas células musculares lisas vasculares (Mollace e col., 1991), mas elas próprias também são capazes de libertar NO durante a agregação induzida pelo colagénio, pela adenosina difosfato e pelo ácido araquidónico (Lantoine e col., 1995; Malinski e col., 1993; Noris e col., 1993; Radomski, Palmer e Moncada, 1990a). De facto, as plaquetas humanas também possuem uma via da L-arginina:NO que regula a sua agregabilidade e assim, as próprias plaquetas de forma semelhante às células endoteliais produzem NO, se bem que em pequenas quantidades (Radomski, Palmer e Moncada, 1990a; Radomski, Palmer e Moncada, 1990b). Esta via parece modular as respostas de agregação plaquetar e pode ser responsável, em parte, pela limitação da auto-amplificação da formação de trombos plaquetares in vivo. Assim, a via da L-arginina:NO supõe-se actuar como um mecanismo de retrocontrolo negativo intraplaquetar que previne a activação e agregação excessiva. Radomski e colaboradores (Radomski, Palmer e Moncada, 1990a; Radomski, Palmer e Moncada, 1990b) foram os primeiros a descrever a existência da via da L-arginina:NO nas plaquetas humanas. Eles foram capazes de demonstrar a libertação de NO a partir do citosol das plaquetas (determinação espectofotométrica), a qual foi aumentada pela L-arginina e inibida por inibidores específicos da NOS. A agregação induzida pelo colagénio foi acompanhada por um aumento do GMPc intracelular e a L-arginina inibia a agregação plaquetar e os níveis de GMPc. Noris e col. (1993) confirmaram estes dados através de ensaios para medir a conversão da L-arginina marcada em L-citrulina. Nos seus estudos também conseguiram demonstrar a libertação de NO das plaquetas estimuladas com colagénio. De notar que sem estimulação a libertação de NO não foi detectada. Recorrendo ao uso de um microsensor porfirínico, Malinski e col. (1993) mediram directamente o NO plaquetar libertado no sangue e em suspensões de plaquetas durante a 85 Capítulo I ___________________________________________________________________________ agregação induzida pelo colagénio, a qual foi bloqueada por um inibidor da NOS e potenciada pela L-arginina. Mais uma vez, a libertação basal de NO não foi detectada. Através de ensaios de detecção electroquímica do NO, Lantoine e col. (1995), confirmaram estes resultados. Eles demonstraram a libertação de NO pelas plaquetas, mas somente após a estimulação com colagénio, facto que era consistente com os dados histológicos, que mostravam que uma NOS activa estará presente apenas nas plaquetas activadas (Berkels e col., 1995). Todos estes dados confirmam a presença de uma isoforma dependente do Ca2+ e semelhante à NOSe. Apenas os estudos de Zhou, Hellermann e Solomonson (1995) através de determinações espectofotométricas, encontraram uma significativa libertação de NO nas plaquetas em “repouso” e a estimulação com colagénio resultou num aumento da libertação de NO, o que confirma os dados anteriormente descritos. Chen e Mehta (1996), conseguiram induzir a actividade da NOSi nas plaquetas através da incubação destas com citocinas. Parece um dado surpreendente já que as plaquetas possuem uma capacidade reduzida para a biossíntese de proteínas. Mas, parece que a enzima já existe nas plaquetas num estado inactivo e que, durante activação/agregação das plaquetas, os níveis intracelulares de Ca2+ estão elevados (Kroll e Schafer, 1989), o que pode activar a NOS das plaquetas, libertando assim quantidades significativas de NO, o qual deve actuar como um mecanismo de retrocontrolo negativo para inibir a excessiva activação/agregação das plaquetas. Estes também demonstraram a presença quer de uma NOSe quer de uma NOSi nos megacarioblastos (Lelchuk e col., 1992). Os estudos de Chen e Mehta (1996) mostraram que as plaquetas humanas possuem uma NOSe e o seu ARNm. Além disso, estes também descreveram a presença de uma NOSi e do seu ARNm em plaquetas não estimuladas. Os estudos anteriores destes autores (Mehta e col., 1995) relatam apenas uma actividade insignificante da NOSi nas plaquetas humanas “em repouso”. Contudo, eles especulam sobre a existência da NOSi numa forma inactiva, ligada a proteínas desconhecidas, formando um complexo de 200 kDa nas plaquetas “em repouso”. Estas proteínas devem desempenhar um papel chave na activação da NOSi quando as plaquetas são estimuladas, como foi descrito acerca da expressão da P-selectina na superfície das plaquetas activadas (Modderman, Von Dem Borne e Sonnenberg, 1994). 86 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Contudo, o mecanismo envolvido na activação da NOSi pelo LPS ou pelas citocinas nas plaquetas continua por identificar. Um facto muito importante é que embora os estudos in vitro demonstrem que o NO derivado do endotélio seja um inibidor da adesão e da agregação plaquetar em condições estáticas (Furlong, Henderson e Lewis, 1987; Radomski, Palmer e Moncada, 1987b;), os estudos ex vivo em humanos mostraram que o NO derivado do endotélio não é suficiente para afectar o “funcionamento” das plaquetas em condições hemodinâmicas (Vallance, Benjamin e Collier, 1992; Varela e col., 1992). Assim, é concebível que a NOSc nativa das plaquetas deve desempenhar um papel fundamental na regulação das plaquetas in vivo, pelo qual pequenas quantidades de NO previnem a deposição das plaquetas nos vasos sanguíneos das pessoas saudáveis. A segunda forma da NO sintase deve ser relevante em estados patológicos como no choque séptico quando o LPS e as citocinas podem induzir a expressão da NO sintase nas plaquetas para “contrariar” os efeitos hemodinâmicos deletórios da invasão bacteriana, ou na trombose e na aterosclerose nas quais as plaquetas estimuladas pelas citocinas podem produzir grande quantidade de aniões superóxido e possivelmente perpetuar a cascata de eventos que levam à trombose (Metha, Chen e Metha, 1995). Assim, parece que enquanto que a libertação constitutiva de NO deve ter um papel fisiológico importante, as grandes quantidades de NO libertado em resposta a estímulos inflamatórios devem ser citotóxicas. A NOSi das plaquetas também deve desempenhar um importante papel nos estados patológicos como a trombose e a aterosclerose. Já existem dados que suportam o facto de que, em certas condições patológicas, a síntese de NO das plaquetas está aumentada. Já foi demonstrado existirem isoformas da NO sintase nas plaquetas humanas (Muruganandam e Mutus, 1994). A análise por RT PCR confirmou a expressão do ARNm codificante das isoformas da sintase do NO endotelial e indutível, mas não da neuronial nas plaquetas (Mehta e col., 1995). Uma isoforma “like” a NOSe já foi isolada das plaquetas e parece requerer co-factores similares aos da própria NOSe. O peso molecular desta NOS expressa de forma constitutiva é de 80-kDa em contraste com os 130-kDa da proteína existente nas células endoteliais. Uma isoforma da NOS homóloga com a NOSi também já foi caracterizada nas plaquetas assim como, o seu ARNm nas plaquetas não estimuladas. A NOSi das plaquetas exibe características cinéticas e um peso molecular diferente das NOSi de outras células (Chen e Mehta, 1995). 87 Capítulo I ___________________________________________________________________________ Uma vez que as plaquetas são anucleadas, com uma pool mínima de ARNm (Djaffar e col., 1991), só sendo capazes de sintetizar quantidades modestas de proteínas, a maior parte das proteínas plaquetares derivam da sua célula percursora, o megacariócito. Já foram identificadas nos megacariócitos humanos as formas indutível e constitutiva da sintase do NO (Lelchuk e col., 1992). Assim, o “limitado” ARNm para a NOSi, é provavelmente capaz de sintetizar NOSi rapidamente, facto consistente com a natureza activa das plaquetas. O mecanismo que controla a produção de NO nas plaquetas não é ainda conhecido. Já foi demonstrado que a L-arginina inibe a agregação plaquetar quer in vitro quer in vivo e também já foi demonstrado que o movimento da L-arginina para dentro das plaquetas se processa através de um sistema de transporte simples, saturável e independente do sódio (Vasta e col., 1995). O mecanismo pelo qual o NO inibe a função das plaquetas é complexo e não está completamente esclarecido. No entanto, estudos demonstraram que o NO se liga ao grupo heme da guanilciclase solúvel das plaquetas, o que leva a um aumento significativo da concentração de GMPc. Este aumento do GMPc é acompanhado pela inibição da activação das plaquetas (Mellion, Ignarro e Ohlstein, 1981; Mendelsohn e col., 1990) e os picos de concentração do GMPc estão bem correlacionados com a extensão da inibição plaquetar in vitro (Mendelsohn e col., 1990). Os dados disponíveis suportam o facto de que o GMPc activa a proteína cinase (“proteína cinase dependente do GMPc”) que fosforila as cinases das cadeias leves de miosina, o que, por sua vez, regula a actividade da ATPase actina-miosina (Hathaway, Konicki e Coolican, 1985). A fosforilação da cinase das cadeias leves de miosina reduz a sua afinidade para o complexo Ca2+/calmodulina o que resulta na diminuição da fosforilação das cadeias leves de miosina, estabilizando a forma inactiva da miosina (Ikebe e Reardon, 1990). A activação da proteína cinase dependente do GMPc pode também levar à fosforilação dos transportadores de cálcio, o que resulta na diminuição da concentração de cálcio intracelular (Ignarro e Kadowitz, 1985). A diminuição das concentrações intracelulares de cálcio estão associadas à alteração de conformação da integrina das plaquetas, a glicoproteína IIb/IIIa, para um estado que não se liga ao fibrinogénio (Mendelsohn e col., 1990). Além disso, o GMPc induzido pelo NO inibe a translocação da P-selectina a partir dos grânulos plaquetares para a membrana plasmática, diminuindo a formação de agregados plaquetas-leucócitos (Kurose e col., 1993; Moro e col., 1993). Todos estes mecanismos reduzem as respostas de activação e de agregação das plaquetas. Assim, uma acção 88 Introdução geral ___________________________________________________________________________ concertada das NOS endotelial e plaquetar regula a activação das plaquetas, causando inibição da adesão e agregação plaquetar e a indução da desagregação. Os efeitos inibitórios do NO nas plaquetas também podem influenciar a reactividade plaquetar através de um mecanismo independente do GMPc, como: a) inibição da fosfodiesterase do AMPc de baixo Km (Maurice e Haslam, 1990); b) inibição da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (Dimmeler, Lottspeich e Brune, 1992; Molina y Vedia e col., 1992; Zhang e Snyder, 1992); c) ribosilação do ADP (Brune e Lapetina, 1989) e d) um aumento do Ca2+i independente da GCs (Ivanova e col., 1993; Menshikov e col., 1993). 89 Capítulo I ___________________________________________________________________________ 90 Introdução geral ___________________________________________________________________________ A CICLOSPORINA A 1. Introdução A ciclosporina A (Figura 14) é um agente imunosupressor derivado de um metabolito do fungo Cylindrocarpon lucidum Booth e Tolypocladium inflatum Gams. Trata-se de uma substância apolar, lipofílica, com características polipeptídicas cíclicas, constituída por 11 aminoácidos (Kahan, 1989). A sua característica farmacológica principal é a actividade imunosupressora (Borel e col., 1976; Borel e col., 1977). Fig. 14 – Fórmula estrutural da ciclosporina onde se representam os 11 resíduos de aminoácidos. Adaptado de Kahan, 1989 91 Capítulo I ___________________________________________________________________________ A CsA (Calne e col., 1978), tem sido extensivamente utilizada desde 1978, sendo o fármaco de 1ª escolha, só ou em associação com outras terapêuticas, como agente imunossupressor, aumentando a sobrevivência após o transplante de orgãos e é indubitavelmente benéfica no tratamento, se bem que em doses mais baixas, de variadas doenças autoimunes (Feutren, 1992). Sabe-se que apresenta um grande número de potenciais efeitos secundários, alguns destes como consequência da diminuição das defesas do doente. Entre estes, encontram-se alguns que podem contribuir para o processo aterogénico, incluindo a hipertensão arterial e a hipercolesterolémia. 2. Propriedades farmacodinâmicas Mecanismo de acção O mecanismo exacto da actividade imunosupressora da ciclosporina não está completamente esclarecido, mas parece estar intimamente relacionado com a inibição da função e proliferação linfocitária. A CsA actua de modo específico e reversível nos linfócitos (em especial nas células T-Helper), produzindo a supressão selectiva da imunidade mediada por estas células. A produção de IL-2 pelas células T é um passo fundamental na evolução da resposta imune, já que esta é necessária para a activação e para a expressão clonal das células T-Helper e T-Citotóxicas e para a maturação de outros tipos de células. Assim, a inibição da expressão da IL-2 pela CsA reduz a formação de uma série de citocinas, produzindo efeitos indirectos em outras células envolvidas na resposta imune (Faulds, Goa e Benfield, 1993). Tem sido sugerido como explicação que o mecanismo de acção se baseia na inibição específica e reversível das células T imunocompetentes (linfócitos-T) na fase G0 ou G1 do ciclo celular (Borel e col., 1977). As propriedades imunomoduladoras da CsA estão dependentes de uma acção específica para inibir os estados iniciais de activação das células T, resultando na inibição da produção de citocinas (Foxwell e col., 1990; Furue, Katz e Kawakami, 1990; GranelliPiperno, Andrus e Steinman, 1986; Reems, Cook e Palladino, 1983). 92 Introdução geral ___________________________________________________________________________ A CsA atravessa as membranas, sendo biologicamente inerte até se ligar ao seu receptor citoplasmático, a ciclofilina , que é uma proteína intracelular específica, inibindo a sua actividade peptidil-prolina cis-trans isomerase (rotamase) e formando um complexo tóxico ciclosporina-ciclofilina (Handschumacker et al. 1984; Takahashi, Mayano e Suzuki, 1989; Walsh, Zydowsky e McKeon, 1992). O alvo celular deste complexo é uma enzima citosólica, a calcineurina. A calcineurina é um complexo heterodimérico composto de uma subunidade catalítica e de uma subunidade reguladora B, que possui actividade enzimática fosfatase serina/treonina dependente do complexo Ca2+-calmodulina (Klee, Crouch e Krinks, 1979; Klee, Draetta e Hubbard, 1988), a qual é inibida pelo complexo CsA-ciclofilina (Clipstone e Crabtree, 1992; Liu e col., 1992; Liu e col., 1991; O'Keefe e col., 1991; Swanson e col., 1992). O efeito funcional da inibição da actividade da calcineurina pela CsA é a interrupção de uma via de sinalização dependente do cálcio, responsável pelo transporte celular da subunidade citoplasmática de um factor de transcrição nas células T, o factor nuclear das células T activadas (NF-AT), o qual é necessário para a expressão dos genes induzidos por antigénios. Na ausência da CsA, a calcineurina desfosforila o NF-AT, levando à sua translocação para o núcleo celular. O resultado destes efeitos da CsA nos linfócitos é o bloqueio da transcrição da fase G0 à G1 do ciclo celular (activação) e a inibição da expressão do ARNm que codifica a síntese de diversas proteínas. Desconhecese se existe um mecanismo semelhante no tecido vascular, já que as vias de transmissão de sinal da CsA estão por caracterizar nas células endoteliais e nas células do músculo liso vascular. Nas células T, os substratos relevantes para a calcineurina são os factores transcripcionais fosforilados no gene para a IL-2. A inibição da calcineurina desempenha um papel chave na prevenção da activação das células T (ou seja da rejeição do enxerto) por impedir a desfosforilação destes factores transcripcionais (Clipstone e Crabtree, 1992; Liu e col., 1991; Liu e col., 1992; O,Keefe e col., 1991). Embora a inibição da produção da IL-2 seja a melhor descrita, também ocorre inibição na produção de IL-3, IL-4, factor de necrose tumoral (TNF), IF- e factor de estimulação da colónia granulócito-macrófago (Mueller e col., 1994). A calcineurina também medeia os efeitos da CsA nos eventos imunes póstranscricionais incluindo a libertação exocitária de histamina dos mastócitos e das citocinas 93 Capítulo I ___________________________________________________________________________ pelas células T citotóxicas (Dutz e col., 1993; Hultsch e col., 1991; Trenn e col., 1989; Triggioni e col., 1989). Tendo por base o seu mecanismo de acção, parece lógico que a CsA deve ser mais efectiva quando administrada num estado precoce, idealmente antes ter sido estabelecida uma resposta das células T. CsA Membrana plasmática Citoplasma CsA CyP CNA CNB CAM Ca2+ IMUNOSSUPRESSÃO Inibição da transcrição genética de IL-2 e outras citocinas Redução do nº de células T activadas Fig. 15. Representação esquemática dos principais passos do mecanismo responsável pelo efeito imunossupressor da ciclosporina. A ligação citoplasmática da ciclosporina (CsA) à ciclofilina (CyP) inibe uma enzima dependente de Ca2+ e calmodulina (CaM), a calcineurina, o que impede a transcrição da interleucina 2 (IL-2) e de outras citocinas necessárias à activação das células T. A redução drástica do número de células T activadas explica a sua acção imunossupressora (Reis, tese de mestrado 1999). 94 Introdução geral ___________________________________________________________________________ 3. Propriedades farmacocinéticas 3.1. Absorção Relativamente à administração por via oral, a absorção da CsA produz-se, principalmente, no intestino delgado, a nível do duodeno e do jejuno (Drewe, Beglinger e Kissel, 1992), de forma rápida e incompleta. A biodisponibilidade absoluta da CsA situa-se nos 30% e deve-se a factores como a existência de um processo metabólico pré-sistémico, que engloba as isoenzimas do citocromo P-450 do tracto gastrintestinal; a presença de bactérias no mesmo; os transportadores de membrana dependentes de ATP (como a glicoproteína P) presentes nos enterócitos e a existência do efeito de primeira passagem hepático. A presença simultânea destes factores no tracto gastrintestinal e a sua diferente importância qualitativa e quantitativa no processo de absorção, condiciona a elevada variabilidade da biodisponibilidade da CsA. Entre os factores mencionados, a expressão da glicoproteína P na membrana dos enterócitos parece ser o principal determinante da biodisponibilidade da CsA e da sua variabilidade, já que actua como uma “bomba” que expele o fármaco, impedindo a entrada de substâncias estranhas na circulação sistémica (entre elas a CsA), mediante o transporte de moléculas lipofílicas desde o interior do enterócito até ao lúmen intestinal. Brynskov e col. (1992) concluíram que a absorção da CsA era bem descrita por uma cinética de ordem zero (independente da dose), o que também indica que o tempo do trânsito intestinal é o factor que mais influencia a absorção. A absorção ocorre através de um processo de difusão não saturável (Ueda e col., 1983). 3.2. Distribuição A CsA possui um elevado volume aparente de distribuição, como consequência da sua ampla dispersão a diversos orgãos e tecidos (Kahan e Grevel, 1988). 95 Capítulo I ___________________________________________________________________________ A CsA distribui-se, principalmente, ao fígado, mas também a tecidos adiposos, sangue, coração, pulmões e pâncreas. Nestes tecidos e, fundamentalmente em orgão ricos em leucócitos, as concentrações alcançadas são mais altas que as obtidas no sangue. O fármaco permanece nos tecidos durante um considerável período de tempo após ter sido interrompida a terapêutica (Holt e col., 1994). A CsA passa rapidamente para a linfa, originando concentrações situadas entre 40 a 60% das encontradas no sangue (Fahr, 1993). No sangue, 58% da CsA circulante está unida aos eritrócitos, 4% aos granulócitos, 5% aos linfócitos e os restantes 33% encontram-se no plasma, 98% dos quais unidos a proteínas plasmáticas (85-90% a lipoproteínas e 5-15% a outras proteínas plasmáticas) (Faulds, Goa e Benfield, 1993). A maior percentagem de união da CsA às lipoproteínas plasmáticas produz-se na fracção HDL (43-57%) e LDL (25%) (Gurecki, Warty e Sanghui, 1985). Segundo alguns autores as LDL actuam como transportadores da CsA e facilitam a entrada do fármaco no interior das células. A união da CsA a eritrócitos é saturável e, para além disso, depende da temperatura e do hematócrito. Assim, uma diminuição da temperatura e/ou um aumento do hematócrito supõem um aumento da fracção da CsA unida aos eritrócitos. Por outro lado, a fracção da CsA unida às lipoproteínas aumenta quando se eleva a temperatura e é dependente da concentração no sangue total. Logo, quando a concentração no sangue da CsA num estado estacionário aumenta, a fracção livre também se incrementa e condiciona a resposta clínica dos pacientes. 3.3. Metabolismo e excreção A principal via de eliminação da CsA é a metabolização nos microssomas hepáticos, catalizada pelas isoenzimas da família 3A4 do sistema enzimático citocromo P450 (CYP3A4). A biotransformação hepática da CsA, principalmente mediante reacções de hidroxilação, oxidação e/ou N-desmetilação, origina um grande número de metabolitos, os quais mantêm a estrutura oligopéptida da CsA intacta e se distinguem pela posição do aminoácido transformado (Combalert e col., 1989; Gonzalez, 1992; Kronbach, Fischer e 96 Introdução geral ___________________________________________________________________________ Meyer, 1988). Todos os outros fármacos metabolizados por este sistema podem potencialmente interferir com o metabolismo da CsA. Até ao momento, foram identificados mais de 30 metabolitos na bílis, nas fezes, no sangue e na urina. Destacam-se, pela sua concentração sanguínea, o M1 (oxidação em posição 1 beta [8`]), o M4N (derivado 4-N-desmetilado), o M9 (oxidação em posição 1 beta, 9 gama) (Bertault-Peres e col., 1987). Num estado estacionário, a concentração no sangue do metabolito M1 e a sua área abaixo da curva pode exceder a do fármaco original; para além disso, é o composto mais activo, com 10 a 20% de actividade in vitro de CsA. Todavia, não existem conclusões definitivas sobre a contribuição destes metabolitos na efectividade e na nefrotoxicidade do tratamento com CsA, pelo que a relevância clínica da sua monitorização não foi estabelecida (Fahr, Hiestand e Ryffel, 1990). Existem evidências directas e indirectas de um significativo metabolismo préhepático da CsA após a administração oral pelas isoenzimas do citocromo CYP3A nas membranas intestinais (Hoppu e col., 1991; Kolars e col., 1991). O metabolismo da CsA pode ser afectado pelo estado clínico ou pela idade do doente, pela disfunção concomitante do fígado, ou pela interacção de fármacos com as enzimas responsáveis pela oxidação da CsA. A excreção biliar é a via maioritária dos metabolitos da CsA, uma vez que a sua concentração na bílis é maior que a concentração total no sangue. O fármaco inalterado é eliminado por esta via numa percentagem inferior a 1%. Em alguns pacientes existem evidências de circulação entero-hepática, tanto da CsA como dos seus metabolitos. Por outro lado, a eliminação renal da CsA é de escassa importância (Maurer e Lemaire, 1986; Venkaratamanan e col., 1985). A monitorização da CsA tem sido fundamental para se assegurar uma eficácia imunossupressiva sem efeitos adversos, fazer a distinção entre um processo de rejeição e a toxicidade induzida pelo fármaco e detectar as interacções de fármacos não esperadas e que afectam a concentração desta. Além disso, é necessária uma monitorização rotineira dos níveis sanguíneos de ciclosporina e os resultados obtidos servirão de orientação para se individualizar o regime posológico com o objectivo de se atingirem as concentrações necessárias. 97 Capítulo I ___________________________________________________________________________ Adicionalmente, devem ser também monitorizados os parâmetros clínicos de segurança tais como a creatinina sérica e a pressão sanguínea e as concentrações sanguíneas de CsA, as quais são apenas um dos factores que contribuem para o estado clínico do doente, não devem ser interpretadas isoladamente dos dados clínicos. Assim, os resultados deverão servir unicamente como orientação da dosagem terapêutica no contexto de outros parâmetros clínicos e laboratoriais. 4. Efeitos secundários Têm sido relatados variados tipos de reacções adversas. Mas os efeitos secundários mais importantes da CsA incluem a hepatotoxicidade (Loertscher e col., 1983), as complicações cardiovasculares como a hipertensão arterial (Bellet e col., 1985; Cohen e col., 1984; Hamilton e col., 1982; Myers e col., 1988; Thompson e col., 1983), a nefrotoxicidade (Cohen e col., 1984; Myers e col., 1988; Shulman e col., 1981) e os eventos tromboembólicos incluindo a microangioplastia trombótica (Neild e col., 1985; Sommer e col., 1985; Vanrenterghem e col., 1985). Já foi sugerido que a elevação da pressão arterial sanguínea pela CsA é secundária à vasoconstrição renal e à anti-natriurese, resultando na expansão do volume dos fluidos extracelulares e numa forma de hipertensão dependente do sódio (Curtis e col., 1988). Contudo, o aumento da pressão arterial precede qualquer alteração da função renal, o que serve de argumento contra este factor como mecanismo único. Alternativamente, é possível que a CsA exerça os seus efeitos vasculares ao alterar a reactividade e/ou a síntese de substâncias vasoactivas endógenas. Mas, o mecanismo ou mecanismos destes efeitos não estão ainda estabelecidos (Óskarsson, Hofmeyer e Olivari, 1997). De facto, têm sido implicados mecanismos renais, vasculares e neuroniais e estes não são mutuamente exclusivos. Além disso, a importância relativa de cada um deles ou de todos ainda não está esclarecida e o desvendar dos mecanismos moleculares subjacentes, nestes diferentes tecidos alvo “ainda agora começou”. 98 Introdução geral ___________________________________________________________________________ 4.1. A ciclosporina como agente indutor de hipertensão arterial Os eventos cardiovasculares são a principal causa de mortalidade recente após um transplante renal ou cardíaco (Ballentyne e col., 1998; Kasiske e col., 1996; Whitworth, 1992). Assim, o tratamento dos factores de risco cardiovasculares coexistentes, como a hipertensão, é provavelmente um elemento importante e definitivamente determinante do resultado após o transplante de orgãos. Está estabelecido que a CsA é uma importante causa iatrogénica de hipertensão arterial no homem (Bellet e col., 1985). A hipertensão pode desenvolver-se em poucas semanas em 10-80% dos doentes, dependendo da dose e da duração de exposição ao fármaco, da terapia concomitante e da situação clínica para a qual foi utilizada a CsA. Mas os efeitos, embora dependentes da dose utilizada, apresentam uma grande heterogeneidade entre os diversos indivíduos e uma insuficiente correlação com os níveis plasmáticos de CsA em relação aos quais se manifestam (Myers, 1986), e esta pode manifestar-se de uma forma aguda ou crónica. É difícil fazer uma estimativa da incidência de hipertensão arterial em doentes tratados com a CsA. Contudo, a hipertensão tem sido relatada tanto em transplantados (Barrett e col., 1982; Hamilton e col., 1982; Hunt, 1983; Thompson e col., 1983) como em não transplantados (Berg e col., 1986; Palestine e col., 1986) que tomam o fármaco. A CsA emergiu assim como uma nova causa de hipertensão arterial e têm sido descritos dois síndromas: a) elevações agudas da pressão arterial durante o início do tratamento com a CsA; b) elevações crónicas da pressão arterial durante a administração a longo prazo. Qualquer dos casos requer tratamento com terapêutica anti-hipertensora múltipla. A taxa de incidência da hipertensão clínica, antes e após a introdução da CsA, encontra-se sumariada na Quadro 5. 99 Capítulo I ___________________________________________________________________________ Quadro 5. Incidência de hipertensão arterial antes e após a administração de CsA Indicação Hipertensão arterial (%) Antes da CsA Após a CsA Transplante: medula óssea coração fígado 5-10 10 NA 33-60 71-100 65-85 rim 45-55 67-86 Não transplante: artrite reumatóide uveíte NA NA 42-45 23-29 miastenia grave psoríase NA NA 81 30 NA – Não aplicável. Adaptado de Taler e col., 1999. Embora a nefrotoxicidade provocada pela CsA possa estar subjacente ao desenvolvimento da hipertensão arterial, o aparecimento precoce da hipertensão leva a crer na existência de um mecanismo vascular eventualmente comum ao aparecimento da hipertensão arterial e da nefrotoxicidade, mas inicialmente independente das lesões renais. Ambas as condições reflectem vasoconstrição e têm sido consideradas diferentes facetas de um só problema (Textor e col., 1994). Variados estudos apresentam diferentes dados, os quais suportam várias causas possíveis para a hipertensão, contudo até agora nenhum clarificou realmente o ou os mecanismos. Como resultado, o tratamento efectivo da hipertensão induzida pela CsA permanece empírico. 100 Introdução geral ___________________________________________________________________________ 4.2. A influência da ciclosporina na reactividade vascular Numa revisão dos trabalhos de investigação sobre os prováveis mecanismos responsáveis pela alteração da reactividade vascular induzida pela ciclosporina, verifica-se que a literatura existente é muito inconsistente devido aos muitos resultados contraditórios obtidos, se bem que tanto nos animais como no homem se verifica um aumento da resistência vascular renal e da resistência periférica total. No entanto, podem salientar-se algumas das alterações descritas na literatura: O uso crónico de CsA pode interferir com a vasoregulação local ao alterar tanto a função do endotélio como do músculo liso. Quando se administra a CsA podemos verificar: aumento (Bartholomeusz e col., 1996; Gerkens, 1989; Hansen e col., 1997; Hansen e col., 1999; Lusting e col., 1989; Moss, Powell e Falk, 1985; Oriji, 1999; Oriji e Keiser, 1998; Oriji e Keiser, 1999; Rego e col., 1991; Roullet e col., 1994; Takeda e col., 1992; Tonnesen, Hamner e Weinmann, 1983; Vaziri e col., 1998), diminuição (Murray, Paller e Ferris, 1985) ou mesmo uma ausência de efeitos desta ao nível da pressão arterial (Garr e Paller, 1990; Kaskel e col., 1987; Textor, Smith-Powell e Telles, 1990). Não obstante, os estudos mais recentes acerca do assunto descrevem, praticamente todos, o aumento da pressão arterial induzida pelo tratamento com a CsA. Contudo, os estudos tanto in vitro como in vivo têm descrito de forma consistente que a CsA exerce um potente acção na vasculatura ao alterar a reactividade desta. Assim tem sido descrita uma significativa potenciação da vasoconstrição (Hertel e Bossaller, 1989; Lamb e Weeb, 1987; Rego e col., 1988; Rego e col., 1990b; Rego e col., 1991; Rossi e col., 1989) e uma marcada atenuação da vasodilatação (Bossaller e col., 1989; Huang e col., 1987; Rego e col., 1988; Rego e col., 1990b; Rego e col., 1991) o que pode fornecer uma explicação para o aumento da resistência vascular observada durante o tratamento com a CsA em humanos (Curtis e col., 1986; Greenberg e col., 1985; Scherrer e col., 1990), nos roedores (Kaskel e col., 1987; Murray, Paller e Ferris, 1985) e noutros animais (Whitworth e col., 1987). Outra implicação destas observações é de que a hipertensão induzida pela CsA pode resultar de uma sensibilidade vascular alterada às substâncias vasoconstritoras e/ou vasodilatadoras. 101 Capítulo I ___________________________________________________________________________ Além disso, a alteração da sensibilidade vascular pode ser devida não só a alterações funcionais mas também a alterações morfológicas induzidas pela CsA. Outro facto consistente é o de que a ciclosporina enfraquece o relaxamento vascular dependente do endotélio (Balligand e Godfraind, 1991; Bossaller e col., 1989; Chan e col., 1992; Diederich e col., 1994; Dinh e col., 1990; Dudhir e col., 1994; Gallego e col., 1994; Gerkens, 1989; Rego e col., 1990a; Roullet e col., 1994; Stephan e col., 1995; Yaris, Tuner e Ilhan, 1992). De facto, os anéis aórticos tanto os pré-incubados (Rego e col., 1990b) como os isolados de animais tratados com o fármaco (Mikkelsen e col., 1992; Rego e col., 1988; Rego e col., 1990b), as arteríolas de resistência subcutâneas humanas alteradas in vitro pela CsA (Richards Poston e Hilton, 1989), os leitos vasculares mesentéricos perfundidos com a CsA (Rego e col., 1990a) e aos animais aos quais foi administrada a CsA (Gallego e col., 1993) todos exibem uma resposta enfraquecida à acetilcolina. Os microvasos renais de ratos tratados com a CsA também apresentam uma resposta vasodilatadora à acetilcolina mais atenuada (Takenaka, Hashimoto e Epstein, 1992). Quanto ao impacto adverso da CsA no músculo liso arterial e no relaxamento independente do endotélio, os dados são por vezes contraditórios. Variados estudos in vitro e ex vivo utilizando grandes vasos ou preparações de leitos arteriais mesentéricos descrevem um efeito atenuado pela acção da CsA no relaxamento suscitado pelo nitroprussiato de sódio (Bossaller e col., 1989; Gerkens, 1989; Huang e col., 1987; Luscher, Weber e Buhler, 1988; Rego e col., 1988; Rego e col., 1990a; Rego e col., 1991; Roullet e col., 1994; Yang e col., 1989). Pelo contrário, outros estudos in vitro (O,Neil e col., 1991; Schrör e col., 1989) e ex vivo (Richards, Poston e Hilton, 1989) as respostas de vasodilatadores que actuavam através de mecanismos independentes do endotélio não apresentavam qualquer alteração. Mais, nos estudos de Richards, Poston e Hilton (1989) a resposta ao nitroprussiato de sódio encontravase aumentada nos vasos de resistência humanos incubados com CsA. O mecanismo molecular de acção do fármaco ainda não foi esclarecido, contudo, variadas linhas de investigação sugerem que um provável alvo intracelular é a via metabólica do NO, incluindo o sistema de formação do NO no endotélio e o sistema efector do NO nas células musculares lisas. Nos estudos de Solagni e col. (1990) em ratos espontaneamente hipertensos e de Gallego e col. (1993) em ratos normotensos, a administração de L-arginina, 102 Introdução geral ___________________________________________________________________________ o substrato natural para a síntese de NO, apresentava um efeito protector contra a hipertensão induzida pela CsA. Amore e col. (1995) também relataram que a administração de L-arginina exerce um efeito protector contra a vasoconstrição renal induzida pela CsA nos ratos. Assim, uma capacidade diminuída da vasculatura em produzir e/ou responder aos vasodilatadores pode favorecer a vasoconstrição. Em alguns estudos nos quais foram utilizados o azul de metileno, um dador de superóxidos, os quais inactivam os factores de relaxamento dependentes do endotélio, este não apresentava qualquer efeito na vasodilatação induzida pela acetilcolina nos vasos de resistência previamente incubados com CsA, facto que é consistente com os relatos que sugerem que o sistema de formação do NO se encontra enfraquecido pela acção da CsA. Noutros estudos, também se verifica que o sistema efector do NO no músculo liso, testado por exemplo com o dador de NO, nitroprussiato de sódio, também se encontra alterado pela CsA, se bem que em menor grau. A enzima sintase do NO é um substrato da calcineurina in vitro (Dawson e col., 1993), sugerindo um potencial mecanismo para explicar um efeito inibitório da CsA na vasodilatação induzida pelo NO. Contudo, os dados ainda são conflituosos em relação a quando é que a desfosforilação mediada pela calcineurina aumenta ou diminui a actividade da sintase do NO (Busse, Luckhoff e Mülsch, 1991; Förstermann e col., 1991; Marumo e col., 1995; Mittal e Jadhau, 1994). Os estudos prévios de Rego e col. (1990a) mostraram uma diminuição do conteúdo de GMPc na aorta de ratos tratados com CsA e uma diminuição da produção de GMPc pelos grandes vasos “estimulados” in vitro pelo fármaco, sugere que a CsA pode enfraquecer o relaxamento independente do endotélio dos vasos de resistência ao interferir com a via do GMPc. Assim, na hipertensão induzida pela CsA a diminuição das respostas relaxantes parece estar também associada à diminuição dos conteúdos de GMPc no músculo liso vascular. O efeito da CsA na libertação do vasodilatador eicosanóide, PGI2 a partir de diferentes tipos de células vasculares é contraditório. Têm sido relatados tanto efeitos inibitórios (Bossaller e col., 1989; Brown e Neild, 1987; Brown, Neild e Lewis, 1990; Fan e Lewis, 1985; Neild e col., 1983) como efeitos estimulantes (Landolfi e Steiner, 1984; Lau e Wong, 1987; Oriji e Keiser, 1998). 103 Capítulo I ___________________________________________________________________________ A CsA causa um aumento no tónus simpático (Golub e col., 1989; Morgan e col., 1991; Scherrer e col., 1990). Pelo contrário, Rego e col. (1991) e Gerkens (1989) afirmam ser pouco provável que os efeitos provocados pela CsA sejam devidos à libertação endógena de catecolaminas e à possível activação directa dos adrenoreceptores pela ciclosporina. Além disso a CsA aumenta as respostas vasculares aos vasoconstritores como a fenilefrina, a noradrenalina e a angiotensina II (Bossaller e col., 1989; Cartier e col., 1994; Rego e col., 1988; Rego e col., 1990b; Rego e col., 1991; Schwelk e col., 1993). No entanto, também em relação à sensibilidade vascular outros estudos obtiveram resultados opostos, ou seja, uma resposta atenuada a algumas destas substâncias vasoconstritoras (Garr e Paller, 1990; Roullet e col., 1994; Textor, Smith-Powell e Telles, 1990). A CsA aumenta a produção de tromboxano A2 (Benigni e col., 1988; Jorkasky e col., 1989; Kawaguchi e col., 1985) e de endotelina (Bunchman e Brookshire, 1991; Grieff e col., 1993; Haug e col., 1995), os quais são ambos potentes vasoconstritores. A endotelina, o peptídeo vasoconstritor endógeno mais potente (Yanagisawa e col., 1988), também tem sido sugerida como mediadora da vasoconstrição e da hipertensão induzida pela CsA. Verificouse que: 1) a hipoperfusão glomerular induzida pela CsA está associada a um marcado aumento na ET urinária (Perico e col., 1992) e em alguns casos na ET plasmática (Textor e col., 1992); 2) as concentrações de endotelina no plasma e na urina encontram-se aumentadas em doentes com transplante hepático ou cardíaco (Grieff e col., 1993; Textor e col., 1995); 3) a CsA estimula a produção de ET em variados tipos de células, renais e não renais (Bunchman e Brookshire, 1991), como se verifica in vivo no rato (Takeda e col., 1992) e nas células endoteliais de cultura humanas (Bunchman, Mauer e Kim, 1990) e de ratos (Takeda e col., 1993) e 4) a hipoperfusão/filtração glomerular e a proliferação celular exagerada relacionada com a CsA pode ser melhorada por agentes que bloqueiam as acções da ET, como os anticorpos anti-ET (Kon e col., 1990) ou os antagonistas selectivos da ET (Fogo e col., 1992). De facto, o antagonismo agudo ou crónico dos receptores da ET baixa a pressão sanguínea de animais com hipertensão induzida pela CsA (Bartholomeusz e col., 1996; Phillips e col., 1994). Todos estes resultados são consistentes com o facto de que o aumento da produção de ET seja patogénica na hipertensão induzida pela CsA, potencialmente conjuntamente com uma redução na produção de NO. Contudo, o papel preciso desempenhado pela endotelina na hipertensão causada pela CsA é ainda 104 Introdução geral ___________________________________________________________________________ desconhecido. Por exemplo, em ratos o efeito hipertensivo agudo causado pela CsA não é afectado pela inibição da endotelina mas é abolido pela simpatectomia química ou cirúrgica, o que pode indiciar uma mediação neuronial simpática (Morgan e col., 1991). Também está descrito que a CsA aumenta os receptores ETA para a endotelina na vasculatura (Takeda e col., 1995). Um aumento transitório do cálcio intracelular é fundamental na mediação das respostas contrácteis do músculo liso vascular (Rasmussen, 1986). A CsA aumenta este cálcio transitório em resposta a agentes vasoconstritores, incluindo a angiotensina II e a noradrenalina, tanto nas células musculares lisas de cultura (Bokemeyer e col., 1994; MeyerLehnert e Schrier, 1989) como nas preparações de anéis de vasos sanguíneos isolados (Lamb e Webb, 1987; Rego e col., 1990b; Xue e col., 1987). A ciclosporina pode aumentar tanto o 2+ influxo de Ca a partir dos compartimentos extracelulares (Meyer-Lehnert e Schrier, 1989; Rego e col., 1990b) como a partir dos compartimentos intracelulares que o armazenam (Bokemeyer e col., 1994), factos que levam a colocar a hipótese de que os mecanismos de armazenamento e de libertação do cálcio estarem alterados após o tratamento (Auch-Schwlk e col., 1993; Meyer-Lehnert e Schrier, 1987; Meyer-Lehnert e Schrier 1989; Pfeilschifter, 1988; Pfeilschifter e Rüegg, 1987). O sistema renina-angiotensina também tem sido considerado como possível factor contribuinte para a hipertensão associada à CsA, já que têm sido observados níveis sanguíneos aumentados de renina em ratos (Perico e col., 1986). Contudo este facto parece não ser confirmado em humanos (Bellet e col., 1985). A CsA também provoca efeitos adversos no equilíbrio homeostático intravascular, favorecendo um estado protrombótico ao diminuir a libertação de prostaciclina (Bossaller e col., 1989; Sharp e col., 1988) e de monóxido de azoto (Bossaller e col., 1989; Chan e col., 1992; Diederich e col., 1994; Dudhir e col., 1994; Rego e col., 1990a) a partir do endotélio ao mesmo tempo que aumenta a síntese de tromboxano A2 e a libertação de serotonina pelas plaquetas (Fernandes e col., 1993; Fishman e col., 1991; Grace e col., 1987; Jorkasky e col., 1989). Além disso, a inibição da síntese de NO promove a adesão das plaquetas, um evento que se sabe causar injúria das células endoteliais. O NO actua como protector em condições 105 Capítulo I ___________________________________________________________________________ fisiológicas, já que pode sequestrar pequenos fluxos de superóxidos produzidos pelas células endoteliais. Assim, a inibição da produção de NO favorece a acumulação de superóxidos e/ou de peróxidos de hidrogénio, os quais se sabe que alteram a integridade microvascular, limitando a toxicidade associada com os radicais livres. Não obstante, a variação dos efeitos descritos pode ser devida a uma grande heterogeneidade no modelo animal escolhido, na dose escolhida de CsA, no período de duração do tratamento e no veículo usado nos diferentes estudos descritos, os quais influenciam a consistência dos resultados. De realçar ainda o facto, de que o efeito da CsA pode variar consoante o tipo e o tamanho do vaso estudado. 4.3. A influência da ciclosporina na função plaquetar A terapêutica com a ciclosporina aumenta a activação expontânea das plaquetas (Cohen e col., 1988), torna as plaquetas hiperagregáveis em resposta a variados agonistas (Cohen e col., 1988; Fishman e col., 1991; Grace e col., 1987; Jorkasky e col., 1989) e causa um aumento na expressão dos receptores para o fibrinogénio na superfície da membrana das plaquetas (Fernandes e col., 1993; Fishman e col., 1991). As plaquetas normais activadas desencadeiam uma vasodilatação nas artérias normais através da secreção de ADP e ATP, que estimulam a libertação de NO (Föstermann e col., 1988; Kaul e col., 1993; Öskarsson e Hofmeyer, 1996). Isto pode ser considerado como um mecanismo contra-regulador no qual a libertação de NO causa uma vasodilatação em oposição às forças vasoconstritoras desencadeadas por vários vasoconstritores como o TXA2 e a serotonina, também libertados durante a agregação plaquetar. Além disso, o NO libertado no espaço da íntima pode inibir a proliferação das células musculares lisas (Newby, Southgate e Assender, 1992; Nunokawa e Tanaka, 1992) e a síntese da matriz extracelular (Kolpakov e col., 1995). O NO é também libertado no lúmen do vaso onde inibe a agregação 106 Introdução geral ___________________________________________________________________________ plaquetar e a formação de trombos (Durane e col., 1992; Kaul e col., 1995; Nguyen, Saitoh e Wane, 1991), providenciando um importante mecanismo de feedback negativo do processo de activação plaquetar em curso. Assim, a incapacidade das plaquetas expostas à CsA em mediar estes efeitos criam condições que favorecem os vasospasmos e a trombose intravascular durante a activação plaquetar. Este facto deve possuir consequências clínicas significativas e pode em parte explicar algumas das complicações tromboembólicas relacionadas com o uso da CsA. Contudo, não está ainda estabelecido como é que a CsA influência o balanço entre estas forças vasodilatadoras e vasoconstritoras mediadas pelas plaquetas activadas. A CsA provoca variadas alterações nas plaquetas mas não é ainda conhecido quando é que estas afectam a capacidade das plaquetas em mediar a vasodilatação. As plaquetas humanas, quando expostas à CsA tanto in vivo como in vitro possuem uma capacidade diminuída em mediar a vasodilatação. Isto não é devido a um aumento da vasoconstrição mediada pelas plaquetas ou a uma diminuição na libertação de nucleótidos derivados das plaquetas mas, provavelmente, a um composto (ou vários) ainda não identificado libertado pelas plaquetas quando expostas à CsA mas não libertado das plaquetas normais com uma semi-vida curta, o qual interfere com a vasodilatação dependente do endotélio ou que diminui a libertação de NO (Óskarsson, Hofmeyer e Olivari, 1997). 107 Capítulo I ___________________________________________________________________________ 108 CAPÍTULO II OBJECTIVOS Objectivos _________________________________________________________________________ A ciclosporina A foi introduzida como fármaco imunossupressor nos processos de transplantação humanos na década de 80. Mas, a sua utilização é complicada devido a uma série de efeitos secundários, e em particular à hipertensão arterial e à nefrotoxicidade que induz. Um elemento comum tanto à nefrotoxicidade como à hipertensão arterial é a vasoconstrição, mas o mecanismo exacto desta resposta permanece por esclarecer. Contudo, parece que a CsA altera a reactividade vascular e/ou a síntese de substâncias vasoactivas endógenas e pode assim causar uma significativa potenciação da vasoconstrição e/ou uma atenuação da vasodilatação. Têm sido sugeridos variados mediadores, incluindo um efeito no sistema renina – angiotensina, na actividade nervosa simpática renal, as endotelinas, o tromboxano A2, as prostaglandinas vasodilatadores, o factor activador das plaquetas, um efeito directo na captação do cálcio pelas células musculares lisas vasculares, entre outros. Os estudos mais recentes encontram-se direccionados para a via da L-arginina:NO, já que hoje se sabe que um dos mecanismos da vasoconstrição induzida pela CsA é a diminuição do relaxamento dependente do endotélio mediado pelo NO. O NO é um importante mediador das alterações vasculares associadas à hipertensão arterial e variados estudos têm sugerido que as alterações da produção e/ou acção do NO deva ser um factor chave na resposta vasoconstritora à CsA. Assim, a CsA continua a ser um fármaco imunossupressor de eleição; até ao presente, nenhum outro que não lhe perca em eficácia lhe tem ganho em segurança. Além disso, a toxicidade, nomeadamente a hipertensão arterial, parece decorrer ou relacionar-se intimamente com o próprio mecanismo benéfico. Sem um fármaco que claramente destrone a CsA, resta ao investigador tentar “inibir” ou diminuir a toxicidade do fármaco, mas, para isso, é forçado a estudar os mecanismos subjacentes ao efeito hipertensor e a desenvolver abordagens preventivas ou terapêuticas para limitar a magnitude das suas acções adversas. Este trabalho insere-se num projecto mais amplo e ambicioso através do qual tentamos propor um(s) possível(is) mecanismo(s) subjacentes à hipertensão arterial induzida pela CsA. 111 Capítulo II _________________________________________________________________________ Até ao momento, o nosso grupo de trabalho (Reis, tese de mestrado 1999; Tavares, tese de doutoramento 1999) desenvolveu e caracterizou um modelo animal de hipertensão arterial secundária à ciclosporina A. Na verdade, o rato Wistar reproduz o desenvolvimento humano de hipertensão arterial sequente à administração de ciclosporina. Morfologicamente, através de microscopia electrónica e de técnicas anatomopatológicas, o nosso grupo descreveu lesões condizentes com um estado hipertensivo em ratos submetidos a ciclosporina: a nível renal foram encontradas lesões ligeiras, não parecendo suficientemente graves para originar a hipertensão arterial desenvolvida; foram registadas alterações cardíacas dependentes da dose; as lesões vasculares encontradas apresentavam uma severidade ligeira, predominando a ruptura e a desorganização das fibras elásticas. A aorta apresentava um perfil de lesões arterioscleróticas precoces mais facilmente associadas a alterações hemodinâmicas; a nível celular, a microscopia electrónica revelou um aumento da síntese de colagénio com uma aparente relação entre este facto e a ruptura das fibras. O nosso grupo (Reis, tese de mestrado 1999; Tavares, tese de doutoramento 1999) seriou as alterações morfológicas e funcionais num quadro de hiperactivação plaquetar as quais parecem sugerir que as plaquetas reflectem se não mesmo contribuem para a hipertensão arterial neste modelo experimental. Tais alterações são, por exemplo: como confirmação da hiperreactividade plaquetar associada ao tratamento com a CsA, verificou-se no nosso modelo um aumento in vitro da formação plaquetar de TxA2 e, paralela e/ou consequentemente, um aumento da agregação plaquetar induzida por colagénio; 112 Objectivos _________________________________________________________________________ a diminuição da concentração de serotonina nas plaquetas dos ratos tratados com a CsA, como resultado da activação plaquetar propriamente dita e/ou da inibição da sua captação (como a inibição in vitro da ligação de [3H]imipramina ao transportador de serotonina, para a concentração mais elevada, sugere), confirma a possibilidade de envolvimento de alterações na actividade do sistema serotoninérgico periférico no desenvolvimento da hipertensão arterial; a nível dos segundos mensageiros intracelulares verificou-se que a CsA promoveu um aumento da [Ca2+]i basal e após estimulação com serotonina e trombina. Para além de um aumento do influxo do meio extracelular através dos transportadores membranares, também parece ocorrer uma exagerada libertação de cálcio das reservas intracelulares; o aumento da produção de fosfatos de inositol em relação ao controlo, incluindo o Ins(1,4,5)P3 reforça esta suposição. Estes resultados foram confirmados pelos estudos in vitro. O endotélio desempenha um papel chave na homeostase do sistema cardiovascular ao regular o tono vascular. Esta acção endotelial é exercida através da libertação de diferentes substâncias que modulam a actividade contráctil do músculo liso vascular. A respeito de moléculas envolvidas na inibição do tono vascular e na vasodilatação, estudam-se os dois principais factores de relaxamento derivados do endotélio: o monóxido de azoto (e o respectivo mediador, o GMPc) e a prostaciclina, uma vez que a observação da inibição da síntese de NO em indivíduos normais pode causar um aumento da resistência vascular até níveis de hipertensão arterial e de variados estudos terem indicado que as artérias de doentes com hipertensão essencial apresentam um déficit na síntese do NO (quer a produção basal quer a estimulada) derivado do endotélio sugerem que tal facto deve desempenhar um papel determinante quer do aumento da resistência vascular destes doentes quer da sua resposta enfraquecida aos agentes dependentes do endotélio, assim, esta deve desempenhar um papel primário nos mecanismos “causais” da hipertensão essencial. 113 Capítulo II _________________________________________________________________________ Além disso, o facto de ocorrer uma elevação da pressão arterial a acompanhar o tratamento com a CsA levou-nos agora a orientar os nossos esforços na investigação da ou das alterações que possam ocorrer nos mecanismos vasodilatadores, em especial na via da L-arginina:NO, visto ser o monóxido de azoto, o principal factor relaxante derivado do endotélio. Mas, uma vez que existe a possibilidade das plaquetas estarem também envolvidas no aumento da pressão arterial induzida pela CsA, com base nos variados mecanismos propostos para o aumento da vasoconstrição e visto que, as plaquetas também possuem uma via da L-arginina:NO que regula a sua agregabilidade, também fomos estudar se estaria alterada a via da L-arginina:NO:GMPc das plaquetas. Assim, o estudo que estabelecemos foi “pensado” para tentarmos responder às seguintes questões: 1. Qual ou quais as alterações encontradas na aorta do principal factor vasodilatador derivados do endotélio, o NO se há algumas, estas acompanham ou não a hipertensão arterial induzida pela CsA no modelo animal (rato Wistar) escolhido? 2. O principal sistema efector da acção do NO, o GMPc, também apresentará qualquer tipo de desregulação a nível do músculo liso vascular. 3. As plaquetas também sofrerão qualquer tipo de alteração no respeitante à produção e/ou ao armazenamento do NO? 4. O que ocorre ao GMPc a nível das plaquetas? 5. As alterações do sistema da L-arginina:NO desencadeadas pela administração crónica da CsA (estudos in vivo) serão correlacionáveis com as alterações encontradas após adição aguda de CsA às plaquetas (estudos in vitro). 114 Objectivos _________________________________________________________________________ 6. Existirá qualquer relação entre a variação do conteúdo de NO e do GMPc quer nas plaquetas quer na aorta? 7. O ou os efeitos verificados poderão ser revertidos ou impedidos pela administração de L-arginina? 8. O conteúdo de PGI2, outro importante factor vasodilatador derivado do endotélio, também se encontrará alterado na aorta do nosso modelo animal de hipertensão induzida pela CsA? 9. Apresentarão as variações de conteúdo(s) do NO e da PGI2 encontradas comportamentos semelhantes, opostos ou interrelacionáveis? 10. Ocorrerão alterações nos teores plasmáticos de PGI2? 11. Serão as plaquetas um “espelho” das alterações que possam ser detectadas a nível arterial, quer em relação aos conteúdos do NO quer do GMPc. 12. Qual o factor que sofrerá uma modificação mais precoce? Para tal seguimos o seguinte protocolo: a) Em primeiro lugar, comprovou-se se no nosso modelo experimental, à semelhança dos estudos anteriores, a administração de 5 mg/kg/dia de CsA aos ratos também desencadeia a elevação da pressão arterial, através da avaliação de: pressão arterial sistólica, diastólica e média; frequência cardíaca; principais parâmetros hematológicos, como o número de plaquetas, plaquetócrito, volume plaquetar médio, coeficiente de variação plaquetar e hematócrito. 115 Capítulo II _________________________________________________________________________ b) De seguida, avaliaram-se os efeitos do tratamento prolongado com a CsA ex vivo nos seguintes parâmetros. conteúdos arteriais dos principais factores de relaxamento derivados do endotélio, o NO e a PGI2; conteúdo arterial do principal sistema efector do NO, o GMPc; alteração nos conteúdos plasmáticos de PGI2; conteúdos plaquetares de NO e de GMPc; Foram também realizados estudos in vitro, para: avaliar a reactividade plaquetar em relação às substâncias administradas nos estudos in vivo; excluir os mecanismos (efeitos) compensatórios que possam “mascarar” o efeito da CsA; determinar a importância relativa do efluxo e do conteúdo residual da produção de NO e de GMPc pelas plaquetas. 116 CAPÍTULO III PARTE EXPERIMENTAL Parte Experimental _________________________________________________________________________ I Modelo animal e protocolo experimental 1. Modelo animal Como modelo animal experimental, escolheu-se o rato, visto este ser muito utilizado para estudos de hipertensão arterial, nomeadamente nos estudos de hipertensão induzida pela administração de CsA. Foram utilizados ratos da estirpe Wistar, machos, com cerca de três meses de idade e um peso de 250-300 gr, provenientes do biotério Charles-River (Barcelona, Espanha). Os animais foram mantidos durante as experiências no biotério de manutenção do Instituto de Farmacologia e Terapêutica Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra de acordo com as normas legislativas europeias e em vigor no nosso país, mantidos em gaiolas apropriadas (um por gaiola) em condições de temperatura (22 1ºC) e humidade (50 10%) controlada e ciclos de luz/escuro de 12 horas diários, com dieta sintética de manutenção para rato , IPM-R20 (Letica, Espanha). Tanto a alimentação como a água foram fornecidas ad libitum até às 24 horas anteriores ao dia das colheitas, altura em que os animais foram colocados em jejum, mantendo-se apenas a água de bebida. 119 Capítulo III _________________________________________________________________________ 2. Protocolo Experimental 2.1 Grupo de ratos Após um período de duas semanas para aclimatização e obtenção do peso mínimo exigido para a experimentação, os ratos foram divididos por forma randomizada em 4 grupos com pesos idênticos e submetidos diariamente, durante 4 semanas, às seguintes dietas: Grupo 1 – Grupo controlo com 10 ratos aos quais foram administrados sumo de laranja e fornecida água destilada ad libitum. Grupo 2 – Grupo ciclosporina (CsA) com 10 ratos aos quais foram administrados 5 mg/Kg/dia de ciclosporina A (Sandimmune Neoral®, Sandoz Pharma, Basel, Suiça) diluída em sumo de laranja e fornecida água destilada ad libitum. Grupo 3 – Grupo L-arginina com 10 ratos aos quais foram administrados sumo de laranja e fornecida água destilada com L-Arg. (1,25 g/L) ad libitum. Grupo 4 – Grupo L-arginina + CsA com 10 ratos aos quais foram administrados 5 mg/Kg/dia de ciclosporina A (Sandimmune Neoral®, Sandoz Pharma, Basel, Suiça) diluída em sumo de laranja e fornecida água destilada com L-Arg. (1,25 g/L) ad libitum. 120 Parte Experimental _________________________________________________________________________ 2.2 Doses administradas Neste modelo experimental (ratos Wistar machos), foi escolhida a via oral para administração da CsA, na dose de 5 mg/Kg/dia, a qual corresponde aos valores farmacocinéticos normalmente obtidos em doentes sujeitos ao tratamento com uma “dose de manutenção” deste imunossupressor. Tal dose é assim designada por corresponder à chamada a “concentração de vale”, de aproximadamente 0,1 M, que se mantém durante 20-22 horas. O fármaco foi administrado durante quatro semanas, uma vez que em estudos preliminares já publicados (Reis, tese de mestrado 1999; Tavares, tese de doutoramento 1999) se encontrava hipertensão arterial e diversas alterações bioquímicas decorrido este período de tempo. A administração oral de ciclosporina A e/ou de sumo de laranja foi realizada através de uma cânula esofágica, no final da tarde e sempre à mesma hora. Nos estudos in vitro foi escolhida a dose de 0,1 M que, como atrás se disse, corresponde à concentração atingida, numa toma diária, após a estabilização dos processos de distribuição/metabolização da CsA no sangue (concentração de “vale”). A solução padrão de ciclosporina foi preparada por diluição com DMSO A dose e o processo de administração de L-arginina (1,25 g por litro de água) foi escolhida de acordo com dados descritos na literatura consultada (Ashab e col., 1995; Yang e col., 1998). 121 Capítulo III _________________________________________________________________________ 2.3 Caracterização do modelo animal experimental Antes do início do tratamento (semana 0) e no final deste (semana 4) cada um dos ratos foi submetido às seguintes determinações: A) peso corporal; B) hemograma; C) pressão arterial e frequência cardíaca (esfigmomanometria a nível da artéria da cauda do rato). A) Peso dos ratos O peso corporal dos diferentes grupos de ratos foi avaliado antes de se iniciar o período de tratamento, para que os ratos incluídos no estudo tivessem o peso requerido como média e, depois, se pudesse avaliar a evolução no final do tratamento, isto é, às quatro semanas (Tabela 1). Tabela 1 Peso corporal (em gramas) dos grupos de ratos sujeitos aos diferentes tratamentos, no início (semana 0) e no final do estudo (semana 4). Semanas Controlo CsA L-Arg. L-Arg+CsA 0 296 7 313 6 339 5 339 7 4 324 10 =28 320 4 =7 377 7 =38 Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n = 10, para cada grupo). 122 348 9 =9 Parte Experimental _________________________________________________________________________ Com os resultados obtidos, verifica-se um aumento do peso do grupo controlo e no grupo de ratos aos quais foi fornecido um aporte exógeno de L-arginina (1,25 gr/L), na água de bebida. Nos ratos tratados apenas com a CsA 5 mg/Kg/dia ou com CsA 5 mg/Kg/dia e Larginina (1,25 gr/L), na água de bebida, não se registou uma variação significativa do peso ao longo das quatro semanas de duração do estudo (Tabela 1). A diminuição no ganho de peso já foi previamente reconhecida como um efeito secundário da administração de CsA tanto em humanos como em animais (Gerkens e col., 1984; McCauley e col., 1987; Reis, tese de mestrado 1999; Tavares, tese de doutoramento 1999). Tal efeito pode ser devido a uma redução no aporte de alimentos (não determinado neste estudo), mas este facto não parece ser a causa , já que os estudos de Natelson e col. (1992) descrevem que a privação parcial crónica de alimentos foi um factor que contribuiu para a redução da pressão arterial. Tal efeito pode ser devido a um efeito catabólico do fármaco como sugerido pelo aumento da ureia plasmática (Roullet e col., 1994). Assim, é possível que o fármaco diminua a absorção intestinal de um nutriente crítico para o controlo da pressão sanguínea, como o cálcio e o magnésio, contribuindo para o aumento desta. Além disso, o menor peso corporal dos ratos tratados relativamente aos ratos controlo poderá ficar a dever-se a uma diminuição da massa muscular, uma hipótese com alguma relevância, já que a simples observação dos ratos permitia visualizar uma atrofia muscular nos dois grupos de ratos tratados com CsA. 123 Capítulo III _________________________________________________________________________ B) Parâmetros hematológicos 1 - Metodologia Na determinação dos principais parâmetros hematológicas efectuaram-se medições do plaquetócrito, do número de plaquetas, do volume plaquetar médio, do coeficiente de variação plaquetar e do hematócrito no sangue de ratos controlo e no sangue dos ratos sujeitos aos diferentes tratamentos no início (semana 0), ao fim de duas semanas de tratamento (semana 2) e no final do estudo (semana 4). O sangue foi colhido da veia jugular direita dos ratos, previamente anestesiados através de injecção intraperitoneal de 2 ml/Kg de uma solução 2:1 (v:v) de 50 mg/ml de cetamina (Ketalar®, Park-Davis) em clorpromazina a 2,5% (Largactil, Rhône-Poulenc), para seringas com ACD 3,2% (w/v) (0,1 ml/ml sangue), como anticoagulante, cuja composição é (em mM): (71) ácido cítrico, (85) citrato de sódio e (111) D-glucose. Após a colheita, o sangue foi transferido para tubos teste de polipropileno contendo EDTA trissódico, e os parâmetros hematológicos foram de imediato determinados num contador Coulter (Coulter, E.U.A.), cujo funcionamento se baseia no método da impedância eléctrica. Este estudo foi realizado em colaboração com o Laboratório de Hematologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra. 2 - Resultados e comentários A determinação dos principais parâmetros hematológicas: plaquetócrito, número de plaquetas, volume plaquetar médio, coeficiente de variação plaquetar e hematócrito fundamentou-se no facto de que a CsA pode produzir alterações do plaquetócrito, número de plaquetas, como se observa para os fármacos citostáticos em geral. Assim, poderíamos pensar que alguns dos efeitos da CsA nas plaquetas se poderem dever a uma diminuição do número de plaquetas e do plaquetócrito, e não a certos mecanismos plaquetares que esta possa alterar. 124 Parte Experimental _________________________________________________________________________ Contudo, em nenhum dos parâmetros hematológicos avaliados se verificaram alterações entre os diferentes grupos de ratos em nenhumas das semanas avaliadas . Tabela 2 Número de plaquetas, plaquetócrito, volume plaquetar médio, coeficiente de variação plaquetar e hematócrito em ratos controlo e em ratos tratados com ciclosporina, L-arginina e L-arginina + ciclosporina A nas semanas 0 e 4 de tratamento. CsA L-Arg. L-Arg. + CsA 615 13 611 13 609 15 613 13 4 609 20 607 18 611 18 609 23 0 0,28 0,01 0,28 0,01 0,30 0,01 0,26 0,02 (%) 4 0,30 0,01 0,28 0,02 0,32 0,01 0,27 0,02 VOLUME 0 5,2 0,2 5,2 0,2 5,3 0,2 5,4 0,1 MÉDIO (f L) 4 5,4 0,2 5,3 0,1 5,6 0,1 5,4 0,2 COEF. DE VAR. 0 15,9 0,3 16,0 0,3 16,2 0,1 16,0 0,2 (ratio) 4 16,1 0,2 16,3 0,2 16,5 0,1 16,3 0,1 HEMATÓCRITO 0 37,3 0,4 37,5 0,3 37,3 0,3 37,1 0,4 (%) 4 37,0 0,2 37,0 0,3 37,2 0,2 37,3 0,2 Parâmetro em estudo Semana Trata/o NÚMERO DE 0 PLAQUETAS (GL) PLAQUETÓCRITO Grupo Controlo PLAQUETAR PLAQUETAR Dados apresentados em médias e.p.m.(n = 10, para cada grupo).As diferenças entre duas médias foram avaliadas pelo teste do t de Student para observações emparelhadas ou nãoemparelhadas de acordo com a situação ou pelo teste de Fishers através da análise da 125 Capítulo III _________________________________________________________________________ varância de uma via (ANOVA). Os níveis de probabilidade inferiores a 0,05 (p0,05) foram considerados como estatisticamente significativos. 126 Parte Experimental _________________________________________________________________________ C) Pressão arterial 1 - Metodologia Neste estudo foi avaliada a pressão arterial sistólica, diastólica e média, assim como, a frequência cardíaca através de um método não invasivo como o método de “tail cuf” no início (semana 0) e no final do tratamento (semana 4), dos diferentes grupos de ratos em estudo após um período prévio de adaptação dos animais ao sistema de medição e às condições de quase total imobilidade dentro das caixas de contenção. A determinação dos diferentes parâmetros foi efectuada através do método oscilométrico, utilizando-se um equipamento LE 5001 (Letica, Espanha) na artéria da cauda do rato, a qual sendo uma artéria elástica com características semelhantes à artéria aorta é muito utilizada para a medição da pressão arterial. As medições foram realizadas em ratos conscientes, em condições de repouso para se evitar induzir qualquer tipo de “stress” nos animais, tendo-se submetido a cauda dos ratos a uma temperatura de cerca de 30ºC durante 20 minutos, para obter uma dilatação dos vasos periféricos. Foram efectuadas várias determinações consecutivas no mesmo animal a cada tempo e os resultados são expressos em média aritmética complementada com o intervalo de variação dos valores, em erro padrão da média. As diferenças entre duas médias foram avaliadas pelo teste do t de Student para observações emparelhadas ou não-emparelhadas de acordo com a situação ou pelo teste de Fishers através da análise da variância de uma via (ANOVA). Os níveis de probabilidade inferiores a 0,05 (p0,05) foram considerados como estatisticamente significativos. O número de determinações efectuadas para cada parâmetro é o indicado nos vários gráficos. Os resultados foram expressos em mmHg. 127 Capítulo III _________________________________________________________________________ 2 - Resultados e comentários 2.1 Pressão arterial sistólica (PAS) No início do estudo (semana 0), os valores obtidos da pressão arterial sistólica, equiparavam-se para os diferentes grupos de ratos (Fig. 2.1): grupo controlo: 148 ± 4,3 mmHg grupo CsA: 152 ± 3,5 mmHg grupo L-arginina: 153 ± 2,3 mmHg grupo L-arginina + CsA: 154 ± 4,7 mmHg No final do tratamento (semana 4), verificou-se um aumento da pressão arterial sistólica no grupo de ratos aos quais foi administrada a CsA relativamente ao controlo. No grupo de ratos aos quais apenas se administrou a L-arginina, não se verificou qualquer variação da PAS em relação aos valores do grupo de referência (controlo). No grupo de ratos aos quais foi administrada simultaneamente a CsA e a L-arginina não se verificaram alterações significativas da PAS relativamente ao grupo da CsA, ou seja, o tratamento com a L-arginina não preveniu o aumento da PAS induzido pela CsA (Fig. 2.1): 128 grupo controlo: 150 ± 3,2 mmHg grupo CsA: 173* ± 5,0 mmHg (p<0,05) grupo L-arginina: 155 ± 3,3 mmHg grupo L-arginina + CsA: 178 ± 7,1 mmHg Parte Experimental _________________________________________________________________________ P.A. Sistólica (mmHg) Controlo CsA L-Arg L-Arg+CsA 190 180 * 170 160 150 140 130 0 4 Semanas Fig. 2.1 Pressão arterial sistólica de ratos controlo, ratos administrados com (5 mg/Kg/dia) de CsA, ratos tratados com L-arginina (1,25 g/L) e de ratos administrados com CsA (5 mg/Kg/dia) e tratados com L-arginina (1,25 g/L), no início (semana 0) e no final do tratamento (semana 4). Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n=10 para cada grupo). *(p<0,05): grupos sujeitos aos diferentes tratamento vs respectivo controlo. 129 Capítulo III _________________________________________________________________________ 2.2 Pressão arterial diastólica (PAD) Os valores da pressão arterial diastólica obtidos na semana 0 foram também semelhantes para os quatro grupos de ratos (Fig. 2.2): grupo controlo: 73 ± 2,2 mmHg grupo CsA: 76 ± 2,2 mmHg grupo L-arginina: 72 ± 3,2 mmHg grupo L-arginina + CsA: 77 ± 2,2 mmHg Após 4 semanas de tratamento verificou-se um aumento da pressão arterial diastólica no grupo de ratos aos quais foi administrada a CsA. No grupo de ratos aos quais apenas se administrou a L-arginina, não se verificou qualquer variação da PAD em relação aos valores do grupo de referência (controlo). No grupo de ratos aos quais foi administrada simultaneamente a CsA e a L-arginina não se verificaram alterações significativas da PAD relativamente ao grupo da CsA, ou seja, o tratamento com a L-arginina não preveniu o aumento da PAD induzido pela CsA (Fig. 2.2): 130 grupo controlo: 76 ± 2,3 mmHg grupo CsA: 94* ± 2,2 mmHg (p<0,05) grupo L-arginina: 80 ± 2,4 mmHg grupo L-arginina + CsA: 86 ± 2,2 mmHg P.A. Diastólica (mmHg) Parte Experimental _________________________________________________________________________ Controlo CsA 110 L-Arg L-Arg+CsA 100 * 90 80 70 60 50 0 4 Semanas Fig. 2.2 Pressão arterial diastólica de ratos controlo, ratos administrados com (5 mg/Kg/dia de CsA), ratos tratados com L-arginina (1,25 g/L) e de ratos administrados com CsA (5 mg/Kg/dia) e tratados com L-arginina (1,25 g/L), no início (semana 0) e no final do tratamento (semana 4). Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n=10 para cada grupo). *(p<0,05): grupos sujeitos aos diferentes tratamento vs respectivo controlo. 131 Capítulo III _________________________________________________________________________ 2.3 Pressão arterial média (PAM) Em relação à pressão arterial média, verificou-se à semelhança do que já foi descrito para a PAS e PAD, que no início do tratamento, os valores da pressão arterial média, equiparavam-se para os quatro grupos de ratos (Fig. 2.3): grupo controlo: 107 ± 3,3 mmHg grupo CsA: 110 ± 2,3 mmHg grupo L-arginina: 108 ± 4,3 mmHg grupo L-arginina + CsA: 105 ± 1,3 mmHg Ao fim das quatro semanas de tratamento ocorreu um aumento significativo da pressão arterial média apenas no grupo de ratos tratados com CsA. A PAM do grupo ao qual apenas se administrou a L-arginina não apresentou qualquer variação, ao longo do tempo do estudo em relação aos valores do grupo de referência (controlo). No grupo de ratos aos quais foi administrada simultaneamente a CsA e a L-arginina não se verificaram alterações significativas da PAM relativamente ao grupo da CsA, ou seja, o tratamento com a L-arginina não preveniu o aumento da PAM induzido pela CsA (Fig. 2.3): 132 grupo controlo: 105 ± 3,4 mmHg grupo CsA: 131* ± 3,5 mmHg (p<0,05) grupo L-arginina: 116 ± 3,0 mmHg grupo L-arginina + CsA: 121 ± 3,2 mmHg Parte Experimental _________________________________________________________________________ Controlo CsA P.A. Média (mmHg) 140 * 130 L-Arg L-Arg+CsA 120 110 100 90 80 0 4 Semanas Fig. 2.3 Pressão arterial média de ratos controlo, ratos administrados com (5 mg/Kg/dia de CsA), ratos tratados com L-arginina (1,25 g/L) e de ratos administrados com CsA (5 mg/Kg/dia) e tratados com L-arginina (1,25 g/L), no início (semana 0) e no final do tratamento (semana 4). Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n=10 para cada grupo). *(p<0,05): grupos sujeitos aos diferentes tratamento vs respectivo controlo. 133 Capítulo III _________________________________________________________________________ 2.4 Frequência cardíaca Quando estudamos a frequência cardíaca, verificou-se que no início do tratamento, os valores da frequência cardíaca, eram semelhantes para os quatro grupos de ratos: grupo controlo: 328 ± 11,1 mmHg grupo CsA: 330 ± 9,1 mmHg grupo L-arginina: 328 ± 12,1 mmHg grupo L-arginina + CsA: 322 ± 11,2 mmHg Após o tratamento, não se registaram quaisquer alterações significativas nos valores da frequência cardíaca, para os quatro grupos de ratos (Fig. 2.4): 134 grupo controlo: 332 ± 10,2 mmHg grupo CsA: 341 ± 12,1 mmHg grupo L-arginina: 351 ± 13,3 mmHg grupo L-arginina + CsA: 351 ± 15,0 mmHg Frequência Cardíaca (bat./min.) Parte Experimental _________________________________________________________________________ Controlo CsA L-Arg L-Arg+CsA 380 360 340 320 300 280 0 4 Semanas Fig. 2.4 Frequência cardíaca de ratos controlo, ratos administrados com (5 mg/Kg/dia de CsA), ratos tratados com L-arginina (1,25 g/L) e de ratos administrados com CsA (5 mg/Kg/dia) e tratados com L-arginina (1,25 g/L), no início (semana 0) e no final do tratamento (semana 4). Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n=10 para cada grupo). 135 Capítulo III _________________________________________________________________________ A pressão arterial média (PAM) é obtida pela fórmula : PAM = PAD + 0,33 x (PASPAD). A PAS é a pressão arterial sistólica ou máxima que corresponde à sístole ventricular, dependendo essencialmente do débito cardíaco. A PAD representa a pressão arterial diastólica, ou mínima, e corresponde ao final da diástole, dependendo sobretudo da resistência vascular periférica, a qual por sua vez, depende da distensibilidade da parede dos vasos e/ou do desequilíbrio entre factores contracturantes e relaxantes. Actualmente, aquele que era um comportamento diverso entre os autores, passou a ser recentemente aceite por praticamente todos: a CsA aumenta a pressão arterial. Assim, tal como já anteriormente fora encontrado pelo nosso grupo de trabalho (Reis, tese de mestrado 1999 e Tavares, tese de doutoramento 1999), e em concordância com a generalidade dos estudos descritos na literatura acerca da hipertensão arterial induzida pelo tratamento com a CsA, verificou-se que o tratamento com CsA, na dose de 5 mg/Kg/dia, induziu um aumento da pressão arterial sistólica, da pressão arterial diastólica e da pressão arterial média, não ocorrendo qualquer variação da frequência cardíaca. Mais a pressão diastólica (aumento de cerca de 23% - grupo controlo: 76 ± 2,3 mmHg vs grupo CsA: 94 ± 2,2 mmHg) do que a pressão sistólica (aumento de cerca de 15% - grupo controlo: 150 ± 3,2 mmHg vs grupo CsA: 173 ± 5,0 mmHg). No entanto, considere-se quer a pressão arterial sistólica quer a pressão arterial diastólica, o aumento é significativo. Embora, não se tenha determinado os mecanismos subjacentes ao aumento da PAS, é de presumir que estes estejam relacionados com o aumento do volume sistólico, tanto mais que a frequência cardíaca não foi influenciada pela CsA (frequência cardíaca - grupo controlo: 332 ± 10,2 mmHg vs grupo CsA: 341 ± 12,1 mmHg). O aumento da PAS e a ausência de alterações significativas na frequência cardíaca, pode sugerir a existência de uma alteração do volume sistólico, facto que por sua vez poderá indiciar um maior trabalho cardíaco. Além deste facto, ao verificarmos um aumento simultâneo da PAD podemos pressupor que a CsA na dose de 5 mg/Kg/dia ao diminuir a distensibilidade arterial, aumentará a resistência vascular periférica, o que também deve desempenhar um papel importante na elevação da pressão arterial. 136 Parte Experimental _________________________________________________________________________ A L-arginina não apresenta um efeito directo na pressão arterial média (grupo controlo: 105 ± 3,4 mmHg vs grupo L-Arg.: 116 ± 3,0 mmHg) ou na frequência cardíaca (grupo controlo: 332 ± 10,2 mmHg vs grupo CsA: 351 ± 13,3 mmHg). No grupo de ratos aos quais se forneceu antecipadamente um suplemento exógeno de L-arginina e que foram depois tratados durante 4 semanas com CsA e Larginina, verificou-se que o aumento da PAS (grupo controlo: 150 ± 3,2 mmHg vs grupo L-Arg. + CsA: 178 ± 7,1 mmHg) não difere do induzido unicamente pela CsA (grupo controlo: 150 ± 3,2 mmHg vs grupo CsA: 173 ± 5,0 mmHg). Que este efeito se deverá à incapacidade da L-arginina para contrariar esse aumento parece ser evidenciado pela semelhança da PAS entre o grupo controlo e o grupo da L-arginina (grupo controlo: 150 ± 3,2 mmHg vs grupo L-Arg.: 155 ± 3,3 mmHg). O mesmo não parece acontecer com a PAD, visto que, quando se adicionam os dois tratamentos, o aumento da PAD (grupo controlo: 76 ± 2,3 mmHg vs grupo L-Arg. + CsA: 86 ± 2,2 mmHg) embora não seja anulado é inferior aquele que se verifica com o uso isolado da CsA (grupo controlo: 76 ± 2,3 mmHg vs grupo CsA: 94 ± 2,2 mmHg). A L-arginina tende a contrariar o aumento da PAD induzido pela CsA. Assim, parece que a L-arginina não influencia o aumento da PAS mas sim o da PAD. 137 Capítulo III _________________________________________________________________________ II O sistema NO:GMP Célula Endotelial L-Arg NOSi NOSc Plaquetas + NO ? ? NO GMPc + NO GTP ? GCs GMPc ? Célula Muscular Lisa Controlo CsA L-Arg. L-Arg.+CsA ? Reactividade Plaquetar Relaxamento Vascular Sistema NO:GMPc A - Introdução O NO no sistema cardiovascular desempenha um papel fundamental mantendo os vasos sanguíneos num estado dilatado e mantendo a superfície do endotélio como não trombogénica. O NO estimula a guanilciclase solúvel através da interacção com o seu centro heme, resultando na formação de GMPc. O aumento do GMPc leva subsequentemente à vasodilatação e à inibição da agregação das plaquetas. 138 Parte Experimental _________________________________________________________________________ Muitos dados apoiam um papel para o NO nos efeitos descritos para a CsA. De facto, a inibição da NOS em ratos normais produz uma vasoconstrição generalizada, um aumento da pressão sanguínea e alterações nos electrólitos urinários, efeitos semelhantes ao observados com o tratamento pela CsA. Além disso, com a inibição do NO através de estudos com inibidores das NOS em humanos saudáveis, verificou-se que estes desencadeavam um aumento significativo na pressão arterial (Bech, Nielsen e Pederson, 1996; Berger e col., 1998; Hansen e col., 1999; Haynes e col., 1993) A diminuição de NO pode determinar quer o aumento da resistência vascular periférica quer o enfraquecimento da resposta aos agentes dependentes do endotélio. A hipótese de uma possível inibição dos mecanismos vasodilatadores leva a pensar que a CsA deve ter um efeito sobre o endotélio vascular que é o principal local de formação de metabolitos vasodilatadores. Um factor chave dos mecanismos que poderão estar implicados na hipertensão arterial induzida pela CsA parece ser a alteração da reactividade vascular e o desequilíbrio do balanço entre factores vasoconstritores e factores vasodilatadores. De facto, ao longo do tempo têm sido fortalecidas as evidências que sugerem a injúria e a disfunção endotelial como causa central das alterações renais e circulatórias induzidas pela CsA. Particularmente, parece que a CsA diminui o relaxamento dependente do endotélio numa grande variedade de modelos in vivo, ex vivo e in vitro, assim como em preparações vasculares de diferentes tamanhos e características funcionais. Estas incluem: animais intactos tratados com a CsA (Gallego e col., 1993); anéis de aorta de animais aos quais foi previamente administrada a CsA (Mikkelsen e col., 1992); anéis aórticos normais incubados num meio que contém CsA (Rego e col., 1990b); artérias femorais de ratos tratados com CsA, leitos mesentéricos vasculares perfundidos com CsA e arteríolas subcutâneas humanas estimuladas com CsA (Gallego e col., 1994; Rego e col., 1990a; Richards, Poston e Hilton, 1989; Roullet e col., 1994; Sudhir e col., 1994; Takenaka Hashimoto e Epstein, 1992). Uma vez que o NO tem sido implicado como um mediador central das alterações hemodinâmicas microvasculares associadas à hipertensão (Vallance, Collier e Moncada, 1989), tem sido colocada a hipótese que a CsA deve interferir com a produção e/ou a acção 139 Capítulo III _________________________________________________________________________ do principal factor de relaxamento derivado do endotélio, o NO, e tal facto deve ser importante na resposta vasoconstritora à CsA. Além disso, variados grupos de investigação têm verificado a existência de um enfraquecimento do relaxamento dependente do endotélio, o que sugere que este fármaco pode interferir com o normal funcionamento da via da L-Arginina:NO. Contudo o passo preciso da interferência ainda não se encontra estabelecido e permanecem variadas possibilidades, entre as quais a possibilidade de existir uma diminuição da quantidade de substrato disponível (L-arginina) ou ocorrer uma alteração na via efectora do GMPc. Alguns dos estudos já realizados demonstraram que a CsA induz uma diminuição na produção de NO em diferentes modelos animais e sistemas, embora os resultados obtidos sejam muitas vezes contraditórios (Gallego e col., 1993; Khalil e col., 1996; O’Neil e col., 1991; Oriji e Keiser, 1998; Oriji e Keiser, 1999; Sudhir e col., 1994; Vaziri e col., 1998) . No entanto, não existe consensualidade nos estudos descritos na literatura a respeito da relação: alteração na via da L-arginina:NO / diminuição do relaxamento vascular e aumento da reactividade vascular. Já tem sido verificada em alguns estudos a inexistência de qualquer alteração ou até mesmo, um aumento da formação de NO ( Assis, Monteiro e Seguro, 1997; Bobadilla e col., 1994; Hansen e col., 1999; O’Neil e col., 1991; Stroes e col., 1997), assim como um aumento da actividade da NOS (Stroes e col., 1997). Alguns destes autores sugerem mesmo que o aumento da produção de NO pode actuar como uma resposta contra-reguladora perante o aumento da vasoconstrição induzida pela CsA, o qual está associado tanto à nefrotoxicidade como à hipertensão (Assis, Monteiro e Seguro, 1997; López-Ongil e col., 1996; Stroes e col., 1997). Também tem sido sugerido que a diminuição da expressão e da actividade da NOS, referida em alguns estudos com células vasculares e renais (Lee e col., 1999; Marumo e col., 1995; Vaziri e col., 1998), possa explicar a diminuição da síntese de NO. Tem sido descrito que a CsA inibe tanto a actividade (Conde e col., 1995) como a expressão da enzima indutível (Kunz e col., 1995). A CsA pode limitar a quantidade disponível de substrato para a NOS, pode inibir competitivamente a NOS e tal facto poderá ser contornado com a presença de um excesso de substrato. 140 Parte Experimental _________________________________________________________________________ Contudo, não se pode excluir um efeito tóxico directo da CsA nas células do músculo liso vascular e nos seus componentes contrácteis. A alteração da reactividade vascular e da reactividade plaquetar são dois fenómenos centrais para a oclusão dos vasos sanguíneos. De facto, existe a possibilidade das plaquetas estarem também envolvidas no aumento da pressão arterial induzida pela CsA, com base nos variados mecanismos propostos para o aumento da vasoconstrição. A maior parte destes e de outros estudos demonstram que a L-arginina pode prevenir e/ou reverter a diminuição da síntese de NO e o enfraquecimento do relaxamento dependente do endotélio induzido pela CsA, factores associados à nefrotoxicidade e à hipertensão (Amore e col., 1995; Andoh, Burdmann e Bennett, 1997; Auch-Schwelk e col., 1993; Kim e col., 1996; Lee e col., 1999; Mathieu e col., 1997; Orijii e Keiser, 1998; Orijii e Keiser, 1999; Yang e col., 1998). Uma deficiente produção de GMPc é um dos mecanismos fisiopatológicos fundamentais nos modelos genéticos de hipertensão, tanto no modelo de rato espontaneamente hipertenso como na hipertensão essencial no homem (Rego e col., 1990a). De facto, estes autores descrevem uma diminuição do conteúdo de GMPc na aorta de ratos tratados com a CsA e uma diminuição na produção de GMPc pelos grandes vasos desencadeada in vitro pelo fármaco, o que sugere que a CsA pode diminuir o relaxamento independente do endotélio dos vasos de resistência ao interferir com a via do GMPc. Os estudos de Caramelo e col. (1995) também corroboram esta opinião, já que estes verificaram que os vasos obtidos de animais tratados com CsA apresentam uma produção diminuída de GMPc. Mas, alguns dos resultados, total ou parcialmente contraditórios, descritos nos estudos sobre o assunto a respeito do efeito da CsA na via da L-arginina:NO:GMPc podem ser devidos a diferenças nas condições experimentais. Existem, pelo menos, quatro variáveis importantes que podem influenciar esta grande variabilidade de resultados: o modelo experimental utilizado, a via de administração, a dose de CsA administrada e a duração do tratamento. 141 Capítulo III _________________________________________________________________________ B - Metodologia 1. Determinação dos teores arteriais de NO A medição de NO da aorta nas diferentes condições experimentais foi feita por recurso a um método que tem sido muito utilizado por outros autores, método de Griess (Green e Col., 1982), que se baseia nas propriedades apresentadas pelo NO em solução aquosa. O NO é quimicamente instável, aos valores fisiológicos de pH, apresentando uma semi-vida de 3 a 5 segundos e em solução aquosa 90% do NO formado é espontaneamente convertido em ião nitrito (NO2-), o principal produto estável resultante da oxidação do NO, sendo apenas uma pequena porção convertida em ião nitrato (NO3-) (Feelisch e Noack, 1987). O método de Griess baseia-se na determinação da quantidade de ião nitrito que forma com o reagente de Griess um composto com propriedades cromóforas (H2NC10H6NN-C6H4SO3H). Assim, este método consiste numa reacção de diazotação na qual os nitritos formados interagem com a naftiletilenodiamina em meio acídico, produzindo um composto rosa que absorve a um comprimento de onda na região dos 540 nm, presente no meio sobrenadante em estudo. Como padrões, foram utilizadas soluções de nitrito de sódio de concentrações conhecidas, o que permite traçar uma curva de calibração e quantificar indirectamente o NO. No final de cada série de tratamento foi realizado o estudo ex vivo com isolamento da artéria aorta torácica de cada rato. Os ratos foram sacrificados por distensão da cervical. A aorta torácica dos ratos foi removida imediatamente após o sacrifício com cuidado para evitar o estiramento vascular e o vaso foi colocado numa placa de Petri com solução salina fisiológica (PSS), fria, gaseificada com uma mistura de 95% de O2 e 5% de CO2, cuja composição (em nmol/L) é: (140) NaCl, (4.6) KCl, (2) CaCl2, (10) MgCl2, (10) HEPES, (1) D-glucose, pH 7,4. A artéria foi limpa de gorduras e de tecido conjuntivo adjacente, com os devidos cuidados para que não fosse danificado o endotélio. De seguida, esta foi cortada e dividida em vários segmentos, tendo sido dois destes segmentos utilizados, cada um com aproximadamente 4-5 mm de espessura, para os estudos do NO arterial. Num deles foi removido o endotélio por fricção cuidadosa da superfície da íntima com a passagem de um cotonete húmido no sentido do comprimento, 142 Parte Experimental _________________________________________________________________________ para a determinação do conteúdo de NO na aorta sem endotélio. A ausência de endotélio foi confirmada por observação das tiras através da microscopia electrónica. Assim, após obtenção dos anéis de aorta, estes foram deixados em repouso até estabilização num banho de orgãos, com 15 ml cada, durante 2 horas aquecidos a 37ºC por circulação de água contendo uma solução de Krebs-Henseleit gaseificada com um mistura de 95% de O2 e 5% de CO2 com a seguinte composição (em mM): (118) NaCl, (4.7) KCl, (2.5) CaCl2, (1.2) KH2PO4, (1.2) MgCl2, (25) NaHCO3, (0.01) Na2-EDTA, (11.1) glucose e H2O q.b.p. 1L (pH 7,4). O meio foi renovado cada hora e no final da incubação os tecidos mantidos no gelo foram homogeneizados num homogenizador rotativo. Seguidamente, os homogeneizados foram centrifugados a 2500 g durante 30 minutos a 4ºC. Os nitritos nos sobrenadantes aórticos foram determinados através do método do reagente de Griess. A 1 ml de amostra foi adicionado 1 ml do reagente de Griess, previamente preparado da seguinte forma: N-1-naftiletilenodiamina a 0,1% em H3PO4 a 5% e sulfanilamida a 1% em H3PO4 a 5% na proporção de 1:1. Após um período de 10 minutos de incubação à temperatura ambiente para a formação de um cromófero, a absorvância foi lida a 540 nm num espectofotómetro (Shimadzu, UV-Visible Recording Spectrophotometer UV-2100). Paralelamente foi efectuada uma curva padrão com várias concentrações conhecidas de nitrito de sódio (NaNO2) (nm/ml) e a concentração de nitritos foi calculada por interpolação nesta curva padrão. Nas determinações espectofotométricas foram utilizadas cuvetes especiais de quartzo com 2 ml de capacidade para se “aumentar” a concentração de nitrito e aumentarmos a sensibilidade do ensaio. A concentração da proteína solúvel em cada amostra foi determinada pelo método de ligação ao azul de Coomassie – Método de Sedmak, usando como padrão a albumina bovina sérica (BSA). A curva de calibração foi construída a partir de uma solução padrão de BSA a 0,1%. O procedimento foi idêntico tanto para a determinação da proteína das amostras como da curva de calibração. O volume das amostras (25 l) e do BSA foi ajustado até 1 ml com água, adicionando-se de seguida 2 ml do reagente de Sedmak diluído na proporção de 30 ml de reagente de Sedmak concentrado para 70 ml de solvente (HClO4 0,3 M). A composição de reagente de Sedmak concentrado é a que a seguir se 143 Capítulo III _________________________________________________________________________ indica: 0,06% de Coomassie blue G 250 em 3% de HClO4 (w/v). Após agitação, a amostra foi incubada durante 15 minutos à temperatura ambiente, determinando-se de seguida a absorvância das amostras, a 620 nm, num espectofotómetro de UV-visível. Os resultados são expressos em média aritmética complementada com o intervalo de variação dos valores, em erro padrão da média. Alguns dos resultados são apresentados em % em relação a determinado grupo, devidamente indicado. As diferenças entre duas médias foram avaliadas pelo teste do t de Student para observações emparelhadas ou não-emparelhadas de acordo com a situação ou pelo teste de Fishers através da análise da variância de uma via (ANOVA). Os níveis de probabilidade inferiores a 0,05 (p0,05) foram considerados como estatisticamente significativos. O número de determinações efectuadas para cada parâmetro é o indicado nos vários gráficos. Os resultados foram expressos em pg por g de proteína. 144 Parte Experimental _________________________________________________________________________ 2. Determinação dos teores arteriais de GMPc Os segmentos arteriais obtidos como descrito anteriormente e após o procedimento de lavagem foram divididos em anéis com um tamanho de aproximadamente 4-5 mm de espessura. Estes foram deixados em repouso até estabilização, num banho de orgãos, com 15 ml cada, durante 2 horas, aquecidos a 37ºC por circulação de água, contendo uma solução de Krebs-Ringer gaseificada com um mistura de 95% de O2 e 5% de CO2 com a seguinte composição (em mM): (118) NaCl, (4.7) KCl, (2.5) CaCl2, (1.2) KH2PO4, (1.2) MgCl2, (25) NaHCO3, (0.01) Na-EDTA, (1) glucose e H2O q.b.p. 1L (pH 7,4), contendo indometacina (5 M). O meio foi renovado cada hora e no final da incubação o meio foi substituído por tampão com igual composição ao qual foi adicionado IBMX (2 mM), um inibidor da fosfodiesterase do GMPc para prevenir a degradação expontânea do nucleótido. Após 40 minutos de incubação, o tecido foi rapidamente congelado em azoto líquido. O tecido congelado foi mantido no gelo e homogeneizado num homogeneizador rotativo. Os homogeneizados foram incubados durante 1 hora a 4ºC com ácido perclórico (0,5 M) e no final foram centrifugados a 12,000 g durante 5 minutos a 4ºC e neutralizados com K3PO4 (1 M) (Moro e col.,1996 ). Após decantação do sobrenadante no qual se encontrava o extracto de GMPc, este foi evaporado à secura a 23ºC num banho de areia. O extracto seco foi reconstituído em tampão acetato de sódio (50mM, pH 6,2) e acetilado com uma solução de anidrido acético:trietilamina (1:2, v/v) antes de ser analisado. As concentrações de GMPc nos sobrenadantes foram determinadas através de um método enzimoimunológico utilizando um “Kit” específico da RD Systems após acetilação das amostras e padrões de acordo com as instruções do fabricante. A leitura foi efectuada em sistema de micro-ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Mios Merck e os níveis de GMPc, calculados a partir da curva de calibração efectuada para cada “Kit”, foram expressos em pmol de GMPc por g de proteína por segmento vascular. A concentração da proteína solúvel em cada amostra foi determinada pelo método de ligação ao azul de Coomassie , utilizando a albumina bovina sérica como padrão, o qual já foi descrito anteriormente. 145 Capítulo III _________________________________________________________________________ Os resultados são expressos em média aritmética complementada com o intervalo de variação dos valores, em erro padrão da média. Alguns dos resultados são apresentados em % em relação a determinado grupo, devidamente indicado. As diferenças entre duas médias foram avaliadas pelo teste do t de Student para observações emparelhadas ou não-emparelhadas de acordo com a situação, ou pelo teste de Fishers através da análise da variância de uma via (ANOVA). Os níveis de probabilidade inferiores a 0,05 (p0,05) foram considerados como estatisticamente significativos. O número de determinações efectuadas para cada parâmetro é o indicado nos vários gráficos. 146 Parte Experimental _________________________________________________________________________ 3. Determinação dos níveis plaquetares de NO 3.1 Ensaios ex vivo O sangue foi obtido da veia jugular direita dos ratos, previamente anestesiados através de injecção intraperitoneal de 2 ml/Kg de uma solução 2:1 (v:v) de 50 mg/ml de cetamina (Ketalar®, Park-Davis) em clorpromazina a 2,5% (Largactil, Rhône-Poulenc), para seringas com ACD 3,2% (w/v) (0,1 ml/ml sangue), como anticoagulante, cuja composição é (em mM): (71) ácido cítrico, (85) citrato de sódio e (111) D-glucose. Após a colheita, o sangue foi transferido para tubos teste de silicone e analisado de imediato. As amostras foram centrifugados a 160 g durante 10 minutos, à temperatura ambiente, para obtenção do plasma rico em plaquetas (PRP), numa centrífuga refrigerada. A partir do PRP, por centrifugação a 900 g durante 15 minutos, obteve-se um precipitado de plaquetas (“pellet”). Ao “pellet” de plaquetas foi de seguida adicionado 1ml de tampão de lavagem cuja composição (em mM) é a seguinte: (90) NaCl, (5) KCl, (36) ácido cítrico, (5) glucose e (10) EDTA e H2O q.b.p. 1L (pH 6,5) e centrifugado a 800 g durante 15 minutos, à temperatura ambiente. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi de novo ressuspendido em igual volume da mesma solução de lavagem e o processo de centrifugação e separação foi repetido, num total de duas lavagens. Após a completa eliminação do tampão de lavagem, o “pellet” de plaquetas foi ressuspendido em 1100 l de tampão Tyrode modificado com a seguinte composição (em mM): (134) NaCl, (3) KCl, (12) NaHCO3, (1) MgCl2.6H2O, (0.42) NaH2PO4, (1.8) CaCl2, (5) Hepes, (0.56) glucose e H2O q.b.p. 1L (pH 7,4) (Shinya e col., 1996). Retiraram-se 100 l para contagem do número de plaquetas e as amostras foram incubadas durante 2 horas a 37ºC. No final da incubação, a reacção foi terminada no gelo e a amostra foi centrifugada a 3600 g durante 15 minutos para se obter o sobrenadante (conteúdo efluído), no qual se determinou a quantidade de nitritos libertados durante o tempo de incubação. O “pellet” de plaquetas obtido foi ressuspenso em 1000 l água ultra-pura e sonicado durante 10 minutos, após o que a amostra foi centrifugada a 3600 g durante 15 minutos para se obter 147 Capítulo III _________________________________________________________________________ um segundo sobrenadante, no qual foram quantificados os nitritos não libertados durante o tempo de incubação (conteúdo intraplaquetar). A formação de NO foi avaliada pelo doseamento da produção de nitritos através da Reacção de Griess, já anteriormente descrita. Assim, a 1 ml de amostra foi adicionado 1 ml do reagente de Griess, previamente preparado da seguinte forma: N-1-naftiletilenodiamina a 0,1% em H3PO4 a 5% e sulfanilamida a 1% em H3PO4 a 5% na proporção de 1:1. Após um período de 10 minutos de incubação à temperatura ambiente para a formação de um cromóforo, a absorvância foi lida a 540 nm num espectofotómetro (Shimadzu, UV-Visible Recording Spectrophotometer UV-2100). Paralelamente, foi efectuada uma curva padrão com várias concentrações conhecidas de nitrito de sódio (NaNO2) (nm/ml) e a concentração de nitritos foi calculada por interpolação nesta curva padrão. Os valores de nitritos reflectem a actividade da sintase do NO já que não existe outra fonte potencial deste ião. As medições espectofotométricas foram realizadas em cuvetes especiais, de quartzo com 2 ml de capacidade, para se “aumentar” a concentração de nitrito e “melhorar” a sensibilidade do ensaio. Os resultados são expressos em média aritmética complementada com o intervalo de variação dos valores, em erro padrão da média. As diferenças entre duas médias foram avaliadas pelo teste do t de Student para observações emparelhadas ou não-emparelhadas, de acordo com a situação, ou pelo teste de Fishers através da análise da variância de uma via (ANOVA). Os níveis de probabilidade inferiores a 0,05 (p0,05) foram considerados como estatisticamente significativos. O número de determinações efectuadas para cada parâmetro é o indicado nos vários gráficos. Os resultados são expressos em nmol/109plaquetas. 148 Parte Experimental _________________________________________________________________________ 3.2 Ensaios in vitro Nos estudos in vitro foram realizados os mesmos procedimentos, diferindo apenas na incubação de várias suspensões plaquetares às quais foram adicionadas as seguintes substâncias: CsA 0,1 M, dissolvida em dimetilsulfóxido; L-arginina 0,2 mM, o substrato da via da L-Arg:NO, como controlo positivo da produção de NO; LPS 1 Mml-1 e IL-1 20 ngml-1, indutores da sintase indutível do NO, como controlo positivo da produção de NO; L-NNA 0,1 mM, um inibidor da NOS, com uma maior “selectividade” para a sintase constitutiva; aminoguanidina 2 mM um inibidor da NOS, com uma maior “especificidade” para a sintase indutível; ou não ( tubo controlo). 149 Capítulo III _________________________________________________________________________ 4. Determinação dos níveis plaquetares de GMPc O sangue recolhido da jugular do rato, em ACD 3,2% (w/v) 1/10 em tubos teste de silicone foi centrifugado de imediato a 120 g durante 20 minutos à temperatura ambiente para obtenção do plasma rico em plaquetas (PRP) numa centrífuga refrigerada. O PRP foi incubado a 37ºC durante 5 minutos com 100 M de AAS (para prevenir a formação de prostaglandinas, endoperóxidos e tromboxanos), e centrifugado a 900 g durante 10 minutos para obtenção do “pellet” de plaquetas. O “pellet” de plaquetas foi de seguida ressuspenso em 1ml de tampão Tyrode-Hepes modificado cuja composição (em mM ) é a seguinte: (134) NaCl, (3) KCl, (12) NaHCO3, (1) MgCl2.6H2O, (0.34) NaH2PO4, (5) Hepes, (5) D-Glucose, H2O q.b.p. 1L (pH 7,4). Ao tampão foi adicionado apirase (20 g ml-1) e posteriormente incubado durante 2 minutos com IBMX (10 M), um inibidor da fosfodiesterase, para se impedir qualquer degradação expontânea dos nucleótido. Foram retirados 100 l para contagem do número de plaquetas e a uma alíquota de 200 l da amostra foram adicionados 1800 l de uma solução de etanol a 72%, aguardouse 5 minutos à temperatura ambiente, após o que se procedeu a uma centrifugação a 1200 g durante 15 minutos a 4ºC. Após decantação do sobrenadante no qual se encontrava o extracto de GMPc, este foi evaporado à secura a 23ºC num banho de areia. O extracto seco foi reconstituído em tampão acetato de sódio (50mM, pH 6,2) e acetilado com uma solução de anidrido acético:trietilamina (1:2, v/v) antes de ser analisado. As concentrações de GMPc nos sobrenadantes foram determinadas através de um método enzimoimunológico utilizando um “Kit” específico da RD Systems, após acetilação das amostras e padrões de acordo com as instruções do fabricante. A leitura foi efectuada em sistema de micro-ELISA Mios Merck e os níveis de GMPc, calculados a partir da curva de calibração efectuada para cada “Kit”, foram expressos em pmol de GMPc por 109plaquetas. 150 Parte Experimental _________________________________________________________________________ C - Reagentes Todos os reagentes foram obtidos através da Sigma Chemicals Co. (St. Louis, E.U.A.). Os kits de imunoensaio foram adquiridos na R&D Systems (McKindley Place, E.U.A.). Em todas as preparações (soluções e tampões) foi utilizada água ultra-pura. O principio activo CsA foi gentilmente cedido pela NOVARTIS, Portugal. 151 Capítulo III _________________________________________________________________________ D - Resultados 1. Determinação dos teores arteriais de NO A - Efeitos do tratamento com a CsA A administração diária de 5 mg/Kg de CsA, durante o período do tratamento (4 semanas), conduziu a uma diminuição do conteúdo de monóxido de azoto nos dois segmentos de aorta de rato estudados, quando comparado com os valores obtidos nos respectivos segmentos do grupo controlo (Fig. 1.1): a) quer na artéria total (segmento vascular integro): grupo controlo: 6,6 0,5 pggprot-1 grupo CsA: 4,6* 0,7 pggprot-1 (p<0,05) NO Arterial (pg/gprot.) Aorta Total 8 30% 6 * 4 100% 70% 2 0 Controlo CsA Fig. 1.1 Teor arterial total de NO de ratos controlo e de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia), após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao grupo controlo. * (p<0,05) grupo CsA vs grupo controlo. 152 Parte Experimental _________________________________________________________________________ b) quer no segmento da artéria após remoção do endotélio, ainda que de forma tendencial: grupo controlo: 2,7 0,3 pggprot-1 grupo CsA: 2,0 0,2 pggprot-1 8 NO Arterial (pg/gprot.) Aorta sem endotélio 6 4 2 100% 74% 0 Controlo CsA Fig. 1.2 Teor de NO no segmento arterial desprovido de endotélio de ratos controlo e de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia), após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao grupo controlo. * (p<0,05) grupo CsA vs grupo controlo. Em termos percentuais, o tratamento com a CsA levou a uma diminuição de cerca de 30% (p<0,05) do conteúdo de NO na artéria total, se considerarmos que ao segmento total da aorta do grupo controlo: 6,6 ± 0,5 pggprot-1 correspondem 100% (Fig. 1.1). 153 Capítulo III _________________________________________________________________________ Verifica-se que na aorta do grupo controlo após remoção do endotélio o teor de NO ficou apenas em 41% do valor inicial (Fig. 1.3): segmento total do grupo controlo: 6,6 ± 0,5 pggprot-1 (100%) segmento da aorta desprovido de endotélio do grupo controlo: 2,7 ± 0,3 pggprot-1 (41%) Isto é, no grupo controlo com a remoção do endotélio perderam-se 3,9 pggprot-1 (59%) de NO presente no segmento vascular total, e no restante tecido vascular ficaram 2,7 pggprot-1 (41%) de NO residual. NO Arterial (pg/g prot.) Com Endotélio Sem Endotélio 8 6 4 100% 2 41% 0 Grupo Controlo Fig. 1.3 Relação entre o segmento total da artéria e o segmento desprovido de endotélio do conteúdo de NO arterial, no grupo de ratos controlo, após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao segmento total da artéria. 154 Parte Experimental _________________________________________________________________________ No grupo tratado com a CsA, com a remoção do endotélio perderam-se 2,6 pggprot-1 (56%) de NO encontrado no segmento vascular total e no restante tecido vascular ficaram 2,0 pggprot-1 (44%) de NO (Fig. 1.4): segmento total : 4,6 ± 0,7 pggprot-1 (100%) segmento desprovido de endotélio: 2,0 ± 0,2 pggprot-1 (41%) Com Endotélio Após remoção do Endotélio NO Arterial (pg/gprot.) 8 6 4 2 100% 41% 0 Grupo CsA Fig. 1.4 Relação do conteúdo de NO arterial entre o segmento total da artéria e o segmento desprovido de endotélio, no grupo de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao segmento total da artéria. Isto é, a quantidade de NO residual nos segmentos vasculares após a remoção do endotélio é em proporção semelhante à encontrada nos segmentos vasculares em que o endotélio não foi removido. 155 Capítulo III _________________________________________________________________________ Tal significará, por isso, muito provavelmente que a redução de 30% no conteúdo de NO no tratamento com a CsA se deverá à menor produção de NO endotelial, perda deste para o espaço vascular e/ou aumento da sua degradação. Distribuição Monóxido de Azoto Endotélio/Músculo liso NO Arterial (pg/gprot.) 8 6 4 2 E n d o t é l i o Músculo Liso 30% * 59% E n d o t é l i o 59% ** 57% ** ** 41% 43% 0 Efeito da CsA Controlo Músculo Liso CsA Fig. 1.5 Distribuição do teor de NO arterial entre o endotélio e o músculo liso no grupo de ratos controlo e no grupo tratado com CsA (5 mg/Kg/dia) após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao grupo controlo e em relação ao segmento total da artéria em cada grupo. * (p<0,05), grupo controlo. 156 ** (p<0,01) grupo CsA vs Parte Experimental _________________________________________________________________________ B- Efeitos do tratamento com a L-arginina No grupo de ratos tratados com a L-arginina (Fig. 1.6), verificou-se que em relação aos teores do grupo controlo, esta não alterava o conteúdo de NO no segmento total do vaso: grupo controlo: 6,6 ± 0,5 pggprot-1 grupo L-arginina: 6,0 ± 0,7 pggprot-1 mas a quantidade que se encontrava no endotélio era significativamente menor já que a maioria se virá a encontrar nos restantes tecidos vasculares (Fig. 1.7): grupo controlo: 2,7 ± 0,3 pggprot-1 grupo L-arginina: 4,5 ± 1,1 pggprot-1 NO Arterial (pg/gprot.) Aorta Total † 8 6 * 4 2 0 Controlo CsA L-Arg L-Arg + CsA Fig. 1.6 Teor arterial total de NO nos grupos de ratos: controlo, tratados com CsA (5 mg/Kg/dia), administrados com L-arginina (1,25 mg/L) e tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) e L-arginina (1,25 mg/L) no final do tratamento (4 semanas). Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). * (p<0,05) diferentes grupos vs grupo controlo; † (p<0,05) grupo tratado com CsA e L-arginina vs grupo CsA. 157 Capítulo III _________________________________________________________________________ Assim, após a remoção do endotélio a perda em NO (25%) (Fig. 1.7) foi menor à verificada no grupo controlo (59%)(Fig. 1.4) NO Arterial (pg/gprot.) Com Após remoção Endotélio do Endotélio 8 6 4 2 100% 75% 0 Grupo L-Arginina Fig. 1.7 Relação entre o segmento total da artéria e o segmento desprovido de endotélio do conteúdo de NO arterial, no grupo de ratos administrados com L-arginina (1,25 mg/L) após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao segmento total da artéria. Tal, pode-nos levar a pressupor que a L-arginina poderá levar a um maior fluxo de NO para as camadas subendoteliais e vasculares, para uma maior utilização deste a esse nível. 158 Parte Experimental _________________________________________________________________________ C- Efeitos do tratamento com L-arginina e CsA Quando os valores obtidos no grupo de ratos aos quais se administrou conjuntamente a CsA e a L-arginina são comparados com os valores do grupo da CsA, verifica-se que a nível da aorta total existem diferenças (Fig.1.6): grupo CsA: 4,6 ± 0,7 pggprot-1 grupo L-arginina + CsA: 6,7† ± 0,4 pggprot-1 (p<0,05) uma vez que a administração simultânea de L-arginina “impediu” a diminuição do conteúdo arterial de NO que ocorre no grupo da CsA. Isto é, a diminuição dos teores de NO encontrados para o grupo da CsA isoladamente foi completamente revertida quando se lhe associou a L-arginina. A remoção do endotélio nos grupos controlo e CsA resultou em idêntica percentagem nas duas camadas vasculares (59% no endotélio e 41% no músculo liso) (Fig. 1.3 e 1.4). Contudo, no grupo da L-arginina e CsA, o valor encontrado após a remoção do endotélio foi ainda ligeiramente inferior (perda de apenas 46%) (Fig. 1.8). 159 Capítulo III _________________________________________________________________________ NO Arterial (pg/gprot.) Com Após remoção Endotélio do Endotélio 8 6 4 100% 54% 2 0 Grupo L-Arginina + CsA Fig. 1.8 Relação do conteúdo de NO arterial entre o segmento total da artéria e o segmento desprovido de endotélio, no grupo de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) e L-arginina (1,25 mg/L) após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao segmento total da artéria. Ou seja, após remoção do endotélio, parece ocorrer um “impedimento”, ainda que apenas tendencial, para que o efeito da CsA se manifeste quando a L-arginina é administrada conjuntamente com a CsA: 160 grupo CsA: 2,0 ± 0,2 pggprot-1 grupo L-arginina + CsA: 3,6 ± 0,6 pggprot-1 Parte Experimental _________________________________________________________________________ 2. Determinação dos teores arteriais de GMPc Os teores arteriais de GMPc dos ratos tratados com CsA foram muito inferiores aos do grupo de ratos controlo. De facto, a administração diária de CsA, durante quatro semanas, conduziu à diminuição de cerca de 67% (p<0,01) do conteúdo de GMPc nos segmentos de aorta total, quando comparados com os do grupo controlo (Fig. 2.1): grupo controlo: 22,0 ± 2,2 pmolprot-1 (100%) grupo CsA: 7,2** ± 0,5 pmolprot-1 (33%) (p<0,01) Este comportamento está de acordo com a diminuição no conteúdo de NO que se verifica quando se compara o mesmo segmento do grupo controlo (6,6 ± 0,5 pggprot-1) (100%) e do grupo ao qual se administrou a CsA (4,6* ± 0,7 pggprot-1) (41%) (p<0,05) (Fig.1.6). No entanto, a percentagem perdida em GMPc (67%) é substancialmente maior do que a perda em NO (30%), sugerindo, uma vez mais, um efeito da CsA não apenas na síntese a nível endotelial como também nos processos que ocorrem no músculo liso GMPc Arterial (pmol/gprot.-1) vascular. 30 25 20 15 67 % 100 % 10 ** 5 33% 0 Controlo CsA Fig. 2.1 Teor arterial de GMPc de ratos controlo e de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao grupo controlo. ** (p<0,01) grupo tratado com CsA vs grupo controlo. 161 Capítulo III _________________________________________________________________________ No grupo de ratos ao qual se administrou L-arginina, não se verificaram alterações no conteúdo arterial de GMPc, em relação ao grupo controlo (Fig. 2.2): grupo controlo: 22,0 ± 2,2 pmolprot-1 grupo L-arginina: 23,7 ± 5,8 pmolprot-1 Quando os teores de GMPc do grupo da L-arginina + CsA são comparados com os obtidos no grupo ao qual se administrou somente CsA (Fig. 2.2): grupo da CsA: 7,2 ± 0,5 pmolprot-1 grupo da L-arginina + CsA: 24,2** ± 6,5 pmolprot-1(p<0,01) verifica-se que estes já apresentam diferenças significativas: parece que a L-arginina quando é administrada conjuntamente com a CsA não deixa esta “actuar”, ou seja a L-arginina impede a diminuição do conteúdo de GMPc arterial desencadeada pela CsA. 162 Parte Experimental _________________________________________________________________________ GMPc Arterial (pmol/gprot.) Controlo CsA L-Arg L-Arg+CsA 35 ** † 30 25 20 15 10 5 0 Fig. 2.2 Teor arterial de GMPc de ratos controlo, ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia), ratos administrados com L-arginina (1,25 mg/L) e de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) e L-arginina (1,25 mg/L), no final do tratamento (4 semanas). Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). ** (p<0,01) grupos tratados vs grupo controlo; † (p<0,05) grupo tratado com CsA e L-arginina vs grupo CsA. Tal comportamento, poderá sugerir que também a nível do GMPc, o principal sistema efector da acção do NO a nível vascular, a L-arginina conseguirá “neutralizar” o efeito da administração da CsA. 163 Capítulo III _________________________________________________________________________ 3. Determinação dos níveis plaquetares de NO 3.1 Ensaios ex vivo Antes do início do tratamento (semana 0), o teor de NO nas plaquetas dos ratos do grupo controlo era similar ao teor de NO nas plaquetas dos ratos que depois foram sujeitos aos diferentes tratamentos ao longo das quatro semanas de duração do estudo (Fig. 3.1): grupo controlo: 27,0 ± 1,9 nmol10-9plaq. grupo CsA: 25,9 ± 2,0 nmol10-9plaq. grupo L-arginina: 26,3 ± 2,1 nmol10-9plaq. grupo L-arginina + CsA: 28,0 ± 1,3 nmol10-9plaq. Com as determinações efectuadas após duas semanas de administração dos diferentes tratamentos, verificou-se que estes não desencadearam qualquer alteração no teor de NO das plaquetas, quando os níveis de NO dos diferentes grupos são comparados com os determinados no grupo controlo (Fig. 3.1): 164 grupo controlo: 26,5 ± 1,5 nmol10-9plaq. grupo CsA: 28,4 ± 3,0 nmol10-9plaq. grupo L-arginina: 26,7 ± 2,0 nmol10-9plaq. grupo L-arginina + CsA: 25,5 ± 2,2 nmol10-9plaq. Parte Experimental _________________________________________________________________________ Os resultados obtidos após quatro semanas de tratamento, isto é, no final das administrações (Fig. 3.1), mostram que no grupo de ratos aos quais se administrou a CsA, os teores plaquetares de NO se encontram aumentados em relação aos valores do grupo controlo: grupo controlo: 26,7 ± 1,4 nmol10-9plaq. grupo CsA: 35,0** ± 2,3 nmol10-9plaq. (p< 0,01) No grupo de ratos aos quais se administrou a L-arginina o teor de NO plaquetar mantêm-se semelhante ao do grupo controlo: grupo controlo: 26,7 ± 1,4 nmol10-9plaq. grupo L-arginina: 29,0 ± 2,7 nmol10-9plaq. Quando os teores de NO do grupo da L-arginina + CsA são comparados com os obtidos no grupo ao qual se administrou somente CsA (Fig. 3.1): grupo CsA: 35,0 ± 2,3 nmol10-9plaq. grupo L-arginina + CsA: 33,6 ± 3,3 nmol10-9plaq. verifica-se que a L-arginina não impediu o aumento de NO intraplaquetar que a CsA isoladamente provocara. 165 9 NO Plaquetar (nmol/10 plaq.) Capítulo III _________________________________________________________________________ Controlo CsA L-Arg L-Arg+CsA 50 40 † ** 30 20 10 0 0 2 4 Fig. 3.1 Conteúdo de NO nas plaquetas de rato controlo, ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia), ratos administrados com L-arginina (1,25 mg/L) e de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) e L-arginina (1,25 mg/L), nas semanas 0, 2 e 4 de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). ** (p<0,01) grupos tratados vs grupo controlo. † (p<0,05) grupo tratado com CsA e L-arginina vs grupo CsA. Quando se analisam os resultados, apresentados no Fig. 3.2, verifica-se que, embora a administração de CsA leve ao aumento do teor de NO nas plaquetas destes ratos: grupo controlo: 26,7 ± 1,4 nmol10-9plaq. grupo CsA: 35,0** ± 2,3 nmol10-9plaq. (p<0,01) não se encontram alterações na relação entre o teor de NO que é efluído da plaqueta: 166 grupo controlo: 15,3 ± 1,7 nmol10-9plaq. grupo CsA: 19,7 ± 2,2 nmol10-9plaq. Parte Experimental _________________________________________________________________________ e o que fica retido no interior desta após o efluxo: grupo controlo: 11,4 ± 1,1 nmol10-9plaq. grupo CsA: 15,7 ± 1,6 nmol10-9plaq. se bem que, num e noutro caso, tendencialmente os valores sejam superiores nos grupos 9 NO Plaquetar (nmol/10 plaq.) tratados com CsA. 50 40 Controlo CsA ** 30 20 10 0 Total Efluído Intraplaquetar Fig. 3.2 Conteúdo de NO nas plaquetas nos rato (total, efluído e intraplaquetar) controlo e tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). ** (p<0,01) grupo tratado com CsA vs grupo controlo. 167 Capítulo III _________________________________________________________________________ 3.2 Ensaios in vitro Também foi estudado o efeito da adição in vitro de CsA (0,1 M), concentração que corresponde à obtida com a dose utilizada in vivo, no conteúdo de NO plaquetar para se poder confirmar ou não os resultados obtidos com a CsA in vivo. Verificou-se que com a adição de CsA (0,1 M) ocorreu um aumento da concentração do NO produzido pelas plaquetas (Fig. 3.3), à semelhança do efeito verificado nos estudos ex vivo: Grupo controlo: 27,0 ± 1,9 nmol10-9plaq. Grupo CsA: 40,1* ± 9,2 nmol10-9plaq. (p< 0,05) Mas, desta vez, esse aumento foi acompanhado por um aumento na quantidade de NO efluído por estas, durante a incubação com CsA: Grupo controlo: 14,9 ± 1,8 nmol10-9plaq. Grupo CsA: 31,6** ± 9,4 nmol10-9plaq. (p< 0,01) sem alteração significativa das quantidades de NO retido no interior das plaquetas: 168 Grupo controlo: 12,1 ± 1,2 nmol10-9plaq. Grupo CsA: 8,5 ± 0,8 nmol10-9plaq. 50 Controlo CsA * ** 9 NO Plaquetar (nmol/10 plaq.) Parte Experimental _________________________________________________________________________ 40 30 20 10 0 Total Total Efluído Efluído Intraplaquetar Intraplaquetar Fig. 3.3 Conteúdo de NO nas plaquetas de rato (total, efluído e intraplaquetar) “não estimuladas” (basal) e nas plaquetas de ratos incubadas com CsA (0,1 µM). Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). * (p<0,05), ** (p<0,01) grupo CsA vs grupo controlo (basal). Neste ponto, os efeitos diferem dos verificados nos estudos ex vivo, uma vez que, embora nestes ocorra um aumento da produção de NO nas plaquetas, estas não libertam NO em maior quantidade, uma vez que, o conteúdo intraplaquetar de NO é idêntico ao encontrado no grupo de ratos controlo. 169 Capítulo III _________________________________________________________________________ Ainda nos estudos in vitro, as plaquetas foram também incubadas nas mesmas condições mas em meios aos quais se adicionaram dois controlos positivos diferentes e dois inibidores da NOS na produção de NO. Nas plaquetas às quais se adicionou a L-arginina, o substrato da via da L-arginina:NO, observou-se um aumento no teor de NO produzido em relação ao teor “basal” das plaquetas não “estimuladas” do grupo de controlo (Fig. 3.4): grupo controlo: 27,0 ± 1,9 nmol10-9plaq. grupo L-arginina: 41,0* ± 6,9 nmol10-9plaq. (p< 0,05) As plaquetas incubadas num meio contendo IL e LPS, indutores da enzima NOSi, também apresentaram um aumento da quantidade de NO produzido por estas (Fig. 3.4): grupo controlo: 27,0 ± 1,9 nmol10-9plaq. grupo IL + LPS: 44,8* ± 6,9 nmol10-9plaq. (p< 0,05) Quando as plaquetas foram incubadas com os diferentes inibidores, o L-NNA, (inibidor “específico” da NOSe) ou com a aminoguanidina (inibidor “específico” da NOSi), estas apresentaram uma reactividade semelhante com qualquer um deles, ou seja, um teor total de NO tendencialmente inferior ao do grupo controlo mas não estatisticamente significativo (Fig. 3.4): 170 grupo controlo: 27,0 ± 1,9 nmol10-9plaq. grupo L-NNA: 19,8 ± 3,0 nmol10-9plaq. grupo aminoguanidina: 20,7 ± 2,6 nmol10-9plaq. NO Plaquetar (nmol/109plaq.) Parte Experimental _________________________________________________________________________ 60 * 50 * * 40 30 CsA L-Arg IL+LPS 20 Ctrl 10 L-NNA Amg 0 Fig. 3.4 Conteúdo de NO nas plaquetas de rato em condições basais e após incubação com: L-arginina (0,2 mM); IL (20 ngml-1) + LPS (1 µgml-1); L-NNA (0,1 mM); aminoguanidina (2 mM) e CsA (0,1 µM). Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). * (p<0,05) diferentes grupos vs grupo controlo (basal). 171 Capítulo III _________________________________________________________________________ 4. Determinação dos níveis plaquetares de GMPc Antes do início do tratamento, o conteúdo de GMPc nas plaquetas dos ratos do grupo controlo era similar ao conteúdo de GMPc nas plaquetas dos ratos que depois foram sujeitos aos diferentes tratamentos ao longo das quatro semanas de duração do estudo (Fig. 4.1) : grupo controlo: 2,7 ± 0,2 pmol10-9plaq. grupo CsA: 2,7 ± 0,7 pmol10-9plaq. grupo L-arginina: 3,1 ± 0,5 pmol10-9 plaq. grupo L-arginina + CsA: 2,6 ± 0,4 pmol10-9plaq. Com as determinações efectuadas após duas semanas de administração dos diferentes tratamentos, verificou-se um aumento significativo no nível de GMPc das plaquetas de ratos tratados com a CsA e que a administração de L-arginina não desencadeou qualquer alteração estatisticamente significativa no conteúdo de GMPc das plaquetas, quando os níveis deste são comparados com os existentes no grupo controlo, embora fosse tendencialmente maior. Já com a associação de L-arginina e CsA tais teores revertem a resposta à CsA, voltando a valores estatisticamente semelhantes aos do controlo (Fig. 4.1): 172 grupo controlo: 2,8 ± 0,4 pmol10-9plaq. grupo CsA: 6,8* ± 1,6 pmol10-9plaq. (p< 0,05) grupo L-arginina: 5,4 ± 1,7 pmol10-9plaq. grupo L-arginina + CsA: 4,3 ± 0,5 pmol10-9plaq. Parte Experimental _________________________________________________________________________ Os resultados obtidos após 4 semanas de tratamento (Fig. 4.1), mostram-nos que no grupo de ratos aos quais se administrou a CsA, os conteúdos plaquetares de GMPc se mantinham aumentados em relação aos valores do grupo controlo, à semelhança do obtido ao fim das 2 primeiras semanas de tratamento : grupo controlo: 2,7 ± 0,8 pmol10-9plaq. grupo CsA: 7,3** ± 1,1 pmol10-9plaq. (p< 0,01) mas os níveis do GMPc das plaquetas dos ratos tratados com CsA eram ainda mais elevados do que os encontrados após as duas primeiras semanas de administração da CsA. No grupo de ratos aos quais se administrou a L-arginina, o conteúdo plaquetar de GMPc mantêm-se semelhante ao do grupo controlo: grupo controlo: 2,7 ± 0,8 pmol10-9plaq. grupo L-arginina: 3,1 ± 1,0 pmol10-9plaq. Mas, mais uma vez e agora ainda mais claramente quando se comparam os conteúdos plaquetares do grupo da CsA com os do grupo tratado conjuntamente com a mesma dose de CsA e com L-arginina, verifica-se que os teores plaquetares de GMPc são francamente inferiores e semelhantes aos do controlo (Fig. 4.1): grupo CsA (T4): 7,3 ± 1,1 pmol10-9plaq. grupo L-arginina + CsA (T4): 3,3* ± 1,2 pmol10-9plaq. (p< 0,05) 173 Capítulo III _________________________________________________________________________ 9 GMPc Plaquetar (pmol/10 plaq.) 10 8 Controlo CsA L-Arg L-Arg+CsA * ** 6 † 4 2 0 0 2 4 (Semanas) Fig. 4.1 Concentrações plaquetares de GMPc de ratos controlo, ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia), ratos administrados com L-arginina (1,25 mg/L) e de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) e L-arginina (1,25 mg/L), nas semanas 0, 2 e 4 de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). * (p<0,05), ** (p<0,01) grupos tratados vs grupo controlo; † (p<0,05) grupo tratado com L-Arg. + CsA vs grupo CsA. Isto é, a administração de L-arginina em simultâneo com a CsA impede o efeito atribuído à CsA. 174 Parte Experimental _________________________________________________________________________ E - Comentários Com os resultados obtidos neste estudo, ou seja, uma diminuição de cerca de 30% (p<0,05) do teor de NO na aorta total do grupo tratado com a CsA em relação ao conteúdo de NO do grupo controlo, que se considerou corresponder a 100%, parece lógico assumir que a hipertensão arterial induzida neste modelo animal, através da administração durante um período de quatro semanas de uma dose de 5 mg/Kg/dia de CsA é, pelo menos em parte, causada pela deficiência em NO e GMPc a nível arterial, facto que sugere que a via vasodilatadora da L-arginina:NO:GMPc está enfraquecida. A diminuição da produção vascular de NO permite o aumento da resistência vascular periférica. A administração prévia de um suplemento exógeno de L-arginina ao grupo tratado com CsA impede que o teor de NO e de GMPc diminua (grupo CsA: 4,6 ± 0,7 pgµgprot -1 vs grupo CsA + L-Arg.: 6,7 ± 0,4 pgµgprot-1; grupo CsA: 7,2 ± 0,5 pmolµgprot-1 vs grupo CsA + L-Arg.: 24,2** ± 6,5 pmolµgprot-1, respectivamente), ou seja, a L-arginina foi capaz de preservar a capacidade vascular de formação de NO e de GMPc, o que está de acordo com o possível efeito protector do tratamento com a L-arginina na produção de NO e no relaxamento dependente do endotélio. Estes dados estão de acordo com os obtidos em alguns estudos até agora realizados. Por exemplo, Khalil e col. (1996) relatam que a injecção de CsA directamente nas artérias coronárias de cães causava vasoconstrição através de “mecanismos miogénicos e dependentes do endotélio”; Sudhir e col. (1994) descrevem que a injecção aguda de CsA “diminui a libertação de factores de relaxamento dependentes do endotélio nas coronárias epicárdicas e de resistência dos cães ”; Richards e col. (1990) mostraram que a incubação de vasos de resistência subcutâneos com a CsA em humanos, inibia o relaxamento dependente do endotélio, experimentando a resposta à acetilcolina; Vaziri e col. (1998) descrevem uma acentuada diminuição na excreção urinária de NOx o que sugere uma diminuição na produção de NO; Gallego e col. (1993) mostraram que a administração crónica de CsA induz uma disfunção endotelial em anéis de aorta femoral do rato e um decréscimo do relaxamento dependente do endotélio induzido pela acetilcolina, o qual seria corrigido pela incubação das artérias do rato com a L-arginina; Oriji e col. (Oriji, 175 Capítulo III _________________________________________________________________________ 1999; Oriji e Keiser, 1998; Oriji e Keiser, 1999) descrevem que o NO2/NO3 e o GMPc (que medeia a acção do NO) se encontravam diminuídos tanto na urina como nos anéis aórticos de ratos tratados com a CsA, que a administração crónica de L-arginina revertia os efeitos da CsA quer in vitro quer in vivo e que a administração crónica de CsA enfraquecia a acção vasodilatadora do endotélio; Yang e col. (1998) também descrevem que a CsA diminui a excreção urinária de metabolitos do NO em ratos, mas que um suplemento exógeno de L-arginina, aumentava a produção urinária de NO; Bartholomeusz e col. (1996) também referem uma diminuição da excreção urinária de nitritos/nitratos. As alterações desencadeadas pela administração de CsA podem ocorrer em variados locais: 1. Redução da concentração (por diminuição da sua biodisponibilidade ou por redução da sua captação pelas células endoteliais) ou diminuição do uso da Larginina. Já foi demonstrado que o tratamento com a CsA está associado a alterações físicoquímicas na estrutura da membrana (Fahr, Nimmerfall e Wenger, 1994; Keelan e col., 1993). Estas alterações físicas e/ou químicas da membrana podem influenciar a actividade dos transportadores de membrana, nomeadamente o transportador da L-arginina. Os efeitos tóxicos da CsA nas respostas dependentes do endotélio são reversíveis pela administração de L-arginina, o substrato do NO (Mathieu e col., 1997; Prieto e col., 1997). Alguns estudos descrevem que a L-arginina é capaz de reverter a disfunção vascular desencadeada pela administração de CsA (Gallego e col., 1993), assim como o enfraquecimento do vasorelaxamento dependente do endotélio (Lee e col., 1999). Tal efeito pode ser devido ao aumento da recaptação da L-arginina com o consequente aumento da cascata do NO:GMPc. A CsA pode limitar a quantidade de substrato disponível para a NOS ou pode inibir a NOS de forma competitiva e tal pode ser torneado pela presença de um excesso de substrato. 176 Parte Experimental _________________________________________________________________________ Na ausência de L-arginina, a NOS reduz o O2 a H2O2 ou a O2-. Assim, é possível que a hiperactividade da NOS induzida pela CsA se deva a um stress oxidativo, o qual poderá contribuir para os efeitos vasoconstrictores e para a lesão provocada pela CsA. A Larginina pode prevenir estes efeitos deslocando a NOS da acção redutase do O2 para a sua função fisiológica Tem sido descrito que o endotélio possui L-arginina suficiente para a produção basal de NO, mas não para a indução da NOSi após estimulação, como um estímulo por lesão. Neste não se avaliou se a administração de L-arginina conseguiria reverter a acção da CsA, uma vez que a administração de L-arginina foi iniciada 5 dias antes do início do tratamento com a CsA e não após este. Mas pôde verificar-se que a L-arginina foi capaz de prevenir os efeitos devidos ao tratamento dos ratos com CsA, ou seja a diminuição do NO (grupo controlo: 6,6 0,5 pggprot-1 vs grupo CsA: 4,6* ± 0,7 pggprot-1 vs grupo L-arginina + CsA: 6,7† ± 0,4 pggprot-1) e do GMPc (grupo controlo: 22,0 ± 2,2 pmolgprot-1 vs grupo CsA: 7,2* ± 0,5 pmolgprot-1 vs grupo L-arginina + CsA: 24,2† ± 6,5 pmolgprot-1) da aorta. 2. Redução da concentração ou da actividade das duas enzimas do NO. Alguns estudos propõem que as alterações da calcineurina intracelular, devidas à CsA, medeiam tanto a vasoconstrição como os mecanismos imunossupressores (Sander e Victor, 1995). A diminuição da formação de NO em ratos tratados com a CsA pode estar relacionada com o efeito da CsA no bloqueio da forma constitutiva da NOS dependente do complexo Ca2+/calmodulina, uma vez que esta se liga à calcineurina (Amore e col., 1995; Dawson e col., 1993). A CsA é permeável nas membranas, mas é biologicamente inerte até se ligar ao seu receptor citoplasmático, a ciclofilina, uma imunofilina (Walsh, Zydowsky e McKeon, 1992). O alvo celular do complexo CsA-ciclofilina é a calcineurina, uma fosfatase dependente do Ca2+ (Klee, Crouch e Krinks, 1979) e da calmodulina, a qual é inibida por este complexo (Liu e col., 1991). 177 Capítulo III _________________________________________________________________________ Já foi demonstrado que a calcineurina e as imunofilinas existem mesmo mais nos tecidos não linfóides, como no sistema nervoso (Steiner e col., 1992), no músculo liso vascular (Dawson, Boland e Holmes, 1993) e no rim (Otsuka e col., 1994). Como estes são os principais locais alvo para a toxicidade induzida pela CsA, em especial na hipertensão arterial, a inibição da calcineurina nestes diferentes tecidos pode mediar a hipertensão induzida pela CsA. A enzima NOS é um substracto da calcineurina in vitro (Dawson e col., 1993), existindo a possibilidade da CsA interferir com a NOS, responsável pela síntese de NO, que é dependente do Ca2+ e da calmodulina. Este facto sugere um possível mecanismo para explicar o efeito inibidor da CsA na vasodilatação induzida pelo NO. Contudo, os dados são conflituosos acerca de quando é que a desfosforilação mediada pela calcineurina aumenta (Busse, Luckhoff e Mülsch, 1991; Förstermann e col., 1991), diminui (Dawson e col., 1993; Mittal e Jadhau, 1994; Zhang e Steiner, 1995), ou não apresenta qualquer efeito na actividade da NOS in vitro (Marumo e col., 1995). Além disso, o significado fisiológico in vivo ainda terá que ser avaliado. Foi sugerido que a CsA inibe a NOSi ao nível do seu ARNm nas células musculares lisas vasculares de rato (Marumo e col., 1995) que descreve que a CsA não diminui a estabilidade da NOSi mas afecta sobretudo a sua transcrição. A expressão vascular da NOSi encontrava-se inibida (Lee e col., 1999), facto concordante com os estudos de Marumo e col. (1995), nos quais a administração aguda de CsA inibia a indução da NOS nas células musculares lisas da aorta de ratos ou que a administração de CsA durante 3 semanas resultava numa redução marcada do ARNm da NOSi vascular, assim como da expressão proteica (Vaziri e col., 1998), os quais sugeriam que a CsA exercia uma inibição na transcrição da NOSi na vasculatura. A CsA inibe a NOSi, quer a sua actividade (Conde e col., 1995) quer a sua expressão (Kunz e col., 1995). Pelo contrário, alguns estudos mostram quer a inexistência de alteração ou mesmo um aumento da expressão e da actividade da NOS (López-Ongil e col., 1996). Estes observaram um aumento da síntese de NO na presença da CsA e descrevem que não existe déficit na expressão da NOSe mas sim um pequeno aumento da sua actividade após a exposição de células endoteliais aórticas bovinas à CsA. A expressão da NOSe não era afectada de forma significativa pelo tratamento com a CsA (Lee e col., 1999), facto apoiado por Vaziri e col. (1998), que não observaram uma alteração da abundância 178 Parte Experimental _________________________________________________________________________ proteica de NOSe na aorta torácica após 3 semanas de tratamento com a CsA; Amore e col. (1995) também descrevem que não ocorre alteração na “síntese de novo” da proteína NOSe após a administração crónica de CsA. Contudo, a massa proteica da NOSe pode não estar correlacionada com a actividade enzimática. A diminuição da formação de NO pode estar correlacionada com uma interferência da CsA na activação dependente do Ca2+ da NOSe. Assim, ainda que os dados encontrados na literatura sejam muito dispares, poderá verificar-se neste estudo não apenas a diminuição do substracto ou da sua utilização mas também, uma alteração da actividade das enzimas que sintetizam o NO, as NOS. 3. Aumento da degradação local de NO por aumento da formação de radicais livres de O2 ou por outro tipo de radicais. O NO é um radical livre que pode participar em diferentes tipos de reacções redox, algumas das quais medeiam os seus efeitos biológicos como a reacção que é responsável pela activação da guanilciclase, mas outro tipo de reacções podem limitar a sua actividade. A inactivação do NO ocorre essencialmente através de reacções oxidativas mediadas pelos intermediários reactivos de O2, incluindo o superóxido e o peróxido de hidrogénio (Kelm, 1999). Estes intermediários são encontrados numa grande variedade de alterações vasculares, incluindo a hipertensão arterial e na disfunção endotelial que sustenta ou acompanha esta (Zalba e col., 2000). O radical livre NO é formado exclusivamente pela enzima NOS. Mas, em certas condições, a NOS pode gerar superóxidos. A formação de superóxidos pela NOSe é mediada pelo grupo heme do seu domínio oxigenase e depende da presença do seu substrato, a L-arginina, e do co-factor BH4; quando existe abundância dos dois, a NOSe produz NO; mas quando a abundância de um deles é relativamente baixa, a NOSe gera superóxidos. Além disso, a NOSi também pode gerar superóxidos através do seu domínio reductase. O mecanismo de redução selectiva da pressão sanguínea por sequestração do O2não é conhecido. Uma possível explicação pode ser a de que o O2- pode inactivar o NO e assim bloquear esta via vasodilatadora. 179 Capítulo III _________________________________________________________________________ O sistema do citocromo P-450 é sugerido como sendo uma fonte de formação de radicas livres dependentes da CsA (Ashmed e col., 1995; Inselmann e col., 1991; L’Azou e col., 1999). Este sistema forma aniões superóxido (O2-) e peróxido de hidrogénio (H2O2) sob certas condições (Halliwell e Gutteridge, 1999). Uma vez que a CyP3A é a única enzima capaz de metabolizar a CsA, esta parece ser um “candidato” óbvio para a formação de intermediários reactivos de oxigénio. Além disso, já foi demonstrada a existência das isoenzimas CyP3A1 e CyP3A2 nas células musculares lisas vasculares do rato, um potencial local de actuação da CsA na hipertensão (Nguyen e col., 1999). Mas estes estudos utilizaram doses de CsA acima das concentrações terapêuticas normalmente utilizadas na prática clínica e, assim, a formação de intermediários reactivos de oxigénio pode não ser a causa do aumento da contracção das células musculares lisas desencadeada por esta. Contudo, não pode ser excluído o facto de que a formação local deste tipo de substâncias pode contribuir para a sinalização de processos que levam ao aumento da vasoconstrição (Avdonin e col., 1999). Além disso, os estudos de McGrath e col. (1997) demonstraram que doentes transplantados, tratados com CsA, apresentavam sinais de stress oxidativo determinado pela expressão alterada de enzimas antioxidantes. Assim, parece que a CsA é capaz de formar intermediários reactivos de oxigénio. Mas, os radicais formados não derivam directamente da molécula de CsA nem parecem ser derivados da mitocôndria nem do metabolismo da CsA mediado pela CyP, antes parecem ser formados tanto no fígado como no rim e nas células de cultura, incluindo as células vasculares. Um dos principais radicais formados parece ser o O2-, o qual é reduzido em radical ˙OH nos sistemas biológicos. Neste estudo, quando se adicionou a L-arginina ao tratamento com a CsA, esta poderá ter impedido a formação de aniões superóxido com o concomitante aumento da produção de NO. 4. Diminuição da difusão do NO a partir do endotélio para as células da íntima e/ou diminuição da sensibilidade do músculo liso vascular às substâncias vasodilatadoras. Para além das possibilidades já expostas para explicar uma diminuição do conteúdo vascular de NO, poderá ocorrer uma diminuição da difusão de NO formado no endotélio 180 Parte Experimental _________________________________________________________________________ para as células musculares onde se transforma em GMPc e promove as funções de vasorelaxamento. Contudo, os resultados deste trabalho parecem afastar esta possibilidade. Assim, a CsA diminui (cerca de 30% como se viu), o conteúdo de NO em aorta total. Este decréscimo não modificou a relação entre o conteúdo medido na tira da aorta desprovida de endotélio e a tira total estudada no grupo controlo, pelo que é provável que a CsA não interfira com o fluxo de NO produzido pelo endotélio para o músculo liso. 5. Diminuição da interacção entre o NO e a guanilciclase e da transdução de sinal pelo NO, pela diminuição da actividade da guanilciclase e a subsequente limitação do aumento dos níveis intracelulares de GMPc. Em diferentes estudos descritos na literatura, o relaxamento independente do endotélio não se encontra alterado, uma vez que a resposta aos dadores exógenos de NO se encontra preservada (Bossaller e col., 1989; Diederich, Yang e Lüscher, 1992; Sudhir e col., 1994). Assim, parece que a resposta do músculo liso ao NO não é influenciada pelo tratamento com a CsA. Não obstante, também já foi relatado que a administração de CsA por períodos prolongados diminui o vasorelaxamento ao nitroprussiato de sódio, um dador de NO (Huang e Detwiller, 1987). Os estudos de Rego e col. (1990) sugerem que a CsA actua directamente no músculo liso vascular, diminuindo na aorta do rato, a vasodilatação mediada pelo GMPc. A CsA atenua de forma significativa a formação vascular de GMPc. Assim, parece que os passos que ocorrem após a formação de NO também possam ser afectados pela CsA. A actividade da guanilciclase por si só também pode estar inibida pela CsA, o que resulta numa inadequada estimulação da formação de GMPc em resposta ao NO. Mas, os estudos de Caramelo e col. (1995), descrevem que nos vasos tratados com CsA, a adição de um excesso de L-arginina ao meio, além de conseguir restabelecer a produção normal de GMPc, ainda alcançou valores acima dos normais. Assim, parece que a alteração produzida pela CsA não deve afectar a guanilciclase. 181 Capítulo III _________________________________________________________________________ No modelo usado por Mathieu e col. (1997), o vasorelaxamento desencadeado pela nitroglicerina, um agente independente do endotélio e mediado pelo GMPc, não se encontrava significativamente diminuído após a administração de CsA. Nos estudos de Gallego e col. (1994), a L-arginina preservava a formação de GMPc induzida pelo nitroprussiato de sódio, um dador não enzimático de NO. Assim, a actividade da guanilciclase solúvel não deveria estar alterada. Contudo, no nosso trabalho salienta-se o facto de ter ocorrido uma diminuição de GMPc (67%) na aorta total do grupo CsA vs controlo superior à perda em NO (30%). Se parece afastada a hipótese de alteração do transporte de NO entre o endotélio e o músculo liso, não se poderá excluir a hipótese de alteração ao nível do mecanismo de síntese do GMPc na camada muscular. Ora, isto estaria de acordo com um efeito combinado da CsA nos processos de síntese de NO no endotélio e nos processos de formação de GMPc a partir de NO, contribuindo para a elevada perda de GMPc relativamente ao NO. Esta explicação suporta um efeito exacerbado da CsA sobre toda a via L-Arg:NO:GMPc vascular, ou seja no endotélio mas também no músculo liso. Em conjunto, pode sugerir-se que os mecanismos através dos quais a CsA altera a função vascular devem ser multifactoriais, incluindo a actividade da NOS e da guanilciclase. Se a aorta de rato tratado com ciclosporina, durante quatro semanas, está apta a um estado hipertensivo, a plaqueta, caso pudesse influenciar este estado, estaria apta a contribuir para o estado inverso. A ciclosporina causa em aorta e em plaqueta variações do conteúdo de NO que não se assemelham. Na verdade, os conteúdos de NO e de GMPc aumentam significativamente nas plaquetas e assim, as plaquetas não “imitam” o comportamento da aorta nem em relação ao NO nem ao GMPc. A variação dos níveis de NO e de GMPc plaquetares induzida pela CsA, embora seja a inversa da verificada na aorta, não parece derivar de um mecanismo compensatório passivo. Se fosse este o caso, não se compreenderia que in vitro a CsA provocasse um aumento significativo de NO. In vivo, as alterações, pese embora não tão marcadas, são semelhantes pelo que, haja compensação ou não, aquela dependerá muito mais de um 182 Parte Experimental _________________________________________________________________________ mecanismo activo do que um mecanismo passivo. Quando se estudaram os níveis de GMPc nas plaquetas, o aumento foi ainda maior do que o verificado com o NO, mas segue o comportamento que ocorre para este factor; contudo, convém mencionar que em relação ao GMPc os teores plaquetares ao fim de duas semanas de tratamento já apresentaram um aumento significativo em relação aos teores do grupo controlo, enquanto que os teores do NO às duas semanas apresentaram um aumento ainda pequeno em relação ao grupo controlo. Este dado parece reforçar a hipótese já avançada de um efeito da CsA não apenas a nível da síntese endotelial do NO como também do seu metabolismo no músculo liso, com formação de GMPc. A CsA aumenta a agregação plaquetar (Furchgott e Zawadzki, 1980). Na literatura, podem encontrar-se variados estudos sobre os efeitos da CsA na agregação plaquetar, mas os resultados nem sempre são concordantes. A alteração da agregação plaquetar pode desempenhar um importante papel na variação da pressão arterial induzida pela CsA. O aumento da formação de agregados nos vasos periféricos pode ser um mecanismo do aumento da resistência vascular. Além disso, o tratamento com a CsA aumenta a libertação de TXA2 das plaquetas (Grace e col., 1987). Assim, tem sido sugerido que esta alteração do metabolismo das prostaglandinas possa explicar a activação crónica in vivo e a hiperagregabilidade in vitro de pacientes que tomam CsA. O TXA2 é o principal produto de activação da COX nas plaquetas e funciona através do 2º mensageiro, o Ca2+. Nas plaquetas, o aumento do TXA2 verificado num estado de hiperactivação plaquetar, já descrito por outros autores e confirmado com trabalhos anteriores do nosso grupo (Reis, tese de mestrado 1999), pode aumentar a concentração intracelular do Ca2+. Mas a CsA pode aumentar este através de outras vias. O aumento do Ca2+ no citoplasma está associado às alterações bioquímicas que culminam na activação das plaquetas. De facto, o Ca2+ apresenta uma papel crucial nos processos que conduzem à activação das plaquetas e às consequentes respostas funcionais, como as reacções de libertação e de agregação, e este pode também activar a NOS plaquetar, aumentando a concentração do NO das plaquetas. Assim, a possível 183 Capítulo III _________________________________________________________________________ interacção entre a actividade da COX e da NOS e do papel central do Ca2+ nesta interacção não pode ser descartada. Existem variados estudos que demonstram o aumento do Ca2+ nas plaquetas em doentes e animais tratados com CsA (Haller e col., 1994; Reis, tese de mestrado 1999). Além disso, o AMPc e o GMPc são dois dos principais reguladores da inibição das plaquetas; nomeadamente através do influxo e da libertação intracelular de Ca2+, podem desempenhar um papel decisivo na homeostase do Ca2+. Em condições de disfunção endotelial, como as por nós verificadas, a própria produção de NO pelas plaquetas pode tornar-se importante na regulação da resposta das plaquetas, nomeadamente na modulação e inibição da sua activação. O aumento do NO e consequentemente o do GMPc encontrado irá levar à diminuição dos níveis de Ca2+ intracelular e assim actuar como mecanismo de retrocontrolo negativo intraplaquetar que previne a activação e agregação excessiva das plaquetas e/ou como mecanismo hemodinâmico intrínseco que protege a parede do vaso da vasoconstrição induzida pela CsA. Muito embora este último possa ocorrer para compensar o déficit de NO e de GMPc arterial observado, tal não deverá ser provável, uma vez que através dos estudos in vitro se verificou que a CsA apresenta um efeito directo no aumento da formação de NO e de GMPc das plaquetas. A administração de L-arginina per si não alterou nem o teor de NO nem o teor de GMPc quer a nível vascular quer a nível plaquetar, no que se concorda com outros autores (Oriji, 1999; Oriji e Keiser, 1998; Oriji e Keiser, 1999). Assim, somos levados a supor que não é necessário um suplemento exógeno de L-arginina para se atingir a sua magnitude normal. De facto, parece que a L-arginina existe em abundância no organismo, em concentrações que excedem o Km da NOS e, assim, a adição exógena de L-arginina não deverá levar à formação de mais NO. Contudo, na presença do agente agressor CsA, à semelhança do verificado a nível vascular, a nível das plaquetas a administração conjunta da L-arginina e da CsA parece “neutralizar” o efeito desencadeado pelo tratamento com CsA per si. Tal facto é importante 184 Parte Experimental _________________________________________________________________________ pois poderá significar que esta possa “ajudar” a reverter o efeito hipertensor atribuído ao uso da CsA. 185 Capítulo III _________________________________________________________________________ III PGI2 – factor vasorelaxante e inibidor da agregação plaquetar A. Introdução Não obstante a contribuição da PGI2 para o relaxamento dependente do endotélio ser negligenciável na maior parte dos vasos sanguíneos, sendo o seu efeito essencialmente aditivo ao do NO, a prostaciclina é também um importante factor vasodilatador derivado do endotélio e inibidor da activação plaquetar. A PGI2 será mesmo o mais potente inibidor endógeno da agregação plaquetar e, assim, um importante regulador da função das plaquetas. De facto, alguns estudos demonstram que a PGI2 não contribui de forma significativa para o relaxamento dependente do endotélio desencadeado pela acetilcolina (Bassange e Heusch, 1990; Shimokawa e col., 1996), visto que, embora ocorra a libertação de PGI2 durante o fluxo pulsátil, o nível de PGI2 libertado é inferior às elevadas quantidades que são necessárias para induzir o relaxamento. Mas, como os efeitos cardiovasculares exercidos pelo NO são muitas vezes mediados em conjunto com outro importante factor vasodilatador e inibidor da adesão das plaquetas, libertado pelas células endoteliais, a PGI2, fomos também estudar as alterações que esta poderia apresentar quer a nível vascular quer a nível plasmático. Além do mais, a libertação de PGI2 é independente do GMPc. A PGI2 forma-se durante a bioconversão do ácido araquidónico pela cicloxigenase e exerce os seus efeitos vasodilatadores e antitrombóticos activando a adenilciclase e aumentando os níveis de AMPc. A capacidade da CsA de se inserir na bicamada lipídica da membrana celular e activar a fosfolipase A2 sugere uma possível interferência deste fármaco com o metabolismo do ácido araquidónico. A implicação dos produtos da cicloxigenase também tem sido investigada em variados estudos, mas também até agora não existe um consenso. 186 Parte Experimental _________________________________________________________________________ Os estudos de Hansen e col. (1999) descreveram um aumento da excreção urinária de todos os metabolitos do ácido araquidónico medidos nesse estudo em humanos (TXB2, 6-ceto-PGF1α e PGE2), após o tratamento com a CsA. Este dado sugere uma activação do sistema enzimático da cicloxigenase, causando um aumento não específico tanto das prostaglandinas vasodilatadores como das prostaglandinas vasoconstrictoras. Tal facto está de acordo com outros estudos realizados em animais que relatam um aumento da excreção urinária de 6-ceto-PGF1α, TXB2 e PGE2 com a utilização de CsA (Hansen e col., 1999; Rigotti e col., 1991; Smeester e col., 1988). B. Metodologia 1. Determinação dos teores arteriais de 6-ceto-PGF1 Uma vez que a PGI2 apresenta uma semi-vida muito curta em condições fisiológicas, a sua formação é quantificada através da determinação da de 6-ceto-PGF1α, o produto equimolar estável da metabolização da PGI2, o qual é usado como indicador directo da produção de PGI2. Os segmentos arteriais de 2-3 mm de espessura foram colocados em solução tampão cuja composição em (mmol/L) é: 100 NaCl, 4 KCl, 25 NaHCO3, 2.1 Na2SO4, 20 citrato de sódio e 50 TRIS, H2O q.b.p. 1L (pH 8,2) e incubados a 37ºC durante 5 minutos. A solução tampão foi substituída e adicionada de ácido araquidónico (100 mol/L), 5 minutos depois foi adicionada indometacina (100 mol/L). O tecido foi então seco e pesado e no sobrenadante foi determinada a 6-ceto-PGF1α que é o produto estável da degradação de PGI2 por imunoensaio (De La Cruz e col., 1997). Os teores arteriais de 6-ceto-PGF1α foram quantificados através de “Kits” de imunoensaio RD Systems. O imunoensaio tem por base o princípio da ligação competitiva. A 6-ceto-PGF1α presente nas amostras e uma quantidade fixa de 6-ceto- 187 Capítulo III _________________________________________________________________________ PGF1α marcada com fosfatase alcalina competem pelo mesmo anticorpo. Durante a incubação, o anticorpo liga-se a outro anticorpo que está aderente à micro-placa. Segue-se a lavagem para remover o excesso de amostra conjugada e não ligada. Em seguida adiciona-se o substrato da enzima e verifica-se o aparecimento de cor, seguindo-se a leitura da absorvância a 405 nm. A intensidade da cor é inversamente proporcional à concentração de 6-ceto-PGF1α na amostra. As concentrações arteriais de 6-ceto-PGF1α obtém-se por média das contagens em duplicado de cada amostra por interpolação a partir da curva padrão. Os resultados foram expressos em ng por mg de aorta. 2. Determinação dos teores plasmáticos de 6-ceto-PGF1 Após colheita de sangue em tubos heparinizados, este foi de imediato centrifugado a 1100 g durante 15 minutos em filtros Centricon (YM 10,000 NMWL, Millipore Corp., Bedford, MA), durante 1 hora a 5000 g. Os teores plasmáticos de 6-ceto-PGF1α foram quantificados através de “Kits” de imunoensaio RD Systems seguindo o protocolo já descrito anteriormente. Os valores das concentrações plasmáticas de 6-ceto-PGF1α das amostras foram calculados por extrapolação da curva padrão. Os resultados foram expressos em ng ml-1. C. Reagentes Todos os restantes reagentes foram obtidos através da Sigma Chemicals Co. (St. Louis, E.U.A.). 188 Parte Experimental _________________________________________________________________________ Os kits de imunoensaio foram adquirido na R&D Systems (McKindley Place, E.U.A.). Em todas as preparações (soluções e tampões) foi utilizada água ultra-pura. D. Resultados 1. Determinação dos teores arteriais 6-ceto-PGF1 Os níveis de 6-ceto-PGF1α na aorta de ratos tratados durante 4 semanas com a CsA 5 mg/Kg/dia, foram inferiores ao do grupo de ratos controlo (Fig. 1.1): grupo controlo: 53,0 ± 6,1 pg/mg aorta grupo da CsA: 26,8* ± 5,2 pg/mg aorta (p<0,05) PGI2 Arterial (pg/mg aorta) 60 50 40 * 30 20 10 0 Controlo CsA Fig. 1.1 Concentração arterial de PGI2 de ratos controlo e de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). * (p<0,05) grupo CsA vs grupo controlo. 189 Capítulo III _________________________________________________________________________ 2. Determinação dos teores plasmáticos 6-ceto-PGF1 Em relação ao conteúdo de 6-ceto-PGF1α, verificou-se que os teores plasmáticos no início do tratamento eram semelhantes no grupo controlo e no grupo ao qual iria ser administrada durante 4 semanas a CsA 5 mg/Kg/dia (Fig. 2.1): grupo controlo: 0,81 ± 0,1 ngml-1 grupo CsA: 0,79 ± 0,1 ngml-1 Após as duas primeiras semanas de tratamento, os níveis plasmáticos de 6-cetoPGF1 α do grupo de ratos tratados com a CsA eram mais elevados do que os do grupo controlo de ratos (Fig. 2.1): grupo controlo: 0,80 ± 0,1 ngml-1 grupo CsA: 1,7* ± 0,05 ngml-1 (p<0,05) No final do tratamento (4 semanas), no grupo da CsA este aumento era ainda maior quando comparado com o grupo controlo (Fig. 2.1): 190 grupo controlo: 0,88 ± 0,3 ngml-1 grupo CsA: 2,0* ± 0,2 ng ml-1 (p<0,05) Parte Experimental _________________________________________________________________________ 2,5 Controlo * [PGI2] Plasma (ng/ml) CsA 2 * 1,5 1 0,5 0 0 2 4 Fig. 1.2 Concentrações plasmáticas de PGI2 de ratos controlo e ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia), nas semanas 0, 2 e 4 de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). * (p<0,05) grupo CsA vs grupo controlo. 191 Capítulo III _________________________________________________________________________ E. Comentários Já foi descrito que a CsA altera o metabolismo do ácido araquidónico nas células endoteliais (Brown e Neild, 1987; Brown, Neild e Lewis, 1990; Voss e col., 1988) e nas células musculares lisas vasculares (Kurtz e col., 1987), desencadeando uma diminuição da produção do agente inibidor das plaquetas PGI2, facto que também foi verificado também neste trabalho. Variados estudos sugerem que o NO estimula a actividade da COX, levando a um aumento da produção de metabolitos da COX (Salvemini e col., 1995a; Salvemini e col., 1995b; Salvemini, Currie e Mollace, 1996), nomeadamente a formação de PGI2 a nível endotelial e o vasorelaxamento mediado pelo AMPc nos segmentos aórticos de rato é, pelo menos em parte, mediado pelo NO produzido nas células endoteliais. Assim, a diminuição do NO encontrada também pode impedir, se bem que não de forma directa, a formação de um outro factor vasodilatador, a PGI2, agravando ainda mais o aumento da resistência vascular periférica através da diminuição do relaxamento mediado pelo endotélio. Com os valores obtidos na medição de 6-ceto-PGF1α podemos referir que a concentração arterial de PGI2 se encontra diminuída em relação aos valores do grupo controlo (grupo CsA: 26,8 ± 5,2 ng/mg aorta vs grupo controlo: 53,0 ± 6,1 ng/mg aorta) e que esta diminuição também deverá contribuir para o aumento da resistência vascular periférica encontrada no nosso modelo. O aumento da concentração de PGI2 plasmática é já mais difícil de explicar. Todavia poderá pensar-se que, por um qualquer mecanismo compensatório, isto é, esse aumento (eventualmente por uma mais rápida saída do endotélio para o plasma) poderá ir desempenhar um qualquer papel como inibidor da hiperreactividade plaquetar desencadeada pelo tratamento com a CsA. Aliás, quer o aumento do GMPc plaquetar por nós encontrado, quer o aumento do AMPc plaquetar verificado por outro estudo do nosso 192 Parte Experimental _________________________________________________________________________ grupo de trabalho (Reis, tese de mestrado 1999), contribuirão também para a inibição das plaquetas, tentando “restaurar” a reactividade excessiva manifestada por estas. Estes resultados, porém, deverão ser reavaliados e alvo de novos estudos tendentes à sua confirmação. 193 CAPÍTULO IV SÍNTESE E CONCLUSÕES Capítulo IV _________________________________________________________________________ A Ciclosporina é um agente imunossupressor que previne a rejeição do órgão transplantado ao impedir a activação e proliferação dos linfócitos T, mediante a inibição da síntese das linfocinas. O mecanismo de acção da CsA é baseado na inibição da actividade da fosfatase da calcineurina. Desta forma, evita-se a desfosforilação do NF-ATc das células T, imprescindível na translocação ao núcleo e no início da síntese de interleucina-2. Desde o aparecimento da CsA na prática clínica que a maioria dos protocolos de imunossupressão nos transplantes se baseiam neste fármaco. Não obstante, o tratamento com a CsA é acompanhado de importantes efeitos secundários como a hipertensão arterial e a toxicidade renal e os seus efeitos causam problemas clínicos críticos que limitam a extensão do seu uso em algumas outras doenças imunológicas. O desenvolvimento de hipertensão arterial durante o tratamento com CsA é um facto quase “universal” que ocorre tanto em transplantados como em não transplantados. Um dos aspectos mais preocupantes da toxicidade provocada pelo uso da CsA é a possibilidade de que os efeitos tóxicos estejam directamente relacionados ou sejam idênticos aos efeitos imunossupressores . Será que ao tentar uma atitude terapêutica que bloqueie a toxicidade da CsA não se esteja a fazer o mesmo com o efeito terapêutico do fármaco. A resposta ainda não está dada e passará pela elucidação dos mecanismos intracelulares da toxicidade da CsA. 196 Síntese e conclusões _________________________________________________________________________ A hipertensão arterial aparece com concentrações sanguíneas normais (necessárias para garantir uma óptima imunossupressão) e requer tratamento farmacoterapêutico. O mecanismo pelo qual a CsA provoca hipertensão continua por esclarecer, pelo menos na sua totalidade. Contudo, hoje é evidente que o mecanismo não deverá depender exclusivamente de um determinado factor ou de efeitos desencadeados num determinado sistema, antes será uma patologia com uma causa multifactorial. Na hipertensão, o relaxamento dependente do endotélio apresenta-se reduzido nos modelos experimentais assim como nos pacientes. Os mecanismos são complexos e envolvem, entre outras, uma redução na produção de NO, um aumento da produção de prostaglandinas vasoconstritoras e possivelmente uma alteração na libertação ou na acção de outros factores de relaxamento como o factor hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF). Hoje, sabe-se que o NO é um multifacetado mensageiro celular, ubiquísta e “sem igual”, envolvido na regulação de diversos processos fisiológicos incluindo a contractilidade do músculo liso, a reactividade plaquetar, a neurotransmissão central e periférica e as acções citotóxicas das células imunológicas. O NO é crucial para muitas funções fisiológicas e uma libertação “desregulada” deste mediador tem sido relacionada com variadas patologias. Do nosso estudo, devem realçar-se os seguintes aspectos: 1. A administração de CsA, na dose de 5 mg/Kg/dia, induziu hipertensão arterial no nosso modelo animal experimental, reproduzindo o desenvolvimento de hipertensão arterial encontrada em doentes sujeitos ao tratamento clínico com a CsA. 2. A hipertensão arterial induzida pela CsA no rato caracterizou-se por um aumento da pressão arterial média, apresentando ao mesmo tempo um aumento da pressão 197 Capítulo IV _________________________________________________________________________ arterial sistólica e um aumento da pressão arterial diastólica, sem alteração da frequência cardíaca. 3. Se se adicionar a L-arginina, o substrato da NOS, ao tratamento com a CsA, o aumento da pressão arterial sistólica é semelhante aquele que se atinge com o uso de CsA. Mas, o aumento da pressão arterial diastólica é apenas parcialmente anulado. 4. Os principais parâmetros hematológicos avaliados não mostraram diferenças significativas entre os ratos do grupo controlo e os ratos tratados com CsA. 5. Os estudos bioquímicos na aorta de ratos tratados com CsA evidenciaram que esta induz alterações que parecem ser subjacentes, se não mesmo determinantes, para a hipertensão arterial idiopática: um decréscimo de cerca de 30% no conteúdo de NO no segmento total da aorta em relação ao grupo controlo. Tal facto poderá indiciar um bloqueio da síntese e/ou maior libertação endotelial de NO, podendo este ocorrer em qualquer um dos passos desta; um decréscimo de cerca de 66% no conteúdo de GMPc no segmento total da aorta em relação ao grupo controlo. Este dado pode sugerir que além da modificação da síntese do NO a nível endotelial, a sua efectividade também pode estar comprometida. Além deste facto, convém salientar que a acção da CsA também deverá manifestar-se directamente sobre a formação de GMPc; a hiperreactividade vascular, pelo menos resultante da diminuição destes factores, é contrariada pela administração de L-arginina; 198 Síntese e conclusões _________________________________________________________________________ um decréscimo de 45% no conteúdo de PGI2 no segmento total da aorta em relação ao grupo controlo o qual tal deverá contribuir para o aumento da resistência vascular periférica e para o aumento da tensão arterial diastólica. Tais variações poderão contribuir para a hipertensão arterial induzida pela CsA, sobretudo se ocorrerem também nos vasos de resistência, porque provavelmente o relaxamento diminui. Além disso, a diminuição da produção vascular de NO aumenta necessariamente a resistência vascular periférica ao reduzir o tónus vasodilatador. 6. Os estudos bioquímicos nas plaquetas indicam que os ratos tratados com CsA apresentam em relação ao grupo de ratos controlo: um aumento do conteúdo de NO plaquetar. um aumento do teor de GMPc plaquetar. o que provavelmente lhe induz um estado não reactivo ou “antihiperreactivo”. Aliás, parece ser essencialmente este último, porque há alterações morfológicas das plaquetas encontradas pelo nosso grupo de trabalho, embora insipientes e indiciadas pela formação de pseudópodes, dismorfia e alteração da estrutura membranar, indicadoras de um estado reactivo. 7. Os teores plasmáticos de PGI2 no grupo de ratos tratados com CsA estavam aumentados em relação aos do grupo controlo e uma vez que esta é o principal inibidor da agregação das plaquetas, o seu aumento poderá contribuir para a contraregulação do estado hiperactivo das plaquetas. Apesar da L-arginina reverter a diminuição de NO e de GMPc vascular e normalizar os valores plaquetares, não previne de forma eficaz o desenvolvimento de hipertensão arterial, quer da pressão arterial sistólica quer da pressão arterial diastólica. Este dado parece indicar, tal como, extensamente discutido, a existência de outras passos 199 Capítulo IV _________________________________________________________________________ da via da L-arginina:NO:GMPc alterados pela administração da CsA e não apenas o substrato da NOS. Assim, deverá ser equacionada uma abordagem terapêutica com outro grupo de dadores de NO que não se cinjam à simples suplementação do substrato. 200 Síntese e conclusões _________________________________________________________________________ 201 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 202 203 Referências bibliográficas _________________________________________________________________________ Bibliografia Admiraal PJ, Derkx FH, Jandanser AH et al. (1990). 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