Biologia Molecular

Biologia Molecular
Evidências de que o DNA é a molécula da hereditariedade.
Estrutura e propriedades dos ácidos nucleicos: DNA e RNA.
Replicação e reparo do DNA .
Mutações: causas e efeitos.
Transcrição e processamento do RNA.
Código Genético.
Biossíntese de proteínas (Tradução)
Estrutura dos ácidos nucleicos e Desnaturação e Renaturação do DNA
Estrutura dos ácidos nucleicos
O DNA é uma macromolécula filamentar muito longa, feita de um grande número de unidades
de desoxirribonucleotídeos.
Os nucleotídeos são compostos por: um açúcar (pentose), a desoxirribose (DNA) ou a ribose
(RNA), uma base nitrogenada (base nitrogenada heterocíclica) ligada ao carbono 1’ da pentose e um ou
até 3 grupos fosfatos (PO4-), ligados ao carbono 5’ da pentose
As bases nitrogenadas podem ser:
Purinas – adenina (A) e guanina (G)
Pirimidinas – citosina (C) e timina (T) ou uracila (U)
As bases ligam-se ao carbono 1’ da pentose através de uma ligação glicosídica b. A molécula
composta pela base nitrogenada ligada ao açúcar, sem grupos fosfato, é denominada nucleosídeo.
Os desoxirribonucleotídeos são denominados de acordo com a base nitrogenada componente.
Na molécula de DNA, os desoxirribonucleotídeos formam cadeias ligadas entre si por pontes
fosfodiésteres estabelecidas entre o grupo fosfato e o grupo OH (hidroxila) do carbono 3’ do nucleotídeo
adjacente.
Todos os nucleotídeos na cadeia polipeptídica (DNA) têm a mesma orientação relativa. Estando o
carbono 5’ da pentose voltado para cima, todos os demais nucleotídeos da cadeia estarão na mesma
posição. Isso confere às cadeias polinucleotídicas direcionalidade. Na extremidade 5’ da cadeia, um
grupo fosfato está presente e, na extremidade 3’, um grupo OH. As cadeias polipeptídicas são, por
convenção, representadas na orientação 5’ ® 3’ e apenas as letras indicativas das bases nitrogenadas são
representadas.
Ex:5’ AACGTTGCTATCGT 3’
Dupla-Hélice do DNA:
Em 1953, James Watson e Francis Crick propuseram um modelo de
estrutura tridimensional do DNA, baseado, principalmente, nos estudos de difração de raio X de
Rosalind Franklin e Maurice Wilkins e em estudos químicos da molécula.
Este modelo demonstrou que o DNA é uma dupla-hélice e que duas fitas de DNA se enrolam em torno
do eixo da hélice. As ligações fosfodiesteres nas duas fitas estão em direções opostas – uma na direção
5’ ® 3’ e a outra 3’ ® 5’ – sendo antiparalelas. Os anéis aromáticos das bases nitrogenadas são
hidrofóbicos e ficam orientados para o interior da estrutura e as desoxirribose ficam externas exposta ao
meio aquoso.
As bases estão pareadas entre as duas fitas da moléculas, mantendo sua estrutura. Este
pareamento de bases é fundamental para a manutenção das dupla-hélice.
A presença de grupos cetônicos (-C O) e grupo amino (C-NH2) permite a formação de pontes
de hidrogênio entre as bases. Desta forma:
T e U podem parear com A – formando 2 pontes de hidrogênio.
C pode parear com G - formando 3 pontes de hidrogênio.
As ligações glicosídicas no DNA, entre as desoxirriboses e as bases nitrogenadas, não estão
diretamente opostas na dupla-hélice, gerando duas cavidades desiguais em seu contorno. As duas
cavidades são denominadas de cavidade (ou sulco) maior e cavidade (ou sulco) menor.
Várias forças agem em conjunto para estabilizar a estrutura da dupla-hélice do DNA. Além das
ligações covalentes, que unem os átomos nas moléculas, outras forças mais fracas atuam no DNA, entre
elas forças de Van der Walls (entre os anéis aromáticos de bases adjacentes).
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O pareamento de bases tem grande significado fisiológico e, devido a ela, as duas fitas de
DNA são ditas complementares. Essa propriedade garante a replicação precisa de cadeias longas de
DNA e a transmissão das informações genéticas às proteínas, vias transcrição.
Estrutura do RNA
Existem semelhanças entre a estrutura do RNA e do DNA. Ambos são polímeros lineares de
subunidades ligadas entre si por ligações fosfodiésteres 5’ ® 3’. Entretanto, na molécula de RNA, o
açúcar presente é a ribose, e a timina (T) é substituída pela uracila (U). As outras 3 bases adenina,
citosina e guanina estão presentes. O RNA está normalmente na forma de fita simples, embora
pareamento entre C e G e entre A e U possam ocorrer entre regiões da própria cadeia, formando
estruturas secundárias que são importantes na função dos RNAs e no reconhecimento proteínas-RNA.
Alguns RNA podem formar fita dupla. Alguns vírus podem ter RNA de fita dupla no genoma.
Os híbridos RNA-DNA são formados em diferentes processos na célula, como por exemplo na
transcrição.
Desnaturação e Renaturação do DNA
Os termos desnaturação e renaturação são sinônimos de fusão e reanelamento, respectivamente.
Esses fenômenos físicos que ocorrem com o DNA dupla-hélice são fundamentais para os processos de
replicação, transcrição e recombinação.
A desnaturação ocorre quando as pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA são
rompidas e as fitas se separam.
·
·
·
A desnaturação da estrutura secundária do DNA pode ser obtida:
aumento de temperatura
titulação com substâncias ácidas ou álcalis
por agentes desnaturantes como a formamida e o dimetil sulfóxido (DMSO).
Os ácidos protonizam os anéis nitrogenados de A, G e C e os álcalis desprotonizam os anéis
nitrogenados de G e T. Esses tratamentos geram grupos carregados no interior da dupla-hélice, o que
leva ao rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases complementares. Como as ligações
glicosídicas nas purinas que são sensíveis ao pH baixo, a desnaturação por ácido tem pouca aplicação
prática.
A desnaturação do DNA pode ser acompanhada pela medida em espectrofotômetro da absorbância (260
nm) da luz ultravioleta (UV). As bases nitrogenadas são responsáveis pela maior parte dessa absorção.
Fitas completamente separadas – A260nm = 37% maior que o DNA na sua forma nativa.
A temperatura na qual 50% do DNA se encontra desnaturado é chamado de Tm.
Para romper um par GC é necessário:uma temperatura mais elevada , pH mais alto ou maiores
concentrações de agentes desnaturantes do que para separar um par AT.
Assim:
O Tm de um par DNA depende da proporção de AT em relação a GC.
Tm (°C) = 69,3 + 0,41 (GC%)
Mesmo quando as fitas do DNA está completamente separadas, o processo pode ser revertido. A
renaturação do DNA tb pode ser acompanhada por espectrofotometria.
Dna desnaturado por calor for lentamente resfriado as fitas complementares se reassociam e a absorção a
260 nm diminui. Esse anelamento ocorre normalmente 25°C abaixo da Tm
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Organização gênica de procariotos
As moléculas de DNA são empacotadas em estruturas chamadas de cromossomos. A maioria das
bactérias e vírus possuem um único cromossomo; os eucariotos possuem muitos cromossomos.
Um único cromossomo tem milhares de genes, a soma de todos os genes e DNAs intergênicos
em todos os diferentes cromossomos da célula é chamado de genoma celular.
Os 23 cromossomos do genoma humano de 3 bilhões de pares de bases possui um comprimento de
contorno de 1 m. a maioria dos eucariotos condensa e compacta seu genoma em vários cromossomos.
O genoma procariótico é normalmente composto por uma única molécula circular de DNA.
Cada cromossomo é um complexo de uma única molécula linear de DNA e proteína, um
material conhecido como cromatina.
O DNA nos cromossomos eucarióticos portanto está fortemente ligado a um grupo de pequenas
proteínas básicas chamadas histonas. De fato as histonas constituem a metade da massa da cromatina, os
cincos principais classes de histonas são: H1, H2A, H2B, H3 e H4 – possuem uma grande porção de
resíduos com carga positiva (Arg e Lys). Essas proteínas podem, portanto ligar-se aos grupos fosfatos
negativamente carregados do DNA por meio de interações eletrostáticas. A outra metade da massa da
cromatina é de DNA.
Organização gênica de procariotos.
Um gene de eucarioto ou de procarioto pode ser definido como toda a seqüência nucleotídica
necessária e suficiente para a síntese de um peptídeo ou de uma molécula de RNA estável.
Seqüências reguladoras – são as seqüências nucleotídicas que determina e controla a
transcrição
Os genes que codificam rRNAs (RNA ribossomal), tRNAs (RNA transportador) ou outras classes de
RNAs menores são transcritos e não são traduzidos.
A tradução só ocorre a partir de um mRNA (RNA mensageiro) sintetizado a partir de genes que
codificam por exemplo, uma proteína.
A expressão de um gene é o processo que inclui a sua transcrição (síntese de um RNA
funcional a partir da seqüência de nucleotídeo do DNA). E a eventual tradução do RNA correspondente
numa seqüência de aminoácido.
O DNA é uma molécula fita dupla que armazena as informações relativas ao desenvolvimento e
divisão das células. A informação genética contida na molécula de DNA na célula de um ser vivo
compreende o seu genoma. Um gene é uma pequena parte codificante do genoma, responsável pela
determinação dos traços hereditários dos organismos vivos.
Em sua estrutura os genes possuem uma região chamada de promotor, responsável por sua
ativação (expressão). O gene possui além do promotor em sua estrutura, uma região codificadora e uma
região terminadora.
Um promotor é um segmento de DNA (sítio no DNA) onde se liga a RNA-polimerase, a
enzima responsável pela transcrição do gene.
Região codificadora – constituída pela seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de
aminoácido de cada cadeia polipeptídica ou um RNA estável (ex: rRNA ou um tRNA), ou seja, é o
segmento de DNA usado para sintetizar uma proteína ou um RNA estável.
Terminador – é a seqüência de nucleotídeos que sinaliza o final da síntese da molécula de
mRNA.
Os genes procariotos também possuem um promotor e uma região regulatória chamada
operador, que são sítios de ligação de proteínas repressoras da transcrição. Os operadores localizam-se
em posições vizinhas aos promotores (anteriores ou posteriores) à do promotor, podendo às vezes haver
sobreposição desses elementos.
A grande maioria dos genes procariotos está organizada na forma de operons.
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Operons – refere-se a dois ou mais genes adjacentes que estão sob o controle de um mesmo
promotor, ou seja, são dois ou mais genes que ocupam posições vizinhas que codificam proteínas com
funções relacionadas (ex: proteínas que participam de uma mesma via metabólica).
-
-
-
Os genes das bactérias, com exceção das arquebactérias, não possuem íntrons.
Os diferentes genes contíguos presentes num operon são co-transcritos num único RNA,
chamado de RNA policistrônico.
O número de genes presentes varia de operons para operons, assim é variável de o número de
nucleotídeo que separa uma região codificadora para outra. O tamanho destas regiões intercistrônicas
varia entre 1 e 40 pb (pares de bases).
O genoma de uma bactéria típica consiste em um único cromossomo formado de uma molécula
de DNA dupla fita circular e covalentemente fechada. O tamanho do genoma é menor do que de
qualquer organismo eucariótico.
Elementos genéticos móveis
Os procariotos (principalmente uma grande maioria de bactérias) também podem possuir
unidades gênicas acessórias, que são denominados de elementos móveis.
São eles:
vírus que infectam as bactérias (bacteriófagos)
plasmídeos– pequenos elementos extracromossomais
elementos transponíveis – seqüênicas de DNA que codificam enzimas capazes de catalisar a replicação
e a transferência desses elementos para outro sítio do genoma
Plasmídeos:
São pequenos elementos genéticos extracromossomais com capacidade de replicação autônoma, que não
possuem uma forma extracelular. A grande maioria dos plasmídeos é formada por moléculas de DNA de
fita dupla circular, embora existam poucos plasmídeos de DNA fita dupla linear.
capacidade de auto-replicação– possui ponto de origem (oriC)
O tamanho do plasmídeo pode variar de 1 a 1.000 Kb
A seqüência de nucleotídeos tem pouca ou nenhuma homologia com o cromossomo da célula
hospedeira.
O plasmídeo pode ser de cópia única ou multicópia
Classificação dos plasmídeos:
plasmídeos naturais
plasmídeos artificiais – construídos pela alteração genética dos plasmídeos naturais ou artificiais préexistentes – serve como ferramenta para as técnicas de Biologia Molecular.
Plasmídeos transmissíveis - capazes de se manter em vários grupos de bactérias.
Podendo ser: - de repertório de hospedeiro restrito
- de repertório de hospedeiro amplo.
Funções codificadas dos plasmídeos:
Muitos plasmídeos além de possuírem todas as seqüências necessárias para a autoduplicação
(replicação), contêm uma considerável quantidade de informação genética adicional.
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Ex: as bactérias Shigella (que causa disenteria no homem) só são patogênicas quando portadoras de um
plasmídeo que contém uma série de genes de virulência (esses genes codificam proteínas responsável
pela adesão da bactéria na mucosa intestinal e invasão do epitélio).
Ex: plasmídeos R ou fatores R (R= resistênicia) – que confere resistênica a antibióticos e outros
agentes antibacterianos – como veremos adiante em conjução bacteriana, muitas bactérias portadoras
do plasmídeo R podem transferi-los para outra bactéria antes sensível, por contato célula-célula. Os
genes de resistência codificam enzimas que inativam (por modificação química) ou degradam classes
específicas de antibióticos ou que alteram a permeabilidade da célula a essas drogas
Alguns plasmídeos conjugativos possuem genes adicionais – genes de transferência (genes tra) – que
confere a capacidade de dirigir a sua transferência para outra célula.
Conjugação – é o processo pelo qual as bactérias transferem o material genético (plasmídeos)
para outra através de um contato direto célula-célula. Durante a conjugação de E.coli, um dos
participantes, o macho, é o doador genético e a fêmea é o receptor genético.
Replicação do DNA em procariotos
A replicação de DNA envolve uma variedade de enzimas, muita dessas enzimas foram isoladas
primeiramente em procariotos sendo, portanto melhor compreendidas em procariotos. Assim iniciamos
com a descrição sobre a replicação de E. coli.
Na bactéria E. coli, há uma região do DNA que contém a origem de replicação do cromossomo
chamada de oriC, que apresenta uma seqüência rica em CATC que são sítios de metilação na Adenina
das duas fitas do DNA.
Em células eucarioticas, o processo de replicação ocorre durante o período de síntese (S) do ciclo
celular.
Origem de replicação:
-
A replicação do DNA ocorre ao longo da molécula, a partir de um ponto de origem.
origem isolada de procariotos e de alguns eucariotos – são ricas em sequência AT.
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células procarióticas, vírus e plasmídeos – só tem 1 origem de replicação.
-
células eucarióticas – várias origens de replicação
Replicação do cromossomo de E. coli.
A síntese de uma molécula de DNA pode ser dividida em 3 etapas: iniciação, alongamento e terminação.
A oriC (ponto de origem da replicação) consiste de 245 pares de bases (pb) muito dos quais são
altamente conservados entre as bactérias.
Enzimas que participam da fase de iniciação:
-
-
DnaA – a ligação da dnaA a quatro locais em oriC próximos aos grupos de 13 ricos em AT inicia um
intrincado processo de etapas que levam ao desenrolamento do molde de DNA e síntese de um primer. O
DNA tem que ter superelicoidização negativa para possibilitar a ligação de dnaA.
As proteínas dnaB e dnaC juntam-se à dnaA para dobrar e abrir a dupla hélice.
A proteína dnaB é uma helicase: ela catalisa o desenrolamento da dupla-hélice de DNA.
A parte desenrolada do DNA é então estabilizada por uma proteína ligadora de fita simples (SSB) a um
filamento de DNA.
O desenrolamento do DNA circular na origem produz uma superelicoidização positiva, que tem que ser
aliviada para permitir que a replicação continue. O alívio é fornecido pela enzima DNA girase, que
introduz superélice negativa à medida que hidrolisa ATP.
O molde do DNA é então exposto, mas o novo DNA não pode ser sintetizado até que um primer seja
construído. (lembre-se que a DNA polimerase necessita de um primer com uma 3’ OH livre para a
síntese do DNA). O RNA serve como primer para a síntese do DNA. A RNA polimerase, chamada de
primase junta-se ao pré-primer em uma montagem de múltiplas subunidades chamado de primossomo.
A primase sintetiza um filamento curto de RNA (~5 nucleotídeos) que é complementar ao filamento
molde do DNA.
Obs: O primer de RNA é removido no final da replicação pela atividade 5’ → 3’ da DNA polimerase I.
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A holoenzima DNA polimerase III catalisa a formação de muitos milhares de ligação fofodiester antes
de liberar seu molde (a DNA polimerase III não deixa o molde de DNA até que ele tenha sido replicado),
em comparação a apenas 20 para a DNA polimerase I ( usado como preenchedora de espaço ou de
reparo).
A DNA polimerase III se posiciona na forquilha de replicação, onde começa a síntese da fita contínua
(leading) e da fita descontínua (lagging). Usando o primer de RNA formado pela primase. A proteína de
ligação (SSB) mantêm o DNA desenrolado distendido e acessível, de modo que ambos os filamentos
podem servir como molde.
O fita contínua (5’→3’) é sintetizada continuamente pela polimerase III, que são libera o molde até que a
replicação tenha sido completada. A DNA girase concomitantemente introduz superélices negativas para
evitar uma crise topológica.
A fita descontínua (3’→5’) é sintetizada em fragmentos pela polimerase III de modo que a
polimerização 5’→ 3’ leva um crescimento geral no sentido 3’→5’. A DNA polimerase III deixa a fita
descontínua após cerca de 1000 nucleotídeos adicionados, formando um fragmento de Okazaki. Um
novo primer é sintetizado pela primase para iniciar a formação de um novo fragmento de Okazaki.
Os espaços entre os filamentos nascentes (fragmento de Okazaki) são preenchidos pela DNA polimerase
I. Esta enzima também usa a sua atividade de exonuclease 5’→ 3’ para remover o primer de RNA. O
primer não pode ser removido pela DNA polimerase III porque a enzima não tem a atividade de
exonuclease 5’→ 3’. Finalmente a DNA ligase une os fragmentos.
Resumindo a função de cada enzima:
Proteína
função
Helicase (dnaB)
Primase
SSB
DNA girase
DNA polimerase III
DNA polimerase I
DNA ligase
Desenrola a dupla hélice
Sintetiza primers de RNA
Estabiliza regiões unifilamentares
Introduz superélices negativas
Sintetiza o DNA
Elimina o primer e preenche os espaços
Une as pontas do DNA
Alguns Vírus tumorais com RNA e outros retrovírus se replicam por meio de DNAs
intermediários de dupla hélice.
Quando o RNA viral entra na célula hospedeira. Este RNA é o molde para a síntese de um
filamento complementar de DNA pela enzima transcriptase reversa, uma enzima viral que também entra
na célula hospedeira. A trasncriptase reversa sintetiza o Dna a partir do RNA, formando o híbrido DNARNA. O novo DNA serve como molde para a síntese da sua dupla fita, esta dupla fita de DNA viral fica
incorporado no DNA cromossômico do Hospedeiro e se replica juntamente com o DNA celular normal
no curso da divisão celular. Posteriormente, o genoma viral integrado se expressa para formar o novo
RNA e proteínas virais, que se juntam em novas partículas virais.
Mutações e Reparo do DNA
Mutações de DNA
As moléculas de DNA de um organismo não são estáticas. Freqüentemente, suas bases estão expostas a
agentes, naturais ou artificiais, que provocam modificações na sua estrutura ou composição química.
Modificações na informação genética, que resultam em células ou indivíduos com alterações fenotípicas,
são denominadas de mutações.
Mutante é todo organismo que exibe uma forma diferente da de seus ascendentes, a qual é o resultado da
presença de uma mutação.
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Mutação refere-se a qualquer modificação súbita e hereditária no conjunto gênico de um organismo, que
não é explicável pela recombinação da variabilidade genética preexistente.
Essas modificações incluem:
1- mudanças no número de cromossomos
2- mudanças grosseiras na estrutura cromossômica (aberrações cromossômicas)
3- e alterações nos genes individuais.
A mutação é a fonte básica de toda a variabilidade genética, constituindo a matéria prima para a
evolução. A recombinação apenas rearranja essa variabilidade em combinações novas e a seleção natural
(ou artificial) simplesmente preserva as combinações mais bem adaptadas às condições ambientais
existentes (ou desejadas).
Mutações espontâneas - Todos os seres vivos sofrem um certo número de mutações, como resultado de
funções celulares normais ou interações aleatórias com o ambiente.
Mutações induzidas – São mutações que ocorre devido ao tratamento com determinados compostos.
Tais compostos são denominados de agentes mutagênicos.
Muitos mutagênicos atuam diretamente no DNA, devido a sua capacidade de atuar como uma
determinada base ou de incorporar-se à cadeia polinucleotídica. O efeito de um dado mutagênico é
medido pelo grau em que ele aumenta a freqüência de mutação.
Qualquer base do DNA pode ser mutada. Uma mutação pontual envolve modificação em um único par
de bases (substituição, adição ou deleção) e pode ser o resultado de um mau funcionamento do sistema
celular que replica ou repara o DNA, inserindo uma base incorreta na cadeia polinucleotídica que está
sendo sintetizada, ou de uma interferência química diretamente sobre uma das bases do DNA.
A maioria das mutações úteis para a análise genética de muitos processos biológicos são mutações
letais condicionais. Essas mutações são aquelas letais em um ambiente, nas denominadas condições
restritivas, mas são viáveis em um segundo ambiente, em condições permissivas.
Mutantes auxotróficos - são incapazes de sintetizar um metabólito essencial (ex: um aminoácido) e que
é sintetizado pelos indivíduos de tipo selvagem da espécie. esses mutantes crescem e se reproduzem
quando o metabólito é fornecido pelo meio (a condição permissiva) e não cresce quando o metabólito
está ausente (condição restritiva).
Mutantes sensíveis à temperatura - que são viáveis em uma determinada temperatura, mas não em
outra, por exemplo, uma enzima que é ativa em temperaturas baixas, mas parcialmente ou totalmente
inativa em temperaturas elevadas.
Mutações a nível molecular:
Modificações tautoméricas - alteram o pareamento de bases normal, A timina se parea com guanina e a
adenina pode parear com a citosina. Quando a adenina parea com a citosina, o par A *.C (o asterisco
denota a forma tautomérica), incorpora, uma citosina na cadeia de DNA no lugar reservado a uma
timina. No próximo ciclo de replicação, a adenina irá parear com uma timina, e a citosina, incorporada
erroneamente em uma das fitas da cadeia, será mantida e irá parear com uma guanina. Assim uma das
cadeias-filhas das moléculas de DNA irá conter um par G.C no lugar do par de bases correta A.T.
As mutações resultantes de modificações tautoméricas nas bases do DNA envolvem a substituição de um
par de bases por outra – mutação pontual.
Transição - a substituição de uma purina por outra purina ou de uma pirimidina por outra pirimidina.
Transversão – é a substituição de uma purina por uma pirimidina ou vice-versa.
Um terceiro tipo de mutação pontual é a mutação que modifica a fase de leitura, porque altera a fase
de leitura de todas as trincas de pares de bases no gene, depois de sítio mutado.
A maioria das bases colocadas erradas durante a replicação em E. coli é corrigida pela atividade 3’ →
5’ da DNA polimerase III.
Considerando os sítios de mutações no interior de uma seqüência de DNA, a pergunta que surge é: todos
os pares de bases de um gene são igualmente suscetíveis à mutação ou existem sítios em que a
probabilidade de ocorrer uma mutação é maior?
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Sítios quentes (hoptspots) - sítios que ocorre um número de mutações maior, diferentes mutagênicos
pode ter diferentes “sítios quentes”.
Mutações silenciosas – mutações sem efeito aparente. Elas dividem-se em 2 grupos: aqueles que
envolve troca de base no DNA, mas não envolve em troca de aminoácido presente na proteína, ou
aqueles que levam à troca do aminoácido, mas a substituição não afeta a atividade da proteína. Essas
últimas são chamadas de mutações neutras.
Mutação direta ou deletéria - é aquela que inativa o gene. A ocorrência de uma Segunda mutação em
um local diferente do genoma, que de alguma forma compensa a primeira mutação é denominada
mutação supressora ou reversão de um segundo sítio, pois suprime os efeitos da mutação original.
Mecanismos de reparo do DNA
A maioria das mutações é desvantajosa para as células. Para que essas células sobrevivam, elas
necessitam de mecanismos enzimáticos para reverter os efeitos de processos mutagênicos.
Como vimos no estudo de mutações do DNA, as bases podem ser alteradas ou perdidas, as
ligações fosfodiésteres podem ser quebradas e as fitas livres podem ser cruzadas e covalentemente
ligadas. Essas lesões são produzidas por radiações ionizantes, como a luz ultravioleta (U.V), por
exemplo, e compostos químicos.
Os mecanismos de reparo do DNA atuam no DNA lesado de tal forma que a informação genética
perdida em uma fita pode ser recuperada a partir da fita complementar.
Os sistemas de reparação são melhor compreendidos e estidados no E. coli.
Reparação por fotorreativação enzimática
Um mecanismo de reparo bem estudado é a remoção dos Dímeros de Pirimidinas que são
formados pela exposição do DNA a luz U.V.
Resíduos
de
pirimidina
ficam
covalentemente
ligados
nesta
situação
Um dos mecanismos de reparo é:
Os dímeros de pirimidina são o alvo universal da enzima fotoliase que se liga ao dímero e
catalisa uma reação fotoquímica que na presença da luz visível desfaz o anel ciclobutânico formado pela
luz U.V., refazendo as bases individuais. Esse processo é chamado de fotorreativação e envolve duas
etapas:
1. A enzima fotoliase reconhece e liga-se ao dímero no escuro;
2. A absorção de luz fornece energia para converter o dímero em monômero de pirimidina e após
terminado o processo, a enzima dissocia-se do DNA.
OBS: Em E. coli o gene (phr), é quem codifica a fotoliase.
Reparação por excisão: a fita de DNA complementar não é danificada e é utilizada como molde
para a substituição do fragmento lesado.
Excisão de base
A citosina do DNA pode ser desaminada espontaneamente em uma freqüência perceptível para
uracila.
G – C desaminação
G–U
A desaminação da citosina é um evento mutagênico porque a uracila vai parear com a
adenina e assim, uma das moléculas-filhas irá conter um par de bases A-U no lugar do original GC.
G–C
G – C→ desaminação G – U → replicação
A–U
O sistema de reparo reconhece a uracila (base estranha ao DNA) e assim a enzima uracila-DNAglicoliase hidrolisa a ligação glicosídica entre a uracila e as moléculas de desoxirribose (neste estágio, a
cadeia de DNA está intacta, mas a base é perdida). Esta fenda chama-se sítio AP.
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A enzima AP endonuclease reconhece o defeito e cliva a cadeia em regiões vizinhas à da base
perdida.
Depois vem a DNA polimerase I que remove o nucleotídeo e insere a citosina. Quando a fita é
corrigida, a DNA ligase une os nucleotídeos.
Reparo por cisão de nucleotídeos (REN)
1.
2.
3.
4.
5.
Este processo consiste em 5 etapas:
Reconhecimento da lesão;
Incisão da fita lesada em ambos os lados da lesão;
Excisão do segmento (contendo a lesão);
Síntese de um novo segmento de DNA ® utilizando a fita não danificada como molde;
Ligação do fragmento recém sintetizado.
1 - Início UvrA dimeriza na presença de ATP com UvrB
Este dímero liga-se fracamente ao DNA e sua atividade de helicase permite que se mova ao longo
da fita do DNA a procura das mutações. Quando este encontra a lesão, os complexos UrvA-UrvB
desnaturam parcialmente a cadeia, permitindo que a UvrC se ligue ao complexo e a UvrA se dissocie da
molécula ® Complexo UvrB-C
Complexo UvrB-C ® promove a incisão da fita danificada (± 8 nucleotídeos da extremidade 5’ da
lesão e 4 a 5 nucleotídeos 3’ da lesão). Esta quebra também requer ATP na excisão ± 12 a 13
nucleotídeos.
A DNA-polI e a UvrD - promovem a excisão ao segmento e a síntese da nova fita complementar
seguindo como molde a fita complementar intacta.
DNA ligase une as extremidades e a cadeia é reparada
Reparação de bases mal pareadas
Algumas bases incorretamente pareadas escapam da revisão da DNA polimerase durante a
replicação.
Em E. coli o sistema de correção de erro consiste em várias proteínas codificadas pelos genes mut.
Esse sistema percorre o DNA recém sintetizado a procura de pares de bases mal pareados e
remove os segmentos de fita simples contendo os nucleotídeos incorretos, permitindo que a DNA
polimerase insira a base correta na lacuna formada.
Etapas do processo em E. coli
A MutS liga-se ao par de bases mal pareada ;
A MutL liga-se a MutS para formar o complexo entre MutS e MutH;
MutS - reconhece o erro e se desloca ao longo do DNA. A MutS liga-se tanto ao local da lesão
quanto na região vizinha da lesão do DNA, formando uma alça de DNA nessa região.
A endonuclease de MutH cliva então a fita e remove o segmento contendo a lesão e é ajudada
pela UvrD (helicase)
Exonuclease VII - cliva 5’→3’
Exonuclease I - cliva 3’ → 5’
A fita DNA nova é sintetizada pela DNA-pol III e a DNA ligase liga o fragmento
SÍNTESE DE RNA – TRANSCRIÇÃO
Introdução e conceitos:
Transcrição é o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir de um molde de DNA.
Através da transcrição, são sintetizados todos os tipos de RNAs da célula, ou seja, o RNA mensageiro
(mRNA), o RNA ribossômico (rRNA), o RNA transportador (tRNA) e outros RNAs menores. Todos os
RNAs estão envolvidos ativamente na síntese protéica.
O mRNA será usado para transferir a informação genética do DNA às proteínas, mas os demais RNAs
sintetizados têm, por si, funções finais na célula, tanto
estruturais como catalíticas. É principalmente durante a transcrição que a célula exerce o controle da
expressão gênica. O processo de transcrição é regulado por proteínas. Na maioria dos casos, o principal
ponto de regulação da atividade de um gene é a decisão de iniciar ou não a sua transcrição. Dependendo
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da necessidade da célula, o mesmo gene pode ser transcrito incontáveis vezes até que a demanda seja
suprida. Além da característica temporal da transcrição, este é um processo extremamente seletivo.
Mecanismos de transcrição:
A transcrição ocorre a partir da informação contida na seqüência de nucleotídeos de uma molécula de
DNA fita dupla, sendo sempre no sentido 5' → 3'. Apenas uma das fitas do DNA, chamada de fita
molde, é utilizada durante a síntese, que segue as mesmas regras de complementaridade e
antiparalelismo, exceto pelo pareamento de uracil (U), ao invés de timina (T), com adenina (A). O RNA
recém sintetizado (5' →3') é, portanto, complementar à fita de DNA que serviu de molde (3' → 5'), essa
fita é chamada de fita molde ou anti-senso. A outra fita de DNA (5' →3') que tem a seqüência idêntica
ao do RNA transcrito, exceto por T (timina) no lugar do U (uracila) é chamada de fita codificadora ou
senso.
Por convenção, entretanto, a seqüência de nucleotídeos de um gene é sempre representada na orientação
5' → 3'. Em 1960 foi descoberta uma enzima capaz de, na presença de DNA fita dupla e dos
ribonucleotídeos trifosfatados (ATP, CTP, GTP e UTP), sintetizar RNA. Essa enzima foi denominada
RNA-polimerase (RNAP). A reação catalisada pelas RNAPs é mecanisticamente idêntica à reação
catalisada pelas DNA polimerases.
As RNAPs desempenham todas as atividades necessárias para a transcrição:
1) reconhecem e ligam-se a seqüências específicas de DNA;
2) desnaturam o DNA, expondo a seqüência de nucleotídeos a ser copiada;
3) mantêm as fitas de DNA separadas na região de síntese;
4) mantêm estável o duplex DNA:RNA na região de síntese;
5) restauram o DNA na região imediatamente posterior à da síntese; e
6) sozinhas ou com auxílio de proteínas específicas, terminam a síntese do RNA.
Existem, pelo menos, cinco RNAPs diferentes que estão envolvidas na síntese de RNAs específicos:
RNAP I, RNAP II, RNAP III, RNAP mitocondrial (mtRNAP), e RNAP de cloroplastos.
Embora consigam sintetizar RNA a partir de nucleotídeos livres, as RNA polimerases sempre precisam
de proteínas acessórias, chamadas de fatores de transcrição, que auxiliem o início da transcrição. São
estes fatores que identificam ao longo de um gene as seqüências específicas no DNA que indicam o local
de início da transcrição, ou seja, a partir de qual base o gene deve ser copiado em RNA. O primeiro par
de bases do segmento de DNA que será transcrito é chamado de sítio de início e recebe o valor +1.
Seqüências anteriores ao sítio de início são chamadas upstream (montante) sendo que as bases progridem
negativamente (-1, -2, -3...) a partir do +1 para trás. Seqüências localizadas após o sítio de início são
chamadas dowstream (jusante), e progridem positivamente (+2, +3, +4...). As seqüências reguladoras da
transcrição podem ser divididas em dois tipos: promotores e elementos reforçadores (enhancers).
Os promotores para transcrição no DNA(em E. coli região –10 (TATA box) e região– 35) são
inicialmente reconhecidos por fatores de transcrição que, ligados ao DNA, interagem com outros fatores,
formando um complexo ao qual as RNAPs se associam. Os promotores são, em geral, seqüências de 100
a 200 pb (pares de bases). Eles sempre estão próximos ao sítio de início da transcrição e possuem
seqüências consenso, comuns a todos os promotores, que são reconhecidas pelos fatores de transcrição.
O processo de transcrição pode ser dividido em 3 partes: iniciação, alongamento e terminação.
Iniciação:
O primeiro passo da transcrição requer regiões reguladoras e a RNA polimerase de E.coli, uma
holoenzima composta pelas subunidades (a2bb’s). O cerne ou núcleo da enzima é composto pelas
subunidades (a2bb’) e o fator sígma da enzima (s). A RNA polimerase desempenha múltiplas funções, e
participa dos processos de início, alongamento e término da transcrição.
A transcrição se inicia nos promotores do DNA molde. Em E. coli eles são conhecidos como
seqüência –10 e – 35, por são centradas a cerca de 10 a 35 nucleotídeo a montante do ponto de início
(+1).
O fator s reconhece a região promotora e o restante da holoenzima (cerne ou núcleo) é
responsável pela transcrição. A RNAP contendo o fator sígma pode detectar o promotor no DNA sem
desenrolá-lo. Os promotores sinalizam o local onde a síntese do RNA deve ser iniciada. O
reconhecimento do promotor passa por duas etaps: formação do complexo e iniciação abortiva.
O complexo é inicialmente fechado (DNA dupla fita) e depois aberto, formando a bolha de
transcrição). A abertura da fita é exatamente na região –10, pois é rica em AT ( AT é mais fácil de ser
rompida, por ter 2 pontes de hidrogênio). O próximo passo é a incorporação dos dois primeiros
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ribonucleotídeos e a formação da ponte fosfodiésteres. Sem que a enzima se desloque do DNA são
sintetizados nove nucleotídeos e logo é novamente reiniciado a síntese novamente, caracterizando a fase
abortiva do processo.
Com o desligamento do fator sígma do complexo termina a fase abortiva permitindo que a RNAP
comece a se deslocar pela fita de DNA para sintetizar a fita de RNA. Esta fase é chamada de
alongamento.
Alongamento:
É o aumento da cadeia de RNA para o qual outros fatores acessórios são necessários. Os fatores
utilizados no complexo de iniciação da transcrição são liberados e a RNAP (a2bb’), deslize sobre o
molde de DNA, abrindo o DNA à sua frente (“bolha de transcrição”) e fechando atrás de si, após ter
usado a fita de DNA como molde para a transcrição. A RNAP tem função de helicase, por isto que ela
abre a fita de DNA.
Um duplex híbrido DNA-RNA forma-se dentro da bolha à medida que o RNA é sintetizado. Os erros na
seqüência da cadeia produzidos nesta etapa são cuidadosamente corrigidos pela RNA polimerase (função
de correção de erro).
Terminação:
Muito pouco se conhece sobre o término da transcrição, mas em E. coli há 2 tipos de término do da
transcrição: terminação independente de rho (r) ou a dependente de rho (r).
Na terminação independente de rho (r), que ocorre em 90% dos casos, sabe-se que a RNAP terminam a
síntese em regiões consenso. Neste tipo de terminação, existe uma seqüência invertida repetida seguida
por uma seqüência de adeninas (A) na fita molde. A região assimétrica permite ao RNA nascente formar
uma estrutura de alça (grampo de terminação) que ocasiona uma longa pausa no alongamento da
cadeia, nesta região há uma desestabilização no híbrido DNA-RNA. O desligamento do RNA do sistema
provoca uma ruptura do complexo de transcrição e as fitas de DNA são renaturadas novamente.
Terminação dependente de rho (r).
Esta proteína na presença de ATP se liga ao RNA nascente simples fita, percorrendo a fita de RNA até
encontrar o ponto de término, desestabilizando o híbrido DNA:RNA, separando o RNA e terminando
assim a transcrição.
OBS: Nos procariotos a transcrição e a tradução são acopladas. Imediatamente após a liberação das
primeiras regiões do RNA sintetizado na bolha de transcrição, os ribossomos se ligam a ele e iniciam a
síntese de proteínas.
Código Genético e Síntese de Proteínas
A relação entre a seqüência de bases no DNA e a seqüência correspondente de aminoácidos, na proteína,
é chamada de código genético. O código genético encontra-se na forma triplets (trinucleotídeos) que são
chamados de códons.
Codóns – seqüência de 3 nucleotídeos que corresponde a um determinado aminoácido.
Em células eucarióticas sabia-se que a informação genética está contida no DNA, dentro do núcleo, e a
síntese de proteínas ocorre no citoplasma, dirigido pelo mRNA. Descobriu-se mais tarde, que a
seqüência do DNA determina a seqüência de aminoácidos de uma proteína, de acordo com um código
genético universal entre os seres vivos. Descobriu-se, também, que a molécula adaptadora (proposta por
Crick) era o tRNA e que esse mediava a tradução do código genético em seqüência de aminoácido.
No processo de tradução, o mRNA é lido a cada 3 nucleotídeos presente no tRNA (RNA transportador),
já ligado a um determinado aminoácido, através do anticódon.
Anticódon – é uma seqüência de 3 nucleotídeos presente no tRNA e complementar ao códon e que, no
momento da síntese proteica, interage com o códon por um pareamento de bases.
Alguns tRNAs com diferentes anticódons são ligados (ativados) a um mesmo aminoácidos e,
conseqüêntemente, diferentes códons podem codificar um mesmo aminoácido. Esse fenômeno define
uma característica do código genético: a degeneração.
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Degeneração – um mesmo aminoácido pode ser codificado por vários códons diferentes.
Sinônimos – códons que representam um mesmo aminoácido.
Excetuando-se a metionina (Met) e o triptofano (Trp), todos os outros aminoácidos são representados
por mais de um códon.
Trp – UGG
Met – AUG
Códon de iniciação e terminação
O códon AUG – é o códon de iniciação, que determina o início da síntese de proteínas, sendo, portanto,
a metionina o primeiro aminoácido a ser incorporado em todas as proteínas de procariotos e eucariotos.
Obs: Eventualmente o códon GUG pode ser utilizado, em E.coli, como códon de iniciação.
Códon de terminação: - UAA, UGA e UAG, estes códons não são reconhecidos por nenhum tRNA,
determinando, dessa maneira, uma parada no processo de incorporação de aminoácidos e
consequentemente, o término da síntese de proteínas.
OBS: estes códigos podem ser alterados em alguns protozoários ciliados por exemplo e nas
mitocôndrias.
Síntese de proteínas:
Várias moléculas de tRNAs foram isolados de
procariotos e eucariotos todos apresentando
uma estrutura de folha de trevo, que é mantida
por meio de pareamento entre seqüências complementares na molécula de tRNA.
Os tRNAs são denominados em função do
aminoácido que prepresenta.
Ex: o tRNA com o anticódon da metionina é
chamado de tRNAMet
O tRNA que está ligado ao seu aminoácido, é denominado de aminoacil-tRNA ( por exemplo MettRNA)
-
Existem duas propriedades, extremamente importante, presente em todos os tRNAs
são capazes de representar somente um aminoácido, ligando-se covalentemente a ele;
contêm uma seqüência de 3 nucleotídeos, o anticódon, que é complementar ao códon do mRNA e que
representa o aminoácido.
Aminoacil_tRNA sintetase
O processo de ligação do aminoácido com o tRNA é realizado por um grupo de enzimas denominadas de
aminoacil-tRNA sintetases. Essa enzima possui uma função de correção de erro para evitar a
incorporação de um aminoácido incorreto ao tRNA.
Reação de ativação dos aminoácidos
l 1º passo
ATP + aa →
aminoacil – AMP + PPi
l 2º passo
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aminoacil – AMP + tRNA →
aminoacil – tRNA + AMP
obs: aminoacil-tRNA = aa-tRNA
EX:ATP + ile → isoleucil– AMP + PPi
isoleucil – AMP + tRNAile → isoleucil – tRNA + AMP
Enzima - isoleucil-tRNA sintetases
Estrutura do Ribossomos
Os ribossomos são estruturas compactas de ribonucleoproteínas, consistindo em duas subunidades.
Cada subunidade é formada por proteínas associadas a moléculas de RNA ribossomico (rRNA).
O ribossomo completo de E.coli tem uem um coeficiente de sedimentação de 70S e apresenta uma
estrutura assimétrica , sendo composto por uma região basal e de outra contendo a cabeça ou
protuberância.
Na subunidade 30S - As proteínas que compõem essa subunidade recebem a denominação de S1 a S21
Na subunidade 50S - As proteínas que compõem essa subunidade recebem a denominação de L1 a L34
Cada subunidade do ribossomo possui vários sítios ativos, sendo o A e P os que estão inicialmente
relacionados com a síntese de proteínas.
Sítio A– liga preferencialmente ao aminoacil-tRNA e localiza-se a subunidade 50S.
Sítio P – liga tanto ao fMet-tRNA como ao peptidil-tRNA e localiza-se na subunidade 30S.
Sítio E – é o sítio de saída das novas proteínas sintetizadas no ribossomo. Localiza-se distante do sítio A
e P.
Início da síntese de Proteína
A iniciação da síntese de proteínas envolve a reunião de componente do sistema de tradução antes que
ocorra a formação da ligação peptídica. Esses componentes incluem as duas subunidades ribossômicas, o
RNAm a ser traduzido, o aminoacil-RNAt para metionina, especificado pelo códon iniciador AUG na
mensagem, o GTP (o qual fornece energia ao processo) e fatores de iniciação que facilitam a montagem
deste complexo de iniciação.
O processo de tradução se inicia pela ligação da subunidade menor do ribossomo a um sítio
(sequência) específica no mRNA chamado RBS (ribosome binding site). Esta ligação é mediada,
provavelmente, pelo pareamento de uma sequência do rRNA 16 S (que faz parte da composição da
subunidade menor) com a sequência de Shine-Delgarno (ou RBS). À subunidade menor acopla-se, então,
o primeiro tRNA (sempre para formil-metionina, em E. coli), e o conjunto desliza pelo mRNA até
encontrar o códon iniciador AUG, podendo ser utilizados GUG ou, mais raramente UUG (identificado
pelo anticódon correspondente no tRNA). AUG corresponde ao códon da metionina. O tRNA
iniciador (tRNAi) está ligado a uma metionina contendo um grupamento formil ligado ao seu radical
amino formando a molécula tRNAfMet. É necessário um ajuste preciso da posição de início da leitura do
mRNA pelo ribossomo. Para cada mRNA existem potencialmente três diferentes quadros de leitura (já
que as bases são lidas em trincas), porém só um quadro de leitura é correto.
A subunidade 30S, por sua vez, não tem como reconhecer o códon AUG, mas "sabe" onde é a sequência
RBS e determina, assim, que a primeira trinca AUG abaixo de seu sítio de ligação será o início da síntese
protéica. Então, fica claro que a associação das duas moléculas, tRNA e subunidade 30S do ribossomo, é
imprescindível.
A ligação da subunidade 30S com o mRNA e o tRNA iniciador necessita de proteínas auxiliares
denominadas de fatores de iniciação (IF). Esses fatores de iniciação estão envolvidos somente na
formação do complexos de iniciação, sendo dissociado durante a formação do ribossomo completo. Em
bactérias existem 3 fatores de iniciação (IF1, IF2, IF3).
Ao conjunto subunidade menor(30S)/ tRNA, já na posição exata para início da síntese protéica, liga-se,
então, a subunidade maior (50S), completando o ribossomo.
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Alongamento: O ribossomo tem formado, assim, uma cavidade P (à esquerda, no desenho), onde está o
tRNA com a formil-metionina, e uma cavidade A, ainda vazia, a sua direita, aguardando a chegada do
próximo tRNA transportando o aminoácido correspondente ao códon apresentado no fundo da cavidade.
Quando isto acontece uma reação química (ligação peptídica) ocorre entre o primeiro aminoácido e o
segundo, transferindo desta forma o primeiro para se ligar ao segundo, que permanece pelo seu lado
ligado ao seu tRNA. O primeiro tRNA, agora ocupando a cavidade P do ribossomo, está descarregado. O
ribossomo então desloca-se no mesmo sentido que já vinha fazendo, descartando assim o tRNA vazio
(provisoriamente alojado no sítio E), posicionando o segundo tRNA com os dois aminoácidos a ele
aderidos na cavidade P e liberando a cavidade A para receber um novo tRNA carregado.
A elongação envolve a adição de aminoácidos à extremidade carboxila da cadeia polipeptídica em
formação. Durante a elongação, os ribossomos movem-se do 5’-terminal do mRNA que está sendo
traduzido. Há vários fatores de elongação (EF-TU, EF-TS, EF-TG) envolvidos com esses processos. A
formação de ligação peptídica é catalizada pela peptidiltransferase. Após formar-se a ligação peptídica,
o ribossomo avança três nucleotídeos em direção ao 3'- terminal do mRNA. Isto causa a liberação do
tRNA descarregado
Terminação:
A terminação ocorre quando um dos três códons de terminação UAA, UGA e UAG movem-se ao sítio,
estes códons não são reconhecidos por nenhum tRNA, determinando, dessa maneira, uma parada no
processo de incorporação de aminoácidos. O fator de liberação faz a proteína recém sintetizada ser
liberada do complexo ribossômico e causa a dissociação entre o ribossomo e o mRNA. O polipeptídeo
recém sintetizado pode sofrer modificações subsequentes; as subunidades ribossômicas, o mRNA, o
tRNA e fatores proteicos podem ser reciclados e usados para sintetizar outro polipeptídeo.
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Regulação da expressão gênica
A bactéria Escherichia coli:
tem um genoma com aproximadamente 4,6 Mb, apresentando mais de 4.200 genes identificados.
somente uma fração destes genes é expressada em um determinado momento
a célula é capaz de bloquear ou ativar a expressão de diferentes genes como resultado de resposta a
estímulos internos e externos, este processo é chamado de regulação da expressão gênica.
Regulação da expressão gênica - são os mecanismos que regulam o processo de transcrição para
sintetizar o RNA, e, posteriormente, a tradução desses para gerar proteínas.
Em bactérias há duas classes de enzimas:
- As enzimas constitutivas - são enzimas produzidas com velocidade e quantidade constantes,
independendo do estado metabólico do organismo. Essas enzimas geralmente são necessárias para as
funções básicas das células
- As enzimas indutíveis - são enzimas sintetizadas apenas quando requerida pelas células
Exemplo de enzima indutível é a b-galactosidase de E. coli, que catalisa a hidrólise da lactose para
formar a hidrólise da lactose em glicose e galactose, sendo sintetizada em resposta a presença de lactose
no meio de cultura.
Indução coordenada - síntese de várias enzimas relacionadas com a mesma rota metalólica.
Pelo menos 3 tipos de proteínas regulam a iniciação da transcrição pela RNA -polimerase:
1- Fatores de especificidade - alteram a especificidade da RNA- polimerase para um promotor ou
conjunto de promotores.
2- Repressores - ligam-se a sítios específicos no DNA. Nos procariotos os sítios de ligação para os
repressores é o o operador (O), bloqueando o acesso da RNA-polimerase ao promotor.
A regulação por meio de uma proteína repressora bloqueia a transcrição sendo referida como Regulação
Negativa.
3- Ativadores - ligam-se próximo ao promotor, aumentando a interação e a atividade da RNApolimerase naquele promotor.
A regulação mediada por ativadores são chamadas de Regulação Positiva
Muitos genes procariotos são regulados em unidades chamadas de operons:
A grande maioria dos genes procariotos estão organizados na forma de operons. (ler apostila genes e
cromossomos de Bilogogia Molecular)
Operons – refere-se a dois ou mais genes adjacentes que estão sob o controle de um mesmo promotor,
ou seja, são dois ou mais genes que ocupam posições vizinhas que codificam proteínas com funções
relacionadas (ex: proteínas que participam de uma mesma via metabólica).
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O operon da lactose (operon lac) está sujeito a regulação negativa.
•
o gene I codifica o repressor lac
•
P - promotor - que é um sítio localizado no DNA onde se liga a RNA-polimerase
•
O - operador - que são sítios de ligação de proteínas repressoras da transcrição
•
Os genes Z, Y e A codificam a b- galactosidase , galactosídeo -permease e transcetilase
respectivamente.
1- Na presença do indutor - Na presença do substrato lactose, o indutor liga-se ao repressor, fazendo
com que ele dissocie do operador (O), proporcionando assim a transcrição dos genes do operon lac, é
dito então, que a transcrição desses genes foram induzidas.
Controle positivo da Transcrição
O exemplo mais bem estudado é o controle positivo em E. coli é o efeito da glicose na expressão dos
genes que codificam as enzimas envolvidas na quebra (catabolismo) de outros açucares (incluindo a
lactose), os quais constituem fontes alternativas de carbono e energia.
Desde que esteja disponível a glicose é preferencialmente usada no metabolismo de bactéria. EX: mesmo
com a presença do indutor (lactose) o operon lac não é transcrito em altos níveis quando há a presença de
glicose no meio.
Em bactéria, a enzima adenil-ciclase converte o ATP em AMP cíclico (cAMP), isto é regulado de tal
forma que os níveis de cAMP é aumentam quando os níveis de glicose diminuem.
cAMP ¯ glicose
Este efeito da glicose é mediado por um controle positivo no qual está acoplado aos níveis de cAMP
O cAMP liga-se a uma proteína reguladora transcricional chamada de proteína ativadora de catabólito
(CAP) e essa ligação está situada a 60pb (pares de bases) antes do início do sítio da transcrição. Neste
momento o CAP interage com a RNA-polimerase (na subunidade a), facilitando a ligação da enzima ao
promotor, ativando assim a transcrição
Portanto:
A indução do operon lac requer tanto a presença de lactoser (indutor) para inativar o represssor,
quanto a ausência de glicose para aumentar a concentração de cAMP e permitri que a CAP se ligue ao
DNA.
Portanto, CAP é um elemento regulador positivo, que responde aos níveis de glicose, enquanto o
repressor lac é um elemento regulador negativo, que responde aos níveis de lactose.
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