Roteiro РM̩todos de estudos de c̩lulas (1)

Curso: Medicina Veterinária
Disciplina: Histologia Geral e Embriologia
Profª: Patrícia Mendes
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Nota:
Alunos (dupla):__________________________________________
MÉTODOS DE ESTUDO DAS CÉLULAS
A DESCOBERTA DA CÉLULA
Com exceção dos vírus, todos os demais organismos têm a
célula como unidade estrutural e funcional. Nos unicelulares, como
bactérias e amebas, a própria célula é um indivíduo. Nos
pluricelulares, a organização do indivíduo alcança níveis mais
elevados, pois compreende formação de tecidos, órgãos e sistemas ou
aparelhos.
Atualmente se conhecem muitos detalhes da morfologia e da
fisiologia celular, bem como as características dos diferentes tipos de
células, graças à evolução de várias técnicas e o aprimoramento de
aparelhos.
Como a maior parte das células é invisível a olho nu, só foi
possível estudá-las após a invenção do microscópio, em 1590. Mesmo
assim, sua descoberta só ocorreu em 1665, quando o físico inglês
Robert Hooke (1635-1703), observando cortes finos de cortiça ao
microscópio, verificou que ela era formada por numerosos
compartimentos vazios, aos quais deu o nome de ‘células’. Na
verdade, o que Hooke observou eram espaços cheios de ar
delimitados por parede celular, as células mortas de cortiça.
Célula  do latim cellula, que significa cela, pequeno compartimento.
Microscópio  do grego mikros, pequeno + skopein, ver, olhar
A teoria segundo a qual “todos os organismos vivos, com
exceção dos vírus, são constituídos de células”, se prende aos nomes do
botânico alemão Matthias Schieiden (1804-1881) e o zoólogo
alemão Theodor Schwann (1810-1882), ambos considerados
criadores da Teoria Celular.
A aplicação da teoria celular na embriologia se deveu a
Kölliker (1841), que identificou o óvulo e o espermatozóide como
células, cuja fusão resulta no zigoto, início de nova vida animal ou
vegetal. Em 1855, o médico Rudolf Virchow generalizou o conceito
de que não existe geração espontânea de células, todas elas se
originando de células pré-existentes. Em 1882, o alemão Walter
Flemming descreveu a divisão celular por mitose.
A moderna doutrina celular pode ser resumida em quatro
conceitos fundamentais: 1) a menor unidade de vida é a célula; 2)
todo ser vivo pluricelular provém de uma célula, o zigoto; 3) todas as
células provêm de outras pré-existentes; 4) todas as reações
metabólicas de um organismo vivo ocorrem dentro de suas células.
A DESCOBERTA DO CONTEÚDO CELULAR
Em 1831, o botânico inglês Robert Brown, estudando
células de orquídeas, observou nelas a presença de um corpúsculo, a
que chamou de núcleo. Por volta de 1832, o conteúdo celular era
conhecido pelo nome de protoplasma, Mais tarde o protoplasma sem
o núcleo foi designado citoplasma. A existência da membrana que
envolve o citoplasma foi percebida indiretamente, pois quando se
pressionava a superfície de uma célula, seu conteúdo extravasava. Tal
fato permitiu supor a presença de uma película. Esta, por ser
extremamente fina, só pôde ser observada após a invenção do
microscópio eletrônico.
Flemming, entre 1876 e 1880, apoiado em descobertas de
outros pesquisadores, confirmou ser a cromatina o principal
componente do núcleo. Em 1890, Waldeyer introduziu o termo
‘cromossomo’ para designar os filamentos de cromatina visíveis na
célula em divisão por mitose. Observou também que o número de
cromossomos não ficava alterado quando uma célula se dividia por
mitose.
Entre 1880 e 1900 foram identificados no citoplasma:
centríolos, mitocôndrias, complexo de Golgi, plastos em células
vegetais e ergastoplasma. As estruturas celulares descobertas
durante o século XIX e início do século XX ficaram mais bem
conhecidas com a utilização do microscópio eletrônico,
principalmente depois de 1950. Junto às membranas do reticulo
endoplasmático foram observados os ribossomos, corpúsculos com
diâmetro aproximado de 150Å, e somente visíveis ao microscópio
eletrônico. A microscopia eletrônica também contribuiu para
identificar os lisossomos. Christian de Duve, por volta de 1955,
descreveu esses corpúsculos como pequenas bolsas contendo
enzimas com função digestiva, na célula animal.
Em 1956, Joe-Him Tijo, biólogo javanês, e Johann Levan,
citologista sueco, utilizando células cultivadas in vitro, procedentes
de pulmões de embriões humanos abortados, descobriram que as
células somáticas humanas têm 46 cromossomos, e não 48 como se
supunha até então.
Mais recentemente, os maiores progressos da citologia
ocorreram no campo da fisiologia do material hereditário, presente
no núcleo das células. Ficou esclarecido que o gene, partícula da
hereditariedade, se identifica como um ácido desoxirribonucléico
(DNA). Sabe-se também que os genes estão localizados nos
cromossomos e que casa gene determina a síntese de uma proteína
específica.
DIMENSÕES DAS CÉLULAS
As dimensões das estruturas biológicas podem agrupar-se
em dois grandes grupos: a) macroscópicas, isto é, visíveis ao olho
humano e b) microscópicas, invisíveis ao olho humano, tendo como
fronteira o poder de resolução do olho humano.
Por isso utilizamos unidades de medida menores que o
milímetro para se fazer referência ao seu tamanho e ao de suas
organelas. Essas medidas são o micrômetro (µm), o namômetro (nm)
e o angström (Å). A sua relação com a unidade fundamental do
sistema métrico, o metro (m) e com o milímetro (mm) é a seguinte:
Fig.1: Uma comparação de tamanhos de microrganismos. O quadro
acima mostra a equivalência no sistema métrico para as unidades
usadas para expressar as dimensões das células microbianas
(modificado por Pelczar et al., 1996).
Para se ter uma idéia mais clara das dimensões a que se
referem às unidades mencionadas, convém lembrar que nosso olho
permite a visão de objetos que meçam no mínimo 0,1mm.
Designando poder de resolução a menor distância que deve existir
entre dois pontos para que sejam vistos individualmente, podemos
afirmar que o poder de resolução do olho humano é de 0,1mm. Dessa
forma, se dois pontos estiverem próximos entre si a uma distancia
menor que 0,1mm, não serão percebidos pelo olho humano, mas
poderão ser vistos individualmente por meio de um microscópio
óptico, com poder de resolução de cerca de 0,2 µm.
As menores células visíveis aos microscópios são as
bactérias, dentre as quais muitas se encontram nos limites de
resolução do aparelho, entre 0,2 e 0,3 µm. Num mesmo organismo
pluricelular o tamanho das células pode variar muito, pois está
relacionado com o tipo de atividade ou função por elas
desempenhada. As células nervosas (neurônios), por exemplo,
podem ter prolongamentos que ultrapassam 1m de comprimento; as
células dos rins, do fígado e da pele têm, em média, 30 µm de
diâmetro; as do sangue, de 0,5 a 0,7 µm.
Em termos de formação de imagem é fundamental
percebermos o significado de 3 conceitos muito importantes, que são
o poder de ampliação, o poder de resolução e o limite de resolução.
Poder de ampliação: capacidade de um aparelho aumentar n vezes
uma imagem. Na microscopia é dado pelo produto entre a ampliação
das oculares e a ampliação das objetivas.
Poder de resolução: capacidade de um aparelho fornecer imagens
distintas de dois pontos distintos.
Limite de resolução: distância mínima a que dois pontos podem
estar para o aparelho os mostrar individualizados.
O que determina a riqueza de detalhes da imagem
fornecida por um sistema de imagens é seu poder de resolução e não
seu poder de ampliar o tamanho dos objetos. A capacidade de
aumentar só tem valor prático se for acompanhado por um aumento
do poder de resolução. Este limite de resolução depende
essencialmente da objetiva, já que as oculares não podem acrescentar
detalhes à imagem. A função das oculares é aumentar o tamanho
dessa imagem, que é projetada no seu plano de focagem pela objetiva.
MÉTODOS DE ESTUDO
Para o estudo da célula o instrumento fundamental é o
microscópio. O mais comum e mais usado é o microscópio óptico
(M.O.). Mas também existe o microscópio eletrônico. A Citologia
desenvolveu-se muito a partir de 1939 com a invenção do
microscópio eletrônico de transmissão. Nesse instrumento o
material é atravessado por um feixe de elétrons (e não por luz) e é
possível obtermos imagens ampliadas até 400 mil vezes.
Posteriormente, foi desenvolvido o microscópio eletrônico de
varredura, no qual o feixe de elétrons, em vez de atravessar o objeto,
o varre como ser fosse uma pessoa sentindo com os dedos o relevo de
uma superfície. Desse modo, consegue-se uma imagem
tridimensional do material observado. Em 1981 surgiu o
microscópio de varredura por tunelamento, capaz de aumentar as
estruturas até 100 milhões de vezes e fornecer imagens de átomos e
moléculas.
O microscópio óptico é um aparelho no qual a ampliação
das imagens é feita por um sistema duplo de lentes convergente:
objetiva e ocular. A objetiva fornece uma imagem real, invertida e
maior do que o objeto; a ocular fornece a imagem definitiva, maior e
virtual, direita em relação à imagem fornecida pela objetiva e
invertida em relação ao objeto.
O M.O. compõe-se de uma parte mecânica que serve de
suporte e uma parte óptica que é constituída de três lentes:
condensador, a objetiva e a ocular (Esquema abaixo). O aumento total
de ampliação dada por um microscópio é igual ao aumento da
objetiva multiplicado pelo aumento da ocular. Esta última aumenta o
material enquanto a objetiva aumenta o poder de resolução que é a
capacidade de diferenciar entre dois objetos muito próximos. O M.O.
comum permite aumentos de até 2.000 vezes.
O material que se quer observar ao microscópio óptico é
colocado entre uma lâmina e uma lamínula de vidro, sendo
atravessado por um feixe de luz que incidirá na lente objetiva. Esta
aumenta a imagem e a projeta na lente ocular que, por sua vez, a
amplia ainda mais, permitindo que seja vista pelo observador.
Observações:
1. A imagem proporcionada pelo M.O. é aumentada, virtual e
invertida em relação ao objeto examinado.
2. Calcula-se o aumento da imagem obtida ao M.O. multiplicando-se
o valor do aumento da ocular pelo valor do aumento da objetiva.
3. Campo microscópico é a área da preparação que se está
observando ao M.O.. Quanto maior o aumento da imagem, menor
é a abrangência do campo
4. Em virtude do último item, sempre ao iniciar a observação ao
M.O. usa-se uma combinação de lentes que proporcione um
menor aumento, a fim de se obter uma visão panorâmica da
preparação; depois usa-se uma combinação de lentes que
proporcione um maior aumento, permitindo a visualização de
detalhes do campo microscópico.
Ao M.O. as células podem ser observadas vivas, bastando
colocá-las sobre a lâmina e cobri-las com uma gota de água ou
solução fisiológica. Este é denominado exame vital, ou observação in
vivo, que traz algumas vantagens: mostra o material como é, sem
altereações; permite a observação de fenômenos fisiológicos como a
divisão celular ou o movimento de materiais dentro da célula;
possibilita observar a locomoção de organismos unicelulares.
Entretanto esse método não permite distinguir, com nitidez, as
estruturas celulares. Nas observações in vivo, a técnica de coloração é
denominada coloração vital e o corante é usado em concentrações
extremamente baixas. Por exemplo, o núcleo, de caráter ácido, tem
afinidade por corantes básicos.
Para se obter um bom contraste entre as diferentes partes
das células há necessidade de tratá-las com substâncias denominadas
corantes. Esse processo, denominado coloração, consiste em corar
diferencialmente as diversas estruturas celulares. A maioria dos
corantes mata as células, podendo ocasionar alteração em suas
estruturas. Para evitar que isso aconteça, em geral, a coloração é
precedida de um processo denominado fixação. Esta é feita com
substâncias que matam a célula rapidamente, estabilizando suas
estruturas de modo que elas permaneçam como se estivessem vivas,
ou, ainda, utilizando processos físicos, como congelamento e a
desidratação.
Os materiais a serem examinados ao microscópio devem
ser suficientemente finos para que a luz ou os elétrons os
atravessem; devem ser preparados por meio de técnicas especiais, de
modo que possam ser cortados em fatias muito finas, denominados
cortes histológicos. As técnicas de preparação para o corte consistem
na fixação do material e posterior inclusão em parafina (para
microscopia óptica) ou em resinas do tipo epóxi (para microscopia
eletrônica). Depois de solidificadas, essas substâncias tornarão o
material mais consistente, permitindo que ele seja cortado em um
aparelho denominado micrótomo. A espessura dos cortes
histológicos para o microscópio óptico é de 3 a 6 µm; para o
eletrônico, de 0,02 a 0,1 µm.
Além da técnica do corte histológico existem outras duas
muito usadas: esmagamento, em que se pressiona o material entre
lâmina e lamínula, juntamente com um fixador e corante, para que as
células se espalhem; esfregaço, que consiste em espalhar, numa fina
camada sobre a lâmina, as células dispersas num meio liquido.
Os processos aqui descritos constituem as técnicas
citológicas básicas, mas há outras também muito utilizadas como a
auto-radiografia (técnica que identifica a incorporação de material
radioativo em tecidos vivos, utilizando um filme sensível à
radioatividade), microdissecação (técnica de dissecação de
estruturas celulares sob a lupa ou microscópio), ultracentrifugação
(centrifugação ultra-rápida para separação de fragmentos e
organelas celulares).
ESTUDO DIRIGIDO
1) Qual é a unidade funcional de todo organismo vivo?
2) Explique como foram as descobertas da célula por Robert Hooke.
3) Cite o conceito da Teoria Celular.
4) Explique porque a Teoria celular tem aplicação na Embriologia.
5) Quais são os quatro conceitos fundamentais da doutrina celular?
6) Explique sobre a descoberta do núcleo celular.
7) O progresso dos microscópios permitiu a descoberta de algumas
organelas. Cite-as.
8) Explique o que é uma observação macroscópica e observação
microscópica.
9) Porque utilizamos unidades de medida menores que 1 milímetro
quando trabalhamos com microscopia?
10) Quais são as medidas utilizadas em microscopia?
11) Qual o tamanho mínimo dos objetos que podem ser vistos pelo
olho humano? E quando utilizamos um microscópio?
12) Qual o menor tipo celular pode ser observado no microscópio?
13) O tamanho das células é variável? Explique e cite exemplos.
14) Para a formação de uma imagem no microscópio, é importante
saber o significado de 3 termos. Descreva-os:
a. Poder de ampliação
b. Poder de resolução
c. Limite de resolução
15) Qual dos fatores citados na questão anterior determina uma
maior riqueza de detalhes numa imagem?
16) Porque o poder de ampliação não é relevante se o poder de
resolução não for bom?
17) Porque o limite de resolução depende essencialmente das
objetivas?
18) Se as oculares não acrescentam detalhes à imagem, qual a sua
função?
19) Cite os dois principais tipos de microscópios. Diferencie-os.
20) Cite os procedimentos básicos para a montagem de uma lâmina e
porque devem ser seguidos criteriosamente.