Apresentação do PowerPoint
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ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra CONCEITOS O QUE É DNA? O QUE ELE FAZ? PORQUE ELE É VITAL EM SERES VIVOS? COMO PROMOVER MODIFICAÇÕES NELE? REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR) TÉCNICA DE CLONAGEM (DNA RECOMBINANTE) SELEÇÃO DE BACTÉRIAS COMPETENTES 3 Cada base nitrogenada é ligada à molécula de açúcar formando um nucleosídeo EXISTE UM ATOMO CENTRAL DE FOSFORO LIGADO A 4 ATOMOS DE OXYGENIO Cada nucleosídeo é ligado a um grupo fosfato formando um nucleotídeo 4 Bases Nitrogenadas Quatro bases de DNA A= Adenina T= Timina G= Guanina C= Citosina U = uracil (RNA) Purinas •Estruturas da cadeias cíclicas: Anel duplo •5 e 6 C & N Pirimidinas •Estruturas de anel único contendo 6 átomos C & N 5 Açúcar Deoxiribose DNA RNA 6 7 O QUE ELE FAZ??? O “dogma central” da biologia molecular Proposto por Francis Crick em 1958. Em 1970 publicado na revista Nature DNA codifica para produção de RNA RNA codifica para produção de proteina. Proteina não codifica para produção de proteina, RNA ou DNA. O final nas palavras de Francis Crick “Once information has passed into protein, it cannot get out again”. 11 Conceitos Básicos • GENOMA: todo DNA existente num organismo • GENE: um segmento de DNA que codifica um produto funcional – proteínas – ou RNAs COMO? TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO Dependente de fator protéico ENVOLVE A PROTEINA rho LOCALIZAÇÃO DO PROMOTOR ATG PROMOTORES DE GENES BACTERIANOS tRNA • tRNAs tem cerca de 80 bases, • Existem ao menos 31 no citoplasma, 22 na mitocôndria. • Todos os tRNAs tem um braço aceptor com uma sequência 3′ CCA, que é covalentemente ligada ao aminoácido. (A) • Posuem um triplet anticodon que transientemente se liga ao mRNA. (B) • A estrutura geral é denominada trevo (cloverleaf ) A B 17 AA tRNA Ativação dos aminoácidos Amino acil tRNA sintetases: ligação dos aminoácidos à extremidade 3’ do tRNA de acordo com o anti-códon braço do anti-codon AAs Uma única amino acil tRNA sintetase liga um Aminoácido a todos os seus tRNAs Três passos na Tradução: Iniciação 1. A subunidade menor do rRNA se liga ao mRNA via sequência líder próxima ao start codon (AUG). 19 Código Genético 20 Tradução: aa livre Ribossomo Phe Gly His Glu Proteína Asp Met Ala Cys 5’ tRNA 3’ AU G G CAU G C GAC GAAU U C G GACACAUA Molécula de mRNA Direção do avanço do ribossomo codon Phe Gly His Glu Asp Met Ala Cys 5’ AU G G CAU G C GAC GAAU U C G GACACAUA 3’ Phe Gly His Glu Met Ala Cys Asp 5’ AU G G CAU G C GAC GAAU U C G GACACAUA 3’ His Gly Met Ala Cys Asp Phe Glu 5’ AU G G CAU G C GAC GAAU U C G GACACAUA 3’ Ile Met Ala Cys Asp Glu His Gly Phe 5’ AU G G CAU G C GAC GAAU U C G GACACAUA 3’ Lys Met Ala Cys Asp Glu Phe Ile His Gly 5’ AU G G CAU G C GAC GAAU U C G GACACAUA 3’ Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly Lys Ile His 5’ AU G G CAU G C GAC GAAU U C G GACACAUA 3’ Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Lys Ile 5’ AU G G CAU G C GAC GAAU U C G GACACAUA 3’ Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Leu Lys 5’ G CAU G C GAC GAAU U C G GACACAUAAAA 3’ Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Met Leu 5’ U G C GAC GAAU U C G GACACAUAAAAU UA 3’ Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Asn Met 5’ GAC GAAU U C G GACACAUAAAAU UAAU G 3’ Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Pro Asn 5’ GAAU U C G GACACAUAAAAU UAAU GAAC 3’ Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Gln Pro 5’ U U C G GACACAUAAAAU UAAU GAAC C CA 3’ Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln 5’ G GACACAUAAAAU UAAU GAAC C CACAA 3’ Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln 5’ STOP 3’ CACAUAAAAU UAAU GAAC C CACAAUAA Ala Cys Asp Glu Phe Met Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln 5’ STOP AUAAAAU UAAU GAAC C CACAAUAAAAA 3’ Ala Cys Asp Glu Phe Met Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln 5’ STOP AUAAAAU UAAU GAAC C CACAAUAATAC 3’ Ala Cys Asp Glu Phe Met Gly His Ile Gln Lys Pro Leu Asn Met 5’ 3’ AUAAAAU UAAU GAAC C CACAAUAATAC VARIAÇÃO GENÉTICA =POLIMORFISMO Ala Cys Asp Glu Phe Met Gly His Ile Gln Lys Pro Leu Asn Met 5’ 3’ AUAAAAU UAAU GAAC C CACAAUAATAC Ala Cys Asp Glu Phe Met Gly His Ile Gln Lys Pro Leu Asn CYS 5’ Muda a forma e função 3’ A U A A A A U U A A U G A A C AA A C A A U A A T A C A replicação in vivo • Replicação é semi-conservativa e a polimerização deve ser sempre no sentido 5´→3´ • Mas o DNA é antiparalelo ou seja, uma fita ocorre no sentido 5’ → 3’ e a outra no sentido 3’ → 5’ • Como ocorre então a replicação nos dois sentidos? Forquilha de replicação do DNA Proteínas de iniciação identificam a origem da replicação (rica em A-T) participam da ligação da DNA helicase ao DNA A proteína de iniciação acoplada à DNA helicase abre o DNA na junção “Y”. As pontes de H se rompem e a molécula se abre como um zíper As fitas se mantêm separadas durante a replicação graças à ação de umas proteínas as Single-strand binding proteins – SSBP’s História do PCR Em 1993, Kary Mullis, um químico ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método em 1985 que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science 239 (1988): 487-491 PCR • Qual é o objetivo? Produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima • Quais os componentes? Mg2+ DNA Polimerase dNTP Primers Termociclador • Como na técnica de PCR se encontram vários ciclos de amplificação, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento Uma reação típica de PCR Sterile Water 38.0 10X PCR Buffer 5.0 MgCl2 (50mM) 2.5 dNTP’s (10mM each) 1.0 PrimerFWD (25 pmol/ul) 1.0 PrimerREV 1.0 DNA Polymerase 0.5 DNA Template 1.0 Total Volume ul ul ul ul ul ul ul ul 50.0 ul O que é uma molécula de DNA recombinante? • Molécula de DNA obtida através da junção de dois ou mais fragmentos de DNA 5’- -3’ 5’- 5’- -3’ -3’ Clonando um gene • O que é clonagem? • Utilização da reprodução assexuada para obter organismos que são geneticamente iguais entre si e ao organismo parental Seleção Isolamento Reprodução assexuada Clonando um gene • O vetor • O DNA inserido não é replicado na célula a menos que esteja recombinado com DNA cromossômico ou inserido em replicon (elemento genético capaz de replicação autônoma) extracromossômico. • Replicons são reconhecidos como substratos por enzimas da célula responsáveis pela replicação (ou vetores) • Podem ser usados para carregar DNA recombinante, permitindo sua replicação 20min • O tipo mais comum de vetor são os plasmídeos 20min Após 30 gerações (10h) haverá 1x 109 cels Clonando um gene • Como se obtém o fragmento de DNA a ser clonado? • Endonucleases altamente específicas, conhecidas como enzimas de restrição, clivam o DNA em sítios precisamente definidos. • Fragmentos são gerados por cortes nos sítios de restrição no fragmento de DNA e no vetor • DNA ligases podem unir os fragmentos acima para obter a molécula de DNA recombinante Genes estão presentes em regiões contínuas de DNA cromossômico e não aparecem perfeitamente delimitados por sítios de restrição. Como conseguir o fragmento específico contendo o gene de interesse? Clonando um gene • Como se obtém o fragmento de DNA a ser clonado? • Há basicamente 3 possibilidades: – DNA sintético – PCR (RT-PCR) – Triagem de Bibliotecas genômicas ou de cDNA Fragmentação mecânica Ou enzimática Vetores • Plasmídeos • Sítio de clonagem múltipla (MCS) • Marcadores de seleção • Alfa-Complementação (hospedeiro Lac-) Tecnologia do DNA recombinante Gene produtor de toxina
